JPH04503455A

JPH04503455A - Ｃｄ４リンパ球の産生増殖方法

Info

Publication number: JPH04503455A
Application number: JP2-504332A
Authority: JP
Inventors: レウング，カム・ハング; タウンゼンド，ロバート・マーチン
Original assignee: テルモ株式会社
Priority date: 1989-02-21
Filing date: 1990-02-08
Publication date: 1992-06-25

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＣＤ４リンパ球の産生増殖方法発明の背景ヘルパー／インデューサー免疫機能に係わる重要な免疫調節細胞であるＴリンパ球のヘルパー／インデューサーサブセットはこれら細胞表面にＣＤ４表面抗原を発現する。ＣＤ４は５５ｋＤａの細胞表面タンパク質でありＭＩＩＣクラスＩＩ抗原の認識に関係している（　ｌ１ｉｄｄｆｓｏｎ等（１９８２）　、Ｊ。

ＥｘｐｌＭｅｄ、、１５６：１０６５〜１０７６）　、このようなＣＤ４−陽性（ＣＤ４”）　Ｔ細胞はヒト末梢血液リンパ球（ＦＢｌ、）の約４５９６である（１．ｅｄｂｅｔｔｅｒ等（１９８１）、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、１５３：３１０）。

ＣＤ４抗原はまた単球上でも低密度で見いだされる（　ｆｏｏｄ等（１９８２）　、Ｊ、　Ｉｍｗｕｎｏｌ、、、１３１：２１２）　、現在末梢血液からＣＤ４ “リンパ球を精製する最も普通の方法は細胞タイプの親和除去または特異的枯渇用のモノクローナル抗体の使用に係わっている。これらの親和分離方法にはバンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）法（Ｅｎｇｌｅｍａｎ等（１９８１）、Ｊ、　Ｉａ＋ｍｕｎｏｌ、、１２７：２１２４）、セルソーティング法（ＰａｒｋｓおよびＩｌｅｒｚｅｎｂｅｒｇ（１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙａ＋ｏｌ、　、１０８：１９７〜２４１）および補体殺生法（ＭｃＣｌｕｓｋｅｙ等（１９８４）、Ｉｎｔ、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

２　：　２９６〜３０３）がある。

細胞を分離する上記パンニング法は、単離すべきリンパ球または細胞のサブ集団（５ｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に存在する細胞表面マーカーに特異的な抗体で被覆したベトリ皿を必要とする。ペトリ皿に特異的に付着した細胞は付着しない細胞と分離される。これはＣＤ４”リンパ球を分離するのにより良好な方法の１つであるが、この方法は純粋な集団の分離が非効率的で且つ大規模な適用が困難なために限界がある。更に、パンニング法はめんどうな技術でありそして抗体を使用するため費用がかかる。

細胞を分離するセルソーティング法では、細胞は、通常特別の蛍光色素で標識された抗体で蛍光標識され、そして細胞は抗体の存在または不存在に基づいてセル −ターによって選別される。この方法は、選別が小規横でしか実施できないので、高価で且つ非常に時間がかかる。

選別中に無菌性を維持することも困難である。

細胞を単離する補体殺生法においては、所望でない細胞集団に特異的な抗体を細胞混合物に加え、次いで補体を加えて抗体と結合した細胞を特異的に溶解させる。この方法は所望しない全ての細胞を除去するのに非常に効率が悪く且つ大規模では実用的でない。磁性ビーズまたはアフィニティーカラムを使用する方法（Ｂｒａｕｎ等（１９８２）、Ｌ　Ｉｍｔｘｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　５４：２５１〜２５８）のような他の細胞分離法があるが、これらも上記方法と同じ多くの制限を有している。

発明の概要本発明はＣＤ４＋リンパ球を増加濃厚化させる改良方法に係わるものである。本発明はＣＤ４を有するリンパ球の純粋な集団の増大を誘発するために末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）または他のリンパ球含有細胞調製物を化学的に処理することに係わるものである。本発明の方法ではめんどうな陽性選別法やアフィニティー分離法の必要がなくなる。本方法は、ＣＤ４　Ｔ細胞を増加させるのに効率的であり、大規模に適用でき技術的に簡単でありそして費用効率性であるため最も実用的である。

ＰＢＭＣからリンパ球の細胞数を直接増加させる試みがなされるとき、得られた細胞のフェノタイプは大きく変動する傾向があるが、一般にこのように増加したＰＢＭＣ集団は少量のＣＤ４　”細胞および大量のＣＤ８＋またはＬｅｕ　１９細胞を含んでいる。ＰＢＭＣを最初にＬ−ロイシンメチルエステル（ＬＭＥ）またはＬ−ロイシル−ロイシンメチルエステル（ＬＬＭＥ）で処理し、続いてマイトジェンで刺激するとき、培養物が増加するにつれて該培養物中でＣＤ４陽性細胞が優勢になることを本発明者は発見した。このような培養物は使用した刺激剤のタイプに従って１０から１０００倍までの細胞数に増加しそして９０％を超えるＣＤ４陽性リンパ球純度を維持することが示される。

成る種のアミノ酸メチルエステルは単球のリゾソームによって容易に吸収され、その際該エステルは加水分解されて対応するアミノ酸とメタノールになる（Ｔｈｅｊｌｅ等（１９８３）、Ｊ、　ＩｍＩＩｕｎｏｌ、、１３１：２２１１１２〜２２９０）　、遊離アミノ酸はリゾソームに集積して、浸透不均衡をもたらす。

その結果水がリソソームを充満してリソソームを膨潤させ破壊させ、その結果細胞を殺す。ＬＭＥの場合には遊離アミノ酸と任意の残余１、ＭＥがロイシル−ロイシンメチルエステルに変換され、単球の破壊によってこのエステルが放出される（Ｔｈｅｉｌｅ等（１９８３）　、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３４ニア８６〜７９３）。その後ＬＬＭＥは、ＬＭＥでは直接影響を受けない細胞侵害性リンパ球に吸収されそして同じような態様でこれらリンパ球を破壊する。細胞に直接加えたＬＬＭＥは同じような態様で作用する（ＬｉｐｓｋｙおよびＴｈｅｉｌｅ、米国特許４．７５２．６０２；ＴｈｅｉｌｅおよびＬｊｐｓｋｙ（１９８６）、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３６：１０３８〜１０４ｇ）。

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）細胞が腫瘍細胞調製物から増加するとき、ＣＤ８を有する細胞が培養物中で優勢となる傾向がある（Ｔｏｐａｌｉａｎ等（１９８７）、Ｊ、　ｆｍｕｎｏｌ、　１ｌｅｔｈｏｄｓ。

１０２：１２７〜１４】）。培養に先立って腫瘍細胞をＬＭＥまたはＬＬＭＥで処理するこの新しい方法を採用することによって、得られた増加細胞培養物はＣＤ４を有するリンパ球が非常に濃厚になっていることが見いだされた。

ＣＤ４陽性リンパ球が非常に濃厚な細胞集団を産生させる方法で腫瘍細胞調製物にＬＭＥまたはＬＬＭＥを使用することは以前には報告されていなかった。これらの化合物の使用によって助けられる、末梢血液からのＣＤ４　Ｔ細胞の精製は以前に記載されている（Ｇｅｐｐｅｒｔ　およびＬｉｐｓｋｙ（１９８７）、Ｊ、　ＩｍＩＩｕｎｏｌ、、１３８：１６６０〜１６６６）。しかし乍らゲラパート（Ｇｅｐｐｅｒｔ）やりブスキー（Ｌｉｐｓｋｙ）の方法は幾つかの点で本発明の方法と異なる。第１に、ゲラパートおよびリブスキーはＣＤ４　’リンパ球を精製するために幾つかの親和性枯渇および陽性選別段階を含む骨の折れる多段階精製方法を使用するが、本発明者はそのような方法は使用しない。この精製にはＬＭＥ処理段階に加えて２つのパンニング段階を含む６つの精製段階が使用される。これら段階には時間がかかり、実施が困難でありそして大規模では実施不可能である。リブスキー等はまたＣＤ８　Ｔ細胞を単離するためにも同一の基本的計画を使用している（ＴｈｅｉｌｅおよびＬｉｐｓｋｙ　（１９８８）　、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｉｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、　４８：４１）５〜４２３）　ｏ第２に、ゲラパートおよびリブスキーはこれらの細胞を免疫療法に使用するために増加させているのではなくて、むしろ彼らは精製Ｔ細胞集団の活性化に必要な種々のパラメーターを研究しているにすぎない。

発明の詳細な説明ＰＢＭＣは典型的には全血製品からフィコール−ハイバク（Ｆｉｃｏｌｌ　−Ｈｙｐａｑｕｅ）によって単離される（Ｂｏｙｕｎ　（１９８９）、Ｔｉ５ｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ、　４：２６！Ｊ〜２７４）。

表面抗原によって特定される、ＰＢＭＣ調製物中のヒトリンパサブセットの幾つかを表１に示す。

表　１表面抗原によって特定されるヒトリンパ球サブセットリンパ球サブセットに通常使用される名称を表？に示す。

リンパ球サブセットおよび特異的モノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）　（Ｂ−Ｄ　＝　Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）Ｂ−Ｄ　Ｌｅｕ−５Ｌｅｕ−４Ｌｅｕ −３Ｌｅｕ−２オルソ　０ＫＴ−１１０ＫＴ−３０ＫＴ−４０ＫＴ−８次いで、単離したＰＢＭＣは、細胞侵害性のＣＤ８　Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＬＡＫ前駆体を効率的に減少させるかまたは除去するのに十分な時間成る濃度のＬＭＥまたはＬＬＭＥと共にインキュベートする。

ＬＭＥ濃度およびＰＢＭＣ処理の長さがＣＤ４産生に与える効果。

ＰＢＭＣはレッド　クロスバッフイコート（Ｒｅｄ　ｃｒｏｓｓ　Ｂｕｆｆｙｃｏａ　ｔ　）から得てフィコール分離によって単離した。細胞は３１Ｍ　Ｖ培地中Ｉ　Ｘ　１０７／　ｍｌに調整して５分の１ずつに分けた。各５分の１分別物はＬＭＥの異なる濃度（０，０，５，１，０，５，０および１０ｉＭ）で処理した。幾つかの時間ポイント（３０，４５，６０および７５分）で、細胞の４分の１を各々から取り出し、３１Ｍ　Ｖで２回洗浄した。次いで、細胞は４００１Ｊ／ｍ１（７）ＴＬ２を加えたＡＩＭ　Ｖ中Ｉ　Ｘ　１０６／ｌｌ１ｌＴ培養シタ。

フィトヘマグルチン（Ｐ１１＾）を各培養物に１ａｇ／ｍｌで加えて６日間培養した。ＦＡＣ３分析は６日目に行った。データはＣＤ４　’の％として示す。

０．５　５２　５３　５３　５７１．０　６０　５６　５８　５９５．０　６９　９３　９８　９８表３に示されるように、〉１．０から１（１ｗＭまでのＬＭＥを使用して４５乃至７５分間ＰＢＭＣ処理をすると＞　９０９６の含量のＣＤ４細胞培養物を産生させるのに有効である。約６０分間処理した後、細胞は２回洗浄してＬＭＥまたはＬＬＭＥを除去した。次いで、細胞は３１Ｍ　Ｖ培地中で所望の刺激剤、例えばレクチン（例えばフイトヘマグルチン）または抗原（例えば腫瘍抗原）と共に外来性のＩＬ２を加えてまたは加えないで３７℃で培養した。ＩＬ２活性単位は全てＢＲＭＰ　（生物学的応答修正プログラム）単位（Ｕ）として示す。４から７日のうちに細胞増殖が始まり、モしてＩＬ２の存在下で２乃至３週間継続する。得られた細胞集団はＩＯから１０００倍の細胞増大後に９０％以上のＣＤＪ＋からなっている。

表４および５は本発明の方法を使用した典型的な結果を要約して示す。簡単に言えばＰＢＩＩＣは５ｍＭのＬＭＥ（Ｓｉｇ＋ａａ）で６０分間処理しそして４００　Ｕ／ｍｌのＩＬ２および３１Ｍ　Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で連続的に培養した。培養物は１ａｇ／ｍｌのＩ’Ｈ＾（ｆｅｌｌｃｏｍｅ）か若しくは５：１の応答細胞対刺激細胞比（Ｒ：　Ｓ）の照射口■（＾ＴＣＣ）腫瘍細胞で刺激するかまたは何も用いないかのいずれかであった。

表　４ＰＢＭＣは５ｍＭのＬＭＥの存在下または不存在下で６０分間インキュベートした。細胞は２回洗浄してＬＭＥを除去した。

細胞は血清を有しない３１Ｍ　Ｖ培地中ｌＸ１０６個の細胞／ｍｌの密度および４００　Ｕ／ｉｔのＩＬ２で培養した。マイトジェンは指定の培養物に加えた（Ｐ１１＾＝１μｇ／ｍｌおよびＩＭ９＝　２０％）。細胞を増殖させ、そして種々の時間ポイントでトリバンブルー排除によって計数した。総増加はこれらの細胞数から計算しそして増加倍率として示した。細胞計数を行った日に、新鮮な培地およびＩＬ２を培養物に加え色ｏ−−−−−−−−−−−−−−−−−−−ｍ＝−ｒＬ２　１．００　１．９４　０．８１　４．９９　１０．６７　４．２７ＩＬ２＋ＰＩＩ＾　１．００　５．１８　１４．８１　５４．５２　３０３．１２　３５１．６２ＩＬ２＋ＩＭ９　１．００　２．８０　６．１０　２１．３６　５４．６９　１６．４１ＬＭＥ処理ＩＬ２　１．００　０．５６　１．６８　３．０２　１０．６４　６．３９ＩＬ２＋ＰＩＩ＾　１．００　２．６ｇ　８．３１　２３．９３　９５．７１　１６０．７９ｔＬ２＋ＩＭ９　１．００　１．７４　４．７０　１３．７２　５９．２６　６７．５６表４の培養物は存在するＣＤ”４リンパ球の９６について定期的に試験した。Ｌｅｕ　３ａ　（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）はＣＤ４を特定するために使用しそしてＦＡＣ３ＣＡＮ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）は分析用に使用した。データはＣＤ４　’の％として示す。

ＩＬ２　４４　４１　ＮＤＩＬ２＋ｒ’ｌｌ＾　４４　３１　ＮＤＩＬ２＋ＩＭ９　４４　２　ＮＤＬＭＥ処理ＩＬ２　５７　９５　９２ＩＬ２＋ＰＨ＾　５７　９７　９２ＩＬ２＋ｌｌｌ９　５７　９８　９６細胞増殖（表４）は処理細胞および非処理細胞の両者で類似していた。非処理細胞の１５日口のフェノタイプは非常に変化しＣＤ４陽性細胞の含量が非常に低かった（全て５０％未満）。対照的に、ＬＭＥ処理細胞培養物は全て１５日口のＣＤ４陽性細胞が９０％以上である細胞含量を示し、２１日月末での培養期間中この高いＣＤ４陽性細胞含量値を維持する。

実験はＬＭＥの代わりに０．５ｍＭのＬＬＭＥを使用しても実施した。表６および７はＬＭＥを使用して得られた結果に類似した結果を示す。

表　６ＰＢＭＣは５００μＭのＬＬＭＥの存在下または不存在下で６０分間インキュベートした。細胞は２回洗浄してＬＬＭＥを除去した。細胞は＾ＩＭ　Ｖ培地中で１ｘ１０６／ｍｌの密度および４００Ｕ／ｍｌのＩＬ２で培養した。マイトジェンは指定した培養物に加えた（Ｐ１１＾＝１μｇおよびＩＭ９＝　２０％）。細胞を増殖させ、そして種々の時間ポイントでトリバンブルー排除によって計数した。総増加はこれらの細胞数から計算し、そして増加倍率として示した。細胞計数を行った日に、新鮮な培地およびＩＬ２を培養物に加えた。７番目の培養物はＩＬ２を加えないで行った。この培養物はｐＨ＾（１ｇｇ／ｍｌ）で刺激し、そしてその増殖およびＣＤ４純度（表７）を、ＩＬ２を加えｐＨ＾で刺激した培養物と比較した。

増　殖　全　体日：　０　４　６　８　１１　１４　１８　２１非処理ＩＬ２　１，００１．００１．０４　１．７０　５．９５　３．９３　６．０？　５．２４ＴＬ２＋１１１９　１．００１．００１．２４　２．５３　６．０？　９．７１　３８．８５　１３４．４４ＩＬ２＋ＰＲ＾　１．００２．００４．１２１４．０９７２．７１４７．９９３９５．５２１４４７．６１ＬＬＭＥ処理ＩＬ２　１．００１．０００．３２　０゜２ｇ　１．７８　３．２８　９．８９　１０．０９ｒＬ２＋ＴＭ９　１．００１．０００．７２　１．８２　４．７７　９．１６　４１．９３　１３２．５０ＩＬ２＋ＰＨ＾　１．００１．００１．４１　４．０６１４．２９３９．４５１９８．０５　９３８．７４ＰＩＩＡ　１．００　１．００　１．０８　２．３２　８．０？　１０．９８　３７．１１　２９．６９表６の培養物は存在するＣＤ４“リンパ球の％について定期的に試験した。ＣＤ４を特定するためにＬｅｕ　３ａ　（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用し、そして分析のためにＦＡＣ３ＣＡＭ　（Ｂｅｅｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用した。データはＣＤ４　”の％として示す。

井　土旦　ｌ旦　Ｕ旦　２１８非処理ＩＬ２　４８　５９　４７　３６　４１１Ｌ２＋ｌｌｌ９　４８　４８　３Ｂ　２７　１８ＩＬ２＋ＰＩＩ＾　４８　６７　６３　５０　３７ＬＬＭＥ処理ＩＬ２　５６　９１　９１　９３　９５ＩＬ２＋ＩＭ９　５６　８３　９２　９５　９５ＩＬ２＋ＰＨ＾　５６　９４　９０　Ｂ７　７２ＰＨ＾　５６　９３　９２　９１　８８更に、培養物の１つにはｐＨ＾は加えたが、外来性ＩＬ２は全く加えなかった。急速な増殖が初期には見られた。しかし乍ら、この増殖は培養２週間後には低下したく表６）。

ＣＤ４細胞値はＩＬ２を加えなかった培養物ではｐＨ＾とＩＬ２を有する培養物より幾らか高かった（表７）。か（して、ＩＬ２を添加するとＣＤ４細胞の増殖よりＣＤ８細胞の増殖をより広範囲に促進するように思われた。

表８は、上記したようにして、ＬＭＥで処理した後マイトジェン（ＩＬ２　）前処理しないでまたはマイトジェン（口■またはＰＨＡ　）前処理して、ＩＬＺ中で培養した８人の異なるドナーのＰＢＭＣのフェノタイプを要約して示す。データは培１０月末および約２週間後の培養物中のＣＴ１４およびＣｒ１８細胞のパーセントを示す。一般に、ＬＭＥで処理した培養物のＣＤ４細胞のパーセントは９０％を超える（２４個の培養物のうち２２個）。

表　８ＣＤ４　ＣＤ８　ＣＤ４　ＣＤ８対照　５５　１６　ＩＬ２　ＮＤ　ＮＤＩＭ９　ＮＤ　ＮＤＰＩＩＡ　ＮＤ　ＮＤＬｉｌＥ　６５　１０　ｒＬ２　ＮＤ　ＮＤＩＭ９　９９　２ＰＨＡ　ＮＤ　ＮＤ対照　４２　１６　ＩＬ２　４９　４６ｇＭ９　Ｉｆ　Ｂ７ｐＨ＾　４３６３！」Ｅ　２７　７　ＩＬ２　９１　７ｇＭ９　９０　１１ｐＨ＾　８３２０対照　４４　２０　ＩＬ２　４１　３７ｇＭ９　２　３９ＰＨＡ　３１７５ＬＭＥ　５７　１７　ＩＬ２　９５　３ｇＭ９　９８　２ＰＨＡ　９７３゜対照　５４　１３　ｒＬ２　ＮＯＮｉ１１１１９　ＮＤ　ＮＤｐＨ＾　ＮＤ　ＮＤＬＭＥ　６８　６　ＩＬ２　９６　２ｇＭ９　９９　１ＰＩＩＡ　９９　０ｐＨ＾　ＮＤ　ＮＤＰＩＩＡ　８８　１４ｐＨ＾　ＮＤ　ＮＤＬＭＥ　７２　１０　ＩＬ２　９５　３ＩＭ９　９８　１ｐＨ＾　９８　２ＰＩＩＡ　ＮＤ　ＮＤＰＩＩＡ　ＮＤ　ＮＤＰＩＩＡ　ＮＤ　ＮＤ概　要ＴＭ９　７　５３ＳＴＤ　５　１４ｐＨ＾　３７６９ＳＴＤ　６　６ＳＴＤ　１３　４　ＳＴＤ　２　２ＩＭ９　９７　３ＳＴＤ　３　３ｐＨ＾　９４　７ＳＴＤ　６　８ＣＤ４陽性リンパ球が非常に濃厚化した細胞培養物を取得する方法は、ＣＤ４　 ”腫瘍浸潤リンパ球（Ｔ　Ｔ　Ｌ　）の増加を得ようとする試みで腫瘍調製物に適用された（Ｔｏｐａｌｆａｎら（１９８８）　、Ｊ、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、　６：８３９〜８５３）　、個々の凍結した腫瘍調製物を解凍し、そして４つの試料に分けた。試料には５Ｉｌ１ＭのＬＭＥ処理、０．５ｍ１ｌのＬＬＭＥ処理、５１のフェニルアラニンメチルエステル（ＰＭＥ）処理、または処理しないかのいずれかとした。これらの処理は約１時間実施し、次いで培養物はＡＩＭＶ培地で２回洗浄した。細胞は４０００１１／ｍｌのＩＬ２を有するＡＩＭ　Ｖ培地中に５×１０６個の細胞／　ｔｍ　ｌの濃度で再懸濁し、そして細胞の増加が停止するまで３７℃で培養した。２１日目と２７日目に蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣ３）分析を実施して種々の培養物のフェノタイプを測定した。表９はこの分析の結果を要約して示し、表１０はＴＩＬ培養物の各々の増加を示す、、２１日目と２７日目の両方で、ＬＬＩＩＥ培養物の相対的ＣＤ４細胞含量はＬＬＭＥで処理しなかった培養物と比べて増加している。

■、ＬＭＥ処理培養物と非処理培養物の増殖は同等であった。

表９の実験で、ＬＭＥがＣＤ４＋細胞含量を濃厚にするのに無効であったことは注目される。一般に、ＬＭＥの有効性はＬＩＩＥをＬＬＭＥに変えるのに必要な培養物中の十分な単球値に依存する。

表　９腫瘍細胞は米国癌研究所（ＮＣｒ）から受領し、そして欄準プロトコールによって培養物を調製した。試料は後で使用するため冷凍して液体窒素中で保存した。

これらの試料を解凍し、２回洗浄した。細胞はＡＩＭＶ培地中でＩ　Ｘ　１０７／　ａｌｌとした。４つの分別物を取り、そしてＰＭＥ（５ｄ）　、ＬＭＥ　（５ＬＩＭ）　、　ＬＬＭＥ（５００μＭ）を用いるかまたは用いないで６０分間処理した。処理後、細胞はＡＩＭ　Ｖ培地で２回洗浄し、そしテ４０００　Ｕ／ｌ１ｌ（７）　ＩＬ２を有すルＡＩＭＶ培地中５Ｘ１０５個の細胞／Ｉｌｌで培養した。細胞を増殖させ、そして培養物のフェノタイプはＦＡＣＳ分析によって、０．２１および２７日目に比較した。データはＣＤ４”の％として示す。

！Ｉ　ＯＢ　２１日　２７日対照　２３　１１　５ＰＭＥ　２４　１１　ＢＬＭＥ　２２　４　２ＬＬＭＥ　２３　４０　４ｇ表　ｌｏＭＣｌから受領し種々のアミノ酸メチルエステルで処理した腫瘍細胞は表９で記載したようにして４０００　Ｕ／ｍｌのＩＬ２を有するＡｒｍ　Ｖ培地中で培養した。培養物を増殖させそして増加は細胞を計数して追跡した。

培養　０日　９日　１６日　１９日　３３日対照　７．０　２．９　２２．８　２０．２　１９７．ＯＰＭＥ　７．０　４．４　２６．７　３１．２　１０７．ＯＬＭＥ　４．５　４．３　１２．８　１２．０　３１．５ＬＬＭＥ　５．５　１゜９　１３．０　３０．２　７２０．０本発明の方法は多数のＣＤ４リンパ球の効率的な産生を提供する。本方法は治療および分析用途の両方を有する。

治療的には、ＣＤ４細胞は癌またはＣＤ４細胞欠失または機能欠如に関連した疾病状態、例えばエイズ（ＡＩＤＳ）のような疾病状態の治療に使用することができる。癌ではＴＩＬ調製物由来のＣＤ４細胞は、腫瘍を減少させるのに必要なヘルパー機能をインビボで提供して腫瘍を特異的に攻撃するために免疫調節剤として使用することができる（Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ等（１９８４）、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３２：２１１７〜２１２２）。

末梢血液由来のＣＤ４細胞も腫瘍減少をもたらすのに必要なヘルパー免疫機能を提供するために同様な態様で使用することができよう。

ＴＩＬ由来のＣＤ４　”リンパ球は単独でまたは他の細胞タイプ若しくはエフェクター細胞集団と組合せて使用することができる。ＣＤ４　ＴＩＬ細胞は、標準的なＴＩＬ調製物由来のエフェクター細胞または末梢血液由来のエフェクター細胞と一緒にインビボで投与することができる。末梢血液由来のＣＤ４細胞も癌患者の免疫を調節する試みでＴＩＬ由来ＣＤ４°細胞と共に投与することができよう。ＴＩＬかまたはＰＢＭＣかのいずれかに由来するＣＤ４細胞はインビトロで培養物または自己由来エフェクター細胞に添加してこれらエフェクターの増殖または機能を多分強化することができよう。

エイズのような疾病状態では、多数のＣＤ４陽性リンパ球は患者血液中の枯渇したＣＤ４集団を再構築するための再注入用に患者末梢血液から誘導することができよう。

これを実施するために、患者のＰＢＬは適当な濃度の抗ウィルス剤、例えばＡＺＴで処理してインビトロでのウィルスの複製を阻止しなければならない（Ｐｅｒｎｏ等（１９８８）、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、１６８：１１１１〜１１２５）　、可溶性の組換え体ＣＤ４（ｒ−ＣＤ４）もインビトロでの新しい細胞の感染を防ぐために使用することができよう（Ｆｉｓｈｅｒ等（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ。

３３１ニア６〜７８）。培養する前に感染細胞を除去するためにトキシンと抱合した可溶性ｒ　−ＣＤ４を使用することが可能である。

本発明者は、ＡＺＴの存在が本発明方法を使用するＣＤ４細胞産生能を妨害するかどうかを試験した。表ＩＩは、５ｍＭのＬＭＥで処理し、目■腫瘍細胞で刺激し、そして続いて４００　Ｕ／ｍｌのｒ−ＩＬ２を有する＾Ｉｌｌ　Ｖ培地で培養したＰＢＭＣの培養物にＡＺＴを添加した結果を示す。ＡＺＴは種々の濃度で培養物に加え、そして培養期間中維持した。ＡＺＴは成る程度これら細胞の増殖を阻止することが見られた。しかしながら、有効濃度のＡＺＴ（０，１１ａｇ／ｍｌ）では増殖は未だ顕著（１００倍の膨張）である。表１２で示されるように、ＡＺＴはこれらの培養物中のＣＤ４細胞含量の相対値は低下させなかった。

表　１１ＰＢＭＣは５ｍＭのＬＭＥで６０分間処理した。細胞は、４００　Ｕ／ｍｌのＩＬ２を有する＾ＩＮ　Ｖ培地中ｌＸｌ０６個の細胞／ｍｌの密度で培養した。培養物は増加を誘発させるために２０％の１Ｍ９で刺激した。培養物には種々の量のＡＺＴ　（１，０，１，０、ＯｌおよびＯμｇ／ａｌ）を加えた。細胞を増殖させ、増加を追跡し、そして増加倍率として示した。

＾ＺＴＣ１ｌ　ｇ／ｍ１）０　１．００　１．００　２．９６　８．５８　２０．６０　９７．２４　２６０．６０．０１　１．００　１．００　２．４０　５．５２　１５．７９　６０．９４　１４６．２５．１　１．００　１．００　２．００　５．００　１６．６０　４４．８２　１０７．５７１　１．００　１．００　１．７４　４．８７　１１．１１　３７．７７　６７．９８表１１の培養物は１５日月末存在するＣＤ４”リンパ球９６とＣＤ８＋リンパ球％を試験した。ＣＤ４を特定するためにＬｅｕ　３ａ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用し、ＣＤ８を特定するためにＬｅｕ　２ｂ　（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用し、そして分析するためにＦＡＣＳＣＡＮ　（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用した。データはＬｅｕ　３＋の％およびＬｅｕ　２＋の％として示す。

ＡＺＴ　１ａｇ／ｍｌ　９９　０ＡＺＴ　Ｏ，Ｉｇ　ｇ／ｍｌ　１００　０＾ＺＴ　Ｏ，０１４ｇ／ｍｌ　９８　１上記のようにしてＩＩ　Ｉ　Ｖ患者から増殖した細胞は患者に再注入するかまたはＩＩ　Ｉ　Ｖ決定基に対する細胞応答を試験するインビトロの診断手段として使用することができよう。これらの細胞にＩＩ　Ｉ　Ｖエンベロープタンパク質　ｇｐ１２０を負荷させることによって、該細胞は細胞侵害性アッセイ　（’ Ｌｙｅｒｌｙ等（１９８７）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１．　＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ＾、４：４６０１〜４６０５）での標的かまたはｇｐ１２０に対する特異的応答を試験する刺激剤かのいずれかとして使用することができよう。

本方法が治療利益を提供し得る他の疾患状態には多発性硬化症（Ｃｈｏｆｆｌｏｎ等（１９８８）　、＾ｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ。

２４：１°８５〜１９１）、慢性滑膜炎（Ｋｊｎｇｓｌｅｙ等（１９８１１１）、５ｃａｎｄ。

Ｊ、　ｏｆ　Ｉｗｈｍｕｒｓｏｌ、、２８：２２５〜２３２）、全身性エリテマトーデス（Ｒａｚｉｕｄｄｉｎ等（１９８ｇ）、Ｃｌ１ｎ、　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒ、　Ｔｍｍｕｎｏｌ、、７２：４４６〜４４９）およびＣＤ４欠失に関連した他の疾患状態がある。

多数のＣＤ４”リンパ球を産生させる能力はインビトロでの抗体産生に有益であろう。ＣＤ４”Ｔ細胞は本願方法で産生させることができ、そして抗体を産生させる試みで抗原に対してインビトロで感作したビト牌細胞培養物に加えることができよう（Ｉｌｏ、　Ｄｕ　Ｐｏｎｔの特許出願米国特許出願７３６．６６０）。この技術は多数のヒト抗体をインビトロで産生させる可能性を発展させる助けとなろう。

国際調査報告Ｉ−ｍ−ａ＋１−ｎｔａｐｍ、ａ□ａ−ｍ　ＰＣＴ／ＵＳ　９０１００６１１＋１１１噂ト＋ＩＩａｌ晴１１１−噛ム−１１１＋ｔｌｌ＋４１１Ｎ・ｎｒｗＩｕｅＱｎ／Ｉ’ｌｌ’ｌに１１国際調査報告Ｌ　ｍｙ　：ｌ＠−＃Ｉ’：ｔａｌＪｌ＋ｔｍ割；＝＝＝ニフ：７５ａｌｓｄ　ｉ“−一１ｍＷ２”Ｗ”°−゛−”７７ｈｅ　ｉｗ−−１８７ｍ１ｍ　ｂ　ＩＩＩ　＋ｗ　ｗｓｙ　ｊ＋１１−１＃　ｕｗ＋ｅｍ’＋＋ｃｗ＋ｘ　ｄ　Ｉｆｆ　ｌｌｌ’１ｍＶ　|ｗ　１ｙ−ｅｌｌ−・−を内・−一帆

Claims

【特許請求の範囲】１）（ａ）末梢血液単核細胞をジペプチドアルキルエステルまたはアミノ酸アルキルエステルで処理して単球および大顆粒リンパ球を枯渇させ、次いで非ＣＤ４＋リンパ球の陽性選択または親和除去をしないで、（ｂ）Ｔ細胞刺激剤若しくはインターロイキン−２またはそれらの両者を含有する培地中で上記末梢血液単核細胞を培養する、ことからなる、少なくとも９０％のＣＤ４＋リンパ球を含有するリンパ球集団を生じさせそして増殖させる方法。２）上記ジペプチドアルキルエステルがＬ−ロイシルーロイシンメチルエステルでありそして上記アミノ酸アルキルエステルがＬ−ロイシンメチルエステルである請求項１）に記載の方法。３）段階（ｂ）において、上記細胞を、Ｔ細胞刺激剤に加えてインターロイキン −２を含有する培地中で培養する請求項１）または２）に記載の方法。４）ＣＤ４＋細胞を約１０から１０００倍増殖させる請求項１）または２）に記載の方法。５）ＣＤ４＋細胞を少なくとも５０倍増殖させる請求項３）に記載の方法。６）患者から末梢血液単核細胞を取得し、そして請求項１）に記載の方法によって処理して濃厚なＣＤ４＋リンパ球細胞集団を提供し、そしてこの濃厚なＣＤ４＋リンパ球細胞集団を患者に戻すことを特徴とする、ＣＤ４＋リンパ球欠損によって特徴づけられる疾病を有する患者の治療方法。７）上記患者がウイルスに感染しておりそして上記細胞を段階（ｂ）においてウイルス複製および／または結合を阻止するのに有効な濃度の抗ウイルス剤の存在下で培養する請求項６）に記載の方法。８）上記患者がヒト免疫不全ウイルスに感染している請求項７）に記載の方法。９）上記細胞を段階（ｂ）においてアジドチミジンの存在下で培養する請求項８）に記載の方法。１０）上記細胞を段階（ｂ）において可溶性の組換え体ＣＤ４の存在下で培養する請求項８）に記載の方法。１１）（ａ）腫瘍浸潤リンパ球をジペプチドアルキルエステルまたはアミノ酸アルキルエステルで処理して単球および大顆粒リンパ球を枯渇させ、次いで非−ＣＤ４＋リンパ球の陽性選択または親和除去をしないで、（ｂ）Ｔ細胞刺激剤およびインターロイキン−２を含有する培地中で上記腫瘍浸潤リンパ球を培養する、ことからなる、ＣＤ４＋リンパ球が濃厚化した腫瘍浸潤リンパ球集団を生じさせそして増殖させる方法。１２）上記ジペプチドアルキルエステルがＬ−ロイシルーロイシンメチルエステルでありそして上記アミノ酸アルキルエステルがＬ−ロイシンメチルエステルである請求項１１）に記載の方法。１３）上記の得られた腫瘍浸潤リンパ球集団が少なくとも４６％のＣＤ４＋リンパ球を含有する請求項１１）に記載の方法。１４）癌患者を治療する方法であって、その際該患者から腫瘍浸潤リンパ球を取得し、そして請求項１１）に記載の方法によって処理して濃厚ＣＤ４＋リンパ球細胞集団を提供し、そして該濃厚ＣＤ４＋リンパ球細胞を単独でまたは上記患者から得られ請求項１１）に記載の方法によって処理しなかったリンパ球と粗合わせて上記患者に戻すことからなる、癌患者の治療方法。１５）少なくとも９０％がＣＤ４＋リンパ球であるヒトリンパ球、およびインターロイキン−２の水性懸濁液からなる組成物。１６）上記リンパ球が末梢血液リンパ球である請求項１５）に記載の組成物。１７）ウイルスに感染した患者から末梢血液単核細胞を取得し、そして請求項１）に記載の方法によって処理してウイルス感染細胞を含有する濃厚ＣＤ４＋リンパ球細胞集団を提供し、次いで上記ウイルスを上記細胞集団から単離することからなる、ヒト免疫不全ウイルスの産生方法。１８）末梢血液単核細胞を請求項１）に記載の方法によって処理して、存在する場合には、ウイルス感染細胞を含有する濃厚ＣＤ４＋リンパ球細胞集団を提供し、次いで該ウイルスの存在について上記細胞をアッセイすることからなる、末梢血液単核細胞中のヒト免疫不全ウイウイルスの検出方法。１９）上記細胞をハイブリダイゼーション・アッセイまたはイムノアッセイによって上記ウイルスの存在をアッセイする請求項１８）に記載の方法。２０）ヒト免疫不全ウイルス感染者から末梢血液単核細胞を取得し、該細胞を請求項１）に記載の方法によって処理し、次いで上記ウイルスのエンベロープ外部グリコプロテインを加えて上記標的細胞を産生させることからなる、ヒト免疫不全ウイルス感染者における細胞侵害性エフェクター細胞の存在を測定するアッセイに使用する自己由来標的細胞を産生させる方法。