JP4435985B2 - ＴｃＲγδＴ細胞の生産方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の分野】
本発明はｅｘ ｖｉｖｏでＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を増すための新規な培養方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞は循環性Ｔリンパ球中の小サブセットであって、古典的クラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）拘束的に、異物ペプチド抗原を精密な特異性で認識する従来のＴｃＲαβ^＋Ｔ細胞とは異なる。ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞は、ウィルスによる感染やトランスフォーメーションなどのストレスによって誘発される内因性細胞生成物に由来するか、または外来微生物に由来する、ペプチド性抗原と非ペプチド性抗原の双方を認識することができる。その上、ＴｃＲαβ^＋Ｔ細胞による抗原認識と異なり、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞による抗原認識はＭＨＣによって拘束されない。
【０００３】
ＴｃＲαβ^＋ およびＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞のＴ細胞受容体は、それらをコードする異なる遺伝子エレメントによって識別される。大部分のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞は、そのδ鎖をコードする遺伝子に基いて、２種の主要なサブセット、Ｖδ１^＋およびＶδ２^＋に分類される。ヒト末梢血中のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の主要サブセットはＶγ９と共にＶδ２を発現するが、その他の多くのものはＶγ２、Ｖγ３、Ｖγ４、Ｖγ５またはＶγ８と共にＶδ１を発現する（Ｓａｌｅｒｎｏ，Ａ．とＤｉｅｌｉ，Ｆ．，１９９８年）。
【０００４】
ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞はＴｃＲαβ^＋Ｔ細胞が有する精密な特異性を欠いていることから、これらが感染や腫瘍に対する最前線の監視機能をになっている、より原始的な免疫機構であるという考えが出されている（Ｂｏｉｓｍｅｎｕ，Ｒ．等、１９９７年）。幾つかの研究で、様々なウィルス、細菌および寄生体に対するＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の反応（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｆ．等、１９９４年；Ｗａｌｌａｃｅ，Ｍ．等、１９９５年；Ｌａｎｇ，Ｆ．等、１９９５年；Ｅｌｌｏｓｏ，Ｍ．Ｍ．等、１９９６年）および、これらの細胞が様々な起源の腫瘍細胞の溶解を引き起こす能力を持つこと（Ｚｏｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．等、１９９０年；Ｋｉｔａｙａｍａ，Ｊ．等；１９９３年；Ｃｈｏｕｄｈａｒｙ，Ａ．等、１９９５年）が記録されている。Ｖγ１．１トランスジーンを発現するトランスジェニックマウスは注入されたＴ細胞白血病に対し自発的な抵抗性を示し、これらのマウスから誘導されたＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞ハイブリドーマは非造血性腫瘍細胞より造血性悪性細胞に選択的に反応する（Ｐｅｎｎｉｎｇｅｒ，Ｊ．等、１９９５）ことから、造血性腫瘍はＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞による溶解作用を特に受け易いようである。加えて、急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄白血病の患者の末梢血および骨髄に由来するヒトＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞クローンは、自家白血病細胞をそれぞれ溶解することが示された（Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ，Ａ．等、１９８９；Ｊａｈｎ，Ｂ．等、１９９５年）。更に、同種骨髄移植後の白血病患者の無病生存期間の伸長は、末梢血中のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の数や割合の増加と関連があることが示されている（Ｌａｍｂ，Ｌ．Ｓ．等、１９９６年）。まとめると、これらの結果からＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞が癌や感染症の治療において潜在的な治療能力を有することが示唆される。
【０００５】
ヒトＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの拡大増殖について報告されている方法の多くは、抗原の存在を必要としている。確立された腫瘍細胞系と同様に、ウィルス感染細胞やトランスフォーム細胞や細胞系、細菌、寄生体がＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖を刺激することが示されている。例えば、ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘウィルス（ＨＳＶ）感染細胞がＶδ２^＋細胞の増殖を刺激するために使用されており（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｆ．等、１９９４年）、またＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス（ＥＢＶ）でトランスフォームされたＢリンパ芽球様細胞系がＶδ１^＋細胞の拡大増殖を刺激するために使用されている（Ｏｒｓｉｎｉ，Ｄ．Ｌ．Ｍ．等、１９９３年）。結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の抽出物および血中期のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのマラリア抗原が、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の増殖を刺激することが示されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｐ．等、１９９４年；Ｅｌｌｏｓｏ，Ｍ．Ｍ．等、１９９６年）。不死化ヒトバーキットリンパ腫細胞系であるＤａｕｄｉもＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の増殖を刺激することができる（Ｋａｕｒ，Ｉ．等、１９９３年）。その上、性質のよくわかっているプレニルリン酸系の非ペプチド性抗原、例えばイソペンテニリルピロリン酸が、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの拡大増殖を刺激することが示された（Ｇａｒｃｉａ，Ｖ．Ｅ．等、１９９８年）。これらの系のいくつかでは、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の抗原刺激培養にＩＬ−２、ＩＬ−４または他のサイトカインが添加されている。
【０００６】
ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞は次のような方法で腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）の集団からもｅｘ ｖｉｖｏで拡大増殖されている。ＩＬ−２と一緒に培養する（Ｚｏｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．等、１９９０年）；固定化抗ＣＤ３抗体とＩＬ−２を併用する（Ｋｉｔａｙａｍａ，Ｊ．等、１９９３年）；抗ＴｃＲγδ抗体と一緒に培養する（Ｙｕ，Ｓ．等、１９９９年）；などである。これらの系では、癌組織からＴ細胞を単離する前にすでに、腫瘍抗原によるＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の選択的刺激がｉｎ ｖｉｖｏで起こっていると推定される。
【０００７】
別の系では、グリオブラストーマ患者の末梢血からＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を拡大増殖させるのに、まず固相の固定化抗ＣＤ３抗体とＩＬ−２とを組み合わせて用いた後、ＩＬ−２だけで培養している（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．等、１９９７年）。この著者等は、それから精製されたＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞はＩＬ−２だけが存在する条件下で１週間以上増殖を続けることができなかったと報告し、したがってこの方法は短期の研究にしか適用できないだろうと結論している。彼等は更に、その方法ではＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞とＴｃＲαβ^＋Ｔ細胞双方の拡大増殖と富化が起こり、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の純度は２８％程度であることを示した。その後の報告で、同じ著者等は、この方法が選択的にＶδ２^＋サブセットを拡大増殖させることを示した（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．等、１９９９年）。
【０００８】
したがって、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで培養し拡大増殖させるための現行の方法では、細胞増殖に限界があり、および／または抗原刺激が必要である。更に、多くの報文がＶδ２^＋サブセットの増殖を報告しているが、Ｖδ１^＋サブセットの増殖を報告している報文はほとんどなく、単一の培養でＶδ１^＋およびＶδ２^＋Ｔ細胞サブセット双方の増殖を報告している報文は全くない。
【０００９】
以上を考えると、ＴｃＲγδ^＋細胞を多量にｉｎ ｖｉｔｒｏで選択的に培養する方法が当分野で必要とされている。
【００１０】
【発明の概要】
本発明は、外因性抗原の不在下の培養でＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を拡大増殖させる新規な方法を提供する。したがって、本発明は
（１）Ｔ細胞マイトジェンおよび少なくとも２種のサイトカインを含む第１の培地中で、出発試料中の細胞を培養すること、および
（２）ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を拡大増殖させるために、少なくとも２種のサイトカインを含む第２の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を培養すること、とを特徴とする、出発試料中のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供する。
【００１１】
実施形態の１つでは、本発明は
（１）（ａ）Ｔ細胞マイトジェン、（ｂ）インターロイキン−２および（ｃ）インターロイキン−４を含む第１の培地中で、出発試料中の細胞を培養し、
（２）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含む第２の培地中で、（１）で得られた細胞を培養することによって、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を拡大増殖させること
を特徴とする、出発試料中のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供する。
【００１２】
他の実施形態では、本発明は
（１）出発試料から低密度単核細胞（ＬＤＭＮＣ）を得て、
（２）（ａ）Ｔ細胞マイトジェン、（ｂ）インターロイキン−２および（ｃ）インターロイキン−４を含む第１の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を培養し、
（３）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含む第２の培地中で、ステップ（２）で得られた細胞を培養することによって、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を拡大増殖させる、
事を特徴とする、出発試料中のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供する。
【００１３】
好ましい実施形態では、第１の培地中で細胞を培養する前に、細胞から非ＣＤ４^＋細胞または非ＴｃＲγδ^＋細胞を除去しておく。
【００１４】
他の実施形態では、本発明は
（１）白血球馴らし培地（コンディションドメディウム)からなる第１の培地中で、出発試料中の細胞を培養すること、および
（２）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含む第２の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を培養することによって、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を拡大増殖させること、
を特徴とする出発試料中のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供する。
【００１５】
更に他の実施形態では、本発明は
（１）出発試料から低密度単核細胞（ＬＤＭＮＣ）を得ることと、
（２）白血球馴らし培地からなる第１の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を培養することと、
（３）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含む第２の培地中で、ステップ（２）で得られた細胞を培養することによって、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を拡大増殖させること、
を特徴とする出発試料中のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供する。
【００１６】
本方法により得られるＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を実験的、治療的および商業的な様々な用途に使用することができる。
【００１７】
本発明のその他の特徴および利点は、次の詳細な説明から明らかとなろう。しかし、本発明の精神および範囲の中での様々な変更や改変は、当分野の技術者には詳細な記述から明らかになると思われるので、この詳細な記述および本発明の好ましい実施形態を示す個々の実施例は例示だけのために提示されていると理解すべきである。
【００１８】
図を参照しながら本発明を以下に説明する。
本発明は、培養中にＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を選択的に拡大増殖させる新規な方法を提供する。本法は未分画出発試料またはＴ細胞の富化された出発試料のいずれをも使用することができる。本発明の方法の利点は、他の方法のほとんどが必要とする抗原刺激の使用を必要としないことである。
【００１９】
したがって、本発明は
（１）Ｔ細胞マイトジェンおよび少なくとも２種のサイトカインを含む第１の培地中で、出発試料中の細胞を培養すること、および
（２）少なくとも２種のサイトカインを含む第２の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を培養することによって、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を拡大増殖させること、
を特徴とする、出発試料中のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供する。
【００２０】
第１および第２の培地中の２種のサイトカインは、同一であつても異なっていてもよい。２種のサイトカインは培地間で同一であることが好ましく、２種のサイトカインがインターロイキン−２およびインターロイキン−４であることがより好ましい。
【００２１】
本発明は、一態様として、
（１）（ａ）Ｔ細胞マイトジェン、（ｂ）インターロイキン−２および（ｃ）インターロイキン−４を含む第１の培地中で、出発試料中の細胞を培養すること、および
（２）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含む第２の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を培養することによって、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を拡大増殖させること
を特徴とする、出発試料中のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供する。
【００２２】
出発試料はＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞またはその前駆体を含有する任意の試料であってよく、血液、骨髄、リンパ組織、上皮、胸腺、肝臓、ひ臓、癌組織、リンパ節組織、感染組織、胎児組織およびそれらの分画物または富化部分などがあるが、特に限定されない。好ましくは出発試料は、軟膜(buffy coat)細胞、単核細胞および低密度単核細胞（ＬＤＭＮＣ）を含んでいる末梢血または臍帯血などの血液またはその分画物などである。細胞は、密度勾配遠心分離などの当分野で公知の技術を用いて、出発血液試料から得られる。例えば、全血を等体積のＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ^ＴＭ上に重層後、室温で３０分間４００×ｇで遠心分離する。界面にくるものには低密度単核細胞が含れると予想され、この細胞を集めて、培地で洗浄し、室温で１０分間１００×ｇで遠心分離することができる。ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を得るために培養する前は、細胞はＡＩＭ−Ｖ^ＴＭ、ＲＰＭＩ１６４０またはＩＭＤＭなどの任意の適当な哺乳類用培地中に維持することができる。
【００２３】
出発試料またはその分画物（ＬＤＭＮＣなど）を第１の培地中で培養する前に、出発試料またはその分画物を一定の細胞型について富化し、および／または他の細胞型を除去してもよい。特に、出発試料またはその分画物をＣＤ４^＋細胞について富化してもよいし、またはＴｃＲαβ^＋Ｔ細胞を除去してＴ細胞を富化してもよい。試料は当分野で公知の技術を用いて、ある細胞型を富化または除去することができる。一実施形態では、出発試料またはその分画物を、除去する細胞上のマーカーに特異的な抗体を含有する抗体カクテルと共に培養することによつて、特定の表現型の細胞を除去してもよい。カクテル中の抗体は、Ｌａｎｄｓｄｏｒｐに与えられた米国特許第４８６８１０９号に記載のような四量体抗体複合体であることが好ましい。
【００２４】
必要に応じて出発試料中の細胞を分画し、富化したならば、Ｔ細胞マイトジェンおよび少なくとも２種のサイトカイン、好ましくはインターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）を含む第１の培地中で細胞を培養する。Ｔ細胞マイトジェンは約０．０１から約１００μｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−２は約０．１から約１０００ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４は約０．１から約１０００ｎｇ／ｍｌの量で存在することが好ましい。Ｔ細胞マイトジェンが約０．１から約５０μｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−２が約１から約１００ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４が約１から約１００ｎｇ／ｍｌの量で存在することがより好ましい。Ｔ細胞マイトジェンが約０．５から約１０μｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−２が約２から約５０ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４が約２から約５０ｎｇ／ｍｌの量で存在することがより一層好ましい。第１培地がＴ細胞マイトジェンを１μｇ／ｍｌ、ＩＬ−２を１０ｎｇ／ｍｌおよびＩＬ−４を１０ｎｇ／ｍｌ含むことが最も好ましい。
【００２５】
細胞は第１培地中で約３日から２１日間培養することが好ましく、約５日から１４日間培養することがより好ましい。
【００２６】
Ｔ細胞マイトジェンは、植物起源および非植物起源のレクチン、Ｔ細胞を活性化させるモノクローナル抗体、および他の非レクチン／非抗体マイトジェンを含むがそれに限定されずに、Ｔ細胞を刺激することのできる任意の物質であってよい。好ましいレクチンはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）であるが、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などの他の植物レクチンが使用されてもよい。好ましい抗体はＯＫＴ３などの抗ＣＤ３抗体である。他のマイトジェンは、ホルボール１２−ミリステート−１３−アセテート（ＴＰＡ）とその関連化合物、メゼレイン、スタフィロコッカスのエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）およびストレプトコッカスのプロテインＡを含む。Ｔ細胞マイトジェンは、可溶形態で、例えば、培地に溶かしてから添加するのが好ましい。
【００２７】
第１の培地中で培養した後、細胞を遠心によって洗浄し、少なくとも２種のサイトカイン、好ましくはインターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）を含む第２の培地中で二次培養する。第２の培地中では、ＩＬ−２とＩＬ−４の両物質が細胞を最大限に拡大増殖させるのに必要である。細胞をＩＬ−２だけで二次培養すると、拡大増殖は２〜３日間連続するが、その後速やかに衰える。また、細胞をＩＬ−４だけで二次培養すると、連続的な拡大増殖はさらに少ない。したがって、マイトジェンを除去した後連続的に細胞増殖させるためには、第２の培地中にＩＬ−２とＩＬ−４が共に存在することが必須である。
【００２８】
二次培養のステップは、出発試料またはＬＤＭＮＣが第１の培地中での培養前に分画されていない場合には特に、本発明の方法によるＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の拡大増殖にとって重要である。ＬＤＭＮＣを分画した場合は二次培養のステップは任意選択となる。ＬＤＭＮＣを（ＩＬ−２／ＩＬ−４中で二次培養せずに）ｃｏｎＡ／ＩＬ−２／ＩＬ−４中で連続的に培養した場合は、ＴｃＲαβ^＋Ｔ細胞だけが拡大増殖するであろう（実施例４参照）。ＩＬ−２／ＩＬ−４中で（即ち、Ｔ細胞マイトジェンのｃｏｎＡを除去して）二次培養すると、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の拡大増殖が起こる。逆にｃｏｎＡを第１の培地から除いた場合、細胞の拡大増殖は全く起こらない。残存コンカナバリンＡが患者に投与されることは望ましくないので、二次培養によってｃｏｎＡを除去することには、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞が治療用途に一層ふさわしくなるというさらなる利点がある。ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞が実験、診断または他の非治療の用途向けならば、二次培養の段階でのＴ細胞マイトジェンの除去は不要かもしれない。
【００２９】
第２の培地中に、ＩＬ−２が約０．１から約１０００ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４が約０．１から約１０００ｎｇ／ｍｌの量で存在することが好ましい。ＩＬ−２が約１から約１００ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４が約１から約１００ｎｇ／ｍｌの量で存在することがより好ましい。ＩＬ−２が約２から約５０ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４が約２から約５０ｎｇ／ｍｌの量で存在することがより一層好ましい。第２の培地がＩＬ−２を１０ｎｇ／ｍｌおよびＩＬ−４を１０ｎｇ／ｍｌ含むことが最も好ましい。
【００３０】
ＬＤＭＮＣを第２の培地中で約３日から約２１日にわたり培養することが好ましく、約９日から約１３日にわたり培養することがより好ましい。
【００３１】
第１および第２の培地は、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の生育と拡大増殖を補助し得る他の成分を追加として含んでもよい。添加してもよい他の成分の例は、血清または血漿、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターフェロン（ＩＦＮ）、アルブミンなどの精製蛋白質、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）などの脂質源、ビタミン、アミノ酸、ステロイドおよび成長および／または生存を支持、促進する任意の他の補助物質を含むが、このようなものに限定されるわけではない。
【００３２】
第１および第２の培地には、共に血清または血漿（Ｐ）を添加しておくことが好ましい。第１および第２培地中のＰ量は、約１％から約２５％であることが好ましい。第１および第２培地中のＰ量は、約２％から約２０％であることがより好ましい。第１および第２培地中のＰ量は、約２．５％から約１０％であることがより一層好ましい。第１および第２培地中のＰ量は、５％であることが最も好ましい。血清または血漿（Ｐ）は、ヒト末梢血、臍帯血、または他の哺乳動物種由来の血液などの、任意の供給源から得ることができるが、これらに限定されない。血漿は１人のドナーから得たものでも、数人のドナーからまとめたものでもよい。自家ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を臨床的に使用する、即ち、出発試料を得た同じ患者に再注入しようとする場合、異物（例えばウィルス）がその患者に導入されることを避けるために、Ｐも自家性の（即ち、同じ患者由来の）Ｐを使用することが好ましい。ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を同種間で使用しようとする（即ち、出発試料を得た人と異なる人に注入する）場合、異物がその患者に導入されるのを最小限に抑えるために、どちらか一方から得た血漿を使用することが好ましい。動物生成物の患者への投与を避けるために、最低でもその血漿はヒト由来のものとすべきである。
【００３３】
本発明の他の態様では、第１の培地中のＴ細胞マイトジェンおよび少なくとも２種のサイトカインは、ＸＬＣＭなどの白血球馴らし培地から由来するものであってもよい。ＸＬＣＭ^ＴＭは、実施例１に記載されるような、臍帯血から調製される馴らし培地であり、Ｔ細胞マイトジェン（ＣｏｎＡ）および数種のサイトカインを含有する。ＸＬＣＭはごく僅かのＩＬ−２およびほとんど検出できないＩＬ−４を含有する。
【００３４】
したがって、本発明は、
（１）白血球馴らし培地を含む第１の培地中で、出発試料中の細胞を培養すること、および
（２）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含む第２の培地中で、（１）で得られた細胞を培養することによって、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を拡大増殖させること、
とを特徴とする、出発試料中のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を拡大増殖させる方法を提供する。
【００３５】
ステップ（１）で出発試料中の細胞群を培養する前に、前記のようにＴ細胞を富化しておくことが好ましい。
好ましい実施形態では、白血球馴らし培地はＸＬＣＭである。ＸＬＣＭは、約１％から約２５％の量で第１の培地中に存在するのが好ましい。ＸＬＣＭは、約２％から約２０％の量で第１の培地中に存在するのがより好ましい。ＸＬＣＭは、約２．５％から約１０％の量で第１の培地中に存在するのがより一層好ましい。第１の培地が５％のＸＬＣＭを含有するのが最も好ましい。第２の培地中のＩＬ−２およびＩＬ−４は、前記の通りであることが好ましい。第１および第２の培地は、前記のように血清または血漿を含有することが好ましい。
【００３６】
本発明の方法はＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の拡大増殖細胞集団を生じる。「拡大増殖」とは、最終調製品中の所望または標的の細胞型（即ち、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞）の数が、開始時の、すなわち出発細胞集団中の数より多いことを意味する。
【００３７】
本発明の方法により得られるＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を、蛍光活性化細胞選別、免疫磁気分離、アフィニティーカラムクロマトグラフィ、密度勾配遠心分離および細胞パニング(panning)を含む当分野で公知の技術を用いて、最終培養物中に存在する他の細胞から分離することができる。
【００３８】
本発明には、本発明の方法によって得られるＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞が含まれる。したがって、本発明はＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の細胞調製品を提供する。ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞は、富化した集団中の全細胞の好ましくは６０％超、より好ましくは８０％超、最も好ましくは９０％超を含む。
【００３９】
従来技術の方法とは異なり、Ｖδ１^＋とＶδ２^＋ の両方のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞が本発明の方法によって増大する。したがって、本発明はＶδ１^＋ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞とＶδ２^＋ ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を含むＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の細胞調製品を提供する。細胞調製品は、調製品中の全ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の内、約５０〜９０％のＶδ１^＋ ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞および約１０〜５０％のＶδ２^＋ ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を含むことが好ましい。細胞調製品は、調製品中の全ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の内、約７０％のＶδ１^＋ ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞および約３０％のＶδ２^＋ ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を含むことがより好ましい。本発明のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞調製品は、Ｔ細胞マイトジェンを含まないか、実質的に含まないという利点がある。
【００４０】
本発明は、本発明の方法によって得られるＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の、任意のあらゆる用途における使用も含む。ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞は、感染性病原体に対する防御における第一線と考えられている。その上、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞は、Ｂ細胞リンパ腫、肉腫および癌腫を含む様々な起源のトランスフォーム細胞に対して、固有の細胞溶解活性を有する。その結果、本発明の方法により得られ、ｅｘ ｖｉｖｏで培養されたＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞は、感染症、癌または免疫抑制から生じる疾患の治療や予防のために、患者に注入することができる。本発明のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞にはＣｏｎＡやウシ胎児血清が含まれないので、ヒトの治療用途に有用であることは利点である。したがって、本発明は、本発明の方法によって調製した有効量のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞をそれを必要とする動物に投与することを含む、免疫反応を調節する方法を提供する。
【００４１】
本明細書で使用する「有効量」という用語は、所望の結果を得るのに必要な投与量と期間において効果のある量を意味する。
【００４２】
本明細書で使用する「動物」という用語は、動物界の全ての種を含む。好ましくは、動物は哺乳類、もっと好ましくはヒトである。
【００４３】
本発明は、実施形態の１つとして、本発明の方法で調製した有効量のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞をそれを必要とする動物に投与することを含む、感染症を治療する方法を提供する。
【００４４】
治療される感染症の例は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａによって起こされるもの（例えば結核）などの細菌感染症、ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘウィルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、または肝炎ウィルスによって起こされるものなどのウィルス感染症、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍによって起こされるもの（例えばマラリア）などの寄生体感染症を含むが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明は、別の実施形態として、本発明の方法で調製した有効量のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞をそれを必要とする動物に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。
【００４６】
本発明によって治療される癌の例は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、およびＴ細胞白血病とＢ細胞白血病を含む白血病、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、リンパ増殖性疾患、プラズマ細胞腫、組織球腫、黒色腫、アデノーマ、肉腫、充実組織の癌腫、低酸素性腫瘍、扁平上皮癌、子宮頚部癌や膀胱癌などの泌尿生殖器癌、造血癌、頭部癌と頚部癌、および神経系癌を含むが、これらに限定されない。
【００４７】
好ましい実施形態の１つで本発明は、本発明の方法によって調製した有効量のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞をそれを必要とする動物に投与することを含む、慢性骨髄性白血病を治療する方法を提供する。このような実施形態では、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者からＬＤＭＮＣを得ることができる。ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を得るために培養し増大させた後は、単離される細胞はＣＭＬ癌細胞を含まないので、その患者に再輸血するのに好適である。
【００４８】
本発明には、前記のように免疫反応を調節し、感染症を治療し、または癌を治療するために、本発明の方法によって得られるＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を使用することも含まれる。本発明は更に、前記のように免疫反応を調節し、感染症を治療し、または癌を治療するための医薬または製剤組成物を調製するための、本発明の方法によって得られるＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の使用も含む。
【００４９】
本発明に従って単離されるＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を、例えばその細胞の機能を更に研究し、解明するために、実験モデルにおいて使用することもできる。その上、これらの細胞を、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞によって認識される抗原／エピトープの同定を目標とした研究、およびワクチンの設計と開発のために使用してもよい。
【００５０】
本発明に従って単離されるＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を、上記の治療、実験または商業の用途に直ちに使用してもよいし、あるいは、後日使用するためにその細胞を凍結保存してもよい。
【００５１】
以下の非限定的実施例は、本発明を例示するものである。
【００５２】
【実施例】
以下の方法は、抗原や補助細胞の不在下、液体培養中でのＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の大規模なｅｘ ｖｉｖｏでの拡大増殖に関する。出発材料はヒト末梢血から採取した低密度単核細胞（ＬＤＭＮＣ）からなる。ＬＤＭＮＣは、
（１）ＣＤ４＋Ｔ細胞の富化、または
（２）ＴｃＲαβ^＋Ｔ細胞の除去を伴ったＴ細胞の富化、によって更に分画してもよいし、あるいは
（３）それ以上分画しなくてもよい。その細胞を、ＸＬＣＭ、ヒト血清または血漿（Ｐ）、コンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）の組合せを含有する培地中で培養するのが好ましい。頻繁に細胞をカウントし、新鮮培地、およびＸＬＣＭ、Ｐ、ｃｏｎＡ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の組合せと共に再植種する。特定の表面マーカーを発現する細胞のパーセントを、特異抗体およびフローサイトメトリーを用いて決定する。
【００５３】
実施例１
ＣＤ４ｅ：ＸＬＣＭ／Ｐ⇒ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞
低密度単核細胞（ＬＤＭＮＣ）を成人末梢血からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（密度＝１．０７７ｇ／ｍｌ）を用いた密度勾配遠心分離によって単離した。体積１５ｍｌの全血を、５０ｍｌの組織培養コニカルチューブ中で等体積のＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ上に重層し、次いで室温で３０分間４００×ｇで遠心分離した。単核細胞が含まれる界面物質を集め、細胞を室温で１０分間１００×ｇで遠心分離することにより、培地（２０単位／ｍｌのヘパリンおよび５０μＭの２−メルカプトエタノールを含有するＡＩＭ−Ｖ；無血清培地＝ＨＣＢＭ−２）中で２回洗浄した。細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＨＣＢＭ−２で希釈し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩、ポリスチレン製組織培養フラスコ中でインキュベートした。翌朝、細胞を遠心分離によって２回洗浄し、ＨＣＢＭ−２中に再懸濁した。細胞懸濁液からとったサンプルを２％酢酸で１：２０に希釈し、有核細胞の全数を血球計数器を用いて決定した。
【００５４】
ＣＤ４^＋Ｔ細胞（ＣＤ４ｅ）を、系統特異抗体および免疫磁気アフィニティークロマトグラフィ（ＳｔｅｍＳＥＰ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）を用いた負の選択によってＬＤＭＮＣから富化した。合計１．７×１０^７個のＬＤＭＮＣを遠心分離によってペレット化し、２％ＦＢＳを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳ／ＦＢＳ）中で２回洗浄した。その細胞を１ｍｌのＰＢＳ／ＦＢＳ中に再懸濁し、系統特異性モノクローナル抗体のカクテルを添加した。このカクテルはＣＤ８（細胞傷害性Ｔ細胞）、ＣＤ１４（単球）、ＣＤ１６（ＮＫ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞）およびグリコホリンＡ（赤血球）に対して特異的な抗体を含有している。これらは、挙げられた系統特異マーカーに対する特異性およびデキストランに対する特異性とを有する両特異性抗体である。ＬＤＭＮＣを氷上で３０分間、二重特異性抗体とインキュベートし、その後鉄デキストランコロイドを添加し、インキュベーションを更に３０分間継続した。次いで、抗体が結合した細胞および鉄デキストラン粒子を除去するため懸濁液の免疫磁気クロマトグラフィを行った。したがって、回収された細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞（ＣＤ３^＋、ＴｃＲαβ^＋）ならびにＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を含む標的抗原欠損細胞の富化集団であった。得られたＣＤ４ｅの収量は２×１０^６個であった。
【００５５】
ＣＤ４ｅ細胞を、５％（体積で）ＸＬＣＭおよび５％ヒト臍帯血漿（Ｐ）を含有するＨＣＢＭ−２中で拡大増殖させた。ＸＬＣＭは、ヒト臍帯血細胞をメゼレインとコンカナバリンＡで刺激することによって調製された馴らし培地である（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ８：１２９，１９９９；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：５２５，１９９９；および国際公開第９８３３８９１号）。ＸＬＣＭは刺激因子および阻害因子の複雑な混合物であり、それらの因子中少なくとも２３種が測定されている（Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：５２５，１９９９）。
【００５６】
ＣＤ４ｅ細胞を５％ＸＬＣＭおよび５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２中で、１×１０^５細胞／ｍｌに希釈し、３７℃、５％ＣＯ_２で数日間インキュベートした。その間に細胞は８倍に拡大増殖した。細胞数および生存率は、細胞再懸濁液から取ったサンプルを等体積の０．４％トリパンブルーと混合し、血球計数器を用いて非染色細胞（生存している）および青色細胞（生存していない）を計数することによって、決定した。細胞を継代するには、少量の培養物を新鮮培地で１×１０^５細胞／ｍｌに再希釈し、新鮮ＸＬＣＭおよびＰを各々５％の最終濃度になるよう加えた。培養物の残りはフローサイトメトリー分析のために使用するか、または廃棄した。その後、同じように細胞を５％ＸＬＣＭおよび５％Ｐで補給した新鮮培地の中で２〜３日毎に継代した。総増殖倍率を各継代で測定した拡大増殖倍率の積として計算し、細胞が全て連続培養中に保持されていると仮定して、全生存細胞の理論収量を初期播種濃度と量、および各継代における拡大増殖倍率に基いて計算した。約３から４週後には、細胞は１０万倍以上拡大増殖した（図１）。
【００５７】
各継代において、ＴｃＲγδを発現するパーセントおよびＶδ１を発現するパーセントを決定するために、拡大増殖細胞の一部をフローサイトメトリーによって分析した。培養して２１日後、培養細胞の６５％超がＴｃＲγδ^＋であり、これらのＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の大部分（＞７０％）がＶδ１^＋であった（図１）。ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の割合は２７日までに更に増加し、その時点で培養細胞の７０％超がＴｃＲγδ^＋であり、これらの約９０％がＶδ１^＋であった。
【００５８】
これらのＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ４ｅの中に存在する、この条件下で選択的に拡大増殖する小集団に由来すると考えられている。
【００５９】
これは予想外で新規な知見であった。その理由は以下の通りである。
（ａ）ＸＬＣＭまたはＸＬＣＭ＋Ｐの中で連続的に拡大増殖する未分画ＬＤＭＮＣは、ほぼ完全にＴｃＲαβ^＋であって、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞は存在する場合でもごく僅かである（Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：５２５，１９９９）。
（ｂ）（血漿なしの）ＸＬＣＭだけでは、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞サブセットの拡大増殖は起こらない（Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９）。
（ｃ）ＸＬＣＭなしでは細胞拡大増殖は全く起こらない。
【００６０】
実施例２
ＴｅＡＢｄ：ＸＬＣＭ／Ｐ⇒ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞
実施例１に記載したように、ＬＤＭＮＣを成人末梢血から単離した。抗体カクテルがＴｃＲαβ^＋細胞除去抗体（ＡＢｄ）とＴ細胞富化カクテル（Ｔｅ）からできていること以外は、実施例１に記載の方法と同じ方法の負の選択によって、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞をＬＤＭＮＣから富化した。Ｔ細胞富化カクテルは、ＣＤ１４（単球）、ＣＤ１６（ＮＫ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞）およびグリコホリンＡ（赤血球）に対して特異的な抗体からなっている。１．７×１０^７個の開始時ＬＤＭＮＣ数から、合計１．３×１０^５個のＴｅＡＢｄ細胞を得た。
【００６１】
ＴｅＡＢｄ細胞を、実施例１に記載するように、５％ＸＬＣＭおよび５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２中で培養した。
【００６２】
約４週の期間を経て、細胞は１０万倍を超えるまでに拡大増殖した（図２）。培養８日目から、拡大増殖細胞は５０％超がＴｃＲγδ^＋であり、１２日目後に８０％超の純度に達した。やはりＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の大多数はＶδ１^＋であった（＞７０％）。
【００６３】
実施例２の方法は、論理的に実施例１の方法から導かれる。即ち、ＣＤ４ｅ中に存在する細胞の小亜集団から、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を増大させることができるならば、ＴｅＡＢｄ中に存在する相対的により富化された集団からも、それらの細胞を増大させることができるはずである。
【００６４】
−実施例２に記載する方法の利点−
実施例２の方法では、実施例１の方法を用いて得られるものに比較して、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞がより速やかに、より高い水準にまで拡大増殖し、かつより純粋であった。
【００６５】
実施例３
ＬＤＭＮＣ：ＸＬＣＭ／Ｐ→ＩＬ−２／ＩＬ−４／ＰまたはＩＬ−２／ＰまたはＩＬ−４／ＰまたはＰ
実施例１に記載したように、ＬＤＭＮＣを成人末梢血から単離し、更なる分画や富化をすることなく培養した。
ＬＤＭＮＣを、５％ＸＬＣＭを含有するＨＣＢＭ−２の中で４日間拡大増殖させ、その後遠心分離によってペレット化し、洗浄し、５等分した。５％ＸＬＣＭおよび５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で、１部分を二次培養した。別の１部分は１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で二次培養した。別の１部分は１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で二次培養した。別の１部分は１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で二次培養した。最後の１部分は５％Ｐだけを含有するＨＣＢＭ−２の中で二次培養した。
【００６６】
ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐで二次培養した細胞は、ＸＬＣＭの存在下で連続培養したものと同等か、それより良好に拡大増殖したが、Ｐだけで二次培養した細胞は速やかに死滅した（図３）。ＩＬ−２＋Ｐで二次培養した細胞は、短期間は低速で拡大増殖し、その後完全に増殖が止まった。ＩＬ−４＋Ｐで二次培養した細胞の拡大増殖は、ＩＬ−２＋Ｐで二次培養した細胞よりさらに悪かった。
【００６７】
これらの結果は、最大の細胞拡大増殖を実現するためには、ＩＬ−２とＩＬ−４が共に必要であることを示す。
【００６８】
実施例４
ＬＤＭＮＣ：ＸＬＣＭ／Ｐ→ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐ⇒ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞
実施例１に記載したように、ＬＤＭＮＣを成人末梢血から単離し、更なる分画や富化をすることなく培養した。
ＬＤＭＮＣを、５％ＸＬＣＭ＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で５日間拡大増殖させから、その後２分して、一方は５％ＸＬＣＭ＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で連続培養し、もう一方は洗浄し、１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で二次培養した。いずれの場合にも、細胞は４週間で１０万倍を超えて拡大増殖した（図４）。しかし、フローサイトメトリーによる分析で、条件が異なると生じる細胞の種類が異なることが判明した。即ち、ＸＬＣＭ／Ｐ中で連続培養した細胞のうちＴｃＲγδ^＋は５％未満であったが、ＸＬＣＭ／Ｐ中で培養された後、ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐ中で二次培養された細胞の５０％超がＴｃＲγδ^＋であった。この実験ではフローサイトメトリー分析は２２日目のみ行った。
【００６９】
これらの条件下でのＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の拡大増殖の知見は全く予想外であった。限定されたサイトカイン中での二次培養を行ったのは、培養細胞からＸＬＣＭを、より具体的には残存するメゼレインおよびコンカナバリンＡを除去するためであった。この技法はＸＬＣＭ中の連続培養で実現する水準と同等の拡大増殖水準を維持するが、異なるサブセット、即ちＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞サブセットが選択的に拡大増殖することが判明した。
【００７０】
−利点−
実施例１および２に記載した方法と比較して、実施例４に記載した方法は開始時細胞集団の初期分画または富化を必要とせず、したがって開始時の細胞数は極めて少なくてもよい（例えば１×１０^５）。その上、二次培養法は、ＸＬＣＭおよびその成分、例えばコンカナバリンＡ、メゼレインおよび他の既知や未知の因子を培養細胞から除去する。
【００７１】
実施例５
ＬＤＭＮＣ：ＣｏｎＡ／ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐ→ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐ⇒ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞
実施例１に記載したように、ＬＤＭＮＣを成人末梢血から単離し、分画や富化をすることなく培養した。
ＬＤＭＮＣを、１μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で５日間拡大増殖させた後、２分し、一方を１μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で連続培養し、残りの半分は洗浄し、１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で二次培養した。いずれの場合にも、細胞は４週間で１０万倍超拡大増殖した（図５）。しかし、フローサイトメトリーによる分析で、条件が異なると生じる細胞の種類も異なることが判明した。即ち、コンカナバリンＡ＋ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐの中で連続培養された細胞の５％未満がＴｃＲγδ^＋であったが、コンカナバリンＡ＋ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐの中で培養された後、ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐ中で二次培養された細胞の５０％超がＴｃＲγδ^＋であった。この実験ではフローサイトメトリー分析は２２日目だけ行った。
【００７２】
これらの条件下でのＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の拡大増殖の知見は、実施例４に述べた理由により予想外であった。即ち、限定されたサイトカイン中での二次培養は、培養細胞からＸＬＣＭを、より詳しくは残存するメゼレインおよびコンカナバリンＡを除去するために行ったのである。この方法は、ＸＬＣＭ中またはコンカナバリンＡ＋ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐ中での連続培養が達成する水準と同等の拡大増殖水準を維持するが、異なるサブセット、即ちＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞サブセットが選択的に拡大増殖されることが判明した。
【００７３】
−利点−
実施例４に記載した方法と同様に、ＬＤＭＮＣの初期分画や富化が不要で、細胞が非常に効果的に拡大増殖するので、開始時の細胞数は極めて少なくてもよい。その上、培養条件が完全に確定され、ＸＬＣＭは本法のいかなる段階でも使用されず、かつ培養細胞はメゼレインに曝されない。
【００７４】
実施例６
ＴｅＡＢｄ：ＣｏｎＡ／ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐ→ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐ⇒ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞
ＬＤＭＮＣを、実施例１に記載のように成人末梢血から単離し、実施例２に記載のようにＴｅＡＢｄを富化した。実施例５に記載のようにＴｅＡＢｄを拡大増殖させた。即ち、１μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中でそれを培養し、その後、１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で二次培養した。一方で、培養物のあまりを廃棄しながら少量の培養物をサイトカインおよび血漿を加えた新鮮培地中に希釈することによって細胞を継代する代わりに、全量の培養物を増殖させ、連続培養の量をふやしながら全細胞を維持した。
【００７５】
全血の開始時体積は５０ｍｌであった。開始時のＬＤＭＮＣ数は３．６×１０^７であった。ＴｅＡＢｄの収量は１×１０^５であった。ＴｅＡＢｄをコンカナバリンＡ＋ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐの中で計１２日間培養した結果、その時点までに１．４ｍｌの全体積中に合計３×１０^６の細胞数に増殖した。この時点で培養細胞を遠心分離によってペレット化し、ＨＣＢＭ−２で１回洗浄した。洗浄細胞を全量３０ｍｌの培地に１×１０^５細胞／ｍｌとなるよう接種し、１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを添加した。この培養では同種臍帯血漿ではなく、自家血漿を使用した。１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で更に９日間、細胞をさらに増殖させた。全培養期間は２１日であった。この時点で、細胞は３００ｍｌの全体積中に合計４．５×１０^８にまで増殖した（図６ａ）。
【００７６】
フローサイトメトリーによる分析の結果、培養２１日の細胞の８５％超がＴｃＲγδ^＋であり、かつこれらの大部分（＞７０％）がＶδ１^＋である一方、小さいが有意の割合（約１０％）がＶδ２^＋であった。その上、細胞の約１０％がＣＤ５６を発現したが、３％未満しかＣＤ１６を発現せず、この方法がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の有意な拡大増殖を生じないことを示した。
【００７７】
拡大増殖ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の細胞傷害活性は、カルセイン放出試験を用いて示された。標的細胞を蛍光基質カルセインＡＭで標識し、ＴｃＲγδ^＋エフェクター細胞と共に様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でインキュベートした。標的細胞の溶解を、カルセインの上清液中への放出を測定することによって検定した。エフェクターによる標的の特異的殺細胞率（パーセント）を、次式による相対蛍光単位（ｒｆｕ）から計算した（式中「実験的ｒｆｕ」とは、エフェクター細胞と共にインキュベートした標的細胞から放出されるカルセインによる蛍光測定量であり、「最大ｒｆｕ」とは、洗剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で溶解される同数の標的細胞から得られる蛍光であり、「自発的ｒｆｕ」とは、エフェクター細胞や洗剤のない状態でインキュベートした同数の標的細胞から得られる蛍光である）。即ち、
特異的溶解パーセント＝（実験的ｒｆｕ−自発的ｒｆｕ）／（最大ｒｆｕ−自発的ｒｆｕ）×１００
【００７８】
Ｐ８１５は、表面にＩｇＧのＦｃ領域に対する受容体を有する、マウスの肥満細胞腫細胞系である。Ｐ８１５標的をＯＫＴ３（抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体）で被覆することによって、標的細胞のエフェクターＴ細胞への結合が、Ｔ細胞特異性に関係なく、ＣＤ３発現によって実現される。したがって、ＯＫＴ３被覆Ｐ８１５標的細胞の死滅は、特異性とは独立のエフェクター細胞の細胞溶解能を示す。ＥＭ−２およびＫ５６２はＣＭＬ由来の細胞系であるが、ＤａｕｄｉはＢ細胞系でＪｕｒｋａｔはＴ細胞系である。これらの全ての標的細胞は、殺されるには、エフェクター細胞によって認識される必要がある。図６ｂ〜ｆは、実施例６の方法によって拡大増殖したＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞が細胞溶解能を有し、その上ＣＭＬ由来および非ＣＭＬ由来双方の標的細胞を認識し、死滅させることができたことを示す。
【００７９】
ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の一部を液体窒素中、１０％自家Ｐおよび１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有するＨＣＢＭ−２中２×１０^７細胞／ｍｌの濃度で凍結保存した。融解後、凍結細胞の約７１％が生存したまま回収され、融解細胞の全生存率は９０％であった。融解細胞の約７０％はＴｃＲγδ^＋であり、その＞７０％はＶδ１^＋であった。エフェクターとして融解細胞を用いたカルセイン放出試験は、融解細胞が凍結保存および融解の後で細胞溶解活性を保持しているが、その活性は試験された標的細胞の一部に対してある程度減少することを示した（図６ｇ〜ｋ）。これらの結果は、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を後日使用するために凍結保存することができることを示す。
【００８０】
実施例７
ＴｅＡＢｄ３３ｄ：ＣｏｎＡ／ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐ→ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐ⇒ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞
実施例１に記載したように、ＬＤＭＮＣを慢性骨髄性白血病患者の末梢血から単離し、実施例２に記載したように、ＴｅＡＢｄを富化した。全血の開始時体積は４３ｍｌであった。ＬＤＭＮＣの開始時細胞数は８．６×１０^７であり、ＴｅＡＢｄの収量は２．５×１０^７であって、開始時ＬＤＭＮＣの２９％であった。この収量は、健常成人末梢血ＬＤＭＮＣから得られる収量（ｎ＝３、平均ＬＤＭＮＣ＝５．２×１０^７、平均ＴｅＡＢｄ＝３．４×１０^５＝＜１％）に比較して極めて高かった。ＣＭＬ患者由来ＴｅＡＢｄのフローサイトメトリーによるその後の分析から、ＣＤ３３^＋骨髄前駆細胞の主要な非Ｔ細胞集団がＣＭＬ−ＴｅＡＢｄの約７８％を占めることが明らかとなった。ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を得るための培養の前にこの細胞サブセットを除去するために、ＣＭＬ患者細胞を用いる以後の実験では、抗ＣＤ３３抗体をＴｅＡＢｄカクテルに添加した。できた抗体カクテルであるＴｅＡＢｄ３３ｄは、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ５６およびグリコホリンＡに対して特異的な抗体を含んでいる。
【００８１】
次の実験で、実施例１に記載したように、ＬＤＭＮＣを（別の）ＣＭＬ患者の末梢血から単離し、前記の改良抗体カクテルを用いて、実施例２に記載したようにＴｅＡＢｄ３３ｄを富化した。全血の開始時体積は４０ｍｌであった。ＬＤＭＮＣの開始時細胞数は８．６５×１０^７であり、ＴｅＡＢｄ３３ｄの収量は１．３×１０^６（１．５％）であった。実施例６に記載したようにＴｅＡＢｄ３３ｄを拡大増殖させた。すなわち１μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中に、その細胞を１×１０^５細胞／ｍｌの密度で接種した。その細胞を全体積５ｍｌ中、１４日間にわたりコンカナバリンＡ＋ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐの存在下で増殖させ、その時点で細胞を遠心分離によってペレット化し、洗浄した後、１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−２＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−４＋５％Ｐを含有するＨＣＢＭ−２の中で二次培養した。次の１３日間（全培養期間は２７日であった）で細胞は全部で１６００ｍｌの培養体積まで殖え、その時点で細胞収量は１．２×１０^９であった。細胞は尚も増殖中であったが、細胞を収穫し、この時点で使用した。増殖速度のグラフを図７ａに示す。
【００８２】
フローサイトメトリーによる分析の結果、細胞の７２％がＴｃＲγδ^＋であり、かつこれらの大部分（＞６０％）がＶδ１^＋であって、一方３３％がＶδ２^＋であった。やはり、３％未満の細胞しかＣＤ１６を発現せず、ＮＫ細胞はこの培養中拡大増殖しなかった。
【００８３】
標準的なＧバンド法を用いた細胞遺伝学的分析によれば、拡大増殖細胞は非白血病性で、クローンの細胞遺伝学的異常は、ＣＭＬの特徴であるフィラデルフィア染色体を含めて検出されなかった。ＩＬ−２およびＩＬ−４のない状態でＨＣＢＭ−２＋５％Ｐの中で細胞を引き続き培養すると、細胞死が起こり、細胞拡大増殖がサイトカイン依存性であって、かつ培養細胞は培養工程によってトランスフォームされていないことを示した。
【００８４】
拡大増殖した細胞の表面にコンカナバリンＡが結合しているかどうかを調べた。その細胞をウサギ抗コンカナバリンＡ ＩｇＧ抗体（ＲａＣｏｎＡ）または等価量の健常ウサギＩｇＧで処理した。その後に細胞を洗浄し、ＦＩＴＣヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＮＲＩｇＧ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。陽性対照として、コンカナバリンＡ＋ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐ（Ｋ）の中で新鮮培養をしたＬＤＭＮＣを同様に染色した。ウサギ抗コンカナバリンＡ抗体で染色された陽性対照細胞（Ｋ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、同一細胞を健常ウサギＩｇＧで染色したときに得られるＭＦＩよりずっと大きく（表１）、細胞表面上にコンカナバリンＡがあることを示した。それとは対照的に、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞のＭＦＩは、ウサギ抗コンカナバリンＡ抗体および健常ウサギＩｇＧのどちらに対しても同じようであった。これらのデータは、ＩＬ−２＋ＩＬ−４＋Ｐの中（コンカナバリンＡの不在下）で細胞の二次培養することにより、恐らくインターナリゼーションや異化によるか、または細胞表面から剥げ落ちることによって、検出し得るコンカナバリンＡは培養細胞から消えたことを示している。
【００８５】
ＣＭＬ患者由来のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の細胞傷害活性は、実施例６に記述したカルセイン放出試験を用いて確認された（図７ｃ〜ｇ）。
ＣＭＬ患者由来のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞は、１０％自家Ｐおよび１０％ＤＭＳＯを含有するＨＣＢＭ−２中、４．４×１０^７細胞／ｍｌの濃度で液体窒素の中に凍結保存された。凍結融解後の生存細胞の回収率は７６％で、凍結融解細胞の全生存率は８４％であった。細胞傷害活性は保持されたが、やや減少した（図７ｈ〜ｌ）。
【００８６】
これらの結果は、治療上有用な数の機能的に細胞傷害性のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を、ＣＭＬ患者から採取した比較的少量の末梢血試料から、ｅｘ ｖｉｖｏで拡大増殖することができることを実証している。その上、これらの細胞は非白血病性でかつトランスフォームしておらず、表面に検出し得るコンカナバリンＡがなく、後日使用するために凍結保存も可能である。
【００８７】
好ましいと現在考えられている実施例を参照しながら本発明を記述したが、本発明は開示された実施例に限定されるものではないと理解されたい。それどころか、本発明は、付随する請求項の精神および範囲の中に含まれる様々な改変および同等のとり合せを包含することを意図されている。
全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が参考として完全な形で挿入されるように特異に、かつ個別に指示された場合と同程度に、参考として完全な形で本明細書に挿入されている。
【表１】

^＊ １以下の比は、ウサギ抗ｃｏｎＡ抗体（ＲａＣｏｎＡ）による染色が、健常ウサギＩｇＧ（ＮＲＩｇＧ）によるバックグランド染色より少ないことを示す。これらの結果は、培養されたＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞の表面上で、ｃｏｎＡを検出することができないことを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はＸＬＣＭ／ＰによるＣＤ４富化細胞の培養中の様々な時間における全細胞収量およびＴｃＲγδ^＋とＶδ１^＋のＴ細胞のパーセンテージを示す図である。
【図２】 図２はＴ細胞富化／ＴｃＲαβ細胞除去を行った細胞をＸＬＣＭ／Ｐとともに培養中の様々な時間における全細胞収量およびＴｃＲγδ^＋とＶδ１^＋のＴ細胞のパーセンテージを示す図である。
【図３】 図３はＸＬＣＭによるＬＤＭＮＣの培養と、その後のＸＬＣＭ／Ｐ、ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐ、ＩＬ−２／Ｐ、ＩＬ−４／ＰまたはＰ単独による二次培養中の様々な時間における全細胞収量を示す図である。
【図４】 図４はＸＬＣＭ／ＰによるＬＤＭＮＣの培養中、またはＸＬＣＭ／ＰによるＬＤＭＮＣの培養とその後のＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐによる二次培養中の、様々な時間における全細胞収量およびＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。
【図５】 図５はｃｏｎＡ／ＩＬ−２／ＩＬ−４／ＰによるＬＤＭＮＣの培養中、またはｃｏｎＡ／ＩＬ−２／ＩＬ−４／ＰによるＬＤＭＮＣの培養とその後のＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐによる二次培養中の、様々な時間における全細胞収量およびＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す図である。
【図６】 図６ａはＴ細胞富化／ＴｃＲαβ細胞除去を行った細胞の、ｃｏｎＡ／ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐによる培養中とその後のＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐによる二次培養中の経時的な全生細胞数を示す図である。
図６ｂ−６ｆは様々なエフェクター対標的比でのＴｃＲγδ^＋エフェクターによる様々な標的細胞の死滅パーセンテージを示す図である。
図６ｇ−６ｋはエフェクターの凍結保存後の様々なエフェクター対標的比でのＴｃＲγδ^＋エフェクターによる様々な標的細胞の死滅パーセンテージを示す図である。
【図７】 図７ａはＣＭＬ患者由来のＴ細胞富化／ＴｃＲαβ細胞除去／ＣＤ３３細胞除去を行った細胞の、ｃｏｎＡ／ＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐによる培養中とその後のＩＬ−２／ＩＬ−４／Ｐによる二次培養中の経時的な全生細胞数を示す図である。
図７ｂはサイトカイン除去後の経時的な生存パーセントを示す。
図７ｃ−７ｇは様々なエフェクター対標的比でのＴｃＲγδ^＋エフェクターによる様々な標的の死滅パーセンテージを示す図である。
図７ｈ−７ｌはエフェクターの凍結保存後の様々なエフェクター対標的比でのＴｃＲγδ^＋エフェクターによる様々な標的細胞の死滅パーセンテージを示す図である。

Claims (31)

1. （１）（ａ）Ｔ細胞マイトジェン、（ｂ）インターロイキン−２および（ｃ）インターロイキン−４を含む第１の培地中で、出発試料中の細胞を培養すること、および
   （２）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含む第２の培地中で、上記（１）で得られた細胞を培養することによって、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を増殖させること
   を特徴とする出発試料中のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を増殖させる方法。
2. （１）ＸＬＣＭ（商標名）を含む第１の培地中で、出発試料中の細胞を培養すること、および
   （２）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含む第２の培地中で、上記（１）で得られた細胞を培養することによって、ＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を増殖させること
   を特徴とする出発試料中のＴｃＲγδ^＋Ｔ細胞を増殖させる方法。
3. 第１および第２の培地が血清または血漿を含有する請求項１または２に記載の方法。
4. ステップ（１）の前に、出発試料中の細胞をＴ細胞について富化する請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. ステップ（１）の前に、出発試料中の細胞をＣＤ４^＋細胞について富化する請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. ステップ（１）の前に、出発試料中の細胞からＣＤ１４^＋、ＣＤ１６^＋、ＣＤ１９^＋、ＣＤ５６^＋およびグリコホリンＡ^＋細胞を除去する請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. ステップ（１）の前に、出発試料中の細胞からＴｃＲαβ^＋ Ｔ細胞を除去する請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. ステップ（１）の前に、出発試料中の細胞から非ＴｃＲγδ ^＋ Ｔ細胞を除去する請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 出発試料が末梢血、骨髄、リンパ組織、上皮、胸腺、肝臓、ひ臓、癌組織、感染組織、リンパ節組織またはそれらの分画物から選択される請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 出発試料がヒト末梢血またはその分画物である請求項９に記載の方法。
11. 出発試料が低密度単核細胞である請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 第１の培地中にＴ細胞マイトジェンが０．０１から１００μｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−２が０．１から１０００ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４が０．１から１０００ｎｇ／ｍｌの量で存在する請求項１または３から１０のいずれか一項に記載の方法。
13. 第１の培地中にＴ細胞マイトジェンが０．１から５０μｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−２が１から１００ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４が１から１００ｎｇ／ｍｌの量で存在する請求項１または３から１０のいずれか一項に記載の方法。
14. 第１の培地中にＴ細胞マイトジェンが０．５から１０μｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−２が２から５０ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４が２から５０ｎｇ／ｍｌの量で存在する請求項１または３から１０のいずれか一項に記載の方法。
15. 第１の培地がＴ細胞マイトジェンを１μｇ／ｍｌ、ＩＬ−２を１０ｎｇ／ｍｌおよびＩＬ−４を１０ｎｇ／ｍｌ含む請求項１または３から１０のいずれか一項に記載の方法。
16. Ｔ細胞マイトジェンがコンカナバリンＡである請求項１または３から１０のいずれか一項に記載の方法。
17. 血清または血漿が１から２５体積％の量で存在する請求項３に記載の方法。
18. 血清または血漿が２から２０体積％の量で存在する請求項３に記載の方法。
19. 血清または血漿が２．５から１０体積％の量で存在する請求項３に記載の方法。
20. 血清または血漿が５体積％の量で存在する請求項３に記載の方法。
21. 第２の培地中にＩＬ−２が０．１から１０００ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４が０．１から１０００ｎｇ／ｍｌの量で存在する請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 第２の培地中にＩＬ−２が１から１００ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４が１から１００ｎｇ／ｍｌの量で存在する請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
23. 第２の培地中にＩＬ−２が２から５０ｎｇ／ｍｌの量で存在し、ＩＬ−４が２から５０ｎｇ／ｍｌの量で存在する請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
24. 第２の培地がＩＬ−２を１０ｎｇ／ｍｌおよびＩＬ−４を１０ｎｇ／ｍｌ含む請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
25. ＸＬＣＭ（商標名）が１から２５％の量で存在する請求項２に記載の方法。
26. ＸＬＣＭ（商標名）が２から２０％の量で存在する請求項２に記載の方法。
27. ＸＬＣＭ（商標名）が２．５から１０％の量で存在する請求項２に記載の方法。
28. ＸＬＣＭ（商標名）が５％の量で存在する請求項２に記載の方法。
29. 慢性骨髄性白血病患者から採取した試料からＴｃＲγδ ^＋ Ｔ細胞を得る方法であって、
    （１）試料から低密度単核細胞（ＬＤＭＮＣ）を得ることと、
    （２）ステップ（１）で得られた細胞からＣＤ３３^＋細胞を除去することと、
    （３）（ａ）Ｔ細胞マイトジェン、（ｂ）インターロイキン−２および（ｃ）インターロイキン−４を含む第１の培地中で、ステップ（２）で得られた細胞を培養することと、
    （４）（ｉ）インターロイキン−２および（ｉｉ）インターロイキン−４を含む第２の培地中で、ステップ（３）で得られた細胞を培養することにより、ＴｃＲγδＴ^＋細胞を増殖させること
    を含む方法。
30. ステップ（２）がその細胞から更にＣＤ１４^＋、ＣＤ１６^＋、ＣＤ１９^＋、ＣＤ５６^＋およびグリコホスホリンＡ^＋の各細胞を除去することを含む請求項２９に記載の方法。
31. ステップ（２）がその細胞から更にＴｃＲαβ^＋Ｔ細胞を除去することを含む請求項２９に記載の方法。

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