JPH04503356A - 生充填移植片の石灰化軽減 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生充填移植片の石灰化軽減 １１星１ これは、１９８９年２月１７日に出願誉号３１２．５４２として最初に出願され た出願の一部継続出願である１９８９年４月１８日に出願された出原書号３３９ ゜７８７の一部継続出願である。

１１立！盈 本発明は、石灰化−抵抗性の生充填移植片およびそれらの製造方法に関するもの である。より特に、本発明は天然誘導された生物学的材料から製造された石灰化 −抵抗性の生充填心臓弁に関するものである。

例えばグルタルアルデヒド陳腐処理された豚の心臓弁の如き生充填心臓弁により 、機械的および同種移植組織心臓弁に伴う多くの問題が解決されている。これら の生充填弁は非常に安定であり且つ非−抗原性であり、顕著な耐性を有しており 、そして天然弁と非常に近い物理的特性を有している。

動物の皮革および組織のタンニングまたは前肩用の別の技術は、金属塩類の使用 を含んでいる０例えば、クロームタンニングが皮革工業において長年にわたり使 用されできている（例えば米国特許１，８９２，４１０参照）。移植可能な充填 製品の製造用に使用することのできる天然誘導された膠原質のタンニング用には 、第二鉄、クロムおよびアルミニウム基原が使用されている（米国９Ｆ４，０９ ７゜２３４参照）。

ダルディック（Ｄａｒｄｉｋ）他は、米国特許３，９７４，５２６中で、ＩＩ帯 から得られる静脈および動脈からの生充填血管移植片の製造を記載している。血 管を硬化またはタンニングするために開示されている試薬の中には酸化クロムが ある。

そのような生充填心臓弁に伴う鏝近の問題は、生体内でのそれらの石灰化傾向で あゐ、この問題は特に子供に敷延しており、子供の生充填心臓弁の使用に対して は推奨しかねる点がある。

生充填心臓弁の石灰化を軽減するための種々の工程が提唱されている。例えば、 レンツ（Ｌｅｎｔｚ）他は、米国特許４，３２３．３５８中で、移植後の石灰化 を抑制するための移植可能なグルタルアルデヒドアルデヒド−固定された天然組 織（厚の心ｌｌｆｆも含む）を硫酸処理された高級脂肪族アルコールの可溶性塩 を用いて処理する方法を開示している。ニンニ（Ｎｌｍｎ　Ｉ）他は、米ｃＩｌ 特許４，３７８゜２２４中で、生充填組織を例えば硫酸コンドロイチンの如き硫 酸処理された蛋白質−多ｓｌ［で柴橋結合することを含む該組織の石灰化を抑制 する工程を開示している。米国特許４，４８１，００９中で、Ａ、Ｓ、ナシｚｙ 　（Ｎｉｓｈｅｆ）は移植組織の前に生充填組織中に主相容性重合体を加えるこ とからなる石灰化軽減工程を開示している。この工程は、組織を表面活性剤で処 理し、洗浄して表面活性剤を除去し１組織をグルタルアルデヒドで固定し、例え ばジホスホン瞭アミノの如き石灰化抵抗性で処理し、そして組織を還元剤で処理 することを含んでいる。カーベンティア−（Ｃｉｒｐｅｎｔｉｅｒ）他の米国特 許４，６４８．８８１は、最初の処理段階がタンニングまたは石灰化軽減工程段 階のいずれであろうとも少なくとも最初の処理段階中またはその後に組織を燐酸 塩−含有溶液との接触を避けることにより移植された生−学的組織の石灰化を軽 減できることを教示している。

活性化因子をジアミン溶液と共に利用して、カルボン酸残基との反応を開始させ る。特に好適な一活性化因子はカルボジイミドである。

本発明の生充填移植片は長期間の移植に対して優れた石灰化抵抗性を示している 。該石灰化軽減方法は、移植片の物理的特性、耐性または主相容性に悪影響を与 えるものではない。

肚ＩＪす１乞１監 石灰化は、それが充填心臓弁中で生じゐ時には、特にやっかいな問題である。

有効に機能させるためには、該心臓弁はそれらを製造する原料組織の高度の柔軟 性および耐性を保有していなければならない。弁は実質的に非−抗原性でありそ の結果として宿主拒絶反応に抵抗性でなければならないだけでなく、それらは全 校形成性であったりまたは炎症反応を刺激してはならない。該生充填弁は長年に わたり問題のない性能を与えなければならｔい。それらが故障するとしても、そ れらの故障が機能の破滅的損失ではなく性能の段階的減少を伴うものでなければ ならない。

石灰化はこれらの望ましい特性の多くを危うくさせることがある。石灰化は弁材 料の柔軟性を減少させ、そして弁の突発的な予期せぬ故障をもたらす可能性があ る。弁上の鉱物沈着が血栓の生成を引き起こすかもしれず、それは突然放出され ると脳血管または心臓血管封鎖などの重大な併発症も引き起こすかもしれなり蔦 。

石灰化はしばしば生充填弁の早期交換を必要とし、その結果、を者が追加手術の 危険性にさらされる。

生充填心臓弁用に使用される生物学的材料に有効量の第二鉄もしくは第二錫イオ ンまたはそれらの混合物を含浸させることにより、石灰化を相当減少できること が、今発見された。

この工程により製造できる心臓弁には、扉の心臓弁、牛の心腹、人間の硬膜物質 などから製造されるものを含む天然組織から製造される一般的な型の全ての弁が 包含される。

本発明の方法は一般的には生物学的組織の適当なＩＲＭおよび固定（タンニング ）方法と組み合わせて使用される。これらのタンニング工程は生物学的組織の耐 性を改良しそして抗原性を減少させる。

一般的な組織タンニングまたは固定工程のいずれでも使用できる。好適な工程は 、組織を燐酸塩−緩衝溶液または燐酸塩を含まない緩衝液中で０６２５％グルタ ルアルデヒドで処理することである。燐酸塩を含まない緩衝液が好ましく、そし てそれらには例えばホウ酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、カコジル酸塩、および他の 合成、人造または有機性緩衝液、例えばＮ−２−とドロキシエチルピペラジン− Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）プロパン −スフレホンＩＩ（ＭＯＰＳ）および１．４−ピペラジンビス（エタンスルホン 酸）（ＰＩＰＥＳ）、が包含される。

本発明の生充填移植片を殺菌するためには、種々の殺菌工程のいずれでも使用で きる。好適な工程は、生物学的組織を殺Ｗ有効量のホルムアルデヒドまたはグル タルアルデヒド、アルコールおよび表面活性剤の溶液と接触させることを含んで いる。

殺菌およびタンニング工程は本発明の石灰化軽減工程の前または後に実施するこ とができる。タンニング工程で使用されるアルデヒド類は蛋白質アミン基と共有 的に架橋結合する。これらの基と例えばグルタルアルデヒドとのＩ１１檎結合は 生充填片の抗原性を減少させるために重要である。第二鉄または第二錫イオンは 、アルデヒドまたはアミン基とシップ塩基を生成するであろう他の物質の存在下 の時には、アミン基との安定な共有結合された錯体または配位子を生成すると信 じられている。

従って、第二鉄および／または第二錫イオンとアミン基との反応はタンニング工 程と直接競合する。アミン基が架橋結合し始める程度を測定するために種々の方 法が考えられている。アミン基の架橋結合度を測定する一方法は、生物学的組織 が収縮を経験する温度（ＴＳ）を測定することである。天然組織は典型的には約 ６５℃のＴＳを有する。架橋結合が増加するにつれて、ＴＳが増大する。グルタ ルアルデヒド固定された組織は約８４℃−８５℃のＴＳを有している。組織の水 熱安定性におけるこの増加は生物学的安定性の増加に関して重要であゐと信じら れている。従って、第二鉄および／玄たは第二錫イオンの含浸がこのＴＳを意義 あゐほど妨害しないことを確保することが望ましい。

高濃度の第二鉄または第二錫塩は生物学的材料に悪影響を与えるかもしれない。

そのような悪影響は、組織の硬化から石灰化傾向の実際の増加までの範囲にわた る。一方、第二鉄または第二錫塩の濃度が低すぎると、この処理では希望する効 果が得られない。溶液中の第二鉄または第二錫塩の濃度は、生物学的材料全体に わたる金属イオンの浸透の均一性および深さにも影響を与える。一般的には、生 物学的材料中の第二鉄または第二錫塩の均一で深い浸透が好ましい。

生物学的組織を最初にタンニング溶液にかける場合には、生物学的組織に石灰化 軽減量の第二鉄または第二錫イオンが確実に含浸できるように注意を払わなけれ ばならない。それとは対照的に、生物学的組織を最初に第二鉄または第二錫イオ ン溶液を用いる処理にかける場合には、適切なタンニングを妨害する高濃度の第 二鉄および／または第二錫イオンの含浸または生物学的材料が硬くなり始めるの を防止するために注意を払わなければならない。

と記の如く、含浸度に影響する多くの因子がある。第一に、含浸溶液中の第二鉄 または第二錫の濃度は含浸用に利用できるイオンの量に影響を与えろであろう。

含浸溶液と生物学的材料の間の接触時間量、含浸溶液のｐＨ１並びに含浸工程お よびタンニング工程の実施順序により、含浸度が影響を受ける。これらの因子を 調節して、組織中での第二鉄または第二錫の希望する含浸水準が得られる。

特定の生物学的組織に関する第二鉄および／または第二錫イオン含浸の正確な水 準は希望する最終的用途に依存している。上記の如く、第二鉄および第二錫イオ ン含浸はタンニング工程中のアルデヒドの架構結合作用と競合する。これＩよ、 タンニング工程中に得られる架橋結合度に依存してしするＴＳに直接影響を与え るであろう。第二鉄および／または第二錫イオンを用誓する組織含浸も、例え１ 組織の柔軟性の如き組織の他の特性にも影響を与えるかもしれなり１゜どの特性 が重要力・は組織に関する希望される最終的用途に依存してしする。

従って、有効量の第二鉄および／または第二錫イオン含浸は希望される最終的用 途に依存している。

組織心臓弁を製造するために使用される生物学的組織材料はある程度の柔軟性を 有することが一般的に要求される。第二鉄および／または第二錫イオンの含浸水 準が増加するにつれて、組織は柔軟性を失う。しかしながら、必要な石灰化軽減 量を与えるためには充分量の第二鉄および／または第二錫イオンを加えなければ ならない。１肥の如く、第二鉄および／または第二錫イオンの含浸１士含浸溶液 中の濃度および生物学的組織材料が浸漬工程を受ける条件に大きく依存してしす る。

上記の如く、タンニング工程にかけられる生物学的材料の有用性を測定するため に使用される一指示法は収縮温度（ＴＳ）の測定である。組織を２個のクランプ 内に保持することにより、ＴＳが測定される。１個のクランプは、組織が保持さ れている方向と一般的に平行である方向にクランプが滑るような方法で設置され ている。このクランプをクランプの運動を指示可能な装置と連結させる。組織を 浴中に浸漬させる。浴の温度をクランプの運動が観察されるまでゆっくり高める 。

意図する最終的用途用に充分な柔軟性を残しながら組織に石灰化軽減量の第二鉄 および／または第二錫イオンを充分含浸させて希望する石灰化啜減が得られるま で、本発明の方法はタンニング工程と一緒に実施される。希望する最終的用途用 の希望する含浸および柔軟度が得られると、ＴＳの測定値が組織安定化用の適切 な参照点を与える。

例えば、グルタルアルデヒドを用いてタンニングされた生物学的組織は望ましい 安定性を有するためには約８５℃のＴＳを有していなければならなし１ことが測 定されている。従って、この望ましいＴＳを保ちながら組織に対する第二鉄およ び／または第二錫イオンの含浸度を最大にすべきである。

本発明の方法は一般的には、生物学的材料を水溶性第二鉄または第二錫塩の溶液 と接触させることにより、実施される。この接触は典型的には、処理溶液中への 生物学的材料の浸漬を必要とする。一方、溶液を生物学的材料に噴霧することも でき、ロールコーティングすることもでき、または適当な工程を用し１て適用す ることもできる。好適態様では、生物学的材料を第二鉄または第二錫塩溶液中に 約２４時間−約２００時間の範囲の時間にわたり浸漬させる。

第二鉄または第二錫塩用の溶媒または賦形薬は、有機溶媒系または水性溶媒であ ることができる。使用できる有機溶媒には、低ＭＣｌ−Ｃ８脂肪族アルコール類 、グリコール類、トリオール類、アルデヒド類などが包含される。

好適な溶媒系は、水−混和性アルコール票、グリコール類、トリオール類および アルデヒド類の水溶液である。これらの水性溶媒系は第二鉄または第二錫塩用の 賦形薬として作用するだけでなく、蛋白質変性剤および８Ｍ剤としても作用する 。そのような溶媒系の例は、エタノール、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒ ド、グリセロールまたはそれらの混合物の水溶液である。これらの水性溶媒系は 、それらを移植可能な生物学的組織の処理において長期にわたり使用できそして それらの安全性および有効性が確立されているという別の利点も有してい墨。

水性溶媒系は有利には、約３０％までのエタノール、約５％までのホルムアルデ ヒド、約０．６２５％までのグルタルアルデヒド、もしくは約３０％までのグリ セロール、またはそれらの混合物を含有しでいる。これらの溶媒系は有利には一 般的な緩術剤を含有することもできる。

第二鉄または第二錫イオンは、可溶性の実質的に非−毒性の塩の形状である。

そのような塩類の例には、硝酸塩、硫酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、ハロゲン化吻、 クエン酸塩および酢酸塩が包含される。好適な塩類は、硝酸第二鉄、硝酸第二錫 、硫酸第二鉄、硫酸第二錫、塩化第二鉄、塩化第二錫、クエン酸第二鉄、クエン 蒙第二錫、酢酸第二鉄および酢酸第二錫である。第二鉄基原が特に好適である。

第二鉄または第二錫塩は溶液状で含浸有効濃度で使用されろ。そのような濃度は 、溶液を用いる処理により生物学的材料に石灰化−軽減量の第二鉄または第二錫 イオンを含浸させるのに充分な量である。一般的には１組織に適用される溶液中 の第二鉄または第二錫塩の濃度は約０．０１重量％−約２５重量％の、好適には 約０．０５重量％−約１５重量％の、範囲である。移植前の組織中の第二鉄また は第二錫濃度は０００１重量％−約３０重量％の、好適には約０００５重量％− 約１０重量％の、範囲である。

第二鉄または第二錫塩溶液のｐＨが、生物学的組織により吸収される第二鉄およ び／または第二錫イオンの速度に影響を与えることが見いだされている。ｐＨが 低くなればなるほど、吸収が速くなる。溶液のｐＨは一般的には約２−約７の範 囲であり、約４．５−約６の範囲のｐＨが好適である。

本発明は生充填心臓斧の製造用に特に有利であるが、本発明の生物学的材料およ び方法を他の型の移植片の製造に適用することもできる。そのような移植片の例 は膀胱再生用の材料、血萱の補修、および整形外科移植であるが、それらは一部 である。

本発明を、下記の非限定用実施例によりさらに説明する。

本発明に至った発見は偶然になされた。豚の・シ・臓弁小片を実験動物中への移 植前にグリセロールで処理した。小片を数週間後に取り出すと、これまでの実験 から予期されたものより相当低い水準の石灰化を有しでいることが観察された。

この結果の原因を研究すると、心臓弁小片の処理用に使用されたグリセロールが 金属容器から取り出されたことが注目された。このグリセロールの容器は非常に 古く、そして該グリセロールは後で比較的大量の鉄および錫を含有していること が見いだされた。金属に関するグリセロールの分析は、それがｌｏｐｐｍのカル シウム、９０ｐｐｍの鉄および３０ｐｐｍの錫を含有していることを示した。確 認実験では、比較的低い石灰化度は汚染されたグリセロールによるものであるこ とが示唆された。石灰化軽減に関する「老化グリセロール」の効果およびこの効 果を得るための別の溶液の開発を行うために、一連の実験を行った。

ス」１１Ｌ：」一 実施例１−５のそれぞれにおいては、標準的なタンニングおよび石灰化軽減工程 を行った。各実施例は２個以上の試料を含んでいた。実施例１は以上で論じられ ている老化グリセロールの使用を含んでおり、そして老化グリセロールが石灰化 軽減度を与えることが示された。残りの実施例は、この石灰化軽減の提供物質が 第二鉄および第二錫イオンであることを示していた。

実施例２−５間の工程における唯一の差異は１石灰化工程中に使用される第二鉄 化合物の型および濃度である。種々の実施例の各試料に対して、特定の化合物お よび濃度が指示されている。

実施例２−５用の標準的工程は下記の如くであった　抽出したでの罫の大動脈心 臓弁小片を等優性食塩水溶液で充分すすいだ。次に小片をタンニングおよび石灰 化工程にかけ、ここでは断らない限り石灰化軽減工程が最初に実施された。実施 例２の１試料では、工程を逆にした。このことは、タンニング工程の前または後 に行っても石灰化工程が作動することを示した。

石灰化工程は、小片を２種のグリセロール溶液の゛１種中に浸漬させることを含 んでいた。実施例中でａａａＢと表示されている第−型の溶液は以上で論じられ ている老化グリセロール溶液であるが、ａａａｃと表示されている第二型の溶液 はｌ／３のエタノール（９０％）、１／３の水性ホルムアルデヒド（４部の３７ ％ホルムアルデヒドおよび６部のＮ２０を混合することにより製造された）並び にｌ／３のグリセロールからなる商業用等級のグリセロール溶液である。ａａａ ｃグリセロール溶液は単独で使用されるかまたは第二鉄もしくは第二錫化合物で 轢波化されて使用された。これは数檻の実施例中で選択された第二鉄または第二 錫化合物の重量／容量％としての％濃度の表示ａ息ａＣと共に指示されて表示さ れている。

使用される第二鉄または第二錫化合物は塩または麿化物のいずれかであった。

タンニング工程（種々の実施例中で「Ｇｌｕｔ　ＭｇＪにより指示されている） は、小片を重量／容量基準で０．６５％の７．４±０．１のｐＨを有する０、０ ２モルのＮ−２−とドロキシエチルピペラジン−Ｎ１−２−エタン−スルホン酸 （ＨＥＰＥＳ）を含有しでいるグルタルアルデヒド、０．２６重量／容量％の塩 化マグネシウムおよび等優性溶液を製造するのに充分な量の塩化ナトリウムから なる溶液中に浸漬させることを含んでいた。

タンニングおよび石灰化工程は、小片を各溶液中に１週間にわたり浸漬させるこ とにより、実施された。

タンニン処理および石灰化工程が完了した後に、小片を成長中の鼠（実施例２− ５）ｔたは成長中の兎（実施例６）の背中の種々の位置に外科的に皮下移植した 。これらの小片を各実施例に対して指定されている期間にわたりそのまま移植さ せておいた。実施例１−５に対して使用された各鼠中には３個の小片を移植し、 ２匹の鼠を各時間間隔後に死亡させた。鼠を死亡させた後に、小片を取り出しそ して石灰化に関してＩＩ察した。

石灰化を実施例２−５において定性的に測定した。実施例２−５用に使用された 定性的工程は、視覚的検査および下記の石灰化目盛りを用いる石灰化度の記録を 含んでいた：観察可能な石灰化なしく０）、いくらかの石灰化（＋）、平均の石 灰化（＋＋）またはひどい石灰化（＋＋＋）。文字Ｆは　ａ微鏡下で観察された 微少石灰化度を示している。文字Ｅは、石灰化が細胞中だけであることを示して おり、そして少量だけの石灰化を表している。一般的には、各時間間隔において ｍｓされた試料は興なる石灰化度を有している。下記の図面でわかるように、２ 種の指示法が各試料に対しで与えられている。これは６個の異なる小片間の興な る石灰化度を表している。しかしながら、標識の付けられている一部の実施例以 外では、各型の石灰化を有する小片の正確な数は記録していない。実施例３では 各等級に関しての小片のそれぞれの数が与えられているが、実施例２および５で は２種の等級が小片に対して与えられている。岬級は視覚的観察により行われた 。最初に、各試料のＸ−線を観察しで石灰化の一般的な指示を与える。比較的大 きい分化度が必要な場合には、小片部分を染色しそして石灰化に関して試験した 。小片をパラフィン塊中に埋め、塊を分割し、そしてその部分にフォア・コツサ 染料で染色すゐことにより、染色された部分は製造された。

Ｉｌｌ！工 この実施例は、上記の老化グリセロールにより供される利点を説明するものであ る０％Ｊｌｌはタンニング工程なしの老化グリセロール中への小片の浸漬を含ん でいるが、処ＪＩ２はタンニング工程だけにかけられた小片だけである。

４亙皇ま　１亙　ＬＩＬ　３亙　１凡 ｆｉｌ　ａａａＢ　＆ｆＯ１４ｆＯ１−−１ｆＯ１２（損失）２（◆◆◆） ＋２１　Ｇｌｕｔ−Ｐ　＄４　４４４　−−　３（損失）観察された小片数は処 理に対して示されている。この実施例は、ａａａＢの石灰化軽減を示しているが 、タンニングなしでは生成する組織が不安定であることを示している。「損失」 の指示は、組織が動物により消化されそして吸収されたことを意味すゐ。

１直舅１ この実施例は、抗−石灰化処理は組織のタンニングと組み合わされる時には良好 な石灰化軽減度を有する生物学的に安定な組織を与えることを示している。処理 １はタンニングを受けなかった。

Ａ１豊ま　ｌＬ　１亙　１亙 ＋１］　ａａａＢ　Ｏ／＋＋＊　Ｏ／＋＊＋　Ｏ／＋＊＋＋２１　Ｇｌｕｔ　Ｍ ｇ／ａａａＢ　Ｏ／Ｋ　Ｏ／Ｅ　Ｏ１＋＋＋（３１ａａａＢ／Ｇｌｕｔ　Ｉｌｇ 　ＯＯＯ１１五１ この実施例は、布置のグリセロールｍａａｃはａ［１のような石灰化軽減を与え ないことを示している。

４１１豆　土Ｌ　１亙　ｌＬ　１上Ｌ ｉ１ｌ　ａａａＢ／Ｇｌｕｔ　１４＠　９ｆＯ１６（０１６＋０１　１ｆＯ］３ ｆＦｌ　３［Ｆｌ　５（Ｆｌ （２１ａａａＣ／Ｇｌｕｔ　Ｍｇ　４ｆＯ）　４＋０１２（＋＋）２（◆◆） この実施例では、３匹の鼠を処理（１）泪に最初の３回の時間間隔で死亡させた 。

ｍ土 この実施例は、第二鉄塩としての第二鉄イオンにより石灰化軽減が与えたこと示 している。醸化第二鉄の使用（処理５）は石灰化軽減を与えなかった。

ＬＬＪＬ！Ｌ”Ｊｌ　１亙　ｌ亙 ＋１１　ａａａＢ／Ｇｌｕｔ　Ｍｇ　Ｏ０ｆ２１　ａａａＣ／Ｇｌｕｔ　Ｍｇ　 ＋＋＋ｆ３１　ａａａＣ／Ｇｌｕｔ　Ｍｇ　ＯＯ＋　ＦｅＦｅＣ１３ｆ５０／１ ００ｍ１ａａａＣ１＋４１　ａａａＣ／Ｇｌｕｔ　Ｍｇ　Ｆ　Ｆ＋　Ｆｅ２ｆＳ ０４１３ｎｌ１２０：２．６％ｗ／ｖｆｉｌ　ａａａＣ／Ｇｌｕｔ　Ｍｇ　゛　 ◆◆◆＊　Ｆｅ２Ｏ２，２Ｈ２０＋５０ｍｇ／１００ｓｌａａａＣ１ｆ６１　ａ ａａＣ／Ｇｌｕｔ　Ｍｇ　ＯＯＯ÷Ｆｅ２ｆ１１０３１３，３１！２０：２．６ １ｗ／ｖ１産里玉 この実施例は、石灰化軽減の提供における第二鉄および第二錫塩（イオン）の間 者の有用性を示している。

ｍ亙　１亙　６７１　８Ｊ’ｌ　上立亙ｆｉｌ　ａａａＢ／Ｇｌｕｔ　Ｍｇ　Ｏ Ｏ／Ｆ　Ｆ／＋＋　Ｏ／”（２１ａａａＣ／ＧｌｕｔＭｇ＋＋＊＋＋＊＋３１　 ａａａＣ／Ｇｌｕｔ　１１１ｇ　ＯＯ／Ｆ　Ｆ　Ｏ／＋＋＋＋　ＦｅＣｌ２：３ ．３％ｗ／ｖ ＋４１　ａａａＣ／Ｇｌｕｔ　Ｍｇ　＋　Ｆ　Ｏ／＋＋　Ｏ／＋＋＋十５ｎＣ１ ５：６Ｘｗ／ｖ ＋５１　ａａａＣ／Ｇｌｕｔ　Ｍｇ　＊＊＋＋　、２Ｈ２０：２％ｗ／ｖ ＋６１　ａａａＣ奉◆＋ ＋　ＣａＣｌ２　Ｈｗ／ｖ ＋　５ｎＣ１５６Ｘｗ／ｖ ＋　ＦｅＣｌ２　３．３％ｗ／ｖ 最後の２個の試料５および６は、カルシウムイオンの存在が第二錫および第二鉄 イオンの石灰化軽減効果を無効にすることを示していゐ。

１ム五１ ６は移植された小片中でのカルシウム（Ｃｍ）および鉄（Ｆｅ）の同友の濃度を 定量的に測定した。この実施例の試料用の小片を製造するために使用された石灰 化およびタンニング工程は上記の如くして実施された。試料用に挙げられている 処理コードは、２種の処Ｉｌ！！！を示している。

処理Ｅは、その後に上記で論じられているタンニング工程を受けた老化グリセロ ールａａａＢを用いている。処ＩＦはその後に上記で論じられているタンニング 工程を受ける０、１重量／容量％の硝酸第二鉄で韓波化されていゐ商業用等級の グリセロールを使用している。この実施例に関する全工程は、食塩水に貯蔵され た小片を取り出し、該小片を指定されている溶液を用いて１週間にわたり上記の 石灰化工程にかけ、その後、グルタルアルデヒドを用いる上記のタンニング工程 に１週間にわた吟かけることを含んでいる。次に小片をＦＥＴＨ（４％ホルムア ルデヒド−２２５％エタノール−１，２％ツイーン（ａポリソルベート９０アニ オン性表面活性剤−０，０２モルＨＥＰＥＳおよび７．４のｐＨを有する溶液） 中で３５℃において９時間にわたり殺菌した。

実施例６中の小片の移植および石灰化観察用に使用された工程は、上記のものと も異なっていた。最初に、小片を６匹の成長中の兎の背中に皮下移植した。第二 に、１２個の小片を６匹の各兎に背椎のＩＩＩＩｍに移植した。各時間間隔後に 、３個の小片を取り出し、そして各小片に関して定量的測定を行った。実施例６ で使用されたＣａおよびＦｅの定量的測定は下記の如くである：指定された各時 間間隔において、小片を体外移植し、そして食塩水ですすいで血液を除去した。

小片のＸ−線を可視観察できるまで行った。次に小片周辺の組織成長を適当な機 械的手段により取り出した。次に清浄化した小片を乾燥するまで親液性化工程に かけた。これは典型的には１６時間を要する。各小片に関する乾燥重量を記録し 、そして次に小片を３規定硝酸中で消化させ、残りの量を大きいフラスコ中で１ ０ミリメートルの蒸留Ｈ２０に調節した。石灰化百分率すなわちカルシウム含有 量および鉄含有量を、各小片に関する原子吸収による元素分析を用いて、測定し た。下表１に示されているカルシウムおよび鉄の百分率は各兎からの３個の小片 に対する平均である。

移植前の処理Ｅの組織中のカルシウムおよび鉄の百分率はカルシウムに関しては ００１２であり且つて鉄に関しては１２９５であり、そして処理Ｆに対してはカ ルシウムに関してはｏ、ｏｏｓであり且つ鉄に関しては１６６２であると測定さ れた。そこかられかるように、カルシウム吸収量は１２週間の期間にわたり鏝小 であった。

表１ 試料　処理　移植時間（週） 誉号　コード　３　５　９　１２ Ｃａ　Ｆｅ　Ｃａ　Ｆｅ　Ｃａ　Ｆａ　Ｃａ　ＦｅＩ　Ｅ　Ｏ，１８３２，２９ ３０，０６５０，４１１０，１１７Ｇ、５６０　０．０９８　０．９０１Ｆ　Ｏ ，０８８Ｇ、９３５　０．００４　０．８４２　０．１５１　１．０９０　０． ０？１　０．９３３２　Ｅ　Ｏ，１２４０，４９Ｇ　０．０２２　０．５０３　 ０．２２２　０．７３１　Ｇ、１００　０．７８８Ｆ　Ｏ，０６００，８４２０ ，０３１１，０２２０，０７７１，０Ｇ１　０．１１８　０．７９９３　Ｅ　Ｏ ，１７３０，６３００，０３３０，７０５０，１７３０，６６６０，０７７０， ６６３Ｆ　Ｏ，０６８０，８７５０，０３７０，８６５０，０６７０，９１６０ ，０８３１，１９６４Ｅ　Ｏ，０８２０，５２００，０３３０，６３２０，１３ ７０，５６１０，０３４０，４０６Ｆ　Ｏ，０７１０，７４５０，０２１０，９ ４２０，１０３０，９４８０，０５３１，００９５Ｅ　０．１１００．７９５　 −　−　０．１４３０．７８６０．０７３０．７２３Ｆ　Ｏ，１０５０，７７５ ０，０１１１，０４２−−０，２６９１，０２２６Ｅ　Ｏ，１０６０，７４７０ ，００８０，４５００，１７２０，３３２０，１１７０，６８０Ｆ　Ｏ，１１１ ０，９０９０，０１２０，９２４０，０７９０，９＋１６　０．０８３　１．２ ２１上記の実施例により示されている如く、本発明の方法は組織移植片の石灰化 を軽減するための有効な手段を提供するものである。しかしながら、本発明の方 法を実施する際の１つの困難は遊離蛋白質アミン基と競合する２種の反応に関連 している。すなわち、アミン基と第二鉄および／または第二錫イオンの間の反応 をい含む石灰化軽減工程並びにアミン基とアルデヒド、例えばグルタルアルデヒ ド、の間の反応を含むタンニング工程である。これらの２種の反応の均衡が組織 の最終的性質に直接影響する。

例えば、石灰化軽減工程が調節されない場合には、アミン基と結合する第二鉄お よび／または第二錫イオンの濃度がアルデヒドとの反応用に利用できるアミン部 位を制限してしまい、最終的組織生成物を硬くする。タンニング工程が調節され ない場合には、充分なアミン基を第二鉄および／または第二錫イオンとの結合用 に利用できずに、石灰化軽減効果を無効にしてしまう。

本発明の好適言様に従うと、１種以上の型のジアミンを活性化因子の存在下で組 織中に加える。ジアミンは蛋白質上の遊離カルボン酸残基および組織中に存在し ているムコ多糖類と、そして特に組織膠原質と、結合する。ジアミンとカルボン 酸残基および有用な活性化因子との結合に関するさらに詳細な説明は、ロイド（ Ｌｌｏｙｄ）およびバーンス（Ｂｕｒｎｓ）によるジャーナル・才ブ・ポＩマー ・サイエンス°ポ言マー・　ミスト盲−・エディシラン、１７巻、３４５９−３ ４８９頁（１９７９）中に開示されており、それはここでは一般的に参照用にそ して特に活性化因子の有用な型に関して記しておく。

固定された組織のジアミンを用いる処理は１９８８年３月８日に発行された米国 特許書号４，７２９，１３９および１９８４年１１月６日に発行された４、４８ １゜００９中に教示されており、それらの間者ともアウス・ナシエフ（Ａｗｓ　 Ｎｕｓｈｅｆ）に対して発行されている。これらの二特許中で論じられている工 程により開示されている如く、組織中へのジアミンの加入はその後に重合される 単量体と蛋白質のカルボン酸残基およびタンニングされた組織のムコ多糖類との 共有結合を補助することである。これらの二特許により教示されている工程の一 般的目的は、組織への重合体の含浸による移植可能組織中での石灰化の抑１１で ある。

ジアミンの適用は本発明の方法のいずれの段階においても実施できる。例えば、 ジアミン溶液は該方法の第一段階として適用することもできる。すなわち、ジア ミンｆＩＩ嫂はタンユング工程または石灰化軽減工程の前に適用される。これは 、アルデヒド並びに第二鉄および／または第二錫イオンとの結合用の別のアミン 基を与える。一方、ジアミン溶液を本発明の第一および第二段階の間で適用する こともできる。すなわち、２種の最初の段階の順序により、ジアミン溶液をタン ニング工程後にそして石灰化軽減工程前に適用することまたはその逆もできる。

本発明の好適な方法は、組織のタンニングおよびその後の石灰化軽減工程の実施 を含んでいろ。この好適態様では、ジアミン適用はタンニングおよび石灰化軽減 段階の間で実施される。

ジアミンは典型的には組織に水溶液状で適用され、ジアミンは水溶性である。

好適なジアミンは式Ｒ−ｉＮＨ２１２を有すゐものであり、ここでＲは炭素数が １−１０の環式または非環式アルキル、アリール、アルキレン、アリールアルキ ル、アリールアルキレン基である。選択されたジアミンは組織蛋白質網目構造中 に微晶に拡散可能でなければならずそして好適には水溶性でなければならない。

特に好適なジアミンはエチレンジアミンである。

活性化因子は典型的にはジアミンを含有している水溶液に直接加えられる。従っ て、有用な活性化因子も水溶性である。好適な活性化因子は１種以上の型のカル ボジイミド類であり、特に好適な活性化因子は１−エチル−３（３−ジメチルア ミノプロピル）−カルボジイミド−ＨＣＬである。

典型的には、組織をジアミンおよび活性化因子を含有している水溶液中で約５− 約３０分間にわたり溶液のｐＨを約４７５に調節してソーキングする。

組織中に存在している１モルの膠原質に対して少なくとも１５０モルのジアミン を確実に利用できるようにジアミンの濃度を選択しなければならない。このモル 比を理論化して、利用可能なカルボン酸残基に対するジアミンの有効結合を確実 にさせる。この理論は、１００．０００グラム乾燥重量の組織に対して１モルの 膠原質が存在しておりそして１モルの膠原質に対して１５０個のカルボン酸残基 が存在しでいるという仮定に基づいている。

ジアミンと共に適用される活性化因子の量も、膠原質中の遊離カルボン酸残基の この理論化された濃度に依存している。活性化因子の使用量は一般的には膠原質 中の利用可能なカルボン酸残基の理論数の少なくとも約５倍より多い。

１１匹二二工旦 下記の実施例は、本発明の好適な態様を示すものである。実施例７−１０の結果 は下表２−５に示されており、ここで処理コードＥおよびＣは実験的に処理され た組織およびｔ＃照組織を示している。

１１茜！− 下記の実施例は、エチレンジアミン（ＥＤ）を用いる移植可能な豚の・シ・臓弁 小片の処理を示している。弁組織をあらかじめグルタルアルデヒド−ＨＥＰＥＳ を用いる処理により固定した。ＥＤを用いる処理は、５％ホルムアルデヒド水溶 液中での硝酸第二鉄を用いる石灰化処理の前に行われた。

試験小片をグルタルアルデヒド／ＨＥＰＥＳＪＩ衝液（実施例１−５に関して以 上で記されている）で１週間にわたり処理した。次に小片を０．１モルＥＤを含 有している水溶液中でソーキングした。この水溶液は１グラム乾燥重量の組織光 たり５グラムの１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミ ド−ＨＣＬも含有していた。溶液のｐＨを４．７５に調節しながら、小片を３０ 分間にわたりソーキングした。次に小片を食塩水中ですすぎ、そして０１％の硝 酸第二鉄を含有している５％ホルムアルデヒド水溶液中で１週間にわたり、次に 硝酸第二鉄を含まないグルタルアルデヒド／ＨＥＰＥＳ緩衝液中で３週間にわた り、ソーキングした。小片を、４％ホルムアルデヒド中で室温において１２時間 ソーキングしその後ｏ、ｓｚｓ％グルタルアルデヒド／ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ緩衝食 塩水（ｐＨ７゜４）中ですすぐことにより、殺菌した。対照用小片をグルタルア ルデヒド／ＨＥＰＥＳ緩衝溶液でタンニングし、そしてＦＥＴＨで［Ｉした。移 植前の試験小片のカルシウムおよび鉄含有量はそれぞれｏ、ｏ　ｏ　ｓ％および ０９３％であった。

移植前の対照小片のカルシウムおよび鉄含有量はそれぞれ００１９％および００ ２４％であった。実施例１−５に関して以上で論じられている工程に従い、小片 を兎に移植し、次に取り出し、そして一定期間後に分析した。各試験に関する期 間は下表２に示されている如＜３，６．９および１２週間であった。取り出され た小片に関するカルシウムおよび鉄含有量並びに標準偏差が表２に示されている 。この実験は、ホルムアルデヒド水溶液中でのＥＤおよび硝酸第二鉄を用いる連 続的処理が実質的な石灰化の軽減をもたらすことを示してし）る。

表２ 兎　処理　移植時間（週） 暑号　コード　３　６　９　１２ Ｃａ　Ｆｅ　Ｃａ　Ｆ＠Ｃａ　Ｆｅ　Ｃａ　ＦｅＩ　Ｅ　０．１２１０．８９５ 　−−　−−　−−　−一　研究終了Ｃ−−−−−−−−−−−− ２Ｅ　Ｏ，１１２０，７６３１，２９３０，３８２０，１３５０，５３９ＣＧ、 １１３　０．００４　−−　−−　０．１９４　０．０５５３　Ｅ　０．０７３ 　Ｇ、５９３　０．１７１　０．５５８　０．１１６　０．５６８ＣＯ，２１４ ０，７４９０，４１８Ｇ、１１２　１．７７１　０．０４１４　Ｅ　１．７４５ 　０．６０６　０．２０９　Ｑ、５４１　１．１００　０．５５７（−−−−− −−−０，１０９０，０１７５Ｅ　Ｏ，１２００，６５１０，１４００，５８７ ０，１９６０，７１９ＣＯ，１２４００，２１８０，０３６０，４４１０，０２ １６Ｅ　Ｏ，１２４０，５７０２，４８６０，３０２０，２０１０，６０４ＣＧ 、０４８　０　０．２３０　０．０４９　０．２１１　０．０１７Ｅ　０．３８ ２±　０．６８０±　０．８６０±　０．４７４±　０．３５０士　０５９７± ０．０６８　０．１２６　１．０３０　０．１２５　０．４２１　０．０７２ｎ ＝６　ｎ−６ｎｍ５　ｎｍ５　ｎｍ５　ｎ１ｌｓ平均　ＣＯ，１２５±０．１８ ８±０．２８９±００６６±０５４５±００３０±±Ｓ、Ｄ、　０．０６８　０ ．３７４　０．Ｌ１２　０．０４１　０．６９６　０．０１７ｎ＊４　ｎｍ４　 ｎ−３ｎｍ３　ｎ＝５　ｎ＝５１五五■ 下記の実施例は、あらかじめ固定された移植可能な扉の心臓弁小片を最初にエチ レンジアミン（ＥＤ）を用いてそして次にホルムアルデヒド／エタノール水溶液 中での硝酸第二鉄を用いで処理する方法を示している。

試験小片を１週間にわたり実施例１−５で記載されている如きグルタルアルデヒ ド／ＨＥＰＥＳ緩衝液で処理した。次に小片を４７５のｐ　Ｈに調節されている ０、１Ｍ　ＥＤ溶液中で３０分間にわたり培養し、その後、１グラム（乾燥重量 ）の組織光たり５グラムのｌ−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カ ルボジイミド−ＨＣＬを加えた。反応は４．７５のｐＨにおいて３０分間にわた り進行した。次に小片を食塩水（０，９％）中ですすいだ。次に小片を１週間に わたり５％のホルムアルデヒド、３０％のエタノールおよび０，１％の硝酸第二 鉄を含有している水溶液中で処理し、次に３週間にわたり硝酸第二鉄を含まない グルタルアルデヒド／ＨＥＰＥＳ緩衝溶液中で処理した。小片を４％ホルムアル デヒドを用いて室温において１２時間にわたり殺菌し、次に７４のｐＨに保たれ ている０゜６２５％ＨＥＰＥＳ／グルタルアルデヒド溶液中ですすいだ。対照小 片はグルタルアルデヒド／ＨＥＰＥＳ緩衝溶液でタンニングし、そしてＦＥＴＨ で殺菌した。

移植前の試験小片のカルシウムおよび鉄含有量はそれぞれ０．００６％薯よび１ ゜９８３％であった。移植前の対照小片のカルシウムおよび鉄含有量はそれぞれ ０゜０１９％およびＯ，０２４％であった。実施例１−５に関して以上で論じら れている工程に従い、小片を兎に移植し、次に取り出し、そして一定期間後に分 析した。

各試験に関する期間は下表３に示されている如く３．６．９および１２週間であ った。取り出された小片に関するカルシウムおよび鉄含有量並びに標準偏差が表 ３に示されている。この実験は、ホルムアルデヒド／エタノール水溶液中でのＥ Ｄおよび硝酸第二鉄を用いる連続的処理が実質的な石灰化の軽減をもたらすこと を示している。

兎　処理　移植時間（週） 瞥号　コード　３　１ｉ　９　１２ Ｃａ　Ｆｅ　Ｃａ　Ｆｅ　Ｃａ　Ｆｅ　Ｃａ　ＦｅＩ　Ｅ　−−−−−−−−− −−一　研究終了Ｃ０，１２００，００２−−−−−−−−２Ｅ　Ｏ，９４１１ ，０４７０，４２４１，６９１０，３２７１，８５０ＣＯ，１３９０−−−−０ ，１６７０，０６０３Ｅ　０．１９６１．８９２　−−　−−　−−　−−Ｃ− −−−−−−−−−−− ４Ｋ　Ｏ，１９５１，９３ｇ　０．２６３　１．２２３　２．４４７　１．６２ ０ＣＯ，１２３００，１８３０，０２４４，８７３０，０１８５Ｅ　Ｏ，１６７ １，９６５−−−−０，２２２１，９６８Ｃ１，２４３０−−−−２，８３８０ ，０３３６Ｅ　０．１８８１．９５１　−−　−−　０．３６５２．１０９ＣＧ 、１５４　０　Ｇ、２３６　０．０４６　３．８２９　０．０４５Ｅ　０．３３ ７±１．７５９±　０．３３４±１．４５７±０．８４０±１．８８７±０．３ ３８　０．３９９　０．１１４　Ｇ、３３１　１．０？３　０．２０７ｎ＝５　 ｎｍ５　ｎ−２ｎｍ２　ｎ−４ｎ＋＋４平均　ＣＧ、３５６±０．０００４±０ ．２１０±０．０３５±２．９２７±０．０３９±±５．０．　０．４９６　０ ．００１　０．０３７　Ｇ、０１６　２．０１９　０．０１８ｎＩ１５　ｎ＝５ 　ｎ＝２　ｎｍ２　ｎｍ４　ｎ禦４１１五旦 下記の実施例は、最初にグルグルアルデヒド／ＨＥＰＥＳ緩衝液で固定されそし て次に石灰比熱Ｎ前にエチレンジアミン（ＥＤ）で処理されたた移植可能な豚の 心臓弁小片のホルムアルデヒド／グリセロール水溶液中での鋼鑵第二鉄を用いる 処理を示している。

試験小片を１週間にわたり（実施例１−５で記Ｉｌされている如く）グルタルア ルデヒド／ＨＥＰＥＳ緩衝液で処理した。次にそれらを０１モルのＥＤおよび５ グラムの１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド−Ｈ ＣＬ／ダラム（乾燥重量）の水溶液中で３０分間にわたりソーキングした。次に 小片を１週間にわたり５％のホルムアルデヒド、２４％のグリセロールおよび０ ゜１％の硝酸第二鉄を含有している水溶液中で処理し、次に３週間にわた９硝酸 第二鉄を含まないグルタルアルデヒド／ＨＥＰＥＳ緩衝溶液中で処理した。小片 を４％ホルムアルデヒドを用いて！温において１２時間にわたり殺菌し、次に実 施例７および８に関して記載されている如くしてＨＢＳ中の４％ホルムアルデヒ ドで室温において１２時間にねたりｔｌｌした。対照小片をグルタルアルデヒド ／ＨＥＰＥＳ緩衝溶液でタンニングし、そしてＦＥＴＨ７’ｆｉｌｌ＋、た。移 植前の試験小片のカルシウムおよび鉄含有量はそれぞれ０．００４％および０． ３０７％であった。移植前の対照小片のカルシウムおよび鉄含有量はそれぞれ０ ．０１９％および０．０２４％であった。実施例１−５に関して以上で論じられ ている工程に従い、小片を兎に移植し１次に取り出し、そして一定期間後に分析 した。各試験に関する期間は下表４に示されでいる如く３．６．９および１２週 間であった。取り出された小片に関するカルシウムおよび鉄含有量並びに標準偏 差が表４に示されている。この実験は、ホルムアルデヒド／グリセロール水溶液 中でのＥＤおよび硝酸第二鉄を用いる連続的処理が実質的な石灰化の軽減をもた らすことを示している。

兎　処理　移植時間（週） 昏号　コード　３　６　９　１２ Ｃａ　Ｆａ　Ｃａ　Ｆｅ　Ｃａ　Ｆｅ　Ｃａ　ＦｅＩ　Ｅ　−−−−０，１０９ ０，１６３−−−−−−−−ＣＧ、０７９０．０８８　−−　−−　−−　−− 　−−　−−２　Ｅ　Ｏ，１１００，３４５−−−−−−−−−−−＋ＣＯ，０ ９８Ｇ　−−−−−−−−−−−−３Ｅ　０．０８Ｇ　０．２４９　Ｇ、１６２ 　０．１６７　０．１７３　０．１６１　２．４７４　０．１０９ＣＯ，２６４ ０１，７７５０，００４１，３２００，０３ｇ　１．１４９　０．０５３４　Ｅ 　Ｏ，０８４Ｇ、１４０　１．０３５　０．１４６　Ｇ、２３１１　０．１９７ 　０．３４６　０．１５０Ｇ　Ｏ，２０００，０８４０，８９６０，０２４０， ２２８０，０３７−−−−５Ｋ　Ｏ，０６４０，１１６−−−一　−−−−０， １６５０，１フ２Ｃ−−−−０，１６２０，０１４０，２４００，０５２０，２ ３４０，０２１６Ｅ　Ｏ，０８３０，１８６０，１６２０，１４７０，８０５０ ，０６１３，４１１０，１１７ＣＯ，０８３００，２７１０，０３１０，１９９ ０，０４３０，８５６０，０５５Ｅ　Ｏ，０８４±０．２０７±０．３６７±ｏ 、　ｔｓｓ±０．４０５±０．１４０±１．５９９±０゜１３７± ０．０１６　Ｇ、０９２　Ｇ、４４６　０．０１１　０．３４８　０．０７０　 １．６００　０．０２９ｎ＝５　ｎ−５ｎｍ４　ｎｍ４　ｎｍ３　ｎ−３ｎ諺４ 　ｎｍ５平均　ＣＯ，１４５±００３４±０．７７６±０．０１８±０．４９７ ±０．０４２±０．７４６±０゜０４３± ±ＳＤ　００８３００４フ　Ｇ、７４０　０．０１２　０．５４９　０．００７ 　Ｇ、４６７　０．０１９ｎｗ５　ｎｍ５　ｎ露４　ｎｍ４　ｎｍ４　ｎｍ４　 ｎ歯３　ｎ−３１直五工ｌ 下記の実施例は、最初にグルタルアルデヒド／ＨＥＰＥＳ緩衝液で固定されそし て次に石灰化処理前にエチレンジアミン（ＥＤ）で処理されたた移植可能な豚の 心臓弁小片のエタノール／ホルムアルデヒド／グリセロール水溶液中での硝酸第 二鉄を用いる処理を示している。

試験小片を１週間にわたり（実施例１−５で記載されている如く）グルタルアル デヒド／ＨＥＰＥＳ緩衝液で処理した。次にそれらを０．１モルのＥＤおよび５ グラムの１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド−Ｈ ＣＬ／ダラム（乾燥重量）の水溶液中で３０分間にわたりソーキングし、小片を 次に食塩水中ですすいだ。次に小片を１週問にわたり０．１％の硝酸第二鉄を含 有しているエタノール／ホルムアルデヒド／グリセロール水溶液中で処理し１次 に３週間にわたり硝酸第二鉄を含まないグルタルアルデヒド／ＨＥＰＥＳ緩衝溶 液中で処理した。小片を次に実施例７および８に関して記載されている如くして ＨＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで１！温において１２時間にわた９Ｒ■した。

対照小片をグルタルアルデヒド／ＨＥＰＥＳ緩衝溶液でタンニングし、そしてＦ ＥＴＨで殺菌した。移植前の試験小片のカルシウムおよび鉄含有量はそれぞれ０ ．００７％および１．６０９％であった。移植前の対照小片のカルシウムおよび 鉄含有量はそれぞれ０．０１９％および０．０２４％であった。実施例１−５に 関して以上で論じられている工程に従い、小片を兎に移植し、次に取り出し、そ して一定期間後に分析した。各試験に間する期間は下表５に示されていゐ如く３ ．６．９および１２週間であった。取り出された小片に関するカルシウムおよび 鉄含有量並びに標準偏差が表５に示されている。この実験は、エタノール／ホル ムアルデヒド／グリセロール水溶液中でのＥＤおよび硝酸第二鉄を用い墨連続的 処理が実質的な石灰化の軽減をもたらすことを示している。

兎　処理　移植時ｆｉｌ！（週） 誉号　コード　３　６　９　１２ Ｃａ　Ｆｅ　Ｃａ　Ｆｅ　Ｃａ　Ｆｅ　Ｃｍ　ＦｅＩ　Ｋ　Ｏ，３３９１，６２ ５０，４９１１，３６５０，５５８１，２１！１１　０．４７７　１．３９１１ ＣＯ，１０５０，００６０，５６１０，０２５Ｑ、２４Ｂ　０．０６２　６６３ ７　０．０３７２　Ｅ　−−−−０，４７１１，４２５０，４６７１，４５９０ ，６１７１，２４９ＣＯ，１９５０，００４−−−−３，４２９０，０７３Ｑ、 ７３１　０．０２４３　Ｅ　Ｏ，２９５１，６４２０，６Ｏｒ１．４９９　−− 　−−　０．７２９　１．３０７ＣＯ，０４９００，１９５０，Ｑ４２　Ｌ、４ ０２　０．０４５　−−　−−４　Ｅ　Ｏ，２６７１，７５７０，５７２１，５ ３９０，７４１１１，２１１００，５７１１，７００ＣＯ，１３３０，００１２ ，４９５０，０２７６，２９１０，０ｆｆ９　０．７３１　０．Ｑ２４５　Ｅ　 Ｏ，１？７　１．３３１　０．４５６　１．４１６　−−　−−　０．７２９　 １．３０７ＣＯ，０８９００，１！１９　０．０１３　Ｌ、８７１　０．０１５ 　−−　−−６　Ｅ　０．２６９１．４０３０．６６５１．５９５　−−　−− 　−−　−−ＣＯ，１１１０，０１７０，２６３０，０１５−−−−−−−−Ｅ 　Ｏ，２６９±１５５２±０．５４４±１４７３±０．５９１±１．３４２±０ ６２５±１゜３９２± ０．０５９　０．１フ８　０．０８４　０．０ｇ６　０．１４３　０．１０１　 ０．１０８　０．１８０ｎｍ５　ｎｍ５　ｎｍ６　ｎｍ６　ｎ１Ｉ３　ｎ璽３　 ｎ−５ｎｍ５平均　ＣＯ，１４４±ｏ、ｏｏｓ±０．７４３±００２４±２６４ ８±００５３±２．７００−ｔ：　００２８士 ±Ｓ、Ｄ、　０．０４９　０．ＱＯ６０，９９＋　０．０１２　２．３３４　０ ．０２４　３．４１０　０．００８ｎ＝６　ｎｍ６　ｎｍ５　ｎｍ５　ｎ−５ｒ ＋ｌ１５　ｎ＝３　ｎｍ３好適態様を記載してきたが、本発明の範囲から逸脱し ない限り種々の改変および置換を行うことができる。従って、本発明は説明用に 記載されてきているが限定用に記載されているものではないことを理解すべきで ある。

国際調査報告 、１工１．。工、。ゎｍＮａＰσ／υＳ　９０１００６３９国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ　９０１００６３９ Ｓ＾　３４７５６

Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. １．生物学的に誘導された組織を、タンニング溶液、ジアミン、活性化因子、お よび可溶性の実質的に非一毒性の第二鉄塩、第二錫塩またはそれらの組み合わせ の溶液で処理することからなる、該生物学的材料の製造方法。
2. ２．該活性化因子がカルボジイミドである、請求項１に記載の方法。
3. ３．塩が第二鉄もしくは第二錫の硝酸塩、硫酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、ハロゲン 化物、クエン酸塩または酢酸塩である、請求項２に記載の方法。
4. ４．塩が硝酸第二鉄、硝酸第二錫、硫酸第二鉄、硫酸第二錫、塩化第二鉄、塩化 第二錫、クエン酸第二鉄、クエン酸第二錫、酢酸第二鉄または酢酸第二錫である 、請求項２に記載の方法。
5. ５．塩が水−混和性アルコール、グリコール、トリオール、またはアルデヒドの 水溶液中に溶解されている、請求項４に記載の方法。
6. ６．塩がエタノール、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはグリセロ ールの水溶液中に溶解されている、請求項４に記載の方法。
7. ７．溶液が約３０％までのエタノール、約５％までのホルムアルデヒド、約１％ までのグルタルアルデヒド、もしくは約３０％までのグリセロール、またはそれ らの混合物を含有している、請求項３に記載の方法。
8. ８．該第二鉄または第二錫塩溶液のｐＨが約２−約７の範囲である、請求項６に 記載の方法。
9. ９．該第二鉄または第二錫塩溶液のｐＨが約２−約３の範囲である、請求項６に 記載の方法。
10. １０．該第二鉄または第二錫塩溶液が約０．０１−約２．５重量％の第二鉄また は第二錫塩を含有している、請求項６に記載の方法。
11. １１．該第二鉄または第二錫塩溶液が約０．０５−約１．５重量％の第二鉄また は第二鉄塩を含有している、請求項１０に記載の方法。
12. １２．該ジアミンおよび該活性化因子を該組織に単一水溶液状で適用する、請求 項１に記載の方法。
13. １３．該ジアミンおよび該活性化因子を該組織に単一水溶液状で適用する、請求 項２に記載の方法。
14. １４．該ジアミンおよび該活性化因子を該組織に単一水溶液状で適用する、請求 項５に記載の方法。
15. １５．該ジアミンおよび該活性化因子を該組織に単一水溶液状で適用する、請求 項６に記載の方法。
16. １６．該ジアミンが式： Ｒ−（ＮＨ２）２ ［式中、 ＲはＣ１−Ｃ１０環式または非環式アルキル、アリール、アルキレン、アリール アルキル、アリールアルキレン基である］を有するものから選択される、請求項 １４に記載の方法。
17. １７．該ジアミンが式： Ｒ−（ＮＨ２）２ ［式中、 ＲはＣ１−Ｃ１０環式または非環式アルキル、アリール、アルキレン、アリール アルキル、アリールアルキレン基である］を有するものから選択される、請求項 １５に記載の方法。
18. １８．Ｒが直鎖脂肪族基である、請求項１６に記載の方法。
19. １９．Ｒが直鎖脂肪族基である、請求項１７に記載の方法。
20. ２０．該ジアミンがエチレンジアミンである、請求項１４に記載の方法。
21. ２１．該ジアミンがエチレンジアミンやある、請求項１５に記載の方法。
22. ２２．該カルボジイミドが１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カ ルボジイミド−ＨＣＬである、請求項１４に記載の方法。
23. ２３．該カルボジイミドが１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カ ルボジイミド−ＨＣＬである、請求項１５に記載の方法。
24. ２４．該生物学的組織が雰の心臓弁の形状である、請求項１に記載の方法。
25. ２５．置生物学的組織が雰の心臓弁の形状である、請求項２に記載の方法。
26. ２６．請生物学的組織が雰の心臓弁の形状である、請求項１４に記載の方法。
27. ２７．該失着牛的線量が雰の心臓弁の形状である、請求項１５に記載の方法。
28. ２８．置生アール学的君重が雰の心臓弁の形状である、請求項１６に記載の方法 。
29. ２９．該ジアミンを該組織に１５０モルのジアミン対１モルの該組織膠原質の割 合で適用する、請求項１に記載の方法。
30. ３０．該ジアミンを該組織に１５０モルのジアミン対１モルの該組織膠原質の割 合で適用する、請求項２に記載の方法。
31. ３１．該ジアミンを該組織に１５０モルのジアミン対１モルの該組織膠原質の割 合で適用する、請求項１４に記載の方法。
32. ３２．該ジアミンを該組織に１５０モルのジアミン対１モルの該組織膠原質の割 合で適用する、請求項１５に記載の方法。
33. ３３．該ジアミンを該組織に１５０モルのジアミン対１モルの該組織膠原質の割 合で適用する、請求項１６に記載の方法。
34. ３４．該ジアミンを該組織に該組織膠原質のカルボン酸残基の５倍の割合で適用 する、請求項２９に記載の方法。
35. ３５．該ジアミンを該組織に該組織膠原質のカルボン酸残基の５倍の割合で適用 する、請求項３０に記載の方法。
36. ３６．該ジアミンを該組織に該組織膠原質のカルボン酸残基の５倍の割合で適用 する、請求項３１に記載の方法。
37. ３７．該ジアミンを該組織に該組織膠原質のカルボン酸残基の５倍の割合で適用 する、請求項３２に記載の方法。
38. ３８．該ジアミンを該組織に該組織膠原質のカルボン酸残基の５倍の割合で適用 する、請求項３３に記載の方法。
39. ３９．生物学的に誘導された組織をタンニングし、該タンニングされた組織を１ 種以上のジアミンの水溶液を１種以上の活性化因子の水溶液と組み合わせたもの で処理し、そして次に該タンニングされた組織を可溶性の実質的に非一毒性の第 二鉄塩、第二錫塩またはそれらの組み合わせの溶液で処理することからなる、該 生物学的材料の製造方法。
40. ４０．該ジアミンおよび該溶性化因子を該組織に単一水溶液状で適用する、請求 項３９に記載の方法。
41. ４１．該活性化因子がカルボジイミドである、請求項３９に記載の方法。
42. ４２．該活性化因子がカルボジイミドである、請求項４０に記載の方法。
43. ４３．該ジアミンを該組織に１５０モルのジアミン対１モルの該組織膠原質の割 合で適用する、請求項４１に記載の方法。
44. ４４．該ジアミンを該組織に１５０モルのジアミン対１モルの該組織膠原質の割 合で適用する、請求項４２に記載の方法。
45. ４５．塩が第二鉄もしくは第二錫の硝酸塩、硫酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、ハロゲ ン化物、クエン酸塩または酢酸塩である、請求項４４に記載の方法。
46. ４６．塩が硝酸第二鉄、硝酸第二錫、硫酸第二鉄、硫酸第二錫、塩化第二鉄、塩 化第二錫、クエン酸第二鉄、クエン酸第二錫、酢酸第二鉄または酢酸第二錫であ る、請求項４４に記載の方法。