JP3510246B2 - アルデヒド処理された生物学的組織の抗石灰化処理 - Google Patents
アルデヒド処理された生物学的組織の抗石灰化処理Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、アルデヒド処理された生物学的組織（alde
hyde tanned biological−tissue）の抗石灰化処理方法
に関するもので、より詳細には、アルデヒド処理された
組織の機械的強度を損なうことなくイン・ビボでの石灰
化を最小限にし、かつ細胞毒性を低下させる抗石灰化処
理方法に関する。
hyde tanned biological−tissue）の抗石灰化処理方法
に関するもので、より詳細には、アルデヒド処理された
組織の機械的強度を損なうことなくイン・ビボでの石灰
化を最小限にし、かつ細胞毒性を低下させる抗石灰化処
理方法に関する。
タンパク質に特有のアミノ基（NH2）を有する生物学
的組織をグルタルアルデヒド（CHO（CH2）3CHO）により
処理すると、グルタルアルデヒドは、架橋反応によって
アミノ含有タンパク質同士を結合させる。その結果得ら
れる架橋生成物は、グルタルアルデヒドの両方のアルデ
ヒド基が異なったアミノ基と反応するために、フリーの
アルデヒド基を有しないものもあれば、両方のアミノ基
が、グルタルアルデヒドの同じアルデヒド基と反応する
ために、１のフリーのアルデヒド基を維持しているもの
もある。両方のタイプの架橋生成物は互いに平衡に存在
するので、グルタルアルデヒド処理された生物学的組織
は、常にフリーのアルデヒド基を持つことになる。
的組織をグルタルアルデヒド（CHO（CH2）3CHO）により
処理すると、グルタルアルデヒドは、架橋反応によって
アミノ含有タンパク質同士を結合させる。その結果得ら
れる架橋生成物は、グルタルアルデヒドの両方のアルデ
ヒド基が異なったアミノ基と反応するために、フリーの
アルデヒド基を有しないものもあれば、両方のアミノ基
が、グルタルアルデヒドの同じアルデヒド基と反応する
ために、１のフリーのアルデヒド基を維持しているもの
もある。両方のタイプの架橋生成物は互いに平衡に存在
するので、グルタルアルデヒド処理された生物学的組織
は、常にフリーのアルデヒド基を持つことになる。
移植片にあるフリーのアルデヒド基は、局所的炎症反
応の誘発およびそれに続く移植片の石灰化を伴う。未反
応のグルタルアルデヒドを除去するするためには、アル
デヒド処理された組織を激しく洗浄することが有効であ
るが、これは、組織のタンパク質と反応したグルタルア
ルデヒドのフリーのアルデヒド基を除去するには、無効
である。組織のタンパク質と反応したグルタルアルデヒ
ドからのフリーのアルデヒド基を除去するための、アル
デヒド処理された生物学的組織の既知の処理（例えば、
酸性バッファー中のアミノ酸）は、アルデヒド処理され
た組織の機械的的強度を損ない、それによりアルデヒド
処理の真の目的は達成されない。
応の誘発およびそれに続く移植片の石灰化を伴う。未反
応のグルタルアルデヒドを除去するするためには、アル
デヒド処理された組織を激しく洗浄することが有効であ
るが、これは、組織のタンパク質と反応したグルタルア
ルデヒドのフリーのアルデヒド基を除去するには、無効
である。組織のタンパク質と反応したグルタルアルデヒ
ドからのフリーのアルデヒド基を除去するための、アル
デヒド処理された生物学的組織の既知の処理（例えば、
酸性バッファー中のアミノ酸）は、アルデヒド処理され
た組織の機械的的強度を損ない、それによりアルデヒド
処理の真の目的は達成されない。
現在世界中で使用されているバイオ人工心臓弁（biop
rosthetic heart valve）は、グルタルアルデヒドによ
り処理されたブタの大動脈弁またはウシの心膜で作られ
ている。生物学的動脈代用物は、グルタルアルデヒド処
理されたウシの心膜の異種移植管（xenograft vessel）
または同種移植管（homograft vessel）で作られてい
る。グルタルアルデヒド処理された組織から作られた人
工心臓弁は、血栓塞栓症のリスクが特に低く、疾患のあ
る自然弁の優秀な代用物である。しかしながら、これら
は、移植後５年以内でほとんど100％の小児に起こる、
先に述べた石灰化性向のためにその有用性が減じられて
いる。上皮小体亢進症あるいは腎不全の成人もこの性向
を持つ。石灰化は、移植片を不全にし、再取り換えを必
要とするために、老人を除いてそれを頻繁に使用するこ
とが妨げられている。
rosthetic heart valve）は、グルタルアルデヒドによ
り処理されたブタの大動脈弁またはウシの心膜で作られ
ている。生物学的動脈代用物は、グルタルアルデヒド処
理されたウシの心膜の異種移植管（xenograft vessel）
または同種移植管（homograft vessel）で作られてい
る。グルタルアルデヒド処理された組織から作られた人
工心臓弁は、血栓塞栓症のリスクが特に低く、疾患のあ
る自然弁の優秀な代用物である。しかしながら、これら
は、移植後５年以内でほとんど100％の小児に起こる、
先に述べた石灰化性向のためにその有用性が減じられて
いる。上皮小体亢進症あるいは腎不全の成人もこの性向
を持つ。石灰化は、移植片を不全にし、再取り換えを必
要とするために、老人を除いてそれを頻繁に使用するこ
とが妨げられている。
未処理の組織を用いるバイオ人工弁による置換という
選択肢は、未処理の組織が部分的消化と吸収を受けるた
めに、時間とともにその強度が低下し、最終的には破壊
するために容認されない。組織をアルデヒドにより処理
することは、時間とともに強度が低下することを防ぐか
または最小限にする。
選択肢は、未処理の組織が部分的消化と吸収を受けるた
めに、時間とともにその強度が低下し、最終的には破壊
するために容認されない。組織をアルデヒドにより処理
することは、時間とともに強度が低下することを防ぐか
または最小限にする。
機械的弁による置換という選択肢は、（弁血栓症を防
ぐために）抗凝集を絶対的に必要とし、また、たとえ適
切に抗凝集を施しても、持続して塞栓が発生するという
顕著な不利益を有している。これらの問題は、多くの小
児が弁性心臓疾患に罹り、抗凝集策を施すことが高率の
血栓症および出血（haemorrhage）の両者を伴って困難
である第三世界において拡大される。
ぐために）抗凝集を絶対的に必要とし、また、たとえ適
切に抗凝集を施しても、持続して塞栓が発生するという
顕著な不利益を有している。これらの問題は、多くの小
児が弁性心臓疾患に罹り、抗凝集策を施すことが高率の
血栓症および出血（haemorrhage）の両者を伴って困難
である第三世界において拡大される。
石灰化しなかったバイオ人工弁は、選択するべき弁で
ある。これは、現在使用されているすべてのバイオ人工
弁にとって代るばかりでなく、現在使用されている機械
的弁の相当数の症例においてもより好まれている。その
ような弁は、弁交換手術の数を増加させることができ、
特に開発途上国における結果を改良すると思われる。他
の用途のための処理された生物組織の製造は、商業的に
はより少ないが、より改良された調整法を求める動きや
可能性は、同様である。しかしながら、今日まで、抗石
灰化処理が成功したことは、報告されていない。
ある。これは、現在使用されているすべてのバイオ人工
弁にとって代るばかりでなく、現在使用されている機械
的弁の相当数の症例においてもより好まれている。その
ような弁は、弁交換手術の数を増加させることができ、
特に開発途上国における結果を改良すると思われる。他
の用途のための処理された生物組織の製造は、商業的に
はより少ないが、より改良された調整法を求める動きや
可能性は、同様である。しかしながら、今日まで、抗石
灰化処理が成功したことは、報告されていない。
アルデヒド処理された組織から作られた人工心臓弁
は、それから作られた移植片の内皮化を阻害する細胞毒
性というさらなる不利益を有する。細胞毒性は、潜在的
な石灰化に比べて、アルデヒド処理された移植片の使用
に与える問題はより小さいが、特に移植片の内皮化が重
要であると思われる場合において、アルデヒド処理され
た移植片を広範に採用することを妨げる問題として残
る。
は、それから作られた移植片の内皮化を阻害する細胞毒
性というさらなる不利益を有する。細胞毒性は、潜在的
な石灰化に比べて、アルデヒド処理された移植片の使用
に与える問題はより小さいが、特に移植片の内皮化が重
要であると思われる場合において、アルデヒド処理され
た移植片を広範に採用することを妨げる問題として残
る。
したがって、本発明の目的は、イン・ビボでの石灰化
を最小にするために、アルデヒド処理された生物学的組
織を処理する方法を提供することにある。
を最小にするために、アルデヒド処理された生物学的組
織を処理する方法を提供することにある。
他の目的は、アルデヒドによる処理で得られた機械的
強度を損なうことのない、そのような処理方法を提供す
ることである。
強度を損なうことのない、そのような処理方法を提供す
ることである。
さらなる目的は、移植片の内皮化を阻害する、アルデ
ヒド処理された移植片の細胞毒性も低減させる、そのよ
うな処理方法を提供することである。
ヒド処理された移植片の細胞毒性も低減させる、そのよ
うな処理方法を提供することである。
また、単純で、経済的でかつ安全なそのような処理方
法を提供することも目的である。
法を提供することも目的である。
発明の概要
上記および関連する本発明の目的は、イン・ビボでの
石灰化を最小にする、アルデヒド処理された生物学的組
織の処理方法において達成される。この方法は、式 （ここで、Ｒは、CH2OHまたはアルキル基、R'は、Ｈ、
アルキル基またはＯ−アシル（アシルは、C2〜C9または
カルボキシアルキル）；または （ここで、Ｒは、Ｈまたはアルキル基、R'は、Ｈ、アル
キル基、Ｏ−アルキルまたはＯ−カルボキシアルキル）
を有する少なくとも１の液体ポリオールにより、アルデ
ヒド処理された生物学的組織を処理する工程を含む。
石灰化を最小にする、アルデヒド処理された生物学的組
織の処理方法において達成される。この方法は、式 （ここで、Ｒは、CH2OHまたはアルキル基、R'は、Ｈ、
アルキル基またはＯ−アシル（アシルは、C2〜C9または
カルボキシアルキル）；または （ここで、Ｒは、Ｈまたはアルキル基、R'は、Ｈ、アル
キル基、Ｏ−アルキルまたはＯ−カルボキシアルキル）
を有する少なくとも１の液体ポリオールにより、アルデ
ヒド処理された生物学的組織を処理する工程を含む。
好ましい態様において、上記ポリオールは、プロピレ
ングリコール（実際的には1,2−プロパンジオール）、
プロパンジオール（実際的には1,3−プロパンジオー
ル）、2,3−ブチレングリコールおよびグリセリンより
なる群から選ばれる。ポリオールは、好ましくはジオー
ル、特に好ましくは、プロピレングリコールである。ポ
リオールは、好ましくは、室温で液体で実質的に無溶媒
でかつアルデヒの環状付加物（ring adduct）、特に５
または６員の環状付加物を形成する。
ングリコール（実際的には1,2−プロパンジオール）、
プロパンジオール（実際的には1,3−プロパンジオー
ル）、2,3−ブチレングリコールおよびグリセリンより
なる群から選ばれる。ポリオールは、好ましくはジオー
ル、特に好ましくは、プロピレングリコールである。ポ
リオールは、好ましくは、室温で液体で実質的に無溶媒
でかつアルデヒの環状付加物（ring adduct）、特に５
または６員の環状付加物を形成する。
上記アルキル基は、好ましくはC1〜C5である。
好ましい方法は、アルデヒド処理された生物学的組織
を、アルデヒドの５〜６員の環状付加物を形成する、プ
ロピレングリコール、プロパンジオールおよび2,3−ブ
チレングリコールからなる群より選ばれる少なくとも１
の実質的に無溶媒の液体ジオールによって処理すること
を含む。
を、アルデヒドの５〜６員の環状付加物を形成する、プ
ロピレングリコール、プロパンジオールおよび2,3−ブ
チレングリコールからなる群より選ばれる少なくとも１
の実質的に無溶媒の液体ジオールによって処理すること
を含む。
この処理は、アルデヒド処理された組織の機械的強度
を損なうことなく、アルデヒド処理された組織の細胞毒
性を減少させる。
を損なうことなく、アルデヒド処理された組織の細胞毒
性を減少させる。
好ましい態様の詳細な説明
本発明によれば、アルデヒド処理された生物学的組織
を処理して、アルデヒド処理された組織の機械的強度を
損なうことなく、イン・ビボでの石灰化を最小にし、さ
らに、アルデヒド処理された組織の細胞毒性を減少させ
る。アルデヒド処理された組織の意図する用途により、
未処理の生物学的組織は、多数の通常のアルデヒド処理
剤のいずれもを使用してアルデヒド処理することができ
るが、グルタルアルデヒドが好ましい。グルタルアルデ
ヒドは、１つではなく１対のアルデヒド基を含有するた
め、２の反応メカニズムが可能で、生物学的組織のたん
ぱく質を架橋する可能性を高めるからである。
を処理して、アルデヒド処理された組織の機械的強度を
損なうことなく、イン・ビボでの石灰化を最小にし、さ
らに、アルデヒド処理された組織の細胞毒性を減少させ
る。アルデヒド処理された組織の意図する用途により、
未処理の生物学的組織は、多数の通常のアルデヒド処理
剤のいずれもを使用してアルデヒド処理することができ
るが、グルタルアルデヒドが好ましい。グルタルアルデ
ヒドは、１つではなく１対のアルデヒド基を含有するた
め、２の反応メカニズムが可能で、生物学的組織のたん
ぱく質を架橋する可能性を高めるからである。
本発明の方法は、式
（ここで、Ｒは、CH2OHまたはアルキル基、R'は、Ｈ、
アルキル基またはＯ−アシル（アシルは、C2〜C9または
カルボキシアルキル）；または （ここで、Ｒは、Ｈまたはアルキル基、R'は、Ｈ、アル
キル基、Ｏ−アルキルまたはＯ−カルボキシアルキル）
を有する少なくとも１の液体ポリオールにより、アルデ
ヒド処理された生物学的組織を処理する工程に特徴があ
る。
アルキル基またはＯ−アシル（アシルは、C2〜C9または
カルボキシアルキル）；または （ここで、Ｒは、Ｈまたはアルキル基、R'は、Ｈ、アル
キル基、Ｏ−アルキルまたはＯ−カルボキシアルキル）
を有する少なくとも１の液体ポリオールにより、アルデ
ヒド処理された生物学的組織を処理する工程に特徴があ
る。
本発明で有用なポリオールは、好ましくは室温で液体
で、実質的に無溶媒（すなわち、それらは濃縮された形
態で用いられる）である。室温で液体のポリオールは、
化学反応性および滅菌の容易性の両面で好ましい。さら
に、室温で固体のジオールは、組織を乾燥させ、柔軟で
なくする傾向がある。無溶媒の（少なくとも99％純粋
な）ポリオールが好ましい。なぜならば、溶媒が存在す
ることにより、組織のタンパク質のアミノ基と反応可能
な官能性基が付加的に導入され、アルデヒド処理メカニ
ズムは可逆的なので、アルデヒド処理された組織におけ
る架橋の進展を妨げるからである。しかしながら、少な
くとも60％のポリオールを含有するポリオール溶液もま
た有用である。
で、実質的に無溶媒（すなわち、それらは濃縮された形
態で用いられる）である。室温で液体のポリオールは、
化学反応性および滅菌の容易性の両面で好ましい。さら
に、室温で固体のジオールは、組織を乾燥させ、柔軟で
なくする傾向がある。無溶媒の（少なくとも99％純粋
な）ポリオールが好ましい。なぜならば、溶媒が存在す
ることにより、組織のタンパク質のアミノ基と反応可能
な官能性基が付加的に導入され、アルデヒド処理メカニ
ズムは可逆的なので、アルデヒド処理された組織におけ
る架橋の進展を妨げるからである。しかしながら、少な
くとも60％のポリオールを含有するポリオール溶液もま
た有用である。
本発明で使用する好ましいポリオールは、ジオールで
あるプロピレングリコール（Ｈ（CHOH）2CH3）（1,2−
プロパンジオールとしても知られている）、1,3−プロ
パンジオール（（CH2OH）2CH2）および2,3−ブチレング
リコール（CH3（CHOH）2CH3）、並びにトリオールであ
るグリセリン（（CH2OH）2CHOH）である。ブタンジオー
ルおよびペンタンジオールのような他のジオールもま
た、本発明の方法において有効であることが明らかにな
った。実際、置換基ＲおよびR'に、より大きいアルキル
基（C4、C5など）を用いると、フリーのアルデヒドの化
学結合を減じることなく脂質溶解性が増加し、その架橋
を弱めることなく処理された組織の可塑性が増加する。
ヒドロキシ基間の鎖長は、いかなる置換基の鎖長または
総鎖長よりも重要であることは明らかである。
あるプロピレングリコール（Ｈ（CHOH）2CH3）（1,2−
プロパンジオールとしても知られている）、1,3−プロ
パンジオール（（CH2OH）2CH2）および2,3−ブチレング
リコール（CH3（CHOH）2CH3）、並びにトリオールであ
るグリセリン（（CH2OH）2CHOH）である。ブタンジオー
ルおよびペンタンジオールのような他のジオールもま
た、本発明の方法において有効であることが明らかにな
った。実際、置換基ＲおよびR'に、より大きいアルキル
基（C4、C5など）を用いると、フリーのアルデヒドの化
学結合を減じることなく脂質溶解性が増加し、その架橋
を弱めることなく処理された組織の可塑性が増加する。
ヒドロキシ基間の鎖長は、いかなる置換基の鎖長または
総鎖長よりも重要であることは明らかである。
本発明において、各種プロパンジオールおよび2,3−
ブチレングリコールのような二置換ジオールは、グリセ
リンのような三置換トリオールよりも高い安定性と大き
い有効性を示す。フリーのヒドロキシ基を含む転移状態
（transition state）は、加水分解を受けやすく、望ま
しくないフリーのアルデヒドを生成するが、フリーのヒ
ドロキシ基の結合に基礎をおく転移状態は、ジオール付
加物からは形成されない。従って、アルデヒドブロック
剤としては、ポリオールよりもジオールがより有効であ
り、アルデヒドによって誘導される石灰化を低下させる
ことが示された。好ましいジオールは、プロピレングリ
コールである。
ブチレングリコールのような二置換ジオールは、グリセ
リンのような三置換トリオールよりも高い安定性と大き
い有効性を示す。フリーのヒドロキシ基を含む転移状態
（transition state）は、加水分解を受けやすく、望ま
しくないフリーのアルデヒドを生成するが、フリーのヒ
ドロキシ基の結合に基礎をおく転移状態は、ジオール付
加物からは形成されない。従って、アルデヒドブロック
剤としては、ポリオールよりもジオールがより有効であ
り、アルデヒドによって誘導される石灰化を低下させる
ことが示された。好ましいジオールは、プロピレングリ
コールである。
本発明の方法において、多種の異なったジオールを用
いることができるが、アルデヒドの５員または６員環状
付加物を生成するジオールは、環状付加物がより安定な
ため、トリオールあるいはポリオールよりもより優れた
石灰化阻害剤であることが見い出された。さらに詳しく
は、本発明の好ましいジオールは、1,3−ジオキソラン
環または1,3−ジオキサン環を与える。グリセリンもま
た、グルタルアルデヒド処理された組織とジオキソラン
およびジオキサンの両方の環を形成することができ、こ
の２の環形態は、互いに平衡に存在する。しかしなが
ら、グリセリンから形成された環状付加物は両者とも
（直接的あるいは間接的に）環に結合したフリーのヒド
ロキシ基を含むが、ジオール付加物は、フリーのヒドロ
キシ基を含有せず、より安定である。
いることができるが、アルデヒドの５員または６員環状
付加物を生成するジオールは、環状付加物がより安定な
ため、トリオールあるいはポリオールよりもより優れた
石灰化阻害剤であることが見い出された。さらに詳しく
は、本発明の好ましいジオールは、1,3−ジオキソラン
環または1,3−ジオキサン環を与える。グリセリンもま
た、グルタルアルデヒド処理された組織とジオキソラン
およびジオキサンの両方の環を形成することができ、こ
の２の環形態は、互いに平衡に存在する。しかしなが
ら、グリセリンから形成された環状付加物は両者とも
（直接的あるいは間接的に）環に結合したフリーのヒド
ロキシ基を含むが、ジオール付加物は、フリーのヒドロ
キシ基を含有せず、より安定である。
イン・ビトロ試験によれば、本発明にしたがって処理
されたグルタルアルデヒド処理組織は、脈管性（vascul
ar）内皮細胞を接種すると、内皮層を構築したが、本発
明にしたがって処理されていないグルタルアルデヒド処
理組織は構築しなかった。従って、本発明は、本発明に
従い形成された移植片が、その接続部位（attachment）
になめらかに適合し、その後適正に機能することの可能
性を高める手段を提供する。
されたグルタルアルデヒド処理組織は、脈管性（vascul
ar）内皮細胞を接種すると、内皮層を構築したが、本発
明にしたがって処理されていないグルタルアルデヒド処
理組織は構築しなかった。従って、本発明は、本発明に
従い形成された移植片が、その接続部位（attachment）
になめらかに適合し、その後適正に機能することの可能
性を高める手段を提供する。
イン・ビボ試験によれば、本発明に従い処理されたグ
ルタルアルデヒド処理組織の移植片は、物理的な一体性
（integrity）（例えば引張り強さ）を保ち、本発明に
従って処理されていないグルタルアルデヒド処理組織に
比べてより柔軟で硬化しなかった。高められた物理的一
体性、柔軟さおよびより低い硬化性は、さらにこの組織
の人工弁置換物としての有用性を高める。
ルタルアルデヒド処理組織の移植片は、物理的な一体性
（integrity）（例えば引張り強さ）を保ち、本発明に
従って処理されていないグルタルアルデヒド処理組織に
比べてより柔軟で硬化しなかった。高められた物理的一
体性、柔軟さおよびより低い硬化性は、さらにこの組織
の人工弁置換物としての有用性を高める。
本発明に従って、フレッシュな生物学的組織（すなわ
ち、アルデヒド処理されていない生物学的組織）を処理
すると、組織の機械的強度が低下するが、アルデヒド処
理後に本発明に従った処理をすると、石灰化を防ぎなが
ら弁の強度を高める。
ち、アルデヒド処理されていない生物学的組織）を処理
すると、組織の機械的強度が低下するが、アルデヒド処
理後に本発明に従った処理をすると、石灰化を防ぎなが
ら弁の強度を高める。
より具体的には、本発明の方法に従えば、アルデヒド
処理された組織を、過剰の未反応アルデヒドを除去する
ために食塩水で洗浄する。その後、洗浄された組織は、
本発明に従ったポリオールにより処理し、保存し、使用
に供される。もし望めば、ポリオール処理は、食塩水洗
浄と合体する（すなわち同時に行う）こともできる。
処理された組織を、過剰の未反応アルデヒドを除去する
ために食塩水で洗浄する。その後、洗浄された組織は、
本発明に従ったポリオールにより処理し、保存し、使用
に供される。もし望めば、ポリオール処理は、食塩水洗
浄と合体する（すなわち同時に行う）こともできる。
本発明に従って処理された材料は、心臓弁、脈管（ve
ssel）、食道、気管、ケン、靱帯、筋膜、膜およびこれ
ら構造物の部分として使用することができる。
ssel）、食道、気管、ケン、靱帯、筋膜、膜およびこれ
ら構造物の部分として使用することができる。
例Ｉ
この例は、（ａ）フレッシュな組織（すなわちアルデ
ヒド処理も、本発明に従った処理もされていない組
織）、（ｂ）グルタルアルデヒド処理されているが、本
発明に従った処理はされていない組織および（ｃ）本発
明に従って（グリセリンまたはプロピレングリコールに
よって）処理されたグルタルアルデヒド処理組織の移植
後70日におけるカルシウム含有量を比較する。
ヒド処理も、本発明に従った処理もされていない組
織）、（ｂ）グルタルアルデヒド処理されているが、本
発明に従った処理はされていない組織および（ｃ）本発
明に従って（グリセリンまたはプロピレングリコールに
よって）処理されたグルタルアルデヒド処理組織の移植
後70日におけるカルシウム含有量を比較する。
フレッシュなウシの心膜を0.6％グルタルアルデヒド
（Glu）により処理し、食塩水で洗浄し、ジオール（す
なわちプロピレングリコール）またはトリオール（すな
わち60重量％または99重量％グリセリン）のいずれかを
含有する容器に移した。続いて、この材料をラットに移
植し、フレッシュな組織およびアルデヒド処理したが本
発明に従って処理していない検体も同様にした。
（Glu）により処理し、食塩水で洗浄し、ジオール（す
なわちプロピレングリコール）またはトリオール（すな
わち60重量％または99重量％グリセリン）のいずれかを
含有する容器に移した。続いて、この材料をラットに移
植し、フレッシュな組織およびアルデヒド処理したが本
発明に従って処理していない検体も同様にした。
70日後に移植片は回収され、そのカルシウム含有量
を、生物学的組織１ミリグラム当たりのカルシウム量
（マイクログラム）を測定した。標準偏差（S.D.）およ
びそれぞれの場合で試験したラットの数とともに、結果
を表１に示す。
を、生物学的組織１ミリグラム当たりのカルシウム量
（マイクログラム）を測定した。標準偏差（S.D.）およ
びそれぞれの場合で試験したラットの数とともに、結果
を表１に示す。
フレッシュ組織に比べて、グルタルアルデヒド（GL
U）処理を施すと、組織の石灰化を高めたのに対して、
グルタルアルデヒド処理した組織に、本発明に従って実
質的に純粋な（99％）グリセリン処理を施すと、石灰化
が和らげられ、さらにグルタルアルデヒド処理した組織
を本発明に従ってプロピレングリコール（PG）処理を施
すと、石灰化の阻害はより効果的であった。
U）処理を施すと、組織の石灰化を高めたのに対して、
グルタルアルデヒド処理した組織に、本発明に従って実
質的に純粋な（99％）グリセリン処理を施すと、石灰化
が和らげられ、さらにグルタルアルデヒド処理した組織
を本発明に従ってプロピレングリコール（PG）処理を施
すと、石灰化の阻害はより効果的であった。
例II
表２
表２には、表１に示されたデータを得るために用いた
実験と平行に行われた実験から得られたデータを示す。
この実験の目的は、本発明の処理が、回収された移植片
の機械的強度に関連した性質に及ぼす効果を測定するこ
とである。最大引張り応力（Smax）およびヒドロキシプ
ロリン含有量（OHP）が、（ａ）グルタルアルデヒド固
定されたウシの心膜ストリップ（Glu.）、（ｂ）グルタ
ルアルデヒド固定されかつプロピレングリコール処理さ
れたウシの心膜ストリップ（Glu.＋PG）および（ｃ）未
固定でグリセリン処理されたウシの心膜ストリップにつ
いて測定された。
実験と平行に行われた実験から得られたデータを示す。
この実験の目的は、本発明の処理が、回収された移植片
の機械的強度に関連した性質に及ぼす効果を測定するこ
とである。最大引張り応力（Smax）およびヒドロキシプ
ロリン含有量（OHP）が、（ａ）グルタルアルデヒド固
定されたウシの心膜ストリップ（Glu.）、（ｂ）グルタ
ルアルデヒド固定されかつプロピレングリコール処理さ
れたウシの心膜ストリップ（Glu.＋PG）および（ｃ）未
固定でグリセリン処理されたウシの心膜ストリップにつ
いて測定された。
移植組織の引張り応力
Glu対Glu＋PG ｐ＞.05
Gly対Glu ｐ＜.001
Gly対Glu＋PG ｐ＞.001
注：グルタルアルデヒドを用いないと、移植片はその引
張り応力（強度）を約5/6失う。従って、Glu＋PGは、Gl
uによる石灰性の変動（calfic changes）なく強度を増
した。
張り応力（強度）を約5/6失う。従って、Glu＋PGは、Gl
uによる石灰性の変動（calfic changes）なく強度を増
した。
例III
以下の記載は、具体的な実験およびその実験で得られ
た結果である。カッコ内は、ここでは詳細に述べられて
いない他の実験からの変数の範囲についてのコメントで
ある。
た結果である。カッコ内は、ここでは詳細に述べられて
いない他の実験からの変数の範囲についてのコメントで
ある。
組織
1.ウシ心膜：
フレッシュなウシの心膜は、マックス・インセル・コ
ーエン社（Max Insel Cohen Inc.）より子ウシが犠牲に
なった直後に氷上で配送された。心膜を、冷たい水道水
の下で30分洗浄し、脂肪と管が取り去られ、心膜を1cm2
の片に切断した。続いてこの心膜を標準食塩水（normal
saline）中で10分濯ぎ、さらなる処理に供した。
ーエン社（Max Insel Cohen Inc.）より子ウシが犠牲に
なった直後に氷上で配送された。心膜を、冷たい水道水
の下で30分洗浄し、脂肪と管が取り去られ、心膜を1cm2
の片に切断した。続いてこの心膜を標準食塩水（normal
saline）中で10分濯ぎ、さらなる処理に供した。
2.ブタの大動脈弁：
フレシュなブタの大動脈弁は、マックス・インセル・
コーエン社よりブタが犠牲になった直後に氷上で配送さ
れた。心臓弁膜尖（cusp）を周りの組織より切断し、水
道水の下で10分洗浄した後、1cm2の片に切断した。心臓
弁膜尖を標準食塩水中で10分濯ぎ、さらなる処理に供し
た。
コーエン社よりブタが犠牲になった直後に氷上で配送さ
れた。心臓弁膜尖（cusp）を周りの組織より切断し、水
道水の下で10分洗浄した後、1cm2の片に切断した。心臓
弁膜尖を標準食塩水中で10分濯ぎ、さらなる処理に供し
た。
材料調製
グルタルアルデヒド（25％）を、フィシャー・サイエ
ンティフィック・カンパニー（Fisher Scientific Comp
any）から入手し、緩衝されていない標準食塩水pH＝6.2
を用いて0.625％グルタルアルデヒド溶液に希釈した。
（他の実験においては、希釈剤としてホスフェートバッ
ファー（pH6.8〜7.4）の等張溶液が用いられ、固定過程
における張度（tonicity）（固定溶液の濃度）は、構造
を保持するのに重要である。以下の「処理」に述べられ
るように、すべての組織は、固定後処理、貯蔵−保存ま
たは移植前にフリーのグルタルアルデヒドおよびバッフ
ァーがなくなるように、食塩水または水による多数回の
リンスによって洗浄した。これは、アルデヒドおよびフ
ォスフェートバッファーの両者の存在が石灰化を助長に
するので必要である。
ンティフィック・カンパニー（Fisher Scientific Comp
any）から入手し、緩衝されていない標準食塩水pH＝6.2
を用いて0.625％グルタルアルデヒド溶液に希釈した。
（他の実験においては、希釈剤としてホスフェートバッ
ファー（pH6.8〜7.4）の等張溶液が用いられ、固定過程
における張度（tonicity）（固定溶液の濃度）は、構造
を保持するのに重要である。以下の「処理」に述べられ
るように、すべての組織は、固定後処理、貯蔵−保存ま
たは移植前にフリーのグルタルアルデヒドおよびバッフ
ァーがなくなるように、食塩水または水による多数回の
リンスによって洗浄した。これは、アルデヒドおよびフ
ォスフェートバッファーの両者の存在が石灰化を助長に
するので必要である。
ここに報告される研究において、固定は、組織を固定
剤に48時間入れることにより生じたが、これは、架橋を
最大にするために必要とされる最低の時間である。架橋
度は、主に、用いられたpH、アルデヒド溶液の濃度およ
び溶液の体積によって決定される。本研究においては、
18の正方形の組織（おのおの1cm2）を100mlの固定剤を
含有するフラスコに入れた。
剤に48時間入れることにより生じたが、これは、架橋を
最大にするために必要とされる最低の時間である。架橋
度は、主に、用いられたpH、アルデヒド溶液の濃度およ
び溶液の体積によって決定される。本研究においては、
18の正方形の組織（おのおの1cm2）を100mlの固定剤を
含有するフラスコに入れた。
プロピレングリコール（100％）は、フィシャー・サ
イエンティフィック・カンパニーから入手し、使用前に
0.22ミクロンのナイロンメンバー（膜）フィルターを通
してろ過した。（他の実験では、プロピレングリコール
を蒸留水を希釈剤として調製した60％溶液として用い
た。固定剤（アルデヒド）および固定後処理（グリコー
ル）の張度は比較的重要であるが、保存溶液の張度はさ
ほどでもない。好ましいグリコールの溶液は、活性成分
60〜100％である。）本研究において、検体は、100％プ
ロピレングリコール中で保存した。
イエンティフィック・カンパニーから入手し、使用前に
0.22ミクロンのナイロンメンバー（膜）フィルターを通
してろ過した。（他の実験では、プロピレングリコール
を蒸留水を希釈剤として調製した60％溶液として用い
た。固定剤（アルデヒド）および固定後処理（グリコー
ル）の張度は比較的重要であるが、保存溶液の張度はさ
ほどでもない。好ましいグリコールの溶液は、活性成分
60〜100％である。）本研究において、検体は、100％プ
ロピレングリコール中で保存した。
処理
コントロール群：心膜を20℃の0.625％のグルタルア
ルデヒド中で、10〜14日間保存した。
ルデヒド中で、10〜14日間保存した。
プロピレングリコール群：心膜を20℃の0.625％グル
タルアルデヒド中で、２日間固定した後、標準食塩水中
で十分に洗浄し（10分×３回）、最後に20℃の100％プ
ロピレングリコール溶液に７〜10日間入れた。
タルアルデヒド中で、２日間固定した後、標準食塩水中
で十分に洗浄し（10分×３回）、最後に20℃の100％プ
ロピレングリコール溶液に７〜10日間入れた。
移植前に、両群の心膜片を標準食塩水で10分×３回洗
浄した。
浄した。
ブタの大動脈弁の心臓弁膜尖片およびウシの心膜片を
同一に処理した。（コントロールの心膜片とブタの大動
脈弁片を10〜14日間固定し、一方、試験片は、２〜８日
間固定し、７〜10日間保存した。これは、単一のバッチ
の心膜あるいは大動脈弁の片が所定の実験で用いられる
ようするために行われた。このことは、グルタルアルデ
ヒド固定についての先の実験で、２日またははそれ以上
（例えば、18日）の期間固定された組織の破断強度の変
化が見られず、固定時間を変化させることによって破断
強度、コラーゲン含有量またはカルシウム含有量に影響
がなかったことより正当化さされると信じる。） 実験設計Ｉ 70〜100gのオスのスプレーグ・ドーレー（Sprague Da
wley）ラット９匹からなる群を用いた。固定および保存
することが、移植された組織の強度に及ぼす影響を調べ
るために、それぞれ９匹のラットからなる２群を調べ
た。一方の群は、45日目に、他方の群は、90日目に犠牲
になるようにされた。ペントバルビタール麻酔下に、ラ
ットに、3cmの脊椎傍（paravertebral）の全厚（fullth
ickness）皮膚切開を施し、２の皮下袋（pouch）を作成
した。一方の袋中に、洗浄された、グルタルアルデヒド
固定された3cmの心膜組織１片を移植した。他方の袋に
は、グルタルアルデヒド固定され、その後プロピレング
リコール中に８日間入れられていた同様の１片を移植し
た。動物の一方の群は45日目に、他方の群は90日目に犠
牲になった。
同一に処理した。（コントロールの心膜片とブタの大動
脈弁片を10〜14日間固定し、一方、試験片は、２〜８日
間固定し、７〜10日間保存した。これは、単一のバッチ
の心膜あるいは大動脈弁の片が所定の実験で用いられる
ようするために行われた。このことは、グルタルアルデ
ヒド固定についての先の実験で、２日またははそれ以上
（例えば、18日）の期間固定された組織の破断強度の変
化が見られず、固定時間を変化させることによって破断
強度、コラーゲン含有量またはカルシウム含有量に影響
がなかったことより正当化さされると信じる。） 実験設計Ｉ 70〜100gのオスのスプレーグ・ドーレー（Sprague Da
wley）ラット９匹からなる群を用いた。固定および保存
することが、移植された組織の強度に及ぼす影響を調べ
るために、それぞれ９匹のラットからなる２群を調べ
た。一方の群は、45日目に、他方の群は、90日目に犠牲
になるようにされた。ペントバルビタール麻酔下に、ラ
ットに、3cmの脊椎傍（paravertebral）の全厚（fullth
ickness）皮膚切開を施し、２の皮下袋（pouch）を作成
した。一方の袋中に、洗浄された、グルタルアルデヒド
固定された3cmの心膜組織１片を移植した。他方の袋に
は、グルタルアルデヒド固定され、その後プロピレング
リコール中に８日間入れられていた同様の１片を移植し
た。動物の一方の群は45日目に、他方の群は90日目に犠
牲になった。
回収された移植片を張力計に供し、圧力（すなわち、
組織を破壊するのに要した力を面積で割ったもの、kg/m
m2）を測定し、組織の強度測定を行った。回収された移
植片はまた張力（すなわち、破壊点での長さの変化（d
L）を初期長（L0）で割ったもの）の測定も行い、組織
の可塑性の測定を行った。
組織を破壊するのに要した力を面積で割ったもの、kg/m
m2）を測定し、組織の強度測定を行った。回収された移
植片はまた張力（すなわち、破壊点での長さの変化（d
L）を初期長（L0）で割ったもの）の測定も行い、組織
の可塑性の測定を行った。
結果
結果を表３に示す。この結果から、プロピレングリコ
ール処理は、グルタルアルデヒド固定された心膜片の強
度も可塑性も有意に変化させないことを示す。この結果
はまた、本研究の短い時間内では、時間の経過によって
機械的強度を損なわないことを示いる。
ール処理は、グルタルアルデヒド固定された心膜片の強
度も可塑性も有意に変化させないことを示す。この結果
はまた、本研究の短い時間内では、時間の経過によって
機械的強度を損なわないことを示いる。
実験設計II
それぞれ９匹からなるラットの４群を用いて、グルタ
ルアルデヒド固定されたウシの心膜片およびブタの大動
脈弁組織のプロピレングリコール処理が、そのような移
植片のコラーゲンおよびカルシウム含有量に及ぼす効果
を調べた。
ルアルデヒド固定されたウシの心膜片およびブタの大動
脈弁組織のプロピレングリコール処理が、そのような移
植片のコラーゲンおよびカルシウム含有量に及ぼす効果
を調べた。
それぞれ９匹のラットからなる４群を作成した。先に
述べたように、ペントバルビタール麻酔下に、すべての
ラットに対して2cmの背側（dorsal）皮膚切開を行い、
それぞれのラットに２の皮下袋を作成し、それぞれの場
合ごとに、グルタルアルデヒド固定された1cm2の組織１
片を一方の袋に、グルタルアルデヒド固定され、プロピ
レングリコール保護された1cm2の組織を他方の袋に移植
した。４群のうち２群は、ウシの心膜片（一方は、グル
タルアルデヒド固定された片、他方は、グルタルアルデ
ヒド固定されかつグリコール処理された片）の移植に供
した。一方の群の動物は45日後に犠牲にされ移植片を回
収し、カルシウムおよびヒドロキシプロリン分析に供
し、他方の群は、90日後に試験に供した。これと並行し
て、２群が、グルタルアルデヒド中で固定されたブタの
大動脈弁組織（ウシの心膜に代えて）およびグルタルア
ルデヒド処理され、プロピレングリコール処理された組
織の移植を受けた。ブタの大動脈弁についての試験の設
計は、ウシの心膜組織試験と同様であった。
述べたように、ペントバルビタール麻酔下に、すべての
ラットに対して2cmの背側（dorsal）皮膚切開を行い、
それぞれのラットに２の皮下袋を作成し、それぞれの場
合ごとに、グルタルアルデヒド固定された1cm2の組織１
片を一方の袋に、グルタルアルデヒド固定され、プロピ
レングリコール保護された1cm2の組織を他方の袋に移植
した。４群のうち２群は、ウシの心膜片（一方は、グル
タルアルデヒド固定された片、他方は、グルタルアルデ
ヒド固定されかつグリコール処理された片）の移植に供
した。一方の群の動物は45日後に犠牲にされ移植片を回
収し、カルシウムおよびヒドロキシプロリン分析に供
し、他方の群は、90日後に試験に供した。これと並行し
て、２群が、グルタルアルデヒド中で固定されたブタの
大動脈弁組織（ウシの心膜に代えて）およびグルタルア
ルデヒド処理され、プロピレングリコール処理された組
織の移植を受けた。ブタの大動脈弁についての試験の設
計は、ウシの心膜組織試験と同様であった。
結果
結果を表４に示す。この結果は、プロピレングリコー
ルによる処理は、グルタルアルデヒド固定に起因する石
灰化の速度を低下させることを示している。この結果
は、心膜と大動脈弁の両者の移植片に共通している。コ
ラーゲンは、プロピレングリコールによって保持され、
事実、大動脈弁組織の場合において実際に増加しうる。
従って、プロオピレングリコールは、組織の強度に害を
及ぼすことなく移植片の石灰化を阻害する。
ルによる処理は、グルタルアルデヒド固定に起因する石
灰化の速度を低下させることを示している。この結果
は、心膜と大動脈弁の両者の移植片に共通している。コ
ラーゲンは、プロピレングリコールによって保持され、
事実、大動脈弁組織の場合において実際に増加しうる。
従って、プロオピレングリコールは、組織の強度に害を
及ぼすことなく移植片の石灰化を阻害する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 セイフター、エリ
アメリカ合衆国、ニューヨーク州
11040、ニュー・ハイド・パーク、モリ
ス・ドライブ 50
(72)発明者 フレイター、ロバート・ウイリアム・マ
ヨ
アメリカ合衆国、ニューヨーク州
10708、ブロンクスビル、グラドウイ
ン・プレイス 17
(56)参考文献 米国特許5002566（ＵＳ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A01N 1/02
A61L 27/00
Claims (7)
- 【請求項１】心臓弁、脈管、食道、気管、ケン、靭帯、
筋膜、膜およびこれらの構造物の部分からなる群から選
択される構造物において使用するための、グルタルアル
デヒド処理された（glutaraldehyde−tanned）生物学的
組織を処理した被処理生物学的組織を製造する方法にお
いて、 前記被処理生物学的組織が、 前記グルタルアルデヒド処理された生物学的組織の機械
的強度を損なうことなく前記グルタルアルデヒド処理さ
れた生物学的組織の細胞毒性が低減され、かつイン・ビ
ボ石灰化が最小限にされたものであり、 前記方法が、前記グルタルアルデヒド処理された生物学
的組織を、少なくとも実質的に無溶媒の1,2−プロパン
ジオールで処理し、前記グルタルアルデヒドの５員環付
加物を形成する工程 を含む方法。 - 【請求項２】前記1,2−プロパンジオールが、室温で液
体である請求項１の方法。 - 【請求項３】前記処理により、前記グルタルアルデヒド
処理された組織の機械的強度を損なうことなく前記グル
タルアルデヒド処理された組織の細胞毒性が低減される
請求項１の方法。 - 【請求項４】前記生物学的組織が、ウシの心膜である請
求項１の方法。 - 【請求項５】前記生物学的組織が、ブタの大動脈弁であ
る請求項１の方法。 - 【請求項６】前記工程が、前記グルタルアルデヒド処理
された生物学的組織を、前記1,2−プロパンジオールか
ら実質的になる組成物で処理することを含む請求項１の
方法。 - 【請求項７】前記工程が、前記グルタルアルデヒド処理
された生物学的組織を、60重量％以上純粋な前記1,2−
プロパンジオールから実質的になる組成物で処理するこ
とを含む請求項１の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US849,940 | 1992-03-13 | ||
| US07/849,940 US5476516A (en) | 1992-03-13 | 1992-03-13 | Anticalcification treatment for aldehyde-tanned biological tissue |
| PCT/US1993/002090 WO1993019209A1 (en) | 1992-03-13 | 1993-03-08 | Anticalcification treatment for aldehyde-tanned biological tissue |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07508706A JPH07508706A (ja) | 1995-09-28 |
| JP3510246B2 true JP3510246B2 (ja) | 2004-03-22 |
Family
ID=25306892
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51658693A Expired - Lifetime JP3510246B2 (ja) | 1992-03-13 | 1993-03-08 | アルデヒド処理された生物学的組織の抗石灰化処理 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5476516A (ja) |
| EP (1) | EP0630416B1 (ja) |
| JP (1) | JP3510246B2 (ja) |
| BR (1) | BR9306072A (ja) |
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