DE69019512T2

DE69019512T2 - Verhinderung von verkalkung in bioprosthetischen implantaten.

Info

Publication number: DE69019512T2
Application number: DE69019512T
Authority: DE
Inventors: Alain Carpentier; Sophie Carpentier; Aws Nashef
Original assignee: Baxter International Inc
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 1989-02-17
Filing date: 1990-02-01
Publication date: 1996-02-15
Anticipated expiration: 2010-02-02
Also published as: CA2046592A1; JPH04503356A; EP0458877A1; EP0458877B1; DE69019512D1; WO1990009102A1; CA2046592C

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft verkalkungsbeständige bioprothetische Implantate und ein Verfahren zum Praparieren derselben. Insbesondere betrifft die Erfindung verkalkungsbeständige bioprothetische Herzklappen, die aus natürlich erhaltenen biologischen Materialien präpariert sind.
Bioprothetische Herzklappen wie etwa in Glutaraldehyd konservierte Schweineherzklappen haben zahlreiche Probleme überwunden, die mit mechanischen und Homotransplantat- Herzklappen verbunden sind. Diese bioprothetischen Klappen sind sehr stabil und nichtantigenisch, haben erstaunliche Haltbarkeit sowie Physische Charakteristiken, die denen natürlicher Klappen weitgehend ähnlich sind.
Ein alternatives Verfahren zum Gerben oder Konservieren von tierischen Häuten und Geweben umfaßt den Einsatz von Metallsalzen. Die Chromgerbung wird beispielsweise seit vielen Jahren in der Lederindustrie angewandt. (Siehe z. B. US-PS 1 892 410.) Eisen(III)-, Chrom- und Aluminiumsalze werden zum Gerben von natürlich gewonnenem Collagen eingesetzt, das zur Herstellung von implantierbaren prothetischen Gegenständen verwendet werden kann. (Siehe US-PS 4 097 234.) Die US-PS 3 974 526 von Dardik et al. beschreibt die Herstellung von bioprothetischen Gefäßtransplantaten aus Venen und Arterien, die aus der Nabelschnur erhalten sind. Unter den Reagenzien, die zum Härten oder Gerben der Gefäße offenbart sind, befindet sich Chromoxid.
Ein ständig auftretendes Problem bei solchen bioprothetischen Herzklappen ist ihre Tendenz zur Verkalkung in vivo. Dieses Problem tritt besonders bei Kindern auf und führt dazu, daß hin und wieder empfohlen wird, keine bioprothetischen Herzklappen bei Kindern zu verwenden.
Es wurden diverse Verfahren zur Milderung der Verkalkung von bioprothetischen Herzklappen vorgeschlagen. Beispielsweise zeigt Lentz et al. in der US-PS 4 323 358 die Behandlung von implantierbaren, in Glutaraldehyd fixierten natürlichen Geweben (einschließlich Schweineherzklappen) mit einem löslichen Salz eines sulfatierten höheren aliphatischen Alkohols, um die Verkalkung nach der Implantation zu hemmen. Die US-PS 4 378 224 von Nimni et al. zeigt ein Verfahren zur Hemmung der Verkalkung von bioprothetischem Gewebe, wobei das Gewebe mit einem sulfatierten Proteinpolysaccharid wie Chondroitinsulfat vernetzt wird. Die US-PS 4 481 009 von A.S. Nashef zeigt ein Verfahren zur Verringerung der Verkalkung, das das Einbringen eines biokompatiblen Polymers in ein bioprothetisches Gewebe vor der Gewebeimplantation aufweist. Die US-PS 4 553 974 von Dewanjee et al. beschreibt ein Mehrschrittverfahren zum Aufbereiten von biologischem Gewebe, um die Verkalkung zu hemmen. Dieses Verfahren umfaßt die Behandlung des Gewebes mit einem Tensid, Waschen zum Entfernen des Tensids, Fixieren des Gewebes mit Glutaraldehyd, Behandeln mit einem Verkalkungshemmer wie etwa einem Aminodiphosphonat und Behandeln des Gewebes mit einem Reduktionsmittel. Die US-PS 4 648 881 von Carpentier et al. lehrt, daß die Verkalkung von implantiertem biologischem Gewebe gemildert werden kann durch Vermeidung eines Kontakts des Gewebes mit phosphathaltigen Lösungen, und zwar wenigstens während der späteren Phasen der Präparierung. Dieses Patent lehrt außerdem, daß die Behandlung des Gewebes mit einem zu Calcium in Konkurrenz tretenden zweiwertigen Kation die Verkalkung des implantierten Gewebes hemmt.
Es besteht weiterhin ein Bedarf für ein zweckmäßiges, zuverlässiges und wirksames Verfahren zum Präparieren von verkalkungsbeständigen bioprothetischen Implantaten wie etwa Herzklappen. Ein solches Verfahren sollte die Dauerhaftigkeit, die Biokompatibilität oder die physischen Charakteristiken der Bioprothese nicht nachteilig beeinflussen und sollte zur Anwendung in einem gewerblichen Herstellungsverfahren geeignet sein.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zum Präparieren von biologisch erhaltenem, Gewebe angegeben, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
(a) Behandeln des biologisch erhaltenen Gewebes mit:
(i) entweder genügend von einer Gerblösung, um das Gewebe adäquat zu gerben; oder
(ii) genügend von einer Lösung aus einem löslichen, im wesentlichen nichttoxischen Eisen(III)-salz, Zinn(IV)- salz oder einer Kombination davon, um die Verkalkung des Gewebes in vivo zu mildern;
(b) anschließendes Behandeln des Gewebes mit genügend der jeweils anderen der Lösungen, wobei die Gerblösung keine Lösung aus einem Eisen(III)-salz, einem Zinn(IV)-salz oder einer Kombination davon ist; und
(c) Behandeln des Gewebes mit einem Diamin und einem Aktivierungsfaktor zur Einleitung der Reaktion des Diamins mit dem Gewebe, wobei dieser Schritt vor Schritt (a) oder Schritt (b) durchgeführt wird.
Ein verkalkungsbeständiges bioprothetisches Implantat weist ein gegerbtes biologisches Material auf, das mit einer verkalkungshemmenden Menge von Eisen(III)- oder Zinn(IV)-ionen oder einem Gemisch davon imprägniert ist.
Das Diamin reagiert mit freien Carbonsäureresten von Proteinen und anderen Bestandteilen des Gewebes. Die zusätzlichen Amingruppen sind frei, um entweder mit dem bei dem Gerbverfahren eingesetzten Agens oder mit den Eisen(III)- und/oder den Zinn(IV)-ionen zu reagieren.
Der Aktivierungsfaktor wird mit der Diaminlösung dazu genutzt, die Reaktion mit den Carbonsäureresten einzuleiten.
Ein besonders bevorzugter Aktivierungsfaktor ist ein Carbodiimid.
Die hergestellten bioprothetischen Implantate zeigen eine ausgezeichnete Beständigkeit gegenüber Verkalkung über lange Implantationszeiträume. Der die Verkalkung mildernde Vorgang hat keine schädliche Auswirkung auf die physischen Eigenschaften, die Dauerhaftigkeit oder die Biokompatibilität der Implantate.
Die Verkalkung ist ein besonders schwerwiegendes Problem, wenn sie in prothetischen Herzklappen auftritt. Um wirkungsvoll zu funktionieren, müssen solche Herzklappen das hohe Maß an Flexibilität und Dauerhaftigkeit des Gewebes beibehalten, aus dem sie bestehen. Die Klappen müssen nicht nur im wesentlichen nichtantigenisch und damit beständig gegenüber Abstoßungsreaktionen des Wirts sein, sondern sie dürfen auch nicht thromboseerzeugend sein oder Entzündungsreaktionen stimulieren. Solche bioprothetischen Klappen sollten über viele Jahre störungsfrei funktionieren. Wenn sie doch versagen, sollte dieses Versagen von einer allmählichen Abnahme der Funktionsfähigkeit und nicht von einem zur Katastrophe führenden Funktionsausfall begleitet sein.
Die Verkalkung kann viele dieser erwünschten Charakteristiken gefährden. Die Verkalkung verringert die Flexibilität der Klappenmaterialien und kann in einem plötzlichen, unvorhersehbaren Ausfall der Klappe resultieren. Mineralische Ablagerungen an den Klappen können die Bildung von Thromben hervorrufen, die bei plötzlicher Freisetzung schwerwiegende Komplikationen einschließlich einer zerebrovaskulären oder kardiovaskulären Blockade hervorrufen können. Verkalkung verlangt häufig einen vorzeitigen Austausch von bioprothetischen Klappen, so daß der Patient den Risiken einer zusätzlichen Operation ausgesetzt wird.
Es wurde nunmehr entdeckt, daß durch Imprägnieren bzw. Tränken der biologischen Materialien, die zur Herstellung von bioprothetischen Herklappen verwendet werden, mit einer wirksamen Menge von Eisen(III)- oder Zinn(IV)-ionen oder einem Gemisch davon die Verkalkung erheblich herabgesetzt werden kann.
Die Herzklappen, die nach diesem Verfahren präpariert werden können, umfassen sämtliche üblichen Klappentypen, die aus natürlichen Geweben präpariert werden, einschließlich derjenigen aus Schweineherzklappen, Rinderperikard, Dura mater vom Menschen und dergleichen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren im allgemeinen in Kombination mit irgendeinem geeigneten Verfahren der Sterilisation des biologischen Gewebes angewandt. Das Gerbverfahren verbessert die Dauerhaftigkeit und verringert die antigene Potenz des biologischen Gewebes.
Ein bevorzugtes Gerbverfahren besteht darin, das Gewebe mit 0,625 % Glutaraldehyd entweder in phosphatgepufferten Lösungen oder in phosphatfreien Puffern zu behandeln. Phosphatfreie Puffer werden bevorzugt und umfassen beispielsweise Borat, Carbonat, Hydrogencarbonat, Kakodylat und andere synthetische, künstliche oder organische Puffer wie etwa N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES), 2-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS) und 1,4- Piperazin-bis(ethansulfonsäure) (PIPES).
Jedes einer Vielzahl von Sterilisationsverfahren kann angewandt werden, um die bioprothetischen Implantate zu sterilisieren. Ein bevorzugtes Verfahren umfaßt das In-Kontakt- Bringen des biologischen Gewebes mit einer zur Sterilisation wirksamen Menge einer Lösung aus Formaldehyd oder Glutaraldehyd, einem Alkohol und einem Tensid.
Die Sterilisations- und Gerbvorgänge können vor oder nach dem die Verkalkung verringernden Schritt der Erfindung durchgeführt werden. Die bei dem Gerbverfahren eingesetzten Aldehyde vernetzen sich kovalent mit Proteinamingruppen. Die Vernetzung dieser Gruppen, beispielsweise mit Glutaraldehyd, ist wichtig zur Verringerung der antigenen Potenz der Bioprothese. Von Eisen(III)- oder Zinn(IV)-ionen wird angenommen, daß sie stabile, kovalent gebundene Komplexe oder Liganden mit Amingruppen bilden, wenn sie sich in Gegenwart eines Aldehyds oder einer anderen Substanz befinden, die Schiff sche Basen mit den Amingruppen bildet.
So tritt die Reaktion der Eisen(III)- und/oder Zinn(IV)- ionen mit den Amingruppen in direkte Konkurrenz mit dem Gerbvorgang. Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um das Ausmaß zu messen, in dem die Amingruppen vernetzt worden sind. Eine Methode der Bestimmung des Vernetzungsgrads der Amingruppen besteht in der Messung der Temperatur, bei der das biologische Gewebe eine Schrumpfung erfährt (TS). Natürliches Gewebe hat typischerweise eine TS von ca. 65 ºC. Mit zunehmender Vernetzung steigt die TS. Mit Glutaraldehyd fixiertes Gebewe hat eine TS von ca. 84 ºC bis 85 ºC. Diese Erhöhung der hydrothermischen Stabilität des Gewebes wird als für die erhöhte biologische Stabilität bedeutsam angesehen. Es ist daher erwünscht sicherzustellen, daß die Imprägnierung mit Eisen(III)- und/oder Zinn(IV)-ionen diese TS nicht signifikant beeinträchtigt.
Eine hohe Konzentration von Eisen(III)- oder Zinn(IV)-salz kann das biologische Material schädlich beeinflussen. Solche schädlichen Auswirkungen rangieren von einer Versteifung des Gewebes bis zu einer tatsächlichen Erhöhung der Verkalkungstendenz. Wenn aber andererseits die Konzentration der Eisen(III)- oder Zinn(IV)-salze zu gering ist, erreicht die Behandlung nicht den gewünschten Wirkungsgrad. Die Konzentration des Eisen(III)- oder Zinn(IV)-salzes in Lösung kann außerdem die Gleichmäßigkeit und Tiefe des Eindringens der metallischen Ionen durch das gesamte biologische Material beeinflussen. Im allgemeinen wird eine gleichmäßige, tiefe Penetration der Eisen(III)- oder Zinn(IV)-ionen in das biologische Material bevorzugt.
Wenn das biologische Gewebe zuerst der Gerblösung ausgesetzt wird, muß sorgfältig darauf geachtet werden, daß das biologische Gewebe mit einer die Verkalkung verringernden Menge der Eisen(III)- oder Zinn(IV)-ionen imprägniert werden kann. Wenn dagegen das biologische Gewebe zuerst der Behandlung mit der Eisen(III)- und/oder Zinn(IV)-ionenlösung unterzogen wird, muß verhindert werden, daß eine Imprägnierung mit einer so hohen Konzentration der Eisen(III)- und/oder Zinn(IV)-ionen erfolgt, daß entweder ein ausreichendes Gerben verhindert oder ein Steifwerden des biologischen Materials bewirkt wird.
Wie angegeben, gibt es viele Faktoren, die den Imprägnierungsgrad beeinflussen. Erstens beeinflußt die Konzentration der Eisen(III)- oder Zinn(IV)-ionen in der Imprägnierlösung die zur Imprägnierung verfügbare Ionenmenge. Der Grad der Imprägnierung wird durch die Dauer der Kontaktzeit zwischen der Imprägnierlösung und dem biologischen Material, dem pH der Imprägnierlösung sowie der Sequenz der Durchführung des Imprägniervorgangs und des Gerbvorgangs beeinflußt. Diese Faktoren werden kontrolliert, um das gewünschte Imprägniermaß mit Eisen(III)- oder Zinn(IV)-ionen in dem Gewebe zu erhalten.
Der exakte Umfang der Imprägnierung mit Eisen(III)- und/oder Zinn(IV)-ionen für ein bestimmtes biologisches Gewebe hängt von der gewünschten Endverwendung ab. Wie angegeben, tritt die Imprägnierung mit Eisen(III)- und Zinn(IV)-ionen in Konkurrenz zu der Vernetzungswirkung der Aldehyde während des Gerbvorgangs. Dadurch wird die TS direkt beeinflußt, die von dem Vernetzungsgrad abhängig ist, der während des Gerbvorgangs erreicht wird. Die Imprägnierung des Gewebes mit den Eisen(III)- und/oder Zinn(IV)-ionen kann sich außerdem auf andere Eigenschaften des Gewebes wie seine Flexibilität auswirken. Die Bedeutung jeder einzelnen Eigenschaft hangt von dem gewünschten Endverwendungszweck des Gewebes ab.
Somit ist die wirksame Imprägnierungsmenge mit Eisen(III)- und/oder Zinn(IV)-ionen von der gewünschten Endverwendung abhängig.
Biologische Gewebematerialien, die zur Bildung von Gewebeherzklappen verwendet werden, müssen gewöhnlich ein bestimmtes Maß an Flexibilität haben. Mit zunehmender Konzentration der Imprägnierung mit Eisen(III)- und/oder Zinn(IV)- ionen verliert das Gewebe an Flexibilität. Eine ausreichende Menge von Eisen(III)- und/oder Zinn(IV)-ionen muß jedoch eingebracht werden, um das notwendige Maß an Verkalkungsmilderung zu erreichen. Wie angegeben, ist die Imprägnierung mit Eisen(III)- und/oder Zinn(IV)-ionen in hohem Maß von der Konzentration in der Imprägnierlösung und von den Bedingungen abhängig, unter denen das biologische Gewebematerial dem Imprägniervorgang unterworfen wird.
Wie gesagt, ist die Messung der Schrumpfungstemperatur (TS) ein Indikator, der zur Messung der Brauchbarkeit des biologischen Materials verwendet wird, das dem Gerbvorgang ausgesetzt wird. TS wird gemessen, indem das Gewebe in zwei Einspannungen gehalten wird. Die eine Einspannung ist auf solche Weise angebracht, daß sie in einer Richtung allgemein parallel zu der Richtung gleiten kann, in der das Gewebe gehalten wird. Diese Einspannung ist mit einer Einrichtung gekoppelt, die fähig ist, die Bewegung der Einspannung anzuzeigen. Das Gewebe wird in ein Bad getaucht. Die Badtemperatur wird langsam erhöht, bis eine Bewegung der Einspannung beobachtet wird.
Das Verfahren der Erfindung wird durchgeführt, bis das Gewebe mit einer die Verkalkung mildernden Menge von Eisen(III)- und/oder Zinn(IV)-ionen ausreichend imprägniert ist, um die gewünschte Milderung der Verkalkung zu erzielen, während es gleichzeitig für den bestimmungsgemäßen Gebrauch hinreichend geschmeidig bleibt. Wenn der für einen gewünschten Endzweck erforderliche Grad der Imprägnierung und Geschmeidigkeit erreicht ist, liefert eine Messung der TS einen adäquaten Referenzpunkt für die Stabilisierung des Gewebes.
Beispielsweise ist ermittelt worden, daß biologisches Gewebe, das unter Verwendung von Glutaraldehyd gegerbt worden ist, eine TS von ca. 85 ºC haben sollte, um die gewünschte Stabilität aufzuweisen. Infolgedessen sollte der Imprägnierungsgrad des Gewebes mit Eisen(III)- und/oder Zinn(IV)- ionen maximiert werden, während gleichzeitig diese gewünschte TS aufrechterhalten wird.
Das Verfahren der Erfindung wird im allgemeinen durchgeführt, indem das biologische Material mit einer Lösung aus einem wasserlöslichen Eisen(III)- oder Zinn(IV)-salz in Kontakt gebracht wird. Dieser Kontakt verlangt charakteristisch, daß die biologischen Materialien in die Behandlungslösung getaucht werden. Alternativ kann die Lösung aufgesprüht, mit der Rolle aufgetragen oder unter Anwendung irgendeines geeigneten Vorgehens auf die biologischen Materialien aufgebracht werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das biologische Material für einen Zeitraum, der zwischen ca. 24 h und ca. 200 h liegt, in die Eisen(III)- oder Zinn(IV)-salzlösung getaucht.
Das Lösungsmittel oder der Träger für das Eisen(III)- oder das Zinn(IV)-salz kann ein organisches Lösungsmittelsystem oder ein wäßriges Lösungsmittel sein. Beispiele von organischen Lösungsmitteln, die eingesetzt werden können, umfassen niedere aliphatische Alkohole mit C&sub1;-C&sub8;, Glykole, Triole, Aldehyde und dergleichen.
Bevorzugte Lösungsmittel systeme sind wäßrige Lösungen aus mit Wasser mischbaren Alkoholen, Glykolen, Triolen und Aldehyden. Diese wäßrigen Lösungsmittelsysteme dienen nicht nur als Vehikel für die Eisen(III)- oder Zinn(IV)-salze, sondern auch als Proteindenaturierungsmittel und antibakterielle Mittel. Beispiele von solchen Lösungsmittelsystemen sind wäßrige Lösungen aus Ethanol, Formaldehyd, Glutaraldehyd, Glycerin oder Gemischen davon. Diese wäßrigen Lösungsmittelsysteme bieten den zusätzlichen Vorteil, daß sie schon seitlangem zur Behandlung von implantierbaren biologischen Geweben verwendet werden und ihre Sicherheit und Wirksamkeit wohletabliert sind. Die wäßrigen Lösungsmittelsysteme enthalten vorteilhaft bis zu ca. 30 % Ethanol, bis zu ca. 5 % Formaldehyd, bis zu ca. 0,625 % Glutaraldehyd oder bis zu ca. 30 % Glycerin, oder Gemische davon. Diese Lösungsmittelsysteme können vorteilhaft auch herkömmliche Puffer enthalten.
Die Eisen(III)- oder Zinn(IV)-ionen sind in Form eines löslichen, im wesentlichen nichttoxischen Salzes. Beispiele solcher Salze umfassen die Nitrat-, Sulfat-, Borat-, Carbonat, Halogenid-, Citrat- und Acetatsalze. Bevorzugte Salze sind Eisen(III)-nitrat, Zinn(IV)-nitrat, Eisen(III)- sulfat, Zinn(IV)-sulfat, Eisen(III)-chlorid, Zinn(IV)- chlorid, Eisen(III)-citrat, Zinn(IV)-citrat, Eisen(III)- acetat und Zinn(IV)-acetat. Eisen(III)-salze werden besonders bevorzugt.
Das Eisen(III)- oder das Zinn(IV)-salz wird in der Lösung in einer für die Imprägnierung wirksamen Konzentration eingesetzt. Eine solche Konzentration ist eine ausreichende Menge, um das biologische Material mit einer die Verkalkung mildernden Menge der Eisen(III)- oder Zinn(IV)-ionen bei Behandlung mit der Lösung zu imprägnieren. Im allgemeinen liegt die Konzentration der Eisen(III)- oder Zinn(IV)-salze in der Lösung, die auf das Gewebe aufgebracht wird, zwischen ca. 0,01 Gew.-% und ca. 2,5 Gew.-%, bevorzugt zwischen ca. 10,05 Gew.-% und ca. 1,5 Gew.-%. Die Eisen(III)- oder Zinn(IV)-Konzentration in dem Gewebe vor der Implantation liegt zwischen ca. 0,001 Gew.-% und ca. 3,0 Gew.-%, bevorzugt zwischen ca. 0,005 Gew.-% und ca. 1,0 Gew.-%.
Es wurde gefunden, daß der pH der Eisen(III)- oder Zinn(IV)- salzlösung die Geschwindigkeit beeinflußt, mit der die Eisen(III)- und/oder Zinn(IV)-ionen von dem biologischen Gewebe absorbiert werden. Je niedriger der pH, umso rascher die Absorption. Der pH der Lösung liegt im allgemeinen zwischen ca. 2 und ca. 7, wobei ein pH, der vorzugsweise zwischen ca. 4,5 und ca. 6 liegt, bevorzugt wird.
Die Erfindung ist zwar zum Präparieren von bioprothetischen Herzklappen besonders vorteilhaft, aber die biologischen Materialien und Verfahren der Erfindung können auch zum Präparieren von anderen Implantat-Typen angewandt werden. Beispiele für solche Implantate sind Materialien zur Wiederherstellung der Blase, zur Reparatur von Blutgefäßen, orthopädische Implantate, um nur einige zu nennen.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter verdeutlicht, die keine Einschränkung bedeuten sollen.
Die Entdeckung, die zu der vorliegenden Erfindung geführt hat, wurde zufällig gemacht. Schweineherzklappenblättchen wurden vor der Implantation in Versuchstiere mit Glycerin behandelt. Die Blättchen wurden nach mehreren Wochen entfernt, und es wurde beobachtet, daß sie erheblich niedrigere Verkalkungswerte aufwiesen, als erfahrungsgemäß zu erwarten war. Bei der Untersuchung der Ursache für dieses Resultat wurde bemerkt, daß das zum Behandeln der Herzklappenblättchen verwendete Glycerin aus einem Metallbehälter entnommen worden war. Dieser Glycerinbehälter war sehr alt, und später wurde festgestellt, daß das Glycerin relativ große Eisenund Zinnanteile enthielt. Die Analyse des Glycerins auf Metalle ergab, daß es 10 ppm Calcium, 90 ppm Eisen und 30 ppm Zinn enthielt. Anschlußversuche wiesen darauf hin, daß der geringere Verkalkungsgrad dem kontaminierten Glycerin zuzuschreiben war. Es wurde eine Versuchsreihe durchgeführt, um die Auswirkung des "gealterten Glycerins" auf die Milderung der Verkalkung und die Entwicklung einer Alternativlösung zu etablieren, die diese Auswirkung erzielt.

Experiment

Das nachstehende Experiment ist nicht gemäß der vorliegenden Erfindung, sondern ist angegeben, um Standard-Gerbverfahren und -Verkalkungsminderungsverfahren wie folgt zu zeigen: Frisch entfernte aortische Herzklappenblättchen wurden gründlich mit isotonischer Kochsalzlösung gespült. Die Blättchen wurden dann Gerb- und Verkalkungsmilderungsschritten unterzogen, wobei der Verkalkungsmilderungsschritt zuerst durchgeführt wird, obwohl das Verfahren umgekehrt ablaufen kann.
Der Verkalkungsmilderungsvorgang umfaßte das Tauchen der Blättchen in eine von zwei Arten von Glycerinlösungen. Die erste Lösungsart ist die oben erörterte gealterte Glycerinlösung, wogegen die zweite Lösungsart eine Glycerinlösung technischer Güte ist, bestehend aus 1/3 Ethanol (90 %), 1/3 wäßrigem Formaldehyd (hergestellt durch Vermischen von 4 Teilen 37 % Formaldehyd mit 6 Teilen H&sub2;O) und 1/3 Glycerin. Die letztgenannte Glycerinlösung wurde entweder für sich eingesetzt oder mit einer Eisen(III)- oder Zinn(IV)-verbindung versetzt. Die eingesetzten Eisen(III)- oder Zinn(IV)-verbindungen waren entweder Salze oder Oxide.
Der Gerbvorgang umfaßte das Tauchen der Blättchen in eine Lösung, bestehend aus 0,625 % (Gew./Vol.) Glutaraldehyd mit einem pH von 7,4 ±0,1, enthaltend 0,02 m N-2-Hydroxyethylpiperazin-N¹-2-ethansulfonsäure (HEPES), 0,26 % (Gew./Vol.) Magnesiumchlorid und eine ausreichende Menge Natriumchlorid, um eine isotonische Lösung herzustellen.
Der Gerb- sowie der Verkalkungsmilderungsvorgang wurden jeweils durchgeführt, indem die Blättchen für einen Zeitraum von einer Woche in die jeweiligen Lösungen getaucht wurden.
Nach Durchführung der Gerb- und Verkalkungsschritte wurden die Blättchen an verschiedenen Stellen subkutan in die Rücken von heranwachsenden Ratten oder heranwachsenden Kaninchen chirurgisch implantiert.
Die Verkalkung wurde qualitativ gemessen, was die Sichtprüfung und Aufzeichnung des Verkalkungsgrads umfaßte (Resultate nicht gezeigt).
Das Verfahren der Erfindung liefert eine wirkungsvolle Möglichkeit zur Milderung der Verkalkung von Gebeweimplantaten. Eine Schwierigkeit bei der praktischen Durchführung des Verfahrens der Erfindung betrifft aber die zwei Reaktionen, die um die freien Proteinamingruppen konkurrieren, d h. den Verkalkungsmilderungsvorgang, bei dem die Reaktion zwischen den Amingruppen und den Eisen(III)- und/oder Zinn(IV)-ionen abläuft, und den Gerbvorgang, bei dem die Reaktion zwischen den Amingruppen und einem Aldehyd, z. B. Glutaraldehyd, abläuft. Das Gleichgewicht zwischen diesen beiden Reaktionen wirkt sich unmittelbar auf die Endeigenschaften des Gewebes aus.
Wenn beispielsweise der Verkalkungsmilderungsvorgang nicht geregelt wird, schränkt die Konzentration der Eisen(III)- und/oder Zinn(IV)-ionen, die mit den Amingruppen eine Bindung eingehen, die verfügbaren Stellen für die Reaktion mit dem Aldehyd ein, wodurch das finale Gewebeprodukt steifer wird. Wenn der Gerbvorgang nicht geregelt wird, sind nicht genügend Amingruppen zur Bindung mit den Eisen(III)- und/oder Zinn(IV)-ionen verfügbar, wodurch jeder Effekt einer Verkalkungsmilderung zunichte gemacht wird.
Gemäß der Erfindung wird ein Diamin in Gegenwart eines Aktivierungsfaktors in das Gewebe eingebracht. Diamine binden an die freien Carboxylgruppen an Proteinen und Mucopolysacchariden, die im Gegenwebe vorhanden sind, und zwar insbesondere an Gewebe-Collagen. Eine genaue Erläuterung der Kopplung von Diaminen an Carboxylgruppen und von brauchbaren Aktivierungsfaktoren ist in Journal of Polymer Science: Polymer Chemistry Edition von Lloyd and Burns, Vol. 17, 5.3459-3489 (1979) angegeben, worauf hier summarisch Bezug genommen wird, insbesondere hinsichtlich der brauchbaren Arten von Aktivierungsfaktoren.
Die Behandlung von fixiertem Gewebe mit einem Diamin wird auch in den US-PS'en 4 729 139, ausgegeben 8. März 1988, und 4 481 009, ausgegeben 6. November 1984, beide für Aws Nashef, gelehrt. Der Einbau von Diaminen in Gewebe, wie er durch die in diesen beiden Patentschriften erörterten Vorgehensweisen angegeben ist, soll die kovalente Bindung von Monomeren, die anschließend polymerisiert werden, an die Carboxylreste von Proteinen und Mucopolysacchariden von gegerbtem Gewebe unterstützen. Der allgemeine Zweck der von diesen beiden Patentschriften gelehrten Vorgehensweisen ist die Hemmung der Verkalkung in implantierbarem Gewebe durch Imprägnieren des Gewebes mit einem Polymer.
Das Diamin kann als der erste Schritt des Verfahrens aufgebracht werden. Das heißt, ein Diamin wird sowohl vor dem Gerb- als auch dem Verkalkungsmilderungsvorgang aufgebracht. Das ergibt zusätzliche Amingruppen zur Kopplung mit dem Aldehyd und den Eisen(III)- und/oder Zinn(IV)-ionen. Alternativ kann das Diamin zwischen dem ersten und dem zweiten Schritt der Erfindung aufgebracht werden. Das heißt, das Diamin kann nach dem Gerbvorgang und vor dem Verkalkungsmilderungsvorgang oder umgekehrt, je nach der Aufeinanderfolge der beiden primären Schritte, aufgebracht werden.
Das bevorzugte Verfahren der Erfindung umfaßt das Gerben des Gewebes und anschließend die Durchführung des Verkalkungsmilderungsvorgangs. Bei dieser bevorzugten Ausführungsform wird die Aufbringung des Diamins zwischen dem Gerb- und dem Verkalkungsmilderungsschritt durchgeführt.
Charakteristisch wird das Diamin auf das Gewebe in einer wäßrigen Lösung aufgebracht, wobei das Diamin wasserlöslich ist. Bevorzugte Diamine sind solche mit der Formel R-(NH&sub2;)&sub2;, wobei R eine cyclische oder nichtcyclische Alkyl-, Aryl-, Alkylen-, Arylalkyl-, Arylalkylengruppe mit ein bis zehn Kohlenstoffatomen ist. Das gewählte Diamin sollte ohne weiteres durch das Proteinnetzwerk des Gewebes diffundieren und bevorzugt wasserlöslich sein. Ein besonders bevorzugtes Diamin ist Ethylendiamin.
Der Aktivierungsfaktor wird charakteristisch der das Diamin enthaltenden wäßrigen Lösung direkt zugefügt. Daher sind die brauchbaren Aktivierungsfaktoren ebenfalls wasserlöslich. Der bevorzugte Aktivierungsfaktor ist ein oder mehr Arten von Carbodiimiden, wobei ein besonders bevorzugter Aktivierungsfaktor 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid- HCL ist.
Charakteristisch wird das Gewebe in der die Diamine und die Aktivierungfaktoren enthaltenden Lösung für ca. fünf bis ca. dreißig Minuten eingeweicht, wobei der pH der Lösung auf ca. 4,75 eingestellt ist.
Die Diaminkonzentration sollte gewählt sein, um die Verfügbarkeit von wenigstens 150 mol Diamin pro 1 mol Collagen, das in dem Gewebe vorhanden ist, sicherzustellen. Dieses Molverhältnis ist theoretisch bestimmt, um die effektive Bindung von Diaminen an verfügbare Carboxylgruppen sicherzustellen. Diese Theorie basiert auf der Annahme, daß 1 mol Collagen für jeweils 100.000 g Trockengewicht des Gewebes existiert und daß 150 Carboxylgruppen für jedes 1 mol Collagen anwesend sind.
Die Menge von Aktivierungsfaktor, die mit dem Diamin zusammen aufgebracht wird, hängt ebenfalls von dieser theoretisch ermittelten Konzentration von freien Carbonsäuregruppen in dem Collagen ab. Die Menge von Aktivierungsfaktor ist im allgemeinen wenigstens größer als ungefähr die fünf fache theoretisch ermittelte Zahl von verfügbaren Carbonsäuregruppen in dem Collagen.
In den nachstehenden Beispielen wurden nach Beendigung der Gerb- und Verkalkungsvorgänge die Blättchen subkutan an verschiedenen Stellen in die Rücken von heranwachsenden Ratten chirurgisch implantiert. Diese Blättchen wurden während der für jedes Beispiel angegebenen Dauer implantiert belassen. Drei Blättchen wurden in jede Ratte implantiert, wobei zwei Ratten in jedem Zeitintervall getötet wurden. Nachdem die Ratten getötet worden waren, wurden die Blättchen entfernt und auf Verkalkung untersucht.
Die Verkalkung wurde in den Beispielen qualitativ gemessen. Das angewandte qualitative Verfahren umfaßte die Sichtprüfung und Aufzeichnung des Verkalkungsgrads unter Anwendung einer Verkalkungsskala wie folgt: keine beobachtete Verkalkung (0), etwas Verkalkung (+), durchschnittlicher Verkalkungsgrad (++) oder schwere Verkalkung (+++). Der Buchstabe F bezeichnet einen sehr kleinen Verkalkungsgrad, der unter dem Mikroskop beobachtet wurde, der Buchstabe E bedeutet, daß Verkalkung nur in den Zellen vorhanden war, und repräsentiert nur geringe Verkalkung. Im allgemeinen besaßen die beobachteten Proben in jedem Zeitintervall unterschiedliche Verkalkungsgrade. Wie die folgenden Tabellen zeigen, werden für jede Probe zwei verschiedene Indikationen angegeben. Das repräsentiert verschiedene Verkalkungsgrade zwischen den sechs verschiedenen Blättchen. Mit Ausnahme von bestimmten Beispielen, die entsprechend gekennzeichnet sind, wurde jedoch kein Versuch gemacht, die genaue Zahl von Blättchen aufzuzeichnen, die jede Art der Verkalkung aufwiesen. Zuerst wurde eine Röntgenaufnahme jeder Probe betrachtet, um ein allgemeines Anzeichen der Verkalkung zu erhalten. Wenn eine stärkere Unterscheidung notwendig war, wurde ein Schnitt eines Blättchens angefärbt und auf Verkalkung untersucht. Der angefärbte Schnitt wurde präpariert durch Einbetten der Blättchen in einen Paraffinblock, Durchschneiden der Blöcke und Anfärben der Schnitte mit Von-Kossa-Färbemittel.

BEISPIELE 1-4

Die nachstehenden Beispiele demonstrieren die Erfindung. Die Resultate der Beispiele 1 bis 4 sind in den folgenden Tabellen 1 bis 4 gezeigt, wobei die Behandlungscodes E und C das experimentell behandelte Gewebe und das Kontrollgewebe bezeichnen.

BEISPIEL 1

Das folgende Beispiel zeigt die Behandlung von implantierbaren Schweineherzklappenblättchen mit Ethylendiamin (ED). Das Klappengewebe wurde vorher durch Behandlung mit Glutaraldehyd-HEPES fixiert. Die Behandlung mit ED wurde vor der Verkalkungsbehandlung mit Eisen(III)-nitrat in einer 5 % wäßrigen Formaldehydlösung durchgeführt.
Testblättchen wurden für eine Woche mit Glutaraldehyd/HEPES- Puffer (wie oben beschrieben) behandelt. Dann wurden die Blättchen in einer wäßrigen Lösung, die 0,1 m ED enthielt, eingeweicht. Diese wäßrige Lösung enthielt außerdem 5 g 1- Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-HCL pro Gramm Trockengewicht des Gewebes. Der pH der Lösung war auf 4,75 eingestellt, während die Blättchen für 30 min eingeweicht wurden. Die Blättchen wurden dann in Kochsalzlösung gespült und für eine Woche in 5 % wäßrigem Formaldehyd, enthaltend 0,1 % Eisen(III)-nitrat, dann für drei Wochen in Glutaraldehyd/HEPES-Puffer ohne Eisen(III)-nitrat eingeweicht. Die Blättchen wurden sterilisiert durch Einweichen in 4 % Formaldehyd für zwölf Stunden bei Raumtemperatur, gefolgt von Spülen in 0,625 % Glutaraldehyd/HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4). Kontroll-Blättchen wurden mit der Glutaraldehyd/HEPES-Pufferlösung gegerbt und mit FETH sterilisiert. Der Calcium- und Eisengehalt der Testblättchen vor der Implantation war 0,005 % bzw. 0,93 %. Der Calcium- und der Eisengehalt der Kontrollblättchen vor der Implantation war 0,019 % bzw. 0,024 %. Die Blättchen wurden in Kaninchen implantiert, dann nach einem bestimmten Zeitraum entfernt und gemäß den oben erläuterten Vorgehensweisen analysiert. Der Zeitraum für jeden Test war drei, sechs, neun und zwölf Wochen, wie in der folgenden Tabelle 1 angegeben ist. Der Calcium- und der Eisengehalt sowie Standardabweichungen (SD) für die entfernten Blättchen sind in der Tabelle 1 gezeigt. Dieses Experiment demonstriert, daß die aufeinanderfolgende Behandlung mit ED und mit Eisen(III)-nitrat in wäßrigem Formaldehyd in einer erheblichen Milderung der Verkalkung resultiert. TABELLE I Kaninchen # Behandlungs-Code Implantationsdauer (Wochen) Mittel ± SD Untersuchung beendet

BEISPIEL 2

Das nachstehende Beispiel zeigt die Behandlung von vorher fixierten implantierbaren Schweineherzklappenblättchen zuerst mit Ethylendiamin (ED) und dann mit Eisen(III)-nitrat in einer wäßrigen Lösung aus Formaldehyd/Ethanol (Milderung der Verkalkung).
Testblättchen wurden für eine Woche mit Glutaraldehyd/HEPES- Puffer behandelt. Die Blättchen wurden dann in 0,1 m ED- Lösung, die auf einen pH von 4,75 eingestellt war, für 30 min inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 5 g 1-Ethyl- 3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-HCL je Grämm (Trockengewicht) Gewebe. Die Reaktion lief bei einem pH von 4,75 für 30 min ab. Die Blättchen wurden anschließend in Kochsalz lösung (0,9 %) gespült. Dann wurden die Blättchen für eine Woche in einer wäßrigen Lösung behandelt, die 5 % Formaldehyd, 30 % Ethanol und 0,1 % Eisen(III)-nitrat enthielt, dann für drei Wochen in einer Glutaraldehyd/HEPES-Pufferlösung ohne Eisen(III)-nitrat behandelt. Die Blättchen wurden mit 4 % Formaldehyd für zwölf Stunden bei Raumtemperatur sterilisiert, gefolgt von Spülen in 0,625 % HEPES/Glutaraldehydlösung, die auf einem pH von 7,4 gehalten wurde. Kontrollblättchen wurden mit der Glutaraldehyd/HEPES-Pufferlösung gegerbt und mit FETH sterilisiert. Der Calcium- und der Eisengehalt der Testblättchen vor der Implantation war 0,006 % bzw. 1,983 %. Der Calcium- und der Eisengehalt der Kontrollblättchen vor der Implantation war 0,019 % bzw. 0,024 %. Die Blättchen wurden in Kaninchen implantiert, dann nach einem bestimmten Zeitraum entfernt und analysiert. Der Zeitraum für jeden Test war drei, sechs, neun und zwölf Wochen, wie in der folgenden Tabelle 2 angegeben ist. Der Calcium- und der Eisengehalt sowie die Standardabweichungen (SD) für die entfernten Blättchen sind in der Tabelle 2 gezeigt. Diese Experiment zeigt, daß die aufeinanderfolgende Behandlung mit ED und mit Eisen(III)-nitrat in wäßrigem Formaldehyd/Ethanol in einer erheblichen Milderung der Verkalkung resultiert. TABELLE 2 Kaninchen # Behandl.-Code Implantationsdauer (Wochen) Mittel ± SD Untersuchung beendet

BEISPIEL 3

Das nachstehende Beispiel demonstriert die Behandlung von implantierbaren Schweineherzklappenblättchen, die zuerst mit Glutaraldehyd/HEPES-Puffer fixiert und dann mit Ethylendiamin (ED) behandelt wurden, bevor die Verkalkungsbehandlung mit Eisen(III)-nitrat in einer wäßrigen Formaldehyd/Glycerinlösung durchgeführt wurde.
Testblättchen wurden für eine Woche mit Glutaraldehyd/HEPES- Puffer behandelt. Sie wurden dann in einer wäßrigen Lösung (pH 7,45) aus 0,1 m ED und 5 g von 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-HCL pro Gramm (Trockengewicht) Gewebe für 30 min eingeweicht, und die Blättchen wurden anschließend in Kochsalzlösung gespült. Die Blättchen wurden dann für eine Woche in einer wäßrigen Lösung aus 5 % Formaldehyd, 24 % Glycerin und 0,1 % Eisen(III)-nitrat, dann für drei Wochen in einer Glutaraldehyd/HEPES-gepufferten Lösung ohne Eisen(III)-nitrat behandelt. Die Blättchen wurden mit 4 % Formaldehyd in HBS für 12 h bei Raumtemperatur sterilisiert, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben ist. Kontrollblättchen wurden mit der Glutaraldehyd/HEPES-Pufferlösung gegerbt und mit FETH sterilisiert. Der Calcium- und der Eisengehalt der Testblättchen vor der Implantation war 0,004 % bzw. 0,307 %. Der Calcium- und der Eisengehalt der Kontrollblättchen vor der Implantation war 0,019 % bzw. 0,024 %. Die Blättchen wurden in Kaninchen implantiert, dann nach einem bestimmten Zeitraum entfernt und entsprechend den oben erläuterten Vorgehensweisen analysiert. Der Zeitraum für jeden Test war drei, sechs, neun und zwölf Wochen, wie in der folgenden Tabelle 3 angegeben ist. Der Calcium- und der Eisengehalt sowie Standardabweichungen (SD) für die entfernten Blättchen sind in der Tabelle 3 gezeigt. Dieses Experiment zeigt, daß die sequentielle Behandlung mit ED und mit Eisen(III)-nitrat in wäßrigem Formaldehyd/Glycerin in einer erheblichen Milderung der Verkalkung resultiert. TABELLE 3 Kaninchen # Behandl.-Code Implantationsdauer (Wochen) Mittel ± SD

BEISPIEL 4

Das folgende Beispiel demonstriert die Behandlung von implantierbaren Schweineherzklappenblättchen, die zuerst mit Glutaraldehyd/HEPES-Puffer fixiert und dann mit Ethylendiamin (ED) behandelt wurden, bevor die Verkalkungsbehandlung mit Eisen(III)-nitrat in wäßrigem Ethanol/Formaldehyd/Glycerin erfolgte.
Testblättchen wurden für eine Woche mit Glutaraldehyd/HEPES- Puffer behandelt. Sie wurden dann in einer wäßrigen Lösung (pH 7,45) aus 0,1 m ED und 5 g von 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-HCL pro Gramm (Trockengewicht) Gewebe für 30 min eingeweicht, und die Blättchen wurden anschließend in Kochsalzlösung gespült. Die Blättchen wurden dann für eine Woche in einer wäßrigen Lösung aus Ethanol/Formaldehyd/analysenreinem Glycerin, die 0,1 % Eisen(III)- nitrat enthielt, dann für drei Wochen mit dem Glutaraldehyd/HEPES-Puffer ohne Eisen(III)-nitrat behandelt. Die Blättchen wurden mit 4 % Formaldehyd in HBS für zwölf Stunden bei Raumtemperatur sterilisiert, wie bei den Beispielen 1 und 2 beschrieben ist. Kontrollblättchen wurden mit der Glutaraldehyd/HEPES-Pufferlösung gegerbt und mit FETH sterilisiert. Der Calcium- und der Eisengehalt der Testblättchen vor der Implantation war 0,007 % bzw. 1,609 %. Der Calciumund der Eisengehalt der Kontrollblättchen vor der Implantation war 0,019 % bzw. 0,024 %. Die Blättchen wurden in Kaninchen implantiert, dann nach einem bestimmten Zeitraum entfernt und entsprechend den oben erläuterten Vorgehensweisen analysiert. Der Zeitraum für jeden Test war drei, sechs, neun und zwölf Wochen, wie in der folgenden Tabelle 4 angegeben ist. Der Calcium- und der Eisengehalt sowie Standardabweichungen (SD) für die entfernten Blättchen sind in der Tabelle 4 gezeigt. Diese Experimente zeigen, daß die aufeinanderfolgende Behandlung mit ED und mit Eisen(III)- nitrat in wäßrigem Ethanol/Formaldehyd/Glycerin in einer erheblichen Milderung der Verkalkung resultiert. TABELLE 4 Kaninchen # Behandl.-Code Implantationsdauer (Wochen) Mittel ± SD

Claims

1. Verfahren zum Präparieren von biologisch erhaltenem Gewebe, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:

(a) Behandeln des biologisch erhaltenen Gewebes mit:

(i) entweder genügend von einer Gerblösung, um das Gewebe adäquat zu gerben; oder

(ii) genügend von einer Lösung aus einem löslichen, im wesentlichen nichttoxischen Eisen(III)-salz, Zinn(IV)- salz oder einer Kombination davon, um die Verkalkung des Gewebes in vivo zu mildern;

(b) anschließendes Behandeln des Gewebes mit genügend der jeweils anderen der Lösungen, wobei die Gerblösung keine Lösung aus einem Eisen(III)-salz, einem Zinn(IV)-salz oder einer Kombination davon ist; und

(c) Behandeln des Gewebes mit einem Diamin und einem Aktivierungsfaktor zur Einleitung der Reaktion des Diamins mit dem Gewebe, wobei dieser Schritt vor Schritt (a) oder Schritt (b) durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gewebe mit dem Diamin und dem Aktivierungsfaktor als einer einzigen wäßrigen Lösung behandelt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Aktivierungsfaktor ein Carbodiimid ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Carbodiimid 1-Ethyl- 3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-HCL ist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Salz ein Nitrat, Sulfat, Borat, Carbonat, Halogenid, Citrat oder Acetat von Eisen(III) oder Zinn(IV) ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Salz Eisen(III)- nitrat, Zinn(IV)-nitrat, Eisen(III)-sulfat, Zinn(IV)-sulfat, Eisen(III)-chlorid, Zinn(IV)-chlorid, Eisen(III)-citrat, Zinn(IV)-citrat, Eisen(III)-acetat oder Zinn(IV)-acetat ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Salz in einer wäßrigen Lösung von mit Wasser mischbarem Alkohol, Glykol, Triol oder Aldehyd gelöst wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Salz in einer wäßrigen Lösung von Ethanol, Formaldehyd, Glutaraldehyd oder Glycerin gelöst wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Lösung bis zu ca. 30 % Ethanol, bis zu ca. 5 % Formaldehyd, bis zu ca. 1 % Glutaraldehyd oder bis zu ca. 30 % Glycerin oder Gemische davon enthält.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der pH der Eisen(III)- und/oder Zinn(IV)-salzlösung im Bereich von ca. 2 bis ca. 7 liegt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der pH der Eisen(III)- oder Zinn(IV)-salzlösung im Bereich von ca. 2 bis ca. 3 liegt.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Eisen(III)- oder Zinn(IV)-salzlösung ca. 0,01 Gew.-% bis ca. 2,5 Gew.-% des Eisen(III)- oder Zinn(IV)-salzes enthält.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Eisen(III)- oder Zinn(IV)-salzlösung ca. 0,05 % bis ca. 15 % des Eisen(III)- oder Zinn(IV)-salzes enthält.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Diamin unter denjenigen mit der folgenden Formel:

R-(NH&sub2;)&sub2;

ausgewählt ist, wobei R eine C&sub1;-C&sub1;&sub0; aufweisende cyclische oder nichtcyclische Alkyl-, Aryl-, Alkylen-, Arylalkyl-, Arylalkylengruppe ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei R eine geradkettige aliphatische Gruppe ist.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Diamin Ethylendiamin ist.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das biologische Gewebe in Form einer Schweineherzklappe ist.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Gewebe mit dem Diamin in einer Menge von 150 mol Diamin pro 1 mol Collagen des Gewebes behandelt wird.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Gewebe mit dem Aktivierungsfaktor in einer Menge entsprechend der fünffachen Menge von Carbonsäuregruppen von Collagen des Gewebes behandelt wird.