JPH04502914A - 免疫グロブリンを可溶化するための塩基性アミノ酸の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫グロブリンを可溶化するための塩基性アミノ酸の使用技術分野 本発明はタンパク質の生産および精製、ならびにそのような生産中および保管中 および処方中におけるのタンパク質の溶解度の維持に関する。特に、本発明は塩 基性アミノ酸を利用して治療上および診断上重要なタンパク質、特に免疫グロブ リン、および特に細胞培養で生産される免疫グロブリンを可溶化することに関す る。

：ｔＵＬ！ 水に対する溶解度が限られているタンパク質は、精製、回収、治療上の利用のた めの処方、および保管において困難な問題をもたらす。十分な濃度が得られない 場合、有効な治療量の投与に必要とされる容量は許容限度を上回る。効能を得る のに、多くのタンパク質の治療量は１回の巨丸剤注入につき数百ミリグラムの範 囲で投与される。したがって、低タンパク質濃度の場合、大量となり、患者への 臨床上の投与が困難になる。好ましい投与量は少なくとも１−１−１Ｏ０，ある いはより少量に最小限化するべきである。投与するために、例えば、１００ｍｇ 投与量では、約２−５　ｍ　ｇ　／　ｍ　１の溶解度が必要である。

粗生産物あるいはガラス瓶詰めの最終材料の精製および効率的な保管にもまた、 体積が実用的な量に制限されることが必要である。さらに、妥当な体積を扱う際 、沈澱による実質的な損失を防ぐため、少なくとも２　ｍ　ｇ　／　ｍ　１の実 用的な濃度レベルが必要である。

この一般的な問題は認められていたが、現時点では、沈澱がどのような条件およ びどのタンパク質に生ずるかを予言することが不可能であり、また問題が認めら れた際、ある特定のタンパク質に対する問題の解決法は明らかでない。本発明は 次の発見に帰する。その発見は、免疫グロブリンは、特に、水性媒体中で２　ｍ 　ｇ　／　ｍ　１以上の濃度の溶解度を確実に保たず、そしてこの低溶解度によ り処理中に損失が生じること、およびこの溶液に有効な濃度の塩基性アミノ酸を 加えることによって、免疫グロブリンの溶解度を上げられるというものアミノ酸 あるいは他の生物学的な化合物の溶液を同時添加して、水性媒体中のある特定の タンパク質を安定化させることが開示されている。協和発酵の米国特許第４．　 ６７５．　１８３号の中で、アルギニン、ヒスチジン、リジン、ヒドロキシリジ ン、オルニチン、グルタミン、γ−アミノ酪酸、またはε−アミノカプロン酸あ るいはそれらの塩を用いてインターフェロンを可溶化する方法が請求の範囲に記 載されている。

持出のゴーロツバ特許出願第２１７，３７９号、およびエーザイの日本出願第６ ２７１２０３２１号には、アルギニンあるいはその塩を用いて組繊ブラスミ／− ゲン活性化因子（ｔＰＡ）を可溶化することが開示されおよび請求の範囲に記載 されている。アサヒの米国特許箪４，５６８，５４４号ではｔＰＡの溶解度を高 めるのにリジンあるいはアルギニンを使用することが請求の範囲に記載されてい る。エーザイのヨーロッパ特許出願第２４２，６５３号はＮ−メチル−グルコサ ミンによるｔＰＡの可溶化を述べている。エーザイのゴーロッパ特許出願第２１ ８，１１２号は、塩基性アミノ酸の添加と、必要に応じて、ジイソシアン酸エス テルで架橋されたゼラチンの部分加水分解物を用いるｔＰＡの可溶化を概説して 開示している。ミドリ十字の日本特許出願第６２／１５３，２２４号は、糖アル コール（例えばマンニトール）あるいは塩基性アミノ酸によるプラスミノーゲン の可溶化について述べてカオトロピックな材料あるいは共有結合複合体を用いる 膜結合タンパク質の可溶化についても述べられている。ドイツ特許出願東３，６ ２３，７４７号は、この目的のため、コール酸／グリシンあるいはコール酸／タ ウリン複合体を用いることを開示している。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの米国特許第４ ゜５１１．５０２号では、屈折体（ｒｅｆｒａｃｔｌｌｅ　ｂｏｄｉｅｓ）とし て沈澱する組換え体で生産されたタンパク質に対する尿素および塩化グアニジウ ム（ＧｎＨＣｌ）の可溶化効果を述べている。Ｋｕｒｉｓａｋｌ、Ｊ、らは、Ｇ ｎＨＣＩを用いてアポリポタンパク質を可溶化した（Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　（１ ９７７）　８上：　４４３−４４９）。日本特許出願第８３／３８５９７号では 、遊離アミノスルフヒドリル基とスクシニルグリシンとの共有結合複合体を用い てタンパク質の可溶化に影響を与えることを述べている。

したがって、この技術の概説は、一般的にタンパク質がカオトロピック試薬ある いは共有結合複合体を用いて可溶化され得るが、タンパク質の三次構造を崩壊す る工程、非変性およびコンホメーシ璽ンを保護する可溶化させる補助剤を用いる ことにより構造を保存する可溶化技術は、例えば、プラスミノーゲン、インター フェロンおよびｔＰＡのような個々のタンパク質に特異的であることを示してい る。本発明は、特に、免疫グロブリン、および特に１ｇＧ３のための実用的な工 程を提供する。

１豆ユ匪玉 現在の細胞培養およびタンパク質精製の技術で、哺乳類細胞培養によるタンパク 質の大量生産が可能になる。特に、大量のモノクローナル抗体は１ｎ　ｖｉｔｒ ｏでそれを分泌できるハイブリドーマを培養することにより生産され得る。様々 な培養技術が用いられるが、全てにおいて、抗体が細胞培養培地から精製されな ければならない。そして、多くの場合では、治療用の組成物に処方される。この 精製および処方を果たすには、実用的な量を用い得るような溶解度レベルが必要 である。本発明は、この目的を達するためおよび最終生産物の回収率を高めるた め、免疫グロブリンおよび関連のタンパク質の溶解度を高める方法を提供する。

−面では、本発明は、有効量の一種あるいはそれ以上の塩基性アミノ酸またはそ れらの塩を混合物に加えることによって、水性媒体中の免疫グロブリンおよび関 連タンパク質を可溶化する方法に向けられる。一種あるいはそれ以上の塩基性ア ミノ酸および／あるいはそれらの塩をまず水溶液に溶解し、そしてこの溶液で免 疫グロブリンを溶解および処理するか、あるいは三つの成分、水、免疫グロブリ ンあるいは関連タンパク質、および可溶化アミノ酸調製物を同時に混合し得る。

代わりに、可溶化させるアミノ酸調製物を固形あるいは溶液として免疫グロブリ ンあるいは関連タンパク質の懸濁液に加え得る。

他の面では、本発明は、有効量の可溶化させるアミノ酸（一種あるいはそれ以上 ）の存在下で可溶化された免疫グロブリンあるいは関連タンパク質を含有する組 成物質に向けられる。

８１１口１１札五 第１図は細胞培養からのＩｇＧ、の精製の順序を図式化したものである。

Ｂを　るためのン。

あるタンパク質は溶液中では十分な不溶性であるかあるいは溶液中で準安定性で あるため、それを精製、処方、輸送、および保管するのが困難である。この問題 のいくつかの特定の例が知られており、これには本明細書に説明されている２種 のタンパク質、１ｇＧ３および受容タンパク質Ｔ４が含まれる。しかし、本発明 はこの特定の実施態様に限るのではなく、溶解度に問題がある免疫グロブリンあ るいは他の関連タンパク質に適用される。特に、本発明におけるタンパク質と関 連して、本明細書に用いられている「免疫グロブリンおよび関連タンパク質」と いうことばは、２．５ｍｇ／ｍｌより高い濃度では水溶液中で安定に可溶化でき ないタンパク質のことを言及している。このタンパク質は、これより高い溶解度 は通常持ち得ないが、本発明の方法を用いることによって得られる。

すなわち、本出願の目的において、「免疫グロブリンおよび関連タンパク質」の 定義は、試料の溶液が攪拌される際、水中での溶解度が２．５ｍｇ／ｍｌより少 ない、いかなるタンパク質をも含む。最も代表的には免疫グロブリンであるが、 他のタンパク質も含む。

免疫グロブリンおよび関連タンパク質は本発明の方法に従って、一種あるいはそ れ以上の塩基性アミノ酸および／あるいはそれらの塩の有効量を含むことにより 、可溶化され得る。

分泌するハイブリドーマの大量細胞培養によるモノクローナル抗体の生産と関連 して、本方法は開発された。しかし、本方法は、もちろん、いかなる方法で調製 された免疫グロブリンにも適用され得る。多クローン性免疫グロブリンは、例え ば、血清から単離され、そして本発明の方法はこれらの多クローン性混合物に適 用され得る。モノクローナル抗体は潅流Ｊ＠養、静置培養リアクターにおける生 産、振とうフラスコ、回転瓶、および当分野の知られているおよび発展される様 々な細胞培養技術を含む、様々な細胞培養法の技術を用いて調製され得る。生産 方法は本発明の一部ではないが、高濃度の免疫グロブリンが産生あるいは所望さ れる際、解決されるべき問題を提供する。１ｇＧ３の生産は特に困難なケースで ある。

同様に、溶解度性質において免疫グロブリンと関連する例えば、細胞性受容体の ような他のタンパク質は、本発明の方法を用いて可溶化され得る。本発明の方法 における適当な関連タンパク質はＴ４のような細胞性受容体を含む。

同様に、特定の免疫グロブリンあるいは関連タンパク質画分の精製または単離に は、様々な工程が用いられ得る。それらの技術はゲルろ過、イオン交換、アフィ ニティークロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィーなどを含む、種々 のクロマトグラフィーを含む。これらの手順を実行するのに、扱いやすい量を用 いるべきであり、高溶解度が保たれるべきである。この場合も、特定の方法は本 発明の一部を構成するのではな（、むしろ本発明の方法が宵月であるような背景 を作り出すのである。

種々の型の抗体は、時には治療用、例えば、治療上の目的で毒素と結合する場合 、あるいは組織を局在するために標識と結合する場合、受動免疫に用いられる。

免疫グロブリン調製物を投与するための処方は、投与される液体の体積を許容の 程度に制限するため、成分を高溶解度レベルに維持しなければならない。関連タ ンパク質もまた治療に用いられ、そして溶解度レベルに同様の制限を有する。

前記の全ての場合においては、３−５ｍｇ／ｍｉの最小溶解度レベルが必要とさ れる。多くの免疫グロブリンおよび細胞性受容体のような他のタンパク質は水溶 液中でこの溶解度レベルに達さないし、可溶性を維持するのに所望の量より多い 量が必要とされる。特に、ＩｇＧクラスの免疫グロブリン、そして、とりわけＩ ｇＧｓサブクラスの免疫グロブリン、およびＴ４受容タンパク質を溶液中に維持 することが困難である。

本発明の方法による可溶化させるアミノ酸を添加しない場合、免疫グロブリンの 回収率は、しばしば経済的に許容できる程度より低い程度に、低下することも明 かである。受容タンパク質Ｔ４は、ＩｇＧｓと異なって、精製の収量には著しい 増加が認められなかったが、免疫グロブリンを可溶化するのと同様の条件を用い ると溶解度が高められる。

本発明の溶解度促進成分は塩基性アミノ酸および／あるいはそれらの塩である。

本明細書の「塩基性アミノ酸」は、妥当な濃度（例えば０．　１−　Ｉ　Ｍ）で 、水に溶解される時、溶液のｐＨが７より上になるようなアミノ酸であると定義 される。これらのアミノ酸を本発明に用いる際、所望ならば高ｐＨから中性（ｐ Ｈ６，５−７，５）に中和するのに酸を用い得る。遺伝暗号にコードされる本来 のアミノ酸であるヒスチジン、アルギニン、およびリジンが好ましいが、例えば 、ヒドロキシリジン、オル−チン、シトルリン、および２，４−ジアミノ−酪酸 などのような任意の塩基性アミノ酸も含まれる。

このレベルは、ある特定の組合せにおいて、簡単な最適化実可溶化に用いられる 溶液のｐＨは、元来用いられるアミノ酸の形に関係なく、調整され得る。従って 、遊離アミノ酸あるいはそれらの塩のどちらも用い得る。

本発明に適用され得るアミノ酸の塩はナトリウム塩、カリウム塩またはアンモニ ウム塩のような無機塩、あるいはエタノールアミンあるいはトリエチルアミンの ような有機塩基の塩を含む水溶性塩である。塩基性アミノ酸中のアミン機能基に 酸を付加して生ずる塩で、例えば、塙酸塩あるいは硫酸塩のような無機酸塩、ま たは酢酸塩あるいはクエン酸塩のような有機酸塩も含まれる。治療用組成物の処 方を目的とする可溶化の場合、もちろん、薬学的に許容され得る塩を用いなけれ ばならない。可溶化させるアミノ酸調製物はそれ自身が可溶性でなければならな いし、そして患者に投与する場合には、得られる溶液はｐＨ３−１０の範囲内、 好ましくはｐＨ６゜５−７．　５、で可溶性でなければならない。ｐＨを維持す るため、必要ならば緩衝剤を混合物に添加してもよい。しかし塩基性アミノ酸自 身が、適当なｐＨ調整で、緩衝剤のように働く。普通の適業の開業医には、公知 の通り、調製物中の特定のアミノ酸の塩を用いた中和の性質および程度もこれら の限度によって制限される。

可溶化させるアミノ酸の調製物の有効な濃度は、可溶化されるタンパク質および 可溶化させる調製物の性質に依存する。

一般的に、可溶化の程度は、可溶化するのに有効ないき値レベルに一度達したら 、塩基性アミノ酸の濃度に依存しない。

を促進するために、アミノ酸の調製物を回収した培地あるい験によって容易に設 定され得る。例えば、水中で本来の溶解度が０．５ｍｇ／ｍｌより少ない夏ｇＧ ３では、２．Ｏｍｇ／ｍ！以上の溶解度を得るのに、５０ｍＭまたはそれ以上の ヒスチジンが有効である。操作に融通性をもたすため、０．１５−０．２Ｍの濃 度範囲のヒスチジンが好ましい。Ｔ４受容体の場合、Ｔ４が２．２ｍｇ／ｍ１以 上の濃度を有する溶液は攪拌に不安定であるが、５０ｍＭ−１５０ｍＭのヒスチ ジンを添加することによって、Ｔ４の濃度が１７　ｍ　ｇ　／　ｍ　１まで溶液 は安定性を保つ。全く攪拌しない溶液における、Ｔ４の溶解度レベルは約８ｍｇ ／ｍｌまで上げられ得る。しかし通常のの取り扱いに伴うのに相当する攪拌で、 そのレベルは約２　ｍ　ｇ　／　ｍ　１に低下する。実際に、ある１つの例では 、２゜２　ｍ　ｇ　／　ｍ　１の濃度を有するＴ４の溶液は配達の際に輸送によ る沈澱を含むことがわかった。

可溶化を果たす方法は直面する状態による。調製物を可溶化する場合、まずアミ ノ酸の調製物を水性媒体に溶かし、そして免疫グロブリンあるいは他のタンパク 質を、固形または少量の水性液体に分散された形態で、溶液に加える。代わりに 、固形のアミノ酸あるいはその濃厚な溶液を免疫グロブリンあるいは他のタンパ ク質の懸濁液に加え得るし、あるいは三つの成分を全部同時に混合し得る。ｐＨ は任意の工程で滴定によって調整され得る。細胞培養で産生された免疫グロブリ ンあるいは他のタンパク質の精製および処理中での溶解度は精製用の緩衝液に直 接加え得、精製課程の工程で溶解度を維持し、全体的な回収率が改善される。

すなわち一般的に、最終的な可溶化された調製物は免疫グロブリンあるいは他の 関連タンパク質を少な（とも３　ｍ　ｇ　／ｍｌの濃度、および適当な有効濃度 のアミノ酸を含有し、必要に応じて、組成物のｐＨが滴定により所望の値に調整 される。

以下に本発明の実施例について説明するが、これは本発明を限定するものではな い。

案１１０− ■　Ｇ　の゛　に　ぼ　ヒス　ジンの≦（Ａ）下記の表１に示す種々の水溶液に 、ＩｇＧ＠を、３−５　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌの懸濁液になるように混合した。混 合物を攪拌し、沈澱の有無を記録した。表に示されるように、１５０ｍＭのヒス チジンで免疫グロブリンの沈澱が阻止され得る。

（以下余白） 紅 ５０ｍＭリン酸、ｐＨ７有 表に示されるように、攪拌しても、１５０ｍＭヒスチジンの添加で、添加しなけ れば発生する沈澱が阻止された。

（Ｂ）第１図に示す工程で、ｒｇＧｓを細胞培養から回収して、カラムクロマト グラフィーにより精製し、＞３ｍｇ／ｍｌの濃度に限外ろ過した。１５０ｍＭヒ スチジンを処理用緩衝液に加えることにより、ヒスチジンを加えない時に認めら れる沈澱を阻止することができ、そして回収率を３０−４０％高める。１５０ｍ Ｍヒスチジンの含有の有無での比較結果を表２に示す。工程の解説は第１図の通 りである。

（以下余白） 処理の各工程におけるＩｇＧａの回収率エ　ヒスチジン　ヒスチジン、し 第１工程　９０％　９０％ 第２工程　９０％　７０％ 第３工程　８５％　５０％ 第４工程　８０％　４０％ Ｌ胤匠主 ！　Ｇ　の′　および　に　ぼ　ヒスチジンの２２００　ｍＭヒスチジンの有無 で、ＩｇＧ３を緩衝液（５０ＭＭ　Ｎａ２ＨＰＯａ＋２００ｍＭ　ＮａＣ１；　 ｐＨ７，０）に２−１０ｍｇ／ｍｌの懸濁液になるように混合した。

溶液を４℃にて４−８時間、静置した。ヒスチジンが含有されない場合、調製物 はかすんで、不透明であった。ヒスチジンが含まれた場合、調製物は透明で、無 色であった。

新鮮なサンプルを調製してから、５分間激しく攪拌した。

攪拌は輸送状態および臨床的投与中での取り扱いの両方の模擬実験のために必要 である。ヒスチジンは免疫グロブリンが沈澱するのを阻止した。ヒスチジンが無 い時では、沈澱が明らかに起きた。

工Ａｊ］し１罎ｌ毀 Ａ、一つの調製物において、精製された５Ｔ４（溶解したＴ４）のサンプルをＳ −セファ０−スＦａｓｔ　ＦＩＯＷカラムから溶離し、０．５Ｍ　ＮａＣ１およ び５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７の緩衝溶液にｓＴ４を６．２３ｍｇ／ｍ１ の濃度で得た。１５０ｍＭヒスチジンを片方のサンプルに添加し、Ｆｉｓｈｅｒ 　Ｖｏｒｔｅｘ　Ｇｅｎ１ｅ　２の上でヒスチジンの有無の両サンプルを攪拌し た。ヒスチジンを含有しないサンプルは目に見えて沈澱し、２４時間以上濁った ままであった。ヒスチジン含有サンプルは溶液のままであって、少なくとも２４ 時間透明であった。

Ｂ、もう１つの同様の調製物には、１５０ｍＭヒスチジンを、通常の精製製造過 程の後で加えて、１７．１ｍｇ／ｍｌの濃度とした。沈澱の発生がなく、調製物 は混合により得られた。そして商業的な国内横断輸送後、沈澱はできなかった。

（以下余白） ＦＩＧ、１ 細胞培養からＩｇＧ、の精製 溶出液 希釈されたｒｌｊ液 本沈澱の問題は過程中のこの時点で発生し、そしてヒスチジンが存在しな「ブれ ば、終始存続するであろう。

国際調査報告 幽耐齢鼾−６醪＾ＩＩＩＩＩイ沖−１１４にπ／Ｕ聞９１０５５１６

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．免疫グロブリンあるいは他の関連タンパク質を水性媒体に可溶化する方法で あって、 該媒体中にある免疫グロブリンあるいは他の関連タンパク質の分散体を、該免疫 グロブリンあるいは関連タンパク質を可溶化させるのに有効量の、可溶化させる アミノ酸の調製物と、混合する工程を包含し、 該調製物が実質的に一種またはそれ以上の塩基性アミノ酸および／またはそれら の塩からなる、 方法。
2. ２．前記免疫グロブリンがＩｇＧクラスに属し、そして、該関連タンパク質が細 胞性受容体である、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記塩基性アミノ酸がヒスチジン、アルギニン、リジン、ヒドロキシリジン 、オルニチンおよびシトルリンでなる群から選択される、請求項１に記載の方法 。
4. ４．前記塩基性アミノ酸がヒスチジンである、請求項６に記載の方法。
5. ５．水溶液に免疫グロブリンあるいは関連タンパク質を可溶化する方法であって 、 該免疫グロブリンあるいは関連タンパク質を、該免疫グロブリンあるいは関連タ ンパク質が可溶化するのに有効な濃度の可溶化させるアミノ酸の調製物を含有す る水溶液に、添加する工程を包含し、 該アミノ酸調製物が実質的に一種またはそれ以上の塩基性アミノ酸および／また はそれらの塩からなる、方法。
6. ６．前記免疫グロブリンがＩｇＧクラスに属し、そして、前記関連タンパク質が 細胞性受容体である、請求項５に記載の方法。
7. ７．前記塩基性アミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リジン、ヒドロキシリジ ン、オルニチンおよびシトルリンでなる群から選択される、請求項５に記載の方 法。
8. ８．前記塩基性アミノ酸がヒスチジンである、請求項７に記載の方法。
9. ９．３ｍｇ／ｍｌを越える濃度の免疫グロブリンあるいは関連タンパク質の水溶 液および可溶化させるアミノ酸の調製物の水溶液を含有する組成物であって、該 アミノ酸の調製物が実質的に一種またはそれ以上の塩基性アミノ酸および／また はそれらの塩からなり、該調製物が該免疫グロブリンあるいは関連タンパク質を 可溶化させるのに有効な濃度で存在する、組成物。
10. １０．前記免疫グロブリンがＩｇＧクラスに属し、そして、前記関連タンパク質 が細胞性受容体である、請求項９に記載の組成物。
11. １１．前記細胞性受容体がＴ４である、請求項１０に記載の組成物。
12. １２．前記塩基性アミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リジン、ヒドロキシリ ジン、オルニチンおよびシトルリンでなる群から選択される、請求項９に記載の 組成物。