JPH04502325A - Hiv−1又はhiv−2抗体の存在又は量の確定方法、免疫特異的試薬、合成ペプチド、診断用キット、hiv−1又はhiv−2抗体の調製方法、免疫原及び抗体 - Google Patents
Hiv−1又はhiv−2抗体の存在又は量の確定方法、免疫特異的試薬、合成ペプチド、診断用キット、hiv−1又はhiv−2抗体の調製方法、免疫原及び抗体Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
合成HIV様ペジペプチドの組成及び使用発明の分野
本発明は、ヒト免疫不全ウィルス(“HIV”)抗原の抗体結合特異性を有する
合成ペプチドに関するものであり、より詳細に言うならば、本発明は天然HIV
ペプチドの成る配列異型(variant)は、単独で又は担体蛋白質に化学的
に結合した形で使用され、HIV抗体を検出するためのイムノアッセイに用いら
れるとき、天然配列ペプチドと同等の又はそれよりすぐれた試薬を提供するとい
う発見に関する。
本発明はさらに、機器を使用することなくHIVに対する抗体を迅速に目で検出
し得る診断法に合成ペプチド及び/又はペプチド蛋白質結合物を使用するという
方法にも関する。
発明の背景
ヒト免疫不全ウィルス1型(“HIV”)が後天性免疫不全症候群(“AIDS
“)の病原物質であることが1983年[バレーシヌッシ(Barre−3in
oussi )ら、サイエンス220巻868−871ページ、1983]及び
1984年[ガo (Garo)ら、サイエンス224巻500−503ページ
、1984年]に確認された。ヒト免疫不全ウィルス2型(“HIV−2”)は
1986年に確認され、中央及び西アフリカのAIDSの重要な原因であり[ク
ラベル(C1avel)ら、サイエンス223巻、343−346ページコ、ヨ
ーロッパ[ブルックチー(Bruckner)ら、ランセット(Lancet
) i : 223ページ、1987;サイセット(Saimt)ら、ランセッ
トI:688.1988]及び米国 にュージ+−シ MMWR87巻33−3
5ページ、1988)でも若干の報告症例がある。
2種類のレトロウィルスは速い突然変異[バーン(Hahn)ら、サイエンス2
32巻1548−1553ページ、1986;ウエンーサイウング(ten−H
siung)ら、多型を示し、DNA配列決定によってHIV−1の13以上の
菌株とHIV−2の4菌株が特徴づけられた[マイヤース(Mycrs)ら、ヒ
トレトロウィルスとAIDS(Human Retrovirus and A
IDS) 1988 ;核酸及びアミノ酸配列の編集(A Cn+opi Ia
tinn nr nucleic acid and a+n1no acid
5equences) 、oスアラモス国立研究所、ロスアラモス、ニューメ
キシコ87545、米国]。
米国食品薬品庁(“USFDA”)が現在米国での使用を許可しているHIV感
染のテストは、抗原として粉砕HTV−1ウィルスを用いCペトリッシアニ(P
etricciani)ら、Annrnt Med 103巻726−729ペ
ージ、1985 ;オスチルホルム(Ostcrholm)ら、New Eng
J 312巻1185−1188ページ、1985)これらの抗原製剤中のH
IV−1蛋白質が感染症の間接的測定単位としての抗体をは有用であるが、単一
のHIV分離物を抗原ソースとして用いる場合は(例えばBH8分離物、米国特
許第4520113号)感度の点で制限がある、というのはHIVは上記のよう
に速い突然変異並びに多数の遺伝的異型を生じ、抗原性異型が存在するからであ
る[ルーニー (Lonney)ら、サイエンス 241巻、357−359ペ
ージ、1988:パルカー(Palker)ら、Proc Nat’ I Ac
ad Set USA 85巻1932−1936ページ、1988]。感度が
悪いのは、抗原ソースとしてウィルス溶解物を使用する現在許可されているアッ
セイキットでは、HrVgp41エンベロープ蛋白質の免疫優性領域の保存が悪
いことにも起因するらしい[ステラケルベルブ(Steckelberg)&ニ
ア−7ケリル(Cockerill) 、Mayo C11nic Proc
63巻377−380ページ、1988]。その上、現在のキットはHIV−1
蛋白質マーカーを用いているから、HI V−2の75%以上は検出されない[
クラベル(C1avel)ら、New Eng J Iced 316巻、11
80−1185ページ、1987]。
抗原ソースとして全ウィルスの溶解物を使用するHIV感染テストは、特異性の
のテストで繰り返し陽性である10人のうち実際にHIVに感染しているのは1
Å以下である[オスチルホルム(Osterholm)ら、New Eng J
Wed 312巻、1185−1188ページ、1985]。
現在ある多数のテストの不十分な感度及び特異性に関連して、成るテストは陽性
サンプルと陰性サンプルとを識別する能力をもっている。ワード(lard)ら
、JAMA256巻、357−361ページ、1986、は、一つのテストで得
られた陽性結果の半数以上が陽性/陰性境界値のほんの少し上にあることを見い
だした。最適のテストはほとんど全てのサンプルで陽性と陰性との間に大きい差
を示し、それによって間違った陽性の試験結果の可能性を減らす。
その後改良されたHrV試験法は一米国内での使用はまだUSFDAによって許
ら、Ann rnt Med 106巻、671−676ページ、1987;ド
ーソン(Da wsnn )ら、J Inrect Dis 157巻、149
−157ページ、1988;ベル′ン(Beltz)ら、米国特許第47538
73号]、HIV蛋白質に関連した合成ペプチド[ローゼン(Rnsen)ら、
PCT出願第WO37108005号:ワンプ(fang)ら、Prcx: N
atl Acad Sci [ISA 86巻、6159−6163.1986
;米国特許第4735896号:コサンド(Cosand)、米国特許第462
9783号、スミス(Swith)ら、JCIin IJi(rnbinl 2
5巻1498−1504ページ、1987;グナン(Gnann)ら、J In
fect Dis 156巻、261−267ページ、1987フ、又は因子の
組み合わせ[レスリー(Leslie)ら、Vnx Sang 54巻84−9
1ページ、1988コを用いてきた。抗原ソースとして組換え蛋白質又は合成ペ
プチドを用いる場合は組織培養汚染物による非特異性は軽減される、そしてどち
らの抗原ソースも製造プロセスにおいてHIVにさらす必要がない。その上合成
ペプチドは、純粋に化学的手段によって標準化される抗原の製造を可能とし、遺
伝子工学によって生成するHrVる。これらの改良倍型はHIV−1に対する抗
体のテストを改善したが、感度及び特異性のより一層の改善、I(IV−2感染
の発見、及び“陽性及び陰性サンプルを識別する迅速且つ簡単な分析試験にこれ
らの試薬を適用すること”に関してはかなりの困難が残っている。
の困難を克服し、テストサンプル中のHrV−1又はHIV−2に対する抗体の
存在又はその量を確認する改善された分析試験結果が得られることが明らかにな
った。
免疫特異的試薬に使われる合成ペプチドは、HI V−1のp24又はgp41
又はHTV−2のgp32蛋白質の免疫反応特異性を有する天然又は非天然のペ
プチドである。本発明の免疫特異的試薬は、例えば血液又は血清などの液体サン
プルを本発明の免疫特異的試薬と接触させ、それからその試薬に結合した抗体の
存在又は量を測定するという方法で使用される。
よって1本発明の一面において、担体蛋白質に化学的に結合したペプチドは゛遊
離”ペプチドより大きい陽性/陰性テスト比をもたらし、陽性サンプルと陰性サ
ンプルとをよりよく識別することが明らかになった。本発明のこの面の代表的実
施態様において、ペプチドはそのカルボキシル末MJ(C−tena開)に付加
したシスティンを介してその担体蛋白質に結合し、HIV−1又はHIV−2に
対する抗体を検出するための免疫特異的試薬として用いられる。
好都合に正常血清に対しては低レベルの反応性を示す反応性ペプチドのいくつか
の天然配列異型は、不十分な感度を有し、陽性血清の5−10%で低い反応性を
与えることも明らかになった。同じ領域からのその他の天然異型ペプチドは陽性
サンプルとの高い反応性を示すが、正常血清とでも許容し得ない程高い反応性を
示し、その結果低い陽性/陰性比を与え、HIV抗体を含むサンプルと含まない
サンプルとの識別が十分でない。HIV−1抗体を検出するためのあらゆる所望
クリテリアを満足する天然ペプチドは見つかっていない。
本発明の他の面よりみれば、陽性サンプルとは高レベルの反応性を維持し、陰性
サンプルとは低い反応性を示す天然HIV−1及びHI V−2の非天然配列異
型がつくられる。好適な非天然ペプチドの担体蛋白質との化学的結合物はこれま
でに試験された天然ペプチドより高い陽性/陰性テスト比を与える、そして遊離
ペプチドでなく、それらペプチドと担体蛋白質との化学的結合物のみが小さい粒
状の固体支持体に結合するのに適していることが、HIV−1抗体の検出のため
の迅速且つ簡単な分析試験法の開発中にわかった。天然及び非天然HIV−2ペ
プチドの同様な結合物は両方共、HIV−2の検出のために適している。
本発明のまた別の面よりみれば、担体蛋白質に結合した本発明の合成ペプチド、
例えばBSA又はKLH,を含む免疫特異的試薬は単独で又はキットの形で提供
され、HIV−1及びHIV−2に対する抗体のイムノアッセイに使用される。
完了までの時間が15分以下で、HIV−1及び/又はHIV−2抗体を検出す
る単純な視覚的終点を与える特に好適な新しい迅速分析試験法が提供される。
恵鶏
免疫化学及びペプチド化学において一般に用いられるいくつかの用語及び略語が
下記の説明及びフレイム中に出てくる。下記の定義は説明のためのものである。
ここに用いられる用語“ペプチド”はアミノ酸から成る蛋白質の線状配列部分で
ある。本発明のペプチドは典型的にはアミノ酸約5ないし約22の長さを有する
。
“天然”ペプチド又は−配列異型とは、天然ソースから分離され、前に文献に報
告されているペプチド配列異型の1つを意味する一現在HIV−1の配列異型は
13種類報告されている。“非天然”ペプチド又は−配列異型とは、報告された
、現在公知のあらゆる天然配列と異なるアミノ酸配列を意味する。
用語゛坑卯性ドメイン”又は“エピトープ”は概してアミノ酸約6−約11の長
さをもつ蛋白質又はペプチド内の領域で、抗体と特異的に相互作用してそれに結
合することができる領域を意味する。
ここで用いられる下記の頭字語は以下に示す意味を有する:EIA=酵素免疫測
定法
ELISA=エライザ法
HTV=ヒト免疫不全ウィルス
HI V−1又ハHI V−2(HI V)1ffト2型)srv=サル免疫不
全ウィルス
KLH=スカシガイのヘモシアニン
BSA=ウシ血清アルブミン
(S)MBS= (スルホ)マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル
(Sulfa)SMCC= (スルホ)スクシンイミジル−4−(N−マレイミ
ドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート5PDP=N−スクシンイミ
ジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネ−トル24蛋白質=HIV−1の
GAG遺伝子の蛋白質生成物の中央部蛋白溶解断片gp41及びgp32=それ
ぞれHIV−1及びHIV−2のENV遺伝子(7)W白質生成物の経膜的部分
蛋白溶解断片
AA±アミノ酸
下記の1文字のアミノ酸コードを用いて特異的アミノ酸をあられす。
アラニン=A ロイシンミL
アルギニン=Rリジン=に
アスパラギン=N メチオニン=M
アスパラギン酸=D フェニルアラニン二Fシステイン二〇 プロリン=P
グルタミン酸=E セリン冨S
グルタミン=Q スレオニン二T
グリシン=G トリプトファン=T
ヒスチジン=Hチロシンミニ
イソロイシン=■ バリン=V
特に記さない限り、すべてのアミノ酸は天然り型アミノ酸である。
図の簡単な説明
図1は、HIV−1のgp41蛋白質、分離物HXB2、オーバーラツプするペ
プチドのアミノ酸配列、及びこれらペプチドををペプチド−蛋白質結合物として
Hiv−1に対する抗体を含む(HI V+)又は含まない(HIV−)ヒト血
清プールに対して試験した場合のこれらペプチドの免疫反応性を示す。
図2は、ペプチド2309の非天然異型のアミノ酸反応性を示す:このペプチド
は図1において蛋白質と結合した場合には高い免疫反応性を有することが示され
た。
各非天然ペプチドの抗原性は、遊離ペプチドとして、ペプチド2S09のBSA
結合結合対HIV−1抗体の結合を阻止する能力によってあられされる。非天然
アミノ酸は、各ペプチドのカルボキシル末端に付加した非天然グリシン(G)及
びシスティン(C)を除いて、担体蛋白質への結合を容易にする点で目立ってい
る二 図3は、ペプチド2S09のその他の天然及び非天然異型のアミノ酸配列
を示す。各ペプチドの抗原性は遊離ペプチドとして、ザイールのHIV−1分離
物で報告される天然配列異型である2S09かペプチド5867かどちらかのB
SA結合結合対するHIV−1抗体の結合を阻止する能力によってあられされる
(グアノら、サイエンス 237巻1346−1349ページ、1987;アリ
シン(Alizon)ら、Al11胞469.36ページ、1986)。各ペプ
チドは非天然のカルボキシル末端GCを含み、ペプチド2S09から得られるア
ミノ酸配列のその他の異型が強調される。
図4は、図2及び3において遊離ペプチドとして大部分が抗原性をもっことがわ
かったペプチドの各々について、それをBSA結合結合対て用いてHIV−1抗
体に直接結合させたときの免疫反応性を示す。ペプチド2S09のAA(アミノ
酸)異型が目立っており、各ペプチドはBSAへのその結合を容易にするために
カルボキシル末端GCを含んでいる:
図5は、HrV−2のgp32蛋白質、分離物ROD、のオーバーラツプするペ
プチドのAA配列を示す。これらはこの領域の5IVAA配列とほぼ一致する。
これらのペプチドの抗原性を試験するために、ペプチド−蛋白質結合物を用い、
Sr V/Hr v−2t:対スル抗体を含む(S I V+)又は含まナイ(
S T V−) マカークザル血清のプールに対して試験した;図6は、図5に
おいて高い免疫反応性をもっことがわかったペプチドであるペプチド2S27の
天然及び非天然異型のAA配列を示す。各ペプチドの抗原性は、遊離ペプチドと
してペプチド2S27のBSA結合結合対 IV/HIV−2抗体との結合を阻
止するf肋によってあられされる。非天然性AAが目立っており、各ペプチドは
BSAへの結合を容易にするためにカルボキシル末端GCを含む;図7は、図6
において遊離ペプチドとして最も大きい抗原性を示したペプチドの各々について
、BSA結合結合対て用いてS T V/HI V−2抗体に直接結合させる場
合の免疫反応性を示す。ペプチド2S27のAA異型が目立っている。各ペプチ
ドはBSAへの化学的結合を容易にするためにカルボキシル末端Cを含む、そし
て大部分は終わりから2番目のGスペーサーを含む:図8は、HIV−1p24
蛋白質のオーバーラツプするペプチドのAA配列と、これらのペプチドをプール
し、ペプチド/蛋白質結合物として、HrV−1抗体を含む(HI V十)又は
含まない(HIV−)ヒト血清に対して試験したときのこれらペプチドの免疫反
応性を示す。先ず異なるペプチド群を上記のようにBSAに結合させ、各プール
の結合物を最初に試験した。個々のペプチド−BSA結合結合対プール中の反応
性を示したペプチドからのみつくられた。
図9は、非天然ペプチド4836を遊離ペプチドとして又はBSAに化学的に結
合した同金のペプチドとして3種類のポリスチレンEIAミクロタイタープレー
トにコーティングした場合の非天然ペプチド4836の免疫反応性を示す。最高
の陽性/陰性比(≧20)、及び陽性及び陰性サンプル間の最大の識別度はBS
A−ペプチド結合物でのみ、そして正常ヒト血清に対して低い反応性をもったプ
ラスチック(プラスチック1型)でのみ得られることに注目すべきである:図1
0Aは、94のヒト血清(内42がHrV−1抗体を含み、52は含んでいない
)を用いてEIAによって試験したときの、天然ペプチド2S06及び2S09
のペプチド−KLH結合物の免疫反応性を示す。
図10Bは、184のヒト血清(内98がHIV−1抗体を含み、86は含んで
いなかった)を用いてEIAによって試験したときの、天然ペプチド2SO9の
ペプチド−BSA結合結合対疫反応性を示す:図10Cは、185のヒト血清(
内98はHIV−1抗体を含み、87は含んでいなかった)を用いてEIAによ
って試験したときの、天然ペプチド5367のペプチド−BSA結合結合対疫反
応性を示す:図11Aは、183のヒト血清(内98はHIV抗体を含み、85
は含んでいなかった)を用いてEIAによって試験したときの、非天然ペプチド
4836のペプチド−BSA結合結合対疫反応性を示す:図11Bは、185の
ヒト血清(内98はHIV−1抗体を含み、87は含んでいなかった)を用いて
ETAによって試験したときの、非天然ペプチド5376のペプチド−BSA結
合結合対疫反応性を示す:図110は、183ヒト血清(内98はHIV−1抗
体を含み、85は含んでいなかった)を用いてEIAによって試験したときの、
非天然ペプチド4836の結合ペプチド−BSA結合結合対疫反応性を示す:図
12は、マカークザルの血清(その内7血清はHIV−2抗体を含み、13血清
は含んでいなかった)を用いてETAによって試験したときの、天然ペプチド2
S24.2S25.2S27.5S84.5S85.5S86、及び非天然ペプ
チド5S88.5S90.5S91、及び5S92のペプチド−BSA結合結合
対疫反応性を示す:
図13は、HIV−1(図13A)、HIV−2(図13B)及び複合HIV−
1プラスHIV−2EIA(図130)試験の個々の免疫反応性を示す:30が
HI V−1抗体陽性、23がHIV−2/SIV抗体陽性、HrV−1抗体の
ないヒト血清 15、S■V/HIV−2抗体のないマカークザル血清 15で
あった。すべてのペプチドはC末端でBSAに結合したものを用いた。HIV−
1プレートに非天然ペプチド4S36及び5S76の結合物をコーティングした
。HIV−2プレートにはペプチド2S24及び5S86をコーティングし、複
合HIV−1プラスHIV−2プL/−ト1:l;t4s36 (HIv−1)
及び2S24プラス5S86 (HI V−2) ヲ:7−−rインクI、f:
;図14は本発明の迅速試験装置の平面図である;図15は図14の迅速試験
装置の分解側面図である。
特殊な実施例の説明
本発明の一面によって、例えば血液又は血清サンプルなどの液体サンプル中のH
IV−1又はHIV−2抗体の存在又は量が下記のように測定される:C末端を
介して担体蛋白質に結合した少なくとも1つの合成ペプチドを含み、HIV−1
のp24又はgp41蛋白質、又はHIV−2のgp32蛋白質の抗原性ドメイ
ンに特異的な免疫反応特異性を有する免疫特異的試薬と上記液体サンプルとを接
触させ、その後その免疫特異的試薬に結合した抗体の存在又は量を調べる。
本発明の実施において担体蛋白質に対するC−末端結合のために用いられる代表
的ペプチドは好適には天然に発生するHIV−1及びHI V−2蛋白質の抗原
性ドメインを代表するアミノ酸配列を有する合成ペプチドである(天然に発生す
るHlv−1及びHIV−2蛋白質の配列については、マイヤーズ(IJyer
s)らの°ヒトレトロウィルス及びA I D S (Hu++an Rctr
oviruses and AIDS)” 1988、”核酸及びアミノ酸配列
の概要″ロスアラモス国立研究所、ロスアラモス、ニューメキシコ、87545
、USA、参照)。本発明ノソノ他ジペプチドは、HIV−1及びHIV−2の
抗原性ドメインに特徴的な免疫反応特異性を有する非天然合成ペプチドを含める
、これについては以下で詳述する。これらのペプチドは例えば下記のような方法
によって、化学的に合成される:同時性多ペプチド合成(SMPS)として知ら
れる標準メリフィールド(Merri r 1eld)固相合成法の変法を用い
る−この方法では約70−100のペプチドを同時に合成することができる(米
国特許第41631211号参照)。この方法を用いて、11のペプチド又は少
数のアミノ酸に含まれる一次及び二次構造エピトープ又は抗原性ドメインすべて
を表現し、HIV−1のgag遺伝子によって規定されるp24蛋白質のすべて
とHIV−1及びHIV−2のenv遺伝子によって規定される経膜的糖蛋白質
の部分を表現するペプチドが合成された。
HIV−1について用いられた最初の配列はHIVHXB2クローンのそれであ
り、HIV−2ではHIVRODクローンのそれであった(マイヤーズら、同上
)、シかしenv経膜的糖蛋白質の免疫優性領域が確認された場合は、その免疫
反応性領域の公知の一般的天然配列異型のすべて並びにこの領域の多くの非天然
配列異型の多くはここに記載の方法で合成された。本発明の代表的ペプチドは約
5ないし約22のアミノ酸、好適には約11ないし約20のアミノ酸、より好適
には約15ないし約17のアミノ酸を含む。ペプチドは20以下のアミノ酸の長
さを有し、より長い分子によって生ずる硬い二次構造を避けるのが好適である。
このような硬い二次構造は、ペプチドの形が感染患者に見いだされるHIVgp
41.gp32.又はp24抗体の8結合部位に適応するのを妨げる。この技術
において一般的に記されるが、図1に示されるようなGCC末端テールをもたな
いいくつかのペプチド、例えばペプチド4S24 (19AA’ s、コサンド
参照)は、部分的にオーバーラツプするより短いペプチド2SO1(14AA’
s)又はペプチド4S25 (26AA’ s、 コサンド及びワンプら、上
記)に比較して、また部分的にオーバーラツプするペプチド2SO4(17AA
’ s)又は3S36 (17AA’ s)に比較しても、免疫反応性が低いの
は、このような二次構造の考察を反映するものかも知れない。組換えDNA法[
ベルブ(Beltz)らの米国特許第4753873号参照]によって作成され
る非常に大きい蛋白質のペプチドのようなペプチドは強い二次及び三次構造的硬
さをもつと考えられる。これは成るエピトープのアクセスし易さを制限し、ベル
ブらが認めたようにいくつかの抗体陽性サンプルの免疫反応性の低下に寄与する
。本発明に用いるよりipさいペプチドサイズは、ペプチドそのものだけを(担
体蛋白質と結合せずに)用いる場合にはイムノアッセイには不都合であると考え
られる。このように小さい遊離ペプチドは結合プロセス中に傷つけられ、低い免
疫反応性に通ずる。結合中のエピトープ妨害は、例えばダナンらの考察(J I
nrectDis156巻261−267ページ巻合61するかも知れない:そ
の考察では、ポリスチレンに直接結合した小さい免疫反応性ペプチドと反応する
陽性サンプルの65%は、1:128希釈で試験したとき、1,0以下のA49
2値を与えた。非結合ペプチドの結合中におこるこのようなエピトープ妨害はロ
ーゼン(Rosen)ら(PCT出願 WO37106065)が好適ペプチド
として、より長いペプチドを使用したこと並びにその中に開示されている複数(
multiple)ペプチドの使用も説明するかも知れない。
」1記とは対照的に、本発明の免疫試薬は、ここに記載するように小さい合成ペ
プチドを免疫試薬として使用する前に、担体蛋白質に化学的にカップリングする
ことによって形成される。したがって典型的アッセイ装置のポリスチレン表面に
結合していない短いペプチドのために、又はその短いペプチドとプラスチック表
面との相互作用によっておこるエピトープの遮蔽又は立体障害のために抗原性ペ
プチドが見逃されるということはない。本発明の合成ペプチドに結合する適切な
担体蛋白質は、分子量約5000ダルトン以上の天然に発生する又は合成のペプ
チド又は蛋白質分子で、分析すべきテストサンプルとは免疫反応性を示さず、合
成ペプチドの反応性に大きく寄与したりそれを減じたりしないものである。代表
的担体蛋白質としてはウシ血清アルブミン(BSA) 、スカシガイのヘモシア
ニンCKLH) 、ヒト血清アルブミン、ポリーL−リジン、ウシ ガンマグロ
ブリン、その他の類似のポリペプチド分子がある。現在好適担体蛋白質はBSA
及びKLHであり、BSAは最適アッセイ感度及び特異性を得るために現在特に
好適である。本発明の合成ペプチドは、それらのカルボキシル末端を介して担体
蛋白質に化学的に結合したとき高度の免疫反応性を保有することが明らかにされ
た。これらペプチドと担体蛋白質との結合は、適した結合剤、例えばマレイミド
安息香酸、p−メチルジチオ安息香酸、無水マレイン酸、無水琥珀酸、グルタル
アルデヒド、又はその他の類似の結合剤などを用い、一般的ペプチド結合手段に
よって実現される。とくに適した結合剤は、マレイミドベンゾイル−N−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル(MBS)、スルフォマレイミドベンゾイルーN−
ヒドロキシスクシンイミド(SMBS) 、スクシンイミジル−4−(N−マレ
イミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC)、スルフォ
スフシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボ
キシレート(sulros MCC)及びN−スクシンイミジル−3−(2−ピ
リジルチオ)プロピオネート(SPDP)である。
担体蛋白質への結合を容易にするために、本発明の合成ペプチドは、抗原性ドメ
インをあられすペプチド部分のカルボキシル末端に位置するアミノ酸スペーサー
テールをもっているのが好ましい。適切なスペーサーテールは、ペプチドと担体
蛋白質との結合の際に抗原性ドメインの免疫反応性を保獲し、所望のアミノ酸を
結合にあずかるようにする機能をもつ。適切なスペーサーテールは、0ないし4
個のグリシンAAスペーサーを有し、担体蛋白質に結合するためのシスティン基
に終わるペプチドセグメントである。ここに詳細に説明され、図に示される特に
好適な実施例において、アミノ酸スペーサーテールはペプチド中でC末端−GC
基によってあられされる、但しその他のスペーサーテールもこの目的のために用
いられる。約50のHIV−1抗体陽性血清のプールに対する免疫反応性、又は
約6のHIV−2抗体陽性血清のプールに対する並びにHIV−1又はHI V
−2抗体のないことがわかっている血清のプールに対する免疫反応性について、
本発明の好適ペプチドがErA法によってスクリーニングされた。血清プールを
用いてEIAスクリーニングすることによって、HIV感染中の霊長類において
最大の抗体反応をおこすペプチドを確認し、個々の人に見られるエピトープの配
列決定(Mapping)は避けた。ひとたび有望なペプチド領域が確認された
ならば(図1.5.8)その後の合成によって最適免疫反応性ペプチドが解明さ
れ(図2−4.6.7)、それから最適ペプチドを多数の個々のda清に対して
スクリーニングしたC以下参照、図1O−13)。
これらの最適ペプチド−C末端がBSAに結合したちの−のなかで最もよいもの
を、機器を必要としない目で見る迅速試験の開発のために用いた(図14)。
これらの研究は、配列rWGcsGKLIcTTAVPGc (2S09)(下
線IV−2抗体の検出のために最大に免疫反応性であることが明らかになった(
図5)。
p24蛋白質でも、ンステインを介して担体蛋白質に化学的に結合したときに顕
著な免疫反応性を示す配列ALGPAATLEEMMTACGC(5S94)を
もつペプチドが確認された(図8)。
本発明のペプチドによってあられれるHIV−1に対する免疫反応性領域は、ワ
ンプ(Wand)らの米国特許第4735896号及びコサンド(Cnsand
)の米国特許第4679783号によって確認された領域のC末端に位置する。
配列RI LAVERYLKDQQLLGIWGC3をもつワンプの免疫反応性
ペプチド及び配列IKは、本発明の目的であるペプチドとは下記の点で異なる。
ワンプのペプチド全体のYLKDQQLLGIWGC3GC(2SO3)は、C
末端を介してBSAに化学的に結合した担体蛋白質結合物として用いたときの本
発明の免疫反応性ペプチドよS25コサンド、参照、上記)は、GCスペーサー
を介してBSAに結合したC末LICTTGC(2506)及びL(’dWGc
sGKIjcTTAGc (2SO7)を含む本発明のいくつかの比較的短いペ
プチドより低い又は同等の免疫反応性を示す(図1)。しかしながらワンプら、
又はコサンドの特許いずれにも見いだされなかった重要な配列を含む本発明の新
しいペプチドを用いて最良の免疫反応性が得られる。これらの配列はワンプ及び
コサンドのペプチドについたC末端であり、例えばBSAなどの担体蛋白質にカ
ルボキシル末端GCを介して結合するときペプチドない、HIV抗体のための高
い免疫反応性を保持する配列を決定するために、免疫優性HIV−1gp41エ
ピトープの50以上の非天然配列異型を合成した。本発明の重要な点は、F(I
V抗体には高度の免疫反応性を保持し、HJV抗体のない正常なヒト血清とは不
都合に反応しない、図2−4.6.7.11に示されるHIV−1及びHIV−
2両方の非天然配列異型の発見である(図11)。これらの高度に免疫反応性の
非天然配列異型は技術的に開示されたペプチドとは著しく異なる。
これらのペプチドのうち2つ、4S36と4S76、はそれらのカルボキシル末
端によるBSAとの結合物として用いたとき、優れたアッセイ性能を与え、高レ
ベルの感度及び特異性、非常に高レベルの陽性及び陰性サンプル間の識別(図1
1C)、そして2つの商業的に承認されたEIA試験で間違った陽性反応を与え
ることが判明した血清サンプルに対しては非常に低い反応性(実施例8、表1)
を示した。この種のアッセイ性能−陽性は492nmの吸光度が1.25以下で
なく、陽性の最低と陰性の最高との間のA49□値の間隔は1.0吸光単位以上
であるーは、ペプチド−BSA結合物として用いられるここに記載の結合非天然
ペプチドによって可能となる。この種のアッセイ性能は最適であり、ベル7(B
eltz)らの米国特許第4753873号に記載されている組換えDNA法に
よってつくられる非常に大きいポリペプチド−それはここに記載の領域を含めた
HIVのgp120及びgp41の大部分を含む−の性能とよい対照となる。ベ
ル7らの特許に記載されているA4.。単位における陽性及び陰性サンプル間の
間隔はたった0、1で、陽性サンプルの11%が1.2以下のA4,2値を有す
る。本発明の合成ペプチド法は、ベル7らの特許の場合のように単一のHIV分
離物に依存するよりもむしろ、HIvエンベロープの臨界的免疫優性領域に対す
る抗原性変異の全範囲をあられすいくつかの異なるペプチドを挿入することがで
きる。また、ペプチド合成によって、免疫優性領域のみが使用抗原に含まれ、H
rvenv遺伝子生成物のあり得る交差反応部分を含むことによって導入される
l目ν異性、又は組換えDNAによって表現される蛋白質をつくるために用いる
細菌性宿主に由来する汚染蛋白質に起因する非特異性を避けることができる。
本発明の免疫特異的試薬は、液体サンプル、例えば血液又は血清サンプル中のH
IV蛋白質に対する抗体を検出する、又はHIV蛋白質捉原を検出するためのイ
ムノアッセイに用いられる。その試薬は、熟練せる当業者には公知の種々のアッ
セイフォーマット、例えばエライヤ法(ELISAアッセイ)、その他の酵素免
疫測定法(EIAアッセイ)、ラジオイムノアッセイ(RIAアッセイ)、及び
免疫特異的結合パートナ−を必要とするその他のアッセイフォーマットに広く用
いられる。
その試薬は好適にはHIV蛋白質に対する抗体の検出のためのアッセイに用いら
れ、分析すべき解体サンプルを本発明の試薬と接触させ、試薬に結合した抗体の
存在又は量をサンプル中に存在するHrV抗体の存在又は量のインディケーショ
ンとして測定する。好適には、試薬/抗体複合物をサンプル混合物から分離し、
形成された試薬/抗体コンプレックスの検出のために検出可能の標識を用いる。
分離は、試薬を固相に固定するか、形成されたコンプレックスを反応混合物から
濾別するか、又は当業者には一般的なその他の方法によって行われる。適切な固
相としてはミクロタイタープレート、ガラスピーズ、ポリスチレンビーズ、ラテ
ックスビーズ、微粒子、セルロースマトリックス、ニトロセルロースマトリック
ス、シリカゲル、及びその他類似の固相表面があるが、これに制限されるもので
はない。当業者には公知のように、試薬/抗体コンプレックスの検出に役立つ種
々の標識が用いられる。例えば適切な標識として酵素、放射性核種、発光部分、
蛍光標識、化学発光標識、磁性粒子及び直接目に見える例えばコロイド金のよう
な標識があるが、これに制限されるものではない。
現在、HTV抗体の検出のために合衆国でUSFDAによって承認されている試
験法はETA法である。これは高価な機器を必要とし、完了までの時間が2ない
し4時間かかり、多数の血清を一度に試験するように設計されている。多くの場
合には、m、器に頼らない、簡単なフォーマットと目で見える終点をもち、少数
のサンプルで行うことができ、15分以内で終了する信頼できる試験法があれば
、HIV抗体の検出の改善が可能となる。よって、5個より少ないサンプルと対
照とを用い、目による試験を行うように設計された方法及び簡単な装置による迅
速試験フォーマットがここに提供される。この装置を使用するための2種類のフ
ォーマットは以下の実施例15及び16に記載されている。各場合に本発明のペ
プチド/蛋白質結合物を用いて、15分以内に終わる簡単な目による試験を実施
する。実施例に説明されるように、これらの目的のためには遊離のペプチドは無
効であるか比較的効果が小さい、一方ペプチド/BSA結合物はよく機能する。
概して、EIA試験で最もよい性能を与える同じペプチド/蛋白質結合物も、簡
単に実施できる目による迅速試験においてすぐれた性能を発揮する。
上述の発見は、熟糺せる当業者には明らかないくつかの変更を含むものである。
例えば、本発明は、G(グリシン)スペーサー及びC(システィン)C末端アミ
ノ酸を経てBSAに結合したとき、HIV抗体の検出のためにこれまでに報告さ
れたペプチドのどれよりもすぐれた天然及び非天然両方のペプチドを明白にして
いる。
しかしながら、このようなペプチド/蛋白質結合物ですぐれたアッセイ性能が得
られるという発見は、下記のような類似の結合物にもあてはまるかも知れない:
1)結合するC末端アミノ酸が異なる、システィンでなく例えばメチオニン、チ
ロシン、リジン、アルギニン、グルタミン酸又はアスパラギン酸など:2)結合
のために用いる蛋白質が異なる、例えばウシ ガンマグロブリン、KLH,ポリ
ーL−リジン、又はHIV抗体を含まない正常ヒト血清との結合物のイムノアッ
セイ反応性には貢献しない分子量5000以上のその他の純粋ポリペプチド又は
蛋白質:3)ここに詳細に示されるもの以外のリンカ−を用いて、ペプチド上の
チオール、カルボキシル、又はその他の基と、結合のために用いるポリペプチド
又は蛋白質上の類似の反応性基との間に共有結合を形成せしめる;4)O−4グ
リシンを用いて反応性ペプチドとC末端アミノ酸との間を架橋する;5)ペプチ
ドのC末端の1−3アミノ酸を変化させる。しかしながら、これらの変更のいく
つかは、ここに記載される好適ペプチド/蛋白質結合物に比較してアッセイ性能
が劣ることがわかった。例えば、本発明のペプチドは、システィン及びそれらの
C末端を介して蛋白質担体に結合すドの方向づけが重要であるというこの原理を
証明したのはドライベルブ(Dryberg)及びオルトストン(Oldstn
ne)(J Esp Med 164巻、1344−1349ページ、1986
)であった。実際、最適免疫反応性をもったペプチド4836及び5S70(図
2−4)がそれらのアミノ基を介して、カルボジイミドを用いてカルボキシル化
ラテックスに共有結合した場合、すべての免疫反応性は失われる(実施例16参
照)。
下記の実施例は、本発明に定義された天然及び非天然ペプチド/蛋白質結合物を
した抗原としての結合物の使用、迅速試験フォーマットに使用するためのコロイ
ド金で標識した抗原としての結合物、そして迅速ETAフォーマットではラテッ
クスに結合した抗原としての結合物の使用を含める。しかしながら、熟練せる当
業者にはその他の応用も容易に理解でき、本発明の範囲はペプチド−蛋白質結合
物のこのような他の可能な同等の使用を含むことを意味する。例えば、用いられ
る固体表面はポリスチレン表面又はラテックスビーズに限られることなく、ガラ
ス、ポリプロピレン、デキストラン、ナイロン、ニトロセルロース、ゼラチン、
紙、シリカゲル、赤血球、リポソームなどを含める。同様に、ペプチド/蛋白質
結合物と、ペプチド/ペプチドポリマーとは同様によく機能し、またこのような
結合物の標識化はコロイド金に限る必要はない。ペプチド含有ポリマーを標識化
する別の方法は、放射性5識、酵素e!識、蛍光標識、抗体標識、リポソーム標
識、遊離基標識又はバクテリオファージ標識を含める。診断試薬としての有用性
に加えて、ここに記載されるペプチド/蛋白質結合物は、免疫原として用いられ
、例えば動物を免疫して診断用ペプチドエピトームに対するポリクローナル抗体
を高め、ハイブリドーマ チクノロ載されるHIVペプチド−蛋白質結合物のこ
れらのおよびその他の利用は熟練せる当業者には明らかである。
る抗体を含むか又は含まないと特徴づけた。
(サンジエゴ、カリフォルニア、米国)から入手した[他のソースのアミノ酸、
例えばアプライド バイオシステム社(Applied Binsystems
Inc)、フォスターシティ−、カリフォルニア、米国、ペニンスラ ラボラ
ドリース(Peninsula Labnrarories)ベルモント、カリ
フォルニア、米国、及びバチエム(Bachem)、 トレンス、カリフォルニ
ア、米国、のアミノ酸も使うことができる]、そしてN−アルファーアミノをt
crtブチルオキシカルボニル(L−Boc)基で保護した。このようなアミノ
酸はその他に側鎖保tf1基を含んでいた、例えばアスパラギン酸、グルタミン
酸、セリン及びスレオニンのためにはベンジル:システィンのためにはp−メチ
ルベンジル:ヒスチジンのためにはジニトロフェニル:リジンのためにはオルト
−クロロ−ベンジルオキシカルボニル、:アルギニンのためにはトシル:チロシ
ンのためにはオルト−プロモーベンジルオキシカルボニルなど。L−Bocで保
護されたアミノ酸アラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、グリシン、イ
ソロイシン、ロイシン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、及びバリンは、
側鎖を保護せずに用いられた。
SMPS合成の各段階において、溶媒及び反応体と、樹脂及び成長するペプチド
鎖との接触を完全にするために、機械的振とう機上で烈しく撹拌し、前の段階か
らの溶媒のすべては、その次の段階のための溶媒を添加する前に除去された。樹
脂を含むパックを塩化メチレン中で1分間洗い、それから5%ジイソプロピルエ
チルアミン(D I EA)−塩化メチレン溶液で2分間づつ3回、それから塩
化メチレン中で18分間づつ2回洗った。樹脂のパックを分類し、カルポギシル
末端アミノ酸として所望の、個々のアミノ酸のためIこ適した容器に入れた。9
6のこの群のすべてのペプチドはC末端システィン、その次にグリシンスペーサ
ーを含んでいたから、こに、0.2M濃度に溶解し、樹脂の8倍モル過剰の容量
をもつ適当な反応びんに入だアミノ酸の各樹脂バックへの添加は振とう機上で1
時間かけて行われた。モしてたアミノ酸をその後脱保護し、55%三フッ化酢酸
(TFA) 、45%塩化メチレンで30分処理することによってN−アルファ
ーL−Boa基を除去し、塩化メチレンで1分間、イソプロパツールで1分間づ
つ2回洗って樹脂を収縮させ、残っているTFAを全部除去し、塩化メチレンで
1分間づつ2回洗った。アルファーアミノ塩を、氷冷した5%DIEA−CH2
C12X3で中和し、それから塩化メチレンで2回洗った。保護アミノ酸の結合
、洗浄、脱保護などは、すべての所望アミノ酸がペプチド鎖に付加するまで繰り
返された。この時点でN−アルファーL−Boc基は、55%TFA/45%C
H2Cl2で30分間処理することによって各ペプチドから除去され、その後C
H2Cl2で1分間洗い、イソプロパツールで1分間づつ2回、CH2Cl2で
1分間づつ2回洗い、凍結乾燥した。完全に乾燥した樹脂バックを秤量し、重量
増加を理論値と比較することによって結合完了を予想した。ヒスチジンを含むペ
プチドはさらに0.5Mチオフェノールで処理することによってジニトロフェニ
ル側鎖保護基を除去した。チオフェノールの個々の量を3回、各々1時間かけて
加え、その後DMFで10回洗い、イソプロパツールか塩化メチレンのどちらか
で10回洗った。そのチオフェノール処理樹脂を凍結乾燥機で完全に乾燥させた
。HF分解、抽出及び凍結乾燥後にHPLCによって検査したときに高純度を示
さなかったペプチドでは、再合成を行い、ピクリン酸で結合完了をモニターした
。結合段階後、樹脂バックを0.05Mピクリン酸−塩化メチレン溶液で処理し
た。目で黄色が認められれば定性的に結合完了とし、そのピクリン酸を5%DI
R八−塩化ノー塩化メチレン溶液、358nmで測定することJこよって定量し
た。この方法は樹脂上の未反応のアミンをたった0、5%に至るまで検出した。
24の個々のペプチドを同時処理することのできるHF分解装置(マルチプルペ
プチド システムズ、ラジョラ、カリフォルニア、米国)中で、それらペプチド
をその樹脂から分離し、同時に側鎖保護基を除去した。標準筒HF法を用いた結
乾燥ペプチドは逆相クロマトグラフィーによって分析した、この場合、シン、ク
ロバック(Synchropak) C−4カラム[スペル:y (Supel
co)、ベレフォンテ、ペンシルバニア、米国]を用い、0−30%アセトニト
リルの直線勾配で0.33%/minの流速で、及び061%三フッ化酢酸で1
ml/minの流速で溶出した。
ベックマンHPLC421型(ベックマン インスツルメント、バロアルト、カ
リフォルニア、米国)及びヒユーレット バラカード社製ダイオードーアレー
ディテクター1040A型(ヒユーレット パラカード、パロアルト、カリフォ
ルニア、返し、図1−8に示される合成ペプチドの各々を合成した。
図1−8の合成ペプチドを、ペプチドの溶解度に応じて10mMボレート又はそ
の他の緩衝液中で、4℃、、pH8で、ゆるやかに撹拌しながら、10rnM
DTT、又は固定r)TT(レダクタクリル、カルビオヘム、サンジエゴ、カリ
フォルニア、米国)で−晩還元した。KLHはlQmM燐酸緩衝液−pH7,2
〜中に10−30ドエステル)、5PDP[N−スクシンイミジル−3−(2ピ
リジルジチオ)プロピオネート]、又はスルフオーSMCC[スルフオースクシ
ンイミジル 4(N−マレ−1’ミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルポキ
ンレートコで処理した。ヘテンカー混合物を室温で15分ないし1時間反応させ
、それからセファデックスG2ラフイーによって還元ペプチドをDTTから分離
し、レダクタクリルを用いた場合は遠心分離してから0.22ミクロンフィルタ
ーを通して濾過した。還元ペプチドとリンカ−処理K L H又はBSAとを、
100−1000 ペプチド/KLH−M質に加え、N2で覆い、それから1時
間室温でおだやかに撹拌し、−晩4℃で静置した。SMCC−BSA結合物をさ
らに、最終濃度ImMのメルカプトエチルアミンで4時間処理し、それから4℃
で100容量の緩衝液(20mM燐酸塩、1mMEDTA、0.05%アジ化ナ
トリウt1、pH6,5)に対して一晩透析した。その他のすべての結合物はア
ジ化ナトリウムの最終濃度0.05%に調節された。結合物のペプチド/蛋白質
の最適モル比は溶解度及び抗原性(ETAによって評価した)によって決定した
。例えば最もよい比は、約1 : l (SPDP−BSA)、10・1 (S
MCC−BSA) 、及び100.1 CMBS−KLH)であることがわがっ
た。
てスクリーニングした、そのためにはポリスチレン ミクロタイターEIAプレ
ート(コスタ−、ケンブリッジ、マサッチュセッツ、米国)の各ウェルに、トリ
ス緩衝液、lQmM、pH8、中の5−50マイクログラム/m15度のペプチ
ドを0.2m!iコーティングし、4℃で一晩盾いた。EIAによって免疫反応
性を示すペプチド又はペプチド−蛋白質結合物をさらに希釈して、コーティング
し、H196トウウイーン20、pH7,4(PBST)で、37℃で30分間
ふさいだ。それからウェルをミクロタイタープレート ウオッシャ−で吸引して
乾燥させ、50mM燐酸塩、100mMNaC1,0,05%トウウィーン20
、pH7,4(PBST)の溶液で3回洗った。試験すべき霊長類血清の1 :
101希釈液(1%BSA、1%NR3を含むPBSTで)を0.2mlとし
て、洗浄した各ウェルに加え、そのプレートを37℃で30分間インキュベート
した。その後プレートをPBSTア、米国)の1゜2000希釈液を0.2mI
fa各ウェルに加え、プレートを37℃で30分間インキュベートした。プレー
!・をPBSTで3回洗い、0.1Mクエン プレートリーダーでA4g□で測
定した。各実験系列にはポジティブ−及びネガにたいしてスクリーニングされ、
同じ血清プールを用いて種々の遊離ペプチド又はペプチド−蛋白質結合物の免疫
反応性を定量的に比較することができた。上の条件は最適試験性能を与えること
がわかった、そして以下のEIA実施例に用いられた。
10マイクログラム ペプチド/m+の濃度でポリスチレンミクロタイター プ
レびにHIV−1抗体又はHIV−2抗体を含まないプール血清(それぞれHI
V−/S I V−)の1 : 101希釈液を用いて免疫反応性を評価した。
ペプチド2S04.4S25,3S36,2SO6,2SO7,2309,23
11,3S51.2S13,3S55.2S15のBSA−SMCC結合物(図
1)ではHIV抗体に対して顕著な免疫反応性が認められ、配列IWGC3GK
LICTTAVPGCをもつペプチド2S09の結合物ではわずかによりすぐれ
た免疫反応性が認められた。HIV−2感染患者からの血清は米国では比較的平
に入らないから、HIV−2合成ペプチドの免疫反応性は、ワシントン大学霊長
類センター、ワシントン、米国、から入手したSIV感染感染−カークザル清を
用いて評価した。SIvのAA配列は合成したペプチド領域においてHIV−2
のそれとほぼ同じである(参照、マイヤーズら、ヒト レトロウィルスとAID
S、1988. “核酸及びアミノ酸配列の編集”ロスアラモス国立研究所、ロ
スアラモス、ニューメキシコ、87545、米国)。ペプチド2S23.2S2
4.2S25.2S27、及び2S28のBSA−SMCC結合物では、S I
V/HIV−2抗体で顕著な免疫反応性が認められた、最高の免疫反応性が認め
られたのは、図5に示されるように2324 (配列 DQARLNSWGCA
FRQVCをもつ) 、2S25 (IE列 ARLNSWGCAFRQVCH
GCをもつ)及び2S27 (配列 5WGCAFRQCHTTVPGCをもつ
)であった。概して、KLH結合物よりもBSAで、よりよい免疫反応性が認め
られた。
してKLHに結合したときの合成天然ペプチド2806及び2SO9(図1)の
免疫反応性を示す。血清サンプルを提供してくれたシアトル キング カランテ
ィ保健部がゲネティック システムズ EIA法によって評価した場合、血清標
本の42がHIV−1抗体を含み、52が含んでいなかった。陽性サンプルすべ
てを陰性サンプルと区別した。しかしながら陽性サンプルの多くの免疫反応性は
低く (A4.2は1.0以下)、陰性サンプルの若干は0.20より少し高い
A4,2値を有し、その結果陽性と陰性との識別はよ(なかった。この不十分な
識別のため、改良された担体蛋白質及び/又はリンカ−を探すことになった。
に結合した場合の、合成提供ペプチドIWGC3GKLrCTTAVPGC(2
S09)の反応性を示す。サンプルを提供したシアトル キング カランティ保
健部がゲネティック システムズ EIA法によって評価した全部で184のヒ
ト血清のうち98がHIV−1抗体を含み、86が含んでいなかった。陰性サン
プルは低いA4,2値を示し、大部分の陽性サンプルはより高いA4,2値を示
したという点で、図5Aに比較してアッセイ性能の改良が認められる。これは、
SMCCリンカ−を用いたペプチド−BSA結合結合用ンカ−としてMBSを用
いたペプチド−K L H結合物よりすぐれたEIA試験性能を与えることを示
している。しかしながら、いくつかの陽性サンプルはこの結合物では非常に低い
−これらを陰性サンプルから確実に区Ullするにはあまりに低い一免疫反応性
をもっていた。低い反応性の若干は、ザイールからのHIV分離物で報告された
ように(ダナンら、サイエンス 237巻、1346−1349ページ、198
7)このエピドーム領域における遺伝的異型の抗原的差異によるかも知れないの
で、天然?EF+1異型ブチド5S67 (図3)を合成し、SMCCによって
BSAに化学的に結合せしめ、同じ血清に対して、それに加えてもう一つの陰性
血清サンプル(図100)に対して試験した。天然2S09−BSA結合結合用
い免疫反応性を示した患者血清の多くは、5S67−BSAではより高い反応性
を与えた。しかしながらペプチド5SはHIV−1抗体を含まない血清と許容し
得ない高い反応性を示した(図100)。このため、HIV−1抗体を含む大部
分の血清との高い免疫反応性を保持し、HIV抗体のない血清とは低い反応性を
示すペプチド2S09の非天然配列異型を探索することになった。
図2及び図3は、実施例1の方法を用いて合成したペプチド2S09及び5S6
7の47の配列異型を示す。目立つアミノ酸はこれらペプチドの天然配列からの
異型である。遊離ペプチドとして、ヒトHIV−1抗体と、ポリスチレン ミク
ロタイター プレートに結合した天然ペプチド2S09及び5S67のBSA−
SMCC結合物との結合を阻止する能力によって、ヒトHIV−1抗体に対する
免疫反応性を保持するこれらを確認した。図4は、図2及び図3で最大の免疫反
応性を示した7天然配列異型及び21非天然配列異型の直接的抗体結合活性を示
す。陽性血清プールに対するA4,2免疫反応性/陰性血清プールに対するA4
,2免疫反応性の比が最もよい結合物を、さらに評価した。非天然ペプチドのい
くつかの結合物は、図10Bの最小免疫反応性血清で試験したとき、ペプチド2
S09よりも高い免疫反応性を与えたが、これらの若干は、ペプチド5367で
見られたように(図100)、陰性血清に対して高い非特異的反応性を示した。
その他のペプチドは大部分の陽性血清では免疫反応性を保持し、陰性血清では免
疫反応性の変化はなかった。2つの特に好適な非天然配列ペプチド、4S36及
び5S76をさらに評価した。
化学的に結谷させ、ポリスチレン ミクロタイター プレートにコーティングし
、183のヒト血清に対してEIA法で試験したときの、非天然ペプチド4S3
6(VQGC3GKLICTTAVPGC)(D免疫反応性ヲ示ス。同シ98
)陽性血m、並びに図10Bの86の陰性血清のうちの85を用いた。ペプチド
のN−末端のイソロイシンの代わりにバリンを置換したものを除いて、低陽性の
免疫反応性が、同じ配列をもつ天然配列ペプチドに比較して著しく増加した。9
8の陽性サンプルのうち、A4,2が1.0以下であったものは1つもなかった
。一方陰性血清のA49□値は比較的低いままであった。図11Bは、ポリスチ
レン ミクロタイター プレートにコーティングし、図10Bと同じ陽性及び陰
性血清に対し、またもう1つの陰性血清に対してEIA法で試験したときの、非
天然ペプチド5S76 (IWGC3GKMICTTAVPGC) の類似(7
)C末端 BSA−SMCC結合物の免疫反応性を示す。5陽性サンプルが1.
0以下のA 462を与えたが、残りの数値は高く、図10Bでは弱く反応した
幾つかの血清に対して強い免疫反応性をもつものも含まれた。図11Cは、ポリ
スチレン ミクロタイター プレートにコーティングし、図11Aと同じ血清に
対してEIA法で試験したときの、結合非天然ペプチド4S36及び5S67の
、BSA−SMCC結合物との免疫反応性を示す。陰性血清との反応性は低いま
まであるが、陽性血清と結合非天然ペプチドとの免疫反応性はどちらのペプチド
でもペプチド単独よりは大きかった、その結果1.25以下のA4,2値をもつ
陽性サンプルはなく、最低陽性と最高陰性とのA4,2値の開きは1.0以上の
吸収単位となった。これらのEIA試験性能結果は、同じ試験血清で試験した他
のいかなるErA試薬の性能よりも優れており、今までに文献に記載された結果
よりも優れている。
の合成非天然gp41ペプチドを組み合わせて結合させることによって、すぐれ
たアッセイ性能及び特に良い感度が得られることを示している。このようなアッ
セイ国)又はデュポン(ウィルミントン、プラウエア、米国)のどちらか又は両
方の市販のEIAアッセイで間違った陽性結果を与えた12のヒト血清を、キン
グ カランティ保健部(シアトル)から入手した。これら市販のEIAシステム
では陽性であったにもかかわらず、これらの各々の血清でのウェスターン プロ
ット 確認試験は完全に陰性であった。
12ヒト血清群を実施例3の方法にしたがい、合成ペプチド4S36及び5S7
6の組み合わせを用いて試験し、市販のゲネティック システムズ及びデュポン
EIAアッセイで得た結果と比較した。結果を下表に示す:11 + + 0.
70(陽性)
12 + −0,18
゛間違った陽性”の合計零11 7 1“間違った陽性′の % 92 58
8京ウェスターン プロットにより陰性。
1表は、非天然合成ペプチド4S36及び5S76のBSA結合結合用いてポリ
スチレンプレートをコーティングするEIA法の免疫反応性を示す。ペプチド4
S36及び5S76を用いるアッセイでは12サンプル中たった1個だけが(8
%)陽性であったのに対し、デュポン及びゲネテイツクシステムズの商売上許可
されたアッセイではそれぞれ12中7(58%)及び12中11(92%)が陽
性であった。これらの結果は、市販の2アツセイに比較して、実施例8及び図1
10において構成されたEIA試験の特異性がすぐれていることを示している。
去麹倒旦
4S36及び5S76のBSA結合結合用いるHIV−1抗体に関する血清変換
本発明の2つの非天然合成ペプチドの免疫反応性とを直接比較することができる
。
結果は下記の2表に示される:
°(神全く
度を示した。
実施例12
結果は下の3表に示す。
1嚢
実験的にSIVに感染した7マカークザルのHIV−2抗体発現(血清変換)の
検拝跡
ペプチド−BSA結合結合用る反応性
0週* O/7 0/7 0/7
3週 2/7 3/7 3/7
4週 471 4/7 3/7
6週 6/7 6/7 6/7
8週 771 7/7 6/7
16週 7/7 7/7 7/’1
み合わせを用いたものである。
実施例13
2ペプチド結合物のHrV−1血清に対する反応性〕HrV−1gp41ペプチ
ドに対応するペプチド4s36 (VWGC3GKLICTTAVPGC) 及
び5S76 (IWGCSGKMICTTAVPGC) を実施例2の方法によ
りそれらのC末端を介して結合させ、これを実施例3のEIA法に用い、HIV
−1抗体陽性血清 30、HIV−2/SIV抗体陽性血清 23、HIV−1
抗体陰性血清 15、HIV−2/S IV抗体陰性血m 15t−試験した。
図13Aに示されるように、結合ペプチド4S36及び5S76はHIV−1抗
体陽性サンプルのみを検出し、HIV−2抗体陽性サンプル23すべてを検出し
なかった。HI V−2/S r V天然ペプチドに対応するペプチド2S24
(DQARLNSWGCAFRQVC)及び5S86 (SWGCAFRQV
CHTSVPGC)を、実施例2の方法によりそれらのC末端を介してBSAに
結合させ、実施例3の方法によるEIA法に用い、上記の血清パネルを試験した
。図13Bに示されるように、結合ペプチド2S24及び5S86はHIV−2
抗体陽性サンプル23すべてを検出し、HIV−1抗体陽性サンプル30のうち
4つは0.4以上のAn□を与えた。検出ペプチド4S36及び5S76をそれ
から結合ペプチド2S24及び5S86と結合させ、EIAに用いて同じ血清パ
ネルを試験した。図13Cに示されるように、HrV−1プラスHIV−2結合
抗原プレートはHIV−1及びHrv−2抗体陽性をすべて検出した。HIV−
1又はHIV−2抗体陰性血?>rすべ実施例14
図8は、SMCCを用いてC末端を介してBSAに結合し、HIV−1抗体を含
む人からの約50の血清のプール、又はHIV−1抗体のない人からの約30の
血清のプールと反応させたときの、HIV−1p24の合成ペプチドの免疫反応
性及びAA配列を示す。図かられかるように、ペプチド5S93−5896を含
むプールのみが明らかな免疫反応性を示し、そのプールのなかで特に、配列AL
GPAATLEEMMTACGCをもつペプチド5S94が免疫反応性ペプチド
であることがわかった。リンカ−としてSMCCを用いてそのC末端を介してB
SAに結合したこのペプチドを、HIV−1抗体を含む98の個々の血清に対し
、またこれを含まない85の個々の血清に対して試験した。陰性血清は1つも反
応しなかった(0/85.0%)、17の陽性血清(17/98.17%)が免
疫反応性であった。
無症候性感染から臨床的疾患及びAIDSへと進行する間に、ヒトにはp24に
対する抗体が失われることが報告されたし7ランチニ(Franchini)ら
、憔液(Blcyxl)”69巻、(2)、437−441ページ、1987、
及びウェーバ−(Weber)ら、ランセット(Lancet) 1巻119−
122ページ、1987]、これは、被験血清ではこのペプチドに対する抗体の
発生頻度が低いことを説明するものかも知れない。
実施例15
HIV抗体を検出する迅速試験
迅速試験を15分以内に行うための試験装置を図14及び15のように作成した
。
図14及び図15に関して言えば、装置は、複数のじょうご状のウェル(12)
をもつ(各ウェルは約200マイクロリツターの容積をもつ)プラスチックスラ
イド(10)と、直径約9mmの上方流入管へり(14)と、直径約2mmの底
部流出管(16)から成る。流出管(16)の下面は、装置内のこれに続いて配
貨されている膜フイルタ−(18)と滑らかに均質に接触できるよう設計されて
いる。膜フィルターは、そこを通過する反応体をその大きさによって分離し、あ
らかじめ定められた大きざ以上−例えば0.22ミクロン以上−の粒子、又は0
.45 ミクロン以上の粒子を保持する(逆捩した特殊フィルターによって)、
但しその装置にf6かれたその他のフィルターは、結合又は親和性によって分離
することができる(すなわちニトロセルロース、ガラス)。フィルター膜の下に
は、ウェルに置かれた液体をすべて吸収する十分の厚さ及び吸収容量をもった吸
収パッド(20)がある。これら3成分は、頂部プレート(22)と底部支持体
(24)とから成るプラスチックホールダー(21)のなかにすっぽり入れられ
る。その入れ物の2部分は摩擦によってぴったり付き、スライド、フィルター膜
及び吸収パッドを試験実施のために適したように支持するのに役立つ。
遊離ペプチド2SO9(IWGC3GKLTCTTAVPGC)及びリンカ−と
してS M CCを用いてC末端を介してBSAに結合した(実施例2の方法に
よる)ペプチド2S09をコロイド金(粒度20ナノメーター、ヤンセン ライ
フ サイエンシズ、ビス力タウエイ、ニューシャーシー、米国)と反応させた。
多大の努力にもかかわらず、遊離ペプチドはコロイド金とでは使用できなかった
。それは電解質のように作用し、コロイド金を直ちに溶液から沈殿させた。数種
類の遊離ペプチドを粒度20のコロイド金に加えたが、結果は同じであった。2
0nm金粒子は直ちに溶液から沈殿し、この効果がペプチド特異的ではないこと
がわかった。2S09ペプチド−BSA結合結合力はこれよりもずっとBSA単
独の場合のように振る舞い、下記のようにペプチド−BSA−Au結合物を作る
ことができた:C末端及びSMCCを介り、てBsAl:結合サセタベブチド
rWGcsGKLICTTAVPGC8mIfrk(A2++o=0.50)を
−晩4℃で蒸留水2Lに対して透析した。
直径20m1のコロイド金ゾル(G20、ヤンセン ライフ サイエンシズ)2
mlfAを、0.2N K2Co、及び0.2N H,PO4を用いてpH5,
0,5,2,5,5,5,8,6,0,6,1,6,4に調節した。凝集を防ぐ
ために、ミクロタイター プレートにおいて各pHに調節した金ゾル溶液200
マイクロリッター量であらかじめチェックした。透析したペプチド結合物20マ
イクロリッターを撹拌しながら各pH1,:調節した金ゾル溶液に加え(このと
き色は変化しない)、2分間放置する。2絹のミクロタイター ウェルに同じ金
ゾル溶液を用意して対照とし、ペプチド−蛋白質結合物の代わりに緩衝液を加え
た。10%NaC! 50マイクロリツターを各ウェルに加えた。ペプチド−B
SAを含まないものは、金ゾルの凝集の結果、灰色になった。各ウェルのA s
goを測定した。最低値(最良の保護を意味する)はpH6,1>pH6゜0)
その他のpHであった。pH6,1でより多量の金ゾルを用いると、保護蛋白質
の最小爪は透析ペプチド−BSA 70マイクロリツター(A2go=0.45
)であることが確認された。pH6,1の透析ペプチド−BSAを150.00
0 X gで70分間超遠心機にかけ、凝集物を除去し、超遠心物の上澄液で最
小保護蛋白質研究を繰り返し同じ結果を得た。G20金ゾル1mlあたりペプチ
ド−BSAの85マイクロリツター量を保護のために選び、超遠心上澄液15m
1を烈しく撹拌しながら2分間で金ゾル176m1に加え、その後0.2NK2
Co、でpHを9.0に調節し、pF(9の10%BSAを加えてBSAの最終
濃度を]%とした。その後溶液を4℃で30分間 12000Xg (平均)で
遠心分離した。上澄液を吸引して捨てた310%のものは捨てずに、ベレットを
懸濁させるために用いた。洗浄緩衝液トリス20mM、150mM NaCl、
]%BSA、0.05%NaN1、pH8,2を最初の量に加え、遠心分離を繰
り返した。
上澄液除去、再懸濁、反復洗浄及び遠心を2度繰り返した、pH9,0に調節し
た同じ洗浄緩衝液を用いた。最終的再懸濁溶液のA5□。は6.68で、色は深
紅色であった。上と全く同じプロトコールで、ただしHIVとは無関係のペプチ
ド及びマイコバクテリウム属蛋白質配列を用いて対照ペプチド−BSA結合結合
力った。
ペプチド−BSA−金納合物の免疫反応性を試験するために、未希釈の結合物1
0マイクロリッターを、1%NRS、1%BSA、50mM燐酸塩、100mM
NaC1,pH7,4,0,05%NaN、で1 : 100に希釈したヒト血
清 20マイクロリツターと混合し、室温で5分間インキュベートした。1%加
熱滅菌5tap。
hylocnccus aureus Cnwan株120マイクロリツターを
各血清に加え、さらに5分間室温でインキュベートした。0.22ミクロン サ
イズの膜フィルターを有する上述の装置のウェル(12)に各サンプル45マイ
クロリツターを入れた。20はHIV−1抗体を含み、20はそれを含まない全
部で40の血清サンプルを試験した。各サンプルの液がその膜を通過し、吸収パ
ッドに入った後、陽性血清サンプル20のうち19並びに陽性血清と共に用いた
マイコバクテリウム属ペプチドーBSへ−金納合物においては赤紫色の点が残っ
た。この試験は、この装置及びペプチドBSA−コロイド金結合物を用いてHI
V抗体を検出する迅速試験が実行可能であることを示した。さらに、このような
結合物をつくるためには遊離ペプチドは適さないこともわかった。
記のようにして証明された:非天然ペプチド4S36 fVWGcsGKLIc
TTAVPGC) 及び5S70 (rWGcsGKQICTTAVPGC)’
c、遊離ペプチドとして及び実施例2に記載の方法でシスティン結合−BSA結
合結合力て、下記のプロトコールによりカルボキシル化ラテックスに化学的に結
合させた。10%ラテックス 125マイクロリツター量を脱イオン水375マ
イクロリツター量に加え、等Q(0,5m1)の1Mカルボジイミド、pH4,
5、と混合した。混合物を室温で1時間おだやかに振とうした。それから900
0Xgで10分間遠心分離し、上澄液を除去し、ペレットを脱イオン水、pH4
,5、に再懸濁するという方法で3回洗った。遊離ペプチド 1mg/ml濃度
(4S 36及び5S70の各ペプチド1mlあたり500マイクログラム)、
又はペプチド4S36及び5S70のペプチド−BSA結合結合力00マイクロ
グラム/m+を最終的に洗浄した活性化ラテックスペレットに加えた(最初のラ
テックス容量125マイクロリツターあたりペプチド含有溶液1ml量)。ラテ
ックス ペプチド混合物を一晩4℃でおだやかに振とうした、それから9000
Xgで10分間遠心分離し、上澄液を除去した。活性化ラテックスと合一する前
と後に、遊離ペプチド溶液の及びペプチド−BSA結合物のA21I0を測定し
たところ、結合物の60%、及び遊離ペプチドの45%がラテックスに結合して
いることがわかった。ラテックスと付着した遊離ペプチド又は結合物のベレット
を、0.03Mトリス、pH8,0,0,8%NaC1,1%BSA及び0.0
5%NaN、、から成る洗浄緩衝液と共に遠心分離することにより各3回洗った
。最終的に洗浄したベレットは、NaN、濃度を0.1%に調節した同じ洗浄緩
衝液(ラテックス希釈緩衝液)を用いてラテックス濃度0.625%になるよう
に再悪濁させた。ペプチド−BSA結合物をコーティングしたラテックスのこの
保存溶液はラテックス希釈緩衝液で1:10〜1:30に希釈され、下記の迅速
EIA法に用い得ることが確認された。これに対して、遊離ペプチドをコーティ
ングしたラテックスの保存溶液は、希釈しなくても、迅速ETAフォーマットに
おいてHIV抗体を含むサンプルと含まないサンプルとを区別することができな
かった。迅速EIA法のために、血清標本を、0.8%NaCl、0.05%N
aN3.0.05%トライトンx−100を含む0.03M トリス、pH8、
から成る血清希釈緩衝液で希釈した。アッセイのために、希釈血清1滴(20マ
イクロリツター)を1.10希釈保存ラテックス1滴(20マイクロリツター)
に加え、混合し、試験管中で室温で1−2分間インキュベートした。この混合物
1滴(20マイクロリツター)を、0.45ミクロン サイズの膜フィルターを
備えた実施例15の迅速試験装rδに加えた。混合物はほとんど直ぐに装置内に
流入し、それに続いて洗浄液(血清希釈緩衝液)各1滴(20マイクロリツター
) 、4mM MgCl2を加えたラテックス希釈緩衝液で1・20に希釈した
ヤギ抗ヒト免疫グロブリン(ガンマ鎖特異的、キャラペルーオルガノン テクニ
カ、PA)に結合したアルカリホスファターゼから成るアルカリホスファターゼ
結合物1滴、洗浄液1滴、基質1滴を次々に加えた。基質は、NBT にトロブ
ルーテトラゾリウム、シグマ ケミカル社、セントルイス、ミズリー、米国)及
びBCIP(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドキシルホスクェート、シグマ
)の各々100マイクログラム/mlを含む100mM1−リス緩衝液から成っ
ていた。陽性は、図14の26に見られるように、概して2分以内にIIQIに
青紫色の沈殿をあられした。陰性は、図14の28に見られるように、最低5分
間は青色を発現しなかった。3−4分後に4 N H2S O41滴を落とすこ
とによって反応を止め、その試験装置は陽性(青紫色)又は陰性(白い膜)の永
久的証拠として、その結果を記録するまで取っておくことができる。全部で20
0のヒト血清(そのうち98はHIV−1抗体を含み、102はそれを含んでい
なかった)をこの迅速EIAで試験した。HIVを含むもの97が迅速EIAフ
ォーマットで紫色を与え、それを含まないものは一つも紫色を与えなかった。こ
れは、上記のプロトコール及び試験装置を用いる迅速EIAを用いてHIV抗体
を15分以内に検出できることを証明した。さらに、非天然ペプチド4S36及
び5S70のペプチド−BSA結合物は迅速EIAに適しているが、同じペプチ
ドでもそのアミン基を介してラテックスに共有結合した遊離ペプチドとしてこの
試験に用いる場合はこれらのペプチドは許容できないことも明らかになった。ラ
テックスに受動的に吸着した遊離ペプチド4836は免疫反応性試薬を生成した
、しかしその反応動態及び陽性及び陰性サンプル間の識別は、この試薬ではペプ
チド−BSA結合物でつくったラテックス試薬よりもよくなかった。
実廊倒↓ヱ
E(rV−2抗体を検出する迅速EIA試験実施例16のカルボジイミド カッ
プリング法を用いて、ペプチド2S24.5S86、及び5S92の共有結合し
たベブ升ドーBSA結合物を含むラテックスをつくった。その他に、2S25は
カルボキシル化ラテックスに受動的に吸着させた。
共有結合及び受動的吸着の前及び後に行ったA28゜測定で、ペプチド−BSA
結合物300マイクログラムが及び受動的吸着ペプチド2S25の230マイク
ログラムが10%ラテックス125マイクロリツターに結合することかわかった
。実施例16に示したように処理し使用した後、両試料共、HIV−2抗体を含
む血清サンプル(HIV−2+)とこれを含まない血清サンプル(HIV−2−
)とを区別できることがわかった。しかしながらシスティン結合 ペプチド−B
SA結合物から6及び5S70、図4)及びHIV−2(2S24.5S86.
5S92、図7)の両方をあられすペプチド−BSA ラテックス試薬の組み合
わせを含めることによって、同じ試薬で)(TV−1又はHIV−2に対する抗
体を検出することが可能になった。HIV−1のみをあられすラテックス試薬は
迅速試験でHIV−2抗体を確認することができなかったし、その反対も言える
。
実施何上旦
非結合ペプチドとの反応の阻止による、迅速EIA試験において認められた陽性
いて、競合又は阻害非結合ペプチドの存在する場合と存在しない場合で、HIV
−1ラテツクス試薬、HIV−2ラテツクス試薬、及びHIV−1プラスHI
V−2ラテツク又試薬で試験したときに得られた結果を示す。予想どうり、HI
V−1ペプチドのペプチド−BSA結合物を含むラテックス試薬はHIV−1抗
体を検出し、HIV−2抗体を検出しなかった、そしてHrV−2ペプチドのペ
プチド−BSA結合物を含むラテックス試薬はHIV−2抗体を検出したが、H
IV−1抗体を検出しなかった。それに対して、両ラテックス試薬の組み合わせ
は両方の抗体を検出した。ペプチド−BSA結合物に使用されたものと同じHI
V−1gp41の遊離ペプチドは抗体のHIV−1結合を阻止したが、HI V
−2ラテツクス試薬を阻止しなかった、この反対も言える。これは、検出された
抗体がHrV経膜的糖蛋白質に向けられることを確認し、さらにその抗体がHI
V−1、又はHIV−2に、又は両方に向けられるのかどうかを明確にした。
土嚢
迅速EIA試験の免疫反応特異性
非結合ペプチドに対する免疫反応性の阻害による確認ペプチド−BSA ラテッ
クスの反応性10 HIvllプラス]0011g/i+I O/ 10 0/
10 0/ 104S36&5S76
10 HIV士プラス1004g/+nl 10/10 0/10 10/10
2S25&5S86
4 )(jV−2+のみ 0/4 4/4 4/44 HIV 27’ラスlO
hg/+nl O/4 0/4 0/42S25&5S86
4 )ITV2プラスlOhg/ml O/4 4/4 4/44S36&5S
76
本ペプチド4S36&及び5S70がシスティンを介してBSAに共有結合して
いるペプチド−BSA結合物でコーティング木本ペプチド2S24及び5S86
がシスティンを介してBSAに共有結合しているペプチド−BSAでコーティン
グ
プチド濃度500ur/mlになるようにフロイント不完全アジュバントの乳濁
液をつくる。この乳濁液の50jgffiをマウスにIP注射するか、100μ
g量を家兎に肩甲骨下に1M注射した。1力月後、同じ用量レベルでブースター
免疫を再び行い、各動物の血清について、遊離ペプチドか、又はK L H結合
物をつくるのに用いたもの(MBS)とは異なるヘテロ三官能性リンカ−(SM
CC)によってBSAに結合したペプチドを使用して、EIA法によってペプチ
ドに対する抗体反応をテストした。多価血清が直接又はその後にブースター免疫
を行った後に使用され、または、モノクローナル抗体が所望の場合はその後標準
ハイブリドーマ法が行われる[ギリス(Gillis) &ブチャナン(Buc
l+anan) 、Infect Immu 49巻371 377ページ、1
982コ。
O<<< a<<<<<<<
天然(N)または A492
ペプチド番号 配列 非天然(U)、HIV+/HIV・サンプル数
サンプル数
一一陣一一−ムムQ
o、、 01.a 0 LAoいOu口サンプル数
サンプル数
アノフル奴
サンプル数
サンプル数
Claims (22)
- 1.液体サンプル中のHIV−1又はHIV−2抗体の存在又は量を確認する方 法であって、 HIV−1のgp41蛋白質又はHIV−2のgp32蛋白質の抗原ドメインに 特異的な免疫特異性を有する少なくとも1つの合成ペプチドをもつ免疫特異的試 薬と液体サンプルとを接触させ、その合成ペプチドはそのC末端を介して担体蛋 白質に結合しており、 免疫特異的試薬に結合した抗体の存在又は量を確認することから成る方法。
- 2.免疫特異的試薬が、 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 及びこれらのマルチマー、ポリマー、免疫反応性断片及びそれらの混合物から成 る群から選択されたHIV−1のgp41蛋白質に特徴的な免疫反応特異性を有 する少なくとも1つの合成ペプチド、 又は 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 及びこれらのマルチマー、ポリマー、免疫反応性断片及びそれらの混合物から成 る群から選択されたHIVgp32蛋白質に特徴的な免疫反応特異性を有する少 なくとも1つの合成ペプチドを含む請求項1記載の方法。
- 3.免疫特異的試薬がC末端を介して担体蛋白質に結合した少なくとも2つの合 成ペプチドを含む請求項2記載の方法。
- 4.免疫特異的試薬がHIV−1のgp41の抗原ドメインに特徴的な免疫反応 特異性を有する少なくとも2つの合成ペプチドを含む請求項3記載の方法。
- 5.免疫特異的試薬が4S36、5S76,AB14,2S04,2S09及び これらのマルチマー、ポリマー、及び免疫反応性断片から成る少なくとも2つの ペプチドを含む請求項4記載の方法。
- 6.免疫特異的試薬がHIV−2のgp32の抗原ドメインに特徴的な免疫反応 特異性を有する少なくとも2つのペプチドを含む請求項3記載の方法。
- 7.免疫特異的試薬がAB18,2S24,2S25,2S27、5S85,5 S86,5S92,及びこれらのマルチマー、ポリマー、及び免疫反応性断片か ら選択される少なくとも2つのペプチドを含む請求項6記載の方法。
- 8.免疫特異的試薬が、HIV−1のgp41蛋白質に特徴的な免疫反応特異性 を有する少なくとも1つの合成ペプチドと、HIV−2のgp32に特徴的な免 疫反応特異性を有する少なくとも1つの合成ペプチドとを含む請求項3記載の方 法。
- 9.免疫特異的試薬が4S36、5S76,AB14,2S04,2S09、及 ひこれらのマルチマー、ポリマー、及び免疫反応性断片から成る群から選択され た少なくとも1つのペプチドと、AB18、2S24,2S25、2S27、5 S85、5S86,5S92及びこれらのマルチマー、ポリマー、及び免疫反応 性断片から成る群から選択された少なくとも1つのペプチドとを含む請求項8記 載の方法。
- 10.免疫特異的試薬が固相に結合している請求項1記載の方法。
- 11.HIV−1のgp41に特徴的な免疫反応特異性を有し、そのC末端を介 して担体蛋白質に結合し、 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 及びこれらのマルチマー、ポリマー、免疫反応性断片及びそれらの混合物から成 る群から選択される少なくとも1つの合成ペプチド、又は【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 及びこれらのマルチマー、ポリマー、免疫反応性断片及びそれらの混合物から成 る群から選択されるHIV−2のgp32蛋白質に特徴的な免疫反応特異性を有 する少なくとも1つの合成ペプチド を含んで成る免疫特異的試薬。
- 12.HIV−1のgp41に特徴的な免疫反応特異性を有する少なくとも2つ の合成ペプチドを含んで成る請求項11記載の免疫特異的試薬。
- 13.4S36、5S76,AB14,2S04,2S09,及びこれらのマル チマー、ポリマー、及び免疫反応性断片から成る群から選択される少なくとも2 つのペプチドを含んで成る請求項12記載の免疫特異的試薬。
- 14.HIV−2のgp32に特徴的な免疫反応特異性を有する少なくとも2つ の合成ペプチドを含んで成る請求項11記載の免疫特異的試薬。
- 15.AB18,2S24,2S25,2S27、5S85,5S86,5S9 2,及びこれらのマルチマー、ポリマー、及び免疫反応性断片から成る群から選 択される少なくとも2つのペプチドを含んで成る請求項14記載の方法。
- 16.gp41の免疫反応特異性を有する少なくとも1つのペプチドとgp32 の免疫反応特異性を有する少なくとも1つのペプチドとを含む請求項11記載の 免疫特異的試薬。
- 17.ペプチド4S36、5S76,2S24,5S86、AB14、AB18 から成る請求項10記載の免疫特異的試薬。
- 18.【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】; 及びこれらのマルチマー、ポリマー、免疫反応性断片及びそれらの混合物から成 る群から選択される合成ペプチド。
- 19.請求項11記載の少なくとも1つの免疫特異的試薬を含んで成る診断用キ ット。
- 20.動物を請求項11記載の免疫特異的試薬で免疫し、その動物によって生成 された抗体又は抗体産生リンパ球を回収することから成るHIV−1又はHIV −2抗体の製法。
- 21.その(ペプチドの)C末端を介して担体蛋白質に結合した請求項18記載 のペプチドを少なくとも1つは含む免疫原。
- 22.請求項21記載の免疫原に対して生じた抗体。
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