JPS63501716A

JPS63501716A - 合成ペプチドおよびａｉｄｓおよびａｒｃの診断ならびにワクチン注射へのその使用

Info

Publication number: JPS63501716A
Application number: JP61505826A
Authority: JP
Inventors: ケネディ，ロナルド・シー; ドリースマン，ゴードン・アール; エセックス，マイロン
Original assignee: サウスウエスト・ファウンデ−ション・フォア・バイオメディカル・リサ−チ; プレジデント・アンド・フェローズ・オブ・ハーバード・カレッジ
Priority date: 1985-10-24
Filing date: 1986-10-22
Publication date: 1988-07-14
Also published as: ATE108022T1; EP0245362A4; DE3689941D1; WO1987002775A1; EP0245362A1; CA1305828C; EP0245362B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】合成ペプチド９およびＡＩＤＳおよびＡＲＣの診断ならびにワクチン注射へのその使用症候群（ＡＲＣ）を予防するためのワクチンに関する。特に、本発明はＡＩＤＳに対する免疫方法およびＡＩＤＳの診断検定に使用し得る合成ベプチｙＫ関する。

ＡＩＤＳは初めに男性同性愛者の間に発生する日和見感染の報告をもたらした重い免疫不全症として発見された〔ゴツトリーブ（Ｇｏｔｔｘｌｅｂ、　Ｍ、Ｓ、）ら、３０５Ｎ、Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍａｄ、　１４２５−１４３１（１９８］）およびマシｘ　−（Ｍａｓｕｒ、　Ｈ，）ら、３０５Ｎ。

Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍａｄ、１４３］−１４３８（１９８］）を参挿されたい〕。

”後天性免疫不全症候群”と名づけられたこの新しいヒトの病気の発生率は急速に増しつつある。性的伝播が主な感染方法であると思われるが、この疾患が幅圧によって伝染される多くの例が報告されている（ゴツトリーブらの上記又状を参照されたい）。この病気の原因はヒト向Ｔ細胞性つィルス■型（ＨＴＬＶ−１）、リン’”　節＆　関連ウィルス（ＬＡＶ）（バレーシヌーシ（Ｂａｒｒｅ−８ｉｎｏｕｓｓｉ、　Ｆ、）ら、２２０　５ｃｉｅｎｃｅ　８６８−８７１（１９８３）を参照〕、あるいはＡＩＤＳ関連レトロウィルス（ＡＲＶ）といろいろに呼ばれるヒト・レトロウィルスであることが判明した。

血清疫学的研究は、大部分のＡＩＤＳ患者またはＡＲＣ患者の血清中にｍＴＬＶ −７１特異的抗体を同定した。ＡＩＤＳ、ｔＢ者および血友病患者から得られた血清中の抗体によって認識される主な抗原は、外被糖タンパク質と関係がある。

さらに、ヒト向Ｔ細胞性ウィルスＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１の大部分の免疫原性タンノξり質は細胞表面で発現される糖タンパク質である〔チェｙ　（Ｃｈｅｎ、　１．Ｓ、　）ら、３０５　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）５０２（１９８３）を参照されたい〕。

ＨＴＬＶ−ＩＩの外被（ｅｎｖ）　遺伝子産物はポリタンパク質前駆体として合成され、その後感染細胞内でグリコジル化される。

推定分子量が１６０にのこのグリコモル化糖タンパタ質（ｇｐ１６０）はｇｐ１２０とｇｐ４］のサブユニットにプロセッシングさり質であると思われる。このｇｐ４１サブユニットは精製したウィルス調製霧中に存在する主なポリペプチドの１種である。

ＡＩＤＳおよびＡＲＣ！ｌ！、者からの抗体はウィルス中和活性を有するが、感染は恐らく中和抗体がつくられる以前にこれらの患者において起こった。レトロウィルスに関する一般的見解は、中和抗体の誘導に関連する抗原決定基すなわちエピトープが糖タン・ξり質外被と関係しているということである〔ホールデン（Ｈｏｌｄｅｎ、　Ｈ６Ｔ、）およびｐニヤーｒ　（Ｔ、　’ｆ’ａｎｉｙａｍａ）、１５０Ｊ、　Ｅｘｐ８Ｍｅｄ、１３６７（１９７９）並びに７ライヤー（ｐｌｙｅｒ。

Ｄ、Ｃ，）ら、３０５　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）８１５（１９８３）を参照されたい〕。本発明まで（グ、この関係がＡＩＤＳ関連ウィルスの場合確立されていなかった。以下で述べるように、今やｇｐ４１゜ｇｐ１２０およびｇｐ１６０外被糖タンパク質はウィルスにさらされた個体において最も免疫原性のおるエピトープであることが立証された。本発明（ｄ、防御的なウィルス中和抗体の誘導に閣与する決定的エピトープが２種のウィルス外被糖タンパク質すブユニツ）ｇｐ１２０およびｇ、Ｂ４１に関係している、という仮定に基づいている。

発明の概要本発明の目的は、ＡＩＤＳおよびＡＲＣに対して患者を免疫化するワクチンを提供することである。この目的は、合成ペプチドに対する抗体のイディオタイプ特異性に属する防御的抗体応答を免疫化した動物において誘発する合、ＦｆＣペプチドを製造することによシ違収された。この目的を達成するために、まず初めに、このような応答を誘発し得る多数の合成ペプチドを同定することが必要であった。従って、本発明の目的はまた、ＨＴＬＶ−ｍの最も免疫原性のちるタンツク質（すなわちｇｐ１２０およびｇｐ４１）のアミノ酸配列を決定し、これらのタンパク質の高次構造および最も抗体結合部位でろシそうなアミノ酸配列部分を同定し、その後それと同じアミノ酸配列２よび高次構造をもつ合成ペプチド、おるいは免疫原性がちるように抗体結合部位を表すアミノ酸配列部分と十分に相同な配列および構造をもつ合５ｙ、−！！プチト９を合成することである。

本発明の他の目的は、ＡよりＳまたはＡＲＣの診断検定法を提供することである。

本発明の他の目的は、ＡＩＤＳまたはＡＲＣに感染した疑いのある思省においてＨＴＬｖ−ＩＩＩに対する抗体を検出する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、合成ペプチドを使用してＨＴＬＶ−１１のｇｐ１２０およびｇｐ４１外被糖タンパク質に対するイディオタイプ抗体を製造することである。

本発明の他の目的は、免疫原性合成ペプチドおよびキャリアーから収るＡＩＤＳおよび／またはＡＲＣに対するワクチン注射用の組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、ＡＩＤＳおよび／またはＡＲＣに対する他の推定上のワクチン候補をスクリーニングする方法を提供することである。

本発明の他の目的コｄ、ＡＩＤＳおよびＡ　ＲＣ患者からのウィルス単離物を血清型で分類する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、ヒトにおいてＨＴＬＶ−１１ウイルスを中和および／または破壊し得る抗体の産生を誘発することである。

これらの目的、および以下の詳細な説明から当業者には明らかな他の目的は、ＨＴＬｖ−１、ＬＡＹまたＨＡＲＶの外被糖タンパク質のｇｐ１６０前駆体のｇｐ１２０またはｇｐ４］サブユニットに相同な配列ｔｅａし且つその配列中に親水領域をもつアミノ酸鎖から成る、八よりＳまたはＡＲＣのウィルス原因物質に対して免疫原応答を生じさせるのに有用な合成ペプチドを提供することによシ達成された。

本発明はまた、ＨＴＬＶ−Ｂ１、ＡＲＶまたはＬＡＹの外被糖タンパク質のｇｐ］６０前駆体のｇｐ１２０またはｇｐ４１サブユニットに相同なアミノ酸配列から成り且つその中に親水領域をもつ合成ペプチドおよびキャリアーを含有する、ＡよりＳおよびＡＲＣのウィルス原因物質に対するワクチン注射において使用する組成物に関する。

本発明はまた、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＡＲＶまたはＬＡＶの外被糖タンパク質のｇｐ１６０前駆体のｇｐ１２０またはｇｐ４１サブユニットに相同なアミノ酸配列から成る合成はブチドの免疫原として有効な量を動物に投与することから収る、ＡＩＤＳのウィルス原因物質に対して動物を免疫化する方法に関する。

発明の詳細な説明先に述べたようＫ、本発明は、外被糖タンパク質のｇｐ１２０およびｇｐ４１サブユニットがＡＩＤＳおよびＡＲＣのウィルス原因物質の最も免疫原性かめるエピトープであるという仮定に基づいている。以下で説明するように、この仮定の正しいことが今や証明された。次に、ｇｐ１２０およびｇｐ４１サブユニットのアミノ酸配列を決定し、そして最も抗体結合部位で１そりなこれらの外被糖タンパク質サブユニットの部分を選択することが必要であった。この選択はｇｐ１２０およびｇｐ４１サブユニットの構造のコンピューターモデル製作法を用いて達成された。

ひとたび抗体結合部位が同定されると、これらの部位のそれぞれのアミノ酸配列を複製すべくアミノ酸鎖を合成した。その後これらのアミノ酸鎖（合成ペプチドと呼ぶ）を用いてウサギにおいて免疫応答を誘発させ、そしてウサギ抗イプチド抗体がＡＩＤＳおよびＡＲＣのウィルス原因物質と結合すること全証明するためにその抗体を試験した。次いでＡＩＤＳウィルスと結合するウサギ抗体を誘発するこれらの合成ペプチドは、ヒト抗ＨＴＬＶ−１１抗体と結合するそれらの能力について試験され、またウサギ抗ＨＴＬＶ−１１抗体はそれらが組織培養において感染ウィルスを中和し得るかどうか調べるために試験された。ひとたびこれらの基準を満たす最も免疫原性のある合成ペプチドが同定されると、それらはワクチンとして並びにＡＩＤＳ診断検定　の原因ウィルスにさらされた個体およびによりａ／ＡＲＣ患者を同定するための診断検定法において使用された。

ｇｐ１２０およびｇｐ４１サシユニットのアミノ酸配列は、ＨＴＬＶ−［１のヌクレオチド配列に基づく推測、並びに　［Ｉ（）ロイシン、〔Ｓ〕シス千ンおよび　〔Ｈ〕バリンで標識したタンパク質のエドマ／分解によるＮＨ２末端アミノ酸配列の分析によるこれらの配列の証明によって決定された。

ｇｐ１２０およびｇｐ４１（並びにそれらの前駆体ｇｐ１６０）外被糖タン−ぞり質の免疫原性の証明は、Ｈ９／ＨＴＬＶ−１細胞株を使用する間接細り膜免疫螢光法（ＭＩＦ）および３５　ｃ　ｓ　＝、シスチン標識Ｈ９／ＨＴＬＶ−［１細胞を用いる放射線免疫沈降法／ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｒ工Ｐ／５ＤＳ−ＰＡＧＥ）Ｋ　よりてＨＴＬＶ−ｍに対ｆ　る抗体’ｆｔ含ｔｊ　も（Ｄを同定すべ（ＡＩＤＳおよびＡＲＣ恵者からの血清試料をスクリーニングすることによシ得られた。また、代表的な抗体陽性血清は、ヒラマメレクチンカラムの使用により濃縮したＨ９／ＨＴＬＶ−１細胞の抛タンパク質調製物に対して試験された。これらの結果は、ｇｐ１２０およびｇｐｉ６ｏを認識する抗体を含む抗体陽性血清の比率が最も高く、且つ他のエピトープに対する抗体を−含む試料がすべてｇｐ１２０およびｇｐ１６０を認識する抗体をも含むことを示した。

ｇｐ１２０　、ｇｐ４１およびｇｐ１６０外被糖タンツク質の最も免疫原性のある部位の選択は、ホップ（Ｈｏｐｐ、　Ｔ、　Ｐ、　）およびウッズ（Ｋ、　Ｒ，Ｗｏｏｄｓ　）　（７８Ｐｒｏｃ＋Ｎａｔ＋１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ３８２４−３８２８（１９８１）を参照〕によシ開示された親水度指数（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ　１ｎａｅｘ）　に基づくコンピュータープログラムラ改変シ、ＨＴＬｖ−ｍ％ＬＡｖおよびＡＲｖから０ＨＴＩ、Ｖ−１１外被ｇｐ１６０糖タンパク質と関連した親水領域の位置を予測することによシ達成された。これらの糖タンパク質のアミノ酸配列ｄまたチエーーファスマンの予測図〔チェー（Ｃｈｏｕ、Ｐ、Ｙ、）および７７　：ｘ−ｒ　：／　（Ｅ、Ｄ、Ｆａｓｍａｎ）　、１３　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２２（１９７４）を参照〕を使用して２次構造について分析した。ピーク親水領域は予測された２次構造と比較し、そして糖タンパク質の表面に最も露出されそうなこれらの領域が同定された。

これらの領域はまた、ウィルス外被タンパク質を用いる以前の研究が、予測されたβターン（βｔｕｒｎ　）　２次構造をもつ表面に露出された親水領域はウィルスの免疫原表面領域を表すことを示したので、βターンの存在についても試験された〔ドリース？　７　（Ｄｒｅｅａｍａｎ、　Ｇ、Ｒ，）ら、２９５　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）　１５８−１６０（１９８２）（Ｂ型肝炎表面抗原）；ポツプおよびウッズの上記文献（Ｂ型肝炎表面抗原）；ヘンダーンン（Ｈｅｎｃｌｅｒｓｏｎ。

Ｌ、Ｅ、）ら、２５６　Ｊ、ＢｉｏＬ　Ｃｈｅｍ、８４００−８４０６（１９８１）（ローシャーマウス白血病ウィルス）；シンジャース（Ｇｉｎｇｅ−ｒａｓ、　Ｔ、Ｒ，）ら、２５７　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、１３４７５−１３４９１（１９８３）（アデノウィルススパイクタンパク質）：ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ、　Ｒ，ａＴ、）ら、２１Ｂ　５ｃｉｅｎｃｅ　３８１−３８４（１９８２）（単純性庖疹ウィルス外被糖タンパク質Ｄ）を参照されたい〕。

ＨＴＬＶ−１、ＬＡ■およびＡＲｖからのｇｐ１６０糖タンパク質の配列およびその配列中の免疫原性があシそうな領域が同定されたので、次の工程は糖タンパク質のその領域と同じアミノ酸配列（またはそのエピトープと結合する抗体によって同一方法で処理されるように十分類似した配列）をもつポリイブチドを合成することであった。この合成はバイオサーチＳａｍ　Ｉ１４ブチド合成機を用いて固相法によシ実施した。全部で６種の合Ｉ：、！ブチ）＃を合成し、予測された免疫原性について上記試験に基づいてそれぞれを選択した。これらの合成ペプチドのそれぞれのアミノ酸配列は表■に示す。

その後６種の合成イブチｒは、そのペプチドを適当なキャリアーに結合させて合成ペプチド／キャリアーをウサギに注射することによシウサギに免疫応答を誘発させるべく使用され、そしてウサギ血清の抗体力価がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合させたそのにブチドと結合する抗体の能力により試験された。

これらの結果は、はブチドーＢＳＡへのウサギ抗にブチドの結合阻害を測定する阻害試験を行うととてよシ確かめられた・ウサギ抗はズチド抗体はその後ＨＴＬＶ−１１１と関連した天然タンツク質を認識するそれらの能力について試験した。　［Ｓ）−シスチンで標識したＨＴＬＶ−１１１感染Ｔ細、空株を免疫沈降のために使用して、抗Ｒプチド皿清か放射性標１ｌＨＴＬＶ−１１天然タンパク質と結合するかどうかを調べた。５ＤＳ−ＰＡＧＥ　によるオートラジオグラフィーは、ウサギ抗はブチド抗体がＨＴＬＶ−１１１のｇｐ１６Ｑ前駆体外被糖タンパク質に相当する単一のタンパク質を特異的に沈殿させることを明らかにした。

前駆体ｇｐ１６０生産物は切断されてｇｐ１２０外被糖タンパク質とｇｐ４］）う／スメンプラン糖タンノセク質を生じる。他方の外被サブユニットｇｐ４１は前駆体ａｐ１６０１ｍタンパク質のアミノ末端と同程度に３５　（Ｓ　）−シスチンで標識されず、こうして免疫沈降法によって検出されなかった。しかしながら、（Ｓ）−メチオニンを標識として使用した場合は、免疫沈降法（その結果はウェスターントランスファー法を使用して確認した）によシその結合が検出された。

その後このようにしてつくられた抗イブチド抗体は、それらがＡＩＤＳまたはＡＲＣの原因ウィルスを中和し得るかどうか調べるために試験された。抗にブチド抗体の中和能は、精製ウィルスおよびウサギ抗はブチド抗体を感染ＭＯＬＴ−３細胞と共にインキエイ−シランし、次にウィルスの存在についてウェスターントランスファー法および免疫沈降法によって溶解細胞を検定することにより試験した。ひとたび最も免疫原性のある合成ペプチドが同定されると、それらはＡＩＤＳ診断検定のために、およびワクチンとして使用される。

診断検定のために使用する場合、好適な方法はＡＩＤＳおよび／または八ＲＣのウィルス原因物質に対する抗体の検出に基づいている。この検定（は、例えば、ポリスチレンビーズのカラムやマイクロウェルテストプレートのような不溶性支持体を、ＡＩＤＳまたはＡＲＣのウィルス原因物質の１種のエピトープと関連したアミノ酸配列を含む合［’ブチドまたはキャリアータンパク質（すなわちウシ血清アルブミン）に結合された合［−？ブチドで被覆することによシ実施される。別法として、不溶性支持体は数種のエピトープのアミノ酸配列を含む多数の異なる合５ｙ、イブチ）＃（″カクテル”）で被覆されてもよい。疑わしい患者から採取した生物学的液体の試料は合Ｆｙ、−！ブチド被覆支持体とインキユベーションして、所定の抗体を免疫捕獲する。次に、非捕獲試料から分離した支持体を、もし存在する々らば、測定可能な数のヒト抗体と結合するのに十分な量の、所定の抗体の種（５ｐｅｃｉｅθ）に特異的なビオチン標識抗体（例えば体液がヒト思考からのものである場合、抗ヒト抗体が予め選ばれた抗体であるだろう）とインキュベージ１ンする。その後非捕獲ビオチン標朦抗体から分離した支持体は、もし存在するならば、測定可能な数の抗体と結合するのに十分な量の、標識アビジン（好ましくはアルカリ性ホスファターゼのような酵素で標識されたアビジン）とインキユベーションする。得られた支持体を非捕獲アビジンから分離し、その酵素に特異的な基質を加えることにより標識を検出および／または好ましくは定量し、それによって試料中のＡＩＤＳウィルスに対する抗体の存在を間接的に測定する。抗体はまた直接酵素で標識することもでき、その場合は支持体を酵素反応性基質とインキユベーションし、基質における変化（例えば色彩の変化または螢光発光）を検出する。

標識が抗体、酵素また（はビオチン−アビジンで標識された酵素である炉どうかにかかわシなく、抗原と抗体または酵素と基質によって形成される結合対は特異的結合対の６リガント９”および１抗リガンドと呼ばれるだろう。

診断検定はまた所定の抗体よりもむしろ抗原を検出するために考案されるだろう。抗原試験を行うために、同相支持体は八ＩＩ）Ｓのウィルス原の物質に対する抗体、すなわち本発明はプチドのような合５Ｘ、ａブチド（好ましくは数種のペプチド）で免疫化することによって生産された抗体で被覆される。次いで、ＡＩＤＳウィルスに感染した疑いのある患者から採取した生物学的液体の試料をその支持体に加え、続いてビオチン標識抗体（この抗体は上記方法と同じ方法でつくられたＡＩＤＳウィルスと結合する抗体である）を加える。その後アビジン標識酊素を加え、続いてその酵素に特異的な基質を加え、そして色彩の変化または螢光発光を検出する。これらの検定はいずれも、結合抗原にＡＩＤＳウィルスに対するビオチン標識抗体を加える代わシに、ビオチン−合成にプチド複合体を加えることにより、阻害検定として実施することもできるだろう。

ＡＩＤＳのウィルス原因物質に対するワクチンとして本発明の合収イブチドを使用するために、本発明の教示に従って製造された約１００〜１０００μ分の合成はブチ）＃または数種の合成はプチドは適当なキャリアーに結合させ、そしてアジュバントと共に個体に投与される。適当々キャリアーにはトキソイド成分ワクチン注射されるべき動物にとって外来性の数種の大きいタンノξり質を含有する物質のいずれか、アジュバント活性を示し且つキャリアーとして作用する数種の小さいペプチド調製物のいずれか、またはリポソームが言まれるうトキソイ）＃成分は破傷風トキソイド９またはシフテリアトキンイドでろシ得る。１ワクチン注射されるべき動物にとって外来性の大きいタンパク質を含有する物質”なる表現は、キーホール・リンイツト・ヘモシア＝　ｙ　（Ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ　；　ＫＬＨ）またはＢＳＡのような物質を意味する。アジュバント活性を示し且つキャリアーとしても作用する小さいはブチド調製物にはムラミル：）Ｒプチド、ムラブチジ／、およびポリ−Ｌ−グルタミン酸またはポリーＬ−リシンのようなポリアミン酸類が含まれる。約１０〜１００分子の合成Ｒプチドが１分子のキャリアーにｍ−マレイミドヘンジル−Ｎ−ヒト０ロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）［リウ（Ｌｉｕ、Ｆ、Ｔ、　）ら、１８　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　６９０（１９８２）を参照〕、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、無水コハク酸、またはＮ−スクシンイミジル−３−〔２ −ピリジルジチオ〕−プロピオネートのようなヘテロ２官能性架橋剤を使用して結合される。

適当なアジュバントには明ばん（水数化アルミニウム）および当分針で知られるような多数の他のアジュバントのいずれかが含まれる。合Ｆｙ、−！プチドーキャリアー複合体は蒸留水、リン酸緩衝溶液、クエン酸緩衝液または中性−の緩衝液（すなわち約６〜８のｐＨｔもつ緩衝液）のような薬学的に受容される希釈剤と共に投与することもできる。

不発明の合成ベブチ）’　ｒｉまたＡＩＤＳおよび／またはＡＲＣに対する推定上のワクチン候補をスクリーニングするために使用される。このよう々スクリーニングは不溶性支持体を合成はブチドまたはキャリアータンパク質に結合させた合収ハブテドで被覆することによシ最良に実施し得る。その後ワクチン候補は工ｇＧ−ウサギ抗イブチドービオチン抗体の１：１０００希釈物のようなはブチドに対する抗体（ビオチン標識を使用してもしなくてもよい）と共にインキエイ− シランする。ビオチン標識抗体を使用する場合、アビジン−酵素複合体を添加し〔ビオチンを使用しない場合はビオチン標識抗種（例えばビオチン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ）抗体を添加し、次いでアビジン−酵素を加える〕、その後基質を加えてその反応を検出する。

本発明の合成ペプチドはまたＡＩＤＳまたはへＲＣ患者からのウィルス単離物を血清型で分類するために使用される。血清型分類はワクチン候補をスクリーニングするための上記方法と同じ方法で実施されろうなぜならば両方の場合において、抗ペプチド抗体は完全なＡＩＤＳウィルス原因物質と結合しなければならないからである。しかしながら、ウィルス羊離物を血清型で分類する場合には、単離物の一部が順次多数の結合抗イブチＶ抗体（各抗体は異なる合成ペプチドに対して特異的でらシ且つ別々の不溶性支持体に結合されている）に添加される。

本発明は以下の非限定的実施例を参照することによシさらによく理解されるであろう。

実施例１．ＨＴＬＶ−Ｂｌ感染細胞の維持および放射性標識２　種ｏＨＴＬＶ− ｎｌ　産生ｍ胞ａＨ−９おｊびＭＯＬＴ−３は２０チウシ胎児血清、２ｍＭダルタミ／、非必須アミノ酸および０．１％ＮａＨＣＯａ　’ｔ”補給したＲＰＭニー１６４０　（維持培地）中で生育させた。細胞培養物は、細胞を維持培地からシスチ／およびグルコニス欠損培地に移し、１時間後　［８）−シスチン（１５゜μＣ１／ｄ）および［Ｈ）−グルコサミン（２０μＣ１／ｄ、２４時間）を加えることにより標識した。細胞は低速遠心（１０００ｘｇ。

１０分間）により組織培養上清から分離・した。

ＡＩＤＳおよびＡＲＣの高危険地域にあるコミユニティ−・ヘルス・クリニックを訪れた患者、および１９８３年から１９８４年にかけてその地域にろる病院を訪れた患者から採取した血清試料は、エセック／Ｃ（Ｅｓｓｅｘ）ら、２２０５ｃｉｅｎｃｅ　８５９（１９８３）Ｋ記載さレルヨうに、Ｈ９／ＨＴＬＶ−１１細胞株’に使用する間接細胞膜免疫螢光法（ＭＩＦ）によシ、ＨＴＬＶ−１に対する抗体についてスクリーニングした。藺単に述べると、この方法は実施例１に記載の培地から細胞を分離し、１×１０〜２Ｘ１０　１ｒＭの細胞をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で２回洗い、そして前もって遠心した血清の１＝４希釈物４０μ 皿にそれらの細胞を３７℃で３０分間さらすことから成る。その後、各調製物＝ｉＨＰＢＳで２回洗い、そしてヒト免疫グロブリン（工ｇ　Ａ＋Ｉ　ｇＧ＋ＩｇＭ）に対するヤギ抗皿清のフルオレセイン結合Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ｐａ、コクランビレ、カベル社）の１：２０希釈物４０μにと反応させた。試料を再び３７℃で３０分間インキエイ−ジョンし、ＰＢＳで２回洗い、そして螢光マイクロスコピーで調べた。少なくとも５０チ（またはＡＩＤＳの徴候を示した場合は４０％）の細胞が特異的な螢光を示すならば、その血清試料は陽性であると判定された。試料は二重盲検法で検定し、陽性および陰性のヒト血清試料を標準として使用した。これらのスクリーニングの結果を表１に示す。

また、同じ１９０人のヒトから採取した試料はすべて、３５（Ｓ　）シスチン標識Ｈ９／ＨＴＬＶ−１１１および非感染Ｈ９細胞を用いる放射線免疫沈降法およびドデシル硫酸ナトリウム−ポリマクリルアミドゲル電気泳動（Ｒ工Ｐ／５ＤＳ −ＰＡＧＥ）によシ試験した（エセックスらの上記文献参照）。簡単に述べると、この方法は次の通シである。標識細胞を１（ＩＰＡ緩衝液（０，Ｉ５ＭＮａ（Ｊ、０．０５Ｍ）リス−Ｈ（Ｊｐ）１７．２、１チトリトｙｘ−１ｏｏ。

１％デオキシコール酸ナトリウムおよび０．１％５ＤＳ）で破壊した後、細胞を１００，０ＯＯＸ９　で１時間遠心した。溶菌液上清を、プロティンＡ−セファロースＣＬ−４ＪプロティンＡビーズ）に結合させた標準陰性対照血清１０μｌで１回清澄化し、次いで一部をヒト被験血清１０μ塁と反応させた。免疫沈殿物は１００℃で２分間沸騰させることによシ試料緩衝液（０，１Ｍクリ−ランド試薬、２％ＳＤ８，０．０８Ｍ）リス−ＨＣρｐｉ（６，８，１０％グリセロールおよび０．２％ブロモフェノールブルー）中に溶出した。試料はレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、２２７　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）　６８０（］　９７０）に記載の不連続緩衝系に従って３．５−重層用（ｓｔａｃｋｉｎｇ）ゲルｔａする１２．５％アクリルアミド分離用ゲルで分析した。表面標識化はラクトペルオキシダーゼによシ触媒される放射性ヨウ素化によシ実施した。これらの結果を表１に示す。

代表的な抗体陽性血清はまたヒラマメレクチンカラムの使用によシ濃縮したＨ９／ＨＴＬＶ−■細胞の糖タンパク質調製物で試験した。ＨＴＬＶ−１ｌｌ糖タンパク質をヒラマメレクチン−セファロース４Ｂと共に４時間インキエベーシ１ンし、その後０．２Ｍメチルマンノシドで溶出した。得られたタンパク質はＨＴＬＶ−■基準血清を用いて免疫沈殿させ、プロティンＡ−セファロースに結合されたその沈殿物を０．１％ＳＤＳおよび０．１５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨｓ、ｓ）の存在下に２分間沸騰させることによシ抗体から解離させた。その後等しい部分をエンドグリコシダーゼＨ０，２５μ分の存在下または不存在下に３７℃で３時間インキュイーシ１ンした。この反応を５倍容量の冷９５チエタノールの添加によシ停止させ、タンパク質を一２０℃で一晩沈殿させた。その後試料’ｔ１２０００Ｘ９で１５分間遠心し、タンツク質を電気泳動試料緩衝液で搏論製し、３分間沸騰させ、そして電気泳動Ｋかけた。４人の抗体陽性ＡよりＳＲ＠からの試料は約１２０ＫＤ、１６０ＫＤおよび４１ＫＤのタンパク質を沈殿させた。類似の結果が２人の抗体陽性ＡＲＣ思者の場合と、２人の置板な抗体陽性男性同性愛者の場合に得られた。関連した大きさのタンパク質は、抗体陰性のｗ！原な男性同性愛者からの血清または明らかに健康な研究所員からの血清には全く検出されなかった。試験したヒト血清試料はどれも、少なくともｇｐ１２０およびｇｐ１６０に対する容易に検出可能々抗体を含むことなしに、ＨＴＬＶ’−１ｌｌウイルスの他のエピトープに対する抗体を含むことはなかった。

１、エセックスら、２２０５ｃｉｅｎｃｅ　８５９（１９８３）　に記載のＭＩＦＫ！！＋実施されたＨＴＬＶ−１膜抗［（ＨＴＬＶ−１１−ＭＡ）についての検定。

２、エセックスら、２２０Ｓｃ１ｅｎｃｅ　８５９（１９８３）に記載のＲ工Ｐ／５ＤＳ−ＰＡＧＥ　ＫＸ、？）実施されたＴｉＴＬＶ−ｍ　（Ｄｇｐ１２０外被糖タ／バク質についての検定。

３種のウィルス単離物ＨＴＬＶ−［１、ＬＡＹおよびＡＲＴからのｇｐ１６０前駆体糖タンパク質の予測され几アミノ酸配列１ｄ、ホップ（Ｈｏｐｐ、Ｔ、Ｐ、　）およびウッズ（Ｋ、Ｒ，ＷＯＯ（１１１）　（２０Ｍｏ１゜Ｉｍｍｕｎｏｌ、４８３−４８９（１９８３）を参照〕によって到達されたノぐラメ−ターおよび親水値を利用するコンビエータ−プログラムによシ解読された。そのコンピュータープログラムはアップルば一シック（Ａｐｐｌｅ　ＢＡＳ工Ｃ）に書かれていた。そのプログラムはチエーーファスマンの予測図〔チェー（Ｃｈｏｕ、Ｐ、Ｙ、）および７７ス？ノ（Ｅ、Ｄ、Ｆａｓｍａｎ）、］　３　Ｂｉｏｃｈｅｚｉｓｔｒｙ　２２２（１９７４）ｉ参照〕と適合しうるフォーマットでディスクにアミノ酸配列を記録する能力をもたせて書かれていた。親水度プログラムはへキサペプチドの鎖長にわたる親水平均値を計算し、それにより予測の正確度を高める。Ａ８！またはＧｌｘ　（酸性アミノ酸残基のアミド体）については親水値が存在しないので、これらのコードは計算の前に削除しなければならない。３種のＡＩＤＳウィルス糖タンパク質についてのアミノ酸配列数に対する残基当たシの親水平均値のプロットを第１図に示す。第１図は同定されたＡＩＤＳ／ＡＲＣの３種のウィルス原因物質からの親水値プロットのコンピューターグラフィック出力の芸術的表現でるる。最大ピーク（最大親水性）は３種すべての配夕ＩＪにおいて類似した領域に見られ、最大親水指数はＨＴＬＶ−［４、ＬＡＶおよびＡＲ／Ｖにおいてそれぞれ残基７３９．７４４および７３８に現れる。２番目に高い親水領域はピーク１のちょうどアミン末端側のアミノ酸残基６５３−６５９　に集中していた。３番目に高い親水領承はピーク１に接近していることがわかシ、３種の糖タン／ｅり質のそれぞれにおいてアミノ酸残基７３３−７３９に集中していた。ＨＴＬＶ−１１配列のセグメントの実際のコンビエータ−グラフ出力を第２図に示す。全ＨＴＬＶ−１配列は長いために、セグメントのみを示す。グラフにおいてプロリン残基はＰ″として表さｎ、配列内に並んで存在する２個以上の芳香族アミノ酸は６０”として表される。所定の配列内に芳香族アミノ酸が存在することｉ・１、高度の潜在的水素結合能力を保有する領域がらることを示している。水素結合はタンパク質の全体的なコンホメーシヨンに影響を与えるように作用しうる。これらのデータは、これらの領域が糖タンパク質の表面に露出されるらしいことを示している。

チュー−ファスマンの予測図によって予測されたＨＴＬＶ−［１糖タンパク質の２次構造は第３図に示す。ＨＴＬ’Ｖ−ｎｕ、ＬＡＹおよびＡＲＭ間の予測された２次構造の主な相違はボックスで囲った領域に現れる。これらの領域にはＨＴＬｖ−１１、ＬＡＹおよびＡＲＭ−Ｉｔにおいてそれｔ’Ｍ！ｆ１２７−１５０，１２７−１５５および１２６−１４８　が含まれ、その場合残基相同性は約４０％にすぎず、存在しうるβターンに変化を生じさせる。さらに有意な相違１ｄＡＲＶＯ３１９−３３０お！び３９８−４０８、ＬＡＶ＋７）３２３−３３３および４０１−４１５、並ヒＫ　ＨＴＬＶ−ｎｕ　Ｏ３１８−３２８オよび３９６ −４１１の各領域に見られた。親水度と２次構造との比較は、ピーク１がその領域内に４つの起こシうるβターｙ′１に含み、アミノ酸７３９−７４４　に集中したその領域を抗原決定基としての第１候補にすることを示す。親水性のピーク２もま几予測されたβターンをもち、この領域が外被糖タンツク質の表面に露出されることを子役している。

実施例４．Ｒブチド合成ＡＩＤＳおよび八ＲＣのウィルス原因物質のｇｐ１２０糖タ／バク質のアミノ酸残基番号３４６〜３５７の配列に相当する、表■のイブチＦ″５の見出しの下に示されるアミノ酸配列をもつ合成はブチドは、バイオサーチＳａｍ　ｌ　ｄブチド合成機を使って固相法〔メリーフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅ１４．　Ｒ，Ｂ、　）ｔ　３２　Ａｄｖ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、２２１（１９６９）ｉ−参照〕によシ合成された。

ジシクロへキシルカルボジイミドと触媒量の４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジンを使用してポリスチレンに結合させたブチルオキシカルボニル−８−４−メチルベンジル−Ｌ−シスチンをこの合成のための面相支持体として使用した。４個のアミノ基はｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）で保護し、側鎖保護基は次の通シであっｆｃ：セリンのヒドロキシル基についてはベンジルエーテル、チロシ／のフェノール性ヒドロキシル基についてはジクロロベンジルエーテル、およびグルタミノ酸とアスパラギン酸のカルボキシル基についてはγおよびβに／ジルエステルがそれぞれ使用された。ｔ−ＢＯＣを除くためにトリフルオロ酢酸（ＣＨ２ＣＩ１２　中４（１）が使用され、そして得られた塩はＮ、Ｎ −ジイソプロピルエチルアミン（ＣＨ２ＣＱ２中１０％）で中和した。ジインプロピルカルボジイミド全使用してｔ−ＢＯＣアミノａｔ結合させた。この合成の特定工程はスパロ−（Ｓｐａｒｒｏｍ、Ｊ、Ｔ、）、４１　Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、１３５０（１９７６）に発表されておシ、その記載内容は参照によりその全体がここに引用される。

保復基の除去後、ペプチドはスカベンジャーとして１０％アニソールおよび１％エタンジチオールを含む無水フッ化水素により０℃で樹脂から切断した。フン化水素試薬を真空下Ｏ℃で除き、次いでＲズチドを無水エーテルで沈殿させ、洗浄した。

トリフルオロ酢Ｓｔ用いて樹脂からペプチドを抽出した後、溶媒ｔ−１５℃で蒸発させ、ペプチドを再びエーテルで沈殿させた。

遠心後エーテルをデカ／トシ、その沈殿物ｆ６Ｍグアニジ／ＨＣＩを含む５チ酢酸中に溶解した。

この溶液を５％匪酸で平衡化したバイオゲルＰ２カラムで脱塩し、はプチド含有分画をプールして凍結乾燥した。その後ペプチドのカルボキシル末端にシスティン残基金付加して、ペプチドをキャリアータンパク質に結合させるための官能性 −８Ｈ基をつけた。また、結合システィ／残基およびｇｐ１６０に類似したアミノ酸配列の間にスペーサーアミノ酸を与えるために、シスチンの後にグリシン残基を付加した。チロシン残基は１２５工での放射性標線のためにアミン末端に付加され、それによシイプチド対キャリアータンパク質の結合効率を測定しまた精製中に２７８ｎｍでの吸光度によりハプチドヲ同定した。

酢酸によるバイオゲルＰ２カラムでの脱塩および凍結乾燥後に、このペプチドは予期され几アミノ酸分析をもつことが見出され（表■参照）、且つ０．０５％トリフルオロ酢酸および２−プロパツールの線状勾配によるＣ１８−逆相ＨＰＬＣで単一ピーク（９２％）として溶離された。

実施例５−９．追加ペプチドの合成実施例４に記載の方法を使用して、表■に示したペプチド２−５ｔ−合成し、谷ペプチドは表示した残基のアミノ酸配列と一致してい几。

表■ はプチド　１２　３　４　５　６ｒｇ二なｓｐ２二でａ　ＬＡＹではａｌａｂ　ＡＲＶ−２ではｇｌｕＣ八ＲＶ−２ではｖａｌ；Ｌへ■ではａｌａ６　ＡＲＶ　−２テＪｄ　１ｙｅｅＡＲＶ−２ではｔｙｒｔ　ＡＲＶ−２では欠除ｇ　ＡＲＴ−２ではｉｃｅとｇ１７の間にｖａｌを挿入ｈ　ＡＲＴ−２ではｎｅｔ１　ＡＲＶ−２でｈａｓｐｊ　ＨＴＬＶ−ｆＪＪではａｓｐで１得るｋ　ＡＲ’Ｖ−２では１ｅｕＩＡＲＶ　−２テＨｈｉｓ実施例】０１合成ペプチドのキャリアーへの結合合成にプチド５（表Ｉｌ＃照）はシスティン残基の一８Ｈ基を介してキーホール・リン啄ット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）のアミノ基に（ウサギの免疫感作の沈め）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に（抗纜プチド活性の・凍定のため）、ヘテロ２官能性架橋剤（Ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミダエステル；ＭＢＳ）ｔ−使用して結合はせた。この方法の詳細はリウ（Ｌｉｕ、Ｆ、Ｔ、）ら、１８　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ７６９０（１９７９）およびグリ−ｙ　（Ｇｒｅｅｎ、Ｎ、　）ら、２８　Ｃｅ１１４７７（１９８２）に示され、両方の記載内容は参照によりそれらの全体がここに引用される。簡単に述べると、１０ｍＭリン酸ナトリウムＣＰ）］７．２）中のＫＬＨまたはＢ５Ａ１ηを、それぞれジメチルホルムアミド中のＭＢＳ　４■および８００μ９と２５℃で３０分間インキＳイージョンした。未反応ＭＢＳおよび溶剤は５ＱｍＭＩＪン酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ６，０）で平衡化し友セファデックスＰＤ−１０カラムによシ除いた。ＫＬＨまたはＢＳＡに対して１００モル過剰のにプチド５を約５００．ＯＯＯｃｐｍの１２５〔工〕標識にプチド５と共に反応混合物に加えて、２５℃でさらに３時間イ７キエベーシｌンした。タンノモク質キャリアーに結合しなかつたペプチドは反復透析によシ除去した。結合効率はＫＬＨｔたはＢＳＡと結合した　（１）ペプチドの量によって測定しＫＬＨおよびＢＳＡの場合それぞれ約６２チおよび５６％であったＯ実施例１１．　ウサギにおける免疫原応答の誘発２匹のウサギはそれぞれ、フロインド不完全アジェパント中に乳化した上記のペプチド５−ＫＬＨ複合体を１回当几シ１００μ９投与することにより免疫感作し九。ウサギは２週間ごとに１回（合計で３回）の筋肉内注射を受け、それぞれの免役感作の後に皿清を採取し次。

固相ラジオイムノアッセイを使用してウサギ抗イプチド抗血清を滴定した。簡単に述べると、実施例１０のようにして襄造しｆｃＢＳＡに結合し几ペプチド５　２００ｎ９をポリビニル製マイクロタイターウェルの各ウェルに吸着させ、４℃ で一晩インキーベーシ１ンした。非特異的部位をブロックするために１０％正常ヤギ血清（ＮＧｔＳ）ｅ添加した後、１０４ＮＧｔＳＴ希釈したウサギ抗イプチド抗血清を加えて３７℃で２時間インキエイーシ璽ンした。抗血清はそれぞれの免疫感作の１４日後に採取した。マイクロタイターウェルをツイーン２０１Ｊ　７に緩衝溶液（Ｔ−ＰＢＳ）で洗い、（１）ヤギ抗つサギγグロブリフ（５０１１ｇ中約５００．ＯＯＯｃｐｍ）を加え友。３７℃で１時間インキエベーシ田ン後、ウェルは過剰の放射能をＴ−ＰＢＳで洗って除き、ガンマカウンターで計測した。すべての容量は５０μｌで１）、表■に示す抗ペプチド力価は終点力価希釈（免疫前ウサギ血清よシ高いｃｐｍｔ示した抗血清の最大力価）の逆数として表される。終点力価は５倍希釈に基づいており、３通シの値の平均を表す。

表■に示す結果は、２匹のウサギがはブチに−ＫＬＨの一回注射の後に検出可能な抗イプテド応答（−？−ブチｒ−ＢＳＡによシ測定）を生じたことを示している。

免疫前に各ウサギから採取し几血清はペプチドと有意に結合しなかった（１０以下の力価）。抗ベブチドカ価はペプチドを注射するたびに増加し、３回目の注射の後では３１２５０〜１５６２５０の範囲であり几。

抗体応答の特異性（グＢＳＡと結合した対照にブチドと結合しない抗ペプチド皿渭の能力によシ明らかにされ友。さらに、ＨＴＬｖ−■ペプチド　７２８−７４５（はゾチド５）はＲプチド−ＢＳＡへのウサギ抗ペプチドの結合全完全に（１００チ）阻害した。２匹のウサギはま７ｊＫＬＨに対して高い抗体力価を生じ友が、ウサギ抗ＫＬ）（はペプチド−ＢＳＡと結合しシかうた。

ＨＴＬＶ−［１と関係する天然タンパク質を認識するペプチド５に対するウサギ抗体の能力は次のようにして調べた。ＭＯＬＴ−３（ｌ（ＴＬ■−■感染Ｔ細胞株）を　［３）−シスチンで標識し、実施例２に記載したような免疫沈降法でそれを使用して、抗イプチド血清が放射性標識ＨＴＬＶ−１１１天然タン、ａり質と結合するかどうかを検定し７ｔウウサギ抗ペプチド抗体は５ＤＳ−ＰＡＧＥのオートラジオグラフィーで明らかなように約１６０，０００ダルトンの単一タンパク質を特異的に沈殿させた。このタンツク質はＨＴＬＶ−１の前駆体外被糖タンパク質ｇｐ１６０でるる。免疫前ウサギ血清を免役沈降法において使用した場合には、ＨＴＬＶ−■タンパク質に対する反応性が全く証明されなかった。ウサギ抗イブチドは、ＡＩＤＳ患者からのヒト抗血清を免疫沈降法で使用するとき　（Ｓ）−シスチン標識ＭＯＬＴ−３細胞から検出されるｇｐ１２０外被サプユニツｌｔ−認識できなかつ几。ｇｐ４１外被サブユニットはｇｐ１２０と同程度に　（Ｓ）−シスチンで放射性標識されず、免疫沈降法で検出することは困難である。

比較的高レイルの比放射能のｇｐ４１Ｔｈ製造する困難性は次の上うにして回避されたうＨＴＬＶ−１１感染ＭＯＬＴ−３細胞を、３５　（Ｓ　）−メチオニンおよび３５ｃ　Ｓ　）−シスチンの両方を添加して２重標識し次。次いで、これらの２重シスチン−メチオニン標識溶菌液中に存在する糖タンパク質集団を、上記の実施例２に記載するようなヒラマメレクチンカラムによるアフィニテイクロマトグラフィーを用いて濃縮した。ｇｐ１６０およびｇｐ４１糖タン／ｅり質は、ウサギ抗Ｒプチド血清をこれらの糖タンパク質濃縮分画と反応させて、実施例２に記載される放射線免疫沈降試験で分析した際に、両方とも検出された。

ＨＴＬＶタンパク質についてのウェスターントランスファー法は、ウサギ抗はプチドがｇｐ４１を確かに認識できることを示した。この方法はＨＴＬＶ−１タンパク質源として感染ＭＯＬＴ−３細胞溶解液の原液を使用する。この検定では、５×１０　個の感染細胞全１％ツビッタージェント３−１４　（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ　３−１４　；カルバイオケムーベーリング社）溶液１ｔｔｔｌ中で５分間可溶化し、１１０００Ｘで１０分間遠心する。得られた上清を等容量の歌壊緩衝液（１０ｍＭ）リス−Ｈ（４声６．８、グリセロールおよび０．０１％ブロモフェノールブルー）と混合し、３分間沸騰させる。破壊した細胞溶解液８μΩ は４〜２５チ線状勾配のアクリルアミドゲル（１，５ｘｌ　７ｘｌ　４ｃｍ）で隣接レーンにて５０ｖ／ゲルの一定電圧下に２０時間電気泳動する。電気泳動によシ分離された勾配ゲルはその後トービｙ　（Ｔｏｗｂｉｎ）ら、　７６　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　４３５０（１９７９）に記載される緩衝系を用いて、ニトロセルロースシートへ１アンペアの一定電ＲＫ　てｔ１０℃で９０分間移行させる。予め染色した分子量マーカー（ＢＲＬ）もまた、移行させ７＝ｊＨＴＬＶ−１１１ペプチドの分子量を概算するための標準として使用するために、電気泳動後ニトロセルロースに移行させる。移行が完了した後、そのニトロセルロースシートは０．００１　ｗ／ｖ　％　メチオレートおよび０．０００１　ｖ／ｖチアンチフォームＡ（シグマ社）を含有するＰＢＳ中で再水和した５　ｗ／ｖ　％脱脂乾燥牛乳１００ｍ／と共に室温で３００分間インキュページンする。その後、ペプチド５で免疫化したウサギから採取された血清の段階的希釈液を、そのニトロセルロースシートと共に３７℃で１時間インキュベージロンする。次いでニトロセルロースシー）ｉＰＢｓ−Ｔ２Ｏ１００ｍＪで洗っ几。ビオチニル化ヤギ抗ヒ）ＩｇＧ（５μ９　／ｍｅ　）は、ウサギ抗ペプチド抗体の結合を検出するためＫ、そのニトロセルロースジートド３７℃で１時間インキュベージロンした。ニトロセルロースシートを再びＰＢＳ−Ｔ２Ｏで洗い、次いでアビジン標識西洋ワサビはルオキシダーゼ（ＡＶ−ＨＲＰＯ）　１μｇ／−を室温で２０分間添加し几。ＰＢＳ−Ｔ２Ｏで洗浄後、ペルオキシダーゼ色素原：基質溶液（ＰＢＳ中の０−ジアニシジン０．２■／ｄ＋３０％Ｈ２ｏ２１μｆｆｉ／ｄ）］００ｄ金ニトロセルロース膜に、その膜上に沈殿物が観察されるまで（１０〜１５分）加えた。イルオキシダーゼ触媒反応はニトロセルロースシートを２％ＳＤＳ水溶液中で洗うことによシ停止させた。ウェスターントランスファー検定では対電として正常ヒト血清が使用され、ま几血清と感染細胞溶解液および非感染細胞溶解液との反応性が並行して比較される。ｇｐ１２０サブユニットとの結合はもちろんのこと、ｇｐ４１タンパク質との結合も観察された。

実施例１３．ＡＩＤＳおよびＡＲＣのウィルス原因物質に対するヒトおよびウサギ抗体による合成ペプチドの認識屏素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）はＡＩＤＳおよびＡＲＣのウィルス原因物質に対するヒト抗体の検出の几めに使用される。

実施例４のようにして製造し且つ実施例１０のようにしてＢＳＡに結合させ九ハプチド５の５μ９試料は、ホウ駿緩衝溶液（ＢＢＳ）ｐ！４８．０中にて３７℃ で１時間ダイナチク・イムノロン・マイクロタイターウェルの固相に吸着させ友。非特異的部位はツイーン２０リン酸緩衝溶液（Ｔ−ＰＢＳ）中１０％正常ヤギ血清（ＮＧｔＳ）でブロックし、その後Ｔ−Ｐｊ３８で洗った。

１０％ＮＧｔＳで希釈し九ヒトおよびウサギ血清はその後ベグチド５被覆グレートに加え、３７℃で１時間インキ具ベージ１ンし、次いでＴ−ＰＢＳで洗った。

その後、ビオチンヤギ抗ヒトエｇＧまたはビオチンヤつ抗ウサギＩｇＧ　（ＣＡ、バージ／ガム。

ベクターラボラトリーズ）をそれぞれ結合ヒトおよびウサギ血清と共に３７℃で１時間インキエベーシＷ　７　した。ウェルを洗った後、西洋ワサビはルオキシダーゼに結合したアビジン（Ａｖ−ＨＲＰ）ｆ室温で２０分間加えた。次にウェルをＴ−ＰＢＳで洗って未結合Ａｖ−ＨＲＰ　ｆ除き、そして１．２′−アジノージ（３−エチル−（ンゾチアジンンースルホン酸）の］ｍＭ溶液および基質としての０．０３％Ｈ２ｏ２′ｆｒ：使用してはルオキシダーゼ活性全測定した。

この反応１Ｃダイナチク・プレート・リーダーを使って４１Ｑｎｍで分光光度計によシ定量する前に、５　ｗ／ｖ　％　）’デシル硫酸ナトリウム水溶液で停止させた。各試薬の最適希釈は滴定によシ選ばれた。特異的結合を測定するための全ての試薬（基質を除く）は１０％ＮＧｔＳ　で希釈した。これらの結果は第４図に示すが、ここにおいてそれぞれの血清は次のように表される：ウサギ抗はゾチド血清（ロ）；免疫前ウサギ血清（○）；ヒトＡＩＤＳ血清（・）；対照血清＃】（）：および対照ヒト血清＃＃２（Δ）。試験はすべて３通υずつ実施し、そしてブラケットは測定値の範囲を表す。

不溶性支持体はホウ酸緩衝溶液（ＢＢＳ）ｐＨ８，０中の実施例１０で製造したペプチド−ＢＳＡ複合体５μｇを用いて４℃で８時間被覆される。（別法として、その支持体は３７℃で１時間被覆される。）はプチドーＢＳＡを１０％正常ヤギ血清（ＮＧｔＳ）で２０分間ブロックし、そしてツイーン２０リン酸緩衝溶液（Ｔ−ＰＢＳ）で３回洗う。ＡＩＤＳウィルスに対する抗体を含む疑いがある血清試料を加えて、３７℃で１時間インキーイーシ璽ンする。支持体６Ｔ−ＰＢＳで３回洗い、ビオチン標識ヤギ抗ヒトエｇ　（１０％ＮＧｔＳ中５■／　ｒｔｔｌの１　：　１０００．　カリフォルニア州バーリンガム、ベクターラボラトリーズ）を加える。その支持体ｔＴ−ＰＢＳで３回洗い、５■／１！Ｌｌアビジン −西洋ワサビペルオキシダーゼの１　：　２０００　希釈物を加え、そして室温で２０分間インキュベーションする。支持体＝２Ｔ−ＰＢＳで３回洗い、基質として２．２′−アジノージ（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸）のアンモニウム塩およびＨ２０□を加える。屏素反応ば１０％ＳＤＳで停止させ、実施例１３のようにして４１０ｎｍでの光学密度を読み取る。

ＡＩＤＳ　抗原の存在を検出するために、固相支持体は合成ペプチド１−６での免疫感作によシ作られた抗体を被覆し、その抗体を上記のようにブロックして洗浄する。その後、ＡＩＤＳまたはＡＲＣウィルス原因物質を含む疑いがちる生物学的液体の試料を加え、そして洗浄する。検定は直接結合検定または阻害検定として行われる。直接結合検定を行う場合には、上記のようにして得られたＡＩＤＳおよび／またはＡＲＣウィルスに対するビオチン標識抗体を加え、洗浄する。

次にアビジン標識酵素を上記のように加えて洗浄し、基質を上記のように加える。

反応を停止させて光学密度を読み取る。

阻害検定を行う場合には、ＡＩＤＳウィルスに対するビオチン標識抗体を加える代わりに、ビオチン標識合成ペプチドヲ加え、そして不溶性支持体を洗浄する。

その後アビジン標Ｒ屏素を加えて、洗浄する。基質を加え、反応を停止させ、そして光学密度を読み取る。ヒトまたはチンパンジーＡＩＤＳ含有血清からのＩ　ｇＧｉ、ワットマンＤＥ−５２アニオン交換カラムでのイオン交換クロマトグラフィーによシ精製する。ウサギ抗ペプチドからのＩｇＧはプロティンＡ−セファロース４Ｂカラム（ファーマシア社）を用いて精製する。工ｇＧはビオチン−Ｎ −ヒドロキシスクシンアミドエステル（ベーリンガー・マンハイム社）を用いてビオチニル化する。

ＡＩＤＳおよびＡＲＣのウィルス原因物質に対してワクチン注射をするために、合ａ　６プチド１−６を上記の実施例１ｏのようにしてキャリアーに結合させる。合成ペプチドーキャリアー複合体は、アジュバントとしての明ばん中合成にプチド１００〜１０００μ９の投与量で注射される。注射はウィルスに対する測定可能な抗体応答が検出されるまで２週間ごとに３回筋肉内または皮下に行われる。０，１および６ケ月のような他の時間間隔も合ＦｆＣＲプチドの注射のために使用し得る。

実施例１７．推定上のＡＩＤＳワクチンのスクリーニング本発明の合成にプチドはまた、動物において免疫原応答を誘発する潜在的ＡＩＤＳワクチン候補の能力についてそれらをスクリーニングするために使用される。合成にプチド（またはキャリアーに結合した合成ペプチド）は実施例７のようにして不溶性支持体に被覆する。その後ワクチン候補をそのペプチドに対する抗体（ビオチン標識をもつ又はもたない抗体）と共にインキュベーションする。ビオチンで標識されている場合はアビジン酵素を加え、そうでない場合はビオチンヤギ抗ウサギＩｇＧのようなビオチン抗種抗体を加え、次いでアビジン酵素を加える。

基質を加え、反応を停止させ、光学密度を読み取ってはプチドの結合を妨害するワクチン候補の能力について測定する。

前記実施例は例示として提供され、何ら限定として解されるべきでない。これらの方法における変更は尚業者の知るところで１、このような変更はすべて本発明の精神および範囲からＡＡ！＃　ＡＡコーＹ゛　親ホ４声　４１本平敢Ｈ巨ビ一り瞳ｔ　ＡＡイｉ：ｆｆｊｉ　Σト（−ＩスｉＪ）ヤｒへ・・坑血晴［造４釈国際調査報告ｌｍ齢−−＾−−−階、ＰＣＴ／υ５８６１０２２３４

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＡＲＶまたはＬＡＶのｇｐ１２０またはｇｐ４１外被糖タンパク質のアミノ酸配列の一部に相同な配列を有するアミノ酸鎖から成る、ＡＩＤＳおよびＡＲＣのウイルス原因物質に対して免疫原応答を生じる合成ペプチド。
２．上記アミノ酸鎖の部分は親水性である、請求の範囲第１項記載の合成ペプチド。
３．上記アミノ酸鎖はβターンを含む、請求の範囲第２項記載の合成ペプチド。
４．上記ペプチドの分子量は１６００より大きい、請求の範囲第２項記載の合成ペプチド。
５．上記アミノ酸鎖のカルボキシル末端にシステイン残基が配置されている、請求の範囲第１項記載の合成ペプチド。
６．上記アミノ酸鎖のカルボキシル末端にグリシン残基が配置されている、請求の範囲第５項記載の合成ペプチド。
７．上記アミノ酸鎖のアミノ末端にチロシン残基が配置されている、請求の範囲第１項記載の合成ペプチド。
８．次の特性：（ａ）約１６００より大きい分子量；（ｂ）動物に投与したとき、ＡＩＤＳまたはＡＲＣのウイルス原因物質に対して免疫応答を誘発し得る；および（ｃ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＡＲＶまたはＬＡＶの外被糖タンパク質のｇｐ１６０前駆体のｇｐ１２０またはｇｐ４１サブユニットのアミノ酸配列の一部に相同なアミノ酸配列；を有する合成ペプチド。
９．ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＡＲＶまたはＬＡＶのｇｐ１２０またはｇｐ４１外被糖タンパク質のアミノ酸配列の一部に相同な配列を有し、且つその中に親水領域を含むアミノ酸鎖から成る、ＡＩＤＳおよびＡＲＣのウイルス原因物質に対して免疫原応答を生じる合成ペプチド。
１０．次の配列：【配列があります】（上記配列中ａはａｓｎまたはａｌａ；ｂはｌｙｓまたはｇｌｕ；ｃはａｓｐ、ｖａｌまたはａｌａ；そしてｄはｓｅｒまたはｌｙｓである）を有する合成ペプチド。
１１．次の配列：【配列があります】（上記配列中ｅはａｒｇまたはｔｙｒであり、ｆはｇｌｎまたはａｒｇであるかあるいは欠失される）を有する合成ペプチド。
１２．次の配列：【配列があります】（上記配列中ｇはｖａｌであるかまたは欠失され、ｈはｌｅｕまたはｍｅｔである）を有する合成ペプチド。
１３．次の配列：【配列があります】（上記配列中ｘは【配列があります】であるかまたは欠失され；ｉはｇｌｕまたはａｓｐであり；そしてｊはｇｌｙまたはａｓｐである）を有する合成ペプチド。
１４．次の配列：【配列があります】（上記配列中ｋはａｒｇまたはｌｅｕであり、Ｉはｐｒｏまたはｈｉｓである）を有する合成ペプチド。
１５．ＡＩＤＳおよびＡＲＣのウイルス原因物質に対する抗体を検出する方法であって、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＡＲＶまたはＬＡＶのｇｐ１２０またはｇｐ４１外被糖タンパク質の一部に相同な配列を有するアミノ酸鎖から成る合成ペプチドを、リガンドおよび該リガンドに対して特異的親和性を有する抗リガンドから成る特異的結合対の該リガンドに結合させ；該複合体を動物から採取した血清と接触させ、それにより存在するかもしれないＡＩＤＳまたはＡＲＣのウイルス原因物質に対する抗体を該複合体に結合させ；そしてその後該結合抗体を該特異的結合対の抗リガンドと接触させる；ことから成る上記方法。
１６．上記リガントは酵素であり、そして上記抗リガントは該酵素に特異的な基質である、請求の範囲第１５項記載の方法。
１７．上記リガントは西洋ワサビペルオキシダーゼであり、上記基質は過酸化水素である、請求の範囲第１６項記載の方法。
１８．上記リガンドは抗体であり、上記抗リガンドは該抗体に特異的な抗原である、請求の範囲第１５項記載の方法。
１９．上記方法はビオチンおよびアビジンの連続的な添加により増幅される、請求の範囲第１５項記載の方法。
２０．ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＡＲＶまたはＬＡＶのｇｐ１２０またはｇｐ４１外被糖タンパク質の一部に相同な配列を有するアミノ酸鎖から成る合成ペプチドおよびキャリアーを含有する、ＡＩＤＳおよびＡＲＣのウイルス原因物質に対する動物のワクチン注射用組成物。
２１．上記キャリアーはトキソイドタンパク質である、請求の範囲第２０項記載の組成物。
２２．上記キャリアーはワクチン注射すべき動物にとって外来性の高分子量タンパク質である、請求の範囲第２０項記載の組成物。
２３．上記キャリアーはそのアジュバンド活性によって特徴づけられるペプチドである、請求の範囲第２０項記載の組成物。
２４．上記キャリアーはムラミルジペプチド、ムラブチジンおよびポリアミノ酸から成る群より選ばれる、請求の範囲第２０項記載の組成物。
２５．上記キャリアーはリポソームである、請求の範囲第２０項記載の組成物。
２６．ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＡＲＶまたはＬＡＶのｇｐ１２０またはｇｐ４１外被糖タンパク質の一部に相同な配列を有し、且つその中に親水領域を含むアミノ酸鎖から成る合成ペプチドを免疫原として有効な量投与することから成る、ＡＩＤＳおよびＡＲＣのウイルス原因物質に対する動物の免疫方法。
２７．上記合成ペプチドは動物に投与する前にキャリアーヘ架橋結合される、請求の範囲第２６項記載の方法。
２８．上記合成ペプチドは薬学的に受容される希釈剤と共に動物に投与される、請求の範囲第２６項記載の方法。
２９．上記希釈剤はさらにアジュバントを含む、請求の範囲第２８項記載の方法。
３０．上記希釈剤は蒸留水または中性ＰＨの緩衝液である、請求の範囲第２８項記載の方法。