JPH10502165A - 合成ペプチド−改良イムノアッセイを使用する異なるｈｉｖ遺伝子型の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 試験試料中のＨＩＶ−１抗体及び／又はＨＩＶ−２抗体の１つ以上のＨＩＶサブタイプの存在を同時に検出するためのイムノアッセイを開示する。被分析物を同一又は異なった固相の上に捕獲し、合成及び組換え抗原を含む指示薬試薬の混合物を使用して発生シグナルを検出することによって、被分析物の存在を決定する。好ましい指示薬試薬は、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の免疫優性領域と相同である合成１９アミノ酸環状ペプチドと、ＨＩＶ−２ ｇｐ３６の免疫優性領域と相同である合成１９アミノ酸環状ペプチドとを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 合成ペプチド−改良イムノアッセイを使用する 異なるＨＩＶ遺伝子型の検出 発明の分野 本発明はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）とイムノアッセイとに関わる。特に 、本発明は、２つ以上のＨＩＶ遺伝子型の同時検出のためのイムノアッセイと試 薬とに関わる。具体的には、本発明は、試験試料中のＨＩＶ−１抗原、並びに／ 又は、ＨＩＶ−１抗体、及び、ＨＩＶ−２抗体を検出するためのイムノアッセイ に係わる。発明の背景 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、米国とヨーロッパと中央アフリカとに おいて流行といえる程度に達している日和見感染及び／又は新生物に関連した免 疫系の障害である。疫学的データは、少なくとも２つのタイプのヒト免疫不全ウ イルス（ＨＩＶと総称される）によってＡＩＤＳが引き起こされることを示唆し ている。ＨＩＶ １型（ＨＩＶ−１）は、ＡＩＤＳ及びＡＩＤＳ関連症候群（Ａ ＲＣ）の患者と、健康なＡＩＤＳハイリスク者とから単離されている。例えば、 Ｆ．Ｂａｒｒｅ −Ｓｉｎｏｕｓｓｉ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：８６８−８７１（１９８３） ；Ｍ．Ｐｏｐｏｖｉｃ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：４９７−５００（１９８４ ）；Ｒ．Ｃ．Ｇａｌｌｏ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：５００−５０３（１９８ ４）を参照されたい。ＨＩＶ−１は、性的接触、並びに、血液及び特定の血液製 品に対する接触によって伝染し、又は、感染した母親からその胎児もしくは子供 に伝染する（Ｐ．Ｐｉｏｔ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：５７３−５７９（１９ ８８））。ＡＩＤＳ及びＡＲＣ患者とハイリスク者ではＨＩＶ−１抗体の出現率 が高く、血清反応陽性者全体の約９０％からＨＩＶウイルスを単離することが可 能である。例えば、Ｍ．Ｇ．Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ２４：５０６−５０８（１９８４）及びＤ．Ｇａｌｌｏ他，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉ ｃｒｏ． ２５：１２９１−１２９４（１９８７）を参照されたい。 １９８６年には、第２のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）が、西アフリカ におけるＡＩＤＳ患者から単離された（Ｆ．Ｃｌａｖｅｌ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：３４３−３４６（１９８６））。ＨＩＶ−２感染は、西アフリカ以外の 数カ国 からの個人にも検出されている。例えば、Ａ．Ｇ．Ｓａｉｍｏｔ他，Ｌａｎｃｅ ｔ ｉ：６８８（１９８７）；Ｍ．Ａ．Ｒｅｙ他，Ｌａｎｃｅｔ ｉ：３８８− ３８９（１９８６）；Ａ．Ｗｅｒｎｅｒ他，Ｌａｎｃｅｔ ｉ：８６８−８６９ （１９８７）；Ｇ．Ｂｒｕｃｋｅｒ他，ＡＩＤＳ ２：１４１（１９８８）；Ｋ ．Ｍａｒｑｕａｒｔ他，ＡＩＤＳ ２：１４１（１９８８）を参照されたい。現 時点ではＨＩＶ−２は西アフリカにおいてだけ流行しているにすぎないと考えら れるが、ＨＩＶ−１に関する経験によれば、ＨＩＶ−２が世界のその他の地域に も伝播する可能性が高い。 ＨＩＶ−２ウイルスは、形態、細胞特異性、ＣＤ４細胞レセプターとの相互作 用、ＣＤ４細胞に対するインビトロ細胞変性作用、全体的ゲノム構造、及び、Ａ ＩＤＳを生じさせる能力の点で、ＨＩＶ−１に類似している（Ｆ．Ｃｌａｖｅｌ ，ＡＩＤＳ １：１３５−１４０（１９８７））。しかし、ＨＩＶ−２は、幾つ かの点でＨＩＶ−１とは異なっている。Ｆ．Ｃｌａｖｅｌ，上記論文及びＲ．Ａ ．Ｗｅｉｓｓ他，ＡＩＤＳ ２：９５−１００（１９８８）を参照されたい。 最近になって、新種のＨＩＶサブタイプが発見されている。 １９９０年に、ＤｅＬｅｙｓ他は、サブタイプ ＡＮＴ ７０と名付けられた新 種のＨＩＶ分離ウイルスを特定した（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：１２０７−１２１ ６（１９９０））。カメルーン及びザイールの野生チンパンジーにおけるＨＩＶ −１関連ウイルスに関する更に別のレポートが公表されている（Ｐｅｔｅｒｓ他 ，ＡＩＤＳ ３：６２５−６３０（１９８９））。中央アフリカのカメルーン区 域で流行しているＨＩＶ−１サブタイプと考えられているウイルスは「サブタイ プ０」と呼ばれている。このサブタイプは、ＨＩＶ検出に現在使用可能な検定に おいては問題となってきたが、現時点で、ＨＩＶ−１共通配列に対して約６５％ の相同性を有し、ＨＩＶ−２共通配列に対して約５５％の相同性を有し、ＡＮＴ ７０配列に対して約８５％の相同性を有するものとして特徴付けられている。 血清学的試験によって、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、及び、新たに出現している これらのサブタイプは、そのコア抗原内に多数の共通エピトープを共有するが、 これらのウイルスのエンベロープ糖タンパク質は著しく交差反応性が低いという ことが明らかになっている（Ｆ．Ｃｌａｖｅｌ，上掲）。エンベローブ抗原の交 差反応性がこのように制限されていることが、ＨＩＶ −２抗体保有者と新たに出現しているＨＩＶサブタイプに対する抗体を保有する 人間とから採取した特定の血清に対して、現時点で利用可能なＨＩＶ−１血清学 的アッセイの殆どが無効であることの原因となっている可能性がある（Ｆ．Ｄｅ ｎｉｓ他，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．２６：１０００−１００４（１９８８） ）。Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ ６００６４から現在入手可能な名称「Ａｂｂｏｔｔ ＨＩＶＡＢ^TM ＨＩＶ− １／ＨＩＶ−２（ｒＤＮＡ）ＥＩＡ」の市販入手可能なＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２ 抗体アッセイは、２つのウイルス性タンパク質（ＨＩＶ−１エンベロープとＨＩ Ｖ−２エンベロープ）に対応する組換え抗原を使用する。この組換え抗原を使用 することによって、抗ＨＩＶ−１抗体及び／又は抗ＨＩＶ−２抗体を含む試験試 料の検出を改善すると同時に、全ウイルス又はウイルスライゼートとの交差反応 に主に起因する非特異的反応を最小限にすることが可能になる。標識した組換え ＨＩＶ抗原を使用して試験試料中のＨＩＶ抗体を検出するために少なくとも１つ の組換えＨＩＶタンパク質を使用することを、本明細書に参考として組み入れる 親特許出願で説明している。 ヒト血清中のＨＩＶウイルスに対する抗体の存在を検出するための従来のイム ノアッセイでは、ウイルス複製が可能な株細胞から得られる不活化全ウイルスを 抗原試薬として使用する酵素抗体アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を使用した。その後 のＨＩＶイムノアッセイは、組換えＤＮＡ方法によって得られるポリペプチド配 列を使用することを説明している。Ｃａｂｒａｄｉｌｌａ他，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ，４：１２８−１３３（１９８５）を参照されたい。しかし、こう した従来のイムノアッセイには感受性と特異性が不足しており、この不足のため に、例えばウイルスを含む血液製品のような試験試料が検出を逃れる可能性があ り、その結果として、こうした血液製品を投与される患者にウイルス感染を生じ させる可能性がある。こうしたイムノアッセイにおける特異性の欠如（即ち、偽 陽性）は、ウイルスライゼート中の細胞タンパク質に対する免疫グロブリンの非 特異的結合に起因することが多く、或いは、組換え抗原の場合には、特異性の欠 如が、ＡＩＤＳには無関係なウイルスとの共有エピトープを原因とする可能性も ある。例えば、Ｇａｌｌａｈｅｒ，Ｃｅｌｌ，５０：３２７−３２８（１９８７ ）は、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１領域が呼吸系多核体ウイルス （respiratory syncytial virus）と抗原領域を共有すると共に、麻疹ウイルス Ｆ１糖タンパク質と抗原領域を共有するということを報告している。従って、高 度に精製した組換えＨＩＶポリペプチドさえもが偽陽性の原因となる可能性があ る。いずれの場合にも、こうした偽陽性はＡＩＤＳの誤診に結びつく可能性があ る。 ウイルスゲノムのヌクレオチド分析に基づいて、ＨＩＶゲノムＲＮＡは（５′ 末端から開始して） （ｉ）ヌクレオチド３１０からヌクレオチド１８６９にまでおよび、且つ、内 部構造コア即ち、最も抗原性のコアタンパク質であるｐ２４を含むヌクレオキャ プシドタンパク質をコードするｇａｇ遺伝子、 （ii）ヌクレオチド１，６２９からヌクレオチド４，６７３にまでおよび且つ 逆転写酵素をコードするｐｏｌ遺伝子、及び、 （iii）ヌクレオチド５，７８１からヌクレオチド８，３６９にまでおよび、 且つ最も抗原性のエンベロープタンパク質であるｇｐ４１を含むエンベロープ糖 タンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子、 をコードする（Ｒａｔｎｅｒ他，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：２７ ７−２８４（１９８５））。 今日の医学界が直面する重要問題の１つは、血液製品（及び、他のヒト体液） 中に発見されており且つ血液の供給を介して伝染することが報告されているＨＩ Ｖによる血液製品の汚染を防止することである。現時点では、米国特許第４，５ ２０，１１３号（Ｇａｌｌｏ他）に開示されているアッセイを含む幾つかのアッ セイを使用することが可能である。 或いは、ＨＩＶ抗原又はＨＩＶ抗体を検出可能なアッセイが知られている。こ うしたアッセイは、本明細書に参考として組み入れられた上記特許出願に開示さ れている上記抗ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２アッセイと、米国特許第４，７４８，１ １０号（Ｄ．Ｐａｕｌ）と同第４，９８３，５２９号（Ｊ．Ｓｔｅｗａｒｔ他） と米国特許出願番号０７／２０４，７９８とに開示されている同アッセイとを含 み、これら全ては共通の所有権を有し、本明細書に参考として組み入れられてい る。しかし、被分析物(analyte)としてのＨＩＶ抗原又はＨＩＶ抗体を検出する ための連邦政府の承認を得た公知のアッセイは全て、試験試料中のＨＩＶ抗原又 はＨＩＶ抗体のどちらかを別個に検出することが可能であるにすぎない。同じ１ つの試験試料を使用する 単一のアッセイにおいて被分析物としてのＨＩＶ抗原及び／又はＨＩＶ抗体の両 方を検出するための、連邦政府の認可を得ている公知の市販入手可能なアッセイ は存在しない。 試験試料中の２つ以上の被分析物を検出することは、一般的に、別々のアッセ イで各被分析物を別々に検出することを含む。こうした検出方法は、試験される べき被分析物の各々に関して厳密に品質保証された検出を可能にするので、好ま しいものとされてきた。 医学の進歩は、様々な疾病と臨床的障害に対応した新たなマーカーの認承と、 こうしたマーカーを臨床試験する必要性とを生じさせている。検査室では、試験 コストを低く抑えながら、ますます増加する量の試験をタイミングよく実施する という難題が生じている。例えば、病原体の存在又は病原体に対する接触のため に、血液銀行の検査室においては、ヒトＴ白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１） 、ＨＩＶ、及び、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を、献血血液を検査するための病 原体パネルに加えることになったので、血液銀行の試験要件が劇的に増加してい る。 （特に血液銀行において）試験要件の結果として生じる検査 室の作業負荷を減少させるための実現可能な解決策の１つは、複数のアッセイを 組み合わせる方法を見い出すことである。しかし、個々のアッセイの性能標準を 低下させずに複数のアッセイを組み合わせることは困難であり、更に重要なこと であるが、製造と品質管理とに係わる問題の解決が著しく困難である可能性があ る。 試験試料中の２つ以上の被分析物を同時に検出するアッセイは、試験試料中の ２つ以上の被分析物を検出するために要する時間が著しく短縮され、且つ、複数 のアッセイを別個に行う場合に比べてアッセイに必要な作業時間と試薬と装置と が少なくてすむために各アッセイのコストが低下するという利点を有するだろう 。 例えば、米国特許第４，３１５，９０７号（Ｆｒｉｄｌｅｎｄｅｒ他）は、標 識試薬の遊離種形態からの標識試薬の結合種形態の分離が生じる不均一特異結合 アッセイ系を開示している。 米国特許第４，３７８，３４４号とＥＰ ０２７００８（Ｚａｈｒａｄｎｉｋ ら）は、その特許請求するアッセイ方法によって各被分析物の存在が検出される 、レセプタクルとインサートとを備えた、各被分析物の存在を検出するための固 相装 置を開示する。 英国特許第２１８８４１８号は、複数の反応穴を備えたアッセイトレーアセン ブリを開示しており、このアセンブリでは、上記反応穴の各々がその頂部表面に 開口を有し、この頂部表面から突起が伸びるようになっており、一方、各々の反 応穴の側壁の内側表面と上記突起の各々の外側表面とが、反応穴の中に入れた試 料の中に存在する２つ以上の特定の物質を検出するために同時にインキュベート されることが可能である。 出願人ＩＤＥＸＸ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに与えられた欧州特許出願公開第 ０ ３５１ ２４８号は、単一結合対の抗原及び／又は抗体メンバーを検出する ことが可能な、ネコ科動物ウイルス又はＨＩＶを検出するための同時イムノアッ セイを開示している。更に、米国特許第５，０３９，６０４号（Ｐａｐｓｉｄｅ ｒｏ）は、２つの互いに異なった抗原を加えた後にこれらの抗原の両方に反応す る単一の標識抗体を加えることによって、２つのＨＴＬＶ抗体又はＨＩＶ抗体を 同時に検出するイムノアッセイを開示している。これに加えて、米国特許第４， ８７０，００３号（Ｋｏｒｔｒｉｇｈｔ他）は、不活化抗原の抗原「スパイク」 を使用する、単一結合対の抗原及び ／又は抗体の検出のための固相イムノアッセイを開示している。 或いは、２つ以上の固相を使用する１つ以上の被分析物の検出が、共通の所有 権を有し本明細書に参考として組み入れる同時係属中の米国特許出願番号第５７ ４，８２１号の主題である。 同時アッセイの開発を成功させるために重要であることが確認されているファ クターは、同時に行われる２つのアッセイにおいて、同一の試験試料容量、同一 のインキュベーション時間、同一のカットオフ計算でなければならないというこ とである。更に、イムノアッセイの感受性と特異性と再現性とを確保するために 、こうした同時アッセイは、このアッセイを使用する製造者と検査室との両方に おいて各々の被分析物に関して別々に品質管理されることが可能であるべきであ る。 従って、２つ以上のＨＩＶサブタイプ被分析物（即ち、ＨＩＶ−１抗体もしく は抗原、及び／又は、ＨＩＶ−２抗体もしくは抗原）の存在を同時に検出するこ とが可能であり、且つ、検出対象の個々の被分析物を別々に品質管理することが 可能であるアッセイを提供することが有利だろう。被分析物としてのＨＩＶ抗原 及び／又はＨＩＶ抗体の存在の同時検出が１つの穴（ｗｅｌｌ）内で行なわれ、 ２つ以上の固相を使用する場合に は固相成分の分離が不要であり、及び、この同時アッセイで検出すべき個々の被 分析物に関してアッセイの品質管理を行うことが可能であるという点で、上記ア ッセイは他の公知のアッセイよりも優れているだろう。 更に、ＨＩＶウイルスの高度に保存された固有のエピトープを有する合成ＨＩ Ｖペプチド抗原を使用する診断アッセイを提供することも有利だろう。合成ＨＩ Ｖ抗原は、相対的に容易に且つ低コストで調製可能であり、且つ、更に重要なこ とであるが、この合成ＨＩＶ抗原を使用する場合に、不純物の存在に起因する、 又は、ＡＩＤＳに関連性がないウイルス性タンパク質との共有エピトープの存在 に起因する偽陽性の発生可能性が低減するので、こうした合成ＨＩＶペプチド抗 原を使用することが有益である。最も重要なことであるが、合成ペプチドＨＩＶ 抗原は、新たに出現するＨＩＶサブタイプを検出する際の感度の増大をもたらす だろう。従って、試験試料中のサブタイプＯ抗体のようなＨＩＶ遺伝子型を一貫 して確実に検出するために合成ＨＩＶペプチド抗原を使用する市販入手可能なア ッセイを提供することが有利だろう。こうしたアッセイの欠如が、血液試料及び 他の生体試料中のＨＩＶの検出に関する重大な難問題 を世界規模で生じさせているのである。発明の概要 本発明によって、１つ以上のＨＩＶ遺伝子型を検出するためのイムノアッセイ が提供され、このイムノアッセイは、１つ以上の固体材料上に固定化した （ａ）ＨＩＶ−２ ｇｐ３６ ｅｎｖ、 （ｂ）ＨＩＶ−１ ｇｐ４１ ｅｎｖ、及び、 （ｂ）ＨＩＶ−１ ｐ２４ ｇａｇ の組換え抗原（以下では「捕獲試薬」と呼ぶ）と試験試料を接触させ、第１の混 合物を形成する段階を含む。この第１の混合物を、「ＨＩＶ ｅｎｖ抗体／組換 え抗原」複合体と、「ＨＩＶ ｇａｇ抗体／組換え抗原」複合体とを形成するの に十分な時間と条件とにおいてインキュベートし、こうして得た複合体を、 （ａ）シグナル発生化合物で標識した組換えＨＩＶ−２ ｅｎｖペプチドの存 在下又は不在下で、シグナル発生化合物で標識した合成抗原性部位特異的環状Ｈ ＩＶ−２ ｅｎｖペプチドを含む改良した指示薬試薬に接触させ、 （ｂ）シグナル発生化合物で標識した組換えＨＩＶ−１ ｅｎｖ 抗原の存在下又は不在下で、シグナル発生化合物で標識した合成抗原性部 位特異的環状ＨＩＶ−１ ｅｎｖ抗原を含む改良した指示薬試薬に接触させ、及 び、 （ｃ）シグナル発生化合物で標識した組換えＨＩＶ ｇａｇ抗原を含む改良し た指示薬試薬に接触させ、 第２の混合物を形成する。この第２の混合物を、「ＨＩＶ抗体／捕獲試薬／指示 薬試薬」複合体を形成するのに十分な時間と条件とにおいてインキュベートする 。試験試料中の１つ以上のＨＩＶ遺伝子型に対する抗体（特に、ＨＩＶ−１ ｅ ｎｖ 抗体、ＨＩＶ−２ ｅｎｖ抗体、ＨＩＶサブタイプ０抗体、及び／又は、Ｈ ＩＶ ｇａｇ抗体）の存在を、上記複合体によって発生させられる全シグナルを 検出することによって判定する。 ＨＩＶ−２のｇｐ３６又はＨＩＶ−１のｇｐ４１の免疫優性領域の免疫反応性 特異性特性を有する合成環状部位特異的ＨＩＶ ｅｎｖペプチドを少なくとも１ つの指示薬試薬が含む時に、本発明のアッセイの感度が増大することを見い出し た。特に、予想外に且つ驚くべきことに、本発明のアッセイ中にＨＩＶ−２ ｇ ｐ３６合成ペプチドを含むことが、指示薬試薬中で組換え抗原だけを使用するＨ ＩＶイムノアッセイに比較してＨＩＶ −２偽陽性の頻度を著しく低減させることを見い出した。更に、予想外に且つ驚 くべきことに、本発明のアッセイ中にＨＩＶ−１ ｇｐ４１合成ペプチドを含む ことが、指示薬試薬中で組換え抗原だけを使用するＨＩＶイムノアッセイに比較 して試験試料中のＨＩＶサブタイプＯに対するアッセイの感度を増大させること を発見した。 本発明のアッセイを行うための検査キットも提供する。発明の詳細な説明 アッセイ方式 本発明による試験試料中のＨＩＶ抗原被分析物並びに／又はＨＩＶ−１及びＨ ＩＶ−２抗体被分析物の検出を、上記の通りの様々な試薬の添加を同時に又は逐 次的に行うことが可能な当業界で公知の様々な均一又は不均一アッセイ方式に従 って行うことが可能である。本発明のアッセイはイムノアッセイ方式であること が好ましいが、本発明はイムノアッセイに限定されない。例えば、特異的結合メ ンバーを使用する任意のアッセイを行うことが可能である。本明細書で使用する 術語「特異的結合メンバー」は、特異的結合対のメンバーを意味する。特異的結 合対とは、その一方の分子が化学的手段又は物理的手段によっ て他方の分子に特異的に結合する２つの異なった分子である。従って、一般的な イムノアッセイの特異的結合対である抗原と抗体に加えて、本明細書で使用する 特異的結合対は、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチ ド配列、エフェクター分子とレセプター分子、補因子と酵素、酵素インヒビター と酵素等のような他の特異的結合対を含むことが可能である。更に、上記特異的 結合対は、当初の特異的結合メンバーの類似体であるメンバー、例えば、被分析 物の類似体を含むことが可能である。免疫反応特異的結合メンバーは、抗原、抗 原フラグメント、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体フラグメント、ポリ クローナル抗体、ポリクローナル抗体フラグメント、及び、組換えＤＮＡ法によ って形成された複合体を含む、前記抗原、抗体、それらのフラグメントの複合体 を含む。 本明細書で使用する用語「被分析物(analyte)」は、試験試料中に存在する可 能性がある検出対象の物質を意味する。被分析物は、その物質に対応する天然の 特異的結合メンバー（例えば、抗体、更に明確に言えばＨＩＶ抗体）が存在する 任意の物質、又は、その物質に対応する特異的結合メンバーを調製することが可 能な任意の物質である。従って、被分析物は、アッセ イ中の１つ以上の特異的結合メンバーに結合することが可能な物質である。「被 分析物」はまた、任意の抗原性物質、ハプテン、抗体、及び、これらの組み合わ せを含む。ビタミンＢ₁₂検出用の捕獲及び／又は指示薬試薬中への固有因子タン パク質の使用、又は、炭水化物検出用の捕獲及び／又は指示薬試薬中へのレクチ ンの使用のように、特異的結合対のメンバーとして天然の特異的結合パートナー （対）を使用して、被分析物を検出することが可能である。被分析物は、タンパ ク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、治療目的で投与 する薬剤、違法な目的で投与する薬剤、細菌、ウイルス、及び、上記物質のいず れかの代謝産物又は抗体を含む。 試験試料は、全血、即ち、赤血球、白血球（リンパ球、もしくは、リンパ球サ ブセット調製物を含む）、血小板、血清、及び、血漿を含む全血成分、腹水、唾 液、糞便、脳脊髄液、尿、痰、気管吸引液、並びに、検出対象の被分析物を含む 可能性がある又は含むと推測される他の身体成分のような、哺乳動物の生物体液 であることが可能である。更に、試験試料は、培養液上清液、又は、培養細胞懸 濁液であることも可能である。本発明によってＨＩＶ抗原又はＨＩＶ抗体被分析 物のアッセイが可 能な体液を有する哺乳動物は、ヒト、霊長類、及び、検出対象の被分析物を含む と推測される他の哺乳動物であることが可能である。本発明では、非生物液体試 料を使用可能であることも意図されている。 本発明の方法を、サンドイッチアッセイ方法と競合的アッセイ方法の両方を含 む固相不均一結合アッセイで使用することが有利である。不均一結合アッセイ方 法は、結合反応メンバーが結合する固相材料を使用する。試験試料中の被分析物 の存在又は量を示す標識を検出する前に、反応混合物から固相を取り除くことに よって、固定化した反応成分を過剰分の試料とアッセイ試薬とから分離する。 固相サンドイッチアッセイでは、下記定義の通りの捕獲試薬は、典型的には、 固相材料にすでに結合している捕獲結合メンバーを含む。例えば、特異的結合メ ンバーは、試験試料中の抗原被分析物に結合可能な固定化抗体であることが可能 であり、又は、この特異的結合メンバーは、試験試料中の抗体被分析物に結合可 能な固定化抗原であることが可能である。捕獲試薬を、検査対象の被分析物を含 むと推測される試験試料に接触させ、更に、標識した第２の特異的結合メンバー （例えば、標識した 抗被分析物抗体又は標識した抗原）を含む指示薬試薬に接触させる。これらの試 薬を同時に混合するか、単独で又は組み合わせて逐次的に加える。結合反応によ って、捕獲試薬／被分析物／指示薬試薬複合体が得られる。このアッセイは、得 られた複合体を過剰分の試薬と試験試料とから分離する段階も含む。固相材料上 に保持された複合体を、指示薬試薬に関して固相を調べることによって検出する 。被分析物が試料中に存在する場合には、標識が固相材料上に存在するだろう。 固相に結合する標識の量は、試料中の被分析物の量に正比例する。 本発明のアッセイは、正手順(forward)アッセイ法、逆手順(reverse)アッセイ 法，及び、同時アッセイ法を含むサンドイッチアッセイ方式のいずれかを使用し て行うことが可能である。典型的には、正手順アッセイは、試験試料を捕獲試薬 に接触させ、その後で一定の時間インキュベートしてから指示薬試薬を加えるこ とを含む。逆手順アッセイは、試験試料に指示薬試薬を加え、その後で一定の時 間インキュベートした後に捕獲試薬を加えることを含む。同時アッセイは、捕獲 試薬と指示薬試薬の両方を同時に試験試料に接触させながら行う単一のインキュ ベーション段階を含む。 本発明の抗原を使用して競合的アッセイを行うことも可能である。固相競合的 アッセイでも、典型的には、捕獲試薬が、再び固相材料に固定化された捕獲結合 メンバーを含み、この捕獲結合メンバーは試験試料と指示薬試料の両方に接触さ せられる。しかし、指示薬試薬を、標識と組み合わせた被分析物又はその類似体 から形成することが可能である。結合反応が生じ、（１）「固定化捕獲試薬／被 分析物」複合体および（２）「固定化捕獲試薬／指示薬試薬」複合体の複合体形 成が起こる。或いは、固定化させる特異的結合メンバーが、指示薬試薬に対する 結合において試験試料被分析物が競合する、被分析物又はその類似体であること も可能である。競合的アッセイでは、固相に結合する標識の量は試料中の被分析 物の量と逆の関係にある。従って、陽性の試験試料はシグナルの低減を生じさせ るだろう。 これらの結合アッセイでは、試験試料中の被分析物の存在又は量は、一般的に 、固相に結合した標識の存在又は量を検出することによって決定されるが、遊離 した又は非結合の指示薬試薬が検出される可能性もある。競合的アッセイでは、 試験試料中に含まれる被分析物の量が多ければ多いほど、固相上に存在する標識 の量が少ない。サンドイッチアッセイでは、試料中に 存在する被分析物の量が多ければ多いほど、固相上に存在する標識の量が多い。指示薬試薬 本発明の指示薬試薬は、シグナル発生化合物（標識）に結合した各被分析物の 特異的結合メンバーを含む。各々の指示薬試薬は、試験試料中の被分析物の量に 対応したレベルで検出可能シグナルを生じさせる。好ましい実施様態では、各々 の指示薬試薬は、異なった被分析物の特異的結合メンバーを含むと同時に、検出 可能なシグナルを発生させることが可能なシグナル発生化合物に結合している。 一般的には、捕獲試薬で指示薬試薬を捕獲した後に、その指示薬試薬を検出又は 測定する。本発明では、指示薬試薬によって発生させられる全シグナルが、試験 試料中の１つ以上の被分析物の存在を示す。本発明の実施においては、様々なシ グナル発生化合物を使用することが可能であることを意図している。従って、例 えば、指示薬試薬の各々ごとに別々の蛍光化合物をシグナル発生化合物として使 用することが可能であり、異なった波長で計測することによって検出を行うこと が可能である。或いは、異なった被分析物に関して各々に異なった時間にシグナ ルを発生させるために、アクリジニ ウム又はフェナントリンジウム化合物のような短寿命化学発光化合物と、ジオキ セタンのような長寿命化学発光化合物とを使用することが可能である。互いに異 なった時間にシグナルを発生させることが可能な２つ以上の化学発光化合物を使 用する方法が、共通の所有権を有し且つ本明細書に参考として組み入れる同時係 属中の特許出願である米国出願番号６３６，０３８の主題である。アクリジニウ ム及びフェナントリジニウム化合物については、共通の所有権を有し且つ本明細 書に参考として組み入れる１９８９年６月２３日付けで出願された同時係属中の 特許出願である米国出願番号第０７／２７１，７６３号に記載されている。 特異的結合対の抗原又は抗体メンバーであることに加えて、指示薬試薬の特異 的結合メンバーは、ビオチン又はアビジン、炭水化物又はレクチン、相補的ヌク レオチド配列、エフェクター分子又はレセプター分子、酵素補因子又は酵素、酵 素インヒビター又は酵素等を含むいずれかの特異的結合対のメンバーであること が可能である。免疫反応特異的結合メンバーは、サンドイッチアッセイの場合に は被分析物に結合し、競合的アッセイの場合には捕獲試薬に結合し、間接アッセ イの場合には補助 的特異的結合メンバーに結合することが可能な、抗体、抗原、又は、抗体／抗原 複合体であることが可能である。抗体を使用する場合には、抗体はモノクローナ ル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、組換え抗体、これらの混合物 、又は、抗体と他の特異的結合メンバーとの混合物であることが可能である。こ うした抗体の調製と特異的結合メンバーとしてのこうした抗体の適合性とに関す る詳細は、当業者には公知である。 実施様態の１つでは、指示薬試薬のＨＩＶ抗原は、ＨＩＶ−１のコアタンパク 質とｅｎｖタンパク質及び／又はＨＩＶ−２のｅｎｖ領域の免疫優性領域に結合 することが可能な、合成又は組換えによって生産される抗原である。好ましい実 施様態では、ＨＩＶ−２指示薬試薬中で使用する抗原は、ＨＩＶ−２のｇｐ３６ の免疫優性領域に対応する合成環状ペプチドであり、ＨＩＶ−２から誘導される 抗体に対して免疫反応する能力を有することとを特徴とする。この合成ペプチド は、長さが約１０アミノ酸から約５０アミノ酸であり、２つのシステインがその ジスルフィド環状形態に酸化されているアミノ酸残基配列−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐ ｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（−ＣＡＦＲＱＶＣ−）を含む。好まし い合成ペプチドは、非 限定的に を含む。 別の好ましい実施様態では、ＨＩＶ−１指示薬試薬で使用する抗原は、ｇｐ４ １の免疫優性領域に対応する合成環状ペプチドであり、ＨＩＶ−１及び他のＨＩ Ｖサブタイプによって誘導される抗体に対して免疫反応する能力を有することを 特徴とする。この合成ペプチドは、長さが約１０アミノ酸から約５０アミノ酸で あり、２つのシステイン残基がそのジスルフィド環状形態に酸化されているアミ ノ酸残基配列−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−（ −ＣＳＧＫＬＩＣ−）を含む。好ましいＨＩＶ−１合成ペプチドは、非限定的に を含み、 前式中で、 ａはＡｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌ ｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ又はＡｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ− Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎであり、 ｂはＧｌｙ又はＳｅｒであり、 ｃはＩｌｅ又はＬｅｕであり、 ｄはｓｅｒ又はＬｙｓであり、 ｅはＩｌｅ又はＶａｌであり、 ｆはＴｈｒ又はＴｙｒである。 最も好ましいＨＩＶ−１ペプチドは、非限定的に、 を含む。 そのペプチドが配列ＣＡＦＲＱＶＣ又は配列ＣＳＧＫＬＩＣ又はその酸化形態 の同族体を含み、且つ、ＨＩＶ遺伝子型によって誘導される抗体と結合すること が可能である限り、本発明のペプチドは、上記の特定のアミノ酸配列と同一であ る必要はないということを理解されたい。更に、本発明の合成ペプチド を様々に変化させることが可能であり、例えば、挿入、欠失、及び、ある特定の アミノ酸を同類又は非同類の別のアミノ酸で置換することが可能である。 本発明のペプチドを様々な公知の方法で調製することが可能である。Ｂ．Ｅｒ ｉｃｋｓｏｎ他，Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉ ｓ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．ＩＩ，３ｒｄ ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉ ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７６）及びＥ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ他，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃ ｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８９ ）に記載されている方法のような従来の固相合成を使用することが最も好ましい 。しかし、他の周知のペプチド合成方法を使用することも可能である。樹脂担体 は、ペプチドの固相調製ために当業界で従来から使用されている適切な樹脂のい ずれであってもよく、ｐ−メチルベンジルオキシアルコールポリスチレン樹脂及 びｐ−メチルベンジルアミン(p-methylbenzydrlamine)樹脂であることが好まし い。第１の保護アミノ酸を樹脂担体に結合させた後に、固相ペプチド合成技術で 従来から使用される標準的方法に よってアミノ保護基を取り除く。アミノ保護基の除去の後に、残っているアミノ 保護アミノ酸と（必要に応じて）側鎖保護アミノ酸を、生成物を得るための所期 の順序で逐次的に結合させる。必要に応じて、ジスルフィド結合形成を促進する 酸化環境の中に粗ペプチドを希釈することによって、２つのシステインの間の環 化を生じさせる。その後で、環化ペプチドを精製し、貯蔵のために凍結乾燥する 。 ペプチド合成の分野で公知の方法によって保護又は非保護ＳＨ基を直接的に酸 化してジスルフィド結合に変換することによって、本発明の環状ペプチド（ペプ チドＩ−ＸＩＩＩ）を調製する。好ましい方法は、遊離ＳＨ基をフェリシアン化 カリウムにより直接酸化することを含む。こうした環状ペプチドは、ＨＩＶ抗体 に結合し易い、より堅固なコンホメーションを有すると考えられている。 従来技術に従って適切な結合剤を選択する。例えば、適切な結合剤試薬は、単 独の、又は、好ましくは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下での、Ｎ， Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド又はＮ，Ｎ′−ジクロロヘキシルカルボジ イミド（ＤＣＣ）である。別の有用な結合手順は、予め形成した保護 アミノ酸の対称無水物を使用する。 指示薬試薬の標識は、外部手段によって検出可能な測定可能シグナルを発生さ せることが可能である。本発明に使用することを意図した標識は、非限定的に、 色原体、酵素のような触媒（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性 ホスファターゼ、Ｂ−ガラクトシダーゼ）、発光化合物（例えば、フルオレセイ ン、ローダミン）、化学発光化合物（例えば、アクリジニウム化合物、フェナン トリジニウム化合物、及び、ジオキセタン化合物）、放射性元素、及び、直接的 に目視可能な標識を含む。具体的な標識の選択はあまり重要ではないが、標識は 、その標識単独で、又は、１つ以上の追加の物質と組み合わせて、シグナルを発 生させることが可能でなければならないだろう。標識又は特異的結合メンバーを 変えることによって様々な指示薬試薬を得ることが可能である。 Ｎａｋａｎｅ，Ｐ．，他，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２２ ：１０８４−１０９１（１９７４）によって説明されている通りの従来のシッフ 塩基化学によって、本発明のペプチドＩ−ＸＩＩＩを西洋ワサビペルオキシダー ゼ（ＨＲＰＯ）で標識することが好ましい。炭水化物残基をメタ過ヨウ 素酸ナトリウムで酸化することによって、ＨＲＰＯ上のアルデヒド基を生じさせ ることが好ましい。こうした反応性アルデヒド基をペプチド上のアミノ基（好ま しくはリシンのアミノ末端又はε−アミノ基）と相互作用させる。その後で、こ うして得たシッフ塩基をその後で水素化ホウ素ナトリウムによる還元によって安 定化し、その結果得た複合体を使用時まで貯蔵する。捕獲試薬 本発明の捕獲試薬は、少なくとも１つの固相に付着させた非標識の試験対象被 分析物の各々に対応する特異的結合メンバーを含む。サンドイッチアッセイの場 合には捕獲試薬が被分析物に対して特異的であるが、競合的アッセイの場合には 捕獲試薬が指示薬試薬又は被分析物に対して特異的であることが可能であり、間 接アッセイの場合には、被分析物に対してそれ自体が特異的である補助特異的結 合メンバーに対して捕獲試薬が特異的であることが可能である。試験試料から固 定化複合体を分離することを可能にするように、アッセイを行う前に又はアッセ イを行っている最中に捕獲試薬を直接的又は間接的に固相材料に結合させること が可能である。例えば、吸収又は共有結合によって固相上を特異的結合メンバー で被覆することによって、 捕獲試薬を固相上に付着させることが可能である。被覆方法と他の公知の付着手 段は当業者に公知である。 上記捕獲試薬の特異的結合メンバーは、別の分子と特異的に結合することが可 能ないずれかの分子であることが可能である。捕獲試薬の特異的結合メンバーは 、抗体、抗原、又は、抗体／抗原複合体のような免疫反応化合物であることが可 能である。抗体を使用する場合には、抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナ ル抗体、抗体フラグメント、組換え抗体、これらの混合物、又は、抗体と他の特 異的結合メンバーとの混合物であることが可能である。 「固相」はそれほど重大ではなく、当業者によって選択されることが可能であ る。例えば、ラテックス粒子、微小粒子、磁性又は非磁性ビーズ及び微小粒子、 膜、プラスチック製チューブ、反応トレイ穴（well）の壁、ガラス又はシリコン 製チップ、及び、タンニン酸処理ヒツジ赤血球細胞は、全て適切な例である。固 相上に捕獲試薬を固定化するための適切な方法は、イオン性相互作用、疎水性相 互作用、共有相互作用等を含む。本発明の実施様態の１つでは、６０穴ポリスチ レン反応トレイと１／４インチポリスチレンビーズを使用し、一方、別の実施様 態では、９６穴反応トレイが唯一の使用固相である。シグナル定量化の際に全て の固相が存在し、従ってシグナルの検出のために固相を分離することが不要であ ることを意図している。 本明細書で使用する用語「固相」は、不溶性であるか又は後続の反応によって 不溶性にされることが可能ないずれかの材料を意味する。捕獲試薬を引きつけて 固定化する固有の能力を有する固相を選択することが可能である。或いは、捕獲 試薬を引きつけて固定化する能力を有する追加のレセプターを固相が含むことが 可能である。この追加のレセプターは、捕獲試薬自体とは逆に帯電した荷電物質 、又は、捕獲試薬に結合した荷電物質とは逆に帯電した荷電物質を含むことが可 能である。更に別の代案としては、レセプター分子は、特異的結合反応によって 捕獲試薬を固定化する能力を有する、固相上に（付着させ）固定化させたいずれ かの特異的結合メンバーであるこどが可能である。レセプター分子は、アッセイ を行う前に又はアッセイを行っている最中に捕獲試薬を固相材料に間接的に結合 させることが可能である。従って、固相は、プラスチック、誘導体化(derivatiz ed)プラスチック、磁性又は非磁性金属、試験管のガラス又はシリコン表面、マ イクロタイター穴、シート、ビー ズ、微小粒子、チップ、及び、当業者に公知の他の構成であることが可能である 。 検出抗体によるアクセスを可能にするのに十分な多孔度と抗原の結合に適した 表面アフィニティーとを有する任意の適切な多孔性材料を上記固相が含むことも 意図され、本発明の範囲内に含まれる。微小細孔構造が一般的に好ましいが、水 和状態のゲル構造を有する材料も使用可能である。こうした有効な担体は、非限 定的に、天然高分子炭水化物とその合成改変誘導体、架橋誘導体、又は、置換誘 導体（例えば、アガー、アガロース、架橋アルギン酸、置換及び架橋グアーガム 、（特に硝酸及びカルボン酸との）セルロースエステル、混合セルロースエステ ル、及び、セルロースエーテル）、窒素を含む天然ポリマー（例えば、架橋又は 改変ゼラチンを含むタンパク質及び誘導体）、天然炭化水素ポリマー（例えば、 ラテックス及びゴム）、適切な多孔性構造を有するように調製することが可能な 合成ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩 化ビニル、ポリ酢酸ビニル、及び、その部分加水分解誘導体を含むビニルポリマ ー、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリエステル及びポリアミドの ような上記重縮合物の コポリマー及びターポリマー、及び、ポリウレタン又はポリエポキシドのような 他のポリマー）、多孔性無機材料（例えば、硫酸バリウム、硫酸カルシウム、及 び、炭酸カルシウムを含むアルカリ土類金属及びマグネシウムの硫酸塩又は炭酸 塩、及び、アルカリ金属又はアルカリ土類金属（アルミニウム及びマグネシウム ）のケイ酸塩）、酸化アルミニウムもしくは酸化ケイ素又は水和アルミニウムも しくは水和ケイ素（例えば、クレー、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト 、シリカゲル、又は、ガラス）（これらの材料は上記ポリマー材料と共にフィル ターとして使用されることが可能である）、並びに、上記種類の混合物又はコポ リマー（例えば、予め存在する天然ポリマーに対する合成ポリマーの重合を開始 させることによって得られるグラフトコポリマー）を含む。これらの材料全てを 、適切な形態（例えば、フィルム、シート、もしくは、プレート）で使用するこ とが可能であり、又は、こうした材料を適切な不活性担体（例えば、紙、ガラス 、プラスチックフィルム、もしくは、織物）の上に被覆、接着、もしくは、積層 することが可能である。 ニトロセルロースの多孔性構造は、モノクローナル抗体を含む広範囲の様々の 試薬に対する優れた吸収及び吸着特性を有す る。ナイロンも同様の特性を有し、使用に適している。 本明細書で前記のこうした多孔性固体担体は、厚さ約０．０１ｍｍから約０． ５ｍｍ、好ましくは厚さ０．１ｍｍのシートの形態であることが好ましいと考え られる。細孔径は広範囲に亙って様々であってよいが、約０．０２５ミクロンか ら約１５ミクロンであることが好ましく、特に０．１５ミクロンから約１５ミク ロンであることが特に好ましい。こうした担体の表面を化学的プロセスによって 活性化することが可能であり、これは抗原又は抗体が担体に共有結合することを 生じさせる。しかし、一般的には、僅かしか解明されていない疎水力によって多 孔性材料上に吸着させることによって、抗原又は抗体の不可逆的結合を得る。 流動アッセイ装置のための好ましい固相材料は、多孔性ガラス繊維材料又は他 の繊維マトリックス材料のようなフィルターペーパーを含む。こうした材料の厚 さはあまり重要な問題ではなく、アッセイを行う試料又は被分析物の特性（例え ば、試験試料の流動性）に主に基づいて選択することが可能である。 固相の固有電荷の変化又は強化のために、荷電物質で固相担体材料を直接被覆 するか、又は、荷電物質で微小粒子上を直接 被覆し、この微小粒子を固相担体材料によって保持することが可能である。或い は、カラム内に微小粒子を保持することによって、もしくは、可溶性試薬と試験 試料との混合物中に微小粒子を懸濁させることによって、微小粒子を固相として 使用することが可能であり、又は、微小粒子自体が固相担体材料によって保持さ れ固定化されることが可能である。用語「保持され固定化される」は、担体材料 内又は担体材料上の粒子が担体材料内の他の位置に実質的に移動することが不可 能であることを意味する。適切なタイプの粒子材料のいずれかから当業者が上記 粒子を選択することが可能であり、この粒子は、ポリスチレン、ポリアクリル酸 メチル、ポリプロピレン、ラテックス、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアク リロニトリル、ポリカーボネート等から構成される粒子を含む。粒径はあまり重 要な問題ではないが、平均粒径が使用担体材料の平均細孔径よりも小さいことが 好ましい。従って、様々な他の固相を使用する実施様態が意図され、こうした実 施様態も本発明の範囲内に含む。例えば、共通の所有権を有し且つ本明細書に参 考として組み入れる同時係属中の米国特許出願第１５０，２７８号（ＥＰ公開第 ０３２６１００号）及び米国特許出願第３７５，０２９号（Ｅ Ｐ公開第０４０６４７３号）に説明されている、負荷電ポリマーによって固定化 可能反応複合体を固定化するためのイオン捕獲手順を、高速の溶液相免疫化学反 応を生じさせるために、本発明で使用することが可能である。負帯電のポリアニ オン／免疫複合体と前処理した正帯電多孔性マトリックスとの間のイオン相互作 用によって、固定化可能な免疫複合体を反応混合物の他の部分から分離させ、こ の免疫複合体を、共通の所有権を有し且つ本明細書に参考として組み入れる同時 係属中の米国特許出願第９２１，９７９号（ＥＰＯ公開第０ ２７３，１１５号 ）に説明されている通りの化学発光シグナル測定で説明されているシグナル発生 系を含む、既に説明されている様々なシグナル発生系を使用することによって検 出する。 固相が微小粒子を含む自動化又は半自動化システムを含む微小粒子技術を使用 するシステムで使用できるように、本発明の方法を適合化させることも可能であ る。こうしたシステムは、共通の所有権を有し且つ本明細書に参考として組み入 れる係属中の米国特許出願第４２５，６５１号（ＥＰＯ出願公開第ＥＰ ０ ４ ２５ ６３３号）と米国特許第５，０８９，４２４号（ＥＰＯ出願公開第ＥＰ ０ ４２４ ６３４号）と米国特許 第５，００６，３０９号に説明されているシステムを含む。このシステムは、共 通の所有権を有し且つ本明細書に参考として組み入れる１９９２年３月２７日付 けで出願した米国特許出願第０７／８５９，２１８号も含む。 本発明の実施様態の１つを実際に行う場合には、検出対象のＨＩＶ抗原被分析 物又はＨＩＶ抗体被分析物のいずれかを含むと推測される試験試料を、第１の被 分析物の第１の特異的結合メンバーを付着させた固相と、第２の被分析物の第１ の特異的結合メンバーを付着させた固相とに同時に接触させ、それによって混合 物を形成する。これらの特異的結合メンバーは、被分析物を固相に結合させる捕 獲試薬の役割を果たす。特異的結合メンバーが免疫反応体である場合には、その 特異的結合メンバーは、検出対象である被分析物の各々に対して特異的である抗 体、抗原、又は、これらの複合体であることが可能である。特異的結合メンバー が抗体である場合には、その特異的結合メンバーは、モノクローナル抗体、ポリ クローナル抗体、抗体フラグメント、組換え抗体、及び、これらの混合物、又は 、抗体と他の特異的結合メンバーの混合物であることが可能である。この混合物 を、結合反応が生じるのに十分な時間と条件において インキュベートし、このインキュベーションの結果として、第１の被分析物が試 験試料中に存在する場合には第１の被分析物の「捕獲試薬／第１の被分析物」複 合体が生じ、第２の被分析物が試験試料中に存在する場合には第２の被分析物の 「捕獲試薬／第２の被分析物」複合体が生じる。 その後で、各被分析物用の指示薬試薬を上記複合体と接触させる。第１の被分 析物のための指示薬試薬は、シグナル発生化合物で標識した、検出対象である第 １の被分析物の特異的結合メンバーを含む。第２の被分析物のための指示薬試薬 は、第１の被分析物のための指示薬試薬の場合と同じシグナル発生化合物で標識 した、検出対象である第２の被分析物の特異的結合メンバーを含み、それによっ て第２の混合物が生じる。この第２の混合物を、「捕獲試薬／第１の被分析物／ 指示薬試薬」複合体、及び／又は、「捕獲試薬／第２の被分析物／指示薬試薬」 複合体を生じさせるに十分な時間と条件においてインキュベートする。上記被分 析物のいずれかの存在を、試験試料中の１つ以上の被分析物の存在の表示として 、固相上に形成された複合体に関連して発生するシグナルを検出することによっ て判定する。指示薬がシグナル発生化合物（標識）として酵素を使用す る場合には、シグナルを視覚によって検出することも分光測定によって決定する ことも可能である。或いは、シグナル発生に使用する標識に応じて、蛍光、化学 発光、放射性エネルギー放出等の測定によって、標識を検出することが可能であ る。 捕獲試薬を同一の固相に付着させることも、異なった固相に付着させることも 可能である。全ての捕獲試薬を同じ１つの固相に付着させることも、各々の捕獲 試薬を別々の固相に付着させることも、又は、捕獲試薬の組み合わせを別々の固 相に付着させることも可能であることを意図している。例えば、微小粒子を固相 として選択する場合には、別々の微小粒子が、それに付着した少なくとも１つの 捕獲試薬を含むことが可能である。微小粒子（固相）の混合物を、微小粒子の混 合物を使用して試験試料中に存在する可能性がある様々な被分析物を捕獲するた めに使用することが可能である。こうしたアッセイでは、被分析物の検出を最適 化するために、固相に付着させた複数の捕獲試薬を様々な割合で使用することが 可能であることを意図している。 上記の実施様態では、ＨＩＶ−１抗体被分析物用の捕獲試薬として使用する特 異的結合メンバーがＨＩＶ−１ ｇｐ４１抗 原であることと、ＨＩＶ−１抗原被分析物用の捕獲試薬として使用する特異的結 合メンバーが抗ＨＩＶ−１ ｇｐ２４抗体であることとが好ましい。捕獲試薬と して使用するＨＩＶ−１ ｇｐ４１が組換えで調製した抗原（タンパク質）であ ることが最も好ましい。或いは、抗体被分析物指示薬試薬のための特異的結合メ ンバーが、酵素で標識したＨＩＶ−１ ｇｐ４１組換えタンパク質又は上記合成 ペプチドであることと、抗原被分析物指示薬試薬のための特異的結合メンバーが 、酵素で標識した抗ＨＩＶ ｐ２４抗体であることも好ましい。このＨＩＶ−１ ｐ４１抗原が合成によって生産され、標識酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼ （ＨＲＰＯ）であることが最も好ましい。ＨＲＰＯに結合した上記合成ペプチド ＸＩＩＩが好ましい指示薬試薬である。 本発明の別の実施様態では、検出対象である第１の被分析物又は第２の被分析 物を含むと推測される試験試料を、第１の被分析物の第１の特異的結合メンバー と第２の被分析物の第１の特異的結合メンバーとを付着させた第１の固相と、シ グナル発生化合物で標識した第１の被分析物に対応する特異的結合メンバーを含 む第１の被分析物用の指示薬試薬と、シグナル発生化 合物で標識した第２の被分析物に対応する特異的結合メンバーを含む第２の被分 析物用の指示薬試薬とに同時に接触させ、それによって混合物を生じさせる。特 異的結合メンバーは、固相に被分析物を結合させる捕獲試薬の役割を果たす。特 異的結合メンバーが免疫反応体である場合には、その特異的結合メンバーは、検 出対象である各々の被分析物に特異的な抗体、抗原、又は、これらの複合体であ ることが可能である。特異的結合メンバーが抗体である場合には、その特異的結 合メンバーは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、 組換え抗体、及び、これらの混合物、又は、抗体と他の特異的結合メンバーの混 合物であることが可能である。指示薬試薬は、シグナル発生化合物で標識した、 検出対象である第１の被分析物と第２の被分析物の特異的結合メンバーを含む。 この混合物を、結合反応が生じるのに十分な時間と条件においてインキュベート し、このインキュベーションの結果として、第１の被分析物又は第２の被分析物 の一方又は両方が試験試料中に存在する場合に、第１の被分析物の「捕獲試薬／ 第１の被分析物／指示薬試薬」複合体、及び／又は、第２の被分析物の「捕獲試 薬／第２の被分析物／指示薬試薬」複合体の複合体が生じる。固 相の一方又は両方の上に形成された複合体に関連して発生するシグナルを試験試 料中の第１の被分析物及び／又は第２の被分析物の存在の表示として検出するこ とによって、第１の被分析物又は第２の被分析物の存在を決定する。指示薬がシ グナル発生化合物（標識）として酵素を使用する場合には、シグナルを視覚によ って検出することも分光測定によって測定することも可能である。或いは、シグ ナル発生に使用する標識に応じて、蛍光、化学発光、放射性エネルギー放出等の 測定によって、標識を検出することが可能である。指示薬試薬がハプテン（例え ば、ビオチン）を更に含むことが可能である場合には、このアッセイがハプテン −抗ハプテン系の使用を含むことが可能であることを意図している。ビオチン／ 抗ビオチン系をアッセイに使用することは、共通の所有権を有し且つ本明細書に 参考として組み入れる同時係属中の米国特許出願第６８７，７８５号（欧州特許 出願公開第０１６０９００号（１９８５年１１月１３日付けで公開）に対応する ）の主題である。 上記の実施様態では、ＨＩＶ−１抗体被分析物用の捕獲試薬として使用する特 異的結合メンバーがＨＩＶ−１ ｇｐ４１抗原であることと、ＨＩＶ−１抗原被 分析物用の捕獲試薬として 使用する特異的結合メンバーが抗ＨＩＶ−１ ｐ２４抗体であることとが好まし い。捕獲試薬として使用するＨＩＶ−１ ｇｐ４１が組換えで調製した抗原（タ ンパク質）であることが最も好ましい。或いは、抗体被分析物指示薬試薬のため の特異的結合メンバーが、酵素で標識したＨＩＶ−１ ｇｐ４１抗原であること も好ましい。このＨＩＶ−１ ｐ４１抗原を合成又は組換えによって生産し、標 識酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）であることが最も好ましい。 このＨＩＶ−１ ｇｐ４１抗原を合成によって生産することが最も好ましい。好 ましい固相は、磁性又は非磁性ビーズ、反応トレイの穴、微小粒子を含み、これ らを単独又は組み合わせて使用する。 信頼性の高い試験結果を得るために、陰性の対照と陽性の対照を本発明のアッ セイに含むことが可能である。捕獲試薬を付着させないブランクの固相を、陰性 の試薬対照として使用することが可能である。陽性の対照は、各々の被分析物毎 に別々に試験される陽性の対照と、アッセイにおいて検出されるべき全ての被分 析物の存在が判定される、陽性の対照の組み合わせとを含むことが可能である。 上記のように、組換えによって調製した抗原を固相上の捕獲試薬として使用す ることと、酵素と結合した合成ＨＩＶペプチドをアッセイの指示薬試薬として使 用することとが好ましい。しかし、本発明では、上記の通りの組換えタンパク質 試薬と合成ペプチド試薬との組み合わせだけに限定せず、他の組み合わせも想定 しているということを理解されたい。例えば、捕獲試薬タンパク質の１つ以上又 は全てを合成によって調製することが可能であり、標識試薬のタンパク質を合成 によって調製することが可能である。酵素で標識した組換えＨＩＶ−１及びＨＩ Ｖ−２を、指示薬試薬として合成ペプチドと組み合わせて使用することが可能で ある。更に、本発明の標識ＨＩＶ−２合成ペプチド試薬を使用する場合には、ウ イルスライゼート又は特定の被分析物の単離物を使用することが可能である。 ＨＩＶ ｇｐ４１の発現又はＨＩＶ ｇｐ４１の一部分の発現が、診断アッセ イにおける組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）由来ＨＩＶエンベロープ配列の有用性を実 証する。Ｗｏｏｄ他，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉ ｕｍ ｏｎ ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｍａｙ ２２−２６（１９８５）；Ｃｈａｎｇ他，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：９ ０５−９０９（１９８５）；Ｃｒｏｗｌ他，Ｃｅｌｌ ４１：９７９−９８６（ １９８５）；Ｃａｂｒａｄｉｌｌａ他，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：１２ ８−１３３（１９８６）。Ｅ．ｃｏｌｉ又は他の生物中で発現させたウイルス性 タンパク質は診断アッセイにおける有用性の可能性を有することは一般に知られ ているが、こうした試薬を使用するイムノアッセイは、細胞培養から得た野生種 のウイルス性タンパク質と同等であるか又はそれより高い特異性と感受性を有す る可能性があるが、こうしたイムノアッセイの開発は現在まで困難なままである 。更に、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのＨＩＶ ｇａｇタンパク質の発現は、ｒＤＮＡ技術 によって生産するＨＩＶ ｇａｇタンパク質が診断アッセイの試薬である可能性 があることを示している。Ｗｏｏｄ他，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｍａｙ ２２−２６（１９ ８５）；Ｄｏｗｂｅｎｋｏ他，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８２：７７４８−７７５２（ １９８５）；Ｇｈｒａｙｅｂ他，ＤＮＡ ５：９３０９ ９（１９８６）；Ｓｔｅｉｍｅｒ他，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５０：２８３−２９ ０（１９８６）。 本発明は、アッセイ試薬として組換え生産ＨＩＶエンベロープタンパク質を使 用する。ＨＩＶゲノムのクローニング、ＨＩＶエンベロープ及びコアタンパク質 のＥ．ｃｏｌｉ中での発現、ｇｐ４１とｐ２４の精製と特性化、及び、これらの 組換えタンパク質を使用する様々なアッセイ方式は、本明細書に参考として組み 入れる１９８７年２月２７日付けで出願した米国特許出願第０７／０２０，２８ ２号に記載されており、優先権が主張されている。簡略的に述べれば、ＨＩＶ感 染ＨＴ−９細胞を収集し、全細胞ＤＮＡを単離し消化する。コアタンパク質をコ ードするＤＮＡセグメントとエンベーロープ糖タンパク質をコードするＤＮＡセ グメントを、公知の組換え技術を使用してバクテリア発現ベクター中に更にサブ クローニングした。米国特許出願第０７／０２０，２８２号も、ＨＩＶ−１抗体 の検出において捕獲試薬及び指示薬試薬として組換え抗原を使用することによっ て、様々な免疫グロブリン種の抗ＨＩＶ抗体の検出が可能になるということを開 示している。こうした免疫グロブリン種は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及び、Ｉ ｇＭを含む。Ａｂ ｂｏｔｔ ＨＩＶＡＢ^TMＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２（ｒＤＮＡ）ＥＩＡアッセイを 使用する抗ＨＩＶ−１ ＩｇＧ、ＩｇＭ、及び、ＩｇＡの検出が、Ｊ．Ｌ．Ｇａ ｌｌａｒｄａ他によるアブストラクト（５ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｆｏｒｕｍ ｏ ｎ ＡＩＤＳ，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｏｒ ｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ，Ａｔｌａｎｔａ，Ｇｅｏｒｇｉａ，１９９２年３月２ ９日−４月１日）に説明されている。 異種ソース中で生産される組換え抗原又は合成ＨＩＶペプチドを上記アッセイ に使用することが可能であり、それによって偽陽性結果の更に著しい低減をもた らすことが可能であることを意図し、本発明の範囲内に含む。例えば、Ｅ．ｃｏ ｌｉ で調製した組換え抗原（例えばｇｐ４１）を捕獲試薬として使用し、Ｅ．ｃ ｏｌｉ とは異なる任意の適切なソース（例えば、適切な酵母宿主又はＢ．ｍｅｇ ａｔｅｒｉｕｍ のような他の適切宿主）中で生産した組換え抗原ｇｐ４１を使用 することが可能である。組換え抗原を含む、アッセイにおける抗原の異種ソース の使用は、共通の所有権を有し且つ本明細書に参考として組み入れる同時係属中 の米国特許出願第０７／７０１，６２６号の主題である。 更に、本発明では、組換えによって生産する抗原を使用することが好ましいが 、組換え生産抗原の代わりに合成タンパク質を使用することが本発明の範囲内に 含まれる。例えば、上記の通りの合成によって調製した様々な長さのＨＩＶペプ チドを使用することが可能である。 本発明はまた、ＨＩＶ抗原被分析物に特異的に結合する抗体も使用する。好ま しい実施様態では、抗ＨＩＶｐ２４抗体を使用する。最も好ましい実施様態の１ つでは、ＨＩＶｐ２４に対して両方が特異的であるモノクローナル抗体の混合物 を使用する。この混合物では、ヒト抗ＨＩＶ−１ ｐ２４ ＩｇＧがそのエピト ープに対して競合的に結合しないＨＩＶ−１ ｐ２４上のエピトープに特異的に 結合する一方のモノクローナル抗体を、ヒト抗ＨＩＶ−１ ｐ２４ ＩｇＧがそ の異なったエピトープに対して競合的に結合するＨＩＶ−１ ｐ２４の異なった エピトープに特異的に結合する別のモノクローナル抗体と共に使用する。更に、 ヒト抗ＨＩＶ−１ ｐ２４ ＩｇＧに競合的に結合しないモノクローナル抗体も 、ＨＩＶ−２ ｐ２４抗原に特異的に結合する。これらのモノクローナル抗体と 、ＨＩＶ抗原アッセイにおけるこれらのモノクローナル抗体の使用 は、共通の所有権を有し且つ本明細書に参考として組み入れる同時係属中の米国 特許出願第０７／２０４，７９８号の主題である。これらのモノクローナル抗体 は３１−４２−１９と３１−９０−２５と呼ばれる。モノクローナル抗体３１− ４２−１９を生産するハイブリドーマ細胞系３１−４２−１９は、１９８８年５ 月２６日付けでＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ ｉｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍ ａｒｙｌａｎｄ，２０８５２に寄託され、ＡＴＣＣ 受託番号ＨＢ ９７２６を 与えられている。モノクローナル抗体３１−９０−２５を生産するハイブリドー マ細胞系３１−９０−２５は、１９８８年５月２６日付けでＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａ ｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，２０８５２に寄託 され、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ ９７２５を与えられている。これらのモノクロー ナル抗体をＨＩＶ抗原アッセイにおいて抗体フラグメントとして使用することも 、共通の所有権を有し且つ本明細書に参考として組み入れる米国特許第７，２０ ４，７９８号に説明されている。 本発明のアッセイを使用してＨＩＶ−２抗原の検出が可能であることを意図し 、本発明の範囲内に含む。このアッセイ方式では、上記のＨＩＶ−１ ｐ４１抗 原捕獲試薬及びＨＩＶ−１抗体捕獲試薬に加えて、ＨＩＶ−２ ｐ４１を、ＨＩ Ｖ−２抗原捕獲試薬として固体担体上に付着させる。この固体担体は、他の全て の捕獲試薬を付着させる担体と同じ固体担体であってもよく、ＨＩＶ−１組換え 抗原を付着させる担体と同じ固体担体であってもよく、又は、（ＨＩＶ−２ ｐ ４１以外の）他の捕獲試薬を付着させていない固相に結合させてもよい。このア ッセイの手順は、本発明の様々な実施様態に関して上記で説明した手順と同一で あってよい。ＨＩＶ−２抗体被分析物指示薬試薬は、検出可能な標識に結合させ た組換え及び／又は合成調製ＨＩＶ−２ ｇｐ３６抗体を含むだろう。実施様態 の１つでは、組換え調製ＨＩＶ−２ ｐ４１を使用する。ＨＩＶ−２ウイルスの 配列（ｐ４１抗原を含む）が、本明細書に参考として組み入れる１９８９年１２ 月２０日付けで公開されたＥＰ第０ ３４７，３６５号（Ｄｉａｇｅｎ Ｃｏｒ ｐ）に記載されている。最も好ましいＨＩＶ−２組換え抗原は、ＨＩＶ−２ ｐ ４１抗原の最初の１０４アミノ酸をコードする。得られたプ ラスミドはｐＪＣ１０４と呼ばれ、ＣＫＳタンパク質との融合としてＨＩＶ−２ ｅｎｖタンパク質を発現させる。共通の所有権を有し且つ本明細書に参考とし て組み入れる１９８８年３月１１日付けで出願された米国特許出願第１６７，０ ６７号（Ｂｏｌｌｉｎｇ及びＭａｎｄｅｃｋｉ，“ＣＫＳ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（タンパク質合成のＣＫＳ方法）”）で 説明されている方法によって、このプラスミドは、ＣＫＳタンパク質の最初の２ ３９アミノ酸と、ｐＴＢ２１０Ｎ多重制限部位リンカーからの１３アミノ酸と、 ＨＩＶ−２ ｅｎｖタンパク質からの１０４アミノ酸（アミノ酸５０６−６０９ ）と、ｐＴＢ２１０Ｎ多重制限部位リンカーからの追加の１５アミノ酸を含む組 換えタンパク質をコードする。別の好ましい実施様態では、上記のように、酵素 と結合した様々な長さの合成ＨＩＶ−２ペプチドを指示薬試薬として使用する。 ＨＲＰＯに結合したＨＩＶ−１ペプチドＩを指示薬試薬として使用することが最 も好ましい。 以下では、本発明の思想と範囲を非限定的に説明することを意図した実施例に よって、本発明を説明する。実施例 実施例１ ２つの固相を使用する被覆手順 この手順は、１／４インチポリスチレンビーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ ６００６４から入手可能）と６ ０穴ポリスチレン反応トレイ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂ ｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ ６００６４から入手可能）を使用した。ビーズ表面 を２つの異なった抗ＨＩＶ−１ ｐ２４モノクローナル抗体で次のように被覆し た。このビーズを、４５℃で２時間、０．２５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐ Ｈ７．２）中の濃度８μｇ／ｍＬ（約１．６μｇ／ｍＬ／ビーズ）で被覆した。 その後でビーズを０．２５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中で洗浄 し、４５℃で１時間、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００^TM（Ｓｉｇｍａ Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能なポリオキシエチ レンエーテル）を含む洗剤溶液と反応させた。その次に、ビーズを、４５℃で３ ０分間、０．２５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中の１％仔ウシ血 清アルブミン（ＢＳＡ）で ブロックし、その後で、０．２５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液中で１５−３０℃ で１５分間、２％スクロースと１％リン酸ガラスでオーバーコートし、乾燥させ た。使用した２つのモノクローナル抗体は３１−４２−１９と３１−９０−２５ と呼ばれる。これらの抗体は、本明細書に参考として組み入れる、これらのモノ クローナル抗体の開発と使用を説明する米国特許出願第０７／２０４，７９８号 の主題である。これらのモノクローナル抗体の使用は、共通の所有権を有し且つ 本明細書に参考として組み入れる米国特許第７，２０４，７９８号にも説明され ている。モノクローナル抗体３１−４２−１９を生産するハイブリドーマ細胞系 ３１−４２−１９は、１９８８年５月２６日付けでＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄ ｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，２０８５２に寄託され、Ａ ＴＣＣ受託番号ＨＢ ９７２６を与えられている。モノクローナル抗体３１−９ ０−２５を生産するハイブリドーマ細胞系３１−９０−２５は、１９８８年５月 ２６日付けでＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ ｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖ ｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，２０８５２に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ ９７２５を与えられている。 その次に、６０穴反応トレイの穴をＨＩＶ抗原で次のように被覆した。ｐＴＢ ３１９と呼ぶ組換えタンパク質ＨＩＶ−１ ｐ４１ ｅｎｖタンパク質を、０． １Ｍ ３−［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ緩衝 液、ｐＨ１１）中に１μｇ／ｍＬの濃度で各々の穴に加え、４０℃で２時間イン キュベートした。その後で、各々の穴をリン酸緩衝塩類液（ＰＢＳＮｐＨ７．５ ）４００μＬで２回洗浄し、４０℃で１時間０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０^TMと反応 させ、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡによって４０℃で１時間ブロックした。その次に、 上記穴をＰＢＳ中の５％スクロースで室温で２０分間オーバーコートし、乾燥さ せた。 組換えタンパク質ｐＴＢ３１９を生産するｐＴＢ３１９プラスミドは、本明細 書に参考として組み入れる１９８８年３月１１日付けで出願された米国特許出願 第１６７，０６７号（Ｂｏｌｌｉｎｇ及びＭａｎｄｅｃｋｉ，“ＣＫＳ Ｍｅｔ ｈｏｄ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（タンパク質合成のＣＫＳ 方法）”）の主題である。Ｂｏｌｌｉｎｇ及びＭａｎ ｄｅｃｋｉ（同書）で説明されている通りに、ＨＩＶ−１ ｐ１２０のカルボキ シ末端４２アミノ酸をコードする合成生産ＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＴ Ｂ３１５の中に挿入することによって、ｐＴＢ３１９を生産した。実施例２ ＨＩＶ抗原とＨＩＶ抗体の同時アッセイ 実施例１で説明した通りに調製した２つの固相を、試験試料中のＨＩＶ抗原及 び／又はＨＩＶ抗体の検出のためのアッセイで次のように使用した。抗体陽転し た９人のＨＩＶ−１感染者から得た６５例の血清試料を収容したＨＩＶ−１抗体 陽転パネルをアッセイに使用した。各々の血清試料を、Ｔｗｅｅｎ−２０^TM（Ｓ ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能な ポリオキシエチレンソルビタン）を２％含む試料希釈液５０μＬに血清試料１５ ０μＬを加えることによって、実施例１で予め用意した６０穴トレイの各々の穴 の中で各々の血清試料を希釈した。その後で、実施例１で説明したように抗ＨＩ Ｖ ｐ２４抗体で予め被覆したビーズを、血清試料を収容した各々の穴の中に入 れた。連続的に回転させながら各トレイの穴を４０℃で６０分間インキュベート した。イ ンキュベーション後に、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎ ｇ Ｃｅｎｔｅｒ^TM（ＰＰＣＮ Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａ ｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能）中で、６０穴反応トレイの各々の穴 を脱イオン水（ｄＨ₂Ｏ）１５ｍＬで洗浄した。２００μｌのＨＩＶ ｐ２４抗 体プローブ試薬（抗体希釈液（２．２５％ＢＳＡ）７．５％ウシ血清、７．５％ ヤギ血清、２５％カルシウム再添加（ｒｅｃａｌｃｉｆｉｅｄ）ヒト血漿、０． １％アジ化ナトリウム）中のウサギポリクローナルＦ［ａｂ′］₂抗ＨＩＶ−１ ［活性成分：濃度２−６μｇ／ｍＬの抗ｐ２４抗体］）を、各々の穴／ビーズに 加え、その後で結果的に得られた混合物を４０℃で６０分間、回転なしにインキ ュベートした。反応トレイ中のビーズ／穴の各々をｄＨ₂Ｏ １５ｍＬで洗浄し た。その後で、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した組換えＨＩＶ−１ ｐ４ １抗原（ＨＲＰＯに結合させたｐＴＢ３１９）とＨＲＰＯ標識ヤギ抗ウサギＩｇ Ｇ抗体との混合物を含む共役希釈液（０．１８％トリス、１．１９％トリスＨＣ ｌ、０．３８％ＮａＣｌ、９．０％仔ウシ血清、０．９％ヤギ血清、１０％カル シウム再添加ヒト血漿、４．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０ ０^TM、０．０１３％硫酸ゲンタマイシン、０．００９％チメロサール）を、反応 トレイの各々のビーズ／穴に加え、回転なしに４０℃で６０分間インキュベート した。６０穴反応トレイの各々のビーズ／穴を上記のようにｄＨ₂Ｏ １５ｍＬ で洗浄した。その後で、ｏ−フェニレンジアミン−２ＨＣｌ（ＯＤＰ）３００μ Ｌを各々のビーズ／穴に加え、暗所で室温で３０分間インキュベートした。その 後で各々のビーズ／穴に停止試薬（１Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄）３００μＬを加えることに よって反応を停止させた。６３０ｎｍ基準を使用して４９２ｎｍで反応の光学密 度を測定するＡｂｂｏｔｔ ＰＰＣを使用して反応を読み取った。０．１ ＯＤ ＋陰性対照の平均ＯＤとしてカットオフ値を設定した。血清試料／カットオフ値 の値が１より大きい場合に、血清試料を反応性（陽性）とみなした。 上記の９人の感染者から得た全部で６５例の血清試料を上記手順に従って試験 した。その後で、得られた結果を、各々の製品に挿入された説明書に示されてい る製造者の指示に従ってＨＩＶ抗原アッセイ（ＨＩＶＡＧ^TM、Ａｂｂｏｔｔ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能）とＨＩ Ｖ抗体アッセイ（ヒト免疫不全ウイルス１型及び２型：Ｅ．ｃｏｌｉ 及びＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、組換え抗原、Ａｂｂｏｔｔ ＨＩ ＶＡＢ^TM ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２（ｒＤＮＡ）ＥＩＡ；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能）を使用した 時に同一の血清試料に関して得た結果と比較した。この結果得たデータを下記の 表１に示すが、この表１では、「ＯＤ」が光学密度の読み取り値を意味し、「Ｓ ／ＣＯ」が「試料／カットオフ値」を意味し、「結果」が試験の解釈を意味し、 「ＨＩＶ−１／２ Ａｂ ＨＩＶ−１ Ａｇ Ｃｏｍｂ」が、本発明のアッセイ を示し、「ＨＩＶ−１／２ Ａｂ」が、ＨＩＶＡＢ^TMＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２（ ｒＤＮＡ）ＥＩＡアッセイを表し、「ＨＩＶ−１ Ａｇ」がＡｂｂｏｔｔ ＨＩ ＶＡＧ^TMアッセイを表す。 表１からのデータは、３つの別々の試験からの結果を別個に互いに比較した時 に、ＨＩＶ−１／２ Ａｂ試験又はＨＩＶ−１ Ａｇ試験のどちらよりも本発明 の方法が高い感受性を有したことを示している。感染の過程で早期に存在し且つ ＨＩＶ感染の最終段階にも存在するＨＩＶ ｐ２４抗原と、感染の後期において 抗体陽転時に現れるＨＩＶ抗体の両方を検出するために、本発明のアッセイを更 に最適化することが可能であると予想される。実施例３ １つの固相を用いる被覆手順 この手順では、次のように１つの固相だけをＨＩＶ抗原とＨＩＶ抗体で被覆し た。モノクローナル抗体３１−４２−１９、モノクローナル抗体３１−９０−２ ５、及び、（実施例１で説明した通りの）ｐＴＢ３１９と呼ぶ組換えＨＩＶ−１ ｐ４１抗原を、各々に０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中の１μｇ／ｍＬ の濃度で、室温で２時間に亙って９６穴マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌ ｏｎ ４^TM、Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ ＶＡから入手可能）の 各々の穴の中を被覆した。その次に、これらの穴を、室温で１時間に亙って、 ブロッキング試薬（５％脱脂粉乳、１０ｍＭ トリス［ｐＨ８．０］、１５０ｍ Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ− 実施例４ １つの固相を使用するＨＩＶ抗原／抗体アッセイ 実施例３で説明した通りに調製した固相を、試験試料中のＨＩＶ抗原及び／又 はＨＩＶ抗体の存在を検出するために次のようにアッセイで使用した。１２メン バー抗体陽転パネル（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔ ｏｎ ＭＡより入手可能なＰａｎｅｌ Ｇ）の血清試料の各々と、陽性の対照と 、陰性の対照とを試験した。各血清試料１５０μＬ、陰性の対照１５０μＬ、又 は、陽性の対照１５０μＬを、マイクロタイタープレートの各々の穴の内で、試 料希釈液（実施例３で説明したようにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００^TM １５μＬと ブロッキング試薬３５μＬを含む）５０μＬで希釈し、回転なしに室温で６０分 間インキュベートした。インキュベーション後に、Ｎｕｎｃ ８チャンネル “ Ｉｍｍｕｎｏｗａｓｈ” マニホルド（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋから入手可能 ）を使用して、洗浄緩衝液（０．０５％脱脂粉乳、１０ｍＭ トリス ［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０^TMを含 む）３００μＬで８サイクルの穴の洗浄を行った。その次に、抗体希釈液（２． ２５％ＢＳＡ、７．５％仔ウシ血清、７．５％ヤギ血清、２５％カルシウム再添 加ヒト血漿、０．１％アジ化ナトリウム）中のＨＩＶ ｐ２４抗体プローブ試薬 （ウサギポリクローナルＦ［Ａｂ′］₂抗ＨＩＶ−１［活性成分：濃度２−６μ ｇ／ｍＬの抗ｐ２４抗体］）１７５μＬを、各々の穴に加え、回転なしに室温で ６０分間インキュベートした。インキュベート後に、上記のように、各々の穴に 対して洗浄緩衝液で８サイクルの洗浄を行った。その後で、（実施例２で説明し た通りの）ＨＲＰＯで標識した組換えＨＩＶ−１ ｐ４１タンパク質（ｐＴＢ３ １９）とＨＲＰＯ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体との混合物を含む（実施例２で説 明した通りの）結合体希釈液１５０μＬを各々の穴に加え、回転なしに室温で６ ０分間インキュベートした。各々の穴に対して上記洗浄緩衝液で８サイクルの洗 浄を行い、更にｄＨ₂Ｏで洗浄した。その後で、ＯＰＤ基質１２５μＬを各々の 穴に加え、これらの穴を暗所で室温で１０分間インキュベートした。（実施例２ で説明した通りの）停止試薬１２５μＬを加えて反応を停止 させた。各々の穴の吸光度を６３０ｎｍ基準を用いて４９０ｎｍで測定した。０ ．０２５ ＯＤ＋陰性対照の平均ＯＤとしてカットオフ値を設定した。 血清試料／カットオフ値の値が１より大きい場合に、血清試料を反応性（陽性 ）とみなした。 これらのアッセイから得たデータを表２に示す。表２では、「ＯＤ」が光学密 度の読み取り値を意味し、「Ｓ／ＣＯ」が「試料／カットオフ値」を意味し、「 結果」が試験の解釈を意味し、「ＮＣ」が陰性の対照を示し、「ＰＣ」が陽性の 対照を示す。 表２のデータが示すように、本発明のアッセイは抗体陽転パネル中のＨＩＶ抗 体及び／又はＨＩＶ抗原の存在を検出することが可能である。ＨＩＶ−１／２抗 体試験とＨＩＶ−１抗原試験とに対して各々に比較すると、これらの抗原又は抗 体の検出に基いて判断する場合に、本発明の方法は、単独のＨＩＶ−１／２抗体 試験と単独のＨＩＶ−１抗原試験のどちらよりも高い感度を検出で示した。本発 明の方法の表２の結果をＨＩＶ−１／２抗体試験とＨＩＶ−１抗原試験との組み 合わせ結果と比較すると、本発明の方法は、これら従来の方法のいずれかで陽性 だった試料の全てを検出することが可能だった。実施例５ ＨＩＶ抗体捕獲試薬とＨＩＶ抗原捕獲試薬とによる微小粒子の同時被覆 各々に０．０１Ｍ 炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中に１５０μｇ／ｍＬの濃度 の、上記モノクローナル抗ＨＩＶｐ２４抗体（３１−４２−１９、３１−９０− ２５）と上記組換えＨＩＶ−１ ｐ４１抗原（ＨＩＶ−１ ｐ４１組換えタンパ ク質ｐＴＢ３１９とＨＩＶ−２ ｐ４１組換えタンパク質ｐＪＣ１０４）の両方 を同時に使用して、室温（１５−３０℃）で２ 時間に亙って、（Ｓｅｒａｄｙｎｅ Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉ ｎｄｉａｎａより入手可能）ポリスチレン微小粒子の均一な０．５％懸濁液（重 量／体積）を同時被覆する。微小粒子の懸濁液を短時間遠心し、微小粒子ペレッ トを０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中に再懸濁させ、過剰分の非結合タ ンパク質を洗浄して取り除く。この洗浄を、非結合タンパク質が全て除去される まで繰り返す。５６℃で１８−２４時間、［０．０１Ｍトリス（ｐＨ８．０）、 ０．１５Ｍ ＮａＣｌ］中の１０ｍｇ／ｍＬカゼインで微小粒子をブロッキング した後、その微小粒子を再び上記の通りに洗浄し、［０．０５Ｍトリス（ｐＨ８ ．０）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、１５％スクロース、及び、０．１ ％アジ化ナトリウム］中の０．０１５％懸濁液（重量／体積）に希釈する。実施例６ 微小粒子を使用するＨＩＶ抗体とＨＩＶ抗原との同時検出 Ａｂｂｏｔｔ ＩＭ_x ^TM Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍ ｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＭＥＩＡ）システムを使用するが、微小粒子を使用する任 意のシステムを使用することが可能である。Ａｂｂｏｔｔ ＩＭ_x ^TM ＭＥＩＡ システ ムは、Ａｂｂｏｔｔ ＩＭ_x ^TM Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｕｓｔｏｍｅ ｒ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能）に詳細に説明されている。このアッセイでは、 実施例５で調製した０．１５％懸濁液１００μＬを、ＨＩＶ−１及び／又はＨＩ Ｖ−２抗体及び／又はＨＩＶ−１抗原を含むと推測される試験試料１００μＬと 混合し、Ａｂｂｏｔｔ ＩＭ_x ^TM 反応セル中で４０℃で１０分間インキュベー トし、反応混合物を形成する。ＨＩＶ抗体及び／又はＨＩＶ抗原が「抗体／抗原 ／微小粒子」複合体中の微小粒子に結合する。その反応混合物１５０μＬをガラ ス繊維マトリックス上に移し、微小粒子をガラス繊維マトリックスに不可逆的結 合の形で保持させる。その後で、「抗体／抗原／微小粒子」複合体を、［０．０ ５Ｍトリス（ｐＨ８．０）、２％ＢＳＡ、０．２５％サポニン、及び、０．１％ アジ化ナトリウム］中のビオチニル化組換えＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２組換えｐ ４１抗原（上記のｐＴＢ３１９、ｐＪＣ１０４）とビオチニル化Ｆ（Ａｂ′）₂ 抗ＨＩＶ−１ ｐ２４から成るプローブ５０μＬ と４０℃で１０分間反応させる。その後で、［０．１Ｍトリス（ｐＨ８．０）、 ０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．９％Ｂｒｉｊ−３５^TM、１．０％ＢＳＡ、及び、０． １％アジ化ナトリウム］中のヤギ抗ビオチンアルカリ性ホスファターゼから成る 抗体結合体５０μＬを、４０℃で１０分間、「ビオチンプローブ／抗体／抗原／ 微小粒子」複合体と反応させる。その後で、この微小粒子複合体を［０．０５Ｍ トリス（ｐＨ８．０）、０．３Ｍ ＮａＣｌ、及び、０．１％アジ化ナトリウム ］で６回洗浄し、「ビオチンプローブ／抗体／抗原／微小粒子」複合体を、基質 メチルウンベリフェリルホスファーゼ（ＭＵＰ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）５０μＬと反応させ、生成物メチ ルウンベリフェロン（ＭＵ）の蛍光を測定する。ＭＵ生成の速度は、試験試料中 の被分析物の濃度に比例している。実施例７ ＨＩＶ抗体捕獲試薬とＨＩＶ抗原捕獲試薬との各々による微小粒子の別個の被覆 この実施例では、個々の被分析物捕獲試薬で別々にポリスチレン微小粒子（Ｓ ｅｒａｄｙｎｅ Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａ ｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａより入手可能）を被覆する。ポリスチレン微小粒子 を、これらの被分析物捕獲試薬の各々によって別々に被覆するか、又は、これら の被分析物捕獲試薬を互いに様々に組み合わせて被覆する。被分析物捕獲試薬の 各々で個々の微小粒子を被覆した後に、この個々の被覆微小粒子を１つにプール しアッセイに使用する。 この実施例では、組換えＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２ ｐ４１抗原（ｐＴＢ３１ ９、ｐＪＣ１０４）で同時被覆した微小粒子とは別の微小粒子を、２つのモノク ローナル抗ＨＩＶ ｐ２４抗体（３１−４２−１９、３１−９０−２５）で同時 に被覆する。その量は様々であってよいが、一般的に、この被覆手順は実施例５ で説明した手順と殆ど同じである。［０．０１Ｍトリス（ｐＨ８．０）、０．１ ５Ｍ ＮａＣｌ］中の１０ｍｇ／ｍＬカゼインを使用して、物理的に分離した微 小粒子を５６℃で１８−２４時間に亙ってブロッキングした後に、実施例５で説 明した通りに微小粒子を再び洗浄し、まとめてプールし、［０．０５Ｍトリス（ ｐＨ８．０）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、１５％スクロース］中の０ ．０１５％懸濁液（重量／体積）に希釈する。プールする段階では、微小粒子の 使用 を最適化するようにアッセイの感度と特異性とに影響を及ぼすために、微小粒子 を様々な割合でプールする。実施例８ ＨＩＶ抗体捕獲試薬とＨＩＶ抗原捕獲試薬との各々によって別々に被覆した微小 粒子上でのＨＩＶ抗体とＨＩＶ抗原の同時検出 Ａｂｂｏｔｔ ＩＭ_x ^TM Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍ ｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＭＥＩＡ）システムを使用するが、微小粒子を使用する任 意のシステムを使用することが可能である。Ａｂｂｏｔｔ ＩＭ_x ^TM ＭＥＩＡ システムは、Ａｂｂｏｔｔ ＩＭ_x ^TM Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｕｓｔ ｏｍｅｒ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓ ｔｉｃ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂ ｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能）に詳細に説明されている。このアッセイ では、実施例５で調製した０．１５％懸濁液１００μＬを、ＨＩＶ−１及び／又 はＨＩＶ−２抗体及び／又はＨＩＶ−１抗原を含むと推測される試験試料１００ μＬと混合し、Ａｂｂｏｔｔ ＩＭ_x ^TM 反応セル中で４０℃で１０分間イン キュベートし、反応混合物を形成する。ＨＩＶ抗体及び／又はＨＩＶ抗原が「抗 体／抗原／微小粒子」複合体中の微小粒子に結合する。その反応混合物１５０μ Ｌをガラス繊維マトリックス上に移し、微小粒子をガラス繊維マトリックスに不 可逆的結合の形で保持させる。その後で、「抗体／抗原／微小粒子」複合体を、 ［０．０５Ｍトリス（ｐＨ８．０）、２％ＢＳＡ、０．２５％サポニン、及び、 ０．１％アジ化ナトリウム］中のビオチニル化組換えＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２ 組換えｐ４１抗原（上記のｐＴＢ３１９、ｐＪＣ１０４）とビオチニル化Ｆ（Ａ ｂ′）₂抗ＨＩＶ−１ ｐ２４から成るプローブ５０μＬと４０℃で１０分間反 応させる。その後で、［０．１Ｍトリス（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、 ０．９％Ｂｒｉｊ−３５^TM、１．０％ＢＳＡ、及び、０．１％アジ化ナトリウム ］中のヤギ抗ビオチンアルカリ性ホスファターゼから成る抗体結合体５０μＬを 、４０℃で１０分間、「ビオチンプローブ／抗体／抗原／微小粒子」複合体と反 応させる。その後で、この微小粒子複合体を［０．０５Ｍトリス（ｐＨ８．０） 、０．３Ｍ ＮａＣｌ、及び、０．１％アジ化ナトリウム］で６回洗浄し、「ビ オチンプローブ／抗体／抗原／微小粒子」複合体を、基質 メチルウンベリフェリルホスファーゼ（ＭＵＰ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）５０μＬと反応させ、生成物メチ ルウンベリフェロン（ＭＵ）の蛍光を測定する。ＭＵ生成の速度は、試験試料中 の被分析物の濃度に比例している。実施例９ 組換えＨＩＶ−１抗原の調製と発現 初めのＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２クローンの調製 （Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ Ｇａｌｌｏ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ ｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ，Ｌｏｔ Ｎｏ．Ｐ３−２１から得られる）ＨＩＶ−１感染ＨＴ− ９細胞から得られるゲノムＤＮＡの部分ＥｃｏＲＩ消化物をバクテリオファージ λ Ｃｈａｒｏｎ ４Ａ ＥｃｏＲＩアームと結合させ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ６ ００の中にトランスフェクションさせることによって、ＨＩＶ−１ゲノムライブ ラリーを調製した。このライブラリーを、ＨＩＶ−１ウイルスＲＮＡから作製し たｃＤＮＡとハイブリッド形成させることによってスクリーニングし、全ＨＩＶ −１ゲノムを含む単一のファージ（Ｐｈａ ｇｅ ４Ｂと呼ぶ）を得た。 Ｐｈａｇｅ ４Ｂ ＤＮＡをＫｐｎＩで消化し、ｐＵＣ１８（Ｂｅｔｈｅｓｄ ａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のＫｐｎＩ部位に結合させ た。ＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子のｐ４１領域全体を含むクローン（ｐｃＫ２と呼 ぶ）を特定し、マッピングした。 Ｐｈａｇｅ ４Ｂ ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ 部位に結合させた。全ＨＩＶ−１ ｇａｇ遺伝子を含むクローン（ｐｃＲ２３と 呼ぶ）を特定し、マッピングした。 ＨＩＶ−２プロファージ単離物Ｄ１９４５からのｅｎｖ遺伝子を含むＤＮＡフ ラグメントを、プロファージＤＮＡのλゲノムライブラリー内で特定した。この フラグメントをＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター（λ ＰＬベクター ｐＫＨ２０）のＥｃｏ ＲＩ部位の中にサブクローニングした。その結果得たプラスミドをｐＥＨ ａと名付けた。組換えＨＩＶ−１ ｇｐ４１抗原の調製 エンベロープ発現ベクターの構築は、２つの段階によるプロセスだった。第１ の段階は、ｅｎｖを含むより小さなＤＮＡフ ラグメントを含むＥ．ｃｏｌｉプラスミド（ｐ４１Ｃと呼ぶ）の構築を含んでい た。第２の段階は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｓｐ．及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓ ｐ． の両方の中で生存する能力を有する発現ベクターの構築と、ｅｎｖフラグメ ントのこのプラスミド（ｐＯＭ１０と呼ぶ）中への導入とを含んでいた。 プラスミドｐｃＫ２から得た８５４塩基対（ｂｐ）ＢｇｌII／ＢａｍＨＩ Ｄ ＮＡフラグメントを、ｐＵＣ９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＢａｍＨＩ部位に結合 させた。ｌａｃＺ遺伝子と同じ方向にｅｎｖ遺伝子の一部分を含むクローンを特 定し、マッピングし、ｐ４１Ａと名付けた。プラスミドｐｃＫ２から得た５５７ ｂｐ ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐ４１ＡのＢａｍＨＩ部 位内に結合させた。ｌａｃＺ遺伝子と同じ方向にｅｎｖ遺伝子の全ｐ４１配列を 含むプラスミドを特定し、マッピングし、ｐ４１Ｃと名付けた。 （Ｄｒ．Ｒ．Ｌｏｓｉｃｋ，Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって 開発され、ｐＶＧ１と呼ぶ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ胞子形成プロモーターｓｐｏＶＧ を含むＥ．ｃｏｌｉプラスミドをＳｍａＩで制限した。このＤＮＡフラグメント を、ＸｂａＩで予め制限しておいたＢａｃｉｌｌｕｓプラスミドｐＥ １９４内に結合させ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ１（クレノウフラグメ ント）を使用して平滑末端を形成し、「付着」ＤＮＡ末端中に充填した（平滑末 端化処理）。（ｐＡＳ５と呼ぶ）プラスミドを単離し、マッピングし、このプラ スミドがＥ．ｃｏｌｉとＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓの両方の中で生存する能力を有 することが示された。その後で、ｅｎｖ遺伝子をｐＡＳ５の中に挿入した。ｅｎ ｖ 遺伝子を含むプラスミドｐ４１ＣからのＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／Ｓａｌ Ｉ消化によって作製し、平滑末端化処理を行った。このＤＮＡフラグメン トを、ＳａｌＩで直線化し平滑末端化したプラスミドｐＡＳ５に結合させた。１ つの単離クローン（ｐＡＳ１４と呼ぶ）が、適正な方向にｓｃｏＶＧプロモータ ーに融合したｅｎｖ遺伝子を有することを確認した。 最後に、次のように、ｐＡＳ１４中のエリスロマイシン耐性遺伝子を、関連のＢａｃｉｌｌｕｓ プラスミドｐＣ１９４からのクロラムフェニコール耐性遺伝子 によって置き換えた。プラスミドｐＣ１９４のＣｌａＩ／ＤｒａＩ消化物からの クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含む１１ ０７ｂｐ ＤＮＡフラグメントを単離した。このＤＮ Ａフラグメントを、ｐＡＳ１４のＣｌａＩ／ＳｍａＩ消化（当初のエリスロマイ シン耐性遺伝子全てを取り除く処理）から単離した６４０７ｂｐ ＤＮＡフラグ メントに結合させた。得られた最終プラスミドをｐＯＭ１０と名付けた。 プロモーター領域、転写開始点、及び、リボソーム結合部位は、塩基４８４０ −４９７１に及ぶ。コーディング領域（塩基４９７２−６１８３）は、親プラス ミドｐＶＧ１のｓｐｏＶＧ領域から得られた配列（塩基４９７２−５００４）と 、ＤＮＡ連結反応中に得られた配列（塩基５００５−５０１０）と、ＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子ｇｐ１２０から得られた配列（塩基５０１１−５１４５）とから 成る（Ｒａｔｎｅｒ，Ｌ．他，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：２７７−２８４，１９８ ５）。ｐ４１配列は、塩基５１４６−６１８０である。ｅｎｖ遺伝子の天然の終 止コドン（塩基６１８１−６１８３）で翻訳を終結させる。組換えタンパク質を コードするＤＮＡ配列を、３つのロットの発酵の後に収集したプラスミドを配列 決定することによって確認した。配列決定したロットを、臨床用マスターロット 用の抗原を生産するために使用するのと同じ細胞バンクから発酵させた。 プラスミドｐＯＭ１０は、ｓｐｏＶＧタンパク質のアミノ末端から得られた１ １アミノ酸と、連結反応中のＤＮＡ操作の結果として得られた２アミノ酸と、次 のｐｌ２０エンベロープタンパク質からの最終４５アミノ酸と、ｐ４１タンパク 質配列全体とを含む融合タンパク質として、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質 を発現させる。このタンパク質を組換えｐ４１（ｒｐ４１）と呼ぶ。組換えＨＩＶ−１ ｇｐ４１融合タンパク質の調製 ＨＩＶ−１ ＣＫＳ−１２０／４１融合抗原を発現させる組換えＥ．ｃｏｌｉ クローンの構築を、複数の段階によって行った。最初に、ＨＩＶ−１抗原のｇｐ ４１部分に対応する遺伝子を合成し、改変ｐＵＣ１８の中に挿入し、プラスミド ｐＴＢ３１５を得た。その次に、ｇｐ１２０タンパク質のカルボキシル４２アミ ノ酸をコードするＤＮＡ配列を合成し、ｐＴＢ３１５の中に挿入し、プラスミド ｐＴＢ３１６を得た。最後に、ｇｐｌ２０／４１遺伝子を発現プラスミド（ｐＴ Ｂ２１０）に転移させ、抗原を融合タンパク質として効率よく発現させた。その 結果得たプラスミドｐＴＢ３１９を単離しマッピングした。 ＨＩＶ−１ ｇｐｌ６０エンベロープタンパク質のアミノ酸 ５１９−６７３とアミノ酸７１２−８６３をコードする遺伝子（Ｒａｔｎｅｒ， Ｌ．他，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：２７７−２８４，１９８５）を、ｐＵＣ１８プ ラスミド誘導体中の一連の合成ＤＮＡフラグメントから構築されるように設計し た。 １４個のフラグメントを化学的に合成し、公表されているｇｐ４１配列の一部 分を再現させた。この配列は、欠失アミノ酸６７４−７１１からの３８アミノ酸 膜貫通領域を含むアミノ酸５１９−６７３とアミノ酸７１２−８６３から成る。 １４個の合成フラグメントをｐＷＭ５００（Ｍａｎｄｅｃｋｉ及びＢｏｌｌｉｎ ｇ，Ｇｅｎｅ ６８：１０１−１０７，１９８８）の中にサブクローニングし、 精製し、互いに連結反応させ、上記融合タンパク質のｇｐ４１部分を形成させた 。しかし、アミノ酸７４１とアミノ酸７４２とにおいて、Ａ／Ｔ欠失が生じ、そ の結果、フラグメント９における１４アミノ酸フレームシフトと成熟前の翻訳終 止とが生じた。得られた合成ＤＮＡ配列は、リンカーの挿入によって破壊されるＮａｒ Ｉ部位を有する改変ｐＵＣ１８プラスミド（ｐＭＢ１０．５と呼ぶ）の中 に挿入するためのフランキングＢａｍＨＩ部位とＫｐｎＩ部位とを保持する。 ｇｐｌ２０のカルボキシ末端を表す１２９塩基対二本鎖ＤＮＡフラグメントを 合成し（３１１．３及び３１１．４）、ｐＴＢ３１５の残りのＮａｒＩ部位の中 に挿入した。このフラグメントを、ＮａｒＩで消化したプラスミドｐＴＢ３１５ の中に挿入した。ｐＴＢ３１６と呼ぶプラスミドを単離し、挿入フラグメントの 方向性がｇｐ４１遺伝子の方向性と同じであるようにスクリーニングした。 プラスミドｐＢＲ３２２から得られたこのプラスミドは、（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ ＭＰ−ＫＤ０シンテターゼ又はＣＫＳタンパク質の全２４８アミノ酸の最初の２ ３９アミノ酸をコードする）ｋｄｓＢ遺伝子フラグメントに融合した改変ｌａｃ プロモーターと、ｋｄｓＢ遺伝子フラグメントの末端に融合した合成リンカーと を含む。この合成リンカーは、遺伝子の挿入のための多重制限部位と、翻訳終止 シグナルと、ｔｒＰＡ ρ独立転写ターミネーターとを含む。このプラスミドは 、ＣＫＳの２３９アミノ酸と、上記合成リンカーによってコードされる２２アミ ノ酸とをコードする。 プラスミドｐＴＢ３１６をＢａｍＨＩとＫｐｎＩとで消化し、１０７３ｂｐフ ラグメントを単離した。このフラグメントは、 適正な位置に挿入されたｇｐｌ２０遺伝子のカルボキシル４２アミノ酸を有する 当初の合成ｇｐ４１遺伝子から構成されていた。このフラグメントを、ＢｇｌII とＫｐｎＩとで予め消化したｐＴＢ１２０の中に挿入した。その結果得たプラス ミド（ｐＴＢ３１９と呼ぶ）を単離し、マッピングした。 プロモーター領域、転写開始点、及び、リボソーム結合部位は、塩基４５−１ ２５に及ぶ。コーディング領域は、ＣＫＳタンパク質の２３９アミノ酸から得ら れた配列（塩基１２６−８４２）と、合成ポリリンカーからの１１アミノ酸（塩 基８４３−８７５）から構成されている。この後にｐｌ２０ ＨＩＶ−１ ｅｎ ｖ （塩基８７６−１００１）の４２残基とＨＩＶ−１ ｐ４１ ｅｎｖ（塩基１ ００２−１５５６）の１８５残基とが続く。膜貫通領域の３８アミノ酸欠失は、 塩基対１４６６と塩基対１４６７との間である。最後に、単一のＡ／Ｔ欠失に起 因するフレームシフトの結果としての更に別の１４アミノ酸（塩基１５５７−１ ５９８）と成熟前の翻訳終止（塩基１５９９−１６０１）とが存在する。組換え タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、３つのロットの発酵の後に収集したプラ スミドを配列決定することによって確認した。 プラスミドｐＴＢ３１９は、ＣＫＳタンパク質の２３９アミノ酸とｐＴＢ２１ ０多重制限部位リンカーからの１１アミノ酸とを含む組換えタンパク質をコード する。この後に、ＨＩＶ−１ ｐｌ２０のカルボキシル末端からの４２アミノ酸 と、ＨＩＶ−１ ｐ４１タンパク質のからの１８５アミノ酸（ｐ４１膜貫通領域 に亙るアミノ酸６７４−７１１の３８アミノ酸欠失を伴う端を切り取った（ｔｒ ａｎｃａｔｅｄ）タンパク質（Ｒａｔｎｅｒ他，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：２７７ −２８４，１９８５））とが続く。最後に、ヌクレオチド１５５６−１１５７の 間の単一のＡ／Ｔ欠失に起因するフレームシフトと成熟前の終止との結果として 生じる１４アミノ酸が存在する。このタンパク質を組換えｐＣＫＳ−４１（ｒｐ ＣＫＳ−４１）と呼ぶ。組換えＨＩＶ−１ ｐ２４抗原の調製 ｐ２４ ｇａｇ発現ベクターを複数の段階によるプロセスによって構築した。 第１の段階は、ＤＮＡフラグメントを含むより小さなｇａｇを有するＥ．ｃｏｌ ｉ プラスミドｐＢ１の構築を含んでいた。第２の段階は、効率的な発現を可能に する適正な分子シグナルを有する発現ベクター（ｐＫＲＲ９５１と呼ぶ） の構築を含んでいた。最後に、遺伝子発現の制御を可能にするために、分子情報 を上記プラスミドに加え、最終プラスミドｐＫＲＲ９５５を結果的に生じさせた 。 プラスミドｐｃＲ２３から得られた９４９ｂｐ ＰｖｕII／ＢｇｌII ＤＮＡ フラグメントを、ＨｉｎｄIIとＢａｍＨＩとで予め消化したプラスミドｐＵＣ９ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）内に結合させた。ｌａｃＺ遺伝子と同じ方向にｇａｇ遺 伝子の一部分（ｐ２４コーディング領域を含む）を含むクローンを特定し、マッ ピングし、ｐＢ１と名付けた。 その後で、ｇａｇ遺伝子ＤＮＡフラグメントを、タンパク質合成の効率的な終 結を可能にすると同時に、ｇａｇ遺伝子発現をＥ．ｃｏｌｉλファージＰ_Lプロ モーターの制御下に置く発現ベクターｐＫＲＲ８１０の中に導入した。ｇａｇ遺 伝子の大半を含む９６３ｂｐ ＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＢ１のＥｃ ｏ ＲＩ（完全）／ＰｓｔＩ（部分）消化によって得た。コード化タンパク質のア ミノ末端を再構築し且つ開始コドンの直ぐ上流にＥｃｏＲＩ部位を位置させるた めに、３６ｂｐの合成オリゴヌクレオチドＤＮＡフラグメントをｇａｇ遺伝子フ ラグメントに加えた。この改変フラグメントを発現ベクター ｐＫＲＲ８１０のＥｃｏＲＩ部位の中に挿入した。λファージＰ_Lプロモーター と同じ方向にｇａｇ遺伝子を有するクローン（ｐＫＲＲ９５０）を特定し、単離 し、マッピングした。このクローンのサイズをｐＫＲＲ９５０プラスミドのＡｐ ａ Ｉ消化と再連結反応とによって１０６ｂｐ縮小し、その結果としてｐＫＲＲ９ ５１と呼ぶプラスミドを得た。 発現ベクターの構築を完了させるために、λｃＩ _ts 調節遺伝子とＥ．ｃｏｌ ｉ λファージＰ_Rプロモーターを構築物中に組み込んだ。温度に敏感なこの遺伝 子を加えることによって、λプロモーターの制御と、従って、ｇａｇ遺伝子発現 の制御とが可能になる。λｃＩ _ts 調節遺伝子とＥ．ｃｏｌｉλファージＰ_Rプロ モーターとを含む２３９２ｂｐ ＤＮＡフラグメントを、ｐＲＫ２４８．ｃＩ _{t s} と呼ぶプラスミドのＢｇｌII消化によって得た。このフラグメントをプラスミ ドｐＫＲＲ９５１プラスミドのＢｇｌII部位に挿入し、ｐＫＲＲ９５５を得た。 プロモーター領域、転写開始点、及び、リボソーム結合部位は、塩基７７５７ −２７１に及ぶ。この領域を２つの異なったλファージ変異体と合成領域とから 得た。コーディング領域は、ｐＵＣ９からのｌａｃＺ′遺伝子のＮＨ₂末端を複 製する合成 配列（塩基２７２−３０７）と、ｐ２４配列全体（塩基３４４−１０３６）を含 むＨＩＶ−１ ｇａｇ遺伝子の一部分をコードする配列（塩基３０８−１１８３ ）と、それに続くベクターｐＫＲＲ８１０の合成３フレーム翻訳ターミネーター からの短い配列（塩基１１６９−１１８０）から構成される。このセグメント（ 塩基１１８１−１１８３）内の第３の終止コドンで翻訳を終止させる。この配列 はｒｒｎＢｔ ₁ 転写ターミネーターを示す（塩基１１８４−１２４１）。 プラスミドｐＫＲＲ９５５は、ｌａｃＺタンパク質から得られた１２アミノ酸 とｐＵＣ９ポリリンカー領域とから成る融合タンパク質を生産する。この後に、ｇａｇ タンパク質の一部分（ｐ１７タンパク質の最終の１２アミノ酸と、ｐ２４ タンパク質の全２３１アミノ酸と、ｐｌ５タンパク質の最初の４４アミノ酸とを 含む）が続く。更にこの後に、ｐＫＲＲ８１０ベクターのターミネーター部分か ら得られた４アミノ酸が続く。このタンパク質を組換えｐ２４（ｒｐ２４）と呼 ぶ。組換えＨＩＶ−２ ｇｐ３６ ｅｎｖ抗原の調製 ｒｐ４１ ＨＩＶ−２抗原を発現させるこの組換えＥ．ｃｏｌｉクローンの構 築を２つの段階によって行った。第１の 段階でＨＩＶ−２ ｅｎｖ遺伝子のフラグメントをＨＩＶ−２プロファージから 単離し、ｐＥＨａと呼ぶＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターの中にサブクローニングした 。第２の段階で、ＨＩＶ−２ ｅｎｖ遺伝子フラグメントをプラスミドｐＥＨａ から別の発現ベクターｐＴＢ２１０Ｎの中にサブクローニングし、プラスミドｐ ＪＣ１０４を得た。 ＨＩＶ−２からのｅｎｖ遺伝子を含むＤＮＡフラグメント（プロファージ単離 物Ｄ１９４．５）をプロファージＤＮＡのλゲノムライブラリー内で特定した。 このフラグメントをＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター（λＰ_LベクターｐＫＨ２０）のＥｃｏ ＲＩ部位の中にサブクローニングした。その結果得たプラスミドをｐＥＨ ａと名付けた。この作業をＤＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ，Ｎｅｉｄｅｒｈｅｉｄｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ ３，４０００ Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆによって行った（Ｋｕ ｈｎｅｌ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２３８３ −２３８７．１９８９）。 クローニングベクターｐＴＢ２１０は、組換え遺伝子がＣＫＳタンパク質に融 合することを可能にする。このプラスミドは、（Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＭＰ−ＫＤ０ シンテターゼ又はＣＫＳタン パク質の全２４８アミノ酸の最初の２３９アミノ酸をコードする）ｋｄｓＢ遺伝 子フラグメントに融合した改変ｌａｃプロモーターを含むプラスミドｐＢＲ３２ ２と、ｋｄｓＢ遺伝子フラグメントの末端に融合した合成リンカーとから成る。 この合成リンカーは、遺伝子挿入のための多重制限部位と、翻訳終止シグナルと 、ｔｒｐＡρ独立転写ターミネーターを含む。 プラスミドｐＴＢ２１０Ｎは、合成リンカー中のＮｃｏＩ部位を含み、プラス ミドｐＴＢ２１０から得られる。 プラスミドｐＥＨａをＮｃｏｌで消化し、ＨＩＶ−２ ｐ４１タンパク質の最 初の１０４アミノ酸をコードする３１４塩基対フラグメントを単離し、プラスミ ドｐＴＢ２１０ＮのＮｃｏＩ部位の中に挿入した。ｐＪＣ１０４と呼ぶこのプラ スミドは、ＣＫＳタンパク質との融合タンパク質としてＨＩＶ−２ ｅｎｖタン パク質を発現させる。 プロモーター領域、転写開始点、及び、リボソーム結合部位は、塩基４５−１ ２５に及ぶ。コーディング領域は、ＣＫＳタンパク質の２３９アミノ酸から得た 配列（塩基１２６−８４２）と合成ポリリンカーからの１３アミノ酸（塩基８４ ３−８８１）から構成される。この後に、ＨＩＶ−２ ｅｎｖのアミノ末端の１ ０４残基（塩基８８２−１１９３）と上記ポリリンカーの 残りの１５アミノ酸（塩基１１９４−１２３８）が続く。翻訳を塩基１２３９− １２４１における終止コドンで終結させる。 ＣＫＳタンパク質の最初の２３９アミノ酸と、ｐＴＢ２１０Ｎ多重制限部位リ ンカーからの１３アミノ酸と、ＨＩＶ−２ ｅｎｖタンパク質からの１０４アミ ノ酸（ＨＩＶ−２ ｅｎｖタンパク質のアミノ酸５０６−６０９）と、ｐＴＢ２ １０Ｎ多重制限部位リンカーからの更に別の１５アミノ酸とを含む組換えタンパ ク質を、プラスミドｐＪＣ１０４がコードする。このタンパク質を組換えｐ４１ ＨＩＶ−２（ｒｐ４１ ＨＩＶ−２）と呼ぶ。プラスミド宿主細胞系 上記の通りに調製したプラスミドｐＯＭ１０を、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ菌 株ＰＹ３６１のプロトプラスト（自然プラスミドのキュアリング菌株ＱＭＢ１５ ５１のプロトトロフ誘導体）にトランスフォーメーションさせ、生存可能なクロ ラムフェニコール耐性細胞を再生させた。ｒｐ４１抗原の発現をｓｐｏＶＧプロ モーターの制御下に置き、その細胞が胞子形成発育相に入る時、発現を観察した 。独立エレメントとして複製したこのプラスミドは不可動であり、細胞１個当た り約１０個から約３０個のコピー数に維持された。 上記の通りに調製したプラスミドｐＴＢ３１９を、塩化カルシウム法でコンピ テントＥ． ｃｏｌｉ Ｋ−１２ 菌株ＸＬ−１（ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｑ ｖｒＡ９６ 、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４、ｒｅｌＡ１、ｌａｃ− ／Ｆ′ 、ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩｑＺｄｅｌｔａＭ１５、ＴＮ１０）細胞にトラン スフォーメーション（形質転換）させた。この構築では、ｒｐＣＫＳ−４１タン パク質の発現はｌａｃプロモーターの制御を受けた。組換えｐＣＫＳ−４１発現 を、ＩＰＴＧを１００μｇ／ｍＬに加えることによって誘導した。独立エレメン トとして複製したこのプラスミドは不可動であり、細胞１個当たり約１０個から 約３０個のコピー数に維持された。 上記の通りに調製したプラスミドｐＫＲＲ９５５を 、塩化カルシウム法でコ ンピテントＥ． ｃｏｌｉ Ｋ−１２ 菌株ＫＲＲ１３６（Ｄｌａｃ−ｐｒｏ、ｓｕｐＥ 、ｔｈｉ−１、ｒｐｓＬ、ｓｂｃＢ１５、ｅｎｄＡ、ｈｓｄＲ４、ｌｏ ｎ−９ 、ｔｓｘ：４６２：Ｔｎ１０／Ｆ′、ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡＢ＋ｌａｃ Ｉ ｑＺｄｅｌｔａＭ１５）細胞にトランスフォーメーションさせた。この構築で は、ｒｐ２４タンパク質の発現は、λＰ_L及びλＰ_Rプロモーターと、上記プラス ミド上のｃＩ _ts 遺伝子から発現したｃＩ _ts リプレッサーとの両方の制御を受けた。組換えｐ２ ４発現を、３０℃から４２℃への温度シフトによって誘発した。独立エレメント として複製したこのプラスミドは不可動であり、細胞１個当たり約１０個から約 ３０個のコピー数に維持された。 上記の通りに調製したプラスミドｐＪＣ１０４を 、塩化カルシウム法でコン ピテントＥ． ｃｏｌｉ Ｋ−１２ 菌株ＸＬ−１（ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｑｖｒＡ９６ 、ｔｈｌ−１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕＤＥｉ４、ｒｅｌＡ１、ｌａｃ −／Ｆ′ 、ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩｑＺｄｅｌｔａＭ１５、ＴＮ１０）細胞にトラ ンスフォーメーションさせた。この構築では、ｒｐ４１ ＨＩＶ−２融合タンパ ク質の発現は、ｌａｃプロモーターの制御を受けた。組換えｐ４１ ＨＩＶ−２ 発現を、ＩＰＴＧを１００μｇ／ｍＬに加えることによって誘発した。独立エレ メントとして複製したこのプラスミドは不可動であり、細胞１個当たり約１０個 から約３０個のコピー数に維持された。 上記の通りに調製したプラスミドｐＴＢ２１０を、塩化カルシウム法でコンピ テントＥ． ｃｏｌｉ Ｋ−１２ 菌株ＸＬ−１（ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｑ ｖｒＡ９６ 、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１７ 、ｓｕｐＥ４４、ｒｅｌＡ１、ｌａｃ−／Ｆ′、ｐｒｏＡＢ、ｌａ ｃＩ ｑＺｄｅｌｔａＭ１５、ＴＮ１０）細胞にトランスフォーメーションさせた 。この構築では、ＣＫＳタンパク質の発現は、ｌａｃプロモーターの制御を受け た。ＣＫＳ発現を、ＩＰＴＧを１００μｇ／ｍＬに加えることによって誘発した 。独立エレメントとして複製したこのプラスミドは不可動であり、細胞１個当た り約１０個から約３０個のコピー数に維持された。実施例１０ １つの固相を使用するＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２抗体アッセイ 実施例３で説明した通りに、１つの固相を組換え抗原ｒｐ２４、ｒｐ４１、及 び、ｒｐ３６で被覆し、試験試料中のＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２抗体の存在を検出 するためのアッセイに使用した。このアッセイの条件は、実施例３の認可アッセ イで使用する試料体積１５０μＬの代わりに試料体積を５０μＬに減少させたこ とを除いて、実施例３で説明した条件と本質的に同じだった。３０人のヒトから 得た１２１例の希釈ＨＩＶ−２試料と、２１９４例の血漿と９８０例の血清とか ら成る新鮮なランダムドナー母集団と、１９人のヒトから得た１５３例のＨＩ Ｖ−１抗体陽転試料とに対して評価を行った。 （上記の通りの）合成ＨＩＶ−２ペプチドＩを使用したアッセイの結果を、各 々の製品に挿入された説明書に示された製造者の指示に従ってＨＩＶ抗体アッセ イ（ヒト免疫不全ウイルス１型及び２型：Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢ． ｍｅｇａｔｅ ｒｉｕｍ 、組換え抗原、Ａｂｂｏｔｔ ＨＩＶＡＢ^TM ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２ （ｒＤＮＡ）ＥＩＡ；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能）Ａｂｂｏｔｔ Ｌｉｓｔ ３Ａ７７又はＡｂｂ ｏｔｔ Ｌｉｓｔ ３Ａ１０を使用した時に同一の血清試料に関して得られた結 果と比較した。これらのアッセイのデータを下記の表３に示す。各々の穴の吸光 度を６３０ｎｍ基準を用いて４９０ｎｍで測定した。０．０２５ ０Ｄ＋陰性対 照の平均ＯＤとしてカットオフ値を設定した。血清試料／カットオフ値の値が１ より大きい場合に、血清試料を反応性（陽性）とみなした。表３では、「ＯＤ」 が光学密度の読み取り値を意味し、「Ｓ／ＣＯ」が「試料／カットオフ値」を意 味し、「結果」が試験の解釈を意味し、「ＮＣ」が陰性の対照を示し、「ＰＣ」 が陽性の対照を示す。 表３に要約した個々の試験試料結果を次の表４に示す。 上記データは、改良ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２ ｒＤＮＡ／合成ＨＩＶ−２ペプ チドＩが、ＨＩＶ−１抗体陽転（セロコンバージョン）感度を損なうことなしに ＨＩＶ−２に対する感度と特異性との向上をもたらすことを示している（下記表 ５）。 必要とする試験試料体積が上記の従来のアッセイよりも少なくてすむので、１ ５０μＬの試験試料体積を得ることが困難な環境での上記アッセイの使用が可能 だろう。しかし、いずれの試料体積であっても、従来のアッセイよりも向上した 検定結果が得られるだろう。 実施例１１ ｒＤＮＡ／合成ＨＩＶ−２ペプチド方式と３Ａ１０との比較 試験試料体積５０μＬを使用して実施例１０で説明した通りにアッセイを行っ た。同等方式を使用した。その結果を次の表６に示す。アッセイ結果は、指示薬 試薬の成分として合成ＨＩＶ−２抗原ペプチドＩを使用するアッセイにおける偽 陽性の数が、組換えＨＩＶ−２ ｇｐ３６抗原だけを指示薬として使用する場合 の偽陽性の数に比べて、著しく少ないことを示している。 実施例１２ 合成ＨＩＶ−１ペプチドによる改良アッセイを使用するＨＩＶサブタイプ特異性 の検出 下記のデータは、新たに出現するＨＩＶ菌株遺伝子型を検出するための合成Ｈ ＩＶ−１ペプチドによる改良アッセイの能力を示している。合成ＨＩＶ−１ペプ チドXIIを使用するアッセイの結果を、各々の製品に挿入された説明書に示され た製造者の指示に従ってＨＩＶ抗体アッセイ（ヒト免疫不全ウイルス１型及び２ 型：Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢ． ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、組換え抗原、Ａｂｂｏｔｔ ＨＩＶＡＢ^TM ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２（ｒＤＮＡ）ＥＩＡ；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから入手可能）Ａｂ ｂｏｔｔ Ｌｉｓｔ ３Ａ７７又はＡｂｂｏｔｔ Ｌｉｓｔ ３Ａ１０を使用し た時に同一の血清試料に関して得られた結果と比較した。これらのアッセイによ って得たデータを次の表７に示す。６３０ｎｍ参照を用いて４９０ｎｍで各々の 穴の吸光度を測定した。０．１００ ＯＤ＋陰性対照の平均ＯＤとしてカットオ フ値を設定した。血清試料／カットオフ値の値が１より大きい場合に、血清試料 を反応性（陽性）とみなした。表７で は、「Ｓ／ＣＯ」が「試料／カットオフ値」を意味し、「結果」が試験の解釈を 意味する。 この表は、サブタイプＯ試料であるカメルーン試料Ｎｏ．５とＮｏ．２が標準 アッセイでは検出されなかったが、合成ＨＩＶ−１ペプチド改良アッセイを使用 した場合に陽性と同定されたということを示している。 サブタイプＯと同定される試料に対する合成ＨＩＶ−１ペプチドXIII改良ＥＩ Ａを次の表に示す。この結果は、合成ペプチドが存在する時にサブタイプＯ抗体 に対して上記アッセイがより高い感度を有することを示している。 アッセイ条件及び／又はインキュベーション時間を変化させること、抗原捕獲 試薬、抗原プローブ試薬、抗体捕獲試薬、又は、抗体プローブ試薬の様々な組み 合わせを使用すること、並 びに、当業者に公知の他の方法、試薬、及び、条件を様々に組み合わせることに よって、本発明のアッセイを更に最適化することが可能であることが意図されて いる。例えば、ＨＩＶ ｐ２４、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｐ１７等を含む様々 な他の抗体捕獲試薬を使用することが可能である。この場合は、抗体捕獲試薬の 相違のために、異なった抗原捕獲試薬を使用することが必要だろう。こうした変 形例の全てが本発明の範囲内に含まれることが意図されている。更に、上記実施 例で説明したアッセイの幾つかは自動化システムを使用したが、手作業による方 法又は他の自動化解析装置を使用すること又は本発明のアッセイに適合化させる ことが可能であることが本発明の範囲内に含まれている。従って、本発明は添付 の請求の範囲によってのみ制限されることが意図されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ストーン，バーバラ・エル アメリカ合衆国、イリノイ・60035、ハイ ランド・パーク、デイアフイールド・ロー ド・771 (72)発明者 リウ，ダグラス・ジエイ アメリカ合衆国、イリノイ・60640、シカ ゴ、ノース・ウエイン・5447 (72)発明者 ハリントン，スーザン・ケイ アメリカ合衆国、イリノイ・60085、ウオ ーキガン、スタンリー・アベニユー・322 (72)発明者 ドーソン，ジヨージ・ジエイ アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイービル、スプルースウツド・15670 (72)発明者 ウー，ピン アメリカ合衆国、イリノイ・60035、ハイ ランド・パーク、オーク・ストリート・ 2680

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 試験試料中の１つ以上のＨＩＶ遺伝子型に対する抗体の存在又は量を検出 するためのアッセイであって （ａ）前記試験試料を、 （ｉ）固相上に付着させた、ＨＩＶ−２ ｅｎｖを含むポリペプチドである第 １の捕獲試薬、 （ii）固相上に付着させた、ＨＩＶ−１ ｅｎｖを含むポリペプチドである第 ２の捕獲試薬、及び、 （iii）固相上に付着させた、ＨＩＶ−１ ｇａｇを含むポリペプチドである 第３の捕獲試薬 と接触させ、第１の混合物を形成する段階、 （ｂ）前記第１の反応混合物を、 （ｉ）シグナル発生化合物で標識したＨＩＶ−２ ｅｎｖ抗原を含む第１の指 示薬試薬、 （ii）シグナル発生化合物で標識したＨＩＶ−１ ｅｎｖ抗原を含む第２の指 示薬試薬、及び （iii）シグナル発生化合物で標識したＨＩＶ ｇａｇ抗原を含む第３の指示 薬試薬 に接触させ、第２の反応混合物を形成する段階、並びに （ｃ）ＨＩＶ抗体／捕獲試薬／指示薬試薬複合体によって発生される全シグナル を検出することによって、前記試験試料中の前記ＨＩＶ−１ ｅｎｖ抗体、前記 ＨＩＶ−２ ｅｎｖ抗体、及び／又は前記ＨＩＶ ｇａｇ抗体の存在を決定する 段階を含む前記アッセイ。 ２． 前記第１の指示薬試薬が、ＨＩＶ−２のｇｐ３６の免疫優性領域の免疫反 応特異性特性を有する合成部位特異的ＨＩＶ ｅｎｖ抗原を含む請求項１に記載 のアッセイ。 ３． 前記合成ＨＩＶ抗原の免疫優性領域がＨＩＶ−２のｇｐ３６のＮ末端領域 からの約１２０アミノ酸である請求項２に記載のアッセイ。 ４． 前記合成部位特異的ＨＩＶ−２のｅｎｖ抗原が、２つのシステインの間で ジスルフィド架橋を形成するように化学的に環化された少なくとも２つのシステ イン残基を含む実質的に純粋なペプチドからなる請求項２に記載のアッセイ。 ５． 前記合成部位特異的ＨＩＶ ｅｎｖ抗原が、 から成る群から選択されるペプチドである請求項４に記載のアッセイ。 ６． シグナル発生化合物で標識した組換えＨＩＶ−２ ｅｎｖ抗原を含む指示 薬試薬を更に含み、前記指示薬試薬がアッセイ試験１回当たり約０．０１４マイ クログラムから約１．４マイクログラムの間で存在する請求項２に記載のアッセ イ。 ７． 前記第２の指示薬試薬が、ＨＩＶ−１のｇｐ４１の免疫優性領域の免疫反 応特異性特性を有する合成部位特異的ＨＩＶ ｅｎｖ抗原を含む請求項１に記載 のアッセイ。 ８． 前記合成部位特異的ＨＩＶ−１ ｅｎｖ抗原が、２つのシステインの間で ジスルフィド架橋を形成するように化学的に環化された少なくとも２つのシステ イン残基を含む実質的に純粋なペプチドからなる請求項２に記載のアッセイ。 ９． 前記合成部位特異的ＨＩＶ−１が、式 （式中、ａがＡｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙ ｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ又はＡｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇ ｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎであり、 ｂがＧｌｙ又はＳｅｒであり、 ｃがＩｌｅ又はＬｅｕであり、 ｄがＳｅｒ又はＬｙｓであり、 ｅがＩｌｅ又はＶａｌであり、及び、 ｆがＴｈｒ又はＴｙｒである。） のペプチドである請求項８に記載のアッセイ。 １０． 前記合成部位特異的ＨＩＶ−１が、 から成る群から選択されるペプチドである請求項９に記載のアッセイ。 １１． シグナル発生化合物で標識した組換えＨＩＶ−１ ｅｎｖ抗原を含む指 示薬試薬を更に含み、前記組換えＨＩＶ−１抗原がｇｐ１２０のカルボキシ末端 とｇｐ４１の全タンパク質配列とを含む請求項７に記載のアッセイ。 １２． 前記第３の指示薬試薬が、ＨＩＶ−１のｐ２４の免疫 優性領域の免疫反応特異性特性を有する合成又は組換えＨＩＶ ｇａｇ抗原を含 む請求項１に記載のアッセイ。 １３． 前記第１の捕獲試薬、前記第２の捕獲試薬および前記第３の捕獲試薬を 少なくとも１つの固相に結合させる請求項１に記載のアッセイ。 １４． 前記固相が、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、反応トレイの穴、微小粒子、 ナイロンストリップ、及びニトロセルロースストリップから成る群から選択され る請求項１３に記載のアッセイ。 １５． 前記第１のＨＩＶ−１ ｇｐ４１ ｅｎｖ捕獲試薬と、前記第２のＨＩ Ｖ−２ ｇｐ３６ ｅｎｖ捕獲試薬、および前記第３のＨＩＶ ｐ２４ ｇａｇ 捕獲試薬を、組換え又は合成によって生産する請求項１に記載のアッセイ。 １６． 前記ＨＩＶ抗体指示薬試薬の前記シグナル発生化合物が、酵素、発光化 合物、化学発光化合物、及び放射性元素から成る群から選択される請求項１に記 載のアッセイ。 １７． 前記酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼである請求項１６に記載のアッ セイ。 １８． 試験試料中の異なるＨＩＶ遺伝子型に対する抗体の存在又は量を同時に 検出するための試験キットであって、 （ａ）固相に付着させたＨＩＶ−１のｇｐ４１ ｅｎｖ領域の免疫反応特異性 特性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むＨＩＶ−１抗原捕獲試薬、 （ｂ）固相に付着させたＨＩＶ−２のｇｐ３６ ｅｎｖ領域の免疫反応特異性 特性を有する少なくとも１つのポリペプチドを含むＨＩＶ−２抗原捕獲試薬、 （ｃ）固相に付着させたＨＩＶのｐ２４ ｅｎｖ領域の免疫反応特異性特性を 有する少なくとも１つのポリペプチドを含むＨＩＶ抗原捕獲試薬、 （ｄ）シグナル発生化合物で標識した合成ＨＩＶ−２ ｇｐ３６ ｅｎｖ抗原 を含む指示薬試薬、 （ｅ）シグナル発生化合物で標識したＨＩＶ−１ ｇｐ４１ ｅｎｖ抗原を含 む指示薬試薬、及び （ｆ）シグナル発生化合物で標識したＨＩＶ ｇａｇ抗原を含む指示薬試薬、 を含む前記試験キット。 １９． シグナル発生化合物で標識した組換えＨＩＶ−２ ｅｎｖ抗原を含む指 示薬試薬を更に含む請求項１４に記載の試験キット。