JPH04501502A - ヒトＣ３ｂ／Ｃ４ｂレセプター （ＣＲ１） - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １４、請求項５記載の核酸ベクターからなる細胞からなる組換え細胞。

１５、請求項８記載の核酸ベクターからなる細胞からなる組換え細胞。

１６、請求項１Ｏ記載の核酸ベクターからなる細胞からなる組換え細胞。

１７、細菌からなる請求項１２．１３または１４記載の組換え細胞。

１８、ＮＲＲＬに寄託されておりそして受託番号Ｂ−１８３５５を有するエシェ リヒア・コリ。

１９、実質的に第１図に示される配列のヌクレオチド番号２８から１５３３まで からなる核酸配列。

２０、実質的に膜貫通領域を含有しないタンパク質を特徴とする請求項１９記載 の核酸配列。

２１、前記タンパク質がそれを発現する細胞により分泌される、請求項２０記載 の核酸配列。

２２、前記タンパク質がインビトロで、好中球酸化的バースト、補体仲介溶血、 またはＣ３ａおよびＣ５ａ産生を阻害する能力により検出される機能を有する請 求項２１記載の核酸配列。

２３、ＤＮＡ配列からなる請求項１９．２０または２１記載の核酸配列。

２４、ＲＮＡ配列からなる請求項１９．２０または２１記載の核酸配列。

２５、請求項１９または２０記載の配列からなる組換え核酸ベクター。

２６、請求項２１または２２記載の配列からなる組換え核酸ベクター。

２７、請求項１９記載の配列からなる組換え発現ベクタ２８、請求項２０記載の 配列からなる組換え発現ベクタ２９、請求項２１記載の配列からなる組換え発現 ベクタ３０　、　ｐＢｓｃＲｌｃ　、　ｐＢｓｃＲｌｓ　、　ｐＢＭ−ＣＲｌｃ 、　ｐＢｓｃＲ１ｃ／ｐＴＣ３ｇｐｔおよび　ｐＢｓｃＲ１ｓ／ｐＴｃｓｇｐｔ からなる群から選択される請求項２８記載の組換え発現ベクター。

３１、　ｐＴ−ＣＲｌｃｌ、　ｐＴ−ＣＲｌｃ２、ｐＴ−ＣＲｌｃ３、ｐＴ−Ｃ Ｒｌｃ４およびｐＴ−ＣＲｌｃ５からなる群から選択される請求項２８記載の組 換え発現ベクター。

３２、ＡＴＣＣに寄託されておりそして受託番号ＣＲＬ　１００５２を有する、 プラスミドｐＢｓｃＲ１ｃ／ｐＴＣ３ｇｐｔからなる組換えＤＮＡベクター。

３３、請求項１９．２０または２１記載の配列からなる組換え細胞。

３４、細菌からなる請求項３３記載の組換え細胞。

３５、請求項２５記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。

３６、請求項２６記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。

３７、請求項２７記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。

３８、請求項２８記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。

３９゜請求項２９記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。

４０、ＡＴＣＣに寄託されておりそして受託番号ＣＲＬ　１００５２を有する、 プラスミドｐＢｓｃＲ１ｃ／ｐＴＣ３ｇｐｔを担持するチャイニーズハムスター 卵巣細胞ＤＵＸ　Ｂｌｌ。

４１、実質的に第１図に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。

４２、Ｃ３ｂと結合しうることを特徴とする請求項４１記載のタンパク質のフラ グメント。４３．Ｃ４ｂと結合し４４、Ｃ３ｂおよびＣ４ｂと結合しうろことを 特徴とする請求項４１記載のタンパク質のフラグメント。

４５、ファクターＩコファクター活性を育する請求項４１記載のタンパク質のフ ラグメント。

４６、Ｃ３コンバーターゼ活性を阻害しつる請求項４１記載のタンパク質のフラ グメント。

４７、Ｃ５コンバーターゼ活性を阻害しうる請求項４１記載のタンパク質のフラ グメント。

４８、グリコジル化されている請求項４１記載のタンパク質または２４個のアミ ノ酸を含有するそのフラグメント。

４９、グリコジル化されていない請求項４１記載のタンパク質。

５０、細胞表面タンパク質として発現される請求項４１記載のタンパク質。

５１、第１図に示されるヌクレオチドの番号２８から１５３３までにより実質的 にコードされるアミノ酸配列を含有するタンパク質。

５２、請求項５１記載のタンパク質をコードする核酸配列。

５３、実質的に膜貫通ドメインを含有しない請求項５１記載のタンパク質。

５４、それを発現した細胞により分泌される、請求項５３記載のタンパク質。

５５、実質的に膜貫通領域を含有しないＣＲ１分子。

５６、それを発現した細胞により分泌される、請求項５５記載のＣＲ１分子。

５７、グリコジル化されていない請求項５５記載のＣＲ１分子。

５８、グリコジル化されている請求項５５記載のＣＲ１分子。

５９、インビトロで、好中球酸化的バースト、補体仲介溶血、またはＣ３ａおよ びＣ５ａ産生を阻害する能力により検出される機能を有する請求項５５記載０Ｃ ＲＩ分子。

６０　、　ｐＢｓｃＲｌｃ　、　ｐＢｓｃＲｌｓ　、　ｐＢＭ−ＣＲｌｃ、　ｐ ＢｓｃＲ１ｃ／ｇＴＣＳｇｐｔおよび　ｐＢｓｃＲ１ｓ／ｐＴＣＳｇｐｔからな る群から選択される核酸ベクターによりコードされる請求項５５記載０ＣＲＩ分 子。

６１　、ｐＴ−ＣＲｌｃｌ、ｐＴ−ＣＲｌｃ２、ｐＴ−ＣＲｌｃ３、ｐＴ−ＣＲ ｌｃ４およびｐＴ−ＣＲｌｃ５からなる群から選択される核酸ベクターによりコ ードされる請求項５５記載のＣＲ１分子。

６２、ＡＴＣＣに寄託されておりそして受託番号ＣＲＬ　１００５２を有する、 プラスミドｐＢｓｃＲ１ｃ／ｐＴＣＳｇｐｔを担持するチャイニーズハムスター 卵巣細胞ＤＵＸ　Ｂｌｌにより発現される、請求項５５記載のＣＲ１分子。

６３、請求項４１記載のタンパク質をその表面に発現する組換え細胞。

６４、請求項４２．４３または４５記載のタンパク質を発現する組換え細胞。

６５、請求項５１記載のタンパク質を発現する組換え細胞。

６６、請求項５５記載のタンパク質を発現する組換え細胞。

６７、請求項５６記載のタンパク質を発現する組換え細胞。

６８．２４個のアミノ酸からなる請求項３６記載のタンパク質の、細胞により分 泌されるフラグメントを発現する組換え細胞。

６９．　（ａ）ＣＲＩタンパク質またはそのフラグメントからなる試料を得； （ｂ）該試料をカチオン交換高圧液体クロマトグラフィーにかけ：そして （Ｃ）該高圧液体クロマトグラフィーカラムからタンパク質またはそのフラグメ ントを溶離する、ことを含んでなるＣＲＩタンパク質またはそのフラグメントの 精製法。

７０゜工程（ｃ）の後に （ｄ）前記タンパク質またはそのフラグメントをアニオン交換高圧液体クロマト グラソイ−にかけ；そして（ｅ）工程（ｄ）の高圧液体クロマトグラフィーカラ ムからタンパク質またはそのフラグメントを溶離する１、１−とをさらに含んで なる、請求項６９記、載の方法。

７１、ＣＲ１タンパク質またはそのフラグメントが実質的に膜貫通ドメインを含 有しない請求項６９または７０記載の方法。

７、２．　（ａ）ＣＲ１分子が分泌されるよ・うな様式で、培養中の細胞におい て、実質的に膜貫通ドメインを含有しないＣＲ１分子を発現させ： （ｂ）ＣＲ１分子からなる細胞培養液の試料を得；（Ｃ）該試料をカチオン交換 高圧液体クロマトグラフィーにかけ；そして （ｄ）該高圧液体クロマトグラフィーカラムからＣＲ１分子を溶離する、 ことを含んでなるＣＲ１分子の精製法。

７３、工程（Ｃ）の後に （ｄ）前記分子をアニオン交換高圧液体クロマトグラフィーにかけ；そして （ｅ）工程（ｄ）の高圧液体クロマトグラフィーカラムから該分子を溶離する、 ことをさらに含んでなる請求項７２記載の方法。

７４、請求項１２記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

７５、請求項１３記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

７６４請求項１４記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

７７、請求項１５記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

７８゜請求項３３記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

７９゜請求項３４記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

８０、請求項３５記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

８１、請求項３６記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

８２、請求項３７記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

８３、請求項３８記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

８４、請求項３９記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

８５、請求項４０記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。

８６、請求項゛４１記載のタンパク質または２４個のアミノ酸からなるそのフラ グメントを患者に投与することを含んでなる、免疫障害または望ましからぬかま たは不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の治療法。

８７、請求項４２または４３記載のフラグメントを患者に投与することを含んで なる、免疫障害または望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有 する患者の治療法。

８８、請求項４５記載のフラグメントを患者に投与することを含んでなる、免疫 障害または望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を育する患者の 治療法。

８９、請求項５１，５３または５４記載のフラグメントを投与することを含んで なる、免疫障害または望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有 する患者の治療法。

９０、請求項５５記載の分子を患者に投与することを含んでなる、免疫障害また は望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の治療法。

９１、請求項５６記載の分子を患者に投与することを含んでなる、免疫障害また は望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の治療法。

９２、請求項５９記載の分子を患者に投与することを含んでなる、免疫障害また は望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の治療法。

９３、請求項６２記載の分子を患者に投与することを含んでなる、免疫障害また は望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の治療法。

９４、請求項４１記載のタンパク質または２４個のアミノ酸からなるそのフラグ メントを患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起因する患者の損傷を治 療または予防する方法。

９５、請求項５５記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起 因する患者の損傷を治療または予防する方法。

９６、請求項５６記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起 因する患者の損傷を治療または予防する方法。

９７、請求項５９記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起 因する患者の損傷を治療または予防する方法。

９８、請求項６０または６１記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心 筋梗塞に起因する患者の損傷を治療または予防する方法。

９９、請求項６２記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起 因する患者の損傷を治療または予防する方法。

１００、請求項４１記載のタンパク質または２４個のアミノ酸からなるそのフラ グメントを患者に投与することを含んでなる、炎症に起因する患者の損傷を治療 または予防する方法。

１０１、ｆｆ請求項５５記載分子を患者に投与することを含んでなる、炎症に起 因する患者の損傷を治療または予防する方法。

１０２゜請求項５６記載の分子を患者に投与することを含んでなる、炎症に起因 する患者の損傷を治療または予防する方法。

１０３、請求項５９記載の分子を患者に投与することを含んでなる、炎症に起因 する患者の損傷を治療または予防する方法。

１０４、請求項６０または６１記載の分子を患者に投与することを含んでなる、 炎症に起因する患者の損傷を治療または予防する方法。

１０５゜請求項６２記載の分子を患者に投与することを含んでなる、炎症に起因 する患者の損傷を治療または予防する方法。

明細書 ヒトＣ３ｂ／Ｃ４ｔ＋レセプター（ＣＲＩ）米国法典３５、＠　２０２（Ｃ）の 規定に従って、アメリカ合衆国政府がこの発明について権利を有することをこご に承認する。この発明の基金の一部はＮＩＨから拠出されている。

１、序論 本発明は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂレセプター（ＣＲＩ）遺伝子およびそのコードするタ ンパク質に関する。また本発明はＣＲ１核酸配列およびその７０ヌクレオチドを 含んでなるフラグメントおよび２４アミノ酸を含んでなるそれらがコードするペ プチドまたはタンパク質にも関する。また本発明はＣＲＩタンパク質およびその フラグメントの発現も提供する。ＣＲＩ核酸およびタンパク質は補体機能および 種々の炎症性および免疫障害にかかわる障害の診断または治療に用途を有する。

２、発明の背景 ２．１．補体系 補体系はヒト正常血清におけるグロブリンの約１０％を構成する一部のタンパク 質である（Ｈｏｏｄ、　Ｌ、Ｅ、、ら、１９８４、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　２ ｄ　Ｅｄ、、　Ｔｈｅ　Ｂｅｎｊａｍｉｎ／ＣｕｍｍｉｎｇｓＰｕｂｌＣｕｍｍ １ｎ　Ｃｏ、、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　ｐ、　３ ３９）。

補体（Ｃ）は免疫およびアレルギー反応の仲介において重要な役割を果す（Ｒａ ｐｐ、　Ｈ，Ｊ、およびＢｏｒｓｏｓ、　Ｔ、１９７０゜Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　Ａｃｔｉｏｎ、　Ａｐｐｌｅｔｏｎ −Ｃｅｎｔｕｒｙ−Ｃｒｏｆｔｓ　（Ｍｅｒｅｄｉｔｈ）、　Ｎｅｒ　Ｙｏｒｋ ）　ｏ補体成分の活性化により、補体依存性疾患と関連した炎症を仲介する化学 走性的ペプチドを包含する一部のファクターの生成にを生ずる。補体カスケード の連続的活性化は抗原−抗体複合体が関わる主経路経由にてまたは特定の細胞壁 多糖類の認識が関わる副経路により起る。

活性化された補体タンパク質により仲介される活性は、標的細胞の溶解、化学定 性、オプソニン作用、脈管および他の平滑筋細胞の刺激およびマスト細胞の脱顆 粒反応、小血管の透過性の増大、白血球遊走の支配、およびＢリンパ細胞および マクロファージの活性化のような機能的異常を包含する（Ｅｉｓｅｎ、　Ｈ，Ｎ 、、　１９７４゜Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｈａｒｐｅｒ　＆　Ｒｏｗ　Ｐｕｂ ｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｉｎｃ、　Ｈａｇｅｒｓ−ｔｏｗｎ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、 　ｐ、５１２）。

タンパク分解カスケード段階中に、生物学的に活性のあるペプチドフラグメント 、アナフィラトキシンＣ３ａ　５Ｃ４ａ　、およびＣ５ａ　（ＷＨＯ５ｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ　Ｇｒｏｕｐ。

１９７７、　ＷＨＯＴｅｃｈ、　Ｒｅｐ、　Ｓｅｒ、　６０６：５およびそこに 引用した参考文献を参照）が第３　（Ｃ３）、第４　（Ｃ４）、および第５　（ Ｃ５）の本来備わっている補体成分から放出される（Ｈｕｇｌｉ、　Ｔ、Ｅ、、 　１９８１．　ＣＲＣＣｒ１ｔ、Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　ｌ：３２１　； 　Ｂｕｌｔ、　Ｈ，およびＨｅｒｍａｎ、　Ａ、Ｇ、、　１９８３．　Ａｇｅｎ ｔｓＡｃｔｉｏｎｓ　１３　：　４０５）。

２．２．　Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター（ＣＲＩ）ＣＲＩと呼ばれる、ヒトＣ ３ｂ／Ｃ４ｂレセプターは、赤血球、単球／マクロファージ、顆粒球、Ｂ細胞、 いくつかのＴ細胞、牌臓濾胞性樹状細胞および糸球体足細胞に存在する（Ｆｅａ ｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、　１９８０．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５２：２０ 、　Ｗｉｌｓｏｎ、Ｊ、Ｇ、、ら、１９８３゜Ｊ、Ｉ＋ｎｍｕｎｏ１．　１３１ ：６８４；Ｒｅｙｎｅｓ、　Ｍ、、ら、１９８５．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３５： ２６８７；　Ｇｅ１ｆａｎｄ。

Ｍ、　Ｃ，、ら、１９７６、　Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、　Ｍｅｄ、　２９５：１０； 　Ｋａｚａｔｃｈ−ｋｉｎｅ、　Ｍ、Ｄ、、ら、１９８２．　ＣＨｎ、Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ。

２７：１７０）。ＣＲＩはＣ３ｂ、　Ｃ４ｂおよび１Ｃ３ｂに特異的に結合する 。レセプターの可溶性形態は、リガンド結合活性お　よび膜関連ＣＲＩと同じ分 子量を有する血しょう中に見い出されている（Ｙｏｏｎ、　Ｓ、Ｈ，およびＦｅ ａｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、。

１９８５、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３４：３３３２）　、　ＣＲＩは免疫複 合体および他の補体活性化因子に共有的に結合しているＣ３ｂおよびＣ４ｂに結 合し、これらの相互作用の結果はレセプターを担持している細胞型の如何による （Ｆｅａｒｏｎ。

Ｄ、　Ｔ、およびＷｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、、　１９８３．　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　 Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１：２４３）。赤血球ＣＲＩは肝臓に輸送するために免疫複 合体に結合する（Ｃｏｒｎａｃｏｆｆ、　Ｊ、Ｂ、、ら、１９８３．　Ｊ、　Ｃ ｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、７１：２３６；　Ｍｅｄｏｆ、　Ｍ、Ｅ、、ら、１９８２．　Ｊ 、　Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、　１５６：　１７３９）　、好中球および単球上のＣＲＩは表面をおお われたくぼみを通して吸着的細胞内取り込みか（Ｆｅａｒｏｎ、Ｄ、Ｔ、ら、１ ９８１．　Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１５３：１６１５；Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ、 　Ｄ、Ｒ，およびＦｅａ、ｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、　１９８３．　Ｌａｂ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　４８：　１６２）またはホルボールエステル、化学定性ペプチ ド、またはフィブロネクチンおよびラミニンのような細胞外マトリックス中に存 在するタンパク質によるレセプターの活性化後の食作用により（Ｎｅｗｍａｎ。

＋：Ｌ　Ｌ、１ら、１９８０．　Ｊ、ｒｍｍｕｎｏｌ、１２５：　２２３６；　 Ｗｒｉｇｈｔ、Ｓ。

Ｄ、および５ｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ、　Ｓ、Ｃ，、１９８２，Ｊ、　Ｅｘｐ、　 Ｍｅｄ、　１５６：１１４９；　Ｗｒｉｇｈｔ、　Ｓ、Ｄ、、ら、１９８３．　 Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１５８：１３３８）結合複合体を内在化させる。ＣＲ Ｉのリン酸化は食作用活性を獲得する役割を有しつる（Ｃｈａｎｇｅｌｉａｎ、 　Ｐ。

Ｓ、およびＦｅａｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、　１９８６．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ 、　１６３：１０１）。

これらの細胞をＣＲＩに対する抗体で処理することによりポークライードマイト ジェンの最適に近い投与量に対する細胞の応答は強化されるが、Ｂリンパ細胞に およぼすＣＲＩの機能は、あまり定義づけられていない（Ｄａｈａ、　Ｍ、Ｒ， 、ら、１９８３．　Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ、１６４：２２７（Ａｂｓｔｒ、）） 。

濾胞性樹状細胞上のＣＲＩは抗原提示役割をしている可能性がある（Ｋｌａｕｓ 、　Ｇ、　Ｇ、　Ｂ、　、ら、１９８０．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ。

５３：３）。

またＣＲＩは主経路および副経路のＣ３／Ｃ５コンバーターゼを阻害し、ファク ターＩによるＣ３ｂおよびＣ４ｂの切断のためのコファクターとして作用する。

このことはＣＲＩが、レセプターとしての役割の他に補体調節機能をも有するこ とを示す（Ｆｅａｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ。、　１９７９．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７６：５８６７；　ｌ１ｄ ａ、　Ｋ、およびＮｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ、　Ｖ、、　１９８１．　Ｊ、　ＥＸ Ｉ）、　Ｍｅｄ、　１５３：１１３８）。

補体活性化の副経路において、二分子複合体Ｃ３ｂ、　ＢｂはＣ３活性化酵素（ コンバーターゼ）である。ＣＲＩ（およまたＣ３ｂ、　Ｂｂの解離も促進しうる 。さらにＣ３ｂ、　ＣＲＩ（およびＣ３ｂ５Ｈ）の形成はＣ３ｂをファクターＩ による不可逆的タンパク質分解的不活性化の作用を受けやすくする。その結果不 活性化されたＣ３ｂ（ｉｃ３ｂ）の形成を生ずる。補体活性化の主経路において 、複合体Ｃ４ｂ、２ａはＣ３コンバーターゼである。ＣＲＩ（および高濃度で、 Ｃ４結合タンパク質、Ｃ４ｂｐ）はＣ４ｂに結合でき、そしてまたＣ４ｂ、　２ ａの解離も促進しつる。この結合は、Ｃ４ｂをファクターエによる、Ｃ４ｃおよ びＣ４ｄ（不活性化補体タンパク質）への切断を介した不可逆的タンパク分解的 不活性化の作用を受けやすくする。

ＣＲＩは単一のポリペプチド鎖で構成される糖タンパク質である。ＣＲＩの４種 のアロタイプ形態が知られており、〜４０．０００−５０．０００ダルトンずつ 増大する分子量差がある。２種の最もよくある形態はＦおよびＳアロタイプで、 ＡおよびＳアロタイプとも呼ばれ、分子量それぞれ２５０　＋　０００および２ ９０．０００ダルトン有し、（Ｄｙｋｍａｎ。

Ｔ、　Ｒ，、ら、１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　 Ｕ、Ｓ、Ａ。

８０　：　１６９８；　Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、、ら、１９８３．　Ｊ、Ｃｌ１ｎ 、Ｉｎｖｅｓｔ。

７２　：　６８５）　２種のよりまれな形態は分子量２１０．０００および＞　 ２９０．０００ダルトンを有する（Ｄｙｋｍａｎ、　Ｔ、Ｒ，、ら、１９８４、 Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１５９：６９１；　Ｄｙｋｍａｎ、　Ｔ、Ｒ，、ら、 １９８５゜Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３４：１７８７）、これらの相異は、グリ コジル化の状態というよりむしろ、明らかにＣＲＩのボリペブ′チド鎖における 変異を示している。なぜなら、それらは精製されたレセプタータンパク質をエン ドグリコシダーゼＦで処理することによりなくすことはできず、（Ｗｏｎｇ、　 Ｗ、Ｗ、、ら、１９８３．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、７２：６８５）そ れらは、レセプターアロタイプがツニカマイシンの存在下で生合成された場合に 観察されたからである（Ｌｕｂｌｉｎ、　Ｄ、Ｍ、、ら、１９８６．　Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６１：５７３６）。

４種のＣＲＩアロタイプの全ては、Ｃ３ｂ結合活性を有する（Ｄｙｋｍａｎ、　 Ｔ、Ｒ，、ら、１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、８０：１６９８；　Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、、ら、１９８３．　Ｊ、 　Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　７２：６８５；　Ｄｙｋｍａｎ、Ｔ、Ｒ，、ら、１９８４．　 Ｊ、　Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、１５９　：　６９１；Ｄｙｋｍａｎ　Ｔ、Ｒ，、ら、１９８５．　Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１３４：１７８７）。

ＣＲＩ　ｃＤＮＡの２つの非重複制限フラグメントは高い緊縮条件の下でクロス ハイブリダイズすることを示した（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、、ら、１９８５．　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２ニア７１１）。また両ｃＤＮＡプローブはゲノムＤＮＡの多 数の制限フラグメントにもハイブリッド形成し、ここで大部分のフラグメントは 両プローブに共通で゛　ある（同上）。ＣＲＩ内の反復コード配列の存在は配列 比較により確認された（Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｌ、Ｂ、、ら、１９８５゜Ｃ ｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　２：４４　（Ａｂｓｔｒ、））　ｏさらに、ＣＲＩ遺伝子 は、いくつかのゲノム制限フラグメントに対するコード配列を欠くゲノムプロー ブがクロスハイブリダイゼーションを示したことにより、反復的仲介配列を有す ることを示しているｏ　（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、、ら、１９８６．　Ｊ、　Ｅｘ ｐ、　Ｍｅｄ。

１６４：１５３１）。さらに、比較的大きなＳアロタイプを有する固体からのＤ ＮＡは、Ｆアロタイプを有する個体からのＤＮＡと比較した場合、このゲノムプ ローブにハイブリッド形成する付加的な制限フラグメントを有した。

このことはゲノム配列の重複は高分子量ＣＲＩ対立遺伝子との関連において起る ことを示している（同上）。

ＣＲＩは補体レセプター２型（ＣＲ２）との相同性を存することが示されている （Ｗｅｉｓ、　Ｊ、Ｊ、、ら、１９８６．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３　：　５６３９−５６ ４３）。

２．３．ヒトの疾患におけるＣＲＩの異常全身性紅斑性狼癒（ＳＬＥ）を有する 患者の赤血球上のＣＲ１発現の減少は、日本（Ｍｉｙａｋａｗａら、１９８１． 　ｔ、ａｎｃｅｔ２：４９３−４９７；　Ｍｉｎｏｔａら、１９８４．　Ａｒｔ ｈｒ、Ｒｈｅｕｍ、２７：１３２９−１３３５）、アメリカ合衆国（Ｉｉｄａら 、１９８２．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ。

１５５：１４２７−１４３８；　Ｗｉｌｓｏｎら、１９８２．　Ｎ、　Ｅｎｇｌ 、　Ｊ、　Ｍｅｄ。

３０７　：　９８１−９８６）およびヨーロッパ（Ｗａｌｐｏｒｔら、１９８５ ゜Ｃｌ１ｎ、Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、５９：５４７；　Ｊｏｕｖｉｎら、１９ ８６．　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ３：８８−９６ＨＨｏｌｍｅら、１９８６．　Ｃ ｌ１ｎ、　Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

６３：　４ｌ−４８）を包含する、いくつかの地域から研究者より報告されてい る。ひとグループとしてとらえると、患者は細胞当りのレセプターの平均数は正 常な人々のそれの５０−６０％である。初期の報告では、赤血球上のＣＲＩの数 は、疾患活動度とは逆に変化する、すなわち、ＳＬＥの最も症状のひどい期間中 は最も低い数で、高い数は同じ患者の寛解期中に観察されたことに注目している （Ｉｉｄａら、１９８２．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５５：１４２７−１ ４３８）。

またＣＲＩＯ数は免疫複合体の血清中レベル、Ｃ３ｄの血清中レベル、および補 体活性化性免疫複合体の取り込みおよび“無害な傍観者”として赤血球上に置か れていることをおそらく反映している赤血球結合Ｃ３ｄｇの量と逆相関関係する ことが知られている（Ｒｏｓｓら、１９８５゜Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３５：２ ００５−２０１４；　Ｈｏｌｍｅら、１９８６．　Ｃｌ１ｎ。

Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６３：４１−４８；　Ｗａｌｐｏｒｔ　ら、　１９ ８５．　Ｃｌ１ｎ。

Ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　５９：５４７）　Ｏ赤血球上にＣＲＩを欠＜　Ｓ ＬＥ患者はＣＲＩに対する自己抗体を有することが見い出された（Ｗｉ　１ｓｏ ｎら、１９８５．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、７６：１８２−１９０） 。

抗ＣＲＩ抗体の力価の減少と患者の臨床状態の改善およびレセプター異常の部分 的後退とは一致する。抗ＣＲＩ抗体は他の２人のＳＬＥ患者で検出されている（ Ｃｏｏｋら、１９８６、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｐａｔ ｈｏｌ、３８＋１３５−１３８）。

最近、活動期ＳＬＥおよび溶血性貧血の組み合わさった状態において赤血球ＣＲ Ｉが後天的に失なわれることが、輸血赤血球のレセプターが迅速に失なわれるこ とが観察されたことにより示された（Ｗａｌｐｏｒｔら、１９８７．　Ｃｌ１ｎ 。

また赤血球からＣＲＩが相対的に失われることは、ヒト免　疫不全ウィルス（Ｈ ＩＶ）感染患者（Ｔａｕｓｋ、　Ｆ、Ａ、。

ら、１９８６．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７８：９７７−９８２） およびらい腫らい患者にも観察される（Ｔａｕｓｋ、　Ｆ、Ａ、、ら、１９８５ ゜Ｊ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔ、　８５：５８ｓ−６１ｓ）。

ＳＬＨにおける補体レセプター発現異常は赤血球ＣＲＩに限定されない。ＳＬＥ 患者の好中球の全細胞ＣＲＩおよびＢリンパ細胞の原形質膜ＣＲＩの相対的欠乏 が起るこ示されている（Ｗｉ　１ｓｏｎら、１９８６．　Ａｒｔｈｒ、　Ｒｈｅ ｕｍ、　２９ニア３９−７４７）。

ＩＶ型ＳＬＥ腎炎を育する患者では、検出できるＣＲＩ抗原の全てが足細胞から 失なわれているが、一方ＳＬＥ腎炎のややひどくない種類、および膜増殖性糸球 体腎炎Ｉ型および■型を包含する増殖性腎炎の非ＳＬＥ種においては、糸球体足 細胞上０ＣＲＩ発現は正常とは相異しない（Ｋａｚａｔｃｈｋｉｎｅら、１９８ ２．　Ｊ、　ＣＬｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ。

６９：９００−９１２；　Ｅｍａｎｃｉｐａｔｏｒ　ら、１９８３．　Ｃｌ１ｎ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

ｒｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、　２７：１７０−１７５）　ｏ　しかしながら、Ｉ Ｖ型ＳＬＥ腎炎を有する患者は、他の種類の腎臓狼癒を有するかまたは全く腎炎 のない他の型を有するＳＬＥ患者よりも赤血球ＣＲＩＯ数が少なくはない（Ｊｏ ｕｖｉｎら、１９８６゜Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　３：８Ｂ−９６）。

インビボにおける補体活性化は好中球の原形質膜のＣＲ１発現をアップレギュレ ートする（Ｌｅｅ、　Ｊ、、ら、１９８４、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、　５６：２０５−２１４；　Ｍｏｏｒｅ、　Ｆ、Ｄ、。

Ｊｒ、　、ら、１９８６．　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１４：９４ ８−９５３）。

３、発明の要約 本発明は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂレセプター（ＣＲＩ）遺伝子およびそのコードするタ ンパク質に関する。また本発明はＣＲ１核酸配列およびそれの７０ヌクレオチド を含んでなるフラグメントおよび２４アミノ酸を含んでなるそれらがコードする ペプチドまたはタンパク質にも関する。本発明はＣＲＩタンパク質およびそのフ ラグメントの発現も提供する。本発明の遺伝子およびタンパク質は補体活性およ び種々の免疫系および炎症性障害にかかわる障害の診断および治療に用途を有す る。

下記の実施例の項に詳記している本発明の詳細な実施態様において、完全な長さ のＣＲＩ　ｃＤＮＡおよびそのフラグメントのクローニング、ヌクレオチド配列 および推定アミノ酸配列が記載され。ＣＲＩタンパク質およびそのフラグメント の発現もまた記載されている。Ｃ３ｂおよび／またはＣ４ｂに対する結合部位を 含み、ファクターエコファクター活性を示すＣＲＩタンパク質およびそのフラグ メントの発現が得られる。

また下記の実施例中に記載しているのは、可溶性ＣＲ１分子の産生および精製で あり、これら分子は炎症性反応の治療および心筋梗塞の大きさの減少および再潅 流損傷の予防に治療上有用であることが示される。

３．１．定義 Ａｄ２ＭＬＰ＝アデノウィルス２主要後期プロモーターＣ＝補体 Ｃ３（ｍａ）＝メチルアミン処理Ｃ３ Ｃ４ｂｐ　＝　Ｃ４結合タンパク質 ＣＭＶ　＝サイトトルメガロウィ′ルスＣＲＩ　＝補体し・セッター１型、Ｃ３ ｂ／　Ｃ４ｂレセプターＣＲ２＝補体レセプター２型 ＤＣＦＤＡ−ジクロロフルレオし・セイニ／ジ了セテ−１・Ｈ円、Ｃ−高速液体 り［１マドグラフ、イー１ｃ３ｂ　＝不活性化に３ｈ ｉ、ＨＲ＝長い相同性反復 ｍＡｂ　＝モノクローナル抗体 ＰＡＧＥ　＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＲＰＡＲ＝逆受動アルチュス反復 ＳＣＲ＝短いコンセンサス反復 ５ＣＲＩ　＝可溶性ＣＲＩ分子 ４、図面の説明 第１図、全ＣＲＩコード領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。この配列はク ローンλＴ１０９．１のオクタマー　ＥｃｏＲＩリンカ−に続く第１番目のヌク レオチドで始まる。この配列のヌクレオチド番号１５３１は第３図に示される配 列のヌクレオチド番号ｌの５°側の第１番目のヌクレオチドである。ｍＲＮＡに 相当するストランドが示されており、推定アミノ酸配列が下に示されている８ヌ クレオチド番号２８−１４７によりコードされる推定のシグナル配列をブラケッ トに入れである。

第２図。ヒトＣＲＩ　ｃＤＮＡの５．５　Ｋｂの制限地図。黒い棒線はｃＤＮＡ を示し、制限部位はＨ，Ｈｉｎｄｌｌｌ　Ｂ、　ＢａｍＨＩ；Ｒ，ＥｃｏＲＩ； 　Ｐ、　ＰｓｔＩ　；　Ａ、　Ａｐａｌ；　Ｓ、　５ａｅｌ；　Ｇ、　Ｂｇｌｌ Ｉ；に−Ｋｐｎｌである。その配列が由来するｃＤＮＡ、クローンを地図の下に 示す。矢印はジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法による配列分 析の方向および程度を示す。ｅＤＮＡクローンは制限地図および重複する配列の 同一性に基づき方向づけだ。

第３図、ヒトＣＲＩ　ｅＤＮＡの５．５Ｋｂのヌクレオチド配列。

ｍＲＮＡに相当するストランドが示されており、そして塩基番号１　（第１図の 塩基番号１５３２に相当）は最も５゛側クローンのＥｃｏＲＩリンカ−の後の第 １番目の塩基である。終止コドンには下線が付しである。ボックス中の１ｉｏｂ ｐ配列はヌクレオチド１４７と１４８の間に見られ（矢印）、そして介在配列の 一部分であると考えられている。

第４図、ヒトＣＲＩ　ｃＤＮＡの５．５　Ｋｂのヌクレオチド配列のドツト　マ トリックス分析。ドツトは９０ｂｐのうち少なくとも４０ｂｐの一致が存在する 場合にプロットした。

正方形を対角線に三等分している黒い線はそれ自身との配列の同一性を示す。同 一性の線から１．３５および２．７Ｋｂにある２本の付加的な平行した黒い線は それぞ゛れ１．．３５Ｋｂの２つの直接縦列した長い相同反復（ＬＨＲ）である 。２つのＬＨＲの間にある６個のより細い点線は〜０、２　Ｋｂの短いコンセン サス反復に相当する。この短いコンセンサス反復（ＳＣＲ）は長い相同反復を０ ．４　Ｋｂこえている。

第５図、ヒトＣＲＩの推定アミノ酸配列。各残基を１文字コードで示す（Ｌｅｈ ｎｉｎｇｅｒ、　Ａ、Ｌ、　１９７５．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ−ｓｔｒｙ、　２ｎ ｄ　Ｅｄ、、　Ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ。

Ｐ、　７２）。長い相同反復中の残基はそれらの相同性を示すために整列させで ある。ＬＨＲ−Ｂ中のすべての残基が示されており、そしてｌ、ＨＲ−Ｃおよび ＬＨＲ−Ｄの残基はそれがＬＨＲ−Ｂの残基と異なる個所のみ示されている。ヒ トロバジ−プロフィルは推定膜貫通領域を示すためにタンパク質のＣ０ＯＨ末端 の下に並べである。疎水性配列の直後の４つの陽性荷電した残基部分の上にライ ンを付しである。表皮成長因子レセプター中のプロティンキナーゼＣ燐酸化部位 と６７％の相同性を存する６アミノ酸配列には下線が付しである。ＣＲＩタンパ ク質の概略図を配列の上に示す。（ＴＭ）膜貫通領域、（Ｃｙｔ）細胞質内領域 、（３°ＬＩＴ）３′非翻訳配列。

第６図、　（Ａ）　ＣＲＩのＳＣＲの整列。反復部はＮＨ，末端からＣ０ＯＨ末 端の方へ１−２３と番号付けしである。整列を最大限に合致させるためにスペー スを設けである。ボックスは不変残基を表わしそして垂直矢印はアミノ酸保存部 分を示す。残基または保存置換がＳＣＲの少くとも半分に存在する場合に、その 残基は保存されていると見なされる。水平矢印はやはりＣＲＩゲノムクローン２ −３８から配列されそして１つのエキソンによりコードされるＳＣＲを示す。（ Ｂ）ゲノムクローンλ２−３８の制限地図、配列法、および部分配列を示す。制 限部位は、（Ｂ）ＢａｍＨＩ、　（Ｓ）ＳａｃＩ、　（Ｅ）ＥｃｏＲＶ、　（Ｋ ）Ｋｐｎｌ、　（Ｐ）Ｐｓｔｌである。

水平矢印は配列決定の方向および程度をそして垂直矢印はエキソンーイントロン 境界を示す。

第７図、この構造を有することが知られているタンパク質のＳＣＲのコンセンサ ス配列の整列。整列を最大限に合致させるためにスペースを導入した。残基が存 在する場合は他のタンパク質の少くとも半分でそれが保存されているものである １個または２個のＳＣＲを有するタンパク質を除き、残基は第５図におけると同 様に保存されていると見なされる。点線は非保存部分に相当する。ＣＲ２および Ｃ２ｂの下線部分はこれらのタンパク質に関しこの領域では何らの配列情報も刊 行されていないことを示す。ボックスは不変半シスチンを示す。配列の右方向の 番号はコンセンサス配列を生成させるのに用いられるＳＣＲの番号を示す。コン センサス配列を決定するのに用いられる配列データに関するタンパク質略語およ び参照は次のとおりである：　（ＣＲＩ）補体レセプタータイプ１．（Ｈ）ファ クターＨ（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、　Ｔ、、ら、１９８６．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、１３６：３４０７）、（Ｃ４ｂｐ）Ｃ４結合タンパク質（Ｃｈｕｎｇ、　ｌ 、Ｐ、、ら、１９８５．　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ、　２３０：１３３）、　（ＣＲ２）補体レセプタータイプ２　（Ｗｅｉｓ。

Ｊ、　Ｊ、　、ら、１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３：５６３９）、　（Ｂａ）ファクターＢのタンパク分解フラ グメント（Ｍｏｒｌｅｙ、　Ｂ、Ｊ、およびＣａｍｐｂｅｌｌ、　Ｒ，Ｄ、、１ ９８４．８ＭＢＯＪ、　３：１５３）、　（Ｃ２ｂ）　Ｃ２のタンパク分解フラ グメント（Ｇａｇｎｏｎ、　Ｊ、、　１９８４．　Ｐｈ１ｌｏｓ、　Ｔｒａｎｓ 、　Ｒ，Ｓｏｅ、　Ｌｏｎｄ。

Ｂｉｏｌ、　Ｓｃｉ、　３０６：３０１）、　（Ｃ１ｒ）　ＣＩのγサブユニッ ト（Ｌｅｙｔｕｓ、　Ｓ、Ｐ、、ら、１９８６．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 ２５：４８５５）。

（Ｘｒｌｌｂ）　７ｙクターＸＩＩＩのｂサブユニット（Ｉｃｈｉｎｏｓｅ。

Ａ、、ら、１９８６．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５：４６３３）、（β２ ＧＰ１）β２糖タンパク質Ｉ　（Ｌｏｚｉｅｒ、　Ｊ、　、ら、１９８４．　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８１：３６４０）、　（Ｈａｐ）　ハプ トグロビン（Ｋｕｒｏｓｋｙ、　Ａ、、ら、１９８０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ。

Ｓ、Ａ、　７７：３３８８）、　（ＩＬ−２−Ｒ）インターロイキン−２レセプ ター（Ｌｅｏｎａｒｄ、　Ｗ、Ｊ、、ら、１９８５．５ｃｉｅｎｃｅ　２３０： ６３３）。

星印は不完全配列が入手しうろことを示す。

第８図、ヒトＣＲＩ配列について提案された構造の概略図。Ｃ０ＯＨ末端細胞質 内領域が脂質二重層の右側にある。３０ＳＣＲは原形質膜の細胞外に直線状に並 べられている。ブラケットはＬＨＲを示す。挿入図はトリプルループ構造を示す ために１個のＳＣＲを拡大して示す。

第９図、ヒ）−ＣＲＩをコードするプラスミドｐＢＳＡＢＣＤの挿入物の制限地 図。コード配列を含存する領域の輪郭を示すボックス内には、ＣＲＩ構築物を形 成するために連結された８個のｃＤＮＡクローンの９個のフラグメントが存在す る。ブラケットはそれぞれＬＨＲ−Ａ、−Ｂ、　−Ｃ１および−Ｄの位置を示す 。ボックスの下の線は新たに単離された５°ｅＤＮＡクローンの位置を示す。制 限部位は、Ａ。

Ａｐａｌ、　Ｂ、　ＢａｍＨＩ；　Ｇ、　Ｂｇｌｌｌ；　Ｈ，ＨｉｎｄＩＩＩ； 　Ｋ、　Ｋｐｎｌ；　Ｍ。

ＢｓｐＭＩＩ；　Ｐ、　ＰｓｔＩ；　Ｒ，ＥｃｏＲＩ；およびＳ、　Ｓａｅ！で ある。

第１０図。　ＬＨＲ−Ａの７個のＳＣＲをコードする５’　ｃＤＮＡクローンの 推定アミノ酸配列、およびこの配列とＬＨＲ−Ｂ。

−Ｃ１および−Ｄの相当するＳＣＲとの整列。各ＳＣＲ中に保存されている４個 のシスティンに下線を付しである。

ＬＨＲ−Ｂ、−Ｃおよび−Ｄの残基はそれがＬＨＲ−Ａのそれと異なる個所のみ 示す。

第１１図０発現プラスミドｐｉＡＢＣＤおよびｐＭＴＡＢＣＤの制限地図。Ｐｍ ｘアおよびＰＣＩＩＩＩ／はそれぞれマウスメタロチオネインおよびサイトメガ ロウィルス極初期プロモーターを示す。

第１２図、それぞれｐｉＡＢｃＤ　（パネルａおよびｂ）およびＣＤＭ　８ベク ターのみ（パネルＣおよびｄ）でトランスフェクションさせ、そしてＹＺｌモノ クローナル抗−ＣＲＩ抗体およびフルオレセイン標識ヤギ抗−マウスＦ（ａｂ’ 　）ｚで間接的に染色したＣＯ３細胞の位相差（パネルａおよびＣ）および免疫 蛍光（パネルｂおよびｄ）顕微鏡写真である。

第１３図０組換えＣＲＩを発現するＣＯ８細胞によるＣ３ｂ−およびＣ４ｂ−結 合の分析。ｐｉＡＢＣＤ　（パネルａおよびＣ）またはＣＤＭ　８ベクターのみ （パネルｂおよびｄ）でトランスフェクションさせたＣＯ３細胞をＥＡＣ４ｂ（ ｌｉｌＴｌ）、３ｂ　（パネルａおよびｂ＞ｔたはＥＡＣ４ｂ　（パネルＣおよ びｄ）とインキュベーションしそして位相差顕微鏡によりロゼツト形成について 検査した。

第１４図、トランスフェ、クションされたＣＯ３細胞により発現された組換えＣ 旧の５Ｏ３−ＰＡＧＥによる分析。ＣＤＭ　８ベクターのみ（レーン１および４ ）およびｐｉＡＲＣＤ　（レーン２および５）でそれぞれトランスフェクション したＣＯＳ細胞、およびＣＲＩのＦおよびＳアロタイプを有する個体からの赤血 球（レーン３および６）を＋ｔｓ■で表面標識した。細胞の界面活性剤による溶 解物を続いてセファロースＵＰＣＩＯ（レーン１−３）およびセファロース−Ｙ ＺＩ（レーン４−６〉で免疫吸着させそして溶出物を非還元条件下の５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析した。

第１５図、免疫固定化された組換えＣＲＩの存在下におけるファクターエによる ’　”　’　Ｉ−Ｃ３（ｍａ）切断　１　！　Ｓ　Ｉ−Ｃ３（ｍａ）の複製試料 を、ファクターＨの存在下におけるファクターＩ　（［ノーン１）、ＣＤＭ　８ ベクターのみでトランスフェクションさせたＣＯＳ細胞の溶解物とブレインキュ ベートしたセファロース−ＵＰＣＩＯ（レーン２）　、ｐｉＡＢＣＤ−トランス ソエクシ３ンＣＯ３細胞の溶解物とプＬ／インキュベートシたセファロースー〇 ＰＣ１ｏ（＋ｚ−ン３）、Ｃ０Ｍ８−ｔ−ランスフェクションＣＯ３細胞の溶解 物とブレイソキュベートしたセファｔ７Ｊ−スーＹＺＩ（Ｌ）−ン４）、および ｐｉＡＢＣＤ　−！−ランスフェクシ３ンＣＯ３細胞の溶解物とプレイ゛／キ３ べ一トシたセファロース−ＹＺＩの６μ！　（レーン５）、１２μ！！、（レー ン・６）および２５μＥ（レーン７）で処理した　ＩＩＪ−標Ｗｋ　Ｃ３（ｌ′ １１ａ　）の試料もファクター■の非存在下に、ｐｉＡＢｃＤ−トランスフＬク シ３ンＣＯ３細胞の溶解物とプレインキュベーＩ・したセファロース・−ＹＺＩ 　２５μｌで処理した（し・−ン８）。還元後、’　２’　Ｉ　＝　Ｃ３（ｍａ ）を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析した。

第１６図、ＣＲ１欠失突然変異体をコードするｃＤＮＡ構箋物。４つのＬＨＲを コードするｃＤＮＡセグメントの位置を欠失突然変異体の調製に用いられた制限 部位が示しである全長ｐｉＡＢＣＤ構築物の上方にブラケットで示す。各突然変 異体中に残存するｃＤＮＡ制限フラグメントを黒い線で示す。制限部位はＡ、　 Ａｐａｌ；　Ｂ、　Ｂｓｍ１；　Ｅ、　ＢｓｔＥＩＩ；およびＰ、　ＰｓｔＩで ある。

第１７図、ＣＲ１の組換え欠失変異体とＣＲＩの野生型ＦおよびＳアロタイプと の比較。赤血球（レーンｌおよび７）、およびＣＤＭ　８ベクターのみ（レーン ２および８）　、ｐｉＡＢｃＤ　（レーン３お、よび９　）　、ｐｉＢＣＤ（レ ーン４および１０）、ｐｉＣＤ　（レーン５および１１）およびｐｉＤ　（レー ン６および１２）でそれぞれトランスフェクションさせたＣＯ８細胞を１！６■ で表面標識したものの界面活性剤による溶解物をセファロース−ＵＰＣＩＯ抗− レバン抗体（レーン１−６）、セファロース−ｙｚｉ抗−ＣＲＩモノクローナル 抗体（レーン７−１１）およびウサギ抗−ＣＲ１抗体およびセファロ−スープロ チインＡ（レーン１２）でそれぞれ免疫沈降させた。溶出物を還元条件下の５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥおよびオートラジオブラフイーにかけた。

第１８図、全長ＣＲＩおよび欠失変異体を発現するｃｏｓ細胞の存在下における ファクターＩによる’　”　’　Ｉ−Ｃ３（ｍａ）の切断。’　”　’　Ｉ−Ｃ ３（ｍａ）の複製試料をファクターＩの非存在下（レーン１−６）または存在下 （レーン７−１２）に、それぞれＣＤＭ　８ベクターのみ（レーン１および７） 、ｐｉＡＢｃＤ　（レーン２および８）　、　ｐｉＡｌ）　（レーン３および９ ）　、ｐｉＢＤ　（レーン４および１０）　、ｐｉｃＤ　（レーン５および１１ ）、およびｐｉＤ（レーン６および１２）でトランスフェクションしたＣＯ３細 胞とインキュベートした。

”’Ｉ−Ｃ３（ｍａ）の試料もそれぞれファクターＨおよびファクターＩ（レー ン１３）とおよびファクターＩのみ（レーン１４）とインキュベートした。還元 後、’　”　”　Ｉ−Ｃ３（ｍａ）を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラ フィーにより分析した。

第１９図、ＣＲ１の各ＬＨＲ，およびＣ３ｂおよびＣ４ｂのレセプターの特異性 を決定する予想部位を含有するＳＣＲ型の模式図。これらの二次的な結合特異性 をカッコで示す。

第２０図、可溶性ＣＲＩ　ＤＮＡ構築物中に残存するＤＮＡ領域を示す概略図。

全長ＣＲＩ　ｃＤＮＡ領域を図面の上方のボックスにより示す。

第２１図０発現ベクターのｐ’ｒｅｓシリーズ中の主要エレメントを示す概略図 。

第２２図０発現ベクターｐＴｃｓｇＰｔの概略図。ポリアデニル化部位はマウス Ｉｇカッパ配列から（ＮＢＲＦヌクレイツクデータベースアクセツション＃Ｋｃ ｍｓ、　ｂｐ　１３０６−１７１４）　；　Ａｄ２　ＭＬＰおよび三分節系領域 はＡｄ２配列から（ＮＢＲＦヌクレイツクデータベースアクセツション＃Ｇｄａ ｄ２、ｂｐ　５７９１−６０６９）；　ＳＶ４０初期プロモーターハ５ｖ４０ゲ ノムから（ＮＢＲＦヌクレイツクデータベースアクセツション＃ＧＳＶ４０Ｗ） 得られた。ｇｐｔ遺伝子、アンピシリン遺伝子および複製の細菌性起点はベクタ ーｐＳＶ２ｇｐｔから（ＡＴＣＣアクセツションＮα３７１４５）得た。

第２３図、抗体アフィニティ精製５ｃＲ１（７）　４−２０％５ＤＳ−ＰＡＧＥ 、非還元（レーンｌ、２．３）および還元（レーン４，５．６）条件下。シー２ １，３２分子量マーカー；レーン３．５＝細細胞培養上出出物質；レーン４゜６ ：抗体アフィニティクロマトグラフィーにより精製した５ｃＲ１゜ 第２４図、カチオン交換ＨＰＬＣ溶離プロフィル。溶離されたタンパク質を２８ ０ｎｍでの吸光度（Ｙ軸）により監視した。フロースルー（０−１００分）およ び溶出５ＣＲＩ（１５０−１６５分）の吸光度はいずれも目盛外であった。Ｙ軸 は溶離時間（分）を表わす。

第２５図、カチオンおよびアニオン交換ＨＰＬＣ精製５ｃＲ１の４−２０％グラ ジェント５ＤＳ−ＰＡＧＥ、　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルは非還元条件下 に行われた。レーン１．バイオリアクター上清の一部分；レーン２．カチオンＨ ＰＬＣ出発緩衝液で透析したバイオリアクター上清の一部分；レーン３．カチオ ン交換ＨＰＬＣカラムからの５ＣＲＩ溶出ピークの一部分：レーン４．カチオン 交換ＨＰＬＣカラムからの５ｃＲ１ビークをアニオンＨＰＬＣの出発緩衝液で透 析した一部分；レーン５および６．アニオンＨＰＬＣから溶離された５ｃＲ１の ２つの異なるフラクションの一部分。

第２６図、ヒト好中球における酸素バーストのＣ５ａ誘導。Ｃ５ａ誘導酵素バー ストに続き、ＤＣＦＤＡが酸化されそして明るく蛍光を発した。フローサイトメ トリーにより測定した蛍光強度をＹ軸にそして細胞の数をＹ軸に示す。パネルａ 、細胞のプロフィルおよびゲート；パネルｂ、Ｃ５ａ添加Ｏ分後；パネルｃ、１ 分後；パネルｄ、２分後：パネルｅ、３分後：パネルｆ、４分後：パネルｇ、２ ０分後。このＤＣＦＤＡアッセイによりＣ５ａが高感度で示される。

第２７図、　５ｃＲ１の存在下におけるヒト補体の活性化によりＤＣＦＣＤＡア ッセイにおいてＣ５ａ活性の低下が示される。パネルａ、未刺激細胞：バネルｂ 、高度の蛍光を示す５ｃＲ１を含まない対照；パネルＣ９蛍光強度の７５％低下 を示す５ｃＲ１の存在下におけるＤＣＦＤＡアッセイ。Ｙ軸は細胞数でありそし てＹ軸は蛍光強度である。

第２８図、ヒト血清における古典的経路Ｃ５ａおよびＣ３ａ産生の５ＣＲＩによ る阻害。同様のプロフィルが抗体アフィニティ精製またはＨＰＬＣ精製５ｃＲ１ で観察された。

第２９図９組換え５ｃＲ１による補体仲介溶血の阻害。同様のプロフィルが抗体 アフィニティ精製またはＨＰＬＣ精製５ｃＲ１で観察された。

第３０図、　５ｃＲ１−処置（左）および未処置（右）ラットのＲＰＡＲの肉眼 的形態。（ａ）両ラットともオバルブミンの静脈注射に続き５ｃＲ１（左ラット ）またはＰＢＳ（右ラット）と、生のままの抗−オバルブミン（左部分）；各希 釈抗−オバルブミン（中央部分）またはウサギＩｇＧ（右部分）の混合物の皮肉 注射を受けた。注射は二通りずつ行い、上方および下方の列で同じ結果が得られ た。５ｃＲ１を与えられたラットは目で見える変化をほとんど示さなかったが、 未処置ラットはＲＰＡＲの完全な徴候を生じた。（ｂ）　（ａ）からの皮膚バイ オプシーの皮膚表面。未処置ラット（右）からのバイオプシーは明らかに見るこ とのできる病変を示したが、５ＣＲＩ処置ラツト（左）からのバイオプシーは正 常な形態を示した。

第３１図、５ｃＲ１処置（ａ）および未処置（ｂ）ラットの皮膚バイオプシーの 光学顕微鏡写真。（ａ）多形核および単核細胞の血管周囲の蓄積が観察されるが 、好中球の広範な浸潤も赤血球の遊出も見られなかった。（ｂ）多形核細胞の広 範な浸潤および赤血球の遊出が確認された。

５、発明の詳細な説明 本発明はＣ３ｂ／Ｃ４ｂレセプター（ＣＲＩ）遺伝子およびそれがコードするタ ンパク質に関する。本発明はまた、ＣＲＩ核酸配列および７０ヌクレオチドを含 有するそのフラグメントおよびそれらがコードする２４アミノ酸を含有するペプ チドまたはタンパク質にも関する。本発明はさらに、ＣＲＩタンパク質およびそ のフラグメントの発現をも提供するものである。かかるＣＲＩ配列およびタンパ ク質は炎症または免疫系の障害および補体活性が関わる障害の診断および治療に 価値がある。

詳細な態様においては、本発明は可溶性ＣＲ１分子およびその発現、精製および 用途に関する。ここで用いられる「可溶性ＣＲ１分子」なる用語は、天然型ＣＲ Ｉタンパク質と対照的に、細胞表面に膜タンパク質として発現されないＣＲＩタ ンパク質の部分を意味しよう。特定の例としては、膜貫通領域を実質的に含有し ないＣＲ１分子が可溶性ＣＲ１分子である。好ましい態様においては、可溶性Ｃ Ｒ１分子はそれらを発現する細胞により分泌される。

下記実施例の項で詳述される本発明の詳細な態様においては、全長ＣＲＩ　ｅＤ ＮＡおよびそのフラグメントのクローニングおよび完全なヌクレオチドおよび推 定アミノ酸配列、およびそれらがコードするＣＲＹ産物の発現が記載される。Ｃ ３ｂおよび／またはＣ４ｂとの結合部位するＣＲＩおよびそのフラグメントの発 現も記載される。

本発明はさらに、可溶性で、先端の切れたＣＲ１分子の産生および精製によって も説明する。詳細な実施例においては、かかる分子は炎症の低下、および心筋梗 塞規模の低下および再潅流損傷の防止に治療上有用であることが示される。

（本頁以下余白） ５．１．　ＣＲＩ遺伝子の単離 ＣＲＩ遺伝子の全コード配列およびその推定アミノ酸配列は第１図に示す。任意 のヒト細胞はＣＲＩ遺伝子の分子クローニングの核酸源として役立つ可能性があ る。

ＣＲＩ遺伝子の単離は、ＣＲＩ関連構造または性質、例えばＣ３ｂまたはＣ４ｂ または免疫複合体の結合、食作用修飾、免疫刺激または増殖、および補体の調節 を示すタンパク質をコードするこれらのＤＮＡ配列の単離を必要とする。ＤＮＡ は、当業上知られている標準的手法、クローン化ＤＮＡ（例えばＤＮＡ“ライブ ラリー″）から、化学的合成により、ｃＤＮＡクローニングにより、または所望 のヒト細胞から精製されたゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントのクローニング により得られる（例えばＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　 ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；　Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｄ、Ｍ、　（編）、　１９８５．　ＤＮ Ａ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　ＭＲＬ　 Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｔｄ、、　０ｘｆｏｒｄ。

Ｕ、に、、　Ｖｏｌ　１．　ＩＩ、参照）。ＣＲ１遺伝子のｃＤＮＡクローニン グの核酸源として役立つ細胞は、単球／マクロファージ、顆粒細胞、Ｂ細胞、Ｔ 細胞、牌臓毛包性樹状細胞および腎糸球体足細胞を包含するがそれらに限定され ない。ゲノムＤＮＡに由来するクローンはコード領域の他に調節およびイントロ ンＤＮＡ領域を含有しつる。

ｃＤＮＡに由来するクローンはエクソン配列のみを含有しよう。その起源が何で あろうと、ＣＲＩ遺伝子は遺伝子増殖のための適当なベクター内に分子的にクロ ーン化されるべきである。

ゲノムＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングに於ては、ＤＮＡフラグメントが 生成され、その一部が所望のＣＲＩ遺伝子をコードしているであろう。ＤＮＡを 種々の制限酵素を用いて特定の部位で切断することができる。

あるいはまｔ：、ＤＮＡをフラグメントにするためにそのＤＮアーゼをマンガン 存在下で用いることができ、また例えば音波処理によるように、物理的にＤＮＡ を切断することもできる。次に、アガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気 泳動およびカラムクロマトグラフィーを包含するがそれらに限定されない標準的 技法により、線状ＤＮＡフラグメントを分子量に従って分離することができる。

ひとたびＤＮＡフラグメントが生成されると、ＣＲＹ遺伝子を含有する特定のＤ ＮＡフラグメントを多数の方法で同定することができる。例えばある量のＣＲＩ 遺伝子またはその特異的なＲＮＡ、またはそのフラグメントが利用可能で、それ を精製し標識化することができれば、生成したＤＮＡフラグメントを標識化プロ ーブとの核酸ハイブリダイゼーションにより選抜することができる（Ｂｅｎｔｏ ｎ、　Ｗ、およびＤａｖｉｓ、　Ｒ，，１９７７、５ｃｉｅｎｃｅ　１９６：１ ８０；　Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、　Ｍ、および）ｉｏｇｎｅｓｓ、　Ｄ、　１９７ ５．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。７２：３９６１）。プローブ と実質的に相同のこれらＤＮＡフラグメントはハイブリダイズするであろう。も し精製ＣＲＩ特異的プローブが利用できない場合は、最初の選択方法として、Ｃ ＲＩに富む核酸フラクションをプローブとして用いることができる。

−例として、繊維芽細胞により発現されたメツセージを取り去ったＢ細胞ｃＤＮ Ａであるプローブを用いることができる。制限酵素消化およびもし利用できれば 既知の制限地図にしたがって予想されるものとのフラグメントの大きさの比較に より適当なフラグメントを同定することも可能である。最初の選択の後に、以下 に記載されるように、遺伝子の性質、または発現された産物の物理的、化学的ま たは免疫学的性質に基づいて、さらに選択を行うことができる。

また、ＣＲＩ遺伝子は、核酸ハイブリダイゼーションによるｍＲＮＡの選択とそ れに続くインビトロ翻訳により同定することもできる。この方法に於ては、ハイ ブリッド形成により相補性ｍＲＮＡを単離するのにフラグメントが用いられる。

このようなりＮＡフラグメントは利用可能な精製ＣＲＩ　ＤＮＡ、またはＣＲＩ 配列に富むＤＮＡであることができる。単離されたｍＲＮＡのインビトロ翻訳産 物の免疫沈降分析または機能アッセイ（例えば、Ｃ３ｂまたはＣ４ｂ結合、また は食作用または免疫刺激の促進、または補体調節等に関して）によりｍＲＮＡが 同定され、従ってＣＲＩ配列を含有する相補性ＤＮＡフラグメントが同定される 。さらに、細胞から単離されたポリゾームを、ＣＲＩ特異的な固定化抗体に吸着 させることによって特異的なｍＲＮＡを選択できる。（吸着されたポリゾームか ら）選択されたｍＲＮＡを鋳型として用いて、放射性標識ＣＲＩ　ｃＤＮＡを合 成することができる。次いで、放射性標識ｍＲＮＡまたはｅＤＮＡをプローブと して使って、ＣＲＩＤＮＡフラグメントを他のゲノムＤＮＡフラグメントの中か ら同定することができる。

ＣＲＩゲノムＤＮＡを単離する以外の方法には、遺伝子配列自体を既知配列から 化学的に合成すること、またはＣＲＹ遺伝子をフードするｍＲＮＡに対するｃＤ ＮＡを作成することが包含されるがこれに限定されるわけではない。

例えば、上記記載のようにＣＲＩ遺伝子のｃＤＮＡクローニングのためのＲＮＡ を、単球／マクロファージ、顆粒細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、および足細 胞を包含するがそれに限定されない細胞から単離することができる。好ましい実 施態様において、扁桃腺細胞はｃＤＮＡクローニングのｍＲＮＡの起源として役 立つ（下記、６．１゜２項参照）他の方法も可能でありそしてそれは本発明の範 囲内である。

次に同定および単離された遺伝子を適当なりローニングベクターに挿入すること ができる。画業上知られた多数のベクター宿主系を用いることができる。使用可 能なベクターにはプラスミドまたは修飾されたウィルスが包含されるがそれらに 限定されるわけではない。

しかしベクター系は使用される宿主細胞と適合しなければならない。このような ベクターには、ラムダ誘導体のようなバクテリオファージ、またはＰＢＲ３２２ またはｐＵｃプラスミドまたはＣＤＭ８プラスミド（Ｓｅｅｄ、　Ｂ、、　１９ ８７、　Ｎａｔｕｒｅ　３２９：８４０−８４２）または誘導体のようなプラス ミドが包含されるがそれらに限定されるわけではない。形質転換、トランスフェ クション、感染、エレクトロポレーションなどによって、組換え分子を宿主細胞 に導入することができる。

別法では、「ショットガン」法で適当なりローニングベクターに挿入後、ＣＲＩ 遺伝子を同定および単離することができる。クローニングベクターへの挿入の前 に、例えば、分子量による分画によってＣＲＩ遺伝子を増強することができる。

ＣＲ１遺伝子を、適当な宿主細胞の形質転換、トランスフェクション、または感 染に使用できるクローニングベクターに挿入すると、その結果多コピーの遺伝子 配列が生成される。詳細な実施態様に於ては、クローニングベクターとして哺乳 動物宿主細胞中で発現を達成するのに使用できるＣＤＭ８ベクターを用いること ができる。例えば相補性付着末端を有するクローニングベクターにＤＮＡフラグ メントを連結することによって、クローニングベクターへの挿入を行うことがで きる。

しかしながら、もしＤＮＡをフラグメントに切断するのに用いられた相補性制限 部位がクローニングベクターに存在しない場合は、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に 修飾することができる。このような修飾には、一本鎖ＤＮＡ末端をさらに消化す るかまたは一本鎖末端を充填することによって平滑末端を生成させることが包含 され、かくしてこれら末端が平滑末端として連結できる。あるいはまた、ＤＮＡ 末端へのヌクレオチド配列（リンカ−）の結合によって任意の所望の部位をつく り出すことができる。これらの連結されたリンカ−は制限エンドヌクレアーゼ認 識配列をコードする特異的な化学合成オリゴヌクレオチドからなることができる 。別法では、切断したベクターおよびＣＲＩ遺伝子をホモポリメリックティリン グによって修飾することができる。

クローン化されたＣＲＩ遺伝子は、ＤＮＡそれ自体の性質または、代わりにその コードするタンパク質の物理的、免疫学的、または機能的性質に基づく多くの方 法で同定することができる。例えば、ＤＮＡそれ自体は、標識化プローブに対す るプラークまたはコロニー核酸ハイブリダイゼーションによって検出できる（Ｂ ｅｎｔｏｎ。

Ｗ、およびＤａｖｉｓ、　Ｒ，、１９７７、５ｃｉｅｎｃｅ　１９６：１８０； 　Ｇｒｕｎｓ−ｔｅｉｎ、　Ｍ、およびＨｏｇｎｅｓｓ、　Ｄ、、　１９７５． 　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７２：　３９６１）　、また、その発現された産物の 性質に基づくアッセイによってＣＲＩ遺伝子の存在を検出することもできる。例 えば、ＣＲＩについて知られているのと同様のまたは同一の、電気泳動での移動 、等電点電気泳動での挙動、タンパク分解的消化地図、Ｃ３ｂおよび／またはＣ ４ｂおよび／または免疫複合体結合活性、補体調節活性、食作用または免疫刺激 におよぼす作用、または抗原性を有するタンパク質を生産するｃＤＮＡクローン 、または適合するｔｎＲＮＡをハイブリッド選択するＤＮＡクローンを選択する ことができる。ＣＲＩに対する抗体が使用できれば、ＢＬＩＳＡ（エンザイムリ ンクトイムノソルベントアッセイ）型の方法で、標識化抗体の推定ＣＲＩ合成り ローンへの結合によって、ＣＲＩタンパク質を同定できる。

詳細な実施態様に於ては、単離されたＣＲＩ遺伝子、ｃＤＮＡ、または合成りＮ Ａ配列を組み込んだ組換えＤＮＡ分子を用いて宿主細胞を形質転換することによ って、多コピーの遺伝子を生成させることができる。従って、その形質転換体を 増殖させ、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、そして必要ならば単離さ れた組換え体ＤＮＡから挿入遺伝子を回収することによって、遺伝子を大量に得 ることができる。

特定の実施態様に於ては、サイトメガロウィルスのプロモーターの制御下で大規 模発現させるにはＣＤＭ８ベクターのＣＲ１ｅＤＮＡＲ１−ンを、ｅｏｓｃサル 腎臓）細胞にトランスフェクションさせることができる（下記６．１゜８項参照 ）。

究極の目的が、ワクシニアウィルスまたはアデノウィルスのようなウィルス発現 ベクターに遺伝子を挿入することであるならば、ＣＲＩ遺伝子を組み込んだ組換 えＤＮＡ分子を、その遺伝子の側面がウィルス配列で挟まれるように修飾でき、 それによってウィルスに感染した細胞中でゲノムでの組換えが可能となってその 結果遺伝子をウィルスゲノム中に挿入することができる。

ＣＲＩ　ＤＮＡ−含有クローンを同定、増殖、および収穫した後、下記５．４． １項に記載されたようにしてそのＤＮＡ挿入物を特性決定することができる。

ＣＲＩ遺伝子の遺伝子構造が判明すると、本発明に於て最適に利用するためにそ の構造を操作することが可能である。例えば、タンパク質の発現を増加させるた めに、もともと備わっているプロモーターに加えて、またはその代わりにプロモ ーターＤＮＡをＣＲＩコード配列の５゛側に連結することができる。ＣＲＩ欠失 変異株を発現する発現ベクターもＣＲＩ配列の特定のフラグメントの発現を提供 するために作られる（下記実施例の項参照）。特別の実施態様においては、所要 のＣ３ｂおよび／またはＣ４ｂ結合機能（下記９項参照）、例えばＣ４ｂ結合の ためのＬＨＲ−ＡまたはＣ３ｂ結合のためのＬＨＲ−Ｃを示すＣＲＩタンパク質 のフラグメントをコードする欠失変異株を構築できる。好ましい実施態様におい ては、膜横断領域の欠失を有するＣＲ１分子をコードする発現ベクターは可溶性 ＣＲ１分子を産生ずるのに使用できる（下記実施例１１−１４項参照）。多くの 操作が可能であり、そしてそれらは本発明の範囲内である。

５．２．　ＣＲＩ遺伝子の発現 ＣＲＩタンパク質（第１図）またはその一部分をコードするヌクレオチド配列を 適当な発現ベクター、すなわち挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻 訳に必要なエレメントを含有するベクター中に挿入することができる。必要な転 写および翻訳シグナルはもともとのＣＲＩ遺伝子および／またはその隣接領域か ら供給されることもできる。種々の宿主ベクター系がタンパク質コード配列を発 現させるのに利用できる。これらには、ウィルス（例えば、ワクシニアウィルス 、アゾンウィルスなど）感染哺乳類細胞系；ウィルス（例えばバキュロウィルス ）感染昆虫細胞系：酵母ベクターを含有する酵母のような微生物、またはバクテ リオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡで形質転換され た細菌、が包含されるがそれらに限定されるわけではない。これらのベクターの 発現エレメントはその強度および特異性が変動する。使用される宿主−ベクター 系に応じて、多数の適当な転写および翻訳エレメントの任意の一つを用いること ができる。

例えば、哺乳類細胞系でクローニングする場合は、哺乳類細胞ゲノムから単離さ れたプロモーターまたは哺乳類細胞中で増殖するウィルス例えばアデノウィルス 、シミアンウィルス４０、サイトメガロウィルスから単離されたプロモーターを 使用することができる。挿入配列の転写を引き起こすためには、組換えＤＮＡま たは合成技法によって作成されたプロモーターを用いることもできる。

また挿入されたタンパク質コード配列を効率的に翻訳するには特異的な開始シグ ナルも必要である。これらのシグナルにはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が包 含される。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を包含する完全なＣＲＩ遺伝子 を適当な発現ベクターに挿入する場合は、翻訳制御シグナルを更に加える必要は ない。しかしながら、ＣＲＩコード配列の一部分のみが挿入される場合には、Ａ ＴＧ開始コドンを含む外来翻訳制御シグナルが付与されねばならない。さらに挿 入物全体の翻訳を保証するには開始コドンはタンパク質コード配列と読み枠が一 致しなければならない。このような外米翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天 然および合成両方の種々な起源のものであることができる。

適当な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列からなるキメラ遺伝 子を含有する発現ベクタ−を構築するには、ＤＮＡフラグメントのベクターへの 挿入に関して既に述べた任意の方法を用いることができる。このような方法には インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技法、およびインビボ組換え（遺伝的組換え ）が包含されつる。

特別の実施態様において、可溶性ＣＲ１分子を発現する。かかる可溶性分子は、 ＣＲＩ膜横断領域をコードするＤＮＡ配列を欠失する組換えＤＮＡ技法の使用に より産生できる（下記１１−１４項参照）。下記に示す様に、可溶性ＣＲ１分子 を発現する能力は、ＣＲＩ核酸配列のいかなる遺伝子的改変にも限定されない。

すなわちＣＲＩ膜横断領域のかなりの部分をコードする核酸配列を欠失するかぎ り、可溶性ＣＲＩ構築物は得られる。

ＣＲＩ遺伝子挿入物を含有する発現ベクターは３つの一般的な方法によって確認 することができる。すなわち（ａ）　ＤＮＡ−ＤＮＡ　ハイブリダイゼーション 、　（ｂ）ｒ７−カー」遺伝子機能の存在または非存在、および（Ｃ）挿入配列 の発現。最初の方法に於ては、発現ベクター中に挿入された外来遺伝子の存在は 挿入されたＣＲＩ遺伝子と相同の配列を含有するプローブを用いるＤＮＡ　−Ｄ ＮＡハイブリダイゼーションによって検出できる。第２の方法に於ては、組換え ベクター／宿主系はベクターへの外来遺伝子の挿入によって引き起こされた特定 の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形 質転換表現型、バキュロウィルスに於ける閉塞体形成）の有無に基づいて確認お よび選択することができる。例えば、もしＣＲＩ遺伝子がベクターのマーカー遺 伝子配列内に挿入されるならば、ＣＲＩ挿入物を含有する組換え体はマーカー遺 伝子機能の欠如によって確認することができる。第３の方法に於ては、組換え体 によって発現される外来遺伝子産物をアッセイすることによって、組換え発現ベ クターを確認することができる。このようなアッセイは遺伝子産物の物理的、免 疫学的、または機能的な性質に基づくことができる。

ひとたび特定の組換えＤＮＡ分子が同定および単離されると、適業上知られたい くつかの方法がその増殖に使用できる。ひとたび好適な宿主系および増殖条件が 確立されると、組換え発現ベクターを大量に増殖および調製することができる。

本発明の実施例で詳述する特定の実施態様に於ては、ＣＲＩ　ｃＤＮＡ挿入物を 有する００Ｍ８ベクターをＣＯ８細胞にトランスフェクションすることができる 。この細胞内でＣＲＩ　ｃＤＮＡ挿入物が発現されてＣＲＩタンパク質が生産さ れる。下記の実施例の項に詳細した他の特別の実施態様において、ＣＲＩコード 領域の部分に相当するＣＲＩｃＤＮＡ挿入物を有する００Ｍ８ベクターをＣＯ８ 細胞にトランスフェクションし、そこでＣＲＩまたはフラグメントが発現する。

さらに下記のもうひとつの実施例によると、切断した可溶性ＣＲ１分子は１１゜ ３．１項記載のｐ’ｒｃｓベクターのような発現ベクターの使用により哺乳動物 細胞中に発現される。既に説明したように、使用できる発現ベクターには少数例 をあげれば以下のベクターまたはそれの誘導体が包含されるがそれらに限定され るわけではない。ワクシニアウィルスまたはアデノウィルスのようなヒトまたは 動物ウィルス；バキュロウィルスのような昆虫ウィルス；酵母ベクター；バクテ リオファージベクター（例、ラムダ）、およびプラスミドおよびゴスミドＤＮＡ ベクター、など。

さらに、挿入配列の発現を調節するかまたはキメラ遺伝子産物を特定の所望の様 式で修飾しプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。ある種のプロ モー・ターからの発現を特定のインデュサーの存在下に高めることができる。し たがって、遺伝子工学的に作成されたＣＲＩタンパク質の発現を制御することが できる。さらに、それぞれ異なった宿主細胞は、翻訳および翻訳後のタンパク質 のプロセシングおよび修飾に関して特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。確 実に異種の発現タンパク質に対し所望の修飾およびプロセシングを行うために、 適当な細胞系または宿主系を選択することができる。例えば、第１図の推定アミ ノ酸配列を有する未グルコシル化ＣＲ１タンパク質を生産するには、細菌系での 発現を用いることができる。酵母菌中での発現は、グリコジル化産物を産生ずる 別の実施態様に於ては、異種ＣＲＩタンパク質の［自然な」グリコジル化を保証 するために、哺乳類ＣＯ８細胞を用いることができる。さらに、種々のベクター ／宿主発現系が種々の程度でタンパク分解的切断のようなプロセシング反応を行 うことができる。種々にプロセシングされた多くのかかるＣＲＩタンパク質を生 成させることができ、そしてこれらは本発明の範囲内にある。本発明の好ましい 実施態様において、可溶ＣＲ１分子の大規模生産は第１２．１以下に記載のよう に行なう。

５８３、発現された遺伝子産物の同定および精製ＣＲＩ遺伝子を発現する組換え 体が−たん同定されると、その遺伝子産物を分析しなければならない。これはそ の産物の物理的、免疫学的、または機能的性質に基づくアッセイによって行うこ とができる。

ＣＲＩタンパク質はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー 、およびサイジングカラムクロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー） 、遠心分離、溶解度の相違、を包含する標準的な方法によって、またはタンパク 質精製に関する任意の他の標準的な技法によって単離および精製することができ る。

下記の実施例中に詳細した本発明の好ましい面において、大量の可溶性ＣＲＩは ＨＰＬＣを用いる方法により精製できる（１２．２以後を参照）。下記に記載の ように精製ＣＲＩの大規模生産は、始めの材料として可溶性ＣＲＩを産生する、 したがって界面活性剤で膜結合ＣＲＩを可溶化する必要性を排除する発現方法を 使用することにより達成できる。バイオリアクター培養物中のウシ胎児血清濃度 の減少および／またはこれらの培養物中に他の培養地の使用により、続く精製中 に可溶性ＣＲＩ含有の始めの材料から高濃度の外部タンパク質を取り除く必要を 排除する。陽イオンＨＰＬＣまたは陽イオンＨＰＬＣの組合せのうちいずれか一 方の後で陰イオン交換ＨＰＬＣを、この好ましい面における精製のために使用で きる。

このようにして、かなり純粋な可溶性ＣＲＩを大量に、一または二段階だけで達 成できる。

また、組換え体によって生産されるＣＲＩタンパク質か−たん同定されると、組 換え体に含まれるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列から、このタンパク質のアミ ノ酸配列を推定することができる。結果として、このタ〕／バク質を当業上知ら れた標準的な化学的方法によって合成することができる（例えば、Ｈｕｎｋａｌ ）ｉｌｌｅｒ、　Ｍ。

ら、１９８４．　Ｎａｔｕｒｅ　３１０：１０５−１１１参照）。

本発明の詳細な実施態様に於ては、このようなＣＲＩタンパク質は、それが組換 えＤＮＡ技法によって生成されるかまたは化学合成法によって生成されるかに関 わらず、実質的に第１図に示すようなアミノ酸配列のすべてまたは一部分を主要 アミノ酸配列として含存するタンパク質を包含するがそれに限定されるわけでは ない。またこのアミノ酸配列には機能的に等価のアミノ酸残基が配列内の残基と 置換されてサイ１ノントな変化を起こしているような変化した配列が包含される 。例えば、一つまたはそれ以上の配列内アミノ酸残基を、同様の極性を示し機能 的に等価な作用をする別のアミノ酸により置換して、結果としてサイレントな変 化を生成させることができる。また非保存的置換は機能的に等価なタンパク質を 生じる。

ひとつの実施態様において、ＣＲｉ配列内でのアミノ酸の代替物はそのアミノ酸 が属するクラスの他のアミノ酸から選択することができる。例えば、非極性（疎 水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フ ェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが包含される。極性中性アミ ノ酸にはグリシン、セリン、トレオニン、システィン、チロシン、アスパラギン 、およびグルタミンが包含される。陽性荷電（塩基性）アミノ酸にはアルギニン 、リジン、およびヒスチジンが包含される。陰性荷電（酸性）アミノ酸にはアス パラギン酸およびグルタミン酸が包含される。翻訳中または翻訳後に例えばグリ コジル化、タンパク分解的切断などによって特別に修飾されたＣＲＩタンパク質 も本発明の範囲に含まれる。

下記に詳記した本発明の実施例において、トランスフェクションした細胞により 発現されるクローン化組換えＣＲＩは、５Ｏ３−ＰＡＧＥによると赤血球のアロ タイプから識別できないことを示しく第１４図）、Ｃ４ｂまたはＣ３ｂのいずれ か一方を担持するヒツジ赤血球の結合に介在することができ、ＣＲＩのリガンド 特異性を再産生すること（第１３図）、およびＣ３（ｍａ）のアルファポリペプ チド切断のためのファクターエコーファクター機能を表わすこと（第１５図）が できる。

５．４．ＣＲＩ遺伝子およびタンパク質の構造ＣＲＩ遺伝子およびタンパク質の 構造は下記に記載された方法を含むが、それらに限定されない当業上知られた種 々の方法により分析することができる。

５　、４．１．遺伝子分析 ＣＲＩ遺伝子に相当するクローン化ＤＮＡまたはｃＤＮＡはサザンハイプリダイ ゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、　Ｍ、、１９７５、　Ｊ、　Ｍｏｌ、　 Ｂｉｏｌ、　９８　：　５０３−５１７）、ノーザンノ１イプリダイゼーション （例え（よ、Ｆｒｅｅｍａｎら、１９８３．　Ｐｒｏｅ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０　：　４０９４−４０ ９８参照）、制限エンドヌクレアーゼマツピング（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、 　１９８２゜Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｒ＋ｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、お よびＤＮＡ配列分析を包含するがそれらに限定されない方法によって分析するこ とができる。用いられた特異的なＣＲＩプローブに対して所望度合の関連性を有 する核酸の検出を確保するために、サザンおよびノーザンハイブリダイゼーショ ンの両方のハイブリダイ・ゼーション条件の厳密さを加減することができる。

ＣＲＩ遺伝子の遺伝子構造を大まかに決定するために制限エンドヌクレアーゼマ ツピングを用いることができる。特定の実施態様に於ては、下記第２図に示す制 限地図を得るために、制限酵素での切断を用いることができる。制限エンドヌク レアーゼ切断によって得られた制限地図をＤＮＡ配列分析によって確認すること ができる。

当業上知られた任意の方法によってＤＮＡ配列分析を行うことができる。このよ うな方法にはマキサム（Ｍａｘａｍ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｃｒｔ）の方 法（１９８０，Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６５　：　４９９−５６０）、サンガーのジデオキシ法（Ｓ ａｎｇｅｒ、　Ｆ。ら、１９７７、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓ ｃｉ、　Ｕ、Ｓ。

Ａ、　７４：５４６３）、または自動化ＤＮＡシークエネーター（例えば、Ａｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）の使 用が包含されるがそれらに限定されるわけではない。ＣＲ１遺伝子のｃＤＮＡ配 列は、実質的には第１図に示されそして下記６および７項に詳述される配列を包 含する。

５　、４．２．タンパク質分析 ＣＲＩタンパク質のアミノ酸配列をＤＮＡ配列からの推定によるか、またはその 代わりに例えば自動化アミノ酸シークエンサーを用いたタンパク質の直接配列決 定により導くことができる。ＣＲＩタンパク質の代表的なもののアミノ酸配列は 、実質的には第１図に示されそして下記６項に詳述される配列を含有する。

下記に記載されているように、ＦアロタイプＣＲＩコード配列の全てはクローン 化され、４１アミノ酸のシグナルペプチドの切断後、成熟レセプターは３ｏのＳ ＣＲを形成する１９３０基の外部ドメインを包含する１９９８アミノ酸を含む。

３０のＳＣＲのうち２８は、ＬＨＲ−Ａ、　−Ｂ、　−Ｃおよび−Ｄ　（第１０ 図）、２５アミノ酸の単一膜間ドメイン、および４３アミノ酸の比較的短い細胞 質ドメインを構成する。

多数のＳＣＲを含むＣ３／Ｃ４結合タンパク質中で、ＣＲＩはＬＨＲを構成する ＳＣＲのグループを有することで特有である。ＣＲＩの４つのＬＨＨの比較によ り、それぞれは４種のＳＣＲ，ａ、　ｂＳｃおよびｄ種、からなる合成物である ことが明らかになる（第１９図）。例えば、ＬＨＲ−Ａの５ＣＲ−１および−２ の配列は、ＬＨＲ−Ｂ、　−Ｃおよび−Ｄの最初の２つのＳＣＲに対して、それ ぞれ６２％、６２％および５７％だけ同一である。しかしながら、５ＣＲ−３が ら５ＣＲ−７までは単一の位置でのみＬＨＲ−Ｂの対応するＳＣＲとは異なり、 ５ＣＲ−３および−４は、三個所の位置でのみＬＨＲ−Ｃのそれらとは異なる（ 第１０図）。したがって、ＬＨＲ−Ａの“ａ”種ＳＣＲのいくつかもＬＨＲ−Ｂ および−Ｃに存在する。ＬＨＲ−Ｂの最初（２）　２　ツノｓｃＲは、ＬＨＲ− Ａ（７）それとは異なり、ＬＨＲ−Ｃの対応するＳＣＲと９９％同一であり、そ の結果ＬＨＲ−Ｂおよび−Ｃは、これらの位置で“ｂ“種ＳＣＲを共有する。Ｌ ＨＲ−Ｃの第５．６および７　ＳＣＲは、これらの位置でＬＨＲ−Ａおよび−Ｂ のａ”種ＳＣＲと７７％だけ同一であり、“Ｃ“種ＳＣＲと考えられている。Ｌ ＨＲ−Ｄの第１から４までのＳＣＲは比較的特有のものであり、“ｄ”種である が、一方策５から７までのＳＣＲは、ＬＨＲ−Ｃ中に見い出される“ｃ”種と約 ９３％同一である。

ＣＲＩタンパク質配列配列水性分析によってさらに特性決定することができる（ Ｈｏｐｐ、　Ｔ、およびＷｏｏｄｓ、　Ｋ、。

１９８１、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　 ７８：３８２４）。親水性プロフィールは、ＣＲＩタンパク質の疎水性および親 水性領域、およびかかる領域をコードする遺伝子配列の対応する領域の同定に用 いることができる。ＣＲＩタンパク質のＣ００Ｈ−末端の親水性プロフィールを 第５図に示す。

特異的な二次構造が想定されるＣＲＩの予想領域を同定するために、二次的構造 分析（Ｃｈｏｕ、　Ｐ、およびＦａｓｍａｎ。

Ｇ、、　１９７４．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３：２２２）を行うことも できる。

他の構造分析法を用いることもできる。これらにはＸ線結晶学（Ｅｎｇｓｔｏｍ 、　Ａ、、　１９７４．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ。

１１ニア−１３）およびコンピューターモデリング（Ｆｌｅｔｔｅｒｉｅｋ。

Ｒ１およびＺｏｌｌｅｒ、　Ｍ、（編）、　１９８６．　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇ ｒａｐｈｉｃｓａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｍｏｄｅｌｉｎｇ、ｉｎ　Ｃｕｒ ｒｅｎｔ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ ｏｇｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ、　 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）が包含されるが それらに限定されるわけではない。

５．５．ＣＲ１関連誘導体、類似体、およびペプチドＣＲＩに関連する誘導体、 類似体およびペプチドの生産および使用も意図されており、それらは本発明の範 囲内にある。所望の免疫原性または抗原性を有するかかる誘導体、類似体または ペプチドは、例えばイムノアッセイに於いて、免疫化のために、治療上の目的な どに用いることができる。例えばＣ３ｂまたはＣ４ｂの結合、補体活性の調節、 または免疫刺激または食作用の促進等のような所望のＣＲＩの性質を保持し、あ るいはまたそれを阻害するかかる分子は、かかる性質のそれぞれインデューサー としてまたはインヒビターとして用いることができる。

本発明のＣＲＩ関連誘導体、類似体およびペプチドは当業上知られた様々な方法 で生産できる。このような生産をもたらす操作は遺伝子またはタンパク質レベル で行うことができる。例えば、クローン化ＣＲＩ遺伝子は当業上知られた多数の 任意の方法で修飾することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、１９８２　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ ｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　ｏ　ＣＲ１配 列をインビトロで、制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な部位で切断し、所望 の場合はさらに酵素的に修飾し、単離し、そして連結することができる（下記８ 項参照）。

ＣＲＩ関連誘導体、類似体、またはペプチドをコードする遺伝子の生産において は、修飾された遺伝子が、所望のＣＲＹ特異的活性をコードする遺伝子領域内に 、翻訳終止シグナルに中断されることなく、ＣＲＩと同じ翻訳の解読枠になるこ とが確保されるよう注意が払われるべきである。

さらに、ＣＲＩ遺伝子をインビトロまたはインビボで突然変異させて、翻訳、開 始、および／または終止配列を生成させおよび／または破壊するか、あるいはコ ード領域に変化を生成させ、そして／または新たな制限エンドヌクレアーゼ部位 を形成させるかまたは既に存在する部位を破壊させ、さらにインビトロ修飾を促 進することができる。突然変異誘発のための当業上知られた任意の方法を用いる ことができ、このような方法にはインビトロ特定部位の突然変異誘発（Ｈｕｔｃ ｈｉｎｓｏｎ。

Ｃ１ら、１９７８．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５３：６５５１）、Ｔ ＡＢ（商標）リンカ−（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用、などが包含されるがそれ らに限定されない。

ＣＲＩ配列の操作はタンパク質レベルでも行うことができる。多数の化学的修飾 のいずれでも既知の技法によ・りて行うことができ、これらには臭化シアン、ト リプシン、キモトリプシン、パハイン、■８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特 異的化学的分解ニアセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシン存在下 の代謝的合成；などが包含されるがそれらに限定されない。

さらに、ＣＲＩ関連類似体およびペプチドを化学的に合成することができる。例 えば、遺伝子発現の所望の機能（例えばＣ３ｂおよび／またはＣ４ｂ結合、免疫 刺激、補体調節、等）を仲介するＣＲＹの一部分に相当するペプチドをＤＮＡシ ンセサイザーを用いて合成することができる。

５．６．　ＣＲＩの使用 ５．６．１．アッセイおよび診断 ＣＲＩタンパク質、その類似体、誘導体、およびサブ配列、および抗−ＣＲＩ抗 体は診断に用途を有する。所望のＣＲＩ性質または機能を示す本発明の分子は、 かかる性質または機能をアッセイするために使用できる。

例えば、単独でおよび／または複合体の形でＣ３ｂおよび／またはＣ４ｂの結合 を示すＣＲＩタンパク質またはそのフラグメントは、例えば患者の体液のような 試料中のかかる物質の量を測定するアッセイに使用できる。

詳細な実施態様において、Ｃ３ｂ（例えば下記第■表、９項参照）　、１ｃ３ｂ またはＣ４ｂ（例えば、第■表参照）と結合する能力を有する細胞表面上に発現 する完全な長さのＣＲＩまたはＣＲＩ欠失変異種（例えば、下記８項に記載され ているもの）は、試料中のそれぞれＣ３ｂ、１Ｃ３ｂ、またはＣ４ｂのレベルを 測定するアッセイに使用できる。他の実施態様において、組換えＤＮＡ技術によ り構築された、膜横断配列を欠＜ＣＲＩタ〕／バク質またはそのフラグメントは １．：のように分泌され、使用される。

特別な実施態様（：゛おいて、Ｃ，３ｂおよび／またはＣ４ｂのかかる測定は補 体機能の指標として信頼でき、炎症性および免疫系障害の診断に作用である。か かる障害は、やけどまたは心筋梗塞誘導損傷による組織損傷、成人呼吸困難症候 群（ショック肺）、リウマチ様関節炎、全身性紅斑性狼癒のような自己免疫障害 、および望ましくないまたは、不適切な補体機能に関係した他の疾患または障害 を含むが、それらに限定されない（例えばＭｉｅｓｃｈｅｒ、　Ｐ、Ａ。および Ｍｕｔｔｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ。

Ｈ，Ｊ、、（編）、　１９７９．　Ｔｅｘｔ　Ｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｐ ａｔｈｏｌｏｇｙ。

２ｄ　Ｅｄ、、　Ｖｏｌｓ、　Ｉ　ａｎｄ　Ｉｆ、　Ｇｒｕｎｅ　ａｎｄ　５ｔ ｒａｔｔｏｎ、　ＮｅｗＹｏｒｋ；　Ｓａｎｄｂｅｒｇ、　Ａ、Ｌ、、　１９８ １．　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　 ａｎｄ　Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ、Ｊ、Ｊ、ら、（編） 、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　 ｐ、３７３；Ｃｏｎｒｏｗ、Ｒ，Ｂ、ら、１９８０．　Ｊ、　Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ 、　２３：２４２；　Ｒｅｇａｌ。

Ｊ、　Ｆ、およびＰｉｃｋｅｒｉｎｇ、　Ｒ，Ｈ，、１９８３，Ｉｎｔ、　Ｊ、 　Ｉｍｍｕｎｏ−ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　５ニア１；Ｊａｃｏｂｓ、　Ｈ，Ｓ、 、　１９８０．　Ａｒｅｈ、　Ｐａｔｈｏｌ。

Ｌａｂ、　１０４：６１７を参照）。

エピトープを含むＣＲＩタンパク質およびそのフラグメントはイノ１ノアツセイ を含むがそれに限定されないアッセイに用途を育する。使用できるイムノアッセ イには、少数例をあげれば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（エンザイムリ ンクトイムノソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、沈降反 応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、 イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロティンＡイムノア ッセイ、および免疫電気泳動アッセイ、のような技法を用いる競合および非競合 アッセイ系が包含されるがそれらに限定されない。

ＣＲ１遺伝子および、関連核酸配列およびサブ配列はハイブリダイゼーションア ッセイに用いることができる。かかるハイブリダイゼーションアッセイは、ＣＲ １発現に関連した炎症または免疫反応を監視するため、ＣＲ１発現の変化に関連 した特定の疾患状態を診断するため、患者のＣＲＩアロタイプを決定するため、 そしてＣＲＩ遺伝子および関連した遺伝子（例えばＣＲ２）の存在および／また は発現を検出するために使用することができる。

５．６．２．治　療 ＣＲＩタンパク質およびフラグメント、誘導体、およびそれの類似体はＣＲＩに より介在された機能の調節をするのに治療上有用である。かかる機能は、単独で または複合体の形でＣ３ｂおよび／またはＣ４ｂの結合、食作用の促進、補体調 節、免疫刺激、等を含むがそれらに限定されない。本発明のＣＲＩタンパク質お よび関連分子の作用をおよぼす投置は、免疫または炎症性障害のような、かかる 機能に関連した多くの疾患または障害に治療上の価値を育する（例えば、上記５ ．６．１項に記載されている障害）。例えば、所望の機能を示す完全な長さのＣ ＲＩまたはそのフラグメントおよび関連した分子は補体構成物Ｃ３ｂまたはＣ４ ｂの不可逆的不活性化を促進するファクターエコーファクターとして作用するそ の能力により（Ｆｅａｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、　１９７９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７６　：　５８６７；　ｌ１ｄａ、　Ｋ 、およびＮｕｓｓｅｎ−ｚｗｅｉｇ、　Ｖ、、　１９８１．　Ｊ、　ＥＸ、）、 　Ｍｅｄ、　１５３：１１３８）および／または副経路または主経路のＣ３また はＣ５コンパ−チーズを阻止する能力により補体の阻止に治療上の用途を有する 。

本発明の詳細な実施態様において、膜横断領域を欠き（例えば、大部分のＣ末端 ＳＣＲによりコードされたアルギニンからカルボキシ末端の欠失により）可溶性 ＣＲＩフラグメントの産生を生じるＣＲ１分子をコードさせるために発現ベクタ ーを構築できる。ひとつの実施態様において、かかるフラグメントは、単独でま たは複合体の形でＣ３ｂおよび／またはＣ４ｂと結合する能力を保持することが できる。特別な実施態様において、かかる可溶性ＣＲＩタンパク質はファクター エコーファクター機能を、もはや示さない。可溶性ＣＲＩ産物は患者にインビボ で投与し、可溶性ＣＲＩは、本来備わっている細胞表土のＣＲＩに対するＣ３ｂ および／またはＣ４ｂの結合競争に勝り、したがって細胞表面ＣＲＩファクター Ｉコーファクター機能を阻止し補体機能を増大する。

Ｃ３ｂが粒子および可溶性免疫複合体に共有的に付着した後、タンパク質分解プ ロセシングされて１Ｃ３ｂおよびＣ３ｄｇになるＣ３ｂの不活性化は２つの生物 学的結果を有する。すなわち増幅経路を経由して補体組織の過度の活性を防ぐこ と、およびＣＲＩ以外のレセプターと結びつくリガンドの形成である。１ｃ３ｂ フラグメントはＢ因子に結合できないので、この状態への転換は副経路増幅回路 経由の追随的補体活性を阻止する。しかしながら、１ｃ３ｂは、骨髄性単核球細 胞による食作用を介在する２つの補体レセプターである、ＣＲＩおよびＣＲ３に より結合し・５る。したがって、Ｃ３ｂから１Ｃ３ｂへの転換の主要な生物学的 帰結は、Ｃ３でおおわれた複合体のＣＲ１−およびＣＲ３介在のクリアランスを 妨げることなく補体活性を中止する。対照的に１Ｃ３ｂからＣ３ｄｇへの追随的 転換は、ＣＲ２とだけ相互作用するがＣＲＩおよびＣＲ３とは相互作用しないフ ラグメントを創る。この状況は、Ｂリンパ細胞、濾胞性樹状細胞および、おそら く真皮の上皮細胞を包含するＣＲ２を発現する細胞型に対するＣ３ｄｇ担持複合 体の補体依存結合を制限し、食作用細胞種との相互作用を減少させるかまたは遮 断する。細胞的かかわりあいの変化したパターンの生物学的帰結は、粒子および 複合体のクリアランスおよび分解にかかわる細胞よりもむしろ免疫反応の導入期 にかかわる細胞に対するＣ３ｄｇ担持複合体の標的であろう。したがって、ＣＲ １分子はクリアランス過程に影響を与えるのみならず、抗原提示および抗体産出 に関与するＣＲ２担持細胞種にも治療上使用できる。

他の実施態様において、Ｃ３ｂまたはＣ４ｂに結合し、および／または、副経路 または主経路のＣ３またはＣ５コンパ−チーズを阻止する能力を保持する、また はファクターＩ−コーファクターを保持するＣＲＩタンパク質またはそのフラグ メントは補体不活性化を促進するのに使用できる。かかる実施態様において、Ｃ ＲＩタンパク質またはフラグメントは望ましくないまたは不適当な補体機能に関 係する障害の治療に価値がある（例えば、ショック肺、やけどまたは２血性心臓 異常による組織損傷、自己免疫障害、炎症性疾患等）。

下記１１−１４項の実施例に詳記した特別の実施態様において、例えばインビト ロにおいて主経路の補体介在溶血反応、主経路Ｃ５ａ産生、主経路Ｃ３ａ産生ま たは好中球酸化的破裂を阻止する能力により示されるように所望の機能的活性を 保持する可溶性ＣＲ１分子は発現する。

特別の実施態様において、かかる可溶性ＣＲ１分子は、炎症およびその有害な作 用な減少するために、または心筋性梗塞の大きさを減少するために、または再潅 流損傷を防ぐ等のために、使用できる。インビボでの治療に有用な、かかるＣＲ １分子は逆受身アルサス反応（１４，１項参照）およびラット心筋性梗塞モデル （１４，３項参照）を含むがそれらに限定されない適業上知られる種々のモデル 系で検定される。

本発明のもうひとつの実施態様において、所望のＣＲ１性質または機能を阻止す ることを示すＣＲＩのフラグメントまたは類似体またはその誘導体は、その機能 に関連する疾患または障害を防ぐのにまたは治療するのに使用できる。

種々の放出系が知られており、そしてそれらをＣＲＩ及び関連分子の放出に使用 することができる。例えばリポソーム内カプセル化、遺伝子療法における造血幹 細胞子細胞による発現など。導入のための他の方法には、皮肉、筋肉内、腹腔内 、静脈内、皮下および鼻内および経口経路が包含されるがそれらに限定されない 。

（本頁以下余白） ６、実施例：ヒトＣ３ｂ／Ｃ４ｂレセプター（ＣＲＩ）のクローニングおよび配 列決定 ここで詳述する実施例に於て、５．５キロベースベア（Ｋｂ）のＣＲＩコード領 域のクローニングおよびヌクレオチド配列を説明する（Ｋｌｉｅｋｓｔｅｉｎ、 　Ｌ、Ｂ、ら、１９８７．　Ｊ。

Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６５：１０９５−１１１２）。

５、５　Ｋｂの範囲にわたる１０個の重なりあったＣＲＩ　ｃＤＮＡクローンを 扁桃腺のライブラリーから単離し、全体または一部を配列決定した。それらのク ローンの５′末端に始まり４．７　ｋｂ下流の終止コドンまで続く単一の長い読 みとり枠を同定した。ＣＲＩのＦアロタイプのコード配列について算出された６ ｋｂの８０％に当たる。３個の縦列で、同方向で、長い、４５０アミノ酸からな る相同反復（ＬＨＲ）を同定した。トリプシンペプチドの配列分析によって、Ｃ Ｒ１のＦアロタイプにおいて第４のＬＨＲの存在が証明された。ＬＨＲ間のアミ ノ酸同一性は第１と第３反復の間での７０％から、第１と第２反復のＮＨ，−末 端２５０アミノ酸の間での９９％までの範囲であった。

各々のＬＨＲは６０−７０アミノ酸からなる７個の短いコンセンサス反復（ＳＣ Ｒ）を含んでなり、これらは例えば相補的レセプタータイプ２、ファクターＢお よびＨ，Ｃ４結合タンパク質、およびＣ２のような他のＣ３／Ｃ４結合タンパク 質のＳＣＲと類似する。さらに別の２個のＳＣＲが’　ＬＨＲを２５アミノ酸か らなる単一の膜結合ドメインに結合する。したがってＣＲＩのＦアロタイプはお そらく少なくとも３０個のＳＣＲを含有し、そのうち２３個は既に配列決定され ている。各ＳＣＲは三重ループ構造を形成すると予想され、この構造に於て、４ 個の保存された％−シスチンがジスルフィド結合を形成する。半開構造として一 列にならぶ３０個のＳＣＲは原形質膜から１．１４０オングストロームにおよび 、免疫複合体と微生物細胞壁の間の空隙に位置するＣＲＩとＣ３ｂおよびＣ４ｂ との相互作用を容易にすることができよう。４３残基からなるＣ０ＯＨ末端細胞 質ドメインは、６アミノ酸の配列を含有し、これはプロテインギナーゼＣによっ てリン酸化される表皮成長因子レセプターに於ける配列と相同である。

６．１．材料および方法 ６．１，１．　ＣＲＩ　トリプシンペプチドの単離および配列洗浄したヒト赤血 球膜から、マトリックスレッドＡおよびＹＺ−１モノクローナル抗体アフィニテ ィークロマトグラフィーを続けて行うことによってＣＲＩを精製した　（Ｗｏｎ ｇ、Ｗ、Ｗ、ら、１９８５．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　８２： ３０３）。（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、ら、１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２ニア７１１）に記載のように、グラジェントおよびイソクラ チックの逆相ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）を連続して行うことに よって、トリプシンペプチドを調製し、単離した。４７０Ａタンパク質シークエ ンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｔｏｓ、Ｉｎｃ、、　Ｆｏｓｔｅｒ 　Ｃ１ｔｙ。

ＣＡ）を用いてトリプシンペプチド分析を行い、各分解サイクルの分析は１２０ ＰＴＨ−アミノ酸分析計（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉＯ３）’ＳｔｅｍＳ、　Ｉｎｃ。

）を用いて行われた。

６．１．２．　ｅＤＮＡクローンおよびゲノムクローンの単離記載（Ｗｏｎｇ、 　Ｗ、Ｗ、ら、１９８５．　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ　Ａｅａｄ、　Ｓｅｉ。

Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８２　：　７７１１．）のようにして、ヒト扁桃腺ポリ（Ａ ＞＋ＲＮＡからλｇｔｌｌ（：ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ＲＮＡプロッ トハイブリッド形成よって、扁桃腺ドナーはＣＲ１のＦ対立遺伝子間してホモ接 合性であった（同上）。

クローニング段階の前に、２から７Ｋｂの間の断片を包含するｃＤＮＡをアガロ ースゲル上で選択した。このライブラリーの最初の組換え率は、１１００ｎ　ｃ ＤＮＡ当り４．５×１０６組換え体であり、このライブラリーをエシエリヒア・ コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｙ１０８８株で増幅した。

ライブラリーをＣＲＩプローブ、ＣＲ１−１（ＡＴＣＣ番号５７３３０（ＣＲ１ −１プラスミド含有Ｅ、コリ、５７３３１（精製ＣＲＩ−ＩＤＮＡ））およびＣ Ｒ１−２（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、ら、１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：　７７１１）を用いてスクリーニン グした（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、１９８２．　Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　ｔ、ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂ。

ｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ ）　ｏ　これらのプローブはニックトランスレーションにより比活性２−８　ｘ 　１０”ｃｐｍ／μｇに予め放射性標識された。５０％ホルムアミド、５　Ｘ５ ＳＣ（Ｉ　Ｘ５ＳＣ：　１５ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウ ム）中で、４３°Ｃで、ハイブリッド形成を行い、フィルターを６０°Ｃで、Ｃ Ｒ２ｃＤＮＡクローンが検出されない条件である０、２ＸＳＳＣで洗浄した（Ｗ ｅｉｓ、　Ｊ、Ｊ、ら、１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３　：　５６３９）。陽性クローンを２回プラーク精 製した後、制限地図作成およびＤＮＡ配列分析を行った。

ヒト白血球ＤＮＡの５ａｕ３Ａ　１部分消化によって生じた１５−２０ｋｂフラ グメントを用いてゲノムライブラリーをＥＭＢＬ−３に構築した。最初の組換え 率は１．２Ｘ１０″であり、ライブラリーをＥ、コリＰ２３９２中で増幅させた 。このライブラリーもｃＤＮＡプローブＣＲ１−１およびＣＲｌ　−２を用いて スクリーニングした（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、ら、１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：　７７ｉ１）。

６．１．３．　ＤＮＡ配列分析 ｃＤＮＡクローンの制限断片をＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９にサブクロ ーニングし、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法（Ｓａｎｇｅ ｒ、　Ｆ、ら、１９７７、　Ｐｒｏｅ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７４：　５４６３）によっ て配列決定した。一部のクローンはエキソヌクレアーゼ■を用いて最初に作成さ れた定序欠失変異体によって、全体または部分的に配列決定された（Ｈｅｎｉｋ ｏｆｆ、　Ｓ、、　１９８４゜Ｇｅｎｅ　２８：３５１）。各領域は二本鎖で配 列決定され、はとんどの場合、各領域は２個の相互に無関係に単離されたｃＤＮ Ａクローンから構築されたＭ１３サブクローンで配列決定された（第２図）。Ｗ ｉｓｃｏｎｓｉｎ大学遺伝コンピューターグループパッケージ（Ｍａｄｉｓｏｎ 、　ＷＴ）を用いて配列データを分析した。

６．２．結　果 ６．２．１．　ＣＲＩ遺伝子のヌクレオチド配列分子量で選択した扁桃腺ｃＤＮ Ａライブラリーを、ＣＲＩｃＤＮＡクローン、λＴ８から得られたＣＲ１−１お よびＣＲｌ　−２プローブを用いてスクリーニングした（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、 ら、１９８５、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ 、　８２：　７７１１）。

１５個の陽性ファージを１．５　Ｘ　ｔｏ＠の組換え体から同定し、そのうち１ ３個は異なるクローンに相当する。１０個は制限地図を作成し、ジデオキシチェ インターミネーション法によって全体、または一部を配列決定した。

同一配列の重なり合いに基づいてｃＤＮＡクローンを整列させ（第２図）、５． ５ｋｂに及ぶことを見いだした（第３図）。ｃＤＮＡクローンの５゛末端に始ま り終止コドンの４．７ｋｂ下流にいたる単一の長い読みとり枠を同定した。この ライブラリーに於けるＣＲＩに関するコード配列は、非グリコジル化レセプター の推定分子量２２０．０００ダルトンに基づいて６ｋｂであると予想される（Ｗ ｏｎｇ。

Ｗ、　Ｗ、ら、　１９８３．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　７２：　６８ ５）。したがって、これらのクローンは推定コード配列の約８０％をカバーする 。

クローンＴ４９．　ｌ及びＴ５５．　ｌは、その５゛末端にコード配列を含有す る。このことはさらに他の５゛コードおよび非コード配列が同定されずに残って いることを示す。

３′領域に於て、重なり部分のあるクローン、Ｔ８．２、Ｔ４３、ｌおよびＴ８ ７．　ｌは、各クローンの同一配列によってコードされる膜貫通および細胞質領 域を含有する。最も３′側に広がるクローン１８．２はポリ（Ａ）配列を持たな い８０７ｂｐの非翻訳領域を含有する。クローンＴ６．１およびＴ５５．　ｉに 見いだされた配列と比較して、クローンＴ８．３はヌクレオチド１．４０６−１ ．４９７の９１ｂｐの欠失を有し、クローンＴ４０．１はヌクレオチド１．４９ ８−１．５０７の９ｂｐの欠失を有する。これらの欠失は、５゛スプライス位と 相同な配列を有する領域に生じたが、このような欠失はｍＲＮＡに於けるスプラ イシングエラーを意味するのかもしれない。クローンＴ４９．１およびＴ５５． １は読みとり枠フレームのヌクレオチド１４７と１４８の間に１１０ｂｐの挿入 を有する（第３図）。この配列は、扁桃腺ポリ（Ａ）″ＲＮＡのプロットに対し てハイブリッド形成しなかったこと、５′スプライス部位を有すること（Ｂｒｅ ａｔｈｎａｃｈ、Ｒ，ら、１９７８．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　７５　：　４８５３Ｘ第３図）、ＣＲＩゲノムクローンに 於てｃＤＮＡ配列に隣接すること、およびその読み枠かシフトしていることから 、イントロンの一部分であると判定される。クローンＴ９．４は、扁桃腺ポリ（ Ａ）″ＲＮＡのブロックに対してハイブリッド形成しない０．８８ｋｂの介在配 列を３′末端に育する。

６．２，２．　ＣＲＩのヌクレオチドおよびアミノ酸配列分析ＣＲＩのヌクレオ チド配列のドツトマトリクス分析（第３図）は２タイプの内部相同性を示した（ 第４図）。

第１のタイプの内部相同性は、太く切れ目のない線で表され、これは３個の縦列 で、同一方向で、相同性の高いｌ。３５ｋｂの反復を示す。これらのヌクレオチ ド配列はＣＲＩの長い相同反復配列（ＬＨＲ）をコードする。第２のタイプの反 復は点線の平行線によって表され、これは相同性の比較的低い領域を示す。この ような配列は１９０−２１０ヌクレオチド毎に現われ、ＣＲＩの短いコンセンサ ス反復配列をコードする。

ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列を第５図に示す。ＬＨＲ−Ｂ、　ＬＨ Ｒ−ＣおよびＬＨＲ−Ｄと命名された３個のＬＨＲを並べてそれらの相同性を明 示する。ＬＨＲ−Ｂは残基１から残基４３８までであり、ＬＨＲ−Ｃは残基４３ ９−８９１に相当し、ＬＨＲ−Ｄは残基８９２から１，３４１におよぶ。ＬＨＲ −Ｃの４５１−６９４残基は、ＬＨＲ−Ｂの残基１−２４４と９９％同一である が、ＬＨＲ−Ｄの対応する残基とはわずかに６１％同一である。対照的に、ＬＨ Ｒ−Ｃの残基６９５−８９１はＬＨＲ−Ｄの残基１．１４８−１．３４１と９１ ％同一であるが、ＬＨＲ−Ｂの対応する領域とはわずかに７６％同一である。し たかってＬＨＲ−Ｃは、ＬＨＲ−Ｂの前半およびＬＨＲ−Ｄの後半にきわめて相 同な配列を含んでなるハイブリッドであると思われる。ＬＨＲに続いて反復のな い二つのＳＣＲがあり、２５残基の疎水性セグメントおよびそのＳＣＲに対して 配列相同性を持たない４３アミノ酸のＣ００Ｈ−末端領域である（第５図）。

５’　１．３　ｋｂのＣＲＩコード配列は第４のＬｌ（Ｒ，ＬＨＲ−Ａに相当す る（上記第１図および下記第７項参照）。この結論は、赤血球ＣＲＩのトリプシ ンペプチドの分析によって支持された。１０個のトリプシンペプチドはｃＤＮＡ クローン由来のアミノ酸配列と同一の配列を有する（第１表）。

（本頁以下余白） 第１表 得られたアミノ酸配列中に見出されたＣＲＩ６６　ＶＤＦＶＣＤＥＧＦＱＬＫＧ Ｓ−Ａ　３３０−３４５２８　ＧＡＡＳＬ−−−−ＱＧ−ＷＳＰＥＡＰ　７３２ −７４９．１．１８５−１．２０２ ４９−−−−−−−−−−−−ＩＦＣ−ＮＰ−ＡＩＬ　８０５−８２６．１，２ ５８−１．２７９ ３５　ＣＱＡＬＮＫＷＥＰＥＬＰＳＣ３Ｒ２２８−２４３，６７８−６９３４１ ｃ　ＤＫＤＮＦＳＰＧＱＥＶＦＹＳＣＥＰＧＹＤＬＲ２６０−２８１３４ｈ　Ａ Ｙ−ＹＴＣＤＰＨＰＤＲＧＴＳＦＤＬＩＧＢＳＴＩＲ３９３−４１７４４ｄ　Ｖ ＣＱＰＰＰＩＥＩＬＨＧ　６９４−７０４．１，１４７−１．１５７ ５４ｄ　ＶＦＥＬＶＧＥＰＳＩＹＣＴＳＮＤＤＱＶＧＩＷＳＧＰＡＰＱ　１５２ −１７９．６０２−６２９５７ｂ　ＹＥＣＲＰＥＹＹＧＲＰＦＳ　１９−３１． ４６９−４８１３９ｂ　ＬＩＧＨ３ＳＡＥＣＩＬＳＧＮＡＡ　８５−１ｏ。

＊得られたアミノ酸配列内に見いだされたヒト赤血球ＣＲＩ由来のトリプシンペ プチド。右側の番号範囲は、得られたアミノ酸配列に於けるそのペプチドの位置 を示す。ペプチド６６．２８および４９にある各々のダッシュは、多数の残基が そのサイクルで同定されたことを示す。ペプチド３４ｂのダッシュは、そのサイ クルで残基が同定されなかったことを示す。

各ＬＨＲは７個の６０−７０アミノ酸ＳＣＲを含んでなり、これらのＳＣＲはＣ ３およびＣ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）群を特徴付ける（第６Ａ図）。ＣＲＩ の２３のＳＣＲ間の最大の相同性は、整列にスペースを導入することによって観 察された（第６Ａ図）。各反復配列に於ける平均６５残基のうち２９が保存され ている。すべてのＳＣＲに存在する６個の残基がある。４個の％シスチン（これ らは比較的類似した位置にあり、このことはこれらの各々が不可欠なジスルフィ ド結合に関係する可能性を示唆する）。

およびトリプトファン、および第２の各シスチンの後の第２のグリシン（第６Ａ 図）。変化しない％シスチンの間の配列をＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎの算法（ Ｃｈｏｕ、　Ｐ、Ｙ。

およびＦａｓｍａｎ、　Ｇ、Ｄ、、　１９７４．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 １３：２２２）を用いて二次構造分析することによって、β−ターン形成の可能 性が高く、α−へリックス形成の可能性は低いことが予想された。二つのＣＲＩ ゲノムクローン、２．３８（第６Ｂ図）および２゜４６の配列分析は、５ＣＲ− １４（第６Ａ図）が単一のエキソンによってコードされること、および５ＣＲ− ２３のＣ００Ｈ−末端がエキソンの末端に対応することを示す。したがって、フ ァクターＢ（Ｃａｍｐｂｅｌｌ、　Ｒ，Ｄ、およびＢｅｎｔｌｅｙ、　Ｄ、Ｒ， ，１９８５，ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｒｅｖ、　８７：１９）やＩＬ−２−Ｒ（Ｌｅｏｎａｒｄ、　Ｗ、Ｊ、ら、１９ ８５．５ｃｉｅｎｃｅ２３０：６３３）のＳＣＲについて示されたように別々の エキソンがＣＲＩのＳＣＲをコードする可能性がある。

ＣＲＩのＳＣＲのコンセンサス配列をこのような特徴的構造を有する一部の別の メンバーのＳＣＲと比較する（第７図）。これらのメンバーはＣ３／Ｃ４結合機 能を有するタンパク質、すなわちＣＲ２（Ｗｅｔｓ、　Ｊ、　Ｊ、ら、１９８６ ．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３　： 　５６３９）　、　Ｃ４ｂｐ（Ｃｈｕｎｇ、　Ｌ、Ｐ、ら、１９８５．　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、　Ｊ、　２３０：１３３）、ファクター　Ｈ（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ 、Ｔ、ら、１９８６．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６＋３４０７）、ファクター Ｂ　（Ｍｏｒｌｅｙ、　Ｂｊ、およびＣａｍｐｂｅｌｌ。

Ｒ，Ｄ、、１９８４．ＥＭＢＯＪ、　３：１５３；　Ｍｏ１ｅ、　Ｊ、Ｅ、ら、 １９８４゜Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５９：３４０７）　、およびＣ２（ Ｂｅｎｔｌｅｙ、　Ｄ。

Ｒ，およびＰｏｒｔｅｒ、Ｒ，Ｒ，、１９８４，Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｅｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８１：１２１２；　Ｇａｇｎｏｎ、　Ｊ、、 　１９８４．　Ｐｈ１ｌｏｓ、　Ｔｒａｎｓ、　Ｒ，Ｓｏｃ、　Ｌｏｎｄ、Ｂ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｓｃｉ。３０６：３０１）のみならず、例えばインターロイキン −２レセプター（ＬｅｏｎａｒｄＷ、　Ｊ、ら、　１９８５，５ｃｉｅｎｃｅ　 ２３０＋６３３）、β、−糖タンパク質１　（Ｌｏｚｉｅｒ、Ｊ、ら、１９８４ ．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、８１：３６４０）、Ｃ１ｒ（Ｌｅｙｔｕｓ、Ｓ、Ｐ、ら、１９８６ ．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５：４８５５）　、ハプトグロビンα鎖（Ｋ ｕｒｏｓｋ）Ｉ。

Ａ、ら、１９８０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ 、　７７：３３８８）および第Ｘ１ｌｌｂ因子（Ｉｃｈｉｎｏｓｅ、　Ａ、ら、 １９８６．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５：４６３３）のような、このよう な機能を有することが知られていないタンパク質をも包含する。

各シスチン残基はすべてのタンパク質のＳＣＲに於て不変であるが、例外は第３ の各シスチンを欠（ハプトグロビンである。ｌ・リブトファンも不変であるが、 β２−糖タンパク質Ｉの５番目のＳＣＲおよび第ＸｌｌＩｂ因子に存在する反復 のうちの２個が例外である。保存されているがすべてのＳＣＲに存在するわけて はない他の残基は、各シスチンのまわりでクラスターを形成する傾向がある。フ ァクターＢおよびＣ２に一つだけ遊離のチオール基があり（Ｃｈｒｉｓｔｉｅ、 　Ｄ、　Ｌ、およびＧａｇｎｏｎ、　Ｊ、、　１９８２、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　 Ｊ、　２０１：５５５；Ｐａｒｋｅｓ、　Ｃ，ら、１９８３．　Ｂｉｏｃｈｅｍ 。

Ｊ、　２１３：２０１）、β２−糖タンパク質■のＳＣＲでは１番目の各シスチ ンが３番目と、２番目が４番目とジスルフィド結合している（Ｌｏｚｉｅｒ、　 Ｊ、ら、１９８４．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ 、　Ａ、　８１：３６４０）。

得られたＣＲＩのアミノ酸配列には、Ｎ−結合オリゴ糖となる可能性のなる部位 が１７個あり、そのすべてが細胞外領域にある（第６図Ａ）。ツニカマイシン存 在下および非存在下で合成されたＣＲ１分子量の相違（Ｌｕｂｌｉｎ、　Ｄ、Ｍ 、ら、１９８６．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６１：５７３６）とグルコ サミン含有量の分析（Ｓｉｍ、　Ｒ，Ｂ、、　１９８５．　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、 　Ｊ、　２３２：８８３）は、わずかに６−８個のＮ−結合複合オリゴ糖の存在 を示唆し、可能性のある部位のすべてが利用されるわけではないことを示す。例 えば、得られたアミノ酸配列（第５図）の残基２６３のアスパラギンは、ペプチ ド４１ｃ（第１表）で同定されたが、このことはこの部位にグリコジル化のない ことを示す。対照的に、ペプチド３４ｂの未同定のアミノ酸は、おそらく残基３ ９５　のグリコジル化されたアスパラギンに相当する。

５、５　ｋｂのｃＤＮＡで同定された繰り返しのないＣＲＩ配列だけが、Ｃ００ Ｈ−末端領域に存在する。この領域の二次構造分析によって、単一の２５残基か らなる推定の膜−結合セグメントが同定される。このセグメントは強い疎水的性 質を存し、α−ヘリックスを形成する可能性が非常に強い（第５図）。この配列 に続いてすぐに多くの膜タンパク質に特育の性質である４個のプラスに荷電した 残基がある。ＣＲＩの推定細胞質領域は４３残基を有してなり、６アミノ酸から なる配列、ＶＨＰＲＴＬ、を含有する。この配列は表皮成長因子（ＥＧＦ）レセ プターおよびｅｒｂ　Ｂガン遺伝子産物におけるプロティンキナーゼＣリン酸化 部位、ＶＲＫＲＴＬ、と相同である（Ｈｕｎｔｅｒ。

Ｔ、ら、１９８４．　Ｎａｔｕｒｅ　３１１：４８０；　Ｄａｖｉｓ、　Ｒ，Ｊ 、およびＣｚｅｃｈ、　Ｍ、Ｐ、、　１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

８２　：　１９７４）。扁桃腺ＣＲＩの細胞質領域にはチロシン残基は存在しな い。

６．３考　察 ＣＲＩのＦアロタイプの一次構造の約８０％が、重なりあったｅＤＮＡクローン の配列決定により得られた。この分析で観察されたＣＲＩのもっとも他と異なる 構造上の特徴は、縦列で、同方向の、４５０アミノ酸からなるＬＨＲの存在であ り、４個のＬＨＲが２　、０００残基の推定ポリペプチド鎖長を有するＣＲＩの Ｆアロタイプに存在すると゛　予想される（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、ら、１９８３ ．　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ。

７２：６８５；　Ｓｉｍ、　Ｒ，Ｂ。、１９８５．　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　Ｊ。２ ３２：８８３）。

３個のＬＨＲがクローニングされ、配列決定された一方で、第４のＬＨＲの存在 に関する証拠がトリプシンペプチドの分析によって与えられた。各ＬＨＲは、他 のＣ３／Ｃ４結合タンパク質の基本的な構造単位である７個のＳＣＲで構成され る。ＳＣＲ当りの４個の各シスチンの保存、第１と第３の、および第２と第４の ％シスチンがジスルフィド結合におそらく関与すること（Ｌａｚｉｅｒ、　Ｊ。

ら、１９８４．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ 、　８１：３６４０）、モしてβ−ターンによくみられるプロリン、グリシン、 およびアスパラギンのような保存されたアミノ酸の存在（Ｒｏｓｅ、　Ｇ、Ｄ、 ら、）９８５．　ＡＤｖ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍ、３７：１）は、ＳＣＲ がジスルフィド結合によって維持される三重ループ構造を形成するという提案に 至る（第８図）。

各シスチンに関するこのような役割は、穏やかな条件でトリプシン処理したＣＲ Ｉ（Ｓｉｍ、　Ｒ，Ｂ、、　１９８５．　Ｂｉｏｅｈｅｍ、Ｊ、　２３２：８８ ３）およびファクターＨ（Ｓｉｍ、　Ｒ，Ｂ、およびＤｉＳｃｉｐｉｏ、　Ｒ， Ｇ、、　１９８２．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２０５：２８５）が非還元条件 下で５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析したときには 未処理の分子と同様に移動し、還元後は多数のトリプシン断片と同様に移動する という発見により支持される。

このような一連の縦列に反復される５ＣＲｓは、ファクターＨについて、および ヒトＣ４ｂｐの各サブユニットについて提出された延長構造（第８図）を形成す ることが予想される（Ｓｉｍ、　Ｒ，Ｂ、およびＤｉＳｃｉｐｉｏ、　Ｒ，Ｇ。

、　１９８２゜Ｂｉｏｅｈｅｍ、　Ｊ、　２０５：２８５；　Ｗｂａｌｅｙ、　 Ｋ、およびＲｕｄｄｙ、　ｓ、１１９７６、Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１４４　： 　１１４７；　Ｄａａｈｌｂａｃｋ、Ｂ、ら、１９８３、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔ ｌ　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０二３４６１）　。

Ｃ４ｂｐのサブユニットの電子顕微鏡による研究は、３００Ｘ３０オングストロ ームの大きさであることを示した（Ｄａｈｌｂａｃｋ、Ｂ。ら、１９８３．　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、Ａ、　８０：３４６ １）。各サブユニットは８個のＳＣＲから構成される（Ｃｈｕｎｇ、　Ｌ、Ｐ、 ら、１９８５．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２３０：１３３）ので、１個のＳＣ Ｒは３８　Ｘ　３０オングストロームであると算出される。ＣＲＩのＳＣＲが同 様の大きさを有することおよびＦアロタイプが３０個のＳＣＲを有することを考 えるとレセプターは細胞膜から１，１４０オングストロームはど伸びることがで きるであろう。好中球上でＣＲ１と結合したフェリチン−標識抗体がしばしば原 形質膜の外葉から５００オングストロームであった（Ａｔ＋ｒａｈａｍｓｏｎ、 　Ｄ、　Ｒ，およびＦｅａｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、　１９８３．　Ｌａｂ、　Ｉｎ ｖｅｓｔ。

４８：１６２）という初期の発現はこのようなＣＲＩ構造の予想と矛盾しない。

このようなＣＲＩの延長構造は、レセプターを担う細胞と、免疫複合体内の比較 的到達しにくい部位や微生物細胞表面に共有結合したＣ３ｂとの相互作用を容易 にするであろう。

ＳＣＲが主要なそしておそらく唯一のＣＲＩの細胞質外要素であるという発見は 、もっばらＳＣＲだけで、またはおもにＳＣＲで構成される二つの血漿タンパク 質であるファクターＨおよびＣ４ｂｐとレセプターとの間の密接な関係について 構造的な証拠を与える（Ｃｈｕｎｇ、　［７，Ｐ、ら、１９８５、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、Ｊ、　２３０：１３３；　Ｋｒ１ｓｔｅｎｓｅｎ、Ｔ、ら、１９８６゜Ｊ、 　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６：３４０７）　、　ＣＲＩは最初にファクターＨ様活 性を有する赤血球膜タンパク質として界面活性剤可溶化後に単離され（Ｆｅａｒ ｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、１９７９．　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、　 Ｕ、Ｓ、Ａ、　７６：５８６７）、その後原形質膜上に存在するときはファクタ ーＨおよびＣ４ｂｐの調節機能を有することが明らかになった（Ｌｔｄａ、　Ｋ 、およびＮｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ、　Ｖ、、　１９８１．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍ ｅｄ、　１５３：１１３８）　、　ＣＲＩ。

ファクターＩ］、およびＣ４ｂｐの構造的多型性の遺伝子を分析することによっ て、これら３つのタンパク質をコードする遺伝子が連なっていることが示され（ ｄｅ　Ｃｏｒｄｏｂａ、　Ｒ，ら、１９８５．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、１ ６１：１１８９）、この連鎖群の、および構造的に関係のあるレセプター、ＣＲ ２、の遺伝子座が、生体内原位置ハイブリッド形成により、また体細胞ハイブリ ッドの分析により、第一染色体の長腕、バンドｑ３２上にあることが示されてい る（Ｗｅｉｓ、　Ｊ、Ｈ，ら、１９８７．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３８＋ ３１２）。本研究以前に、これらのタンパク質問の構造的な関連性についての唯 一の証拠は、それらのアミノ酸組成の有意な類似であった（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ 、ら、１９８５．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　８２　：　３０ ３）。したがって、このようなＣＲＩにおける少な（とも２３のＳＣＲの発見は 、レセプターと、同様の機能を持つタンパク質であるファクターＨおよびＣ４ｂ ｐとの構造的な関係（Ｃｈｕｎｇ、　Ｌ、Ｐ、ら、１９８５．　Ｂｉｏｃｈｅｍ 。

Ｊ、　２３０：１３３：　Ｋｒ１ｓｔｅｎｓｅｎ、　Ｔ。ら、１９８６．　Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１３６：３４０７）　）そし、てそれぞれＣ３ｂおよびＣ４ｂと酵素複合体を形 成する構成要素であるファクターＢおよびＣ２のＢａおよびＣ２ｂフラグメント との構造的な関係（ＭｏｒｌｅＬ　Ｂ、Ｊ、およびＣａｍｐｂｅｌｌ、　Ｒ，Ｄ 、、　１９８４．　ＥＭＢＯＪ、　３：１５３；　Ｍｏ１ｅ、Ｊ、Ｅ。ら、１９ ８４．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９：３４０７；Ｂｅｎｔｌｅｙ、　 Ｄ、Ｒ，およびＰｏｒｔｅｒ、　Ｒ，Ｒ，、１９８４，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｅａａ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。８１：１２１２；　Ｇａｇｎｏｎ、　Ｊ 、、　１９８４、　Ｐｈ１ｌｏｓ、　Ｔｒａｎｓ、Ｒ，Ｓｏｃ、　Ｌｏｎｄ、Ｂ 、　Ｂｉｏ、　Ｓｃｉ。３０６　：３０１）を直後、きちんと明示するものであ る。しかしながら、ＳＣＲはいくつかの補体以外のタンパク質にも発見されてお り（Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｒ，Ｄ、およびＢｅｎｔｌｅｙ、　Ｄ、Ｒ，、１９８５ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ、８７：　１９；　Ｌｏｚｉｅｒ、　Ｊ、ら、１９ ８４．　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ、　Ｓ、Ａ、　８ ｍ＋３６４０；　Ｌｅｙｔｕｓ、　Ｓ。

Ｐ、ら、１９８６．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５　：　４８５５；　Ｋｕｒ ｏｓｋｙ、　Ａ、ら、１９８０、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７７：３３８８；　Ｉｃｈｉｎｏｓｅ、　Ａ、ら、１９８ ６．　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５：４６３３）（第７図）それが必ずし もＣ３／Ｃ４結合構造を表していないことを示す。

ＳＣＲを存するタンパク質の中で、ＣＲＩは、この基本構造および遺伝ユニット をＬＨＲの高次構造ユニット中に編成した点で独特である。Ｓアロタイプの発現 に関連するゲノムＤＮＡの１４．５ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメントの分析は、Ｃ ＲＩにおける少なくとも一つの反復するゲノムユニットが、少なくとも５個のＳ ＣＲとそれらのフランキンゲイントロンをコードするエキソンを含有するＤＮＡ の延長セグメントであることを示唆した（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、ら、１９８６、 　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６４：１５３１）。これらの研究はまた、Ｆ対 立遺伝子に存在する数と比較して、Ｓ対立遺伝子がこのゲノムユニットの付加的 コピーを含有することを示唆した。この観察を、トリプシンペプチドマツピング 研究（Ｎｉｃｋｅｌｌｓ、　Ｍ、Ｗ、ら、１９８６．　Ｍｏ１．　Ｉｍｏ＋ｕｎ ｏｌ。

２３：６６１）およびＬＨＲが−４０−５０ｋＤのペプチドに相当するというこ こでの発見と組み合わせることによって、われわれはＳアロタイプ（２９０ｋＤ ）に付加的なＬＨＲが存在することを、Ｆアロタイプ（２５０，０００ダルトン 分子量）の４個のＬＨＨの推定値と比較して、予想することができる。

重複現象に関する証拠を提供することに加えて、ＬＨＲの配列はまた、ＣＲＩ遺 伝子内で変換現象が起こったことを示唆する。ＬＨＲ−Ｂおよび−Ｄは、相互の 全長にわたって６７％同一であるが、これにたいしてＬＨＲ−ＣはＬＨＲ−Ｂと ＮＨ２−末端４　ＳＣＲに於て９９％同一であり、ＬＨＲ−ＤとＣ００Ｈ−末端 ３　ＳＣＲに於て９１％同一である。このような機構は、このハイブリッドプラ スミドの起源に於て同一の親対立遺伝子の間で一回組換えが起きただけでは生じ なかったであろう。むしろハイブリッドＬＨＲは、ＬＨＲ−Ｃ前駆体にある配列 がＬＨＲ−ＢまたはＬＨＲ−Ｄに存在する配列によって置き換えられるような遺 伝子変換によって生じた可能性がある（Ａｔｅｈｉｓｏｎ、　Ｍ、およびＡｄｅ ｓｎｉｋ、　Ｍ、、　１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

８３　二２３００）。また１、これらのＬＨＲｉこおけるほとんど完全な同一性 および相同配列の正確な配列（第５図）は、遺伝子変換を含む機構によって維持 されたのかもしれない。ＬＨＲをコードするＣＲＩ遺伝子セグメントの介在配列 間の相同性の程度の分析は、遺伝子変換が機能的制約に基づく選択のどちらが配 列分岐を厳密に限定したかを決定するはずである。

以前の研究がＣＲＩが一価であることを示唆した（Ｗｉ　ｌ５ｏｎ。

１、　Ｇ、ら、１９８２．　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３０７：９８ １）が、各々のＬｌ（Ｒは単一のＣ３ｂ／Ｃ４ｂ結合ドメインに相当し、それに よってレセプターは多価となり、そして多数のＣ３ｂおよびＣ４ｂ分子を担う複 合体の結合に適応される。あるいはまた、異なるＬＨＲがそれぞれＣ３ｂおよび Ｃ４ｂの結合に対応しく下記第９項参照）、ＣＲＹに於けるファクターＨおよび Ｃ４ｂｐ活性の組合せに関する構造的な基礎を与える。最後に、ＣＲＩのＬＨＲ は、提出された構造モデル（第８図）によって示唆されるようにＣＲＩを原形質 膜から伸長させるのに有用な構造ドメインに相当する可能性があり、ＮＨ，−末 端領域のＳＣＲはファクターＨについて見いだされたようにＣ３ｂおよびＣ４ｂ と結合する（Ｓｉｍ、　Ｒ，Ｂ、およびＤｉＳｃｉｐｉｏ、　Ｒ，Ｇ、、　１９ ８２．　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ、　２０５：２８５；Ａｌ５ｅｎｚ、　Ｊ、ら、１９８４．　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　Ｊ、　２２４：３８９）。ホルボールエステルによるプロティンキナーゼＣ の活性化は、好中球、単球、および好酸球においてＣＲＩのリン酸化を誘導しく Ｃｈａｎｇｅｌｉａｎ、　Ｐ、　Ｓ、およびＦｅａｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、１９８ ６．　Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、１６３：１０１）　、４３アミノ酸からなるＣ ＲＩ細胞質ドメインは、上皮成長因子においてプロティンキナーゼＣによってリ ン酸化される部位と相同な配列を有する（Ｈｕｎｇｅｒ、　Ｔ、ら、１９８４゜ Ｎａｔｕｒｅ　３１１：４８０；　Ｄａｖｉｓ、　Ｒｊ、およびＣｚｅｃｈ、　 Ｍ、Ｐ、、１９８５、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、 Ｓ、Ａ、　８２：　１９７４）　、　Ｌかしながら、この細胞質の配列は扁桃腺 ライブラリーの三つの独立したクローンに於て見いだされたが、それはＢ細胞Ｃ ＲＩのものである可能性が最も高く、このＣＲＩはプロティンキナーゼＣによる 活性化の後にリン酸化されない（Ｃｈａｎｇｅｌｉａｎ、　Ｐ、Ｓ、およびＦｅ ａｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、。

１９８６、　Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、　１６３：１０１）。

７、実施例：ＣＲ１５°ｃＤＮＡ配列は第４の長く相同な反復を含有する ＣＲＩの部分的なｃＤＮＡ配列の分析により、４５０アミノ酸からなる三つのＬ ＨＲ，ＬＨＲ−Ｂ、　ＬＨＲ−Ｃ，ＬＨＲ−Ｄを含み、その各々がＣ３／Ｃ４結 合タンパク質に特徴的な６５アミノ酸からなる７個の短いコンセンサス反復（Ｓ ＣＲ）を含んでなる構造が明らかになった（上記第６項参照）。ここで述べる実 施例に於て、本発明者らは５°ｃＤＮＡクローンの配列決定によって第４のアミ ノ末端ＬＨＲ，ＬＨＲ−Ａ（Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｌ、Ｂ、ら、１９８７． 　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　４　：　１８０）のクローンニングおよびヌクレオチ ド配列を説明する。ＬＨＲ−Ａの分析により、５個の３°ＳＣＲに於てＬＨＲ− ＡはＬＨＲ−Ｂに９９％相同であるが、２個の５’　ＳＣＲにおいては６１％し か相同でないことが明らかになった。

７．１．材料および方法 ７．１，１゜ｃＤＮＡライブラリーの構築記載　（ＣＨｉｒｇｗｉｎ、　Ｊ、Ｍ 、ら、１９７９．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８：５２９０；　Ａｖｉｖ、 　Ｈ，およびＬｅｄｅｒ、　Ｐ、、　１９７２．　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、６９：１４０８；　Ａｕ５ｕｂｅ１．　Ｆ 、Ｍ、ら、１９８７、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ）に従い、以下の改変を加えて、選択的にプライマーを用いたｃＤＮＡラ イブラリー、λＨＨ１をＤＭＳＯ誘導細胞から精製した３μｇのポリ（Ａ）”　 ＲＮＡから構築した。ＬＫ３５．１．３５−マーオリゴヌクレオチド、５゜−Ｔ ＧＡＡＧＴＣＡＴＣＡＣＡＧＧＡＴＴＴＣＡＣＴＴＣＡＣＡＴＧ　ＴＧＧＧＧ− ３’をオリゴ（ｄＴ）１＊−＋−の代わりに用い、４０μＣｉのα３２Ｐ−ｄＣ ＴＰを第二のストランド合成の間に添加した。ｃＤＮＡの３分のｌがλｇｔｌｌ にクローニングされ、ｅＤＮＡライブラリ・−が上記６，１．２項に従ってヒト 扁桃腺ポリ（Ａ）”ＲＮＡから構築された。７５０．０００個の相互に無関係な 組換え体が得られた。

７．１．２．　クローンの単離、プローブ、およびＤＮＡ配列分析 ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いられたプローブは、ＣＲ Ｉ　−１（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ。ら、１９８５゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：　７７１１）（ＡＴＣＣ番号５７３３ １）、ＣＲ−２（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、ら、上記）　、ＣＲ１−４（Ｗｏｎｇ。

Ｗ、　Ｗ、ら、１９８６．　Ｊ、　ＥＸり、　Ｍｅｄ、　１６４：１５３１）、 および第１図でヌクレオチド１０１−３５２に相当するｃＤＮＡクローンλＨ３ ，１の０．５　ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメント由来の２５２ｂｐＳａｕ３Ａ−フ ラグメントであるＣＲＩ−１８であった。高緊縮条件下で、ＣＲＩ−１８はＬＦ Ｒ−ＡのＮＨ２−末端ＳＣＲまたはシグナルペプチドのいずれかをコードしたｃ ＤＮＡにに対してのみハイブリッド形成する。ｃＤＮＡクローンのインサートを 、フラグメントのＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９へのサブクローニングの 後（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，ら、１９８５．　Ｇｅｎｅ２８：３ ５１）、ジデオキシヌクレオチド法（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、ら、１９７７、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７２：５４６３ ）によって配列決定した。

７．２．結　果 ７．５Ｘ１０’の組換え体を含有する特異的なプライマーを用イたλｇｔｌｌ　 ｃＤＮＡ　ライブラリーを、ＤＭＳＧ誘導ＨＬ−６０細胞由来のポリ（Ａ）′″ ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを用いて調製した。これらの細胞はＣＲＩのＦア ロタイプのみを発現するが（Ｌｕｂｌｉｎ、　Ｄ、Ｍ、ら、１９８６．　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６１＋５７３６）　、これは４個のＬＨＲを有すると予想される （Ｌａｐａｔａ、　Ｍ、Ａ、ら、１９８４．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅ ｓ。

１２：５７０７）。プライマー、ＬＫ３５．１　ハ第３図に示ｔｃＲ１（７）部 分的なｃＤＮＡ配列のヌクレオチド８９６−９３０に相当するアンチセンス３５ −マーであった。このオリゴヌクレオチドが逆転写条件下でＬＨＲ−Ｂ、　ＬＨ Ｒ−ＣおよびＬＨＲ−Ｄとハイブリッド形成することが示された。ＣＲＩ　ｃＤ ＮＡプローブ、ＣＲ１１およびＣＲ１−４の混合物を用いてスクリーニングされ た３、８ＸＩＯ’個の増幅していない組換えファージの平板に於て、２５０個の 陽性コロニーが同定された。３８個の陽性クローンを取りあげてプラーク精製し た。これらのクローン由来のＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡのサザンプロットを、２３− マーオリゴヌクレオチド、ＫＳ２３．１．５’　−ＣＴＧＡＧＣＧＴＡＣＣＣＡ ＡＡＧＧＧＡＣＡＡＧ−３’　を用いてスクリーニングした。このオリゴヌクレ オチドは第３図の部分的なＣＲＩ　ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド７６３−７８５ に相当する。このプローブは高度に緊縮な条件下で、ＬＨＲ−Ｂをコードする配 列に於て一つの部位でハイブリッド形成するが、ＬＨＲ−ＣまたはＬＨＲ−Ｄを コードする配列ではハイブリッド形成しない。クローンのλＨ７，４（第９図） の挿入物は、１、Ｏｋｂ、０．９　ｋｂおよび０．４　ｋｂの３個のＥｃｏＲＩ フラグメント、および２個のそれより大きい、ＫＳ２３．１　とハイブリッド形 成するフラグメントを含有したが、このことはこのクローンが３′側５／７のＬ ＨＲ−ＡおよびすべてのＬＨＲ−Ｈのコード配列を含有することを示す。この発 見は、ＬＨＲ−Ａが、ＬＨＲ−Ｂに対してきわめて相同であることを確証した。

クローンλＨ３，１（第９図）は、１．Ｏｋｂの単位のＫＳ２３．１を有するＥ ｃｏＲＩフラグメントおよび高緊縮下でＣＲ１−４と弱くハイブリッド形成する ０、　５ｋｂフラグメントを含有した。このクローンはＬＨＲ−Ａを完成し、５ ＣＲ−１および−２と０．　ｌ　ｋｂの上流配列を包含する追加の５゛配列を含 有すると考えられる。

残った３６クローンのうち一つも、それらのすべてがＣＲ１−１とはハイブリッ ド形成したが、プローブ、ＣＲＩ−１８で検出されなかった。このプローブはＬ ＨＲ−Ｂ、　−Ｃ，または−Ｄをコードして配列とハイブリッド形成しないクロ ーンλＨ３，１の０．５　ｋｂ　ＥｅｏＲＩフラグメント由来の２５２ｂｐ　５ ａｕ３ＡＩフラグメントである。

λＨ３，ｌのＤＮＡ配列分析は、オーブンリーディングフレームがｃＤＮＡの５ ゛末端まで続（ことを明らかにし、このことはそのクローンが翻訳開始部位まで 達しなかったことを示す。したがって、ｃＤＮＡライブラリー、λ曲およびλＳ ２ＴをプローブＣＲＩ−１８を用いて再度スクリーニングし、各々から−クロー ンずつ、それぞれλＨ１０，３およびλＴ１０９．１を同定した。ＣＲＩ−１８ とハイブリッド形成するこれらのクローンのＥｃｏＲＩフラグメントを、そのク ローン由来の挿入物、λＨ３，１およびλ８７．１と同様に配列決定した。合成 した配列を第１図に示すが、第１図のヌクレオチド番号１５３１は第３図のヌク レオチド＃１である。ＨＬ−６０および扁桃腺ライブラリー由来のｅＤＮＡクロ ーンの重なりあう配列は同一である。

ＬＨＲ−Ａのすぐ上流に、クローンλＴＩ０．３およびλＨ１０９，１は、同一 の推定疎水性リーダー配列（Ｖｉｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ。

Ｇ、、　１９８６．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：４６８３）を 含有するが、この配列は４１アミノ酸をコードし、真核翻訳開始部位に関して提 出された共通配列ＮＮＡ／ＧＮＮＡＴＧＧに適合するＡＴＧを包含する　（第１ Ｏ図ＸＫｏｚａｋ、　Ｍ、、　１９８６．　Ｃｅ１１４４：２８３）。その選ば れたＡＴＧの６コドン上流、そしてインフレーム終止コドンのすぐ下流に存在す る第２のＡ、ＴＧは、このコンサンサス配列にあまり当てはまらない。ＣＲＩの ようなリーダー配列の最初の三つのアミノ酸、ＭＧＡは、ＣＲ２について報告さ れているのと同じである。これら二つのクローンのその配列はＡＴＧの上流で分 かれ、λ１Ｏ１３クローン由来のそれは、上記第６項で他のＣＲ１ｃＤＮＡクロ ーンについて記載されたように、介在配列の一部に相当すると考えられる。

シグナルペプチド切断がグリシン−４６およびグルタミン−４７の間で起こるこ とが予想され（Ｙｏｎ　Ｈｅ１ｊ　ｎｅ。

Ｇ。、　１９８６．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：４６８３）　 、このことはＣＲ−ＩのブロックされたＮＨ３−末端（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、ら 、１９８５゜Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　８２：３０３；　Ｈｏ１ ｅｉｓ、Ｖ、Ｍ。ら、１９８６゜Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　３：６３）のために、 ピロリドンアミドが存在するのかもしれないことを示唆する。これらのクローン に含まれるＮｌ（、−末端ＬＨＲ−Ａの最初の二つのＳＣＲは、ＬＨＲ−Ｂの対 応する領域に対して６１％しか同一でなく、一方ＬＨＲ−Ａの５ＣＲ３−７はＬ ＨＲ−Ｂの対応ＳＣＲに９９％同一である（第１Ｏ図）。ＬＨＲ−ＡのＬＨＲ− Ｃとの比較により、各々の第３と第４のＳＣＲのみが相同性が高い（９９％同一 ）ことが明らかである。ＬＨＲ−Ａおよび−Ｄは、全体ではわずかに６８％の同 一性を有するのみだが、各ＬＨＲの第６　ＳＣＨ間では最大の８１％の同一性を 有する。したがって、ＣＲＩの５’　ｃＤＮＡ配列の完成は、Ｆアロタイプが２ ０３９アミノ酸を含んでなり、４１アミノ酸のシグナルペプチド、それぞれ７個 のＳＣＲからなる４個のＬＨＲ、二つのＣ００Ｈ−末端ＳＣＲ、２５残基の膜貫 通領域および４３アミノ酸細胞質ドメインを包含する。２５個の可能性のあるＮ −結合グリコシル化部位が存在する。

７．３．考　察 ＣＲＩのＦアロタイプのＮＨ２−末端およびシグナルペプチドの一次構造は、５ °ｃＤＮＡクローンの単離および配列決定によって推定された。ＣＲＩ配列の高 い反復性の性質のために、レセプターのこの領域をコードするｃＤＮＡクローン の調製および同定のための適当な方法を開発することは不可欠になった。逆転写 の条件下でＬＨＲ−Ｂ、　−Ｃおよび−Ｄとハイブリッド形成することが知られ ている３５−マーオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてｃＤＮＡライブ ラリーを調製した。このブラーイマーが、ＬＨＲ−Ｂと非常に相同であると予想 されたＬＨＲ−Ａともハイブリッド形成する可能性が考えられた（上記第６項参 照）。別のオリゴヌクレオチドＫＳ２３゜１を用いて適当なｃＤＮＡクローンを 同定したが、とのＫＳ２３．１は緊縮条件下でＬＨＲ−Ｂとのみハイブリッド形 成し、そのことにより５’　ｅＤＮＡクローン発見の確率を増加させる。はとん どすべてのＣＲＩの残基の配列を包含する二つのクローンを発見し、この内の一 つの５ａｕ３Ａｌフラグメント、ＣＲＩ−１８は残りの５クローンの同定にそれ を用いるのに十分ユニークな配列を育した（第９．１０図）。

ＬＨＲ−Ａの５゛領域由来の２５０ｂｐプローブは、７，９および９．２　ｋｂ のＣＲ１転写物のみならず、緊縮条件下でヒト扁桃腺ＲＮＡに於ける２ｋｂ転写 物ともハイブリッド形成した。このようなりロス−ハイブリッド形成ｍＲＮＡは 、他のＬＨＲ由来のＣＲｔ　ｃＤＮＡプローブでは、またはジメチルスルホキシ ド誘導ＨＬ−６０細胞およびＨＳＢ−２Ｔリンパ芽球細胞由来のＲＮＡのノーザ ンプロットに於いては、観察されなかった。したがって、ＣＲＩはさらに二つの Ｂ細胞タンパク質、一つはこの新たな認識されたｍＲＮＡによってコードされ、 もう一つはＣＲ２である、に相同な配列を含有する。

８、実施例：組換えヒトＣＲＩの発現 上記のように７．ＯｋｂにおよぶヒトＣＲＩ　ｅＤＮＡクローンが単離され、そ れは２０３９アミノ酸をコードする読みとり枠を有する（第１図）。提案された レセプターの前駆体型は、４１アミノ酸のシグナルペプチド、４５０アミノ酸か らなる４個の長く相同な反復（ＬＨＲ）（各ＬＨＲは７個の短いコンセンサス反 復（ＳＣＲ）を含んでなる）、６５アミノ酸からなる二つのＣ００Ｈ−末端ＳＣ Ｒ、２５アミノ酸膜貫通ドメイン、および４３アミノ酸細胞質領域を包含する。

したがって、ＣＲＩ　Ｆアロタイプは３０ＳＣＲを含有する。ＮＨｔ−末端ＬＨ Ｒ、ＬＨＲ−Ａ　（上記第７項参照）は、最初の二つのＳＣＨに於いてＬＨＲ− Ｂの対応する領域に対して６１％同一であり、Ｃ００Ｈ−末端の５　ＳＣＲでは ９９％同一である。８個のＣＲＩ　ｃＤＮＡクローンの制限フラグメントをスプ ライスして６．９ｋｂの全長構築物を作成し、マウスメタロチオネインプロモー ターまたはサイトロスガロウイルスプロモーターの下流に置き、Ｌ（マウス）細 胞またはＣ０３（サル）細胞にトランスフェクションさせた。組換え細胞表面Ｃ ＲＩを間接的なラジオイノムアッセイおよび免疫蛍光法により検出した。親ベク ター（ＣＲＩ−）だけでトランスフェクションした細胞には抗原は検出されなか った。トランスフェクションし、表面＋ｔｓＩ−標識したｃｏｓｃサル）細胞の 抗ＣＲＩモノクローナル抗体による免疫沈降反応、および非還元ドデシル硫酸ナ トリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミノゲル電気泳動による分析は、ヒト赤血球 由来のＦアロタイプとともに移動する分子量１９０．０００ダルトンのバンドを 生じた。正確な分子量の組換えＣＲＹ抗原の発現（Ｋｌｉｅｋｓｔｅｉｎ。

Ｌ、　Ｂ、ら、１９８８．　ＦＡＳＥＢ　Ｊ、　２：　Ａ１８３３）は、そのｃ ＤＮＡがヒトＣＲＩの完全なコード配列を含有することを証明する。

８．１．完全なＣＲ１コード配列を含有するプラスミドｐＢＳＡＢＣＤの構築 ここで、全長の（ＳＣＲ１−３０）　ＣＲ１タンパク質をコードするベクター、 プラスミドｐＢＳＡＢＣＤの構築について説明する。

ｃＤＮＡクローンλＴ８．２由来の２．３ｋｂ挿入物（Ｋｌｉｅ−ｋｓｔｅｉｎ 。

Ｌ、Ｂら、１９８７．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６５：　１０９５；上記 第６項参照）をＥｅｏＲＩフラグメントとしてｐｕｃ１８にサブクローニングし 、その結果５′末端はプラスミドポリリンカーに於てＨｉｎｄＩ［に近接した。

このプラスミドをｐｌＢ８．２と命名した。ｐ１８８．２をＡｐａ　ＩおよびＨ ｉｎｄＩＩＩで切断し、５ＣＲ２６から３′非翻訳領域までのＣＲＩ配列および ベクター配列を含有する大きな４．７ｋｂフラグメントをゲル精製した。

ｃＤＮＡλＴ５０．　ｌ由来の挿入物（ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｌ、Ｂ、　ら 、１９８７、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６５：１０９５．上記第６項参照 ）゛　をＢｃｏＲＩフラグメントとしてＭ１３ｍｐ１８にサブクローニングした 。このファージを１８Ｒ５０，１と称した。このクローンの複製型に由来するＤ ＮＡをＡｐａＩおよびＩ（ｉｎｄｌｌ［で切断し、ＣＲＩ　５ＣＲ１８−２５を 含有する１、　４５ｋｂフラグメントを単離し、ｐ１８８．２由来の４．７ｋｂ フラグメントに結合し、その結合をＥ、コリＤＨ５αに形質転換した。このプラ スミドを９８．２５０．１と称した。

ｃＤＮＡクローンλＴ８．３由来の０．７５ｋｂおよび０．９３ｋｂＥｃｏＲＩ フラグメント（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、ら、１９８５．　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　２２ニア７１１）をプラスミドｐＢＲ３ ２７にサブクローニングした。これらのサブクローンをそれぞれｐｃＲｌ−１お よびｐｃＲｌ−２と呼び、これらはそれぞれ５ＣＲＩＩ−１４および５ＣＲ１７ −２１を含有した。ＢｅｏＲＩ挿入物を各々から精製した０、　７５ｋｂのｐｃ Ｒｌ−１フラグメントをＳｍａ　Ｉで消化し、その消化物をＥｃｏＲｌおよびＳ ｍａ　Ｉで切断したｐｔｌｃ１８ＤＮＡに結合した。５ＣＲ１２−１４に対応す る０、　５　ｋｂ挿入物を有するサブクローンの一つ、ｐ１８１−１．１を単離 した。

ｐｃＲｌ−２の０．９３ｋｂフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩて消化し、ＢｃｏＲ １およびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐｌＪｃ１９に結合し、５ＣＲ１７を含有す る０、　２７ｋｂインサートを有するサブクローンの一つ、ｐ１９１−２．１を 単離した。

ｃＤＮＡクローンλ６．１（上記第６項参照；　Ｋ１１ｃｋｓｔｅｉｎ。

Ｌ、　Ｂ、ら、１９８７．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１６５：１０９５；　Ｗ ｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ。

ら、１９８７．　Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、　１６４：１５３１）をＥｃｏＲＩ で消化し、ＣＲＹの５ＣＲ１５および１６に相当する０、　３７ｋｌ＋フラグメ ントをｐＢＲ３２２にザブクローニングした。このクローンをｐＣＲｌ−４と名 付けた。クローンｐ１８１−１．１をＥｃｏＲＩおよび５ｃａｒで切断し、１． ４　ｋｂフラグメントを単離した。クローンｐ１９１−２．１（Ｋｌｉｅｋｓｔ ｅｉｎ、Ｌ、Ｂ、ら、１９８７．　Ｊ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、　１６５　：　１０９５；上記第６項参照）をＥｃｏＲＩおよびＳｅａ 　Ｉで消化し、２．Ｏｋｂフラグメントを単離し、ｐ１８１−１．１由来１．４ ｋｂフラグメントに結合し、その混合物をＥ、コリＤＨ５αに形質転換した。結 果として得られたプラスミドをｐｉ−１１−２と名付けた。プラスミドｐｉ−１ １−２をＥｃｏＲＩで消化し、ｐｃＲｌ−４由来の０．３７ｋｂ挿入物フラグメ ントを連結によって挿入した。その結果生じたプラスミドをＥ。コリＤＨ５αの 形質転換に用いた。

０．３９ｋｂ　ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含有するサブクロー ンを選択した。このプラスミドをｐ１４２と称し、これはＣＲＩ　５ＣＲ１２− １７を含有した。ｐ８．２５０．１由来の３．５ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ ［挿入物フラグメントをｐＧＥＭ３ｂに移した。このプラスミドをｐＧ８．２５ ０．１　と命名した。ｐ１４２由来の１゜２　ＨｉｎｄｌＩＩフラグメントを精 製し、Ｈｉｎｄｍ：で予め切断したｐＧ８．２５０．１に結合した。Ｚ４．ｋｂ のＰｓｔｌ−ＡｐａＩ挿入物を含有するサブクローンを選択し、した　がって正 しい方向を選択した。このプラスミドをｐＣＤと呼び、これは５ＣＲｉ２から３ ′末端までのＣＲＩ配列を含有した。ｃＤＮＡクローンλ５″７．１　（Ｋｌｉ ｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｌ、Ｂ、ら、１９８７、　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　４：１８ ０；上記第７項参照）を　ＰｓｔＩで切断し、５ＣＲ６−１２に相当するｌ、　 ３５ｋｂフラグメントを単離し、Ｐｓｔｌ−切断ｐＣＤに結合した。その混合物 を形質転換し、１．３５ｋｂおよび１．　ｌｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント を含有するサブクローンを選択した。

ｃＤＮＡクローンλ５’　３．１　（Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｒ＋、　Ｌ、Ｂ、ら、 １９８７゜Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　４：１８０；上記第７項参照）をＢｃｏＲＩ で切断し、その消化物をＥｃｏＲＩ−切断ｐＵｃＩ８に結合した。サブクローン 、９３．１１−１を単離し、これは５ＣＲ３−７に相当する１、　Ｏｋｂ挿入物 を含有するが、この挿入物をゲル精製した。ｃＤＮＡクローンλ５°１Ｏ１３（ Ｋｌ　１ｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｌ、　Ｂ、ら、１９８７、　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ 　４：１８０；上記第７項参照）をＥｃｏＲＩで切断し、ＳＣＲ１および２を含 有する０、　６３ｋｂ挿入物をｐＵｃ１８にサブクローニングした。このクロー ンをｐｌｏ、　３．５と命名した。プラスミドｐｌＯ，３，５をＥＣＯＲ１で部 分消化し、線状プラスミドに相当する３、　４　ｋｂフラグメントを単離し、ｐ ｓ、１ｉ−ｉ由来のｌｋｂフラグメントに結合した。サブクローンｐＬＡを取あ げたが、これは１．３ｋｂ　ＰｓｔＩフラグメントを挿入および方向の正しい部 位に含有した。

ｅＤＮＡクローンλＴ１０９．４（Ｋｌ　１ｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｌ、　Ｂ、ら、 １９８７゜Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　４：１８０；上記第７項参照）をＥｃｏＲＩ で消化し、ｐＵｃ１８にサブクローニングした。リーダー配列およびＳＣＲ１お よび２を通じて５°非翻訳領域に相当する０、５５ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメン トを含有するサブクローンを選択した。プラスミドｐ１０９゜４をＰｓｔＩおよ びＢｓｐＭＩＩで切断し、ベクター、リーダー配列、およびＳＣＲ１を含有する ３、Ｏｋｂフラグメントを単離した。そのフラグメントを、ＳＣＲ２−５を含有 するｐＬＡ由来の０．８１ｋｂ　ＰｓｔＩ−ＢｓｐＭＩ［フラグメントに結合し た。この新たなプラスミドをｐＮＬＡと命名した。プラスミドｐＮＬＡをＥＣＯ ＲＩで部分消化して、Ｐｓｔｌで完全消化し、リーダー配列からＳＣＲ５に通じ るＣＲＩ配列を含有する１、１ｋｂ　ＥｃｏＲ［−ＰｓｔＩフラグメントを単離 し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ＋（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＳａｎ　Ｄｉｅｇ ｏ、　ＣＡ）に結合し、ｃＤＮＡの５′部位にｘｈｏ　Ｉ部位を置いた。このプ ラスミドをｐＸＬＡと称す。

プラスミドｐＢＣＤをＥＣ０ＲＶで切断し、次にＰｓｔｌで部分消化し、ＳＣＲ ６から３゛非翻訳領域にいたるＣＲＩ配列を含有する６、Ｏｋｂ　Ｐｓｔｌ−Ｅ ｃｏＲＶフラグメントを単離し、Ｐｓｔｌ＋Ｓｍａｒ−消化ｐＸＬＡに結合した 。その結果生じた細菌発現プラスミドは、完全なＣＲＩ　ｅＤＮＡコード配列を 含有し、ｐＢＳＡＢＣＤと命名した。

８．２．完全なＣＲＩコード配列を含有する哺乳動物発現ベクタープラスミドｐ ｉＡＢＣＤの構築およびアッセイ プラスミドｐＢＳＡＢＣＤをＸｈｏ　ＩおよびＮｏｔｌで消化し、その挿入物を 、やはりこれらの制限酵素で予め切断した発現ベクターＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、　 Ｂ、、　１９８７．　Ｎａｔｕｒｅ　３２９：８４０−８４２）の４゜４ｋｂフ ラグメントに於てＣＭＶプロモーターから下流に結合した。得られた構築物をｐ ｉＡＢｃＤと名付けた（第１１図）。あるいはまた、６．９ｋｂ　ＸｈｏＩ−Ｎ ｏｔＩフラグメントを、やはりこれらの制限酵素で予め切断した発現ベクター、 ｐＭＴ、　ｎｅｏｌにおいて、メタロチオネインプロモーターから下流に、結合 した。得られた構築物をｐＭＴＡＢＣＤと名付けた（第１１図）。

ウサギ抗体で感作されたヒツジ赤血球（ＥＡ）、および限られた量のＣ４ｂ［Ｅ ＡＣ４ｂ（ｌｉｍ）］　、および細胞当り１２、０００ｃｐｍの”Ｊ−Ｃ３ｂ［ ＥＡｃＣ４ｂ（ｌｘｍ）、　３ｂｉを、ＥＡＣ４ｂ（ｌｉｍＸＤｉａｍｅｄｉｘ ）をＣ１、Ｃ２および１２５Ｉ−Ｃ３で連続的に処理し、つぎに４０ｍＭＥＤＴ Ａ含有ゼラチンベロチール−緩衝食塩水中で、３７°Ｃ６０分間インキュベート することによって調製した。あるいはまた、メチルアミン−処理したＣ３［Ｃ３ ｍａ）］を、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシン イミドエステル（Ｓｊ、ｇｍａ）で処理したヒツジＥ（赤血球）に共有結合させ た（Ｌａｍｂｒｉｓ、Ｊ、　Ｄ、ら、１９８３．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　６５：２７７）。ＨＡＣ４ｂを精製Ｃ４を用いて調製した（Ｈａｍ ｍｅｒ、　Ｃ，Ｈ，ら、１９８１、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５６：３ ９９５）。

ｐｉＡＢＣＤおよびｐＭＴＡＢＣＤはいずれも、ＤＥＡＥ−ジエチルアミノエチ ル）−デキストラン法によって、Ｃ０５（サル）細胞にトランスフェクションさ れた。抗−ＣＲＩモノクローナル抗体、ＹＺ−１を用いた免疫蛍光反応によって ；そして＋ｔｓ■−標識細胞の免疫沈降反応とその後の非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ によって；そしてＣ３ｂでコー　１・されデニヒ゛ンジ赤血球でのロゼツト形成 によって（Ｆｅａｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、１９８０、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、 　１５２：２０）、組換えＣＲＩをトランスフェクション細胞の表面に検出した 。この５ＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｆアロタイプにホモ接合性のドナーのヒト赤血球か ら免疫沈澱させたＣＲＩと同一の移動度を存するタンパク質を示した（Ｗｏｎｇ 、　Ｗ、Ｗ、ら、１９８３．　Ｊ、　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ。

７２：　６８５）。天然型と組換えＣＲＩの電気泳動移動度が同一であることは 、ＣＲＩＦアロタイプが５ＣＲＩ−３０を含有することを確認した。

さらに、マウスＬ細胞をＤＥＡＥ−デキストラン法（Ａｕｓｕｂｏｌ、　Ｆ、Ｍ 、ら、１９８７．　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌ ａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｓｅｉｄｍａｎ、　Ｊ、Ｇ、および５ｔｒｕｈ１．　 Ｋ。

編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；　５ｅｅｄ、 　Ｂ、、　１９８７゜Ｎａｔｕｒｅ　３２９：８４０）によって、二通りで、０ ．２．または４μｇのｐｉＡＢＣＤまたはｐＭＴＡＢＣＤのいずれか一方、およ び成長ホルモンの発現を指示するレポータープラスミドである２μｇのｐＸＧＨ ５（Ｓｅｌｄｅｎ、　Ｒ，Ｆ、ら、１９８６．　Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　６：３１７３）を用いて、同時にトランスフェクション した。三日後細胞を集め、ＹＺＩモノクローナル抗−ＣＲＩ抗体の結合によって ＣＲＩの発現をアッセイした。組換えプラスミドＤＮＡとＣＲＩ抗原の発現の間 には用量応答関係が存在した（第■表）。

第■表 同時にトランスフェクションしたし細胞における組換えＣＲＩおよびヒト成長ホ ルモンの用量応答Ｙｚｌ抗−ＣＲＩ プレート　ｐＸＧＨ５ｐＭＴＡＢＣＤ　ｐＩＡＢＣＤ　ｍＡＢ　ＲＩＡ”　成長 ホルモン！旦　（μｇ）匹Ｌｒ　（μｇ）　（ｃｐｍ）　（ｎｇ／艷）本ラジオ イムノアッセイ（ＲＩＡ）については、１％ウシ血清アルブミンおよび０．２％ アジ化ナトリウムを含有する０、１ｒＩＬｌリン酸緩衝食塩水の３ＸＩＯ’）ラ ンスフエクション細胞の複製試料を０℃で６０分間３μｇ／艷ＹＺ−１（ｇＧ　 １抗−ＣＲＩとともにインキュベートした（Ｃｈａｎｇｅｌｉｓｎ、Ｐ、Ｓ、ら 、１９８５．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３４＋１８５１）　、細胞を洗浄し、１ −２　μＣｉ／ｒｎＩの””Ｉ−Ｆ（ａｂ’　）ヤギー抗−マウスｒｇＧまたは １２５■−プロティンＡを含有する０、１Ｔｎｌバツフアーに再懸濁した。０° Ｃで１−２時間後、細胞を洗浄し１２ｓ）をアッセイした。

プラスミドｐｉＡＢＣＤはｐＭＴＡＢＣＤよりも約３倍多いＣＲＩ抗原の発現を 指示した。培地中の成長ホルモン濃度は、プレート５を除けば２倍以下の範囲で 変化した。追加実験は、ｐｉＡＢＣＤがＣＯＳ細胞に於て、Ｌ細胞よりも３倍多 いＣＲＩ抗原の一過性の発現を指示することを示した。

ＺＹｌ抗ＣＲ１ｍＡＢで染色させた細胞の間接的な免疫蛍光反応で評価する場合 には、ＣＲＩはトランスフェクションＣＯ３細胞表面のクラスターに存在した（ 第１２図）。

ＣＯ８細胞上の組換えＣＲ１のこのような分布は、野生型ＣＲＩのヒト白血球上 での分布に似ている（Ｆｅａｒｏｎら、１９８１、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、 　１５３：１６１５）。

組換えＣＲＩの分子量を、ｐｉＡＢＣＤを用いてトランスフェクションしたＣＯ ３細胞の表面ヨウ素化、細胞溶解物とセファロース−Ｙｚｌとの免疫沈降反応、 ５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって決定した。組換えＣＲ Ｉは非還元で分子量１９０．０００を有し、これはＦアロタイプと等しく赤血球 ＣＲＩのＳアロタイプより小さい（第１４図）。

組換えＣＲＩのＣ３ｂ結合およびＣ４ｂ結合機能を、トランスフェクションＣＯ ３細胞とＥＡＣ４ｂまたはＥＡＣ４ｂ（ｌｉｍ）。

３ｂとのロゼツト形成によってアッセイした。３１の別個のトランスフェクショ ンに於て、プラスミドｐｉＡＢｃＤを用いてトランスフェクションされたＣＯ３ 細胞の５に一５０％が、５個またはそれ以上のＥＡＣ４ｂまたはＥＡＣ４ｂ（ｌ ｉｍ）、　３　ｂと結合した（第１３図）。ＣＲＩを発現するＣＯ３細胞は、Ｅ ＡＣ４ｂ（ｌｉｍ）、３　ｂｉとロゼツト形成しなかった（ただしこの中間体は ＣＲ２を発現するＲａｊｉＢリンパ芽球細胞とはロゼツトを形成した）。

８．３．ＣＲ１フラグメントの発現 ＣＲＩコード配列の一部をコードし、た発現ベクター（欠失変異体）を下記のよ うに構築し、それらがＣＯ８細胞に形質転換されたときそれぞれＣＲＩ挿入物を 発現することを見いだした。ＣＲＩフラグメントは細胞表面タンパク質として発 現された。

８．３．１．欠失変異体ｐｉＢＣＤ、　ｐｉＡＢＤ、　ｐｉＡＣＤ、　ｐｉＡＤ 、　ｐｉＢＤ。

ｐｉＣＤおよびｐｉＤの構築 このような変異体の構築は、４個のＣＲＩの長く相同を反復（ＬＨＲ）の各々の アミノ末端付近に単一のＢｓｍ１サイトが存在し、ＣＲＩ　ｃＤＮＡおよび旧ｕ ｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃ Ａ）内に他にはＢｓｍ１部位が存在しないことを利用して行われた。

１０マイクログラムのプラスミドｐＢＳＡＢＣＤを５０ユニツトの制限酵素Ｂｓ ｍ１で４５分間、部分消化し、その消化物をアガロースゲル電気泳動によって分 画した。それぞれ１．２または３個のＬＨＲを欠失した親プラスミドの線状セグ メントに対応する８゜５５ｋｂ、　７．２０ｋｂおよび５．８５ｋｂのＤＮＡフ ラグメントを精製した。３フラグメントの各々をそれ自身に結合し、その連結は 別々に、コンピテントなＥ、コリＤＨ５αをアンピシリン耐性に形質転換するた めに用いられた。

８゜５５ｋｂフラグメントはｐＢＳＡＢＣＤを二つの隣接したＢｓｍ［サイトで 切断した結果生じた。したがって連結後３種の産物プラスミド、ｐＢＣＤ、　ｐ ＡＣＤまたは１）ＡＢＤが存在する可能性がある。ここにおいて、大文字はプラ スミドに残ったＬＨＲを表す。これらはＳｍａ　Ｉを用いた制限マツピングによ って区別される。ＤＮＡを１２コロニーから調製し、Ｓｍａｌで消化し、アガロ ースゲル電気泳動で分離した。５コロニーは、２゜５ｋｂと６．　ｌｋｂの二つ のＳｍａ　Ｉフラグメントを有し、ＬＨＲ−Ａコード配列の欠失に相当する、し たがってｐＢＣＤに当たる。３コロニーは８．５ｋｂの単一の直線フラグメント を有し、Ｉ）ＡＣＤに相当する。４コロニーは１．２ｋｂと７．４ｋｂの二つの Ｓｍａｌフラグメントを有し、これらはＬＨＲ−Ｃコード配列の欠失が予想され 、ｐＡＢＣを示す。これら３種の構築物の各々５．６ｋｂ挿入物を、ＸｈｏＩと ＮｏｔＩで二重に消化した後、ゲル−精製し、あらかじめ同制限酵素で消化後ゲ ル精製した発現ベクターＣＤＭ８に結合した。Ｅ、コリＤＫＩ／Ｐ３を連結混合 物を用いて形質転換し、各々の５コロニーからＤＮＡを調製した。発現ベクター 中に欠失したＣＲＩ　ｃＤＮＡ挿入物が存在することは、各々の場合に於て、５ ａｃＩ消化によって示され、それは４．２０ｋｂと５．７５ｋｂの予想された二 つのフラグメントを示した。これらのプラスミドをｐｉＢＣＤ、　ｐｉＡＣＤ及 びｐｉＡＢＤと命名した。

ｐＢＳＡＢＣＤの部分消化から得られた７、　２０ｋｂフラグメントは、三つの 隣接部位での、または、同様に大きなフラグメントについては、その二つの部位 の間に一つの非切断部位を持つ二部位での、ＢｓｍＩ消化の結果であり、したが って、形質転換後に二つの産物、１）ＡＤおよびｐＣＤが得られる可能性があっ た。これらはＸｈｏｉとＰｓｔｌを用いた二重の消化によって区別することかで き、この消化によってｐＡＤの場合１．Ｏｋｂと６．２ｋｂの二つのフラグメン トが生じ、ｐＣＤについては７．２ｋｂの直線フラグメントが生じる。これらの プラスミド各々からの４．２ｋｂ挿入物をＸｈｏ　ＩとＮｏｔｌで二重に消化し た後、ゲル−精製し、上記のようにＣＤＭ８にサブクローニングした。発現ベク ター中に欠失のあるＣＲＩ　ｃＤＮＡが存在することは、Ｐｓｔｉ及びＢｇｌＩ ［で二重に消化することによって示された。クローンｐｉＡＤは２．４　ｋｂど ６．２ｋｂのフラグメントを有し、一方ｐｉｃＤは８．６ｋｂの一つのフラグメ ントを有した。

ｐＢＳＡＢＣＤのＢｓｍＩ消化から得られた５、　８５ｋｂフラグメントは完全 消化産物に相当し、−・一つのクローンｐＤはＥ、コリＤＨ５αの形質転換後に 得られた。これはＨｉｎｄＩ［［およびＢｇｌＩ［を用いた二重の消化によって 確認され、予想された３、　７ｋｂおよび２．２ｋｂのフラグメントを生じた。

そのクローンの２．９ｋｂ挿入物をＸｈｏ　ＩとＮｏｔＩで二重に消化した後、 ゲル−精製し、上記のように発現ベクターに結合した。その結果生じたｐｉＤク ローンのＨｉｎｄｌＩ［消化は、予想された７、３ｋｂフラグメントを生じ、Ｘ ｈｏ　ＩとＢｇｌｌＩを用いた二重の消化は、’２．２ｋｂと５．１ｋｂのフラ グメントを与えた。そして、５ａｃＩ消化物は予想された１゜５ｋｂおよび５． ８ｋｂフラグメントを生じた。

ｐＢＣＤのＢｓｍ１部分消化によってプラスミドｐＢＤを調製した。二つの隣接 するＢｓ＋ｎＩ部位での切断に対応する線状７．２ｋｂフラグメントをゲル精製 し、上記のようにそれ自身に結合し、Ｅ、コリＤＨ５αをアンピシリン耐性に形 質転換した。ｐＢＤは、ＳｍａＩ消化での１．２　ｋｂおよび６゜Ｏｋｂフラグ メントの存在によって同定された。４．２ｋｂ挿入物を、ＸｈｏＩとＮｏｔｌで 二重に消化した後、精製し、上記のようにＣＤＭ８に移した。クローンｐｉＢＤ は、ＨｉｎｄｌＩＩ消化後の予想された０、８ｋｂおよび７．８ｋｂのフラグメ ントの観察によって確認された。

それぞれｐｉＡＢＣＤ、　ｐｉＢＣＤ、　ｐｉｃＤ、およびｐｉＤ構築物を一過 性に発現するＣＯ３細胞を、′！５■で表面標識し、抗−ＣＲＩ抗体とともに免 疫沈降させた。還元後の５ＤＳ−ＰＡＧＥで、ｐｉＡＢＣＤ構築物の産物は、Ｃ ＲＩのＦアロタイプど同様に移動し、他方、欠失変異体はそれぞれ１，２゜およ び３　ＬＨＲの欠失を示す約４５．０００ダルトンづつの段階的な減少を示した （第１７図）。

８　、３．２．欠失変異体ｐｉＰ１．　ｐｉＥｌ、　ｐｉＥ２．　ｐｉＥ−２， ｐｉｌｌ。

ｐｉＵ−２およびｐｉＡ／Ｄの構築 プラスミドｐｉＡＢｃＤをＢｓｔＨＩ［で完全に消化し、１．３５ｋｂ（タブレ ット）および８．６　ｋｂの二つのフラグメントをゲル精製し、混合し、結合し 、そしてＥ、コリＤＫＩ／Ｐ３をアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性に形 質転換した。ＣＲＩ　ｃＤＮＡプローブＣＲ１−４とのハイブリッド形成により 、コロニーをスクリーニングしく上記８．１項参照）、強く陽性のクローンをつ り上げ、ＳｍａＩでの消化によりさらにスクリーニングした。ｐｉＥＬは、２− ７ｋｂおよび７．３ｋｂの二つのフラグメントの存在によって同定された。ｐｉ Ｅ２は単一の１０．　Ｏｋｂ線状フラグメントによって同定された。ｐｉＥ−２ は、単一の８．６ｋｂ　Ｓｍａｌフラグメントを含有する弱いＣＲ１−４陽性ク ローンとして同定された。

プラスミドｐｉＰ１は、ｐｉＡＢｃＤのＰｓｔＩ完全消化、および大きな１０． 　Ｏｋｂフラグメントのゲル精製によって得られた。このフラグメントを結合し 、Ｅ、コリＤＫＩ／Ｐ３をその混合物を用いて形質転換した。その結果生じたプ ラスミド、ｐｉＰｌは、単一の１０．Ｏｋｂ　Ｓｍａｌフラグメントを含有した 。

プラスミドｐｉｕｉおよびｐｉＵ−２は、プラスミド１）ＸＬＡを用いたｄｅｍ −株ＧＭ２７１／Ｐ３の最初の形質転換によって調製された。このＤＮＡは、５ ｔｕｌおよびＮｅｏｌで二重に消化し、３．３ｋｂフラグメントをゲル精製した 。プラスミドｐＢＳＡＢＣＤをＮ５ｉＩで部分消化し、その結果生じた４塩基対 の３゛オーバ〜・ラップをＥ。コリＤＮＡポリメラーゼＩのフレナラフラグメン トで処理することによって取り除いた。

次にそのＤＮＡを、Ｎｏｔｌで完全に消化し、ｓ、４ｋｂおよび４、　Ｏｋｂフ ラグメントをゲル精製した。これらをｐＸＬＡ由来の３゜３ｋｂ　５ｔｕＩ−Ｎ ｏｔｌフラグメントに結合し、その連結混合物を用いてＥ、コリＤＨ５αをアン ピシリン耐性に形質転換した。ＣＲＩ　ｃＤＮＡプローブＣＲ１−４とのハイブ リッド形成によって、コロニーをスクリーニングし、陽性クローンをＩ（ｉｎｄ ＩＩ［制限消化によってさらにチェックし、その消化はｐＵｌについて０．８　 ｋｂ、　１．３　ｋｂおよび６゜５ｋｂの３種のフラグメントを、そしてｐＵ− ２については０．８ｋｂおよび６．５　ｋｂの２種のフラグメントを生じた。

５ｔｕＩでプラントしたＮ５ｉｌスプライスは、これらのプラスミドのＤＮＡ配 列決定により読み枠が一致することが確認された。それぞれ５．６　ｋｂおよび ４．２ｋｂのｐＵｌおよびｐＵ−２の挿入物を、ＸｈｏｌおよびＮｏｔｌの二重 消化後にゲル精製し、上記のように発現ベクターＣＤＭ８に結合した。クローン 、ｐｉＵｌおよびｐｉＵ−２の構造は、ＸｈｏｌおよびＰＳｔｌを用いた制限消 化によって確認され、ｐｉｌｌについては、予想された１、２ｋｂおよび８．８ ｋｂの二つのフラグメントを、そしてｐｉＵ−２については線状８．７ｋｂフラ グメントを生じた。

プラスミドｐｉＡ／Ｄは、ＰｓｔＩを用いたｐｉＡＢＣＤの最初の完全消化によ って調製された。ＰｓｔＩ消化物を次にＡｐａ　Ｉで部分消化し、３゛オーバー ラツプを、Ｅ、コリＤＮＡポリメラーゼＩのフレナラフラグメントを用いて除去 した。

次にＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分画し、７．５　ｋｂフラグメントを単 離し、結合し、それを用いてＥ７コリＤＫＩ／Ｐ３をアンピシリンおよびテトラ サイクリン耐性に形質転換した。その構築はＫｐｎ　Ｉ　＋　Ｓａｃ　Ｉを用い た二重消化によって確認され、予想された０、　８　ｋｂＳｌ、５ｋｂ、　１． ７ｋｂおよび３．３ｋｂの４フラグメントを生じた。

（本頁以下余白） ９、実施例：　Ｃ３ｂおよびＣ４ｂ結合ドメインの同定９．１．アッセイおよび 結果 その名称の頭文字により示されるＬＨＲを含有するプラスミドｐｉＡＢＣＤ、　 ｐｉＡＤＳｐｉＣＤおよびｐｉＤをＣＯＳ細胞中に形質転換し、これらを、その コードされたＣＲＩフラグメントがＣ３ｂまたはＣ４ｂと結合する能力を評価す るアッセイに用いた。結合アッセイは、それらの細胞表面上で完全長ＣＲ１分子 またはＣＲＩ欠失組換え体を発現する（一過性発現＞　ＣＯＳ細胞によるＣ３ｂ またはＣ４ｂ被覆赤血球の結合から生じる赤血球ロゼツト形成を観察することに よって行った。トランスフェクション細胞１−４　ｘ　１０＠／ｒｎｌをＣ３ま たはＣ４担持赤血球２−６　ＸＩＯ”／−と共に０．０２ｉ中で６０分間２０° Ｃでインキュベートした。

トランスフェクション細胞形成ロゼツトの％は顕微鏡的に、少なくとも５個の付 着性赤血球がある場合を１０ゼツトとして記録されたトランスフェクション細胞 により評価した。その結果を第■表に示す。

（本頁以下余白） 第１表 ＣＲＩおよびヒツジ赤血球を担持するＣ３（ｍａ）またはＣ４（ｍａ＞の組換え 体形を発現するＣＯＳ細胞トランスブエクタン！・間のロゼツトの形式 ％式％（） ネ１赤血球あたりのＣ３（ｍａ）数はこの中間体を用いる３つの実験においてそ れぞれ６０．０００．３５θ、０００および９００、０００であった。

＃１赤血球あたりのＣ４（ｍａ）数はこの中間体を用いる２つの実験においてそ れぞれ１６０．０００および１４０．０００であった。

π実験数 ３つの別個の各実験において、ＥＣ３（ｍａ）でロゼツトを形成し、た完全長ｐ ｉＡＩｉｃＤ構築物を発現するｃｏｓ細胞の比率は、ＹＺＩモノクローナル抗− ＣＲＩ抗血清またはウサギ抗−ＣＲＲ抗血清のいずれかを用いるイムノフルオレ ッセンスにより評価して、検出しうる組換え体レセプターを育するフラクション と同様であった（第１表）。

これど対照的に、ｐｉＤを発現する細胞はロゼツトを形成しなかった。これはＣ ３−結合部位がＬＨＲ−Ａ、−Ｂまたは−Ｃ中に存在するはずであることまたは これらの存在を必要とすることを示している。ある１つの部位は、ｐｉＢＤまた はｐｉＣＤのいずれかを発現する細胞がＥＣ３（ｍａ）でロゼツトを形成するこ とを実証することによってＬＨＲ−Ｂおよび−Ｃの両方に存在することが示され た。ｐｉＡＤ、　ｐｉＡ／ＤまたはｐｉＥ−２を発現する細胞は同等のＣ３−結 合機能を有しなかった。ｐｉＥ−２構築物は、ＬＨＲ−Ｃの最初の２つのＳＣＲ の代わりにＬＨＡの５ＣＲ−１および−２を有する点でのみｐｉＣＤと相異する ので、ＬＨＲ−Ｃ中のＣ３−結合部位の機能はこれらＮＨ，−末端ＳＣＲを必要 とするはずである。

ＥＣ４（ｍａ）でロゼツトを形成した完全長ｐｉＡＢＣＤ組換え体を発現するＣ Ｏ３細胞の比率は、ＥＣ３（ｍａ）でロゼツト形成するフラクションよりも少な かった。これは恐らく、ｌ赤血球あたりのＣ４（ｍａ）がより少ないこと（第１ 表）またはルセブターあたりの０４−結合部位がより少ないを反映している。Ｌ ＨＲ−Ａの全部または一部分を存する欠失組換え体ｐｉＡＤ、　ｐｉＡ／Ｄおよ びｐｉＥ−２構築物は、欠失組換え体ｐｉＢＤおよびｐｉｃＤよりも良好にＥＣ ４（ｍａ）を結合し；　ｐｉＤにはこの機能が欠けていた。従って、ＣＲＩの０ ４−結合物は、二次的部位がＬＨＲ−Ｂおよび−Ｃ中に存在するかもしれないが 、最初はＬＨＲ−Ａ中にある。

ｐｉＥ−２構成のロゼツト化能がｐｉｃＤのそれに比して良好であることは、Ｌ ＨＲ−Ａの５ＣＲ−１および−２がＣ４−結合部位に関連していることを示唆し ている。

ＹＺ１モノクローナル抗−ＣＲＩ抗体の結合のラジオイムノアッセイハ、ｐｉＡ ＢｃＤ、　ｐｉＡＤＳｐｉＢＤおよびｐｉｃＤ構築物を発現するＣＯＳ細胞によ る有意な取り込みを示した（第■表）。ＬＨＲ−Ａの５個のＮＨ，−末端ＳＣＲ およびＬＨＲ−Ｄの３個のＣ００Ｈ−末端ＳＣＲから構成されるｐｉＤまたはｐ ｉＡ／Ｄでトランスフェクションされた細胞は、これらの構築物の産生物がポリ クローナル抗−ＣＲＩ抗血清と結合したが、ＹＺＩ抗−ＣＲＪ抗体とは結合しな かった（第■表）。

従っで、ＹＺＩエピトープはＬＨＲ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃ中で反復され、ＬＨＲ −ＡのＮＨ２−末端ＳＣＲ中には存在ぜず、そしてＬＨＲ−Ｄ中では存在しない かまたは利用できない。

（本頁以下余白） 第■表 ＣＲＩの組換え体形を発現するＣＯ３細胞トランスフェクタントへのモノクロー ナルおよびポリクローナル抗−ＣＲＩ抗体の結合 ＣＯＳ細胞　結合した　結合した ｐｉＡＤ　２８７９　１９８９１ ｐｉＢＤ　３６４６　２１９２２ ｐｉＣＤ　２１８９　１９９２６ ｐｉＡ／Ｄ　４１０　２３０５２ ｆ）ｉＤ　４０４　１６３８６ ＣＤＭ８　４２８　４８８６ ＊１％ウシ血清アルブミンおよび０．０２％ナトリウムアジドを含有する０、　 １−リン酸塩緩衝塩溶液中の３×１０’　）ランスフェクション細胞の複製サン プルを３Ｈｇ／ｒｎｌ！　ＹＺＩ　ＩｇＧ１抗−ＣＲＩ　ｍＡｂと共に（Ｃｈａ ｎｇｅｌｉａｎ。

Ｐ、Ｓ、ら、１９８５．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３４：１８５１）または ９０μｇｏｄウサギ（ｇＧ抗−ＣＲＩ抗体と共に０℃で６０分間インキュベート した。細胞を洗浄し、そして’　！’　Ｉ−Ｆ（ａｂ’　）　ｔヤギ−抗−マウ スＩｇＧまたは１■Ｉ−プロティンＡｌ−２μＣｉ／＋ｙ＋１を含有する緩衝液 ０，１−中に再浮遊させた。０℃で１−２時間後、細胞を洗浄し、ｌ１ｌＳｉに ついてアッセイした。示した値は２通りの測定の平均、ｅｐｍ／　３　ｘ　１０ ’　ＣＯ３細胞である。

９．２．考　察 各ＬＨＲ中の最初のＳＣＲのコード化配列の途中に見出された保存されたＢｓｍ Ｉ部位により、ＬＨ３の境界に密接に対応しそしてオーブン読枠および推定ジス ルフィド結合形成のために必要な４個のシスティンの適切な位置を保持した一連 の欠失組換え体を構成することが可能であった（第１６図）。これらの欠失組換 え体のＣ３（ｍａ）−およびＣ４（ｍａ）〜結合機能の比較により、これらの特 異性を有するＬＨＲだけでなく配位子特異性の決定に決定的なＳＣＲも区別され た。従って、ｐｉＤ形ではなくてｐｉＡＤ。

ｐｉＡ／ＤおよびｐｉＥ−２形がトランスフェクションＣＯ３細胞とＥＣ４（ｍ ａ）との間のロゼツト形成を仲介する能力は、ＬＨＲ−Ａの２個のＮＨ，−末端 ＳＣＲがこの補体タンパク質と相互作用するための部位を含有することを示した （第■表）。この部位はｐｉＡＤおよびｐｉＡ／Ｄを発現するトランスフェクシ ントがＥＣ３（ｍａ）を結合することができたので（第■表）　、Ｃ４（ｍａ） に対して比較的に特異的であるにすぎなかった。ロゼツトアッセイならびにｐｉ ＢＤおよびｐｉＣＤおよびＣ３（ｍａ）の開裂のためファクターＩ　＝コファク ター機能により実証された（第■表；第１８図）ｐｉＢＤおよびｐｉＣＤ構築物 によりコードされたレセプターのＣ３（ｍａ）−結合機能は、これらのＬＨＲの 最初の２つのＳＣＲ中にＣ３（ｍａ）に対して特異的な部位が存在することを示 した。これらの部位はＣ４（ｍａ）と相互作用することも可能であった（第■表 ）。したがって、ＬＨＲ−Ａ、　−Ｂおよび−Ｃには選択的ではあるが重複する Ｃ４−およびＣ３−結合活性がある。

あるいはまた、ＪＢＤおよびｐｉＣＤを発現するＣＯＳ細胞がＥＣ４（ｍａ）と 結合する能力は、ＮＨ２−末端３６アミノ酸をコー・ドするヌクレオチドがＢｓ ｍ１フラグメンＩ・の連結によりＬＨＲ−Ａの５ＣＲ−ＩからＬＨＲ−Ｂおよび −Ｃに転移することによって生じたものであろう。しかしながら、こわらの３６ アミノ酸だけでは、　ｐｉＤ産生物に０４−ロゼツト形成機能を与えなかった。

本発明者らはこれらの反応におけるＬＨＲ−Ｄの二次的機能を排除することがで きない。なぜならばこのＬＨＲ−Ｄは機能について°アッセイした構築物のすべ てに存在したからである。ＣＲＩ中に３つの明確なリガンド認識部位、Ｃ３ｂに ついて２つおよびＣ４ｂについて１つがあるとの発見は、各レセプター分子は１ 価のリガンドに対して比較的低い親和性を有するにもかかわらず（Ａｒｎａｏｕ ｔ、　Ｍ、　Ａ。ら、１９８３．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　４８：２２９）複数 のＣ４１）およびＣ３ｂ分子を担持する複合体を有効に結合できるであろうこと を示す。この発見は、可溶性Ｃ４ｂがＣ３ｂ担持赤血球とヒトＢリンパ芽球様細 胞系との間でのロゼツト形成を阻害する能力がないことについての説明をも提供 する（Ｇａｉｔｈｅｒ、　Ｔ。

Ａ、ら、１９８３．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３１：８９９）、　ＣＲＩが 特に適合するであろうありうるリガンドは、それぞれ主経路および副経路の活性 化の際に生成する分子複合体Ｃ４ｂ／Ｃ３ｂおよびＣ３ｂ／Ｃ３ｂであろう。４ つのＬＨＲのうちの３つに明確な結合部位があるので、それらのＬＨＲの数によ り異なるＣＲＩ構造アロタイプはリガンド結合部位の数の変化によって生じた存 意な機能上の相違を有するであろう。インビトロ研究はＦ、　ＳおよびＦ’（そ れぞれＡ、ＢおよびＣ）アロタイプの異なる結合活性を報告していないが、おそ らく３個のみのＬＨＲを有する小さいＦ°アロタイプは免疫複合体を解明するに はそこなわれた能力を有するかもしれない。Ｆ′アロタイプは全身性エリテマト ーデスと多分関連することが報告されている（ｖａｎ　Ｄｙｎｅ、　Ｓ、ら、１ ９８７．　Ｃ１１ｎ、　ＥＸｐ、　Ｈｍｍｕｎｏｌ、　６８　：　５７０）。

１０、実施例：ファクター・■コファクター活性の提示細胞表面および可溶化形 の両方における組換えＣＲＩタンパク質およびその特定のフラグメントはＣ３ｂ フアクターＩコフアクター活性を有することが示された。

ファクターエコファクター活性のアッセイは、刊行された操作法（Ｆｅａｒｏｎ 、　Ｄ、Ｔ。、　１９７９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７６：５８６７）を変更して行った。

可溶化したＣＲＩおよびフラグメントのファクターエコファクターをアッセイす るため、細胞表面ＣＲＩタンパク質およびフラグメントをＮｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ− ４０で可溶化し、溶解物をセファロースゲルに結合させた抗−ＣＲＩモノクロー ナル抗体ｙｚ−ｉで免疫沈降させた。ｌＸｌ０”トランスフェクション細胞の界 面活性剤溶解物を、セファロースＵＰＣＩＯ抗−レパンおよびセファロース−Ｙ Ｚ−］で順次免疫沈降させた。次いで洗浄したビーズを０．０５ｍｔ’ＰＢＳ、 　０．５％ＮＰ−４０中の０．５μｇの’　ｔ’　Ｉ−Ｃ３（ｍａ）および２０ ０ｎｇのファクターエと共に３７°Ｃで６０分間インキュベー１・することによ り、免疫沈降物をファクターエコファクター活性についてアッセイした。インキ ュベーション後、放射性標識Ｃ３（ｍａ）を含有する上溝を５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより分析した。ファクタ ーエコファクター活性は、ファクターＩによるタンパク質分解開裂から生じるＣ ３（ｍａ）のアルファー鎖の低分子量形がオートラジオグラム上に現われること によって示された。

細胞表面（Ｒ１およびフラグメントのファクター■コフｙり９＝　（上記〕ｐｉ ＡＢＣＤ、　ｐｉＡｃ、　ｐｉＢＤ、　ｐｉｃＤマタｉ；！ｐｉＤ）を担持する トランスフェクションｃｏｓ細胞を０．５１−Ｌ　ｇ　”　’　Ｉ−Ｃ３（ｍａ ）および０．２μｇファクター■と共にインキュベートし、た（Ｆｅａｒｏｎ、 　Ｄ、Ｔ、、１９７７、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　ｊ、１９：１２４８）。

細胞表面組換えＣＲ１のファクターニーコファクター活性を第１５図に示す。フ ァクターＩは免疫固定化された組換えＣＲＩまたはファクターＨの存在下でのみ Ｃ３（ｍａ）のアルファー鎖を開裂して分子量７６、０００および４６．０００ のフラグメントにしたく第１５図）。オートラジオダラムからのバンドに対応す る領域をゲルから切り出し、＋ｔ″１についてアッセイして開裂されたアルファ ー鎖の量を測定した。ファクターＨの存在下で９１％のアルファー鎖が開裂され たか、漸増量の絹換えＣＲＩの存在下ではそれぞれ２６９６．４１％および５５ ％が開裂された。いくらかの内因性ファクターニーコファクター活性を含有する ＣＤＭ８ベクタ・−単独でＣＯ８細胞をトランスフェクションしたが、この機能 の増加はｐｉＡＢｃＤ、　ｐｉＥＩＩ）およびｐｉＣＤでトランスフェクション されたＣＯＳにより明らかであった（第１８図）。ｐｉＡＤまたはｐｉＤでトラ ンスフェクシヨンされたしＯ８細胞によってはｒ　ｔ　ｓ　ｌ−Ｃ３（ｍａ）の 高められた開裂はみられなかった。従って、これらの構築物のうち、ＣＯ８細胞 にＣ３結合能を与えた欠失組換え体ｐｉＢＤおよびｐｉＣＤだけが０３開裂につ いてのファクターニーコファクター活性をも有していた。

ＣＲＩおよびそのフラグメントの細胞表面および可溶化形によりファクターニー コファクター・−活性をアッセイした結果を第７表に示す。

（本頁以下余白） 第７表 ＣＲＩおよびＣＲＩフラグメントの細胞表面および可溶化ｐｉＡＢｃＤ＋＋ １ＡＤ−− ｐｉＢＤ　＋　ＮＤ’ ｐｉＤ　ＮＤ’ ａアッセイしたＣＲＹタンパク質またはフラグメントをコードしており、そして 発現のためにＣＯ８細胞中にｌ・ランスフエクションした。

ｂ　（＋）はＣ０Ｍ８ベクター単独でのトランスフェクションに際して観察され た内因性レベル以上にコファクター活性が増加したことを示す。

Ｃ測定せず。

ｄ抗−ＣＲＪモノクローナル抗体ＹＺ−１により認識されるエピトープのＬＨＲ −Ｄが存在しないために測定せず。

第７表に示すように、ｐｉＡＢｃＤ　（完全長ＣＲＩタンパク質をコードする） 　、ｐｉＢＤ（ＬＨＲ−Ｂおよび−Ｄをコードする）またはｐｉＣＤ（ＬＨＲ− Ｃおよび−Ｄをコードする）の発現はＣ３ｂファクターＩ−コファクター活性を 存するＣＲＩ産生物を産生した。従って第ｖ表のデータは、ＣＲＩタンパク質ま たはそのフラグメントが補体不活性化を促進することができるとの証明を提供す る。

１１、実施例二組換え可溶性ＣＲＩの発現ＣＲＹ　ｃＤＮＡを組換えＤＮＡ操作 により修飾してＣＲＩまたはＣＲＩフラグメントの可溶性形（ｓｃＲｌ）を生成 させた。

５ｃＲ１構築物を哺乳類系中で発現させ、そこで細胞から発現タンパク質を分泌 させた。大量の可溶性ポリペプチドが産生され、これらのものはＣＲＩタンパク 質の膜結合形と対照的に、溶液として得るために可溶化させる必要はなかった。

！１．１．材料および方法 １１゜１．１．酵素消化 すべての制限酵素消化、リンカ一連結、およびＴ４ＤＮＡリガーゼおよびＥ、ｃ ｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ反応を製造業者（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ ｌａｂｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、　ＭＡ）の説明書に従って行った 。Ｅ、ｃｏｌｊ　ＤＨＩまたはＤＨ５αをＭｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｄ、Ａ、、　１ ９７９．　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ　６８：３２６−３３１の操作法により コンピテントにした。コンピテント細菌細胞をＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ。ら、１ ９８２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　ＹｏｒｋによりＤＮＡで形 質転換した。プラスミドをアルカリ溶解または煮沸方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　 Ｔ、ら、上記）により精製した。

１１．１．２．　ＤＮＡフラグメントの単離ＤＮＡフラグメントをアガロース（ ＢｉｏＲａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ。

（Ａ）ゲルから下記のようにして精製した。適切なりＮＡバンドをゲルからカミ ソリを用いて切り出し、アガローススライスをパラフィン仕上に置き、きわめて 小さい切片にスライスし、新しいパラフィン片に移した。

アガロース片をつぶし、アガロースを１．５ｍｊ’管に移した。同容量のフェノ ール（超純粋、ＢＲＬ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ。

ＭＤ）を添加し、混合物を回転させ、次いで一７０℃で１０分間凍結し、１０分 間遠心した。水相をさらにフェノール／クロロホルム（１：　１）で２回、クロ ロホルムで２回抽出した。次いでＤＮＡをエタノール沈降させ、ペレットを洗浄 し、真空乾燥し、ＩＱｍＭ　トリス−）ＩＣＩ、　ｐＨ７，０゜１　ｍＭ　ＥＤ ＴＡに再浮遊させた。

ＤＮＡフラグメントを低ゲル化温度アガロース（ＦＭＣ。

Ｃｏｒｐ、、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　ＭＥ）から下記のようにして単離した。適 切なりＮＡバンドをアガロースゲルから切出し、１．５イ管に入れ、６５℃で１ ５分間融解させた。液化ゲルをＯ３１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、超純 粋、、　ＢＲＬ。

Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、　ＭＤ）を含有するフェノールで抽出した。

水相をさらにフェノール−３ＤＳで１回、クロロホルムで２回抽出した。次いで ＤＮＡを２．０ＭＮＨ４アセテート中でエタノール沈降させ、乾燥し、水に再浮 遊させた。

１１゜！、３．　哺乳類細胞へのトランスフェクション哺乳類細胞へのＤＮＡの トランスフェクションをＣａＰＯｉ沈降およびＧｒａｈａｍおよびｖａｒ　ｄｅ ｒ　Ｈｂのグリセロールショック法（１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５ ６−４６７）により行った。

ＤＵＸ　Ｂｌｌ　ＣＨＯ細胞を、ＤＮＡ−リン酸カルシウム調製物と共に４〜６ 時間インキュベートしたのち、通気による成長培地の除去および２９６グリセ１ コ一ルＤＭＨＭ培地５ｒｎＩ！の１分間添加によってグリセロールショックにか けた。

次いで細胞を完全アルファーＭＥＭで２回洗浄し、この培地中で４８時間インキ ュベートした。

１１、．１．４．　ＣＨＯトランスフエクタント細胞培養ＤＵＸ　Ｂｌｌ　ＣＨ Ｏ細胞トランスフエクタントを、ヌクレオシド不合で１０％透析ウシつ児血清（ Ｇｉ、ｈｅｏ）および４ｍＭＬ−グルタミンを補充したアルファーＭＥＭ培地（ Ｇｉｂｅｏ）からなるＩＩＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）選択培地中で増 殖させた。漸増量のメトトレキセート（Ｓｉｇ＋ｎａ。

＃Ａ−６７７０．　Ａｍｅｔｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）濃度で細胞を増殖させること により増幅を行った（Ｋａｕｆｍａｎ、　Ｒ，Ｊ。ら７、１９８５゜Ｍｏ１ｅｃ 、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ！、　５：１７５０−１７５９）。

１１．１．５．可溶性ＣＲＩレベル測定用ＥＬＩＳＡ１１、１．５．１．　ＣＲ １標準物 ヘモグロビン不含血球球細胞（ＲＢＣ）　ｇｈｏｓｔの界面活性剤溶解物をＥＬ ＩＳＡ（酵素−結合イムノソルベントアッセイ）におけるＣＲＩ標準物として用 いた。ｇｈｏｓｔは先に記載されたようにして作製した（Ｗｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、 およびＦｓａｒｏｉｙ、Ｄ、Ｔ、、、１９８７．　Ｍｅｔｌｌ、Ｅｎ７１ｙ＋ｉ ＋ｏ１１５０：５７９−５８５）。

簡単にいうと、赤十字から使用期限の切れな全血を得た。赤血球をＰＢＳで３回 洗浄したのち、６容量の低張溶解緩衝液（１０ｍＭ　トリスｐＨ８，、Ｏ，ｉｍ Ｍ　ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）　、　０．　Ｘ　ｒｎＭ 　ＴＰＣＫ（トシルアミドーフェニルエヂルクロロメゲルケトン）、アブ口Ｉ・ ニン、２ｍ門ＥＤＴＡ）中で溶解した。ｇｈｏｓ　ｔを溶解緩衝液で数回洗浄し 、血球針でカウントし、小部分に分け、必要になるまで一７０℃で凍結した。Ｃ ＲＩ　ＥＬＩＳＡについては、ｇｈｏｓｔを可溶化緩衝液（１０ｍＭ０ｍＭトリ スル。

５０ｍＭ　ＫＣＩ、　０．２％ＮＰＯ４０，０，３％ＤＯＣ，６，２ｍＭ　ＰＭ ＳＰ−０，２ｍＭヨー　ドアセトアミド、アブロトニ、二〕、０．１ｍＭ　ＴＰ ＣＫ。

２ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０゜２％ＮａＮ５）中で１．６　ｘ　１０”　ｇｈｏｓｔ 　／ｒｒｄ；！に希釈し、ＥＬＩＳＡにおける標準物として用いるために連続的 に２．５　Ｘ　１０’　ｇｈｏｓｔ　／−に希釈した。４９０ｎｍにおける吸光 度をプロットし、すべての未知サンプル操作をプロットと関連させてｇｈｏｓ　 を当量／ｍｌを得た。

１１．１．５．２．　ＣＲＩ　ＥＬＩＳＡＩｒｎｍｕｎ　１ｏｎ−ＩＦプレート をＰＢＳ中の０．４　ｔｔ　ｇ／ｍｊ？濃度の抗−ＣＲＩモノクローナル抗体（ クロー　ンＪ３Ｄ３．　ＡＭＡＣＪＯＴ　１７）の１００μｅ／ウエルで被覆し くＣｏｏｋ、　Ｊ、ら、１９８５、　Ｍｏ１ｅｃ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。２２：５３ １−５３８）　、４°Ｃて１夜インキユベートした。次いで抗体溶液を捨て、ブ ロッキング溶液（１，０％　ＢＳＡ、　ＰＢＳ中）を３ｏｏμＩ２／ウニ）Ｉｓ で添加することによりプレートをブロックし、３７°Ｃで２時間インキュベート した。ブロッキングののち、プレートをそのまま使用し、または必要になるまで ４℃で保存した。

０．０５％Ｔｉｖｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳを用いてプレ・−トを３回洗浄 した。サンプルを１００μ！！／ウエルで２通りずつで添加し、３７℃で２時間 インキュベートした。

場合によってはサンプルを可溶化緩衝液で希釈した。

標準ＲＢＣｇｈｏｓｔを各プレートに包含させた。サンプルインキュベーション ののち、プレートを３回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）お よびモノクローナル抗体ＹＺ　１　（Ｃｈａｎｇｅｌｉａｎ、　Ｐ、　Ｓ、ら、 １９８５．　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌｏ、　１８４：１８５１−１８５８）の結合物（Ｗｉｌｓｏｎ、 　Ｍ、Ｂ、および　Ｎａｋａｎｅ、Ｐ、に、、１９７８．　Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕ ｏｒｅｓｅｅｎｃｅ　ａｒ司Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉ ｑｕｅｓ、　ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ、 　Ｉ）り、２ｉ５−２２４）を５０％ＦＣ３，５０％ブロッキング緩衝液中でｉ 　：　５ｏｏｏに希釈し、１００μＩ７／ウエルで添加した。３７°Ｃで２時間 インキュベートシたのち、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで 再び２回洗浄した。基質オルトフェニレンジアミン（ＯＰＨ）を基質緩衝液（０ ，３６％クエン酸Ｈ２０，１，７４％ＮａｚＨＰＯ４−７Ｈ２０゜０．１％チメ ロサール、０．４％Ｈ２Ｏ２，ｐＨ６，３）中０．２％濃度で１００μｉ／ウエ ルで添加した。室温で２０分後に２Ｎ　Ｈ，ＳＯ，５０μｌ／ウエルを用いて反 応を中断させた。４９０ｎｍにおける吸光度を読み取った。

１１．２．　ＣＲＩコード配列の遺伝子修飾ＣＲＩ　ＣＤＮＡは約６．９５１ヌ クレオチド塩基対から構成される（第１図、上記の第６および７節）。天然型ｅ ＤＮＡの翻訳停止シグナルは塩基対６１４５に位置する。このタンパク質は、細 胞膜の外表面に露出された４個の長い用量性反復（ＬＨＲ）プラス約２５アミノ 酸の膜に及ぶドメイン、これに続く細胞質内に伸びるカルボギシル末端領域から 構成された膜結合レセプター分子である。この細胞質ドメインは４３アミノ酸か ら構成される。可溶性ＣＲ１分子（ｓｃＲｌ）の産生に用いた戦略は、細胞膜に タンパク質を固定する膜貫通領域を除去し、次いで切りつめられた構築物を分泌 ポリペプチドとして発現させることであった。

１１．２．１．ｐＢＳ（Ｊｌｃの形式 プラスミドｐＢＳＡＢＣＤ（上記の実施例８）はヌクレオチドｌ−６８６０から のＣＲＩ　ｃＤＮＡを含有し７、非翻訳配列３′からヌクレオチド６８６０にお けるＢｃｏＲＶ部位を有しない。

Ｃ！’ｉ！１　ｃＤＮＡは膜貫通ドメインの開始から２９塩基離れた、塩基対５ ９１４における独特な制限ヌク１ツアー・ゼ認識部位を有する。りＢＳＡＢＣＤ をまずＢａ１．Ｉで消化してフラッシュ末端を有する線状分子を生成させ、次い でＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて下記の配列を有する２個の３８ヌクＬ・オチド 相補鎖からなる合成オリゴヌクレオチドに連結した。

５’　：ＣＣＡＡＡＴＧＴＡＣＣＴＣＴＣＧＴＧＣＡＣＡＴＧＡＴＧＣＴｔａａ ＣＴＣＧＡＧ３゛　二ＧＧＴＴＴＡＣＡＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＧＴＧＴＡＣＴＡ ＣＧＡＡＴＴＧＡＧＣＴＣ生成した分子は回復されたＢａＩＩ部位および膜貫通 ドメインの開始点におけるアラニン残基まで（これを含む）の天然型ＣＲＩ配列 を再生する変化した配列を有していた。これに加えて、翻訳停止シグナル（下記 場合で及び上で下線つき）はアラニンの直後に挿入されており、続いて変化した ｃＤＮＡのサブクローニングを容易ｔごするＸｈｏｌ制限部位があった。

このプラスミドのＸｈｏ　Ｉ消化（消化されたｐＢｓｃＲｌｃ）は、ｅＤＮ、Ａ のオリゴヌクレオチド付加Ｘｈｏ１部位およびＣＲＩｅＤＮＡの５′末端におけ るｐＢＳＫＳ＋■多重クロー、；ング部位のＸｈｏ　［部位において切断するこ とによりｃＤＮＡ挿入物（消化された５ｃＲ１ｅ）を切出した。ｐＢｓｃＲｌｃ は下記のＮ−末端配列を含有する。

塩基Ｎα５９１．１　：　ＣＴＧＧＣＣＡＡＡＴＧＴＡＣＣＴＣＴＣＧＴＧＣＡ ＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧアミノ酸：　ＬＡＫＣＴＳＲＡＨＤＡ　 末端Ｘｈｏ１部位１１．２，２．１）ＢＳＣＲＩの形成 膜貫通領域を有しない第２の５ＣＲＩ構築物を次のようにして生成させた。ｐＢ ＳＡＢＣＤをＳａｃ　Ｉで消化した。これはＣＲＩ　ｃＤＮＡのヌクレオチド塩 基対５４８５における独特なＳａｃ　Ｉ部位およびＣＲＩ　ｃＤＮＡの３′末端 に位置する宿主プラスミドの多重クローニング部位のＳａｃ　１部位において切 断する。この消化はｃＤＮＡの３°末端から１３７５ヌクレオチドのＤＮＡ配列 の切出しを生じさせた。次いでこのフラグメントを電気泳動により除去した。残 りの５ｃＲ１ｃＤＮＡを含有する生成プラスミドの露出末端を、Ｔ４　ＤＮＡポ リメラーゼを用いてフラッシュとなし、プラント末端連結を行った。Ｐｈａｒｍ ａＣｉａ翻訳ターミネータ−（カタログ＃２７−４８９０−０１．　Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ、　Ｉｎｃ、、　Ｐｉｓｅａｔａｗａｙ、　ＮＪ）、３つのすべての読 枠中に翻訳終止シグナルを含有する自己相補性オリゴマーも、連結に含まれてい た。連結に際して、挿入されたオリゴマーは５ｃＲ１ｃＤＮＡについての新たな 翻訳停止シグナルを提供した。

１１．２゜３．　ｐＢＭ−ＣＲｌｃの形成ｐＢＭＴ３Ｘは、ヒトメタロチオネイ ン−ＩＡ遺伝子を含有する真核発現ベクター（Ｋｒｙｓｔａｌ、　Ｍ、ら、１９ ８６．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３：　２７０９−２７１ ３）であり、この遺伝子は重金属例えばカドミウムの増加レベルに対する抵抗性 を細胞に与える。このベクターはまた、Ｍｔ−１タンパク質に関する開始コドン の前にある遺伝子操作されたＸｈｏ　Ｉ部位を含有するマウスメタロチオネイン −１遺伝子を含む。このＸｈｏ　ｒ部位はマウスＭｔ−１プロモーターの制御下 での遺伝子発現に関する挿入部位として用いられる。

ｐＢｓｃＲｌｃからＸｈｏｌを用いて５ｃＲ１ｃ挿入物（約５．９　ｋｂ）を切 出し、次いでベクターｐＢＭＴ３Ｘの独特なＸｈｏ　Ｉ部位に連結した。９８Ｍ ＴａＸ中のＣＣＲＩＣの正しい方向を制限消化により測定した（Ｍａｎｉａｔｉ ｓ、　Ｔ、ら、１９８２．　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａ ｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏ ｒｋ）。生成したプラスミドをｐＢＭ−ＣＲｌｃと命名した。

１１．２．４．欠失組換え体ｐＴ−ＣＲ１ｃｌ、　ｐＴ−ＣＲｌｃ２、ｐＴ−Ｃ Ｒｌｃ３、ｐＴ−ＣＲＩＣ４およびｐＴ−ＣＲｌｃ５の形成５ｃＲ１，ｃＤＮＡ のタンパク質を特異的に欠失した種々の欠失組換え体も構築された（第２０図） 。各欠失組換え体は完全長ｅＤＮＡの膜貫通領域を欠いていたので、組換え体の 発現は可溶性ポリペプチドを生じさせるであろう。

１１．２．４，１．　ｐＴ−ＣＲｌｃｌｐＢｓｃＲｌｅをＳｍａＩで消化して大 きさ２．５６ｋｂおよび７，３ｋｂの２個のフラグメントを生成した。これらの フラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離し、７．３ｋｂフラグメント を精製してそれ自体に連結した。ｌＥ、ｃｏｌｉＤＨ５α細胞をコンピテントと なしくＭｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｄ、Ａ、。

１９７９、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｔｎｏｌ、　６８：３２６−３３１）、次い て連結混合物で形質転換した。生成したプラスミドをｐＢＬ−ＣＲｌｃｌと命名 した。この構築物はＣＲ１ｃ挿入物のＬＨＲ−８３８％、ＬＨＲ−Ｃ１００％お よびＬＨＲ−Ｄ　５１％を除去した。さらに、これは接合部２３３５／４８９４ ｂｐでＳｍａ　Ｉ部位を再生し、正しい翻訳枠を保持していた。ｐＢＬ−ＣＲｌ ｃｌをＸｈｏ　Ｉで消化し、ＣＲＩ挿入物をｐＢｌｅｕｓｃｒｉｌ）ｔ■ベクタ ーから分離した。

単離されたＣＲＩフラグメントを次いで発現ベクターｐＴＣ３ｇｐｔの独特なＸ ｈｏ　Ｉ部位中に挿入してプラスミド＋　ｐＴ−ＣＲｌｃｌを生成した。

１１．２．４．２．　ｐＴ−ＣＲＩＣ，２ｐＢｓｃＲ１ｅをＣ１ａｌおよびＢａ １Ｉで消化して大きさ３．９６ｋｂおよび５．９　ｋｂの２個のフラグメントを 生成した。これらのフラグメントをアガロースゲルから精製した。プラスミドｐ ＢＲ３２２をＣ１ａｉおよびＢａ１Ｉで消化し、２．９ｋｂｐＢＲ３２２フラグ メントを精製し、ｐＢｓｃＲｌｃからの５．９　ｋｂフラグメントに連結した。

Ｂ、ｅｏｌｉ　ＤＨ５α細胞を連結混合物で形質転換し、生成したプラスミドを ｐＢＲ８，８と命名した。このプラスミドをＸｂａ　Ｉで消化し、大きさ７．４ ５ｋｂおよび１．３５ｋｂの２個のフラグメントを生成した。

７、４５ｋｂフラグメントをアガロースゲルから精製し、それ自体に連結させた 。生成したプラスミドｐＢＲ７，４５をＣａ１ｉおよびＢａ１Ｉで消化し、５Ｃ Ｒ１ｅＤＮＡを含有する単離された４、　５　ｋｂフラグメントをｐＢｓｃＲｌ ｃからの３．９６ｋｂフラグメントに連結し、プラスミドｐＢＬ−ＣＲ１ｃ２を 生成した。この構築物はＬＨＲ−８９０％を５ｃＲ１挿入物において除去してお り、接合部１６３７／２９８７ＰｂでＸｂａ　Ｉ部位を再生し、正しい読枠を保 持していた。ｐＢＬ−ＣＲｌｃ２をＸｈｏ　Ｉで消化し、５ｃＲ１挿入物をｐＢ ｌｅｕｓｃｒｉｐｔ■ベクターから分離した。単離された５ＣＲＩフラグメント を次いで発現ベクター　ｐＴｃｓｇｌ）ｔの独特なＸｈｏ　１部位に挿入し、プ ラスミドｐＴ−ＣＲ１ｃ２を生成した。

１１．２．４．３゜　ｐＴ−ＣＲ１ｃ３ｐＢｓｃＲ１ｃをＮ５ｉＩで消化して大 きさ１，０９ｋｂＳ１．３５ｋｂおよび７．４６ｋｂの３つのフラグメントを生 成した。７．４６ｋｂフラグメントをアガロースゲルから精製し、それ自体に連 結させ、プラスミドｐＢＬ−ＣＲ１ｃ３を生成した。この構築物はＬＨＲ−Ａの ７７％およびＣＲＩ挿入物の残りを除去していた。Ｎ５ｉＩ部位を接合部４６３ ／２９０７ｐｂで再生した。

ナンセンスコドンを再生されたＮ５ｉＩ部位のすぐ後に導入することにより翻訳 枠を修飾した。ｐＢＬ−ＣＲ１ｃ３をＸｈｏ　Ｉで消化し、５ＣＲ１挿入物をｐ Ｂ１ｅｕｓｅｒｉｐｔ＠ベクターから分離した。挿入された５ｃＲ１フラグメン トを次いで発現ベクターｐＴｓｃｇｌ）ｔの独特なＸｈｏ１部位に挿入し、プラ スミドｐＴ−ＣＲ１ｃ３を生成した。

１１．２．４．４．　ｐＴ−ＣＲ１ｃ４ｐＢｓｃＲ１ｅをＰｓｔｌで消化した。

ｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔ■のポリリンカーのＰｓｔ１部位は、このベクターにＣ ＲＩ　ｃＤＮＡを連続する際に除去されていた（上記の実施例８．１）。生成し た大きさ１．３５ｋｂおよび８．５　ｋｂのフラグメントをゲル電気泳動により 分離し、８．５　ｋｂフラグメントを精製し、それ自体に連結させ、プラスミド ｐＢＬ−ＣＲＩＣ４を生成した。この構築物はＬＨＲ−Ａの３１％および５ｃＲ １挿入物のＬＨＲ−Ｂの６９％を除去した。　Ｐｓｔ１部位を接合部１０７４／ ２４２４ｐｂで再生させ、こうして正しい読枠を保持させた。

ｐＢＬ−ＣＲ１ｅ４をＸｔ＋ｏｌで消化し、５ｃＲ１挿入物をｐＢｉ、ｅｕｓｅ ｒｉｐｔ■ベクター・から分離した。単離された５ｃＲ１フラゲメントを次いで 発現ベクターｐＴＣ３ｇｐｔの独特なＸｈｏＩ部位に挿入してプラスミドＰＴ− ＣＲ１ｃ４を生成した。

！１．２．４．５．　ｐＴ−ＣＲ１ｅ５ｐＢＬ−ＣＲｌｅｌ　＄：ｓｍａｉで消 化し、こうしてこのプラスミドを独特なＳｍａ　Ｉ部位で線状にした。このプラ スミドを脱ホスホリル化し、ナンセンスコドン（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏ ｌａｂｓ、　Ｒｅｖｅｒｌｅｙ、　ＭＡ）を含有するホスホリル化Ｎｈｅ　１リ ンカ−に連結した。この型のリンカ−は３一つのすべてのありうる読枠中に翻訳 停止コドンを含有し、ＮｈｅＩ制限部位をも含有し、これは５ｃＲ１ｃＤＮＡ中 のナンセンスリンカ−の存在の確認を容易にする。ｐＢＬ−ＣＲ１ｃ５をＸｈｏ 　Ｉで消化し、５ｃＲ１挿入物をｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔ■ベクターから分離し た。単離された５ｃＲ１フラグメントを次いで発現ベクターｐＴＣＳｇｉ）ｔの 独特なＸｈｏ　１部位に挿入してプラスミドｐＴ−ＣＲ１ｅ５を生成した。

１１．３．可溶性ＣＲＩの発現 ここに示すように、細胞から高収率で分泌させることのできるＣＲＩの可溶性形 の発現は、（ｉ）欠失または切りつめのために使用するＣＲＩ　ＤＮＡ中の１つ のその位置に限られず、そして（ｉｉ）特別の発現ベクターの使用にも限定され ない（下記参照）。分泌５（Ｊｌを産生ずる能力は２つの異なる発現系において 示された。

１１．３．１．発現ベクターのｐＴＣＳシリーズの形成用いられた発現ベクター のｐＴＣＳシリーズは３つのプラスミドから成り、それぞれはｃＤＮＡの挿入の ための独特なＸｈｏＩクローニング部位を存する（第２１図）。挿入されたｃＤ ＮＡの転写は１組のタンデムプロモーターにより誘導される。ＳＶ４０初期プロ モーターはアデノウィルス２主要延期プロモーター（ＡＤ２　ＭＬＰ）の上流に 位置する。ｃＤＮＡの初めとＡＤ２　ＭＬＰの間にはアデノウィルス３分節系リ ーダーがある。転写されたｍＲＮＡは、Ｘｈｏｌ　ｃＤＮＡクローニング部位の 下流に位置するマウス免疫グロブリンカッパ（Ｉｇに）配列により供給されたポ リアデニル化シグナルで停止される。選択可能なマーカーであるキサンチン−グ アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）　、ジヒドロ葉酸レダクタ ーゼ（ｄｈｆｒ）またはネオマイシン耐性（ｎｅｏつはそれぞれｐＳＶ２ｇｐｔ 　５ｐＳＶ２ｄｈｆｒまたはｐＳＶ２ｎｅｏからの対応するマーカーの挿入によ り供給された。これらのプラスミドは、アンピシリン耐性についての複製および ベーターラクタマーゼ遺伝子の細菌系の源でもあった。一般に、これらのベクタ ーのうちどれを選んで使用するかは、どの選択可能なマーカーまたはマーカーの 組合せが組換体の選択に好ましいかの如何による。

完全なりＮＡ配列は’７デノウイルス２　（ＡＤ２）　、ＳＶ４０、ｐＳＶ２ｅ ａｔ（Ｇｏｒｍａｎ、　Ｃ，、１９８５，ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｖｏｌｕ ｍｅ　ＩＩ。

Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｅｄ、Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ、Ｉ ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ。

ｐｐ、　１．４３−１９０）およびマウス免疫グロブリンカッパについて知られ ている。配列はＧｅｎＢａｎｋ■データベー・スおよびＮａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉ ｏｎ＋ｅｄｉｅａｌ　Ｒｅ５ｅａｒＣｈの注解および参考文献中にある。これら の配列のいずれもがｐＴＣＳベクターの適切なセグメントのための源として役立 つ。

ベクター’ｐ’ｒｅｓｇｐｔ、　ＰＴＣ３ｎｅｏおよびｐＴｃｓｄｈｆｒは中間 体プラスミドｐＥＡＸｇｐｔおよびｐＭＬＥｇｐｔから下記のよ・うにして形成 した。

１１．３．１゜！、ｐＥＡＸｇｐｔの形成階段１　、　Ａｄ２　ＭＬＤ　ＮＤＡ フラグメントをＭ１３　ｍｐ　り　／ＭＬＰから誘導した（Ｃｏｎｅｉｎｏ、　 Ｍ、Ｆ、ら、１９８３．　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２５８：８４９３−８４９６）。このプラスミドは、ヌクレオチド６０６９にお けるＰｖｕ］Ｉ制限部位およびヌクし・オ”チド５７９１におけるＳａｃ　ＩＩ 部位を含むヌクレオチド５７７Ｂ（Ｘｈｏ１部位）ないし６２３１　（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位）のアゾノウ・イルス２配列を含有する（ＮＢＲＦ　Ｎｕｅｌｅｉｅ データベース、受入わ券Ｇｄａｄ２参照）　。ＸｈｏｌないしＨｉｎｄｌＩｒフ ラグメントをＭ１３ｍｐ９のＨｉｎｄｌｌＩおよび５ａｌＩ部位中にクローニン グしてプラスミドＭ１３　ｍｐ９　／ＭＬＰを生成した。

プラスミドＭ１３　ｍｐ　９　／ＭＬＰをＥｅｏＲＩおよび！（ｉｎｄｌｌＩで 消化し、フラグメントを含有するより小さいＭＬＰを単離した。ｐＵＣプラスミ ド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ、、　Ｐｉｓｃａｔｗａｙ。

ＮＪ）もＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌ［で消化し、このプラスミドからのより大 きいフラグメントを次いでＥｃｏＲＩないしＨｉｎｄＩＩＩ　ＭＬＰフラグメン トに連結した。これはｐＵＣのプラスミドバックボーンを有する新規なＭＬＰ含 有プラスミドを生成した。このプラスミドをＳｍａ　ｉで消化し、Ｓａｌ、Ｉリ ンカ−に連結し、再び環状化した。次いでこの新規なプラスミドをＰｖｕ　ＩＩ で消化し、これはプラスミドをアデノウィルス２挿入配列内の位ｆｌｔ　＃６０ ６９に位置するＰｖｕ　ＩＩ部位で開裂した。生成した線状フラグメントをＸ１ １０Ｉリンカ−に連結し、再び環状化した。次いでこのプラスミドをＸｈｏＩお よび５ａｌＩで消化し、ＭＩ、Ｐ　ＤＮＡを含有するより小さいフラグメントを ｌ離した（フラグメント＃ｌ）。

段階２．プラスミドｐＳＶ２ｇｐｔ　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ ｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）受託Ｎａ３７１４５）をＰｖｕ　Ｉ Ｉで消化し、Ｓａｌ、Ｉリンカ−に連結し、５ａｌＩで消化した。最終生成物は 、ｇｐｔ遺伝子源として役立つ線状ｐＳＶ２ｇｐｔフラグメントであった（フラ グメント＃２）。

段階３．マウス免疫グロブリンＩｇにフラグメント（Ｈｉｅｔｅｒ。

Ｐ、　Ａ、ら、１９８０．　Ｃｅ１ｌ　２２：ｌ９７−２０２）をＨｉｎｄＩＩ ＩおよびＡｖａ　ＩＩで消化し、ポリアデニル化配列を含有するフラグメントを 単離した。ＮＢＲＦ　Ｎｕｃｌｅｉｃデータベース（受託＃にｃｍｓ）で入手で きるマウスＩｇカッパ配列には、Ｉｇ停止コドンが位置１２９６にあり、続いて １３０６にＡｖａ　ＩＩ部位、１４８４にＡＡＴＡＡＡポリアデニル化部位およ 化部子１４にＨｉｎｄＩＩＩ部位がある。このフラグメントのオーバーハング端 をε、ｅｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼで充填し、次いでこのフラグメントをＸｂ ｏｌリンカ−に連結し、Ｘｈｏ　Ｉで消化した。このフラグメント（フラグメン ト＃３）はポリアデニル化部位源とし役立った。

段階４．フラグメント１，２および３をＴ４　ＤＮＡリガーゼにより一緒に連結 し、環状プラスミドを生成した。

このプラスミド中のフラグメントの正しい方向は制限酵素分析により確認された 。Ｘｈｏ［ｅＤＮＡクローニング部位の下流にはマウスカッパポリアデニル化部 位があり、この部位からさらに下流にはＳＶ４０プロモーターおよびｇｐｔ遺伝 子があった。Ｘｈｏ　１部位の上流にはＭＬＰプロモーターがあり、このプロモ ーターからさらに上流には細菌由来の複製およびアンピシリン遺伝子があった。

次いでこのプラスミドを５ａｉｌで消化し、オーバーハング端を８．ｃｏｌｉ　 ＤＮＡポリメラーゼで充填した。生成したプラントエンドフラグメントをＥｃｏ ＲＩ　リンカ−に連結し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで再び環状化した。この最終プ ラスミドをｐＥＡＸｇｐｔ　と命名した。

１１．３．１．２．　ｐＭＬＥｇｐｔの形成段階１．プラスミドｐＭｔ、ｐ　Ｃ ＡＴ　（Ｌｅｅ、　Ｒ，Ｆ、ら、１９８８゜Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１６５：５Ｏ −５６）はｐＭＩ、ベクターバックグランドを有する発現プラスミドであり、ア デノウィルス２ＭＬＰおよびＣＡＴ遺伝子の５′側の３分節系リーダー配列を含 有する。ｐＭＬＰ　ＣＡＴをＸｈｏｌおよびＳａｃ　ＩＩで消化した；ＸｈｏＩ はＣＡＴ遺伝子と３連リーダーのＬ３領域との間の部位で切断し、そしてＳａｃ 　ＩＩはアデノウィルスＤＮＡ内の位置＃５７９１で、ただしＭＬＰの５゛で切 断する。こうして、ＡＤ２　ＭＬＰおよび３分節系リーダーはこの小さいＸｈｏ Ｉ上にＳａｃ　ＩＩフラグメントまで位置した（フラグメント＃４）。

段階２．プラスミドｐＥＡＸｇｐｔをＸｈｏｌおよびＳａｃ　ＩＩで消化し、フ ラグメントを含有するより小さいＭＬＰを捨てた。より大きいフラグメント（フ ラグメント＃５）を単離した。Ｓａｃ　ＩＩおよびｘｈｏ　Ｉ末端の両方を有す るフラグメント４および５を連結してプラスミドｐＭＬＥｇｐｔを生成した。

１１．３．１．３．　ｐＴｃｓｇｌ）ｔの形成段階１．　ｐＭＬＰＥｇｐｔを５ ａｅｌＩで消化し、末端をＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで充填し、プラントエンド フラグメント（フラグメント＃６）を生成した。このＳａｃ　ＩＩ部位はアデノ ウィルス２配列中のヌクレオチド５７９１にＭＬＰ−３分節系リーダーの５°に 位置する。

段階２　、ｐＳＶ　２　ｄｈｆｒ　（ＡＴＣＣ受託Ｎ（Ｌ３７１４６）をＨｉｎ ｄＩ［ＩおよびＰｖｕ　Ｉ［で消化した。ＳＶ４０初期プロモーターを含有する より小さな３４２ヌクレオチドフラグメントを、Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントを用いてプラントエンド とした（フラグメント＃７）。フラグメント６および７をＴ４　ＤＮＡリガーゼ で連結した。制限酵素分析により、これらのフラグメントは正しく配向して、Ｘ ｈｏＩ　ｃＤＮＡクローニング部位の上流に２個のタンデムプロモーターを与え 、各プロモーターは同じ方向へのＲＮＡ合成を誘引できることが確認された。こ のプラスミドはｐＴＣ３ｇｐｔと命名された（第２２図）。

１１．３．１．４．　ｐＴＣ３ｄｈｆｒの形成段階１　、ｐＳＶ　２　ｄｈｆｒ をＨｉｎｄＩ［およびＰｖｕ　ＩＩで消化し、次いでより大きいフラグメントを アガロースゲルから精製した（フラグメント＃８）。より小さいＳＶ４０初期プ ロモーター含有フラグメントを捨てた。

段階２．　ｐＴＣ３ｇｐｔをＥｃｏＲｒで消化し、次いでＥ、ｃｏｌｉＤＮＡポ リメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで充填してプラントエンドを生成した。

次いでこの線状フラグメントをＨｉｎｄｌＩ［で消化し、ＳＶ４０プロモーター のｐ’ｒｃｓ転写ユニット、ＭＬＰ、３分節系リーダー、Ｘｈｏｌ　ｃＤＮＡク ローニング部位、マウスＩｇλ配列および第２のＳＶ４０プロモーターを含有す るフラグメント（約１６００ヌクレオチド）を単離した（フラグメント＃９）。

このフラグメントは１個のフラッシュエンドおよび１個のｔ（ｉｎｄＩＩＩオー バーハングエンドを有した。フラグメント８および９の連結はプラスミドｐＴＣ ３ｄｈｆｒを生成した。

１１．３．１．５　ｐＴＣ３ｎｅｏの形成段階１．　ｐＳＶ２ｎｅｏ（ＡＴＣＣ Ｎα３７１４９）をＨｉｎｄＩ［およびＢａｍＨＩで消化し、より大きいフラグ メント（フラグメント＃１０）を単離した。このフラグメントはブ・ラスミドバ ックグランドおよびｎｅｏ遺伝子を含有していた。

段階２．　ｐＴＣ３ｇｐｔ中を旧ｎｄＩＩ［およびＢａｍＨＩで消化し、ｐＴＣ ３転写ユニット（フラグメント＃１１）を消化生成物の電気泳動ののちアガロー スゲルから単離し、た。フラグメントｌＯおよび１１の連結はプラスミドｐＴＣ Ｓｎｅｏを生成した。

１１．３．２．　プラスミドｐＢＳＣＲＩＣ，ｐＢＳＣＲＩＳおよびｐＢＭ−Ｃ Ｒｌｃの発現およびアッセイ、可溶性ＣＲＩクローニング配列を含有する哺乳類 発現ベクター１１．３．２．１．　ＣＲＩ　ｃＤＮＡ内の異なる位置で切りつめ られたＣＲＩ構築物の発現 プラスミドｐＢｓｃＲ１ｃおよびｐＢｃｓＲｌｓを形成しく上記の第１１．１節 ）、膜貫通および細胞質内領域を除いて大部分のｃＤＮＡコード領域を保存する ようにし、た（第２０図）。

ｐＢｃｓＲｌｓは、ＬＨＲ−Ｄの一部分およびｐＢｓｃＲｌｃに存在する５ＣＲ ｓ２９および３０を欠くので、ｐＢｓｃＲｌｃよりも短い。

これらのプラスミドの５ｃＲ１部分をｐＴＣ３ｇｐｔ中に挿入し、次いで上記の ようにしてトランスフェクションおよび発現を行った。

ｐＢｓｃＲ１ｃ／ｐＴＣ３ｇｐｔ構築物：　ｐＢｓｃＲｌｃをＸｈｏｌで消化し て５．９ｋｂ挿入物を５ｃＲ１ｃを生成した。５ｃＲ１ｃをｐ’ｒｃｓｇｐｔの Ｘｈｏｌ　ｃＤＮＡクローニング部位中に挿入してｐＢｓｃＲ１ｃ／ｐ’ｒｅｓ ｇｐｔを生成した。

ｐＢｓｃＲ１ｓ／ｐＴＣＳｇｐｔ構築物：　ｐＢｓｃＲｌｓをＸｈｏ　Ｉおよび Ｐｖｕ　１で消化して５ｃＲ１ｓ挿入物を放出させた。この挿入物の両端をＴ４ 　ＤＮＡボリメラ・−・ゼでプラントにした。この挿入物をアガロースゲルから 精製した。ベクターｐ’ｒｅｓｇｐｔをＴｈｏ！で消化し、オーバーハングＸｈ ｏ　ＩエンドをＥ、ｃｏｉｉＤＮＡポリメラーゼエで充填した。次いで５ｃＲ１ ｓ挿入物をプラントエンドベクターに連結しＣｐＢｓｃＲ１ｓ／ｐＴＣ３ｇｐｔ を生成した。

プラスミドｐＢｓｃＲ１，ｅ／ｐＴｃｓｇｌ）ｔおよびｐＢｓｃＲ１ｓ／ｐＴｃ ｓｇｐｔをＦｓｐＩで消化し、生成した線状ＤＮＡをチャイニーズハムスター卵 巣細胞中にトランスフェクションし、この細胞はプラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒと のリン酸カルシウム共沈によるｄｈｆｒ遺伝子中の組換え体（ＣＨＯＤＵＸ　Ｂ ｌｌ細胞）であった。トランスフエクタントをＤＨＰＲ選択培地中でのその増殖 能により選択した。トランスフエクタントクローンの培養物上清をＥｌ、ＩＳＡ により選択された５ｃＲ１についてアッセイした。５０のｐＢｓｃＲ１ｃ／ｐＴ Ｃ３ｇｐｔ組換え体からの培養物上清をアッセイし、陽性組換え体を漸増濃度の メトトレキセート中での培養による増殖方法によって取出した。さらに、トラン スフエクタントのプールを、各プールにつき８個のＰＢＳＣＲ１ｃ／ｐＴＣ３ｇ ｐｔ　）ランスフエクタントを一緒に培養１１１、同じ増幅方法によりそれらを 担持させることによって作製した。増幅の結果を第■表に示す。

（本頁以下余白） 第■表 ｐＢｓｃＲｃｌ／ｐＴＣ３ｇｐｔの発現４　０．０４　０゜１ １．５　０．４５　１．１　７．３　９．０２１　０．０７ ３０　０．２７　＜０．０２　＜０．０２３５”　０．８２　６．３　８゜４　 １０．９　１０．９４０　０．０５ ４１　０．０５ ５０　０．１２ ５２　０．１２ プール Ｄ　＜０．０２　＜０．０２ Ｅ　Ｏ，２７１，１ Ｐ　３．６　５．８　９．１ 本５ｃＲ１の大規模産生のためにクロ・−ン２および３５を選択した。

＋クローン３５を希釈を限定することによりサブクローニングし、各ザブクロー ンについて可溶性ＣＲＩの産生を測定【また。ｐＢｓｃＲ１ｃ／［）ＴＣ３ｇｌ ｌｔ−クローン３５．６はより高い産生体で１７．７μｇ／−５ｃＲ１を示した 。

ＭＴＸ　：メトトレキセート ｐＢｓｃＲ１ｓ／ｐＴｃｓｇｐｔからの１２の組換え体をＥＬＩＳＡにより可溶 性ＣＲＩの産生についてアッセイした。１２のすべての候補は認めつるレベルの 分泌５ｃＲ１を示した。最良の産生体は、最良のｐＢｓｃＲｃｌ／ｐＴＣ３ｇｐ ｔ　）ランスフェクタントにより産生されたものに匹敵するｓｃｌ？ルベルを生 じブこ。

ｐＢｓｃＲ１ｃ／ｐＴＣ３ｇＰｔおよびｐＢｓｃＲ１ｓ／ｐＴＣＳｇｐｔ組換え 体は可溶性ＣＲＩを同様の産生レベルで産生じた。これは可溶性ＣＲＩポリペプ チドの産生能がＣＲＩ　ｅＤＮＡ内のその切りつめた点に依存しないことを示し た。

（本頁以下余白） １１．３．２．２．二つの異なる形質発現系中の５ｃＲ１ｃの形質発現 切形ＣＲＩ　ｅＤＮＡ挿入物である５ｃＲ１ｅを発現ベクターｐ’ｒｅｓｇｐｔ 中に挿入し、上記のように発現した。また、それを１１．２．３項に記載のよう にして発現ベクターｐＢＭＴＳＸ中に挿入してｐＢＭ−ＣＲｌｃを生じた。これ ら両方の発現ベクターは、非常に強いプロモーターを有する。一つの系が分泌ポ リペプチドの一層良好な産物を生じるか否かを決定するため、可溶性ＣＲＩの発 現を両方の系中で試験した。

Ｃｌ２７Ｉｖウス細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ１．６１６、Ｒｏｅｋｖｉ　ｌ ｉｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ）を、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、Ｌ。及びｖ ａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ａ、　Ｊ、、１９７３．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２巻、 　４５６−４６７）を用いてｐＢＭ−ＣＲｌｃでトランスフェクションした。グ リセロールショック後に、細胞をｌＯ％ウシ胎児血清及び２ｍＭのし一グルタミ ンを含むＤ−ＭＨＭ培地を再度供給し、３７℃で４８時間インキュベートした。

その後、細胞をトリプシン処理し、完全Ｄ−ＭＥＭ培地＋１０μＭの塩化カドミ ウム中に１＝５及びｌ：１０の比で分割した。カドミウム耐性コロニーが１０日 以内に現われた。１０のコロニーをクローニングシリンダーの使用により取り出 した。

夫々のコロニーを、完全Ｄ−ＭＥＭ培地を含む６０ｍｍのペトリ皿に移し、細胞 が集密に達するまて３７°Ｃ１５％ＣＯｚでインキュベートした。その後、夫々 の皿に関し、細胞をトリプシン処理し、３個の６０ｍｍの皿に分けて、凍結細胞 株の調製、ＲＮＡ抽出、分泌５ＣＲＩＣの存在に関する細胞培地のＢＬＩＳＡ試 験に使用した。

夫々の集密ベトリ皿から細胞培地を取り出しＥｌ、ＩＳＡ分析にかけた時、試験 した全てのｐＢＭ−ＣＲ１ｃＲ１−ンは可溶性ＣＲＩ生産に関して陽性であった 。ｐＢＭ−ＣＲＩＣ組換え体からの分泌５ＣＲＩのレベルはｐＢｓｃＲ１ｃ／ｐ ＴＣＳｇｐｔ組換え体からの分泌量に匹敵した。これは、高レベルの分泌５ＣＲ Ｉポリペプチドを生産する能力が或種のプロモータ・−または形質発現系のみの 使用に依存性でないことを示した。

１１．３．３゜可溶性ＣＲｉコード配列を含有する哺乳類の発現ベクター、プラ スミドＩ）Ｔ−ＣＲｌｃｌＳｐＴ−ＣＲｌｃ２、ｐＴ−ＣＲＪ、ｃ３、ｐＴ−Ｃ Ｒｌｃ４、及びｐＴ−ＣＲｌｃ５の形質発現及び分析アッセイ 欠失変異体のｐＴ−ＣＲＩ　Ｃシリーズは、構成物ｐＢＳＣＲＩＣ及びｐＢｓｃ Ｒｌｓのように、膜貫通及び細胞質ドメインを失っていた。加えて、欠失変異体 はＣＲＩ　ｅＤＮＡの種々のＬＨＲ領域のかなり大きな欠失をも含んでいた（第 ２０図参照）。欠失変異体をＣＨＯＤＵＸ　Ｂｌ！細胞中で発現し、生産された 可溶性ＣＲＩポリペプチドのレベルを測定した。

夫々の欠失構成物に関し、クローンの４０の異なるブールを、可溶性ＣＲＩポリ ペプチドが生産されているか否かを測定するＥＬＩＳＡ分析のために選択した。

５つのｐＴ−ＣＲｌｃ全ての構築物はＥＬＩＳＡまたは細胞培地中の機能活性の 存在のいずれかにより測定され、５ｃＲ１を細胞培地に分泌していることがわか った。５つのｐＴ−ＣＲＩＣ構築物のうちの４つによりトランスフェクションさ れた細胞からの上清は、溶血アッセイにより測定されるように機能がある５ｃＲ １を生産していた（上記第■表及び１３．２項参照）。

第■表 １）Ｔ−ＣＲｌｃｌ　＋ ｐＴ−ＣＲ１ｅ２　＋　” １）Ｔ−ＣＲｌｃ３　＋ ｐＴ−ＣＲＩＣ４＋　測定せず ｐＴ−ＣＲｌｃ５　＋ ６　ＥＬＩＳＡまたは溶血分析に関して試験した上清はＴ７５フラスコ中または ２４ウ工ル皿中で増殖する培養物から得た。種々の量の可溶性ＣＲＩはこれらの 条件下で培養上清中に累積し得たので、示された結果は定性的である。（＋）は 、示された分析により検出される機能のある５ｃＲ１の生産を示す。

欠失変異体がまた可溶性ＣＲＩを生産し得たという事実は、５ＣＲ１を発現する 能力がＣＲＩ　ｅＤＮＡの−・っの正確な遺伝的改変に依存しないことを更に示 し、た。膜内外領域が欠失された限り、全ての構成物は可溶性ポリペプチドを生 産し得た。

１２、実施例：可溶性ＣＲＩの生産及び精製多量の５ｃＲ１を中空繊維バイオリ アクター系中で生産した。得られた５ｃＲ１の量は、接種した組換えクローンの 相対収量に比例していた。最適の精製結果のために、多量の外部から添加される ウシ胎児血清ポリペプチドの非存在下で５ｃＲ１の高い生産量を生じる血清を含 まない培地を選択した。

１２．１、可溶性ＣＲＩの大規模生産 モデルＩＶ−Ｌ中空繊維バイオリアクター（３０ｋＤ分子量カットオフ）を備え たＣｅｌｌ−Ｐｈａｒｍ、商標、細胞培養系Ｉ　（ＣＤ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎ ｃ、　Ｍｉａｍｉ　Ｌａｋｅｓ、　ＰＬ）を無菌条件下で組立てた。二種のクロ ーン（ｐＢｓｃＲ１ｃ／ｐＴＣ３ｇｐｔのクローン２及びクローン３５）を８個 のＴ−２２５フラスコで増殖させた。集密時に、細胞をトリプシン処理し、洗浄 し、ベレットにし、培地中で再懸濁した。クローン２の約５Ｘ１０”個の細胞及 びクローン３５の約１０ＸＩＯ″個の細胞を二つの別個の中空繊維バイオリアク ターに接種した。アルファーＭＥＭ＋１０％のウシ胎児血清、８ｍＭのし一グル タミン、１００μｇ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン及び適当な濃度の メトト・レキセード（クローン２に関して５０ｎＭ　；クローン３５に関して５ ００μＭ）の２０ｊ’の培養リザ・−バ〜を使用した。既混合ガス（空気中５％ Ｃ０７）を酸素添加装置によりリザーバー培地中に吹き込んでｐＨを維持した。

培地循環速度、交換速度及びガス流速を９、最大の生産を生じるように調節した 。

試料を接種口により回収し、１１０００ｒｐで１０分間遠心分離し、０ｏ２２μ Ｍの孔径のフィルターで濾過し、精製前に４℃に保った。回収容量及び頻度を、 培養の開始時に２５１ｎｌ、週３回から、２％３ケ月後に４０−１週５回に次第 に増加した。５ｃＲＸの生産をＣＲＩ　ＥＬｉＳＡによりアッセイした。接種後 の最初の１ケ月でクローン２及びクローン３５の収量は、夫々６６μｇ７日及び １０６０μｇ７日であった。これらの収量は、培養が確立されるようになるに′ つれて増加した。

１２、１．１．血清を含まない培地中の５ＣＲＩの生産２種の市販の血清を含ま ない培地を、細胞増殖及び５ＣＲＩの生産を支持するそれらの能力に関して試験 した。

ｐＢｓｃＲ１ｃ／ｐＴＣＳｇｐｔクローン３５の集密Ｔ７５フラスコを２個のＴ ７５フラスコに分けた。一つのフラスコを、１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミ ン、抗生物質、及び５００μＭのメトトレキセートで補充されたアルファＭＥＭ で培養した。別のフラスコを、アルファＭＥＭ＋Ｌ−グルタミン、抗生物質０． ５００μＭのメトトレキセートトＨＢ　ＣＨＯ増殖補足物（Ｈａｎａ　Ｂｉｏｌ ｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、　Ａｌａｍｅｄａ、　ＣＡ）中にウシ胎児血清を５％から １％、０．５％及び０％と段階的に離乳させた。２個のフラスコの細胞増殖及５ ｃＲ１生産量を比較した。血清を含まない培地中の細胞の増殖は、集密に達しな かった。５（Ｊｌ生産のレベルを第１表に示す。

夫々の場合、５ｃＲ１生産のレベルは、細胞を１０％胎仔ウシ血清中で増殖した 時に最良であった。比較のために、血清を含まない培地中で１４日自回見られた レベルは、１０％胎仔ウシ血清で補足した培地の場合４．２ＸＩＯ”個のｇｈｏ ｓｔｓ／−に比べて、１．４Ｘ１０”個のｇｈｏｓｔｓ／ｍＡであった。

第１表 １０％ウシ胎児血清を含む培地に対し、ＣＨＯ増殖補足物で補足された血清を含 まない培地中の５ＣＲＩ生産９本１０１０個のｇｈｏｓｔｓ／−として表わされ る組換え体中の細胞増殖及び５ｃＲ１生産を、血清を含まない培地の第二の源（ ＣＨＯ−１，Ｖｅｎｔｒｅｘ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ、　Ｐｏｒｔｌ ａｎｄ　ＭＥ）を用いて試験した。血清で増殖された細胞をこの培地中に離乳さ せることは必要でなかったので、細胞を解凍し血清を含まない培地中で直接培養 した。この培地は、ＤＭＥ−Ｆ１２ベース及び増殖添加剤からなる。同数の細胞 を解凍し、２４ウエルブレー１・の別個のウェル中に接種した。細胞か付着し、 た後、培地を廃棄し、ｌＯ％ウシ胎児血清を含む培地または血清を含まない培地 を適当なウェルに添加した。夫々の条件を重複して行なった。先に試験した血清 を含まない培地と異なって、ＣＨＯ−１、即ちＶｅｎｔｒｅｘ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ培地は、胎仔ウシ血清を含む培地の場合ど同様の量の増殖細胞を生じ た。

１２、ｉ、２．結　論 上記の結果は、５ｃＲ１を生産するＣＨＯ細胞が特定の血清を含まない培地中で 維持し得ることを示した。これは、大規模な生産実験のための培地のコストの節 減をもたらした。更に別の利点は、細胞培養上清からの５ＣＲＩの精製が簡素化 されることであった。何となれば、胎仔ウシ血清タンパク質を除去する必要がな かったからである。

１２．２．可溶性ＣＲＩの精製 特異的な抗−ＣＲＩ抗体の出現により、精製ＣＲＩを生産するのに必要とされる 多くのクロマトグラフィ一工程を、簡素化された二工程操作で置換することが可 能になった。これは、得ることができるＣＲＩタンパク質の収量を５．９Ｘ１０ ”個の赤血球当り約１〜５ｍｇのＣＲＩに増加したＷｏｎｇ、　Ｗ、Ｗ、ら、　 １９８５．　Ｊ、ｉｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ　８２：　３０３−３１３）　 。しかしながら、叩告された精製は膜に結合形態のＣＲＩであったので、界面活 性剤中でＣＲＩを含む物質を可溶化することが常に必要であった。

組換えトランスフェクタントにより生産された可溶性ＣＲ１は、精製用の界面活 性剤で可溶化される必要はない。それは既に可溶性である。可溶性ＣＲＩは抗Ｃ ＲＩ抗体クロマトグラフィ・−（下記参照）により精製し得るが、この操作はそ れ自体を大規模生産に容易にしない。スケールアップの程度は、抗体精製カラム の抗体マ■・リックスを調製するために得ることができる抗ＣＲＩ抗体の量によ り制限される。加えて、ＣＲＩに対するｙｚ−ｉの如き抗体の高い結合親和性は 、かなり苛酷な条件、例えばｐＨ１２，２が結合された５ＣＲ１生産物を抗体マ トリックスから除去するために使用される必要があることを意味するＷｏｎｇ、 　Ｗ、Ｗ、、　１９８５．　Ｊ、ｂｎｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ８２　：　３ ０３−３１３）。

非常に多量の可溶性ＣＲＩを精製する能力を育するために、ＨＰＬＣカラムを伴 なう精製操作が開発された。これらのＨＰＬＣカラムは、更に多量の精製された 可溶性ＣＲＩを生産するために容易にスケールアップし得る。

加えて、それらは５ｃＲ１の溶離及び回収のために苛酷な条件を必要としない。

１２．２゜１．抗体アフィニティ力ラム精製１２．２．１．１．方　法 ５ｃＲ１の抗体アフィニティ精製に関し、モノクローナル抗体ＹＺ−１１００■ を、製造業者の指示に従って、ＡｆｆｉＧｅｌ−１０ＢｉｏＲａｄ、　Ｒｉｃｈ ｍｏｎｄ、　ＣＡ）７ｍｇに共有結合した。

細胞培養からのＣＲＩを含む上清を、揺動するフラスコ中で固定化ＹＺ−１と共 に４℃で一夜インキユベードした。

その物質をガラスカラムに注入し、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、　０．１ＭのＮａＣ １，ｐ１７で徹底的に洗浄した。５ｃＲ１を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、０ ．７ＭのＮａＣ１、ｐＨ１２を用いて溶離したＹｏｏｎ、　Ｓ、Ｈ，及びＦｅａ ｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、　１９８５．　Ｊ、ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３４゜３３３２ −３３３８）。溶離した画分を、Ｂｉｏｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ−アッセイ（Ｂ ｉｏｒａｄ　Ｒｉｅｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）を用いてタンパク質の存在に関して試 験した。タンパク質を含む試料を直に溜め、０．１ＭのＨｅｐｅｓ　ｐＨ７中で ４°Ｃで一夜透析した（２×１！り。その後、試料をＰＢＳ中で透析した。５Ｃ ＲＩの存在をＣＲＩ　ＥＬＩＳＡにより分析した。

１２．２．１．２．結　果 トランスフエクタントｐＢｓｃＲ１ｃ／ｌ）ＴＣ３ｇｐｔクローン２により生産 された５ｃＲ１を含む細胞培養上清を、抗ＣＲＩ抗体アフィニティカラムに装填 し、ピーク５ｃＲ１画分を溜めた。この精製物質の一部分を４〜２０％５ＤＳ− ＰＡＧＥゲルにかけたＤＡＩＩＣＨＩ　Ｉｎｃ、　；ポリアクリルアミドゲル； Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｕ、に、の改変操作、１９７０．　Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６ ８０−６８５）。

還元条件下で、可溶性ＣＲＩの見掛分子量は約２２４．０００ダルトンであった （第２４図）。また、この精製ＣＲＩは、補体媒介溶血並びにＣ５ａ及びＣ３ａ 生産を抑制するその能力により活性であることが示された（下記の１３項）。

１２．２．２．　ＨＰＬＣによるＣＲＩ精製１２．２．２．１．方　法 １２゜２．２゜１．１．出発物質 培養物をバイオリアクター中で最初に定着させた場合、５ｃＲ１生産のレベルは 、培養物が数カ月間増殖していた場合よりも少なかった。一般に、バイオリアク ター中の細胞が集密に達し、最大量の５ｃＲ１を生産するまでに、数週間の期間 があった。少量の５ｃＲ１を含む細胞培養上清を、精製の前に硫酸アンモニウム 沈澱または限夕）濾過により濃縮できた。６０〜８０９６の飽和の範囲にわたる 上清の硫酸アンモニウム分別は、実質的に等しい収量で５ｃＲｊ、を沈澱させた 。沈澱を最小容量に溶解し、陽イオン交換ＨＰＬＣのために出発緩衝液中で透析 した。

またＣＨＯ細胞培養上清は、限外濾過により濃縮でき、陽イオン交換クロマトグ ラフィーのために出発緩衝液中に透析できた。

バイオリアクターが一層高い濃度の可溶性ＣＲＩを生産するにつれて、これらの 培養物からのＣ１（０細胞培養上清は、陽イオン交換クロマトグラフィーのため に出発緩衝液中に直接に透析できた。

１２、２．２．　Ｉ。２．陽イオン交換ＨＰＬＣ操作試料を出発緩衝液（０，０ ２Ｍのリン酸ナトリウム、０．０６Ｎの塩化ナトリウム、ｐＨ７，０）中に透析 し、続いて、０゜２μｍのフィルターで濾過して粒状物を除去した。その後、試 料を陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーカラム（１０ｃｍ　Ｘ　１０ｍｍ 、　Ｒａ１ｎｉｎからのＨｙｄｒｏｐｏｒｅ−３ＣＸ　ＨＰＬＣカラム）に装填 した。カラムを洗浄し、塩化ナトリウム勾配で溶離し、０．０２Ｍのリン酸塩、 ０．５ＮのＮａＣ１、ｐＨ７，０を用いて溶離した。５ｃＲ１は０．０６Ｎ　〜 ０．２５ＮのＮａＣ１のどこかで溶出した。溶離を、２８０ｎｍに於ける吸光度 及びＥＬＩＳＡにより監視した。

１２、２．２．１．３．陰イオン交換ＨＰＬＣ操作所望により、陽イオンＨＰＬ Ｃ精製５ｃＲ１の更に精製が、陰イオンＨＰＬＣにより得ることができた。陰イ オン）ＩＰＬＣからのピーク画分を、陰イオンＨＰＬＣのために出発緩衝液中に 透析した。試料を装填し、カラム（ＲａｉｎｉｎからのＨｙｄｒｏｐｏｒｏ−Ａ Ｘ）を０．０１Ｍのリン酸塩液ｐＨ７，５中で洗浄し、た。カラムを一連の工程 及びグラジェントにかけ０．０１Ｍのリン酸塩、０．５ＮのＮａＣｌ５ｐ８７． ５を用いて溶離した。５ｃＲ１は０．ＯＮ〜０．３ＮのＮａＣ１のどこかで溶出 した。

溶離は、陽イオン交換ＨＰＬＣに関して前記したようにして監視した。陽イオン ＨＰＬＣカラム緩衝液及び陰イオン１（ＰＬＣカラム緩衝液の濃度及び［）Ｈは 、例示にすぎない。

その他の緩衝液濃度、塩の条件、またはｐＨ条件がまた゛　可能である。

１２．２．２．１．４゜ウェスタンプロット分析Ｔｏｗｂｉｎ、Ｈ，ら、１９７ ９．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

７６、４３５０−４３５４からの改変操作を用いて、ウェスタンブロッティング を行なった。簡単に云えば、精製５ｃＲ１を４〜２０％の５ＤＳ−ＰＡＧＥで処 理し、ニトロセルロースに移し、抗ＣＲＩ（７ウスｍＡｂ　ＹＺ−１またはＪ３ Ｄ３）で詳細に探査し、アルカリホスファターゼと接合したヤギ抗マウス抗体で 検出した。

１２．２．２．２．結　果 典型的な実験に関して、バイオリアクター培養からの上清５０〜１００−を出発 緩衝液中に透析し、１０ａｎＸ１０−の陽イオン交換）（ＰＬＣに装填した。ピ ーク画分をＥＬＩＳＡ及び２８０ｎｍに於ける吸光度により測定し、溜めた。プ ールのタンパク質濃度を、２８０ｎｍに於ける吸光度により測定した（ＣＲ１ｃ アミノ酸組成から概算して、２８０ｎｍにおけるε（１％）＝１０）。数十■を 、増幅培養上清１００ｍ１から精製した。

一例として、トランスフエクタントｐＢｓｃＲ１ｃ／ｐＴｃｓｇｌ）ｔクローン ２からの培養上清液１００ｒｎｌは、陽イオンｔ（ＰＬＣにより精製した場合、 ２８０ｎｍに於ける吸光度により測定されるように、精製５ｃＲ１２２ｍｇを生 産した（第２４図）。ＣＲＩ　ＥＬＩＳＡにより監視した場合、収率は２０２％ であると計算され、その他１３％が貫通画分またはカラム洗浄画分中にあった。

１００％より大きい収率は、おそら＜ＢＩ、１８人中のマトリックス作用を反映 している。

培養上清をバイオリアクター・から抜き取ることができる速度が与えられたとす ると、１基のパイオリアククー当り１週間で約１００ｍｇの精製した可溶性ＣＲ Ｉを生産することは、この水準のメトトレギセ・−ト増幅で可能であるべきであ る。このレベルの生産をスケールアップし得る幾つかの方法は、バイすりアクタ −に接種する前に出発培養物をメトトレキセー　トで最大限に増幅すること、生 産時のバイオリアクターの数をいずれか一度に増加すること、及び大容量のＨＰ ＬＣカラムを使用することを含む。

１２、２．２．３．精製した可溶性ＣＲＩの特性決定陽イオンＨＰＬＣからの５ ｃＲ１を含むピーク画分（第２４図）を、陰イオンＨＰＬＣで更に精製した。種 々の工程に於ける５ｃＲ１物質の純度を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより試験した（第２ ５図）。

これらの重度に装填されたゲル中に見られる一層小さいバンドは、抗ＣＲＩモノ クローナル抗体ＹＺＩまたはＪ３Ｄ３を用いるウェスタンプロット分析により測 定されるように、ｓＣＲ１のフラグメントを代表する。フラグメント５ｃＲ１バ ンドは、殆どの調製物中に見られなかった。

精製５ｃＲ１の機能的活性を、０．２５　ｔｔ　ｇ／ｒｄの精製５ＣＲＩ濃度で 主経路補体媒介溶血を５０％抑制するその能力により試験した。また、精製した 可溶性ＣＲＩは５μｇ／−で主経路補体Ｃ５ａ生産を５０％抑制でき、１３ｕｇ ／ｄでＣ３ａ生産を５０％抑制できた（下記、１３項参照）。

１２．２．２．４．結　論 上記のように、我々は、治療用途に必要とされる５ＣＲ１の量を生産するために 容易にスケールアップし得る可溶性ＣＲＩの精製の改良方法を開発し７た。この 操作の基本要素は、既に可溶性であり、それにより、膜に結合されたＣＲＩを界 面活性剤で可溶化するという必要をなくす出発物質を含んでいた。バイオリアク ター培養物中のウシ胎児血清濃度の減少及び／またはこれらの培養物中の代替培 地の使用は、その後の精製中に高濃度の外来タンパク質を、５ｃＲ１を含む出発 物質から除去する必要をなくした。更に、精製のためのＨＰＬＣ操作の開発は、 大規模な精製方法を提供した。陽イオンＨＰＬＣまたは陽イオンＨＰＬＣとその 後の陰イオン交換ＨＰＬＣとの組合せが、精製に使用し得る。高収率の実質的に 純粋な可溶性ＣＲＩを、この操作により１工程または２工程のみで得ることがで きる。

１３、実施例：可溶性ＣＲ１のインビトロ活性の実証１３、１．好中球酸化的バ ーストの抑制心筋梗塞中に受ける組織損傷の再潅流（ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ） 損傷モデルに於いて、活性補体成分は好中球の癒着及び活性化を誘発する。活性 好中球は、非常に毒性の酸素ラジカルを生じる酸化的バーストを受ける。これら 及びその他の潜在的な毒素は、好中球の顆粒消失中に放出され、周囲の組織を損 傷する。可溶性ＣＲＩは１、Ｃ３ａ及びＣ５ａ　、即ち好中球活性化に関与する 補体・成分の発生を防止することにより損傷組織の領域を減少し得る。

インビトロで補体活性化中のＣ５ａの発生を阻止する可溶性ＣＲ１の能力を監視 するため、Ｃ５ａ誘発の酸素バーストに好中球により生じられる酸素ラジカルの 発生を定量化し得るバイオアッセイを使用したＢａ５ｓ、　Ｄ、Ａ。

ら、　１９８３．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３０．１９１０−ｉ９１７）。こ の分析は、ジクロロフルオレセイン　ジアセテート（ＤＣＦＤＡ）を使用し、こ れは細胞に入って閉じ込められ、酸化の際に非常に螢光性になることができる脂 質可溶性の分子である。

１３．１゜１．材料及び方法 １３．１゜■。１．材　料 新しい全血、ヒト補体源（Ｂｅｔｈ　ｌ５ｒａｅＪ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ。

Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）、乾燥パン酵母、０．１％のゼラチ〉・及び５ｍＭのグ ルコースを含むＰＢＳ　、　１００ｍＭのＥＤＴＡＳＨＢＳＳ（Ｋｏｄａｋ社） 中の１０ｍＭのＤＣＦＤＡ、赤血球（ＲＢＣ）を溶解する緩衝液（Ｏｒｔｈｏ　 Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、精製Ｃ５ａ（Ｓｉｇｍａ、　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、 、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）　、及び可溶性ＣＲＩを使用した。

ｉｓ、　ｉ、　ｉ。２．好中球の調製 好中球をＢａ５ｓにより記載されたように調製した（１９８３、　Ｊ、Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、　１３０．１９１０〜１９１７）　ｏ全血ＺＯｍｔ’をＰＢＳ−ゼラチ ン−グルコース中で３回洗浄し、ＨＢＳＳ中のｌ。

ＩＭのＤＣＦＤＡ　５ｍ１ｊ＋ＰＢＳ−ゼラチン−グルコース５ｉ中で再懸濁し 、３７℃で１５分間インキュベー）−した。その後、細胞を遠心分離し、ＰＢＳ −ゼラチン−グルコース＋５ｍＭのＥＤＴＡ　２．０ｒｌＬｌ中で再懸濁した。

］、３．１．１゜３．酵母粒子の調製 乾燥パン酵母を水中で再懸濁し、２回洗浄Ｉ７・、３０分間沸騰させた。粒子を 水中で２回再洗浄し、水中で０．５ｇ／ｒｎｌで再懸濁した（上記のＳｉｍｐｓ ｏｎ、　Ｉ’！。ら）。

１３、１．１．４．精製Ｃ５ａによる好中球の活性化ＤＣＦＤＡを含んだ細胞１ ００μ！を、ＲＢＣを溶解する緩衝液で処理し、ＰＢＳ−ゼラチン−グルコース −ＥＤＴＡ中で１回洗浄し、ＰＢＳ−ゼラチン−グルコース１．〇−中で再懸濁 した。２００ｎｇ／ｍｊの精製Ｃ５ａまたは対照５０μｌを標的細胞０．５−に ３７°Ｃで添加し、種々の時間間隔でフロートサイトメトリーで分析した。

１３、１．１．５．　ヒトの血清または血漿における純化されたＣ５ａによる好 中球の活性化 ＤＣＦＤＡ−負荷した細胞１００μｌをヒト血清またはへパリニア化した血漿（ １１００ｎ／ｍｌ）または対照で１：Ｉに希釈したＣ５ａの５０μβ中で、３７ ℃、３０分間インキュベートした。ＲＢＣ’　ｓを溶解させ、そして好中球をフ ロー血球計算器で分析した。

１３、１．１．６．酵母粒子で活性化したヒトの血清または血漿による好中球の 活性化 新しい凍結血清及び血漿４２５μ！＋５ｃＲ１または対照５０μｌを、酵母粒子 ２５μ！と共に３７℃で３０分間インキュベートした。その後、補体活性化試料 及び対照試料を、遠心分離して酵母粒子を除去した。これらの試料の夫々の１０ 回の２倍希釈をＰＢＳ−ゼラチン−グルコース−ＥＤＴＡ中で行なった。対照並 びに活性化された血清及び血漿の夫々の連続希釈液５０μｌを、ＤＣＦＤＡを含 んだ標的細胞５０μｌに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後 、ＲＢＣを溶解して除き、好中球をフローサイトメトリーにより分析した。

１３゜１．２．結　果 １３．１．２．１．　Ｃ５ａはＤＣＦＤＡを用いて測定し得るヒト好中球中の酸 素バーストを誘発する 第２６図は、精製Ｃ５ａによる刺激後のヒト好中球の螢光強度の急速な増加を示 す。Ｃ５ａ　（２０ｎｇ／Ｔｄ！最終濃度）の添加の４分以内に、好中球は対照 のＤＣＦＤＡを含んだ好中球よりも１０倍明石かった。２０分までに、好中球は 対照の２０倍明石かった。この分析は、Ｃ５ａの感度のよい指標であるように思 われる。

１３、１．２．２．　ヒト血清は、好中球に及ぼす精製Ｃ５ａの酸素バースト作 用を阻止する ＤＣＦＤＡが含まれ、ヒト血清中で希釈された精製Ｃ５ａど共にインキュベート された好中球では、螢光強度の増加が観察されなかった。この作用は、凝固中に 血小板から放出される血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）によるものであり得る。

少量のＰＤＧＦはＣ５ａ誘発の好中球活性化を抑制し得ることが示されていた（ Ｗｉｌｓｏｎ、　Ｅ、ら、１９８７、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：　２２１３−２２１７）。

１３゜１．２．３．ヘパリン化血漿は好中球に及ぼすＣ５ａの作用を阻止しない ヘパリン化血漿中で１＝１に希釈されたＣ５ａは、ＤＣＦＤＡを含んだ好中球中 に酸素バーストを誘発した。緩衝液中のＣ５ａはど著しくないが、好中球と共に ３０分間インキュベートした後、螢光強度の１０倍の増加があった。シグナル低 下は、瀉血または血漿分離中のＰＤＧＦ放出により生じ得る。血液の細胞成分か らの血漿の一層穏やかで迅速な単位は、ＰＤＧＦの放出を最小にし、一層良好な Ｃ５ａ機能を生じ得る。

１３、１．２．４．補体活性化中に存在する５ｃＲ１はＣ５ａ発生を阻止する 可溶性ＣＲＹの存在下のヒト補体のザイモサン誘発活性化は、ＤＣＦＤＡ分析に より測定されるようにＣ５ａ活性の低下を示した。第２７図に見られるように、 ５ｃＲ１の存在下で活性化されたヒト血漿の１：１６希釈物は、５ｃＲ１か存在 しないで活性化されたｌ：１６希釈血漿に較べて好中球中で７０％少ない螢光強 度の増加を生じた。これは５ｃＲ１によるＣ５ａ発生の抑制を意味する。ＤＣＦ ＤＡアッセイ及び血漿収集の更に最適化は、可溶性ＣＲＩ活性の一層動的で、し かも感度の良い分析をもたらす。

１３、２．補体媒介溶血の抑制 御３．２．１．方　法 補体を阻害する能力を、補体媒介赤血球溶解（溶血）の阻害に関して分析するこ とにより試験した。溶血の阻害を、可溶性ＣＲＩ　１ｍ度の関数として測定した 。試験すべき５ｃＲ１試料を０゜ＩＭのヘペス緩衝液（０，１５Ｎ　ＮａＣ１， ｐＨ７，４）中で希釈し、５０μ！をＶ字形の底部のマイクロタイタープレート の夫々のウェルに代表的には三通りずつで添加した。補体源として使用したヒト 血清をヘベス緩衝液中で１−１２５倍に希釈し、５０μｌを夫々のウェルに添加 した。次に、抗ヒツジ抗体を含む市販のヒツジ赤血球（Ｄｉａｍｅｄｉｘカタロ グ番号７８９−００２）を、入手したまま使用し、１００μｌ／ウエルで添加し 、溶血に至る補体経路を開始させた。プレ・−トを３７℃で６０分間インキュベ ートし、続いて、５００Ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を取り出し、平底の マイクロタイタープレートに入れた。溶血の程度を、４１０ｎｍに於ける試料の 吸光度の関数として測定した。最大吸光度（最高の溶血に相当する）　Ａｍａｘ を、ヒトの血清のみを含有する赤血球試料の吸光度Ａｓ−赤血球のみを含有する 試料の吸光度Ａｏから得た。したがってＡｍａｘ＝Ａｓ−Ａｏ。ヒト血清゛　及 び５ＣＲＩの両方を含む赤血球試料の吸光度と１．５ｃＲ１のみを含む細胞試料 の吸光度との差をＡ試料と定義した。

阻害、ＩＨを分数（Ａｍａｘ−Ａ試料／Ａｍａｘ）として表わし、。

ＩＨ，。を［Ｈ＝１／２の値を生じるのに必要とされる５ＣＲＩの濃度として定 義した。クロマトグラフィー画分を監視するため、無血清対照を包含させず、抗 補体活性を試料の４１０ｎｍに於ける吸光度の減少として定性的に監視した。

また、上記の溶血アッセイを使用して、モルモット及びラットの如きその他の種 からの補体によるヒツジ赤血球溶解を阻害するヒト組換え体５ｃＲ１の能力を評 価した。夫々の種に関して、新しい凍結血清または新たに凍結乾燥した血清もし くは血漿を、補体源として使用した。成る場合には、血清を商業的に入手した（ ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ） 。

まず、血清を、活性化赤血球を溶解するその能力に関して滴定した。最高の赤血 球溶解の少なくとも８０％を生じる最大希釈度を、添加ヒト５ｃＲ１の作用を評 価するのに選んだ。その後、ヒト血清を動物血清に代え、好ましい希釈度で、ア ッセイを上記のように行なった。

１３．２．２．結　果 第２８図に示されるように、精製５ＣＲｉは０．１２ｕ　ｇ／ｍｌの５ｃＲ１濃 度で主経路補体媒介溶血を５０％阻害した。溶血アッセイを阻害する抗体アフィ ニティ精製５ｃＲ１の能力を、未精製物質（ｓｃＲｌを含む細胞培養上清）の能 力と比較した。精製５ｃＲ１は、未精製ｓＣＲｌの活性に匹敵する活性を有し、 両者はＬ６Ｘ１０ゞ個のｇｈｏｓｔ／ｍｌで溶血アッセイで５０％の阻害を生じ た。これは、精製操作が最終的５ｃＲ１生産物の機能的活性を実質的に低下させ ていないことを示した。

精製５ｃＲ１が凍結して貯蔵し得るかを調べるために、一部分を一７０°Ｃで１ 週間貯蔵した。凍結５ｃＲ１の濃度は、２８０ｎｍに於ける吸光度及びＣＲＩ　 ＥＬＩＳＡにより測定されるように、凍結しなかった５ｃＲ１と同じであった。

また、凍結５ｃＲ１は、溶血の阻害により測定されるように、凍結しなかった５ ＣＲＩと同じ活性を有していた。

幾つかの種からの補体により媒介される溶血を阻害するヒト組換え体５ｃＲ１の 能力を第■表に要約する。

（本頁以下余白） 第■表 種々の動物血清からの補体を用いて感作したヒツジＲＢＣの溶血 使用した血清　５ｃＲ１に　抑制（ＩＨ）”　ＩＨＲ０９″動物　の最終濃度　 よる抑制　（ｇｈｏｓｔ／ｒｎＩ）　（ｇｈｏｓルラ０−モルモット　”　１： ５００　有　６６％（２，６Ｘ１０”）　１．ＯＸＩＯ”ｔト１：５００　有　 ９４％（２，５Ｘ１０リ　２゜ＯＸＩＯ”ヒト　１：３１２　有　９４％（１， ２Ｘ１０’）　１．ＯＸｌＯ７ラブト　１：２００　有　８５％（２，６Ｘ１０ ’）　２．４　ＸＩＯ’ラフト　１：２００　有　７７％（３，８Ｘ１０リ　１ ．ＯＸＩＯ’イヌ　１：５０　無 ウサギ　”　１：２０　無 マウス　＄　１：５　無 本商業的に得られた凍結乾燥血清（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｒｎｉｃａｌＣｏ、、　 Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）本本明細書（１３，２項）中に定義される。

モル゛モット補体及びラット補体の両方は、ヒト５ＣＲＩにより阻害されること が明らかであった。その他の種に関して明らかな阻害の欠如は、（ａ）アッセイ 系中にウサギ抗体及びヒツジ赤血球を使用することの不適なこと、または（′ｂ ）この系中における高濃度の血清が溶血に必要とされることを反映しているもの かも知れない。

１３．３．　Ｃ３ａ及びＣ５ａの産生の阻害１３．３．１．方　法 補体を阻害する能力を、Ｃ３ａ及びＣ５ａ産生の特異的な阻害に関してアッセイ することにより、また試験した。全ての実験に関して、補体の源として使用すべ き単一のヒト血清プールを、一部分ずつ分け、−７０℃で凍結して貯蔵した。ヒ トＩｇＧを熱凝集させ、一部分ずつ分け、−７０℃で凍結して貯蔵した。夫々の 実験に関し、血清一部分を、試験すべき５ｃＲ１の濃度を変えて３７゛Ｃで平衡 化した。補体経路を、凝集したヒトＩｇＧの添加により開始させた。ＩｇＧを含 有しない対照試料を常に包含させた。１５分の一定の反応時間（早期の経時検討 で、Ｃ５ａまたはＣ３ａの生産がほぼ完結される、即ち９０％以上完結する都合 のよい時間間隔を得るために決定されていた）の後に、放出された補体ペプチド （Ｃ５ａまたはＣ３ａ）のレベルを、改変操作で市販の放射性免疫測定（ＲＩＡ と称する）キット（Ｃ５ａ　ＲＩＡ、　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）カタログ番号ＲＰ Ａ、５２０；　Ｃ３ａ　ＲＩＡ、　（Ａｍｅｒｓｈａｎ＋）カタログ番号ＲＰＡ 、　５１８）を用いる放射性免疫測定法により測定した。

競合免疫測定法を使用したので、補体ペプチド（Ｃ５ａ及びＣ３ａ）濃度は、計 数と逆に変化した。試料に関する結合数（ＣＢ）は、ペレット中で測定された全 計数（１分当りの計数、ｃｐｍ）として定義された。

第２９図中のｙ軸は、フラクション阻害を表わす。フラクション阻害は、（“Ｉ ｇＧを含まない対照”に関する’　ＣＢ−“５ｃＲ１を含まない試料”中のＣＢ ）で割った（“試料′に関する結合数（ＣＢ）−“５ｃＲ１を含む試料中のＣＢ ）に等し７い。

■３゜３．２．結　果 精Ｅ！５ｃＲ１の活性を、活性化ヒト血清試料中でＣ５ａ及びＣ３ａの生産を阻 害するその能力を試験するごとによりアッセイした。

第２９図により示されるように、試験条件下で、精製ＳＣＩ？ｉはＣ５ａ生産を １００％、Ｃ３ａ生産を６０％、最大に阻害し７、得た。５０％の阻害は、Ｃ５ ａ生産に関して５μｇ／ｍｅ、そしてＣ３ａの生産に関して１５〜２０μｇ／− の５ｃＲ１濃度で観察された。これらのデータは、組換え５ｃＲＩが０３コンバ ーターゼよりもＣ５コンバーターゼを有効に阻害することを示唆する。

１４、実施例：可溶性ＣＲＩの機能的なインビボの治療活性の実証 １４、１．可溶性ＣＲＩは逆受身アルチュス反応にインビボ作用を示す アルチュス反応は、抗原を局所注射し、その抗原が次に循環中に抗体と反応する ことにより引き起こされる古典的な免疫誘導炎症応答である。主要な生物応答は 、免疫複合体沈着、補体結合、多形核（ＰＭＮ）白血球浸潤、リソシーム酵素の 放出、血管活性アミン、及び局所の組織損傷により特徴づけられる（Ｕｒｉｕｈ ｕｒａ、　Ｔ。

及びＭｏｖａｔ、　Ｈ，Ｚ、、　１９６６、　Ｅｘｐ、Ｍｏ１．Ｐａｔｈｏｌ、 　５　：　５３９−５５８；　Ｃｏｅｈｒａｎｅ、　Ｃ，Ｇ。、　１９６８．　 Ａｄｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　９　：　９７−１６２）。

直接アルチコス反応の改変、即ち逆受身アルサス反応（ＲＰＡＲ）は、抗炎症薬 を同定するためのモデルとして使用されている（Ｐｆ）ｕｎ、　Ｌ、Ｒ，及びＧ ｒａｅｍ、　Ｍ、Ｌ、、　１９７９゜Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｃ！Ａｃｔｉｏｎｓ、 　９．１８４−１８９）。ＲＰＡＲでは、抗体が局所注射され、抗原が循環中に 存在する。

ラットＲＰＡＲモデル中で試験した場合、可溶性ＣＲ１，ｓは局所炎症反応を阻 止できた。インビボのこの可溶性ＣＲ１機能の作用機構は、補体経路酵素の阻害 により媒介されている。

１４．１１．材料及び方法 体重約１００−１２５ｇの生後５週の雌のＳｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙラット （ＣＤ株ＸＣｔ１ａｒｌｅｓ　ＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｗｉｌ ｍｉｎｇｔｏｎ、　ＭＡ）を、０．１〜Ｏ，ＷのＡｖｅｒｔｉｎ溶液の腹腔内注 射により麻酔した。この溶液は、ｌ５ｍ１のアメルＡｍｅ　ｌエタノール中の１ ｇのトリブロモエタノールでつくられた貯蔵液の１：２希釈物であった。動物の 背中の毛皮を剃った。次に、尾部を、まず温水で、次にヒートランプで温めた。

１ｍｌの注射器を用いて、０．１５Ｍのリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の５■ ／　ｍｌの卵アルブミン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　Ｃｏｒｐ　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇ ｏ、　ＣＡ）　０．３５−を尾部静脈１尾部の先端から約２５〜５．１　ａｎ　 （１〜２インチ）の位置に静脈内注射した。５分後、ラット・を、４■／ｍｊ’ の抗体力価を有する抗−卵アルブミン抗体の２０■／−のウサギｒｇ画分（Ｏｒ ｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ　Ｃｏｒｐ、　Ｃａｐｐｅｌ　Ｄｉｖｉ−ｓｉｏｎ 、　Ｗｅｓｔ　Ｃｈｅｓｔｅｒ、　ＰＡ）　０．０８−または２０ｍｇ／ｍｌの ウサギＩｇＧ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｃａｌ　Ｃｏ、、　ＳＴ、Ｌｏｕｉｓ、 　ＭＤ）　０００８Ｔｄ！、またはＰＢＳで皮肉注射した。夫々の注射を二通り ずつ行ない、注射付近の領域をマーカーペンで円形に印した。その後、ラットを １時間後、４時間後、１８時間後に監視した。２４時間後にラットをドライアイ ス中に３分間性めることにより死亡させた。皮膚試料を注射部位から切開した。

二通り試料の一つを、パラフィン包埋のために１０％のホルマリン中で固定し、 別の試料をクリオスラット切片用に凍結した。組織部分を調製し、ヘマトキシリ ンおよびエオシンで染色した。

１４、１．２．結　果 弱いＲＰＡＲ反応（例えば、浮腫及び紅斑）が抗−卵アルブミン抗体の皮肉注射 の３〜５時間後に目視できるようになり始めた。反応の大きさが２４時間後に直 径３〜５ｍｍに達するまで、反応の強さが次第に増大した（第３０ｂ図を）。非 免疫ウサギＩｇＧまたはＰＢＳのみを注射した夜分のラットの皮膚では反応は観 察されなかった。

病変の部位から調製された組織切片の顕微鏡検査のもとで、多くの急性炎症細胞 が、特に血管付近の皮膚炎及び脈管周囲炎として識別される。その組織は、血管 外部のＰＭＮの広範囲に及ぶ浸潤、結合組織中の赤血球の存在、及びコラーゲン 繊維の弛緩を伴なう典型的な炎症症状を示した。

１４、１．３．可溶性ＣＲＩの皮肉投与の作用０．７５■／ｍｌの５ＣＲＩ　４ ０μｌを等容量の抗−卵アルブミンまたは正常なウサギＩｇＧまたはＰＢＳと組 合せることにより、精製５ｃＲ１の混合物を調製した。５ＣＲＩ　：抗−卵アル ブミン混合物または５ｃＲ１：ウサギＩｇＧ混合物、または５ｃＲ１：　ＰＢＳ 混合物を、卵アルブミンで静脈内に感作されたラットに皮肉注射した。わずかに 目視できる病変が、５ＣＲＩ＋抗−卵アルブミン抗体を受けた注射部位中に現わ れた（第３０ａ図）。予測されるように、病変は５ｃＲ１：ウサギＩｇＧまたは ５ｃＲ１：　ＰＢＳを受けた注射部位中に現われなかった。５ＣＲＩ　：抗−卵 アルブミン注射部位の周囲の組織の部分を顕微鏡で調べたところ、ＰＭＮ及び単 核細胞のクラスターが細静脈の周囲に見られたが、ＰＭＮの広範囲に及ぶ浸潤ま たは赤血球の濡出はなかった（第３１ａ図）。これらのデータは、可溶性ＣＲＩ の投与が内皮細胞の損傷の抑制及び炎症反応の抑制を生じたことを示す。

上記の卵アルブミンラットモデル中のＲＰＡＲを阻止するのに必要とされる５ｃ Ｒ１の最小有効量を測定するために、０．７５ｍｇ／ｒｎｌｓｃＲ１原液の１０ 倍の連続希釈液（希釈なし、１／１０．１／１００．　ｘ／ｌ：ｏｏｏ及び１／ １０．０００）を試験した。

夫々の５ｃＲ１希釈物を、等容量の生のままニートまたは各希釈抗−卵アルブミ ン抗体と混合した。夫々の部位に合計８０μｌを注射した。、　ＲＰＡＲを阻害 する５ＣＲＩの能力は用量依存性であり、浮腫の有効な減少が部位当り３００ｎ ｇで観察された（第Ｘ表）。

第Ｘ表 ０．００３　＋＋＋＋ Ｑ　＋十＋十 １４、２．インビボに投与された５ＣＲＩの薬物速度論インビボの５ｃＲ１の生 物学半減期を、以下のように測定した。同様の齢（６週）及び体重（１１０〜１ ２５ｇ）のラットに、０．３５ｍ１中２５０μｇの５ｃＲ１を静脈内注射した。

注射後、２分、５分、１０分、６０分及び２４時間で、ラットを犠牲にし、大静 脈孔から血液を得た。夫々のラットからの血清！−２Ｔｄ！を、１８００ｒｐｍ で１０分間の遠心分離により得、夫々の試料中の５ＣＲＩＯ量をＣＲＩ　ＥＬＩ ＳＡにより測定した。対照のラット血清またはヘモグロビンを含まない赤血球ｇ ｈｏｓｉ（Ｊ、、　６　Ｘ　１０”個のｇｔｌｏｓｔ　／ｄ）の界面活性剤溶解 産物中に加えられた精製、Ｃ１？１１μｇ７・′−の２倍希釈液を、ＣＲＩ標準 物質として使用した。

結果を第ＸＩ表に示す。

第ＸＩ表 注射５ｃＲ１の血清濃度の経時的な薬物速度論データ静脈内注射　ｓＣＲＩ濃度 後の時間　（μｇ／ｍｔ’） 対照　０．０１ ２分　０．１７ ５分　０．８０ １０分　ｌ。０１ ６０分　０．３８ ２４時間　０．４９ これらのデータは、５ｃＲ１が静脈内注射の２４時間後に検出し得ることを示す 。２４時間の時点で、血清中の５ｃＲ１のレベルは、注射後１０分で観察された ピークレベルの５０％であった。

１４．３．５ｃＲ１は再潅流された心筋梗塞のラットの梗塞の大きさを減少する 。

本明細書に記載されたように、インビトロの補体経路Ｃ３／Ｃ５コンバーターゼ の活性を抑制し得た５ｃＲ１は、またインビボのラット心筋梗塞モデル中の再潅 流損傷の程度を軽減し得た。

心筋梗塞は、冠状動脈結紮によりラット中に誘発し得る。心筋梗塞後の最初の数 時間以内に確立された場合、再潅流は、梗塞の大きさを減少し、左心室機能を改 善し、かつ死亡率を低下することが示されているＢｒａｕｎｗａｌｄ、　Ｅ、及 びＫｌｏｎｅｒ、　Ｒ，Ａ。、　１９８５．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　７６　：　１７１３−１７１９）。しかしながら、重度に虚血 性であるが不可逆的に損傷されていない心筋の再潅流は、それ自体で損傷を生じ 、拡大することがある。

再潅流誘発損傷の原因となる機構は、酸素を含まないラジカル及び細胞のカルシ ウム過負荷により媒介される損傷を含有し得る。単独で、または微小血管内皮細 胞と協力して作用する白血球が、この損傷の原因となることがある。補体活性化 が、この過程に関係することがあるＲｏｓｓｅｎ、　Ｒ，Ｄ、ら、１９８５．　 Ｃｉｒ、　Ｒｅｓ。５７．１１９−１３０；　Ｃｒａｗ−ｆｏｒｄ、　Ｍ、Ｈｏ ら、１９８８．　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　７８　：　１４４９−１４５８）。

１４．３．１．方　法 １４、３．１．１．ラット心筋梗塞の誘発体重２００〜２５０ｇのラット（ｎ＝ １４）を、メトキシフルランの吸入により麻酔し、右頚静脈切断及びカニユーし 挿入した。半分（ｎ＝７）がカニユーレにより５ＣＲ１２ｙｄ（１■）をそして 他の半分が同様に調製された食塩水偽薬２ｒｌＬｌを投与された。これらの動物 から頚静脈カニユーレを除去し、頚静脈を結紮し、その部位を閉じた。その後、 左開胸を、第五〜第六肋換隙内で行ない、その間、９５％酸素及び５％二酸化炭 素による間欠の陽圧換気を与えた。続いて、心のう心腹切開を行ない、左冠状動 脈を、隣接の大動脈の左２〜３ｍａ＋内の縫合結紮により咬合した。この冠状動 脈結紮の作用は、前壁内梗塞のおそれのある大きな領域を生じることであった。

胸を一時的に閉じ、その間ラットは麻酔を受けたままであった。咬合の３５分後 に、胸を再開し、結紮を解いた。この時間間隔は、危険領域のかなりの部分が潜 在的に救済できるように選んだ。続いて、開胸部を永久に閉じ、通常手術後５＝ １０分以内で、動物を麻酔から覚醒させた。１００．０００単位のベンザチンペ ニシリンＧ及び０．２５■／ｋｇのモルヒネスルフェートを筋肉内投与した。動 物を水及び通常のラット用食物で１週間維持し、ヘパリン添加及びメトキシフル ラン麻酔後に心臓の切除により殺した。

１４、３．１．２．実験の梗塞の形態学的分析：研究用の心臓の調製 心臓の切除の後に、大動脈にす早くカニユーレを挿入し、冠状動脈をまずＫｒｅ ｂｓＨｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液で潅流して心臓の血液及び血餅をきれいにし、続い て、拡張期心搏動停止には３０１ｒ１ＭのＫＣＩで潅流しｔ−０心臓を、冠潅流 および、１０％の緩衝ホルマリン中に浸漬４−ることにより固定した。充填圧力 を適当に調節するため、心臓を、ブンスチック管を用いて７、僧帽弁を通り、て 通気した。

固定後、心臓を、下部から頂部へと２ｍｍずつ房室間溝に平行に横方向に薄く切 り、組織切片を調製した。

１４．３．２、結　果 生存は両グル・・−ブで同じであり、即ち７匹のうちの６匹のラットが７日間生 存し、分析された。組織スライドの肉眼検査で、６匹の偽薬処ｎラウドのうちの ５匹が、大きな壁内心筋梗塞（全体の左心室の質量の少なくとも１５％であると 概算される）を有し７′″Ｃいた。生存している５ｃＲ１−処置動物の６匹のつ ちのわずかに１匹のみが、この大きな壁内梗塞の所見を有していた。

その他の５ｃＲ１処置動物は多少の左心室の塊（１５％未満）を含む小さな斑状 の梗塞を存していた。実際に、これらの殆どが顕微鏡によりわずかに検出でき、 一方、偽薬処置ラットからの梗塞は肉眼検査により明らかであった。

１４．３．３．結　論 これらの結果は、５ｃＲ１処置がインビボの再潅流損傷を減少し、心筋梗塞の作 用を改善するのに有効であることを示す。再潅流損傷が好転し得る程度に、救出 される心筋の絶対量を増加でき、再潅流が臨床上有効である時間帯が延長できる 。５ＣＲ１による処置は、急性梗塞中の血栓溶解剤またはバルーン式冠状血管形 成との同時治療に有効な筈である。

１５、微生物の寄託 完全な長さのＣＲＩタンパク質をコードするプラスチックｐｉＡＢｃＤ（［）Ｃ ＲＩ−ｐｉＡＢＣＤと称する）を担持する大腸菌ＤＫＸ／Ｐ３を、イリノイ州Ｐ ｅｏｒｉａにあるＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ 　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＮＲＲＬ）　！：１９８８年３月３１日に寄託し、 登録番号Ｂ−１８３５５を指定された。

可溶性ＣＲ１分子をコードするプラスミドｐＢｓｃＲ１ｅ／ｐ’ｒｃｓｇｐｔク ローン３５．６を担持するチャイニーズハムスター卵巣細胞系ＤＵＸ　Ｂｌｌを 、メリーランド州、ＲｏｃｋｖｉｌｌｅにあるＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）に１９８９年３月２３日に 寄託し、登録番号ＣＲＬ　１００５２を指定された。

本発明は、寄託された微生物により範囲を限定されるべきではない。何となれば 、寄託された実施態様は本発明の一つの特徴の単なる例示として意図され、機能 的に同等である任意の微生物が本発明の範囲内にあるからである。実際に、本明 細書に示され説明されたものの他に、本発明の種々の改変が、上記の説明及び添 付図面から当業者に明らかになる。このような改変は、請求の範囲の中に入るこ とが意図される。

また、ヌクレオチドに関して示された全ての塩基対の大きさは概略であり、説明 の目的で使用されることが理解される。

種々の文献が本明細書中に引用されており、その開示はそのまま参考として含ま れる。

（本頁以下余白） ｏｌ−１ロじ　ロト　ロト　ロＣＪ　ロロ　ローψ（ＪＱ＋　Ｎｈ＞　中トー　 −く−ロト〉　ψｈ＞　ＮａＱＣＪ　”ｌ）　＋＋＋＄　ｃｑＥ：４ｃｑＱ　Ｆ ＩＱ　ｗ＋Ｅ−＋６″″　し〉　８″　乏ｚ　４ｃ′Ｂ“　と４８′″−８（む ４　七４　ゴ２　百０　ミ２す・　ｇ−Ｆ、Ｚ　Ｅ−ヨ・　ト　ミ・淀−￥Ｊｄ 　ト　し　ご−七−仁− ＜　ＣＪ　ＣＪ　＜ と・　と・　８−８０　翼Ｑ　乏２１ 七。　括、５　８６　仁、８□　じエ　８゜Ｅ、Ｑ（ｊ（（ロ　− 七の　ごＣ５５Ｋ　３〜　ミＨｇｕ　Ｂクト　ロ トトトト目・トト ト　目・　ト　卜　化・　ト　ト 仁−８０ち〉　足８　８″′　足Ｃ″′　ミ８ＣＪＣＪＣ５（Ｅ−ＣＪＩ、５ ｑｕ　（Ｊへ　Ｑら　トー　ベ糎　くロ　ト〉ト　υ　（ＪＣＪＥ−＋Ｑ（５ ミ８　８（七′！　乏２．８°　乏８　６０淀っ　８４　８＜　８Ｅ−じ、む、 旨。

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Ｃ） ｃＤＮＡ ｐＴＣＳ、　ｇｐｔ　ｐＴＣＳ、ｄｈｆｒ　ｐＴＣＳ、　ｎ６０ＦＩＧ、２イ ＦＩＧ、２２ 吸死度 ＦＩＧ、２６ａ　’　ＦＩＧ、２６ｂ ＦＩＧ、２６ｃ　ＦＩＧ、２６ｄ ＦＩＧ、　２７　ａ 辷上法シ有°１１１うＩ７るマジ英的稀゛イネＣケユｈ；ひ゛Ｑ３久翫主、すＰ 且＊ＣＲＩ　浅Ｌ　（ｐｇ／ｍｌ） 臭し８多（？３勺　でト　イ〈ｉ治′悸付怜奏恒　リ　そロー　ゴηンＣＲ−１ ”、％ｆｆ　（ｐ９／ｍｌ） ＦＩＧ、３０ ＦＩＧ、３１Ａ Ｆ／Ｇ、３ｆＢ 国際調査報告 ＋ｍｅ＋ｖ＋、１ｌｌｌａ＋ＡＩＤ普１ｃｍ＋１ｅ＋＋Ｎａ、””：Ｔ−−３３ ９１０ｉこ’５３ｌｍｖ止−−Ａ帥−―艶１１＊、　Ｐ”τ／４９ｐ９７ｃＨ６ ｙｙｓη

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．実質的に第１図に示される全長ＣＲ１タンパク質のヌクレオチド番号２８か ら６１４７までをコードする配列を含有する核酸配列。 ２．ＤＮＡ配列からなる請求項１記載の配列。 ３．ＲＮＡ配列からなる請求項１記載の配列。 ４．請求項１記載の配列からなる組換え核酸ベクター。 ５．請求項２記載の配列からなる組換え核酸ベクター。 ６．ｐＡＢＣＤからなる組換えＤＮＡベクター。 ７．ＮＲＲＬに寄託されておりそして受託番号Ｂ−１８３５５を有する、ｐｉＡ ＢＣＤからなる組換えＤＮＡベクター。 請求項１記載の配列からなる組換え発現ベクター。 前記配列を細菌中で発現しうる請求項８記載の発現ベクター。 １０．前記配列を哺乳類細胞中で発現しうる請求項８記載の発現ベクター。 １１．ＮＲＲＬに寄託されておりそして受託番号Ｂ−１８３５５を有する、ｐｉ ＡＢＣＤからなる請求項１０記載の発現ベクター。 １２．請求項１記載の配列からなる組換え細胞。 １３．請求項４記載の核酸ベクターを含有する細胞からなる組換え細胞。 １４．請求項５記載の核酸ベクターからなる細胞からなる組換え細胞。 １５．請求項８記載の核酸ベクターからなる細胞からなる組換え細胞。 １６．請求項１０記載の核酸ベクターからなる細胞からなる組換え細胞。 １７．細菌からなる請求項１２、１３または１４記載の組換え細胞。 １８．ＮＲＲＬに寄託されておりそして受託番号Ｂ−１８３５５を有するエシェ リヒア・コリ。 １９．実質的に第１図に示される配列のヌクレオチド番号２８から１５３３まで からなる核酸配列。 ２０．実質的に膜貫通領域を含有しないタンパク質をコードする請求項１９記載 の核酸配列。 ２１．前記タンパク質がそれを発現する細胞により分泌される、請求項２０記載 の核酸配列。 ２２．前記タンパク質がインビトロで、好中球酸化的バースト、補体仲介溶血、 またはＣ３ａおよびＣ５ａ産生を阻害する能力により検出される機能を有する請 求項２１記載の核酸配列。 ２３．ＤＮＡ配列からなる請求項１９、２０または２１記載の核酸配列。 ２４．ＲＮＡ配列からなる請求項１９、２０または２１記載の核酸配列。 ２５．請求項１９または２０記載の配列からなる組換え核酸ベクター。 ２６．請求項２１または２２記載の配列からなる組換え核酸ベクター。 ２７．請求項１９記載の配列からなる組換え発現ベクター。 ２８．請求項２０記載の配列からなる組換え発現ベクター。 ２９．請求項２１記載の配列からなる組換え発現ベクター。 ３０．ｐＢＳＣＲ１ｃ、ｐＢＳＣＲ１ｓ、ｐＢＭ−ＣＲ１ｃ、ｐＢＳＣＲ１ｃ／ ｐＴＣＳｇｐｔおよびｐＢＳＣＲ１ｓ／ｐＴＣＳｇｐｔからなる群から選択され る請求項２８記載の組換え発現ベクター。 ３１．ｐＴ−ＣＲ１ｃ１、ｐＴ−ＣＲ１ｃ２、ｐＴ−ＣＲ１ｃ３、ｐＴ−ＣＲ１ ｃ４およびｐＴ−ＣＲ１ｃ５からなる群から選択される請求項２８記載の組換え 発現ベクター。 ３２．ＡＴＣＣに寄託されておりそして受託番号ＣＲ１１００５２を有する、プ ラスミドｐＢＳＣＲ１ｃ／ｐＴＣＳｇｐｔからなる組換えＤＮＡベクター。 ３３．請求項１９、２０または２１記載の配列からなる組換え細胞。 ３４．細菌からなる請求項３３記載の組換え細胞。 ３５．請求項２５記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。 ３６．請求項２６記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。 ３７．請求項２７記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。 ３８．請求項２８記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。 ３９．請求項２９記載のベクターからなる細胞からなる組換え細胞。 ４０．ＡＴＣＣに寄託されておりそして受託番号ＣＲＬ１００５２を有する、プ ラスミドｐＢＳＣＲ１ｃ／ｐＴＣＳｇｐｔを担持するチャイニーズハムスター卵 巣細胞ＤＵＸ　Ｂ１１。 ４１．実質的に第１図に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。 ４２．Ｃ３ｂと結合しうることを特徴とする請求項４１記載のタンパク質のフラ グメント。 ４３．Ｃ４ｂと結合しうることを特徴とする請求項４１記載のタンパク質のフラ グメント。 ４４．Ｃ３ｂおよびＣ４ｂと結合しうることを特徴とする請求項４１記載のタン パク質のフラグメント。 ４５．ファクターＩコファクター活性を有する請求項４１記載のタンパク質のフ ラグメント。 ４６．Ｃ３コンバーターゼ活性を阻害しうる請求項４１記載のタンパク質のフラ グメント。 ４７．Ｃ５コンバーターゼ活性を阻害しうる請求項４１記載のタンパク質のフラ グメント。 ４８．グリコシル化されている請求項４１記載のタンパク質または２４個のアミ ノ酸を含有するそのフラグメント。 ４９．グリコシル化されていない請求項４１記載のタンパク質。 ５０．細胞表面タンパク質として発現される請求項４１記載のタンパク質。 ５１．第１図に示されるヌクレオチドの番号２８から１５３３までにより実質的 にコードされるアミノ酸配列を含有するタンパク質。 ５２．請求項５１記載のタンパク質をコードする核酸配列。 ５３．実質的に膜貫通ドメインを含有しない請求項５１記載のタンパク質。 ５４．それを発現した細胞により分泌される、請求項５３記載のタンパク質。 ５５．実質的に膜貫通領域を含有しないＣＲ１分子。 ５６．それを発現した細胞により分泌される、請求項５５記載のＣＲ１分子。 ５７．グリコシル化されていない請求項５５記載のＣＲ１分子。 ５８．グリコシル化されている請求項５５記載のＣＲ１分子。 ５９．インビトロで、好中球酸化的バースト、補体仲介溶血、またはＣ３ａおよ びＣ５ａ産生を阻害する能力により検出される機能を有する請求項５５記載のＣ Ｒ１分子。 ６０．ｐＢＳＣＲ１ｃ、ｐＢＳＣＲ１ｓ、ｐＢＭ−ＣＲ１ｃ、ｐＢＳＣＲ１ｃ／ ｇＴＣＳｇｐｔおよびｐＢＳＣＲ１ｓ／ｐＴＣＳｇｐｔからなる群から選択され る核酸ベクターによりコードされる請求項５５記載のＣＲ１分子。 ６１．ｐＴ−ＣＲ１ｃ１、ｐＴ−ＣＲ１ｃ２、ｐＴ−ＣＲ１ｃ３、ｐＴ−ＣＲ１ ｃ４およびｐＴ−ＣＲ１ｃ５からなる群から選択される核酸ベクターによりコー ドされる請求項５５記載のＣＲ１分子。 ６２．ＡＴＣＣに寄託されておりそして受託番号ＣＲＬ１００５２を有する、プ ラスミドｐＢＳＣＲ１ｃ／ｐＴＣＳｇｐｔを担持するチャイニーズハムスター卵 巣細胞ＤＵＸＢ１１により発現される、請求項５５記載のＣＲ１分子。 ６３．請求項４１記載のタンパク質をその表面に発現する組換え細胞。 ６４．請求項４２、４３または４５記載のタンパク質を発現する組換え細胞。 ６５．請求項５１記載のタンパク質を発現する組換え細胞。 ６６．請求項５５記載のタンパク質を発現する組換え細胞。 ６７．請求項５６記載のタンパク質を発現する組換え細胞。 ６８．２４個のアミノ酸からなる請求項３６記載のタンパク質の、細胞により分 泌されるフラグメントを発現する組換え細胞。 ６９．（ａ）ＣＲ１タンパク質またはそのフラグメントからなる試料を得； （ｂ）該試料をカチオン交換高圧液体クロマトグラフィーにかけ；そして （ｃ）該高圧液体クロマトグラフィーカラムからタンパク質またはそのフラグメ ントを溶離する、ことを含んでなるＣＲ１タンパク質またはそのフラグメントの 精製法。 ７０．工程（ｃ）の後に （ｄ）前記タンパク質またはそのフラグメントをアニオン交換高圧液体クロマト グラフィーにかけ；そして（ｅ）工程（ｄ）の高圧液体クロマトゲラフィーカラ ムからタンパク質またはそのフラグメントを溶離する、ことをさらに含んでなる 、請求項６９記載の方法。 ７１．ＣＲ１タンパク質またはそのフラグメントが実質的に膜貫通ドメインを含 有しない請求項６９または７０記載の方法。 ７２．（ａ）ＣＲ１分子が分泌されるような様式で、培養中の細胞において、実 質的に膜貫通ドメインを含有しないＣＲ１分子を発現させ； （ｂ）ＣＲ１分子からなる細胞培養液の試料を得；（ｃ）該試料をカチオン交換 高圧液体クロマトグラフィーにかけ；そして （ｄ）該高圧液体クロマトグラフィーカラムからＣＲ１分子を溶離する、 ことを含んでなるＣＲ１分子の精製法。 ７３．工程（ｃ）の後に （ｄ）前記分子をアニオン交換高圧液体クロマトグラフィーにかけ；そして （ｅ）工程（ｄ）の高圧液体クロマトグラフィーカラムから該分子を溶離する、 ことをさらに含んでなる請求項７２記載の方法。 ７４．請求項１２記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。 ７５．請求項１３記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。 ７６．請求項１４記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。 ７７．請求項１５記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。 ７８．請求項３３記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。 ７９．請求項３４記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。 ８０．請求項３５記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。 ８１．請求項３６記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。 ８２．請求項３７記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。 ８３．請求項３８記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。 ８４．請求項３９記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。 ８５．請求項４０記載の細胞を増殖させることを含んでなるＣＲ１分子の製法。 ８６．請求項４１記載のタンパク質または２４個のアミノ酸からなるそのフラグ メントを患者に投与することを含んでなる、免疫障害または望ましからぬかまた は不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の治療法。 ８７．請求項４２または４３記載のフラグメントを患者に投与することを含んで なる、免疫障害または望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有 する患者の治療法。 ８８．請求項４５記載のフラグメントを患者に投与することを含んでなる、免疫 障害または望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の 治療法。 ８９．請求項５１、５３または５４記載のフラグメントを投与することを含んで なる、免疫障害または望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有 する患者の治療法。 ９０．請求項５５記載の分子を患者に投与することを含んでなる、免疫障害また は望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の治療法。 ９１．請求項５６記載の分子を患者に投与することを含んでなる、免疫障害また は望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の治療法。 ９２．請求項５９記載の分子を患者に投与することを含んでなる、免疫障害また は望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の治療法。 ９３．請求項６２記載の分子を患者に投与することを含んでなる、免疫障害また は望ましからぬかまたは不適当な補体活性が関わる障害を有する患者の治療法。 ９４．請求項４１記載のタンパク質または２４個のアミノ酸からなるそのフラグ メントを患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起因する患者の損傷を治 療または予防する方法。 ９５．請求項５５記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起 因する患者の損傷を治療または予防する方法。 ９６．請求項５６記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起 因する患者の損傷を治療または予防する方法。 ９７．請求項５９記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起 因する患者の損傷を治療または予防する方法。 ９８．請求項６０または６１記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心 筋梗塞に起因する患者の損傷を治療または予防する方法。 ９９．請求項６２記載の分子を患者に投与することを含んでなる、心筋梗塞に起 因する患者の損傷を治療または予防する方法。 １００．請求項４１記載のタンパク質または２４個のアミノ酸からなるそのフラ グメントを患者に投与することを含んでなる、炎症に起因する患者の損傷を治療 または予防する方法。 １０１．請求項５５記載の分子を患者に投与することを含んでなる、炎症に起因 する患者の損傷を治療または予防する方法。 １０２．請求項５６記載の分子を患者に投与することを含んでなる、炎症に起因 する患者の損傷を治療または予防する方法。 １０３．請求項５９記載の分子を患者に投与することを含んでなる、炎症に起因 する患者の損傷を治療または予防する方法。 １０４．請求項６０または６１記載の分子を患者に投与することを含んでなる、 炎症に起因する患者の損傷を治療または予防する方法。 １０５．請求項６２記載の分子を患者に投与することを含んでなる、炎症に起因 する患者の損傷を治療または予防する方法。