FI106316B - Ihmisen C3b/C4b-reseptori (CR1) - Google Patents

Description

106316

Ihmisen C3b/C4b -reseptori (CR1) 35 U.S.C. § 202:n edellyttämällä tavalla ilmoitetaan, että 5 Yhdysvaltain hallituksella on tiettyjä oikeuksia tähän kek-'* sintöön, joka tehtiin osittain laitoksesta National Insti tutes of Health saadulla rahoituksella.

1 Johdanto 10 Tämä keksintö liittyy C3b/C4b reseptori (CR1) -geeniin ja sen koodaamaan proteiiniin. Tämä keksintö liittyy myös CRl:n nukleiinihappojaksoihin ja näiden fragmentteihin, jotka käsittävät 70 nukleotidiä ja niiden koodaamiin pep-tideihin tai proteiineihin, jotka käsittävät 24 aminohap-15 poa. Tämä keksintö mahdollistaa CRl-proteiinin ja sen fragmenttien ilmentämisen. CRl-nukleiinihapoilla ja -proteiineilla on käyttöä sellaisten sairauksien diagnoosissa tai hoidossa, joihin liittyy komplementtiaktiivisuutta, sekä useissa tulehdussairauksissa ja immuunijärjestelmän sai-20 rauksissa.

2 Keksinnön tausta 2.1 Komplementtijärjestelmä

Komplementtijärjestelmä on proteiiniryhmä, joka muodostaa ;; 25 noin 10 prosenttia ihmisen normaalin seerumin proteiineis ta (Hood, L.E. et ai. (1984) Immunology, toinen painos, Benjamin/Cummings Publishing Co., Menlo Park, California, s. 339). Komplementilla (C) on tärkeä osuus immuuni- ja allergisten reaktioiden välittäjänä (Rapp, H.J. ja Borsos, % 30 T, (1970) Molecular Basis of Complement action, Appleton- Y **_ Century-Crofts (Meredith), New York). Komplementin kompo- * nenttien aktivaatio johtaa siihen, että muodostuu ryhmä tekijöitä, joihin kuuluu kemotaktisia peptidejä, joiden välityksellä komplementista riippuviin sairauksiin liitty-35 vä tulehdus tapahtuu. Komplementtireaktiosarjän vaiheit- 2 106316 täinen aktivaatio voi tapahtua klassista reaktiotietä, johon antigeeni-vasta-ainekompleksit ottavat osaa, tai vaihtoehtoista tietä, johon liittyy tiettyjen solunseinän polysakkaridien tunnistaminen. Aktiivisuuksiin, joissa ak- ^ 5 tivoidut komplementtiproteiinit toimivat välittäjinä, kuuluvat kohdesolujen hajotus, kemotaksia, opsonisointi, verisuonten ja muiden sileiden lihassolujen stimulointi, ja toiminnalliset häiriötilat, kuten syöttösolujen degranu-laatio, pienten verisuonten läpäisevyyden lisääntyminen, 10 leukosyyttien ohjautuminen ja B-lymfosyyttien ja makrofa-gien aktivaatio (Eisen, H.N. (1974) Immunology, Harper &

Row Publishers, Inc. Hagerstown, Maryland, s. 512).

Proteolyyttisen reaktiosarjän aikana vapautuvat biologises-15 ti aktiiviset peptidifragmentit, anafylatoksiinit C3a, C4a, ja C5a (ks. WHO Scientific Group (1977) WHO Tech. Rep. Ser.

606:5 ja tässä siteeratut viitteet), kolmannesta (C3), neljännestä (C4) ja viidennestä (C5) natiivista komplementin komponentista (Hugli, T.E., (1981) CRC Crit. Rev. Immunol.

20 1, 321, Bult, H. ja Herman, A.G., (1983) Agents Actions 13, 405) .

2.2 Komplementtireseptori C3b/C4b (CR1)

Ihmisen C3b/C4b reseptori, jota nimitetään CRl:ksi, esiin-25 tyy erytrosyyteissä, monosyyteissä/makrofageissa, granulo-syyteissä, B-soluissa, joissakin T-soluissa, pernan imuke-rästen dendriittisoluissa ja munuaiskeräsen podosyyteissä (Fearon, D.T., (1980) J. Exp. Med. 152, 20, Wilson, J.G. et ai., (1983) J. Immunol. 135, 684, Reynes, M. et ai., (1985) 30 J. Immunol. 135, 2687, Gelfand, M.C. et ai., (1976) N.

" Engl. J. Med. 295, 10, Kazatchkine, M.D. et ai., (1982) r'

Clin. Immunol. Immunopathol. 27, 170). CR1 sitoo spesifisesti C3b:tä, C4b:tä ja iC3b:tä. Plasmassa on havaittu tämän reseptorin liukoinen muoto, jolla on samanlainen ligan-35 dia sitova aktivisuus kuin kalvoon liittyneellä CRl:llä 3 106316 (Yoon, S.H. ja Fearon, D.T., (1985) J. Immunol. 134, 3332). CR1 sitoo C3b:tä ja C4b:tä, jotka ovat liittyneet kovalent-tisesti immuunikomplekseihin ja muihin komplementin akti--1 vaattoreihin ja näiden vuorovaikutusten seuraukset riippu- 5 vat siitä solutyypistä, jossa reseptori on (Fearon, D.T. ja » Wong, W.W., (1983) Ann. Rev. Immunol, l, 243) Erytrosyyt- tien CR1 sitoo immuunikomplekseja niiden kuljettamiseksi maksaan (Cornacoff, J.B. et ai., (1983) J. Clin. Invest. 71, 236 ja Medof, M,E. et ai., (1982) J. Exp. Med. 156, 10 1739) . Sitoutuneet kompleksit siirtyvät solun sisälle neut- rofiileissä ja monosyyteissä olevan CRl:n toimesta joko adsorptiivisella endosytoosilla peitteisten kuopakkeiden kautta (Fearon, D.T. et ai., (1981) J. Exp. Med. 153, 1615 ja Abrahamson, D.R. ja Fearon, D.T., (1983) Lab. Invest.

15 48, 162) tai fagosytoosilla reseptorien aktivaation jälkeen forboliestereillä, kemotaktisilla peptideillä tai solunul-koisessa matriisissa esiintyvillä proteiineilla kuten fib-ronektiini ja laminiini (Newman, S.L. et ai., (1980) J. Immunol. 125, 2236, Wright, S.D. ja Silverstein, S.C., 20 (1982) J. Exp. Med. 156, 1149 ja Wright, S.D. et ai., (1983) J. Exp. Med. 158, 1338) . CRl:n fosforylaatiolla voi olla osuutta fagosyyttisen aktiivisuuden syntymiseen (Chan-gelian, P.S. ja Fearon, D.T., (1986) J. Exp. Med. 163, 101) . B-lymfosyyteissä olevan CRl:n toiminta tunnetaan huo-·; 25 nommin, vaikkakin näiden solujen käsittely CRl:tä vastaan valmistetulla vasta-aineella vahvisti niiden vastetta ker-mesmarjan mitogeenille (Daha, M.R. et ai., (1983) Im-munobiol. 164, 227 (Abstr.). Imukeräsen dendriittisoluis-sa olevan CRl:n osuus voi olla toiminta antigeenin esittä- * 30 jänä (Klaus, G.G.B., et ai., (1980) Immunol. Rev. 53, 3).

CR1 voi myös inhiboida C3/C5-konvertaasien klassista reak-tiotietä ja toimia kofaktorina tekijän 1 suorittamassa C3b:n ja C4b:n pilkkomisessa, mikä viittaa siihen, että 35 CRlrllä on myös komplementtia sääteleviä toimintoja sen 4 106316 lisäksi, että se toimii myös reseptorina (Fearon, D.T., (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76, 5867 ja Iida, K. ja Nussenzweig, V., (1981) J. Exp. Med.153, 1138). Komplementin aktivaation vaihtoehtoisessa reaktiotiessä bimoleku- =·- 5 laarinen C3b, Bb -kompleksi on C3:a aktivoiva entsyymi (konvertaasi). CR1 (ja korkeammissa pitoisuuksissa tekijä H) voi sitoa C3b:tä ja myöskin edistää C3b, Bb:n dissosiaa-tiota. Lisäksi C3b, CRl:n (ja C3b, H:n) muodostuminen tekee C3b:n alttiiksi tekijän I toimesta tapahtuvalle palautumat-10 tomalle proteolyyttiselle inaktivaatiolle, jonka tuloksena on inaktivoitunut C3b (iC3b). Komplementin aktivaation klassisessa reaktiotiessä kompleksi C4b, 2a on C3-konver-taasi. CRl (ja C4:ää sitova proteiini, C4bp, esiintyessään korkeahkoissa pitoisuuksissa) voi sitoutua C4b:hen ja myös-15 kin edistää C4b, 2a:n dissosioitumista. Tämä sitoutuminen tekee C4b:n alttiiksi tekijän I toimesta tapahtuvalle palautumattomalle proteolyyttiselle inaktivaatiolle niiden pilkkoutuessa C4c:ksi ja C4d:ksi (inaktivoidut komplement-tiproteiinit).

20 CRl on yhdestä polypeptidiketjusta koostuva glykoproteii-ni. On löydetty neljä CRl:n allotyyppistä muotoa, jotka eroavat molekyylipainoltaan -40 000—50 000 daltonin suuruisten lisäosien verran. Kahdella yleisimmällä muodolla, ;· 25 F- ja S-allotyypillä, joita nimitetään myös A- ja B-allo- tyypeiksi, on 250 000:n ja 290 000:n suuruinen molekyyli-paino (Dykman, T.R. et ai., (1983) Proc. Natl. Acad. Sei.

U.S.A. 80, 1698 ja Wong, W.W. et ai., (1983) J. Clin. Invest. 72, 685), tässä järjestyksessä mainittuna, ja kah- 30 della harvinaisemmalla muodolla on 210 000:n ja >290 000:n “ suuruiset molekyylipainot (Dykman, T.R. et ai., (1984) J.

• I

Exp. Med. 159, 691 ja Dykman, T.R. et ai., (1985) J. Immunol. 134, 1787). Nämä eroavuudet edustavat ilmeisesti pikemminkin CRl:n polypeptidiketjussa kuin glykosylaatio-35 tilassa esiintyviä vaihteluja, koska ne eivät hävinneet 5 106316 puhdistetun reseptoriproteiiniin käsittelyssä endoglykosi-daasi F:llä (Wong, W.W. et ai., (1983) J. Clin. Invest. 72, 685) ja ne havaittiin, kun reseptorin allotyyppejä biosyn-tetisoitiin tunikamysiinin läsnäollessa (Lublin, D.M. et 5 ai., (1986) J. Biol. Chem. 261, 5736). Kaikilla neljällä * CRl-allotyypillä on C3b:tä sitovaa aktiivisuutta (Dykman, T.R. et ai., (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80, 1698, Wong, W.W. et ai., (1983) J. Clin. Invest. 72, 685, Dykman, T.R. et ai., (1984) J. Exp. Med. 159, 691 ja Dykman, T.R.

10 et ai., (1985) J. Immunol. 134, 1787).

Kahden CRl-cDNA:n restriktiofragmentin, jotka eivät olleet toistensa suhteen limittäin, osoitettiin ristiinhybridi-soituvan olosuhteiden ollessa hyvin rajoittavat (Wong W.W. 15 et ai., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82, 7711).

Molemmat cDNA-koettimet hybridisoituivat myös useisiin ge-nomin DNA:n restriktiofragmentteihin, joista useimmat olivat yhteisiä molemmille koettimille (id.). CRl:ssä olevien toistuvien koodaavien jaksojen olemassaolo vahvistettiin 20 sekvenssejä vertaamalla (Klickstein, L.B. et ai., (1985) Complement 2, 44 (Abstr.)). Lisäksi CRl:n on osoitettu omaavan toistuvia välijaksoja osoittamalla, että genomista peräisin oleva koetin hybridisoituu ristiin useiden sellaisten genomin restriktiofragmenttien kanssa, joista koo-" 25 daavat jaksot puuttuvat (Wong, W.W. et ai., (1986) J. Exp.

Med. 164, 1531). Koehenkilöllä, jolla oli suurempi S-allo-tyyppi, oli lisäksi yksi tähän genomikoettimeen hybridisoi-tuva ylimääräinen restriktiofragmentti F-allotyypin koehen-^ kilöstä saatuun DNA:han verrattuna, joka viittaa siihen, • 30 että suurempimolekyylipainoisen CRl-alleelin kyseessäol- " lessa oli tapahtunut genomijaksojen duplikaatio (id.).

Ψ CRl:n on osoitettu omaavan homologiaa komplementtiresepto-rityypille 2 (CR2) (Weiss, J.J. et ai., (1986) Proc. Natl. 35 Acad. Sei. U.S.A. 83, 5639—5643).

6 106316 2.3 CRl:n epänormaali käyttäytyminen ihmisessä esiintyvissä sairauksissa

Havaintoja systeemistä punahukkaa (SLE) sairastavien poti- -

5 laiden erytrosyyteissä olevan CRl:n ilmentymisen alenemisesta ovat raportoineet tutkijat, jotka ovat peräisin J

useilta eri maantieteellisiltä alueilta mukaan lukien Japani (Miyakawa, et ai., (1981) Lancet 2, 493—497 ja Mino-ta et ai., (1984) Arthr. Rheum. 27, 1329—1335), Yhdysval- 10 lat (Iida et ai., (1982), J. Exp. Med. 155, 1427—1438) ja

Wilson et ai., (1982) N. Engl. J. Med. 307, 981—986) ja

Eurooppa (Walport, et ai., (1985) Clin. Exp. Immunol. 59, 547, Jouvin, et ai., (1986) Complement 3, 88—96), Holme et ai., (1986) Clin. Exp. Immunol. 63, 41—48) . Kokonaisuutena 15 otettuna näillä potilailla on keskimääräinen reseptorien lukumäärä solua kohti sellainen, että se on 50—60 % normaalin populaation vastaavasta määrästä. Yhdessä ensimmäisistä raporteista esitettiin se huomio, että erytrosyyteissä oleva CRl-luku vaihteli kääntäen verrannollisesti sairauden 20 aktiivisuuteen siten, että lukumäärä oli pienimmillään SLE:n pahimpien vaiheiden aikana ja korkeampia lukumääriä havaittiin sairauden uudelleen puhkeamisten aikoihin samassa potilaassa (Iida et ai. 1982, J. Exp. Med. 155, 1427—1438) . CRl-luvun on myös havaittu korreloivan kääntäen ] 25 immuunikompleksien seerumitasojen suhteen, C3d:n seerumi- tasojen suhteen ja erytrosyytteihin liittyneen C3dg:n määrien suhteen, jotka ehkä heijastavat komplementtia aktivoivien immuunikompleksien ottoa solun sisään ja niiden siirtymistä erytrosyytin pinnalle "viattomina sivustakatsojina" 30 (Ross et ai., (1985) J. Immunol. 135, 2005—2014, Holme et ai., (1986) Clin. Exp. Immunol. 63, 41—48 ja Walport, et » · ai., (1985) Clin. Exp. Immunol. 59, 547). SLE:n saaneella potilaalla, jolta puuttui erytrosyyteissä oleva CRl, havaittiin muodostavan vasta-ainetta omaa CRl:tä vastaan 35 (Wilson, et ai., (1985) J. Clin. Invest. 76, 182—190.

7 106316 CRl:tä vastaan syntyvän vasta-aineen tiitterien aleneminen tapahtui samanaikaisesti potilaan kliinisen tilan paranemisen kanssa ja tähän liittyi reseptorien epänormaalin tilan ^ osittainen palautuminen. CRl:tä vastaan muodostuvaa vasta- 5 ainetta on havaittu kahdessa muussa SLE-potilaassa (Cook, 4 et ai., (1986) Clin. Immunol. Immunopathol. 38, 135—138).

Äskettäin osoitettiin erytrosyyttien CRl:n hankittu häviäminen olosuhteissa, joissa esiintyi aktiivinen SLE ja hemo-lyyttinen anemia, siten, että seurattiin reseptorien nopea-10 ta häviämistä verensiirrossa siirretyistä erytrosyyteistä (Walport et ai., (1987) Clin. Exp. Immunol. 69, 501—507).

CRl:n suhteellinen häviäminen on myös havaittu potilaissa, joilla on ihmisen immuunipuutostautivirus (HIV) -infektioi-15 ta (Tausk, F.A. et ai., (1986) J. Olin. Invest. 78, 977—982) ja kyhmyisessä spitaalissa (Tausk, F.A. et ai., (1985) J. Invest. Dermat. 85, 58s—6ls) .

Komplementtireseptorin ilmentymisen epänormaalit muodot 20 SLE:ssä eivät rajoitu erytrosyyttien CRl:een. SLE-potilai-den neutrofiilien solussa esiintyvän kokonais-CRl:n ja B-lymfosyyttien solukalvon CRl:n suhteen on havaittu esiintyvän suhteellista niukkuutta (Wilson et ai., (1986) Arthr. Rheum. 29, 739—747).

:: 25

Potilaissa, joilla on tyypin IV SLE-nefriitti, katoaa po-dosyyteistä kaikki havaittavissa oleva CRl-antigeeni, kun taas vähemmän vakavissa SLE-nefriittimuodoissa ja sellaisissa etenevissä nefriittimuodoissa, jotka eivät ole SLE-• 30 tyyppisiä, mukaan luettuna tyypin I ja II membraaniprolife- ’ ratiivinen glomerulonefriitti, CRl:n ilmentyminen munuais- T keräsen podosyyteissä ei eroa normaalista (Kazatchkine et ai., (1982) J. elin. Invest. 69, 900—912, Emancipator et ai., (1983) Clin, Immunol. Immunopathol. 27, 170—175). Po-35 tilailla, joilla on tyyppiä IV oleva SLE-nefriitti, ei kui- β 106316 tenkaan erytrosyyttien CRl-lukumäärä ole pienempi kuin SLE-potilailla, joilla on muun tyyppinen munuaislupus tai joilla ei ole ollenkaan nefriittiä (Jouvin et ai., (1986) Complement 3, 88—96). s- 5

Komplementin in vivo -aktivaatio säätelee CRl:n ilmentymi- - sen laukeamista neutrofiilisolujen solukalvossa (Lee, et ai., (1984) J. Clin. Exp. Immunol. 56, 205—214, Moore, F.D.

Jr. et ai., (1986) N. Engl. J. Med. 314, 948—953).

10 3 Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö liittyy C3b/C4b-reseptori (CR1) -geeniin ja sen koodaamiin proteiineihin. Tämä keksintö liittyy myös CRl:n nukleiinihappojaksoihin ja näiden fragmentteihin, 15 jotka käsittävät 70 nukleotidiä ja niiden koodaamiin pep-tideihin tai proteiineihin, jotka käsittävät 24 aminohappoa. Tämä keksintö mahdollistaa CRl-proteiinin ja sen fragmenttien ilmentämisen. Tämän keksinnön mukaisilla geeneillä ja proteiineilla on käyttöä sellaisten sairauksien diag-20 noosissa tai hoidossa, joihin liittyy komplementtiaktiivi-suutta, sekä useissa tulehdussairauksissa ja immuunijärjestelmän sairauksissa.

Tämän keksinnön mukaisissa spesifisissä sovellutusmuodois-* 25 sa, jotka esitetään yksityiskohtaisesti esimerkkijaksossa, kuvataan täyspitkän CRl-cDNA:n ja sen fragmenttien kloonaus, nukleotidijakso ja siitä johdettu aminohappojakso. Kuvataan myös CRl-proteiinin ja sen fragmenttien ilmentäminen. On kyetty ilmentämään CRl-proteiinia ja sen fragment-30 teja, jotka sitovat C3b:tä ja/tai C4b:tä ja joissa esiintyy tekijän I kofaktoriaktiivisuutta.

> · »

Esimerkeissä kuvataan myös liukoisen CRl-proteiinin tuotto ja puhdistus, joiden molekyylien osoitetaan olevan tera-35 peuttisesti käyttökelpoisia tulehdusreaktioiden hoidossa ja 9 106316 pienentämään sydäninfarktin kokoa ja estämään perfuusion palautumisvaurio.

3.1 Määritelmät 5 Ad2 MLP = adenovirus 2:n myöhäinen pääpromoottori * C = komplementti C3(ma) = metyyliamiinilla käsitelty C3 C4bp = C4:ää sitova proteiini CMV = sytomegalovirus 10 CR1 = tyypin 1 komplementtireseptori, C3b/C4b-reseptori CR2 = tyypin 2 komplementtireseptori DCFDA = dikloorifluoreskeiinidiasetaatti HPLC = korkeasuoritteinen nestekromatografia 15 iC3b = inaktivoitu C3b LHR = pitkä homologinen toistojakso mAb = monoklonaalinen vasta-aine PAGE = polyakryyliamidigeelielektroforeesi RPAR = käänteinen passiivinen Arthrus-reaktio 20 SCR = lyhyt konsensus-toistojakso sCRl = liukoinen CRl-molekyyli 4 Kuvien selitys

Kuva 1. CRl:n koko koodaavan alueen nukleotidi- ja amino-25 happojaksot. Jakso alkaa ensimmäisestä nukleotidistä, joka on EcoRl-kytkijäjakso-oktameerin jälkeen kloonissa XT109.1. Tämän jakson nukleotidi numero 1531 on kuvassa 3 esitetyn jakson nukleotidin numero l ensimmäinen 5'-puoleinen nukleotidi. Kuvassa on esitetty lähetti-RNA:ta vastaava nauha, * 30 jonka alla esitetään siitä johdettu aminhappojakso. Ehdolla | oleva signaalijakso, jota koodaavat nukleotidit n:o 28—147 * on esitetty suluissa.

Kuva 2. Restriktiokartta ihmisen CRl-cDNA:n 5,5 keistä. 35 Musta palkki tarkoittaa cDNA:ta, restriktiokohdat ovat: H: 10 106316

Hind III, B: BamH I, R: EcoR I, P: Pst I, A: Apa I, S:

Sac I, G: Bgl II, K: Κρη I. Ne cDNA-kloonit, joista jakso oli johdettu, esitetään kartan alapuolella. Nuolet osoittavat dideoksinukleotidiketjun terminaatiomenetelmällä suori- v

5 tetun sekvenssointianalyysin suunnan ja pituuden. cDNA

-kloonit orientoitiin restriktiokarttojen ja jaksojen li- - mittäisen identiteetin perusteella.

Kuva 3. Ihmisen CRl-cDNA:n 5,5 ke:n muodostama nukleotidi-10 jakso. Kuvassa esitetään lähetti-RNA:ta vastaava nauha ja emäs numero l (vastaa kuvan 1 emäsnumeroa 1532) on'ensimmäinen emäs EcoRI-kytkijäjakson jälkeen 5'-suunnassa äärimmäisessä olevassa asemassa kloonissa. Pysäytyskodoni on alleviivattu. Kehystettynä oleva 110 ep:n jakso löydettiin 15 nukleotidien 147 ja 148 välistä (nuoli) ja sen uskotaan edustavan osaa välijaksosta.

Kuva 4. Pistematriisianalyysi ihmisen CRl-cDNA:n 5,5 kein muodostamasta nukleotidijaksosta. Piste tulostettiin, jos 20 ainakin 40 emästä 90:stä sopi yhteen. Tumma neliön kulmittain lävistävä ja puolittava viiva osoittaa jakson identiteettiä itsensä kanssa. Kaksi muuta yhdensuuntaista tummaa viivaa l,35:n ja 2,7:n ke:n etäisyydellä identiteettivii-vasta edustavat kahta peräkkäistä, pitkää homologista tois-25 tumajaksoa (LHR:ää), jotka kumpikin ovat 1,35 ke:n suuruisia. Kuusi vaaleampaa pilkkuviivaa kahden LHR:n välissä vastaavat lyhyitä, -0,2 ke: n konsensus-toistumajaksoja.

Lyhyet konsensus-toistumajaksot (SRC:t) ulottuvat 0,4 ke pitkien homologisten toistumajaksojen ulkopuolelle.

30

Kuva 5. Ihmisen CRl:n johdettu aminohappojakso. Kukin ryhmä esitetään yksikirjaimisella merkintätavalla (Lehninger A.L., (1975) Biochemistry 2. painos, Worth Publishers, Inc.

New York, s. 72). Pitkissä homologisissa toistumajaksoissa 35 olevat ryhmät on asetettu toistensa suhteen samaan kohtaan 11 106316 niiden homologian kuvaamiseksi. Kaikki LHR-B:ssä olevat ryhmät on esitetty ja LHR-C:n ja LHR-D:n suhteen mainitaan vain ne ryhmät, jotka poikkeavat LHR-B:ssä olevista ryhmis-ΐ tä. Hydropaattisuusprofiili on ryhmitetty proteiinin COOH- 5 terminaalisesta päästä tämän alapuolelle otaksutun kalvon „ läpäisevän alueen kuvaamiseksi. Välittömästi hydrofobisen alueen jälkeen tuleva alue, jossa on neljä positiivisen varauksen omaavaa ryhmää, on merkitty näiden päällä olevalla viivalla. Epidermaalisessa kasvutekijäreseptorissa ole-10 van proteiinikinaasi C:n fosforylaatiokohdan suhteen 67-%:sta homologiaa osoittava, kuudesta aminohaposta koostuva alue on alleviivattu. Jakson yläpuolella on esitetty kaavio CRl-proteiinista. (TM) kalvon läpäisevä alue, (Cyt) sytoplasmassa oleva alue, (3'UT) translaatioon osallistumaton 15 3'-alue.

Kuva 6. (A) CRl:n SCR-alueiden ryhmittyminen toistensa suhteen. Toistumajaksot on merkitty numeroilla 1—23, jotka alkavat NH2~terminaalisesta päästä ja päättyvät COOH-ter-20 minaaliseen päähän. Tyhjiä välejä on lisätty ryhmittymisen maksimoimiseksi. Suorakaiteet edustavat muuttumattomia ryhmiä ja pystysuuntaiset nuolet osoittavat säilyvien aminohappojen esiintymisen. Ryhmän katsotaan olevan säilynyt, jos se tai sen säilyttävästi tapahtunut korvautuminen .· 25 esiintyy ainakin puolessa SRC-alueista. Poikkisuuntainen nuoli merkitsee sellaista SCR:ää, joka sekvenssoitiin myös CRl:n genomista valmistetusta kloonista 2.38 ja se on yhden eksonin koodaama. (B) Genomista saadun kloonin X2.38 rest-riktiokartta, sekvenssointistrategia ja ositttainen jakso.

* 30 Restriktiokohdat ovat: (B) BamH I,, (S) Sac I, (E) Eco RV, .. (K) Κρη I ja (P) Pst I. Poikkisuuntainen nuoli osoittaa * sekvenssoinnin suunnan ja sen kattaman alueen ja pystysuuntaiset nuolet osoittavat eksoni-introni -rajakohtia.

35 Kuva 7. SCR-jaksojen konsensus-jakson ryhmittyminen prote- 12 106316 iineissa, joissa tiedetään olevan tämä rakenne. Tyhjiä välejä lisättiin ryhmittymisen maksimoimiseksi. Ryhmän katsottiin olevan säilynyt kuvan 5 yhteydessä käytetyllä tavalla paitsi silloin, kun kyseessä ovat ainoastaan yhden ' 5 tai kaksi SCR-jaksoa omaavat proteiinit, joissa ryhmä on säilynyt, jos se esiintyy ainakin puolessa muista proteiineista. Poikkiviivat vastaavat säilymättömiä kohtia. Alleviivatut CR2:n ja C2b:n osa-alueet tarkoittavat sitä, että näille proteiineille ei ole tästä alueesta julkaistu sek-10 venssitietoa. Suorakaiteet tarkoittavat muuttumattomia kys-teiinipuolikkaita. Sekvenssin oikeanpuoleinen numero tarkoittaa niiden SCR-jaksojen määrää, jota käytettiin konsensus-jakson muodostamiseksi. Proteiinien lyhenteet ja konsensus-sekvenssien määrittämiseen käytettyjen sekvenssoin-15 titulosten kirjallisuusviitteet ovat: (CR1) tyypin 1 komp-lementtireseptori, (H), H-tekijä (Kristensen, T. et ai., (1986) J. Immunol. 136, 3407, (C4bp) C4:ää sitova proteiini (Chung, L.P. et ai., (1985) Biochem. J. 230, 133), (CR2) tyypin 2 komplementtireseptori (Weis, J.J. et ai., (1986) 20 Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83, 5639), (Ba) B-tekijän proteolyyttinen fragmentti (Morley, B.J. ja Campbell, R.D.,

(1984) EMBO J. 3, 153), (C2b) C2:n proteolyyttinen fragmentti (Gagnon, J., (1984) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B

Biol. Sei. 306, 301), (Clr) Cl:n r-alayksikkö (Leutys, S.P.

25 et ai., (1986) Biochemistry 25, 4633), (02GP1) 02-glykopro-teiini I (Lozier, J. et ai., (1984) Proc. Natl. Acad. Sei.

U.S.A. 81, 3640), (Hap) haptoglobiini (Kurosky et ai., (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77, 3388), (IL-2-R) interleukiini-2 -reseptori (Leonard, W.J. et ai., (1985) 30 Science 230, 633). Asteriski tarkoittaa sitä, että saatavilla oleva jakso on epätäydellinen.

Kuva 8. Kaavioihmisen CRl:n ehdotetusta rakenteesta. COOH-terminaalinen sytoplasmassa oleva alue on lipidikaksoisker-35 roksen oikealla puolella. 30 SCR-jaksoa on järjestetty li- 13 106316 neaarisesti solukalvon solunulkoisella puolella. Hakasulut tarkoittavat LHR-jaksoja. Sisäkuva on suurennus yhdestä SCR-jaksosta kolminkertaisen mutkarakenteen valaisemiseksi.

'W

5 Kuva 9. Ihmisen CRlrtä koodaavan plasmidin pBSABCDrn liit-, tymäjakson restriktiokartta. Suorakaiteen rajoittamalla alueella, joka käsittää koodaavan jakson sisältävän alueen, on osoitettu yhdeksän fragmenttia kahdeksasta cDNA-kloonis-ta, jotka liitettiin yhteen ligaasireaktiolla CRl-konstruk-10 tion muodostamiseksi. Hakasulut osoittavat LHR-A:n, -B:n, -C:n ja -D:n asemat, tässä järjestyksessä mainittuna.'Suorakaiteen alla olevat viivat edustavat uusia 5'-puoleisia cDNA-klooneja. Restriktiokohdat ovat: A, Apa I, B, B, BamH I, G, Bgl II, H, Hind III, K, Κρη I, M, Bsp Mil, P, Pst I, 15 R Eco Rl ja S, Sac I.

Kuva 10. LHR-A:n seitsemää SCR-jaksoa koodaavien 5'-puo-leisten cDNA-kloonien johdettu aminohappojakso ja tämän jakson ryhmittely LHR-B:n, -C:n ja -D:n vastaavien SCR-jak-20 sojen suhteen. Neljä kysteiiniä, jotka ovat säilyviä ryhmiä kussakin SCR-jaksossa, on alleviivattu. LHR-B:n, -C:n ja -D:n ollessa kyseessä esitetään ryhmä vain siinä tapauksessa, että se poikkeaa LHR-A:ssa olevasta ryhmästä.

.. 25 Kuva 11. Ilmentämisplasmidien piABCD ja pMTABCD restrik- tiokartat. Pm^, ja pCMV tarkoittavat hiiren metallotioneii-nin promoottoria ja sytomegaloviruksen esivarhaista promoottoria tässä järjestyksessä mainittuna.

30 Kuva 12. piABCD:llä (paneelit a ja b) ja pelkällä CDM8- \\ vektorilla (paneelit c ja d) transfektoitujen ja epäsuoras- v: * ti monoklonaalisella YZ-1 CRl-vasta-ainetta vastaan valmis tetulla vasta-aineella ja fluoreskeiinilla leimatulla vuohen hiiren F(ab')2:ta vastaan valmistetulla vasta-aineella 35 värjättyjen COS-solujen faasikontrasti- (paneelit a ja c) 14 106316 ja immunofluoresenssimikroskooppi- (paneelit b ja d) -analyysi, tässä järjestyksessä mainittuna.

Kuva 13. Yhdistelmä-CRl:tä ilmentävien COS-solujen C3b:tä 1 5 ja C4b:tä sitovan aktiivisuuden analyysi. piABCDrllä (paneelit a ja c) tai pelkällä CDM8-vektori11a (paneelit b ja d) transfektoidut COS-solut inkuboitiin EAC4b(lim),3b:n (paneelit a ja b) tai EAC4b:n (paneelit c ja d) kanssa ja niistä tutkittiin rosettien muodostus faasikontrastimikro-10 skoopilla.

Kuva 14. Transfektoitujen COS-solujen ilmentämän yhdistel-mä-CRl:n analyysi SDS-PAGE:11a. Pelkällä CDM8-vektorilla (kanavat l ja 4) ja piABCDrllä (kanavat 2 ja 5), tässä jär-15 jestyksessä mainittuna, transfektoidut COS-solut ja CRl:n F- ja S-allotyypit omaavalta koehenkilöltä saadut erytro-syytit (kanavat 3 ja 6) leimattiin pinnastaan 125I:llä. Näiden solujen detergenttilysaateille suoritettiin immuuniad-sorptio Sepharose-UPCIO:llä (kanavat 1—3) ja Sepharose-20 YZl:llä (kanavat 4—6) ja eluaatit analysoitiin SDS-PAGE:11a pelkistämättömissä olosuhteissa ja autoradiografisesti.

Kuva 15. 125I-C3(ma):n pilkkoutuminen tekijällä I immuuni- ·· 25 immobilisoidun yhdistelmä-CRl:n läsnäollessa. Rinnakkaiset 125I_C3(ma)-näytteet käsiteltiin tekijällä I tekijän H läsnäollessa (kanava l) , pelkällä CMD8-vektori11a transfektoi-tujen COS-solujen lysaatin kanssa esi-inkuboidun Sepharo-se-UPC10:n läsnäollessa (kanava 2), piABCD:llä transfektoi-30 tujen COS-solujen lysaatin kanssa esi-inkuboidun Sepharo-·< se-UPC10:n läsnäollessa (kanava 3) CDM8:lla transfektoi tujen COS-solujen lysaatin kanssa esi-inkuboidun Sepharo-se-YZl:n läsnäollessa (kanava 4) ja piABCD:llä transfektoi-tujen COS-solujen lysaattien kanssa esi-inkuboidusta Sepha-35 rose-YZ-1:stä koostuvien 6 μ1:η (kanava 5), 12 μ1:η (kanava 15 106316 6) ja 25 μ1:η (kanava 7) erien läsnäollessa. Näytteitä 125

Itllä leimatusta C3(ma):sta käsiteltiin myös tekijän I puuttuessa 25 /il:lla Sepharose-YZl:tä, joka oli esi-inku-boitu piABCD:llä transfektoitujen COS-solujen lysaatin 5 kanssa (kanava 8). Pelkistyksen jälkeen I-C3(ma) analy-* soitiin SDS-PAGE:lla ja autoradiografiällä.

Kuva 16. CRl-deleetiomutantteja koodaavat cDNA-konstrukti-ot. Neljää LHR:ää koodaavien cDNA-segmenttien asemat on 10 osoitettu täyspitkän piABCD-konstruktion yllä olevien hakasulkujen avulla ja jossa on esitetty deleetiomutänttien valmistukseen käytetyt restriktiokohdat. Kuhunkin mutant-tiin jäävät cDNA-restriktiofragmentit on osoitettu yhtenäisillä viivoilla. Restriktiokohdat ovat: A, Apa I, B, Bsm I, 15 E, Bst EH ja P, Pst I.

Kuva 17. CRl:n yhdistelmädeleetiomutanttien vertailu CRl:n F- ja S-allotyyppeihin. Detergenttilysaateille, jotka oli saatu 125I:llä pinnasta leimatuista erytrosyyteistä (kanavat 20 1 ja 7) ja COS-soluista, jotka on transfektoitu pelkällä CMD8-vektorilla (kanavat 2 ja 8), piABCD:llä (kanavat 3 ja 9), piBCDrllä (kanavat 4 ja 10), piCDrllä (kanavat 5 ja 11), piD:llä (kanavat 6 ja 12), tässä järjestyksessä suoritettuna, suoritettiin immuunisaostus levaania vastaan val-”, 25 mistetulla Sepharose-UPCIO -vasta-aineella (kanavat 1—6) , CRl:tä vastaan valmistetulla monoklonaalisella Sepharose-YZ1 -vasta-aineella (kanavat 7—11) ja kanin CRl:tä vastaan valmistetulla vasta-aineella ja Sepharose-proteiini-A:11a (kanava 12), tässä järjestyksessä suoritettuna. Eluaateille ’ 30 suoritettiin SDS-PAGE pelkistävissä olosuhteissa sekä auto- ~ radiografia.

7 125 ·

Kuva 18. I-C3(ma) :n pilkkoutuminen tekijällä I COS-solujen läsnäollessa, jotka ilmentävät kokonaista CRl:tä ja sen 125 35 deleetiomutantteja. Rinnakkaiset I-C3(ma) -näytteet inku- 16 106316 boitiin sellaisten COS-solujen kanssa, jotka on transfek-toitu pelkällä CMD8-vektorilla (kanavat 1 ja 7) , piABCD:llä (kanavat 2 ja 8), piAD:llä (kanavat 3 ja 9), piBDrllä (kanavat 4 ja 10), piCDrllä (kanavat 5 ja 11) ja piD:llä (ka-5 navat 6 ja 12) , tässä järjestyksessä suoritettuna, siten että tekijää I ei ollut läsnä (kanavat 1—6) tai tekijän I läsnäollessa (kanavat 7—12). 125I-C3(ma)-näytteet inkuboi-tiin myös tekijän H ja tekijän I kanssa (kanava 13) ja pelkän tekijän I kanssa (kanava 14), tässä järjestyksessä suo-10 ritettuna. Pelkistyksen jälkeen 125I-C3(ma) analysoitiin SDS PAGE:11a ja autoradiografiällä.

Kuva 19. Kaavio mallista, joka esittää CRl:n kunkin LHR:n SCR-tyypit ja ennustetut kohdat, jotka määräävät reseptorin 15 spesifisyydet C3b:tä tai C4b:tä kohtaan. Näiden toissijaiset sitoutumisspesifisyydet on osoitettu sulkumerkeillä.

Kuva 20. Kaavio liukoisiin CRl:n DNA-konstruktioihin jäävistä DNA-alueista. Täyspitkän CRl:n cDNA:n alueet on osoi-20 tettu kuvan yläosassa olevilla suorakaiteilla.

Kuva 21. Kaavio ilmentämisvektorien pTSC-sarjan tärkeimmistä rakenneosista.

25 Kuva 22. Kaavio ilmentämisvektorista pTCSgpt. Polyadeny-laatiokohta on peräisin hiiren IgG:n kappa-jakoista (NBRF nukleiinihappotietokanta, hakunumero Kcms, ep 1 306-1 714), Ad2 MLP ja kolmiosaiset alueet ovat Ad2-jaksosta (NBRF nukleiinihappotietokanta, hakunumero Gdad2, ep. 5 791—6 069, 30 SV40-varhainen promoottori on SV40-genomista (NBRF nukle-.. iinihappotietokanta, hakunumero GSV40W). gpt- ja ampisil- liinigeenit ja bakteerin replikaatioalkukohta ovat vektorista pSV2gpt (ATCC:n hakunumero 37 145).

35 Kuva 23. Vasta-aineaff initeettikromatograf isesti puhdiste- 17 106316 tun sCRl:n 4—20-%nen SDS-PAGE. Olosuhteet pelkistämättömät (kanavat 1, 2 ja 3) ja pelkistävät (kanavat 4, 5 ja 6).

Kanavat 1 ja 3: molekyylipainomarkkerit, kanavat 3 ja 5: * lähtömateriaalina oleva soluviljelmäsupernatantti, kanavat 5 4 ja 6: sCRl, joka on puhdistettu vasta-aineaffiniteetti- ·1 kromatograf iällä.

Kuva 24. Eluutioprofiili kationinvaihto-HPLC:stä. Eluoitu-vaa proteiinia monitoroitiin absorbanssin suhteen 280 10 nm:ssä (y-akseli). Sekä läpimenevä materiaali (0—100 minuuttia) että eluoitunut sCRl) (150—165minuuttia) antoivat kumpikin yli käytetyn asteikon menevän vasteen. X-akseli edustaa eluutioaikaa minuutteina.

15 Kuva 25. 4—20-%:sessa gradientissa tehty SDS-PAGE katio nin- ja anioninvaihto-HPLC:llä puhdistetusta sCRlrstä. Ajo SDS-polyakryyliamidigeelissä suoritettiin pelkistämättömis-sä olosuhteissa. Kanava 1, näyte bioreaktorisupernatantis-ta, kanava 2, näyte bioreaktorisupernatantista, joka dia-20 lysoitiin kationinvaihto-HPLC:n lähtöpuskuria vastaan, kanava 3, näyte kationinvaihto-HPLC -pylväästä saadusta elu-oituneesta sCRl-piikistä, kanava 4, näyte kationinvaihto-HPLC -pylväästä saadusta eluoituneesta sCRl-piikistä, joka dialysoitiin anioninvaihto-HPLC:n lähtöpuskuria vastaan, ;; 25 kanavat 5 ja 6, näytteet anioninvaihto-HPLC:stä eluoituneen sCRl:n eri fraktioista.

Kuva 26. C5a:n aiheuttama happipurkaus ihmisen neutrofii-leissä. C5a:n aiheuttaman happipurkauksen jälkeen DCFDA

* 30 hapettui ja muuttui voimakkaasti fluoresoivaksi. Virtaussy- tometrimittauksilla saatu fluoresenssin intensiteetti on • i r esitetty x-akselilla ja solujen määrät y-akselilla. Panee li a, profiili ja portti soluille, paneeli b, 0 minuuttia C5a-lisäyksestä, paneeli c, 1 minuutti, paneeli d, 2 mi-35 nuuttia, paneeli e, 3 minuuttia, paneeli f, 4 minuuttia, is 106316 paneeli g, 20 minuuttia. Tällä DCFDA-määrityksellä saadaan C5a:n esiintyminen osoitetuksi herkästi.

Kuva 27. Ihmisen komplementin aktivaatio sCRl:n läsnäol-5 lessa osoittaa alentunutta C5a-aktiivisuutta DCFDA-määri- tyksessä. Paneeli a, stimuloimattomat solut, paneeli b, * ilman sCRl:tä suoritettu kontrolli, joka osoittaa korkeanasteista fluoresenssia, paneeli c, sCRl:n läsnäollessa suoritettu DCFDA-määritys, joka osoittaa 75-%:sen vähenemisen 10 fluoresenssin intensiteetissä.

Kuva 28. sCRl:n aikaansaama klassisen reaktiotien kautta tapahtuvan C5a:n ja C3a:n tuotannon inhibitio ihmisen seerumissa. Samanlaiset profiilit havaittiin joko vasta-aine-15 affiniteettikromatografiällä puhdistetulla tai HPLC:llä puhdistetulla sCRl:llä.

Kuva 29. Komplementin välittämän hemolyysin inhibitio yh-distelmä-sCRl:llä. Vasta-aineaffiniteettikromatografiällä 20 puhdistetulla tai HPLC:llä puhdistetulla sCRlrllä havait tiin samanlaiset profiilit.

Kuva 30. RPAR:n yleiset morfologiset piirteet sCRl:llä käsitellyillä (vasemmalla) ja käsittelemättömillä (oikealla) 25 rotilla. Molemmat rotat saivat ovalbumiinia suonen sisäisenä ruiskeena, jonka jälkeen annettiin ihonsisäinen ruiske seosta, joka koostui joko sCRl:stä (vasen rotta) tai PBSrstä (oikea rotta), jossa oli mukana laimentamatonta ovalbumiinia vastaan valmistettua vasta-ainetta (vasen an-30 tokohta), suhteessa 1/2 laimennettua ovalbumiinia vastaan valmistettua vasta-ainetta (keskimmäinen antokohta) tai kaniinin IgG:tä (oikea antokohta). Ruiskeiden anto suoritettiin rinnakkaisruiskeina ja ylä- ja alariveistä saatiin identtiset tulokset. Rotilla, jotka saivat sCRl:tä, esiin-35 tyi juuri näkyviä muutoksia, kun taas käsittelemättömiin 19 106316 rottiin kehittyivät täysimittaiset RPARrn oireet, (b) ihon pinta (a):sta saaduissa ihobiopsioissa. Käsittelemättömästä rotasta (oikealla) otetussa biopsiassa nähtiin kehittyneen selvästi havaittava vaurio, kun taas sCRlrllä käsitellyn 5 rotan (vasemmalla) biopsiassa esiintyivät normaalit morfologiset piirteet.

Kuva 31. Valomikroskooppinen analyysi sCRlrllä käsitellyistä (a) ja käsittelemätömistä (b) rotista otetuista iho-10 biopsioista. (a) Havaittiin polymorfonukleaaristen ja mo-nonukleaaristen solujen kerääntymistä verisuonten ympärille, mutta ei lainkaan laajamittaista neutrofiilien keräytymistä tai erytrosyyttien pääsyä verisuonten ulkopuolelle, (b) Havaittiin laajamittaista polymorfonukleaarisolujen 15 keräytymistä ja erytrosyyttien joutumista verisuonten ulkopuolelle.

5 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tämä keksintö liittyy C3b/C4b-reseptori (CR1) -geeniin ja 20 sen koodaamiin proteiineihin. Tämä keksintö liittyy myös CRl:n nukleiinihappojaksoihin ja näiden fragmentteihin, jotka käsittävät 70 nukleotidiä ja niiden koodaamiin pep-tideihin tai proteiineihin, jotka käsittävät 24 aminohappoa. Tämä keksintö mahdollistaa CRl-proteiinin ja sen frag-25 menttien ilmentämisen. Näillä CR1-jaksoilla ja proteiineilla on käyttöä sellaisessa diagnoosien teossa ja hoidossa, joka koskee tulehdussairauksia tai immuunijärjestelmän sairauksia tai sairauksia, joihin liittyy komplementtiaktiivi-suutta.

» 30

Yksi tämän keksinnön erityinen sovellutusmuoto liittyy liu-t " koisiin CRl-molekyyleihin ja niiden ilmentämiseen, puhdis tukseen ja käyttömuotoihin. Tässä patenttihakemusjulkaisussa termiä "liukoiset CRl-molekyylit" käytetään tarkoitta-35 maan CRl-proteiinin sellaisia osia, jotka natiiveista CRl- 20 1 0 6 3 1 6 proteiineista poiketen eivät ilmenny solun pinnassa kalvo-proteiineina. Erityisenä esimerkkinä tästä on se, että CR1-molekyylit, jotka ovat oleellisesti vaillinaisia kalvon läpäisevän alueen suhteen, ovat liukoisia CRl-molekyylejä.

5 Yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa liukoisia CRl-molekyylejä erittää solu, jossa niitä ilmennetään. * Tämän keksinnön mukaisissa erityisissä sovellutusmuodoissa, jotka käsitellään yksityiskohtaisesti esimerkit sisältäväs-10 sä jaksossa, kuvataan täyspitkän CRl-cDNA:n ja sen fragmenttien kloonaus ja täydelliset nukleotidi jaksot ja' näistä johdetut aminohappojaksot ja CRl:n koodaamien tuotteiden ilmentäminen. Kuvataan myös CRl:n ja sellaisten sen fragmenttien ilmentäminen, joissa on C3b:n ja/tai C4b:n sitomi-15 seen tarvittavat kohdat ja jotka inhiboivat tekijän 1 ko-faktoriaktiivisuutta. Tämän keksinnön valaisemiseksi esitetään vielä liukoisten ja lyhennettyjen CRl-molekyylien tuotto ja puhdistus. Näiden molekyylien osoitetaan erityisissä esimerkeissä olevan terapeuttisesti käyttökelpoisia 20 tulehduksen rajoittamiseen ja sydäninfarktin koon vähentämiseen ja ehkäisemään perfuusion palautumisvaurioita.

5.1 CRl-geenin eristys CRl-geenin täydellinen koodaava jakso ja siitä johdettu 25 aminohappojakso on esitetty kuvassa 1.

Mikä tahansa ihmisen soluista voi potentiaalisesti toimia nukleiinihappolähteenä CRl-geenin molekulaarisessa kloonauksessa. CRl-geenin eristykseen kuuluu niiden DNA-jak-30 sojen eristys, jotka koodaavat proteiinia, jossa ilmenee CRl:een liittyvä rakenteellinen piirre tai siihen liittyvät ominaisuudet, esim. C3b:n tai C4b:n tai immuunikompleksien sitominen, fagosytoosin modulointi, immuunijärjestelmän stimulaatio tai sen solujen lisääntymisen edistäminen ja 35 komplementin säätely. DNA voidaan saada tällä alalla tunne- 2i 106316 tuilla vakiomenetelmiä käyttäen kloonatusta DNA:sta (esim. DNA-"kirjastosta"), kemiallisella synteesillä, cDNA-kloo-nauksella tai halutusta ihmisen solusta puhdistetun geno-, min DNA:n tai sen fragmenttien kloonauksella. (Ks. esimer- 5 kiksi Maniatis, et ai. (1982) Molecular Cloning, A s Laboratory Manual, Cold Sprong Harbor Laboratory, Cold

Spring Harbor, New York; Glover, D.M., (toim.) (1985) DNA-cloning: A practical Approach, MRL Press, LTD., Oxford, U.K. Osat I ja II) . Soluihin, jotka voivat toimia nuk-10 leiinihappolähteenä CRl-geenin cDNA-kloonauksessa, kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, monosyytit/mak-rofagit, granulosyytit, B-solut, T-solut, pernan imukeräs-ten dendriittisolut ja munuaiskeräsen podosyyttisolut. Ge-nomista johdetut solut voivat koodaavien alueiden lisäksi 15 sisältää säätely- ja introni-DNA-alueita, cDNArsta johdetut kloonit taas sisältävät ainoastaan eksonijaksoja. CRl-geeni tulee kloonata molekulaarisesti sopivaan vektoriin geenin lisäämiseksi riippumatta siitä, mitä lähdettä on käytetty.

20 Genomin DNA:sta tehtävässä geenin molekulaarisessa klonauk-sessa muodostetaan DNA-fragmentteja, joista jotkin koodaa-vat haluttua CRl-geeniä. DNA voidaan pilkkoa tietyistä kohdista useita eri restriktioentsyymejä käyttäen. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää DNaasia mangaanin läsnäollessa 25 DNA:n pilkkomiseksi osiin, tai DNA voidaan hajottaa fysikaalisesti, kuten esimerkiksi ultraäänikäsittelyllä. Lineaariset DNA-fragmentit voidaan sitten erottaa koon mukaan vakiomenetelmillä, joihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, agaroosi- ja polyakryyliamidigeelielektrofo-r 30 reesi ja pylväskromatografia.

> Kun DNA-fragmentit on muodostettu, voidaan nimenomaisesti CRl-geenin sisältävien DNA-fragmenttien tunnistus suorittaa useilla tavoilla. Jos on saatavissa pääosa CRl-geenistä tai 35 sille spesifisestä RNA:sta, tai näiden fragmentti, ja tämä « 22 1 0 6 3 1 6 voidaan puhdistaa ja leimata, muodostuneet DNA-fragmentit voidaan seuloa nukleiinihappohybridisoinnilla leimattuun koettimeen (Benton, W., ja Davis, R., (1977) Science 196, 180, Grunstein, M. ja Hogness, D., (1975) Proc. Natl. Acad.

5 Sei. U.S.A. 72, 3961). Tässä hybridisoituvat vain ne DNA-fragmentit, jotka ovat huomattavan homologisia koettimen suhteen. Jos saatavilla ei ole puhdistettua CRl-spesifistä koetinta, CRl:n suhteen rikastettuja nukleiinihappoja voidaan käyttää koettimina alkuun käytettävässä valikointi-10 menetelmässä. Tästä esimerkkinä on se, että voidaan käyttää B-solun cDNA:ta edustavaa koetinta, josta on poistettu fib-roblastien ilmentämät lähetit. On myös mahdollista tunnistaa asianmukainen fragmentti pilkkomalla se restriktioent-syym(e)illä ja vertaamalla fragmenttien kokoja odotettui-15 hin, tunnetun restriktiokartan mukaisiin fragmentteihin, jos tällainen kartta on käytettävissä. Alkuun suoritetun selektion lisäksi voidaan käyttää muunlaisia selektioita, jotka perustuvat tämän geenin ominaisuuksiin tai sen ilmentämän tuotteen fysikaalisiin, kemiallisiin tai immunolo-20 gisiin ominaisuuksiin myöhemmin esitettävien kuvausten mukaisesti .

CRl-geeni voidaan myös tunnistaa nukleiinihappohybridisoinnilla tapahtuvalla mRNA:n selektiolla, jonka jälkeen suori-25 tetaan in vitro -translaatio. Tässä menetelmässä käytetään fragmentteja komplementaaristen mRNA-molekyylien eristämiseksi hybridisoinnin avulla. Nämä DNA-molekyylit voivat edustaa saatavissa olevaa puhdistettua CRl-DNA:ta tai DNA:ta, joka on rikastettu CRl-jaksojen suhteen. Eristetty-30 jen mRNA-molekyylien in vitro -translaatiotuotteille suoritetulla immuunisaostusanalyysilla tai toiminnallisilla määrityksillä (esim. C3b:n tai C4b:n sitominen, fagosytoosi-toiminnan edistäminen, immuunijärjestelmän stimulointi tai komplementin säätely jne.) tunnistetaan kyseinen mRNA ja 35 tätä kautta ne komplementaariset DNA-fragmentit, jotka si- 23 106316 sältävät CR1-jaksoja. Spesifisiä mRNA-molekyylejä voidaan lisäksi valikoida adsorboimalla soluista eristetyt polyso-mit immobilisoitujen, spesifisesti CRl:tä vastaan suunnattujen vasta-aineiden pintaan. Radioaktiivisesti leimattu 5 mRNA tai cDNA voidaan syntetisoida käyttäen valikoitua ' mRNA-molekyyliä templaattina. Radioaktiivisella leimalla varustettua mRNA:ta tai cDNA:ta voidaan sitten käyttää koettimena CRl-DNA-fragmenttien tunnistamiseksi muidenb genomin DNA-fragmenttien joukosta.

10

Genomin CRl-DNA:n eristämisvaihtoehtoihin kuuluu,' tähän kuitenkaan rajoittumatta, se, että tämä geenijakso syntetisoidaan tunnetusta jaksosta kemiallisesti tai että tehdään CRl-geeniä koodaavaa mRNA vastaava cDNA. Kuten edellä 15 kuvattiin, voidaan esimerkiksi CRl-geenin cDNA-kloonaukseen tarkoitettu RNA eristää soluista, joihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, monosyytit/makrofagit, granulosyytit, B-solut, T-solut, dendriittisolut, ja podo-syyttisolut. Edullisessa sovellutusmuodossa cDNA-kloonauk-20 seen tarkoitettuna mRNA-lähteenä voivat olla nielurisojen solut (ks. myöhempänä oleva kappale 6.1.2). Myös muut menetelmät ovat mahdollisia ja nämä kuuluvat tämän keksinnön suojapiiriin.

·* 25 Tunnistettu ja eristetty geeni voidaan sitten liittää sopi vaan kloonausvektoriin. Voidaan käyttää suurta määrää tällä alalla tunnettuja vektori-isäntäsysteemejä. Mahdollisiin vektoreihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, plasmidit tai modifioidut virukset, mutta vektorisys-* 30 teemin täytyy olla yhteensopiva käytetyn isäntäsolun kans sa. Näihin vektoreihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan ' rajoittumatta, bakteriofagit, kuten lambda-johdannaiset, tai plasmidit, kuten pBR322, pUC-plasmidi tai CDM8-plasmidi (Seed, B., (1987) Nature 329, 840—842) tai näiden johdan- 35 naiset. Yhdistelmämolekyylit voidaan tuoda isäntäsoluihin 24 106316 transformaatiolla, transfektiolla, infektoimalla, elektro-poraatiolla jne.

Vaihtoehtoisessa "haulikkoammuntaperiaatetta" käyttävässä 5 menetelmässä voidaan CRl-geeni tunnistaa ja eristää sopivaan kloonausvektoriin tehdyn liittämisen jälkeen. CRl-gee- * nin rikastus, joka tapahtuu esimerkiksi koon mukaan suoritetulla fraktioinnilla, voidaan suorittaa ennen kloonausvektoriin liittämistä.

10 CRl-geeni liitetään kloonausvektoriin, jota voidaan käyttää sopivien isäntäsolujen transformointiin, transfektointiin tai infektointiin ja tämän avulla saadaan geenijaksoista useita kopioita. Yhdessä erityisessä sovellutusesimerkissä 15 tämä kloonausvektori voi olla CDM8-vektori, jota voidaan käyttää ilmentämisen suorittamiseksi nisäkässolussa. Liittäminen kloonausvektoriin voidaan suorittaa esimerkiksi liittämällä DNA-fragmentti ligaasireaktiota käyttäen kloonausvektoriin, jossa on komplementaariset kohesiiviset 20 päät. Jos kloonausvektorissa ei kuitenkaan esiinny DNA:n pilkkomisessa käytetyille restriktiokohdille komplementaarisia kohtia, voidaan DNA-molekyylien päät muokata entsymaattisesti. Vaihtoehtoisesti voidaan valmistaa mikä tahansa kohta liittämällä DNA:n päihin nukleotidijaksoja (kytki-25 jäjaksoja); nämä liitetyt kytkijäjaksot voivat käsittää kemiallisesti syntetisoituja oligonukleotideja, jotka koo-daavat restriktioendonukleaasien tunnistuskohtia. Vaihtoehtoisessa menetelmässä voidaan katkaistu vektori ja CRl-geeni muokata käyttäen homopolymeerisiä jatkeita.

30

Kloonatun CRl-geenin tunnistaminen voidaan suorittaa useil- • · la eri tavoilla, jotka perustuvat tämän DNA:n ominaisuuksiin tai sen koodaaman proteiinin fysikaalisiin, immunologisiin tai toiminnallisiin ominaisuuksiin. DNA sinänsä voi-35 daan havaita leimattuihin koettimiin suoritettavalla nukle- « 25 106316 iinihappojen plakki- tai pesäkehybridisoinnilla (Benton, W., ja Davis, R., (1977) Science 196, 180, Grunstein, M.

ja Hogness, D., (1975) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72, * 3961). Vaihtoehtoisesti voidaan CRl-geenin esiintyminen 5 havaita määrityksillä, jotka perustuvat sen ilmentämän * tuotteen ominaisuuksiin. Voidaan esimerkiksi valita sellaista proteiinia tuottavia cDNA-klooneja, tai DNA-klooneja, jotka hybridisoitumisen avulla valikoivat asianmukaisia mRNA-molekyylejä, joilla on esimerkiksi samanlai- 10 nen tai identtinen elektroforeettinen liikkuvuus, isoelekt-risessä fokusoinnissa esiintyvä käyttäytyminen, proteolyyt-tisessä pilkkoutumisessa saatavat pilkkoutumiskartat, C3b:n ja/tai C4b:n ja/tai immuunikompleksien sitomisaktivisuus, komplementtia säätelevä aktiivisuus, vaikutukset, jotka 15 ilmenevät fagosytoosissa tai immuunijärjestelmän stimoloi-tumisessa tai antigeeniset ominaisuudet, jotka tiedetään kuuluvan CRlille. CRl-proteiini voidaan tunnistaa CRl:tä vastaan valmistetulla vasta-aineella sen perusteella, että leimattu vasta-aine sitoutuu ehdokkaina oleviin CRl:tä syn-20 tetisoiviin klooneihin ELISA (entsyymivälitteinen immuuni- sorbenttimääritys) -tyypisessä määrityksessä.

Erityisissä sovellutusesimerkeissä mahdollistaa CRl-geenin useiden kopioiden muodostamisen se, että isäntäsolut trans-;· 25 formoidaan yhdistelmä-DNA-molekyyleilla, joihin on liitetty eristetty CRl-geeni, cDNA tai syntetisoitu DNA-jakso. Geeniä voidaan siten saada suuria määriä kasvattamalla trans-formantteja, eristämällä transformanteista yhdistelmä-DNA-molekyylit ja poistamalla tarvittaessa liitetty geeni yh- » 30 distelmä-DNA:sta.

' Yhdessä nimenomaisessa sovellutusesimerkissä CDM8-vekto- rissa olevat CRl-cDNA-kloonit voidaan transfektoida COS (apinan munuais-) -soluihin ilmentämisen suorittamiseksi 35 suuressa mittakaavaisessa sytomegaloviruksen promoottorin 26 1 0 6 3 1 6 ohjaamana (ks. myöh. kappale 8).

Jos lopullisena päämääränä on geenin liittäminen virusil-mentämisvektoreihin, kuten vacciniavirus- tai adenovirus-5 vektoreihin, voidaan CRl-geenin sisältävä yhdistelmä-DNA-molekyyli muokata siten, että geenin molemmilla puolilla on virusjaksoja, joiden avulla geneettinen rekombinaatio geenin liittämiseksi viruksen genomiin viruksen infektoimissa soluissa on mahdollista.

10

Sitten kun CRl-DNA:ta sisältävä klooni on tunnistetta, kasvatettu ja otettu talteen, siihen liitetty DNA voidaan luonnehtia jäljempänä kappaleessa 5.4.1 kuvatulla tavalla.

15 Kun CRl-geenin geneettinen rakenne on tunnettu, tätä rakennetta voidaan käsitellä sen optimaalista käyttöä varten tässä keksinnössä. Promoottori-DNA voidaan esimerkiksi liittää ligaasia käyttäen CRlrtä koodaavan jakson 5'-puolelle natiivin promoottorin lisäksi tai tämän korvaten, 20 jotta proteiinin ilmentämistä voitaisiin nostaa. Voidaan myös valmistaa CRl-deleetiomutantteja ilmentäviä ilmentä-misvektoreita, jotta CRl-jakson rajattujen fragmenttien ilmentäminen kävisi mahdolliseksi (ks. myöhempänä olevat esimerkkejä käsittelevät kappaleet). Yhdessä erityisessä 25 sovellutusesimerkissä voidaan valmistaa deleetiomutantteja, jotka koodaavat niitä CRl-proteiinin fragmentteja, joissa esiintyy haluttu C3b:tä ja/tai C4b:tä sitova aktiivisuus (ks. myöh. kappale 9) , esim. LHR-A C4b:n sitomiseksi ja LHR-B C3b:n sitomiseksi. Edullisessa sovellutusesimerkissä 30 voidaan liukoisen CRl-molekyylin tuottamiseksi käyttää il- mentämisvektoria, joka koodaa kalvon läpäisevän alueen kä- • · sittävän deleetion sisältävää CRl-molekyyliä (ks. myöh. esimerkkeihin sisältyvät kappaleet 11—14) . On mahdollista käyttää useanlaisia muokkaustapoja ja nämä kuuluvat tämän 35 keksinnön suojapiiriin.

« 106316 5.2 Kloonatun CRl-geenin ilmentäminen CRl-proteiinia koodaava nukleotidijakso (kuva 1) tai sen osa voidaan liittää sopivaan ilmentämisvektoriin, ts. vek-5 toriin, joka sisältää tarpeelliset rakenneyksiköt liitetyn . proteiinia koodaavan jakson transkriptiota ja translaatiota varten. Tarvittavat transkriptio- ja translaatiosignaalit voidaan myös saada natiivista CRl-geenistä ja/tai sen viereisiltä alueilta. Proteiinia koodaavan jakson ilmentämi-10 seen voidaan käyttää useita eri isäntä-vektori -järjestelmiä. Näihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, viruksella infektoidut nisäkässolusysteemit (esim. vac-ciniavirus, adenovirus jne.), viruksella infektoidut hyön-teissolujärjestelmät (esim. baculovirus) ja mikro-organis-15 mit, kuten hiivavektoreita sisältävät hiivat tai bakterio-faagien, plasmidien tai kosmidien DNA:11a transformoidut bakteerit. Näiden vektorien ilmentämiseen liittyvät rakenneyksiköt eroavat toisistaan vahvuuksiensa ja spesifisyyk-sientä suhteen. Käytetyn isäntä-vektorijärjestelmän mukai-20 sesti voidaan käyttää mitä tahansa monista sopivista transkription ja translaation rakenneyksiköistä. Esimerkiksi nisäkässolusysteemeissä kloonattaessa voidaan käyttää nisä-kässolujen genomista tai näissä soluissa kasvavista viruksista (esim. adenovirus, simian virus 40 tai sytomegalovi-; 25 rus) eristettyjä promoottoreja. Voidaan myös käyttää yhdis- telmä-DNA-tekniikoilla tai synteettisillä menetelmillä valmistettuja promoottoreja liitettyjen jaksojen transkription aikaansaamiseksi.

» 30 Tarvitaan myös spesifisiä aloitussignaaleja liitettyjen proteiineja koodaavien jaksojen tehokasta translaatiota ' varten. Näihin signaaleihin kuuluvat ATG-aloituskodoni ja sen viereiset jaksot. Niissä tapauksissa, joissa sopiviin ilmentämisvektoreihin liitetään koko CRl-geeni oma aloi-35 tuskodoninsa ja sen viereiset jaksot mukaanluettuna, voi » 28 1 0 6 3 1 6 olla tarpeetonta käyttää muita translaation ohjaussignaaleja. Kuitenkin niissä tapauksissa, joissa liitetään vain osa CRl:tä koodaavasta jaksosta, on tarjottava käyttöön ulkopuolisia translaation ohjaussignaaleja, ATG-aloituskodoni 5 mukaanlukien. Aloituskodonin on lisäksi oltava proteiineja koodavien jaksojen suhteen oikeassa lukukehyksessä, jotta f voitaisiin varmistua koko liitetyn jakson osallistumisesta translaatioon. Nämä ulkopuoliset translaation ohjaussignaalit ja aloituskodonit voivat olla alkuperältään vaihtelevia 10 ja olla sekä luonnosta peräisin olevia että synteettisiä.

Mitä tahansa edellä kuvattua menetelmää DNA-fragmenttien liittämiseksi vektoriin voidaan käyttää sellaisen kimeeri-sen geenin sisältävien ilmentämisvektoreiden valmistamisek-15 si, joka muodostuu asianmukaisista transkription/translaa-tion ohjaussignaaleista ja proteiinia koodaavista jaksoista. Näihin menetelmiin voi kuulua in vitro -yhdistelmä-DNA-tekniikat ja synteettiset menetelmät ja in vivo -rekombi-naatiot (geneettinen rekombinaatio).

20

Yhdessä erityisessä sovellutusesimerkissä voidaan ilmentää liukoista CRl-molekyyliä. Tämä liukoinen molekyyli voidaan tuottaa käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikoita kalvon läpäisevää aluetta koodaavan alueen poistamiseksi CRl:n jak-25 sosta (ks. myöh. kappaleet 11—14). Kuten jäljempänä osoi- « taan, kyky liukoisen CRl-molekyylin ilmentämiseen ei rajoitu mihinkään CRl:n nukleiinihappojakson geneettisistä modifikaatioista; mikäli olennainen osa CRl:n kalvon läpäisevää osaa koodaavasta nukleiinihappojaksosta on poistettu, voi-30 daan saada liukoisia CRl-konstruktioita.

Liitetyn CRl-geenin sisältävät ilmentämisvektorit voidaan tunnistaa kolmella yleisellä lähestymistavalla: (a) DNA- DNA-hybridisoinnilla, (b) "markkeri,,geenitoimintojen esiin-35 tyminen tai puuttuminen ja (c) liitettyjen jaksojen ilmen- 29 1 0 6 3 1 6 tautinen. Ensimmäisessä lähestymistavassa ilmentämisvekto-riin liitetyn vieraan geenin läsnäolo voidaan havaita DNA-DNA-hybridisoinnilla käyttäen koettimia, jotka käsittävät * liitetyn CRl-geenin suhteen homologisia jaksoja. Toisessa 5 lähestymistavassa vektori/isäntä -yhdistelmäjärjestelmä » voidaan tunnistaa ja valikoida esiin tiettyjen "markkeri"- geenitoimintojen (esim. tymidiinikinaasiaktiivisuus, resistenssi antibiootteja vastaan, transformaatiofenotyyppi, okkluusiokappaleen muodostuminen baculovirus-systeemissä) 10 perusteella, jotka aiheutuvat siitä, että vektoriin on liitetty vieraita geenejä. Jos CRl-geeni liitetään esimerkiksi vektorin markkerigeenijaksoon, voidaan liittyneen CRl:n sisältävät rekombinantit tunnistaa markkerigeenin toiminnan puuttumisen perusteella. Kolmannessa lähestymistavassa yh-15 distelmäilmentämisvektorit voidaan tunnistaa määrittämällä rekombinantin ilmentämä vieraan geenin tuote. Nämä määritykset voivat perustua geenituotteen fysikaalisiin, immunologisiin tai toiminnallisiin ominaisuuksiin.

20 Kun erityinen yhdistelmä-DNA-molekyyli on tunnistettu ja eristetty, voidaan käyttää useita tällä alalla tunnettuja keinoja sen lisäämiseksi. Kun sopiva isäntäjärjestelmä ja kasvatusolosuhteet on vakiinnutettu, voidaan ilmentämisvek-toreita lisätä ja valmistaa suuria määriä.

25

Erityisessä sovellutusesimerkissä, joka esitetään yksityiskohtaisesti tämän keksinnön mukaisissa esimerkeissä, voidaan liitetyn CRl-cDNA:n sisältäviä CDM8-vektoreita trans-fektoida COS-soluihin, joissa liittynyt CRl-cDNA ilmentyy * 30 ja tuottaa CRl-proteiinia. Muissa erityisissä sovellutus- *· esimerkeissä, jotka esitetään yksityiskohtaisesti esimerk- r kikappaleissa, voidaan CDM8-vektoreita, joihin on liitetty CRl:tä koodaavan alueen osaa vastaava CRl-cDNA, transfek-toida COS-soluihin, joissa CRl tai sen fragmentti ilmentyy. 35 Käyttämällä vielä yhtä esimerkkiä (ks. jäljempänä) voidaan 30 106316 lyhennettyjä ja liukoisia CRl-molekyylejä ilmentää nisäkäs-soluissa käyttämällä ilmentämisvektoreita, kuten kappaleessa 11.3.1 kuvattuja pTCS-vektoreita. Kuten edellä on selitetty, kuuluvat ilmentämisvektoreihin, joita voidaan käyt-5 tää, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, seuraavat vektorit ja niiden johdannaiset: ihmis- tai eläinvirukset, ? kuten vacciniavirus tai adenovirus, hyönteisvirukset, kuten baculovirus, hiivavektorit, bakteriofaagivektorit (esim. lambda) ja plasmidi- ja kosmidivektorit joidenkin esimerkit) kien mainitsemiseksi.

Voidaan lisäksi valita isäntäsolukanta, joka moduloi liitettyjen jaksojen ilmentymistä tai modifioi ja muokkaa ki-meeristä geenituotetta tietyllä halutulla tavalla. Tietyis-15 tä promoottoreista tehty ilmentäminen voidaan kohottaa tiettyjen indusorien läsnäollessa ja geneettisesti muokatun CRl-proteiinin ilmentämistä voidaan näinollen säädellä. Eri isäntäsoluilla on lisäksi luonteenomaisia ja spesifisiä mekanismeja proteiinien translaation aikaiseen ja translaa-20 tion jälkeen tapahtuvaa muokkausta varten. Sopivat solulin- jat tai isäntäsysteemit voidaan valita sen varmistamiseksi, että ilmennetty heterologinen proteiini modifioituu ja muokkautuu halutulla tavalla. Yhdessä sovellutusmuodossa voidaan esimerkiksi käyttää ilmentämistä bakteerisysteemis-25 sä sellaisen glykosyloimattoman CRl-proteiinin tuottamiseksi, jolla on kuvan 1 mukainen aminohappojakso. Hiivassa suoritettu ilmentäminen tuottaa glykosyloidun tuotteen. Toisessa sovellutusesimerkissä voidaan käyttää COS-nisäkäs-soluja heterologisen CRl-proteiinin natiivin glykosyloitu-30 misen varmistamiseksi. Eri vektori/isäntä järjestelmissä voi lisäksi tapahtua prosessointireaktioita, kuten eriasteisia proteolyyttisiä pilkkoutumisia. Voidaan tuottaa useita tällaisia eri tavoin prosessoituja CRl-proteiineja, jotka myös kuuluvat tämän keksinnön suojapiiriin.

35 “ 1G6316 Tämän keksinnön mukaisessa edullisessa sovellutusmuodossa liukoisten CRl-proteiinien suuressa mittakaavassa tapahtuva tuotanto voidaan suorittaa myöhempänä kohdassa 12.1 et seg. kuvatulla tavalla.

5 . 5.3 Ilmennetyn geenituotteen tunnistaminen ja puhdistus

Kun CRl-geeniä ilmentävä rekombinantti on tunnistettu, tulisi geenituote analysoida. Tämä voidaan suorittaa määrityksillä, jotka perustuvat tuotteen fysikaalisiin, immuno-10 logisiin tai toiminnallisiin ominaisuuksiin.

CRl-proteiinit voidaan eristää ja puhdistaa vakiomenetel-millä, joihin kuuluvat kromatografia (esim. ioninvaihto-, affiniteetti- ja koon mukaan vaikuttava pylväskromatografia 15 ja nestekromatografia), sentrifugointi, liukoisuuserojen käyttö, tai mikä tahansa muu proteiinien puhdistuksessa käytetty vakiomenetelmä.

Esimerkeissä yksityiskohdittain esitetyssä tämän keksinnön 20 mukaisessa edullisessa sovellutusmuodossa voidaan suuria määriä liukoista CRl-proteiinia puhdistaa menetelmillä, joihin liittyy HPLC:n käyttö (ks. kohta 12.2 et seg.). Kuten edellä kuvattiin, puhdistetun CRl:n tuotanto suuressa mittakaavassa voidaan suorittaa käyttämällä ilmentämissys-.. 25 teemiä, joka tuottaa liukoista CRl:tä lähtöaineena käytet täväksi, jolloin kalvoon sitoutuneen CRl:n solubilisointi detergenteillä jää tarpeettomana vaiheena pois. Sikiö-kautisen vasikan seerumipitoisuuden alentaminen bioreakto-riviljelmissä ja/tai vaihtoehtoisten kasvatusliuosten käyt-r 30 tö näissä viljelmissä poistaa tarpeen erottaa liukoista .. CRl:tä sisältävästä lähtömateriaalista suuria pitoisuuksia r ’ ylimääräisiä proteiineja myöhemmissä puhdistusvaiheissa.

Tässä edullisessa vaihtoehdossa on puhdistukseen edullista käyttää joko kationinvaihto-HPLC:tä tai kationinvaihto-35 HPLCrtä yhdistettynä sitä seuraavaan anioninvaihto- 32 1 0 6 3 1 6 HPLCrhen. Huomattavan puhdasta liukoista CRl:tä voidaan siten saada talteen ainoastaan yhtä tai kahta vaihetta käyttäen samalla kun saanto on korkea.

5 Toisena vaihtoehtona on se, että kun rekombinantin tuottama CRl-proteiini on tunnistettu, rekombinantin sisältämän ki-meerisen geenin nukleotidijärjestyksestä voidaan johtaa proteiinin aminohappojakso. Tästä seuraa se, että tämä proteiini voidaan syntetisoida tunnetuilla kemiallisilla valo kiomenetelmillä (esim. ks. Hunkapiller, M. et ai., (1984) Nature 310, 105—111) .

Erityisessä tämän keksinnön mukaisessa sovellutusmuodossa tällaisiin CRl-proteiineihin, huolimatta siitä, onko ne 15 tuotettu yhdistelmä-DNA-tekniikoilla vai synteettisillä kemiallisilla menetelmillä, kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, ne proteiinit, joihin sisältyy primäärinen aminohappojakso, joka on kokonaisuudessaan tai osittain olennaisesti kuvassa 1 esitetyn jakson mukainen ja 20 johon sisältyvät muunnetut jaksot, joissa tässä jaksossa olevat ryhmät on korvattu toiminnallisesti samanarvoisilla ryhmillä siten, että tuloksena on neutraali muutos. Säilyt-tämättömistä korvaamisista voi myös olla tuloksena toiminnallisesti samanarvoisia proteiineja.

25

Yhdessä sovellutusmuodossa voivat CRl-jaksossa olevia aminohappoa korvaavina ryhminä olla muita jäseniä siitä ryhmästä, johon aminohappo kuuluu. Esimerkiksi poolittomiin (hydrofobisiin) aminohappoihin kuuluvat alaniini, leusiini, 30 isoleusiini, väliini, proliini, fenyylialaniini, tryptofaa-ni ja metioniini. Polaarisiin neutraaleihin aminohappoihin kuuluvat glysiini, seriini, treoniini, kysteiini, tyrosii-ni, asparagiini ja glutamiini. Positiivisen varauksen omaaviin (emäksisiin) aminohappoihin kuuluvat arginiini, lysii-35 ni ja histidiini. Negatiivisen varauksen omaaviin (happa- 33 1 0 6 3 1 6 miin) aminohappoihin kuuluvat asparagiinihappo ja gluta-miinihappo. Tämä keksinnön suojapiiriin kuuluvat myös ne proteiinit, jotka modifioituvat eri tavoin translaation ϊ aikana tai tämän jälkeen, esimerkiksi glykosylaation tai 5 proteolyyttisen hajoamisen jne. vaikutuksesta.

*

Yhdessä jäljempänä yksityiskohtaisesti kuvattavassa tämän keksinnön mukaisessa esimerkissä transfektoitujen solujen ilmentämän kloonatun yhdistelmä-CRl:n osoitettiin olevan 10 sellainen, että sitä ei voitu erottaa erytrosyyttien F-al-lotyypistä SDS-PAGE:lla (kuva 14), sillä oli kyky välittää joko C4b:tä tai C3b:tä sisältävien lampaan erytrosyyttien sitoutumista, että CRl:n ligandispesifisyys pystyi siinä säilymään (kuva 13) ja että se osoitti C3(ma):n alfa-poly-15 peptidin pilkkomisena ilmenevää tekijän I kofaktoriaktiivi-suutta (kuva 13).

5.4 CRl-geenin ja -proteiinin rakenne CRl-geenin ja -proteiinin rakenne voidaan analysoida useil-20 la erilaisilla tunnetuilla menetelmillä, joihin kuuluvat seuraavassa kuvattavat menetelmät mutta jotka eivät rajoitu näihin.

5.4.1 Geneettinen analyysi .. 25 CRl-geeniä vastaava kloonattu DNA tai cDNA voidaan analy soida menetelmillä, joihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, Southern-hybridisointi (Southern, E.M. (1975) J. Mol. Biol. 98, 503—517), Northern-hybrisoisointi (ks. esim. Freeman, et ai., (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. , 30 U.S.A. 80, 4094—4098, restriktioendonukleaasikartoitus (Ma- niatis, T., (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual,

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) ja DNA-jakson analyysi. Southern- ja Northern-hybri-disoinneissa käytettyjen olosuhteiden rajoittavuutta voi-35 daan muokata sen varmistamiseksi, että niissä havaitaan ne 34 106316 nukleiinihapot, joiden läheisyys käytetyn spesifisen CR1-koettimen suhteen on haluttua suuruusluokkaa. Esimerkiksi lievästi rajoittavissa olosuhteissa suoritettua hybridi-sointia koettimella, joka sisältää LHR-B:tä ja LHR-C:tä 5 koodaavat CRl-geenijaksot, voidaan käyttää CR2-nukleiini-happojaksojen havaitsemiseen.

Restriktioendonukleaasikartoitusta voidaan käyttää CRl-gee-nin geneettisen rakenteen karkeaan määrittämiseen. Yhdessä 10 erityisessä sovellutusmuodossa voidaan restriktioentsyy-meillä suoritettua pilkkomista käyttää kuvassa 2 esitetyn restriktiokartan aikaansaamiseksi. Restriktioendonukleaa-seilla pilkkomisesta saadut restriktiokartat voidaan vahvistaa DNA:n jakson analysoinnilla.

15 DNA:n jakson analysointi voidaan suorittaa millä tahansa tunnetuista menetelmistä, joihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, Maxamin ja Gilbertin menetelmä ((1980) Meth. Enzymol. 65, 4 99—560) , Sangerin dideoksimene-20 telmä (Sanger, F., et ai., (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74, 5463) tai automaattisen DNA-sekvenointilaitteen käyttö (esim. Applied Biosystems, Foster City, CA) . CR1-geenin cDNA-jakso käsittää jakson, joka on olennaisesti kuvassa 1 esitetyn jakson mukainen ja joka on kuvattu kap-25 paleissa 6 ja 7.

5.4.2 Proteiinin analyysi CRl-proteiinin aminohappojakso voidaan johtaa päättelemällä tämä DNA-jaksosta tai vaihtoehtoisesti sekvenssoimalla pro-30 teiini suoraan automaattisella aminohappojen sekvenssointi- laitteella. Edustavana esimerkkinä oleva CRl-proteiinin aminohappojakso käsittää jakson, joka on olennaisesti kuvassa 1 esitetyn jakson mukainen ja joka on esitetty yksityiskohtaisesti kappaleessa 6. Kuten jäljempänä on kuvattu, 35 F-allotyyppiä olevan CRl:n koodaava jakso on kloonattu ko- > a 35 1 0 6 3 1 6 konaisuudessaan ja 41 aminohaposta koostuvan signaalijakson pilkkomisen jälkeen valmistunut reseptori sisälsi 1998 aminohappoa, mukaan lukien 1930 ryhmästä koostuvan solunulkoi-sen alueen, joka muodostaa 30 SCR:ää, joista 28 on organi-5 soitunut LHR-A-, -B-, -C- ja -D-alueiksi (kuva 10) , yhden „ kalvon läpäisevän 25 aminohappoa käsittävän alueen ja suh teellisen lyhyen 43 aminohappoa käsittävän sytoplasmassa olevan alueen.

10 Useita SCR-alueita sisältävien C3/C4:ää sitovien proteiinien joukossa CR1 on ainutlaatuinen siinä suhteessa, että siinä on LHR-alueiksi järjestyneitä SCR-alueiden ryhmiä. CRl:n neljän LHR:n vertailu osoittaa, että kukin näistä on tyyppiä a, b, c ja d olevien neljän tyyppisen SCR:n yhdis-15 telmä (kuva 19). Esimerkiksi LHR-A:n SCR-1 ja -2 -alueiden jaksot ovat vain 62 %, 62 % ja 57 % identtisiä LHR-B:n, -C:n ja -D:n kahden ensimmäisen SCR-alueen suhteen, tässä järjestyksessä mainittuna. Alueet SCR-3:sta SCR-7:ään eroavat LHR-B:n vastaavista SCR-alueista kuitenkin vain yhdessä 20 asemassa ja SCR-3 ja SCR-4 eroavat LHR-C:n vastaavista alueista vain kolmessa asemassa (kuva 10) . Siten jotkin LHR-A:n ”a"-tyyppiset SCR-alueet esiintyvät myös LHR-B:ssä ja -C:ssä. LHR-B:n kaksi ensimmäistä SCR-aluetta, jotka eroavat LHR-A:n vastaavista alueista, ovat 99 % identtisiä 25 näissä asemissa olevien LHR-C:n SCR-alueiden suhteen, joten "tyyppiä "b" olevat SCR-alueet ovat LHR-B- ja -C-alueiden yhteisenä piirteenä. LHR-C:n viides, kuudes ja seitsemäs SCR ovat vain 77 % identtisiä näissä asemissa olevien LHR-A- ja -B-alueiden "a"-tyypin SCR-alueiden suhteen ja 30 näiden katsotaan olevan "c"-tyyppisiä SCR-alueita. LHR-D:n SCR-alueet ensimmäisestä neljänteen ovat suhteellisen ai-, ’ nutlaatuisia ja ne ovat tyyppiä "d", kun taas SCR-alueet viidennestä seitsemänteen ovat noin 93 % identtisiä LCR-C:ssä olevien "c"-tyypin jaksojen kanssa.

35 36 1 0 6 3 1 6 CRl-proteiinin jaksoa voidaan lisäksi luonnehtia hydrofii-lisyysanalyysilla (Hopp, T. ja Woods, K., (1981) Proc.

Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78, 3824). Hydrofiilisyysprofiilia voidaan käyttää hydrofobisten ja hydrofiilisten alueiden 5 tunnistamiseen CRl-proteiinissa ja näitä alueita koodaavien geenijaksojen vastaavissa alueissa. CRl-proteiinin COOH-terminaalisen osan hydrofiilisyysprofiili on esitetty kuvassa 5.

10 Voidaan myös tehdä sekundaarirakenteen analyysi (Chou, P. ja Fasman, G., (1974) Biochemistry 13, 222) niiden alueiden ennustamiseksi, joissa CRlcllä on spesifisiä sekundaarira-kenteita.

15 Voidaan myös käyttää muita rakenneanalyysimenetelmiä. Näihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, rönt-gensädekristallografia (Engstom, A., (1974) Biochem. Exp.

Biol. 11, 7—13) ja tietokonemallitus (Fletterick, R. ja

Zoller, M. (toim.), (1986) Computer Graphics and Molecular 20 Modeling, teoksessa Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).

5.5 CRl:n läheiset johdannaiset, analogit ja peptidit 25 CRl:n läheisten johdannaisten, analogien ja peptidien tuo- % tanto ja käyttö muodostaa kuviteltavissa olevan mahdollisuuden ja näiden on tarkoitus kuulua tämän keksinnön suo-japiiriin. Näitä johdannaisia, analogeja ja peptidejä, joilla on halutut immunogeenisyys- tai antigeenisyysominai-30 suudet, voidaan käyttää esimerkiksi immuunimäärityksissä, ·· immunisointia varten, terapeuttisesti jne. Molekyylejä, >» joissa haluttu CRl:n ominaisuus on säilynyt tai jotka vaihtoehtoisesti inhiboivat kyseistä ominaisuutta, esim. C3b:n tai C4b:n sitoutumista, komplementtiaktiivisuuden säätelyä 35 tai immuunijärjestelmän stimulaation tai fagosytoositoimin- « 37 106316 nan vahvistumista jne, voidaan käyttää näiden ominaisuuksien indusoreina tai inhibiittoreina, tässä järjestyksessä mainittuna.

5 Tämän keksinnön mukaisia CRl:n läheisiä johdannaisia, analogeja tai peptidejä voidaan tuottaa useilla tunnetuilla menetelmillä. Näiden syntymiseen johtava muokkaus voi tapahtua geeni- tai proteiinitasolla. Kloonattu CRl-geeni voidaan esimerkiksi muuntaa millä tahansa tunnetuista 10 useista eri strategioista (Maniatis, T., (1982) Molecular

Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). CR1-jakso voidaan pilkkoa sopivista kohdista restriktioendonukleaas(e)ilia, jonka jälkeen suoritetaan haluttaessa muita entsymaattisia muun-15 noksia, eristää ja liittää ligaasin avulla in vitro (ks. kappale 8). Tuotettaessa CRl:n läheistä johdannaista, analogia tai peptidiä koodaavaa geeniä on pidettävä tarkoin huolta siitä, että muunnettu geeni pysyy samassa lukukehyksessä kuin CR1 ja että translaation lopetussignaalit eivät 20 keskeytä sitä sillä geenialueella, jossa haluttu CRl-spesi-finen aktiivisuus on koodattuna.

CRl-geeniin voidaan lisäksi haluttaessa aiheuttaa in vitro-tai in vivo -olosuhteissa mutaatioita, joilla luodaan 25 ja/tai hävitetään translaation aloitus- ja/tai lopetusjak-soja tai luodaan variaatioita koodaaville alueille ja/tai muodostetaan uusia tai hävitetään entisiä restriktioendo-nukleaasikohtia myöhempien in vitro -muokkausvaiheiden helpottamiseksi. Voidaan käyttää mitä tahansa tunnettua muta-, 30 geneesimenetelmää, joihin kuuluvat in vitro -kohdemuta- ” geneesi (Hutchison, C. et ai., (1978) J. Biol. Chem. 253, ·· ® 6551), TAB -kytkijäjaksojen (Pharmacia) käyttö jne.

CRl-jakson muokkaus voidaan suorittaa myös proteiinitasol-35 la. Voidaan suorittaa mikä tahansa useista kemiallisista I t 38 1 0 6 3 1 6 modifioinneista tunnetuilla menetelmillä, joihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, spesifinen kemiallinen pilkkominen syanogeenibromidilla, trypsiinillä, kymot-rypsiinillä, papaiinilla, V8-proteaasilla, NaBH4:llä, ase-5 tyloinnilla, formyloinnilla, hapetuksella, pelkistyksellä, metabolisella synteesillä tunikamysiinin läsnäollessa jne.

CRlrlle läheisiä analogeja ja peptidejä voidaan lisäksi syntetisoida kemiallisesti. Peptidisyntetisointilaitetta 10 käyttäen voidaan esimerkiksi syntetisoida peptidi, joka vastaa haluttua aktiivisuutta välittävää CRl:n osaa. (esim. C3b:n ja/tai C4b:n sitominen, immuunijärjestelmän stimuloiminen, komplementin säätely jne).

15 5.6 CRl:n käyttötavat 5.6.1 Määritykset ja diagnoosi CRl-proteiineilla, -analogeilla, -johdannaisilla ja näiden osana olevilla jaksoilla sekä CRlrtä vastaan valmistetuilla vasta-aineilla on käyttöä määrityksissä ja diagnostiikassa. 20 Tämän keksinnön mukaisia molekyylejä, joissa esiintyy haluttu CRl:n ominaisuus tai toiminto, voidaan käyttää tämän ominaisuuden tai toiminnon määritykseen. Esimerkiksi vapaana tai kompleksoituneissa muodoissa esiintyvän C3b:n ja/tai C4b:n sitomiskykyä osoittavia CRl-proteiineja tai näiden 25 fragmentteja voidaan käyttää määrityksissä mittaamaan näi- • · den aineiden määrä näytteessä, esim. potilaan ruumiinnesteessä.

Erityisessä sovellutusmuodossa voidaan näytteessä olevien 30 C3b-, iC3b- tai C4b-tasoja mittaavissa määrityksissä käyt tää täysimittaista CRlrtä tai solun pinnalla ilmennettyä CRlrn deleetiomutanttia (esim. sellaisia mutantteja, jotka on kuvattu kappaleessa 8) , joilla on kyky sitoa C3b:tä (ks. esim. taulukko 2, kappale 9), iC3b:tä tai C4b:tä (ks. esim. 35 taulukko 2), tässä järjestyksessä mainittuna. Toisessa so- 39 106316 vellutusmuodossa voidaan käyttää CRl-proteiinia tai sen fragmenttia, joka on konstruoitu yhdistelmä-DNA-tekniikalla siten, että siitä puuttuu kalvon läpäisevä jakso ja joka siten erittyy solusta.

5 * Yhdessä erityisessä sovellutusmuodossa tällainen C3b:n ja/tai C4b:n mittaus voi kuvata luotettavalla tavalla komplement-tiaktiivisuutta ja tämä voi olla käyttökelpoinen tulehdus- ja immuunijärjestelmän sairauksien diagnoosissa. Näihin sairauk-10 siin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, kudosvaurio, joka johtuu palon tai sydäninfarktin aiheuttamasta traumasta, aikuisiän hengityssyndrooma (shokkikeuhko), autoimmuunisairaudet, kuten nivelreuma, systeeminen punahukka ja muut taudit tai sairaudet, joihin liittyy haitallinen tai 15 sopimaton kömpiementtiaktiivisuus (ks. esim. Miesher, P.A. ja Muller-Eberhard, H.J. (toim.), (1976) Text Book of Immunopat-hology, 2. painos Osat I ja II, Grune ja Stratton, New York, Sandberg, A.L., (1981) teoksessa Cellular Functions in Immu nity and Inflammation, Oppenheim, J.J., et al. (toim.), El-20 sevier/North Holland, New York, s. 373, Conrow, et al., (1980) J. Med. Chem. 23, 242, Regal, J.F. ja Pickering, R.H., (1983) Int. J. Immunopharmacol. 5, 71, Jacobs, H.S., (1980)

Arc. Pathol. Lab. Med. 104, 617).

25 Epitoopin sisältävillä CRl-proteiinilla tai sen fragmen teilla on käyttöä määrityksissä, joihin kuuluvat immuuni-määritykset tähän kuitenkaan rajoittumatta. Immuunimääri-tyksiin, joita voidaan käyttää, kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, kompetitiiviset ja ei-kompetitiivi- r 30 set määritysjärjestelmät, joissa käytetään menetelmiä, kuten radioimmuunimääritykset, ELISA (entsyymivälitteinen im-muunisorbenttimääritys), kerrosimmuunimääritykset, presi-pitiinireaktiot, geelidiffuusiopresipitiinireaktiot, immuu-nidiffuusiomääritykset, agglutinaatiomääritykset, komplemen- 40 1 0 6 3 1 6 tin sitomismääritykset, immuuniradiometriset määritykset, fluoresenssi-immuunimääritykset, proteiini-A-immuunimääri-tykset ja immuunielektroforeesimääritykset joidenkin esimerkkien mainitsemiseksi.

5 CRl-geenejä ja näille läheisiä nukleiinihappojaksoja ja jaksojen osia voidaan käyttää hybridisointimäärityksissä. Näitä hybridisointimäärityksiä voidaan käyttää silloin, kun tarkoituksena on seurata tulehdus- tai immuunireaktioita, 10 joihin liittyy CRl:n ilmentyminen, diagnosoida tiettyjä tautitiloja, joihin liittyy CRl:n ilmentymisen muutoksia, määrittää potilaan CRl-allotyyppi ja havaita CRl-geenin ja läheisesti yhteen kuuluvien geenien (esim. CR2) esiintyminen ja/tai ilmentyminen.

15 5.6.2 Terapia CRl-proteiini ja sen fragmentit, johdannaiset ja analogit voivat olla terapeuttisesti käyttökelpoisia CRl:n välittämien toimintojen moduloinnissa. Näihin toimintoihin kuulu-20 vat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, vapaassa tai kompleksoituneissa muodoissa olevien C3b:n ja/tai C4b:n sitominen, fagosytoosin vahvistaminen, komplementin säätely, immuunijärjestelmän stimuloiminen jne. Tämän keksinnön mukaisten CRl-proteiinien ja sitä läheisesti muistuttavien 25 molekyylien tehokkailla annoksilla on terapeuttista arvoa monissa taudeissa ja sairauksissa, jotka liittyvät näihin toimintoihin, kuten immuunijärjestelmän sairauksissa tai tulehdussairauksissa (esim. kohdassa 5.6 kuvatut sairaudet). Esimerkiksi täysimittaisella CRl:llä tai sen frag-30 menteilla ja sitä läheisesti muistuttavilla molekyyleillä, joissa esiintyy haluttu aktiivisuus, voi olla terapeuttista käyttöä komplementin inhibitiossa sen johdosta, että niillä on kyky toimia tekijän I kofaktorina, joka edistää komplementin komponenttien C3b tai C4b palautumatonta inaktivoi-35 tumista (Fearon, D.T., (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.

41 106316 76, 5867, Iida, K. ja Nussenzweig, V. , (1981) J. Exp. Med.153, 1138) ja/tai sen johdosta, että niillä on kyky inhiboida vaihtoehtoisia tai klassisia C3- tai C5-konver-taaseja.

5

Yhdessä erityisessä tämän keksinnön mukaisessa sovellutus-muodossa voidaan ilmentymisvektori konstruoida koodaamaan CRl-molekyyliä, jolta puuttuu kalvon läpäisevä alue (esim. deleetiolla, joka poistaa C-terminaalista osaa lähimpänä 10 olevan SCR-alueen arginiinista lukien C-terminaalisella puolella olevan osan), jolloin tuloksena on liukoisen CR1-fragmentin muodostuminen. Yhdessä sovellutusmuodossa tässä fragmentissa voi säilyä kyky sitoa vapaata tai komp-leksoituneissa muodoissa olevaa C3b:tä ja/tai C4b:tä. Yh-15 dessä erityisessä sovellutusmuodossa tämä liukoinen CR1-proteiini ei saata enää kyetä osoittamaan tekijän I kofak-toriaktiivisuutta. Liukoista CRl-tuotetta voidaan antaa potilaalle in vivo, jotta liukoinen CR1 voisi tehokkaasti syrjäyttää solun pinnalla olevan natiivin CRl:n kilpailussa 20 C3b:n ja/tai C4b:n sitomisesta ja ehkäistä siten täysin solun pinnalla olevan CRl:n tekijän I kofaktoriaktiivisuu-den ja lisätä komplementtiaktiivisuutta.

Kun C3b on liittynyt kovalenttisesti partikkeleihin ja liu-25 koisiin immuunikomplekseihin, C3b:n inaktivoitumisella pro-teolyyttisellä prosessoinnilla iC3b:ksi ja C3dg:ksi on kaksi biologista seurausta: komplementtisysteemin vahvistavaa reaktiotietä käyttävän liiallisen aktivoitumisen estäminen ja sellaisten ligandien muodostuminen, jotka voivat kytkey-30 tyä muihin reseptoreihin kuin CRl:een. iC3b-fragmentti ei voi sitoa B-tekijää, joten tähän tilaan johtava muunnos ehkäisee komplementin aktivoitumisen edelleen vaihtoehtoisen reaktiotien kautta kulkevaa vahvistumiskiertoa käyttäen. CRl ja CR3, jotka edustavat kahta myelomonosyyt-35 tisolujen fagosytoositoimintaa välittävää reseptoria, voi- 42 106316 vat kuitenkin sitoa iC3b:tä. Tämän vuoksi ensisijaisena seurauksena C3b:n muuttumisesta iC3b:ksi on komplementin aktivoitumisen lakkaaminen ilman, että tämä häiritsee CRl:n ja CR3:n välittämää C3:n päällystämän kompleksin poistamis-5 ta. Sitävastoin iC3b:n muuntuminen edelleen C3dg:ksi muodostaa fragmentin, joka osallistuu vuorovaikutukseen ainoastaan CR2:n kanssa mutta ei CRl:n tai CR3:n kanssa. Tämä asiantila rajoittaa C3dg:tä sisältävän kompleksin komplementista riippuvan sitoutumisen CR2:ta ilmentäviin solu-10 tyyppeihin, joihin kuuluvat B-lymfosyytit, imukerästen den-driittisolut ja ehkä ihon epiteelisolut, ja sulkee pois vuorovaikutuksen fagosyyttisten solutyyppien kanssa. Tämän muuttuneen soluassosiaatiojärjestyksen biologinen seuraus olisi ehkä C3dg:tä sisältävien kompleksien ohjautuminen 15 ensisijaisesti soluihin, jotka liittyvät immuunivasteen muodostumisen kehittymisvaiheeseen eikä soluihin, jotka liittyvät partikkelien ja kompleksien poistamiseen ja hajottamiseen. CRl-molekyylejä voidaan siksi käyttää terapeuttisesti ei ainoastaan vaikuttamaan poistoprosesseihin 20 vaan myös kohdistamaan kompleksit CR2-solutyyppeihin, jotka osallistuvat antigeenin esittämiseen ja vasta-aineiden tuotantoon .

Vaihtoehtoisessa sovellutusmuodossa voidaan komplementin 25 inaktivoinnin edistämiseen käyttää CRl-proteiinia tai sen fragmenttia, joka voi sitoa C3b:tä tai C4b:tä ja/tai jossa on säilynyt kyky vaihtoehtoisten tai klassisten C3- tai C5-konvertaasien inhibitioon tai jossa on säilynyt tekijän I kofaktoriaktiivisuus. Tässä sovellutusmuodossa CRl-prote-30 iini tai sen fragmentti voi olla arvokas sellaisten sairauksien hoidossa, joihin liittyy haitallinen tai sopimaton komplementtiaktiivisuus (esim. sokkikeuhko, kudosvaurio, joka johtuu palovamma- tai sydäninfarktitiloista, autoimmuunisairauksista, tulehdustiloista jne.).

35 43 106316

Yhdessä erityisessä sovellutusmuodossa, joka on esitetty yksityiskohtaisesti kappaleissa 11—14 esitetyissä esimerkeissä, voidaan ilmentää liukoista CRl-proteiinia, jossa „ haluttu toiminnallinen aktiivisuus on säilynyt, mistä on 5 osoituksena se, että niillä on esimerkiksi kyky inhiboida * klassista komplementista riippuvaa hemolyysiä, klassista C5a:n tuottoa, klassista C3a:n tuottoa tai neutrofiilista hapetuspurkausta in vitro. Yhdessä erityisessä sovellutus-muodossa tällaista liukoista CRl-molekyyliä voidaan käyttää 10 tulehduksen ja siihen liittyvien vaurioittavien vaikutusten vähentämiseen tai pienentämään sydäninfarktin kokoa tai estämään perfuusion palautumisvaurioita jne. Tällaiset in vivo -terapiassa käyttökelpoiset CRl-molekyylit voidaan testata useissa erilaisissa tunnetuissa mallisysteemeissä, 15 joihin kuuluu, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, käänteinen passiivinen Arthus-reaktio (ks. kappale 14.1) ja sydäninfarktin rottamalli (ks. kappale 14.3.).

Vielä yhdessä tämän keksinnön mukaisessa sovellutusmuodossa 20 voidaan käyttää CRl:n fragmenttia tai sen johdannaista, jonka on osoitettu inhiboivan haluttua CRl:n ominaisuutta tai toimintaa, tähän toimintaan liittyvien tautien tai häiriötilojen ehkäisemiseen tai hoitoon.

25 Tunnetaan useita annostelujärjestelmiä ja näitä voidaan käyttää CRl:n ja sitä läheisesti muistuttavien molekyylien annostelemiseksi, esim. kapselointi liposomeihin, ilmentäminen hematopoieettisten kantasolujen jälkeläissoluissa geeniterapiassa jne. Muihin annostelujärjestelmiin kuulu-, 30 vat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, antaminen ihon- sisäisiä, lihaksensisäisiä, vatsaontelonsisäisiä, suonen-, sisäisiä, ihonalaisia ja nenänsisäisiä annosteluteitä ja suun kautta tapahtuvaa annostelua käyttäen.

35 6 Esimerkki; Ihmisen C3b/C4b-reseptorin (CR1) kloonaus ja 44 106316 sekvenssointi Näissä yksityiskohtaisissa esimerkeissä kuvaamme 5,5 kilo-emäsparin (ke.) pituisen CRl:n koodaavan alueen kloonauksen ja nukeotidijakson (Klickstein L.B. et ai., (1987) J. Exp.

5 Med. 165, 1095—1112).

Kymmenen limittäistä CRl:n cDNA-kloonia, jotka kattavat 5,5 ke., eristettiin nielurisakirjastosta ja ne sekvenssoitiin kokonaan tai osittain. Näistä tunnistettiin yksi pitkä 10 avoin lukukehys, joka alkoi kloonien 5'-puolelta ja ulottui myötäsuuntaisesti 4,7 ke:n verran lopetuskodoniin ') . Tämä jakso edustaa noin 80 % CRl:n F-allotyypin arvioidusta koo-daavasta jaksosta. Tunnistettiin kolme suoraa, pitkää homologista 450 aminohaposta koostuvaa toistumajaksoa (LHR). 15 Trypsiinikäsittelyllä saatujen peptidi sekvenssien analyysi antoi todisteita neljännen LHR:n esiintymisestä CRl:n F-allotyypissä. LHR-jaksojen välinen aminohappojen identiteetti ulottui ensimmäisen ja kolmannen toistumajakson 70-%:sesta identiteetistä ensimmäisen ja kolmannen toistu-20 majakson 250 ensimmäisen NH2-termiaalisen aminohapon 99-%:iseen identiteettiin. Kukin LHR käsittää seitsemän lyhyttä konsensus-toistumajaksoa (SCR:t), jotka ovat kooltaan 60-70 aminohapon mittaisia ja jotka muistuttavat SCR-jaksoja muissa C3/C4:ää sitovissa proteiineissa, kuten tyy-25 pin 2 komplementtireseptori, B- ja H-tekijät, C4:ää sitova proteiini ja C2. Kaksi muuta SCR-jaksoa liittävät LHR-jak-sot yhteen 25 aminohaposta koostuvaan kalvon läpäisevään alueeseen, joten CRl:n F-allotyyppi luultavasti sisältää ainakin 30 SCR-jaksoa, joista 23 on sekvenssoitu. Kunkin 30 SCR-jakson ennustetaan muodostavan kolmoissilmukkaraken- • teen, jossa neljä säilyvää puolikystiiniä muodostaa disul- fidisidokset. Suoraksi järjestyneenä näiden 30 SCR-jakson muodostama jäykähkö rakenneyksikkö pistäisi esiin 114 nm solukalvosta ja saattaisi helpottaa CRl:n vuorovaikutusta 35 immuunikompleksien ja mikrobien soluseinien välisessä ti- 45 106316 loissa olevien C3b:n ja C4b:n kanssa. Sytoplasmassa oleva 43 ryhmän muodostama COOH-terminaalinen alue sisältää kuuden aminohapon muodostaman jakson, joka on homologinen epi-dermaalisessa kasvutekijässä olevan proteiinikinaasi C:llä 5 fosforyloituvan jakson suhteen.

6.1 Materiaalit ja menetelmät 6.1.1 CRl:n trypsiinipeptidien eristys ja sekvenssit CR1 puhdistettiin ihmisen erytrosyyttien kalvoista peräk-10 käisillä Matrex Red A- ja monoklonaalisella YZ-l-vasta-aineaffiniteettikromatografiällä (Wong, W.W., et ai., (1985) J. Immunol. Methods 82, 303). Typsiinipeptidit valmistettiin ja eristettiin peräkkäisillä gradientti- ja iso-kraattisella käänteisfaasi-HPLC:llä (korkean suorituskyvyn 15 nestekromatografia) kuten julkaisussa Wong, W.W., et ai., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82, 7711 on kuvattu. Trypsiinipeptidien analyysi suoritettiin mallin 470A Protein Sequencer -laitteella (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA) käyttäen 120 PTH-aminohappoanalysaattoria 20 (Applied Biosystems, Inc.).

6.1.2. cDNA-kloonien ja genomista saatujen kloonien eristys cDNA kirjasto konstruoitiin Xgtll:ssä ihmisen nielurisojen ,. 25 poly(A)+-RNA:sta julkaisun Wong, W.W., et ai., (1985) Proc.

Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82, 7711 mukaan. RNA-blottaushybri-disoinnin mukaan nielurisojen luovuttaja oli homotsygootti-nen CRl:n F-alleelin (id.) suhteen. cDNA valittiin ennen kloonausvaiheita agaroosigeelissä siten, että siihen tuli - 3 0 mukaan 2 ja 7 ke:n fraktiot. Kirjaston kompleksisuus oli alussa 4.5 x 106 rekombinanttia 100 ng cDNA:ta kohti ja ” kirjasto monistettiin Escherichia coli -kannassa Y1088.

Kirjasto seulottiin (Maniatis, T. , et ai., (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborato-35 ry, Cold Spring Harbor, New York) CR-koettimilla CR1-1 46 106316 (ATCC hakunumerot 57330 (E. coli, joka sisältää plasmidin CR1-1), 57331 (puhdistettu CR1-1 DNA) ja CR1-2 (Wong, W.W., et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82,7711), jotka oli leimattu radioaktiivisella leimalla spesifiseen ak-5 tiivisuuteen 2—8 x 108 cpm/jug käyttäen katkostranslaati-ota. Hybridisointi suoritettiin liuoksessa, jonka koostumus oli 50% formamidia, 5 x SSC (1 x SSC: 15 mM natriumsit-raatti ja 150 mM natriumkloridi) 43°C:ssa ja suodattimet pestiin 60°C:ssa 0,2 x SSC:ssa, olosuhteissa, joissa CR2 10 cDNA kloonien havaitseminen ei ole mahdollista (Weis, J.J., et ai., (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83,' 5639). Positiiviset kloonit puhdistettiin plakkieristyksen kautta kahdesti ennen restriktiokartoitusta ja DNA-sekvenssin analyysia.

15 EMBL-3:een konstruoitiin genomikirjasto 15—20ke:n fragmenteista, jotka oli saatu Sau3Al:llä osittain pilkotusta ihmisen leukosyytti-DNA:sta. Lähtövaiheen kompleksisuus oli 1,2 x 106 ja kirjasto monistettiin E. coli -kannassa 20 P239-2. Kirjasto seulottiin cDNA koettimilla CR1-1 ja CR1-2 (Wong, W.W., et ai., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82, 7711).

6.1.3 DNA-sekvenssin analyysi ;· 25 cDNA-kloonien restriktiofragmentit jatkokloonattiin M13mpl8:ssa tai M13mpl9:ssa ja sekvenssoitiin dide-oksinukleotidiketjun terminaatiomenetelmällä (Sanger, F., et ai., (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74, 5463).

Toiset klooneista sekvenssoitiin kokonaan tai osittain si-30 ten, että ensin muodostettiin järjestyksessä deleetiomu-tantteja eksonukleaasi III:a käyttäen (Henikoff, S., (1984) Gene 28, 351) . Kukin alue sekvenssoitiin molempia nauhoja käyttäen ja useimmissa tapauksissa kukin alue sekvenssoitiin M13-jatkoklooneissa, jotka oli konstruoitu kahdesta 35 toisistaan riippumatta eristetystä cDNA kloonista (kuva 2) .

106316

Sekvenssointitulokset analysoitiin Wisconsinin yliopiston Genetics Computer Group -analyysiohjelmalla (Madison, WI).

6.2 Tulokset 5 6.2.1. CRl-geenin nukleotidijakso * Koon mukaan valittu nielurisojen cDNA-kirjasto seulottiin CR1-1- ja CRl-2-koettimilla, jotka oli saatu CRl:n cDNA kloonista XT8.3 (Wong, W.W., et ai., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82, 7711). Viisitoista posiitivista faa-10 gia tunnistettiin 1.5 x 106 rekombinantin joukosta ja näistä 13 edusti itsenäisiä klooneja. Näistä kymmenelle suoritettiin restriktiokartoitus ja kokonais- tai osittaissek-venssointi dideoksinukleotidiketjun terminaatiomenetelmäl-lä. cDNA kloonien keskinäinen järjestys määrättiin sekvens-15 sien yhteisten limittäisten osien perusteella (kuva 2) ja niiden havaittiin kattavan 5,5 ke:n suuruisen alueen (kuva 3) . Tunnistettiin cDNA-kloonien 5'-päästä alkava yksi pitkä avoin lukukehys, joka ulottui 4,7 ke:n verran myötä-suuntaisesti ja päättyi lopetuskodoniin. Tässä kirjastossa 20 olevan CRl:tä vastaavan koodaavan jakson odotetaan olevan 6 ke:n pituinen glykosyloitumattoman reseptorin arvioidun 220 000 daltonin molekyylimassan perusteella (Wong, W.W., et ai., (1983) J. elin. Invest. 72, 685). Siten nämä kloonit kattavat noin 80 % arvioidusta koodaavasta jaksosta.

·· 25 • ·

Kloonit T49.1 ja T55.1 sisältävät koodaavaa jaksoa 5'-puoleisissa päissään, joka viittaa siihen, että muita 5'-puo-leisia koodaavia ja koodaamattomia jaksoja on tunnistamatta. 3'-puoleisella alueella esiintyvät limittäiset kloonit ' 30 T8.2, T43.1 ja T87.1 sisältävät kalvon läpäisevän ja syto plasmassa olevan alueen, jotka ovat kussakin kloonissa ole- « · t 1 van identtisen jakson koodaamia. Pisimmälle 3'-puoleiseen suuntaan ulottuva klooni T8.2 sisältää 807 ep:n translaatioon osallistumattoman jakson, jossa ei ole poly(A) -jaksoa. 35 Klooni T8.3 sisältää 91 ep:n pituisen nukleotidiasemien * 48 106316 1 406—1497 välisen deleetion ja klooni T40.1 sisältää 9 ep:n pituisen nukleotidiasemien 1 498—1 507 välisen deleetion klooneissa T6.1 ja T55.1 havaittuun jaksoon verrattuna. Nämä deleetiot esiintyivät alueilla, joissa oli 5 sekvenssihomologiaa 5'-puoleisten katkaisukohtien suhteen ja ne voivat edustaa mRNA:ssa olevia katkaisuvirheitä. Kloonit T49.1 ja T55.1 sisältävät 110 ep:n insertion avoimessa lukukehyksessä olevien nukleotidien 147 ja 148 välissä (kuva 3) . Tämän jakson katsotaan olevan osa intronia, 10 koska se ei hybridisoitunut nielurisojen poly(A)+-RNA -blotteihin, se sisältää 5'-puolella olevan katkaisukohdan (Breathnach, R. , et ai., (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75, 4853) (kuva 3), genomista saaduissa klooneissa sen molemmilla puolilla on esiintyy cDNA-jaksoja ja se 15 siirtää lukukehyksen. Klooni T9.4 sisältää 3'-puoleisessa päässä olevan 0,88 ke:n pituisen välijakson, joka ei hybri-disoidu nielurisojen poly(A)+-RNA -blotteihin.

6.2.2 CRl:n nukleiinihappo- ja aminohappojakson analyysi 20 CRl:n mukleotidijakson pistematriisianalyysi (kuva 3) paljasti kahden tyyppistä sisäistä homologiaa (kuva 4). Ensimmäistä sisäisen homologian tyyppiä edustavat paksut ja yhtenäiset viivat, jotka vastaavat kolmea peräkkäin sijaitsevaa, suoraa ja erittäin homologista toistumajaksoa, jonka 25 koko on 1,35 ke. Nämä nukleotidi jaksot koodaavat CRl:n pit- • · kiä homologisia toistumajaksoja (LHR-jaksot). Toista toistuma jaksotyyppiä edustavat yhdensuuntaiset katkoviivat, jotka vastaavat vähemmän homologisia alueita. Nämä jaksot esiintyvät 190—210 nukleotidin välein ja ne koodaavat CRl:n 30 lyhyitä konsensus -toistumajaksoja (SCR-jaksot).

• > • * cDNA-jaksosta johdettu aminohappo jakso esitetään kuvassa 5 ja kolme LHR-jaksoa, joita merkitään LHR-B:llä, LHR-C:llä ja LHR-D:llä, on asetettu toistensa suhteen samoihin ase-35 miin niiden homologian osoittamiseksi. LHR-B ulottuu ryh- • 49 1 0 6 3 1 6 mästä 1 ryhmään 438, LHR-C vastaa ryhmiä 439-891 ja LHR-D ulottuu ryhmästä 892 ryhmään 1,341. LHR-C:n ryhmät 451-694 ovat 99-%:sesti identtisiä LHR-B:n ryhmien 1-244 suhteen . mutta ainoastaan 61-%sesti identtisiä LHR-D:n vastaaviin 5 ryhmiin verrattuna. Sensijaan LHR-C:n ryhmät 695-891 ovat , 91-%:sesti identtisiä LHR-D:n ryhmien l 148-1 341 suhteen mutta vain 76-%:sesti identtisiä LHR-B:n vastaavan alueen suhteen. Siten LHR-C vaikuttaa olevan hybridi, joka käsittää jaksoja, jotka ovat pääasiassa homologisia LHR-B:n en-10 simmäisen puolikkaan suhteen ja LHR-D:n toisen puolikkaan suhteen. Näitä LHR-jakso ja seuraa kaksi SCR-jaksoa', jotka eivät toistu, 25 ryhmästä koostuva hydrofobinen segmentti ja 43 aminohaposta muodostunut COOH-terminaalinen alue, jolla ei ole sekvenssihomologiaa SCR-jaksojen suhteen (kuva 15 5) .

CRl:n koodaavan jakson 5'-puoleinen 1,3 ke:n osa edustaa neljättä LHR-jaksoa, LHR-A:ta (ks. kuva 1 ja kappale 7) . Tätä johtopäätöstä vahvisti erytrosyyttien CRl:n 20 trypsiinipeptidien analyysi. Kymmenellä trypsiinipeptidillä ovat jaksot, jotka ovat identtisiä cDNA-klooneista johdettujen aminohappojaksojen suhteen (taulukko 1).

• » m · • «

X

( so 106316 5

Taulukko 1

Johdetussa aminohappojaksossa esiintyvät CRl:n tryp-siinipeptidit*

Peptidi- Aminohappojakso Ryhmien numerot numero johdetussa jaksossa 10 66 VDFVCDEGFQLKGS-A 330—345 28 GAASL----QG-WSPEAP 732—749, 1,'185— 1,202 49 ------------IFC-NP-AIL 805—826, 1,258— 1,279 15 35 CQALNKWEPELPSCSR 228—243, 678—693 41c DKDNFSPGQEVFYSCEPGYDLR 260—281 34b AV-YTCDPHPDRGTSFDLIGESTIR 393—417 44d VCQPPPEILHG 694—704, 1,147— 1,157 20 54d VFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQ 152—179, 602—629 57b YECRPEYYGRPFS 19—31, 469—481 39b LIGHSSAECILSGNAA 85—100 ♦Johdetusta aminohappojaksosta havaitut ihmisen erytrosyyt-25 tien CRl:n trypsiinipeptidit. Oikeanpuoleisessa sarakkeessa olevat lukualueet osoittavat peptidin sijaintia johdetussa aminohappojaksossa. Kukin väliviiva peptideissä 66, 28 ja 49 osoittaa, että tässä syklissä tunnistettiin useita ryhmiä. Väliviiva peptidissä 34b osoittaa sitä, että tässä 30 syklissä ei tunnistettu ryhmää lainkaan.

5i 106316

Kukin LHR käsittää seitsemän 60-70 aminohapon SCR-jaksoa, jotka ovat luonteenomainen piirre C3:a ja C4:ää sitoville proteiineille (C4bp) (kuva 6A). Maksimaalinen CRl:n 23 SCR-- jaksojen välinen homologia havainnollistettiin asettamalla 5 tyhjiä välejä keskenään järjestettyihin jaksoihin (kuva * 6A). Kussakin toistumajaksossa esiintyvästä keskimäärin 65 ryhmästä on säilyviä yhteensä 29 ryhmää. Näistä ryhmistä on kuusi sellaista, jotka esiintyvät kaikissa SCR-jaksoissa: neljä puolikystiiniä, joiden suhteelliset asemat ovat salo manlaisia, mikä viittaa siihen, että kukin niistä voi olla osallisena kriittisessä disulfidisidoksessa, ja tryptofaani ja toisen puolikystiinin jälkeinen toinen glysiini (kuva 6A). Muuttumattomien puolikystiinien välisten jaksojen se-kundaarirakenteen analyysi Choun ja Fassmanin algoritmia 15 (Chou, P.Y. ja Fasman, G.D. , (1974) Biochemistry 13, 222) käyttäen ennustaa suurta todennäköisyyttä jS-taipeen muodostumiselle ja pientä todennäköisyyttä α-kierteen muodostumiselle. Kahden CRl:n genomikloonin, 2.38:n (kuva 6B) ja 2.46:n, sekvenssianalyysi viittaa siihen, että SCR-14 (kuva 20 6A) on yhden eksonin koodaama ja että SCR-23:n COOH-termi- naalinen pää vastaa eksonin päätä. Siten erilliset eksonit voivat koodata CRl:n SCR-jaksoja, jollaista on osoitettu tapahtuvan B-tekijän SCR-jaksojen ollessa kyseessä (Campbell, R.D. ja Bentley, D.R., (1985) Immunol. Rev. 87, 19) ; 25 ja IL-2-R:n ollessa kyseessä (Leonard, W.J., et ai., (1985)

Science 230, 633).

CRl:n SCR-jaksojen konsensus-jaksoa voidaan verrata SCR-jaksoihin tämän suuren molekyyliperheen muihin jäseniin, ' 30 joilla tämä luonteenomainen piirre esiintyy (kuva 7). Näi hin jäseniin eivät ainoastaan kuulu proteiinit, joilla on ' C3/C4:ää sitova toiminto, CR2 (Weis, J.J., et ai., (1986)

Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83, 5639), C4bp (Chung, L.P., et ai., (1985) Biochem. J. 230, 133), H-tekijä (Kristensen, 35 T., et ai., (1986) J. Immunol. 136, 3407), B-tekijä (Mor- 52 1 0 6 3 1 6 ley, B.J. ja Campbell, R.D., (1984) EMBO J. 3, 153; Mole, J.E., et al., (1984) J. Biol. Chem. 259, 3407) ja C2 (Bentley, D.R. ja Porter, R.R., (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81, 1212, Gagnon, J., (1984) Philos. Trans. R.

5 Soc. Lond. B. Biol. Sci. 306, 301), vaan myös proteiinit, joiden ei tunneta omaavan tätä toimintoa, kuten inter-leukiini-2 reseptori (Leonard, W.J., et ai., (1985) Science 230, 633), 02-glycoproteiini I (Lozier, J., et ai., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3640), Clr (Leytus, S.P., 10 et ai., (1986) Biochemistry 25, 4855), haptoglobiinin a- ketju (Kurosky, A., et ai., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 3388), ja tekijä XHIb (Ichinose, A., et ai., (1986) Biochemistry 25, 4633). Puolikystiiniryhmät ovat muuttumattomia kaikkien proteiinien SCR-jaksoissa paitsi 15 haptoglobiinissa, jolta puuttuu kolmas puolikystiini. Tryptofaani on myös muuttumaton muissa paitsi jS2-glyko-proteiini I:n viidennessä SCR-jaksossa ja XHIb-tekijän kahdessa toistumajaksossa. Muut ryhmät, jotka säilyvät mutta eivät esiinny jokaisessa SCR-jaksossa, pyrkivät ryhmit-20 tymään puolikystiinien lähettyville. B-tekijässä ja C2:ssa on vain yksi vapaa tioliryhmä (Christie, D.L. ja Gagnon, J., (1982) Biochem. J. 201, 555; Parkes, C., et ai., (1983)

Biochem. J. 213, 201) ja j02-glycoproteiini I:n SCR-jaksois-sa ensimmäinen puolikystiini on liittynyt disulfidisidok-25 sella kolmanteen ja toinen neljänteen (Lozier, J., et ai., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3640).

CRl:n johdetussa aminohapposekvenssissä on 17 potentiaalista kohtaa N:n välityksellä liittyville oligosakkarideille 30 ja kaikki näistä ovat solunulkoisella alueella (kuva 6A). Molekyylimassassaero tunikamysiinin läsnä- ja poissaollessa syntetisoituneessa CRl:ssä (Lublin, D.M., et ai., (1986) J. Biol. Chem. 261, 5736) ja glukoosiamiinipitoisuusanalyysi (Sim, R.B., (1985) Biochem. J. 232, 883) viittaavat siihen, 35 että tässä molekyylissä esiintyy vain 6-8 kappaletta N:n 53 1 0 6 3 1 6 välityksellä sitoutuneita kompleksisia oligosakkarideja, joka merkitsee sitä, että kaikki potentiaaliset kohdat eivät ole käytössä. Esimerkiksi asparagiini, joka on johdetun aminohappojakson ryhmän 263 kohdalla (kuva 5), tunnis-5 tettiin peptidissä 41c (taulukko 1), joka viittaa siihen, , että tässä kohdassa ei esiinny glykosylaatiota. Sitävastoin tunnistamaton aminohappo peptidissä 34b luultavasti vastaa ryhmän 395 kohdalla olevaa glykosyloitua asparagiinia. Ainoat tunnistetut 5,5 ke:ssä cDNArta toistumajaksoja si-10 sältämättömät CRl-jaksot esiintyvät COOH-terminaalisessa alueessa. Tämän alueen sekundaarirakenteen analyysi'paljas-taa yhden 25 ryhmästä koostuvan otaksutun kalvon läpäisevän segmentin, jolla on vahva hydrofobinen luonne ja suuri α-kierteen muodostamisen todennäköisyys (kuva 5) . Tätä jak-15 soa seuraa välittömästi neljä positiivisen varauksen omaavaa ryhmää, joka on useiden kalvoproteiinien tunnusomainen piirre. CRl:n otaksuttu sytoplasmassa oleva osa käsittää 43 ryhmää ja se sisältää kuuden aminohapon muodostaman jakson VHPRTL, joka on homologinen jakson VRKRTL suhteen, joka 20 on proteiinikinaasi C:llä tapahtuvan fosforylaation kohta epidermaalisen kasvutekijän (EGF) reseptorissa ja erb B -onkogeenituotteessa (Hunter, T., et ai., (1984) Nature 311, 480; Davis, R.J. ja Czech, M.P., (1985) Proc. Natl.

Acad. Sei. U.S.A. 82, (1974). Nielurisojen CRl:n sytoplas-; 25 massa olevalta alueelta puuttuvat tyrosiiniryhmät.

6.3 Tarkastelu

Noin 80% F-allotyyppiä olevan CRl:n primäärirakenteesta on saatu selville limittäisiä cDNA klooneja sekvenssoimalla. , 30 Epätavallisin tässä analyysissä havaittu CRl:n piirre on perättäisten, suorien ja 450 aminohaposta koostuvien LHR-/ ' jaksojen esiintyminen, joista neljän ennustetaan esiintyvän F-allotyyppisessä CRlrssä, jonka arvioitu polypeptidiketjun pituus on 2 000 ryhmää (Wong, W.W., et ai., (1983) J. Clin. 35 Invest. 72, 685; Sim, R.B., (1985) Biochem. J. 232, 883).

54 106316

Kolme näistä LHR-jaksoista on kloonattu ja sekvenssoitu, kun taas todisteita neljännen esiintymisestä saatiin tryp-siinipeptidien analyysilla. Kukin LHR-jakso käsittää seitsemän SCR-jaksoa, jotka ovat muiden C3/C4:ää sitovien pro-5 teiinien rakenteen peruselementtejä. Neljän puolikystiinin säilyminen kussakin SCR-jaksossa, ensimmäisen ja kolmannen ja toisen ja neljännen puolikystiinin otaksuttu osallistuminen disulfidisidoksiin (Lozier, J., et ai., (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81, 3640) ja säilyvien aminohappo-10 jen, kuten /3-taipeissa usein havaittujen proliinin, gly-siinin ja asparagiinin esiintyminen (Rose, G.D., et ai., (1985) Adv. Protein Chem. 37, l) ovat perusteina sille ehdotukselle, että SCR-jakso muodostaa kolmoissilmukkaraken-teen, jota disulfidisidokset pitävät yllä (kuva 8) . Tätä 15 puolikystiinien osuutta tukee havainto, että lievästi tryp-siinikäsitelty CR1 (Sim, R.B., (1985) Biochem. J. 232, 883) ja H-tekijä (Sim, R.B. ja DiScipio, R.G., (1982) Biochem.

J. 205, 285) kulkeutuvat ehyinä molekyyleina, kun ne analysoidaan SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesissa (PAGE) 20 pelkistämättömissä olosuhteissa ja monina trypsiinifrag-mentteina pelkistyksen jälkeen.

Tämän perättäisesti toistuvien SCR-jaksojen ryhmän ennustetaan muodostavan pitkänomaisen rakenteen (kuva 8), jollai-25 nen on esitetty H-tekijälle ja ihmisen C4bp:n kullekin alayksikölle (Sim, R.B. ja DiScipio, R.G., (1982) Biochem. J. 205, 285; Whaley, K. ja Ruddy, S., (1976) J. Exp. Med. 144, 1147; Dahlback, B., et ai., (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80, 3461). C4bp:n alayksiköiden elektronimikroskoop-30 pitutkimukset viittaavat siihen, että niiden ulkomitta on 30 x 3 nm (Dahlback, B., et ai., (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80, 3461). Koska kukin alayksikkö koostuu kahdeksasta SCRs-jaksosta (Chung, L.P., et ai., (1985) Biochem. J. 230, 133), yhden SCR-jakson lasketaan olevan 3 35 x 3 nm. Jos oletetaan, että CRl:n SCR-jaksoilla on saman- 55 106316 laiset ulkomitat, ja että F-allotyypillä on 30 SCR-jaksoa, niin reseptori voisi ulottua jopa 114 nm päähän solukalvosta. Tämän CRl:n rakenteesta tehdyn ehdotuksen kanssa yhdenmukaista on se aiempi havainto, että neutrofiilien 5 pinnalla olevan CRl:een sitoutuneen ferritiinillä leimatun , vasta-aineen havaittiin usein olevan 50 nm päässä solukal von ulommasta puoliskosta (Abrahamson, D.R. ja Fearon, D.T., (1983) Lab. Invest. 48, 162). Tämä CRl:n pitkänomai nen rakenne on omiaan helpottamaan reseptorin sisältävien 10 solujen vuorovaikutusta C3b:n kanssa, joka on kovalentti-sesti sitoutunut suhteellisen vaikeapääsyisiin kohtiin im-muunikomplekseissa ja mikrobisolujen pinnoilla.

Se havainto, että SCR-jakso on CRl:n pääasiallisin ja ehkä 15 ainoa sytoplasman ulkopuolinen elementti, antaa rakenteeseen pohjautuvia todisteita läheisestä suhteesta tämän reseptorin ja H-tekijän ja C4bp:n välillä, jotka kaksi viimemainittua ovat yksinomaan tai pääasiassa SCR-jaksoista koostuvia plasmaproteiineja (Chung, L.P., et ai., (1985) 20 Biochem. J. 230, 133; Kristensen, T., et ai., (1986) J.

Immunol. 136, 3407). CR1 eristettiin ensimmäiseksi eryt- rosyytin kalvoproteiinina, jolla oli H-tekijän kaltaista aktiivisuutta detergentillä suoritetun solubilisoinnin jälkeen (Fearon, D.T., (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.

25 76, 5867), ja sen havaittiin myöhemmin omaavan H-tekijän ja C4bp:n säätelytoimintoja plasmamembraaniin liittyneenä ollessaan (Iida, K. ja Nussenzweig, V., (1981) J. Exp. Med.

153, 1138). Analysoimalla CRl:n, H-tekijän ja C4bp:n rakenteellisten polymorfiapiirteiden periytymistä näitä kolmea - 30 proteiinia koodaavien geenien osoitettiin olevan kytkeyty- « neitä (de Cordoba, R., et ai., (1985) J. Exp. Med. 161, * 1189), ja tämän kytkentäryhmän lokuksen ja sille rakenteel lisesti sukulaisuutta osoittavan reseptorin, CR2:n, lokuksen on äskettäin osoitettu sijaitsevan kromosomi l:n pit-35 kässä käsivarressa kohdassa b ja q 32 käyttäen in situ - 56 106316 hybridisointia ja somaattisten soluhybridien analyysia (Weis, J.H., et ai., (1987) J. Immunol. 138, 312). Ennen tämän tutkimuksen tekoa ainoana todisteena näiden proteiinien välisestä rakenteellisesta sukulaisuussuhteesta oli 5 niiden aminohappokoostumusten merkittävä samankaltaisuus (Wong, W.W., et ai., (1985) J. Immunol. Methods 82, 303). Tässä hakemusjulkaisussa esitetty havainto, että CRl:ssä on ainakin 23 SCR-jaksoa, muodostaa suoran ja muodollisen osoituksen tämän reseptorin rakenteellisesta sukulaisuus-10 suhteesta H-tekijään ja C4bp:hen (Chung, L.P., et ai., (1985) Biochem. J. 230, 133; Kristensen, T., et ai., (1986) J. Immunol. 136, 3407), jotka ovat samanlaisia toiminnallisia ominaisuuksia omaavia proteiineja, ja B-tekijän Ba- ja C2b-fragmentteihin ja C2:een (Morley, B.J. ja Campbell, 15 R.D., (1984) EMBO J. 3, 153; Mole, J.E., et ai., (1984) J.

Biol. Chem. 259, 3407; Bentley, D.R. ja Porter, R.R. , (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81, 1212; Gagnon, J., (1984) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 306, 301), jotka ovat C3b:n ja C4b:n kanssa entsymaattisia komplek-20 seja muodostavia komponentteja. SCR-jakso on kuitenkin havaittu myös useissa proteiineissa, jotka eivät kuulu komplementtiin (Campbell, R.D., ja Bentley, D.R., (1985)

Immunol. Rev. 87, 19; Lozier, J. , et ai., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3 640; Leytus, S.P., et al., 25 (1986) Biochemistry 25, 4855; Kurosky, A., et al., (1980)

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 3388; Ichinose, A., et al., (1986) Biochemistry 25, 4633) (kuva 7), mikä viittaa siihen, että se ei ehdottomasti edusta C3/C4:ää sitovaa rakennetta. SCR-jaksoja sisältävien proteiinien joukossa 30 SCR-jaksoja omaavien proteiinien joukossa CR1 on ainutlaa-. tuinen siinä suhteessa, että sillä tämä perusrakenne ja geneettinen yksikkö on organisoitu korkeammanasteiseksi LHR-jaksosta koostuvaksi rakenneyksiköksi. S-allotyypin ilmentymiseen liittyvän genomista saadun DNA:n 14,5 ke:n Bam-35 HI fragmentin analyysi viittaa siihen, että CRl:ssä aina- « 57 1 0 6 3 1 6 kin yksi toistuva genomissa oleva yksikkö on pitkä DNA-seg-mentti, joka sisältää ainakin viittä SCR-jaksoa koodaavat eksonit ja niiden ulkopuoliset intronijaksot (Wong, W.W., et ai., (1986) J. Exp. Med. 164, 1531). Nämä tutkimukset 5 ovat myös antaneet aiheen ehdottaa, että S-alleeli sisältää 1 yhden ylimääräisen kappaleen tätä genomissa olevaa yksikköä verrattuna F-alleelissa esiintyvien yksikköjen lukumäärään. Tämä havainto yhdessä trypsiinipeptidikartoitustutkimuksen (Nickells, M.W., et ai., (1986) Mol. Immunol. 23, 661) ja 10 tässä käsiteltävänä olevan havainnon kanssa, että LHR-jakso edustaa noin 40-50 kD:n suuruista peptidiä, antaa mahdollisuuden ennustaa sen, että S-allotyypissä (290 kD) on yksi ylimääräinen LHR-jakso, kun tätä verrataan siihen arvioon, että F-allotyypissä (250,000 daltonin molekyylimassa) on 15 neljä LHR-jaksoa.

Sen lisäksi, että LHR-jaksojen sekvenssi tarjoaa todisteita duplikaatiotapahtumien esiintymisestä, se myös viittaa siihen, että CRl-geenissä on tapahtunut konversioita. LHR-B 20 ja -D ovat kauttaaltaan keskenään 67-%:sesti identtisiä, kun taas LHR-C on 99-%:sesti identtinen LHR-B:n kanssa neljän NH2-terminaalisen SCR-jakson suhteen ja 91-%:sesti identtinen LHR-D:n kanssa kolmen COOH-terminaalisen SCR-jakson suhteen. Tämä organisaatio ei olisi voinut muodos-25 tua yhdessä rekombinaatiotapahtumassa identtisten parentaa- listen alleelien välillä tämän hybridi-LHR-jakson syntyessä. Pikemminkin hybridi-LHR-jakso on voinut syntyä geeni-konversion kautta (Atchison, M. ja Adesnik, M., (1986)

Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83, 2300), jossa LHR-C:n esi-30 muodon sekvenssit korvautuivat LHR-B:ssä tai LHR-D:ssä ; esiintyvillä sekvensseillä. Näissä LHR-jaksoissa oleva lä hes täydellinen identiteetti ja homologisten jaksojen tarkka samapalkkaisuus (kuva 5) voi myös olla kyennyt säilymään sellaisen mekanismin myötävaikutuksella, johon on liittynyt 35 geenikonversio. LHR-jakso ja koodaavien CRl-geenisegmenttien 58 106316 välissä olevien jaksojen homologian suuruuden analyysillä saataisiin määritetyksi se, onko sekvenssien divergenssiä jyrkästi rajoittavana tekijänä ollut geenikonversio vai toiminnallisten tekijöiden asettamat rajoitukset.

5 Vaikkakin yksi aiempi tutkimus viittasi siihen, että CR1 on yksiarvoinen (Wilson, J.G., et ai., (1982) N. Engl. J. Med. 307, 981), kukin LHR-jakso voisi edustaa yhtä C3b/C4b:tä sitovaa aluetta, joka tekisi reseptorin multivalentiksi ja soveltuvaksi sitomaan komplekseja, joissa on useita C3b- ja 10 C4b-molekyylejä. Vaihtoehtoisesti erilliset LHR-jaksot voi sivat toimia C3b:n ja C4b:n sitomisessa, tässä järjestyksessä mainittuna (ks. kappale 9), josta saataisiin rakenteellinen peruste H-tekijä- ja C4bp-aktiivisuuksien yhdistymiselle CRl:ssä. Lopuksi CRl:n LHR-jaksot voivat edustaa 15 rakenteellisia alueita, joiden tehtävänä on viedä CR1 ulommaksi plasmamembraanista, johon viittaavat ehdotettu rakenteellinen malli (kuva 8) ja se, että NH2-terminaalisen alueen SCR-jaksot sitovat C3b:tä ja C4b:tä, minkä on havaittu pätevän H-tekijän suhteen (Sim, R.B. ja DiScipio, R.G., 20 (1982) Biochem. J. 205, 285; Alsenz, J. , et ai., (1984)

Biochem. J. 224, 389).

Proteiinikinaasi C:n aktivaatio forboliestereillä indusoi CRl:n fosforylaation neutrofiileissä, monosyyteissä ja 25 eosinofiileissä (Changelian, P.S. ja Fearon, D.T. , (1986) J. Exp. Med. 163, 101) ja CR1:n sytoplasmassa olevassa 43 aminohaposta muodostuneessa alueessa on jakso, joka on homologinen epidermaalisessa kasvutekijäreseptorissa olevan kohdan kanssa, joka fosforyloituu proteiinikinaasi C:llä 30 (Hunger, T., et ai., (1984) Nature 311, 480; Davis, R.J. ja Czech, M.P., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82, 1974) . Tämä sytoplasmassa oleva jakso, joka havaittiin nie-lurisakirjaston kolmessa toisistaan riippumatomassa kloonissa on kuitenkin todennäköisemmin B-solun CRl-jaksoon 35 kuuluva alue, joka ei fosforyloidu proteiinikinaasi C:n 4 59 106316 aktivaation jälkeen (Changelian, P.S. ja Fearon, D.T. , (1986) J. Exp. Med. 163, 101).

7 Esimerkki: CRl:n DNA:n 5'-puoleiset jaksot sisältävät 5 neljännen pitkän homologisen toistumajakson CRl:n cDNA-jakson osittainen analyysi paljasti rakenteen, jossa kolme 450 aminohapon pituista LHR-jaksoa LHR-B, LHR-C ja LHR-D käsittivät kukin seitsemän 65 aminohapon pituista lyhyttä konsensus -toistumaa (SCR-jakso), joka on 10 C3/C4:ää sitovien proteiinien luonteenomainen tunnusmerkki (ks. kappale 6) . Tässä patenttihakemusjulkaisussa kuvatuissa esimerkeissä kuvaamme neljännen aminoterminaalisen LHR-jakson, LHR-A:n, kloonauksen ja nukleotidijakson (Klick-stein, L.B., et ai., (1987) Complement 4, 180) käyttäen 15 5'-cDNA -kloonien sekvenssointia. LHR-A:n analyysi paljas ti, että se on 99-%:sesti homologinen LHR-B:n suhteen viiden 3'-SCR-jakson alueella, mutta vain 61-%:sesti homologinen kahden 5'-SCR-jakson alueella.

20 7.1 Materiaalit ja menetelmät 7.1.1 cDNA-kirjaston konstruointi

Valikoivalla alukkeella varustettu cDNA kirjasto, \HH, konstruoitiin 3 g:sta poly (A) +-RNA:ta, joka oli puhdistettu DMSO:lla indusoiduista soluista, kuten julkaisuissa 25 Chirgwin, J.M. et ai., (1979) Biochemistry 18, 5290; Aviv, H. ja Leder, P., (1972) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 69,

1408; Ausubel, F.M., et ai., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) on kuvattu, käyttäen seuraavia modifikaatioita. LK35.1:tä, 35-meeristä 30 oligonukleotidia 5'-TGAAGTCATC ACAGGATTTC ACTTCACATG

*1 TGGGG-3' käytettiin oligo(dT)12-18:n tilalla ja 40 μΟχ 32P-dCTP:tä lisättiin toisen nauhan synteesin aikana. Kolmasosa cDNA:sta kloonattiin Xgtll:ssa ja cDNA kirjasto konstruoitiin ihmisen nielurisojen poly(A)+-RNA:sta kuten 35 kappaleessa 6.1.2 on kuvattu. Talteen saatiin 750 000 toi- « 60 1 0 6 3 1 6 sistaan riippumatonta rekombinanttia.

7.1.2 Kloonien ja koettimien eristys ja DNA-jakosn analyysi 5 cDNA kirjastojen seulontaan käytetyt koettimet olivat CR1-1 (Wong, W.W., et ai., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82, 7711) (ATCC hakunumero 57 331), CR-2 (Wong, W.W., et ai., ks. yllä), CR1-4 (Wong, W.W. et ai., (1986) J. Exp. Med. 164 , 1531) ja CR1-18, 252 ep:n Sau3AI-frag-10 mentti, joka oli saatu cDNA kloonin AH3 0,5 ke:n pituisesta EcoRI-fragmentista XH.l, joka vastaa nukleotidejä 101—352 kuvassa 1. Olosuhteisen ollessa jyrkästi rajoittavia CR1-18 hybridisoituu ainoastaan niiden cDNA-kloonien kanssa, jotka koodaavat joko NH2-terminaalista LHR-A:n SCR-jaksoa tai 15 signaalipeptidiä. cDNA-kloonin insertit sekvenssoitiin di-deoxynukleotidimenetelmällä (Sanger, F., et ai., (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74, 5463) sen jälkeen kun fragmentit oli jatkokloonattu M13mpl8:aan ja M13mpl9:ään (Yanisch- Perron, C. et ai., (1985) Gene 28, 351).

20 7.2 Tulokset

Erityisillä alukkeilla varustettu Xgtll cDNA-kirjasto, XHH, joka sisälsi 7.5 x 105 rekombinanttia, valmistettiin poly (A) +-RNA: sta, joka oli saatu DMSO:lla indusoiduista 25 HL-60-soluista. Nämä solut ilmentävät vain CRl:n F-allo-tyyppiä (Lublin, D.M., et ai., (1986) J. Biol. Chem. 261, 5736), jonka ennustetaan omaavan neljä LHR-jaksoa (Lapata, M.A., et ai., (1984) Nucl. Acids Res. 12, 5707). Aluke, LK35.1, oli "antisense" -tyyppinen 35-meeri, joka vastasi 30 kuvassa 3 esitettyjä nukleotidejä 896—930CRl:n osittaisessa cDNA-jaksossa. Tämän oligonukleotidin osoitettiin hyb-ridisoituvan LHR-B:hen, LHR-C:hen ja LHR-D:hen käänteisen transkription olosuhteissa. Kaksisataaviisikymmentä positiivista kloonia tunnistettiin maljaamalla 3.8 x 105 amp-35 lifioimatonta yhdistelmätaagia ja suorittamalla seulonta 61 106316 CRl-cDNA-koettimien CRl-1 ja CR1-4 seoksella. Poimittiin kolmekymmentäkahdeksan positiivista kloonia, jotka puhdistettiin käyttämällä plakkieristystä. Näistä klooneista saatujen EcoRI:llä pilkottujen DNA-näytteiden Southern -blotit 5 seulottiin 23-meerisellä oligonukleotidillä K523.1, * 5'-CTGAGCGTAC CCAAAGGGAC AAG-3 ', joka vastaa nukleotidejä 763—785 kuvassa 3 esitetyssä CRl-cDNA:n osittaisessa jaksossa. Tämä koetin hybridisoituu jyrkästi rajoittavissa olosuhteissa yhteen kohtaan LHR-B:tä koodaavassa jaksossa, 10 mutta ei LHR-C:tä tai LHR-D:tä koodaaviin jaksoihin. Kloonin AH7.1 liittymäjakso (kuva 9) sisälsi kolme EcoRI-frag-menttia, joiden koko oli 1,0 ke, 0,9 ke. ja 0,4 ke. ja kaksi suuremmista fragmenteista hybridisoitui K523.1:een, joka viittaa siihen, että tämä klooni sisälsi jaksot, jotka koo-15 daavat 5/7 LHR-A:n 3'-puoleisesta jaksosta ja kaikki LHR-B:tä koodaavat jaksot. Tämä havainto vahvisti sen, että LHR-A on hyvin homologinen LHR-B:n suhteen. Klooni AH3.1 (kuva 9) sisälsi yhden K523.1-positiivisen EcoRI-frag-mentin, jonka koko oli 1,0 ke ja 5'-puoleisen 0,5 ke:n suu-20 ruisen fragmentin, joka hybridisoitui heikosti CRl-4:n kanssa olosuhteiden ollessa jyrkästi rajoittavia. Tämän kloonin ajatellaan sisältävän vielä lisää 5'-puoleisesta jaksosta, joka muodostaa kokonaisen LHR-A-jakson, mukaanlukien SCR-jaksot -1 ja -2 ja 0,1 ke vastakkaisessa suunnassa 25 olevasta jaksosta. Yhtäkään jäljellä olevista 36 kloonista, jotka kaikki hybridisoituivat CRl-l:n kanssa, ei havaittu koettimella CRl-18, joka on 252 ep:n Sau3AI-fragmentti kloonin XH3.1 0,5 ke:n suuruisesta EcoRI-fragmentista, joka ei hybridisoidu LHR-B:tä, -C:tä tai -D:tä koodaavaan jak-30 soon.

XH3.1:n DNA-jakson analyysi paljasti se, että avoin luku-kehys jatkui cDNA:n 5'-päähän, joka viittasi siihen, että klooni ei ulottunut translaation aloituskohtaan. Tämän 35 vuoksi suoritettiin cDNA-kirjastojen XHH ja XS2T seulonta • · 62 106316 uudelleen koettimella CR1-18, ja näin kummastakin tunnistettiin yksi klooni, λΗΙΟ.3 ja XT109.1, tässä järjestyksessä mainittuna. Näiden kloonien EcoRI-fragmentit, jotka hyb-ridisoituivat CRl-18:n kanssa, sekvenssoitiin rinnan kloo-5 neista XH3.1 ja XH7.1 saatujen inserttien kanssa. Koostettu jakso esitetään kuvassa 1 siten, että kuvassa 1 oleva numeron 1531 jälkeinen nukleotidi on kuvassa 3 oleva nukleotidi 1. HL-60:stä ja ihmisen nielurisakirjastosta saatujen cDNA-kloonien limittäiset jaksot ovat identtisiä.

10 Välittömästi LHR-A:sta vastakkaiseen suuntaan olevat kloonit XH10.3 ja XT109.1 sisältävät identtiset hydrofobisiksi johtojaksoiksi otaksutut jaksot (Von Heijne, G., (1986)

Nucl. Acids Res. 14, 4683), jotka koodaavat 41 aminohappoa, 15 mukaan lukien ATG:n, joka on yhdenmukainen konsensus-jakson NNA/GNNATGG suhteen, jonka jakson on esitetty olevan euka-ryoottien translaation aloituskohtajakso (kuva 10) (Kozak, M., (1986) Cell 44, 283). Toinen ATG, joka sijaitsee vas takkaisessa suunnassa kuusi kodonia valitun ATG:n etupuo-20 lella ja välittömästi myötäsuuntaan lukukehyksessä olevan lopetuskodonin jälkeen, sopii huonosti yhteen tämän konsensus-jakson kanssa. Tämän CRl:n johtojakson ensimmäiset kolme aminohappoa, MGA, ovat samat kuin mitä on raportoitu CR2-jaksolle. Näiden kahden kloonin jaksoissa esiintyy v 25 eroavuuksia ATG:n vastakkaissuuntaisella puolella ja kloonista XlO.3 peräisin olevan jakson ajatellaan edustavan osaa välissä olevasta jaksosta, jollainen on kuvattu kappaleessa 6 kuvattujen muiden CRl:n cDNA-kloonien ollessa kyseessä.

30

Signaalipeptidaasin suorittaman pilkkomisen ennustetaan (Von Heijne, G., (1986) Nucl. Acids Res, 14;4683) tapahtuvan glysiini-46:n ja glutamiini-47:n välistä, joka viittaa siihen, että CRl:n suojauksen sisältävä NH2-terminaalinen 35 pää CR1 (Wong., W.W., et ai., (1985) J. Immunol. Methods 63 106316 82, 303; Holeis, V.M., et ai., (1986) Complement 3, 63) saattaa johtua pyrrolidoniamidin esiintymisestä. Näiden kloonien sisältämien NH2-terminaalisen LHR-A:n ensimmäiset kaksi SCR-jaksoa ovat vain 61-%:sesti identtisiä vastaavan 5 LHR-B:n alueen suhteen, kun taas LHR-S:n SCR-jaksot 3—7 * ovat 99-%:sesti identtisiä LHR-B:n vastaavien SCR-jaksojen suhteen (kuva 10) . LHR-A:n vertaus LHR-C:hen paljastaa, että kummastakin vain kolmas ja neljäs SCR-jakso on erittäin homologinen (99-%:nen identtisyys). LHR-A:11a ja 10 -D:llä on keskimääräisesti vain 68-%:nen identtisyys maksimaalisen identtisyyden ollessa 81 % näiden molempien LHR-jaksojen kuudennen SCR-jakson välillä. Täysin selville saatu CRl:n 5'-cDNA-jakso viittaa siten siihen, että F-allo-tyyppi käsittää 2039 aminohappoa, joihin kuuluu 41 aminoha-15 posta koostuva signaalipeptidi, neljä LHR-jaksoa, joista kukin sisältää seitsemän SCR-jaksoa, kaksi C00H-terminaa-lista SCR-lisäjaksoa, 25 ryhmää sisältävä kalvon läpäisevä alue ja 43 aminohappoa sisältävä sytoplasmassa oleva alue. Molekyylissä esiintyy 25 potentiaalista kohtaa N:n väli-20 tyksellä tapahtuvalle glykosylaatiolle.

7.3 Tarkastelu CRl:n F-allotyypin NH2-terminaalisen pään ja sigaalipepti-din primaarirakenne on johdettu eristämällä ja sekvenssoi-! 25 maila 5'-cDNA-klooneja. Koska CRl-jakso oli luonteeltaan runsaasti toistumia sisältävä, tästä seurasi se, että sopivan strategian kehittäminen oli kriittinen vaihe reseptorin tätä aluetta koodaavien cDNA-kloonien valmistamiseksi ja tunnistamiseksi. Valmistettiin cDNA-kirjasto käyttäen aluk-30 keena 35-meeristä oligonukleotidiä, jonka tiedettiin hyb- ridisoituvan käänteistranskriptio-olosuhteissa LHR-B:hen, -C:hen ja -D:hen; harkittiin sitä mahdollisuutta, että tämä aluke saattaisi hybridisoitua myös LHR-A:hän, jonka oli voitu ennustaa olevan hyvin homologinen LHR-B:n suhteen (ks 35 kappale 6) . Sopivat cDNA-kloonit tunnistettin käyttäen • · · 64 106316 toista oligonukleotidiä, K523.1:tä, joka hybridisoituu ainoastaan LHR-B:hen rajoittavissa olosuhteissa ja lisää siten todennäköisyyttä löytää 5'-cDNA-klooneja. Löydettiin kaksi kloonia, jotka sisälsivät miltei kaiken jäljellä ole-5 vasta CRl-jaksosta ja yhden tällaisen kloonin Sau3Al-frag-mentin, CRl-18:n, jakso oli riittävän ainutlaatuinen tämän käyttämiseen muiden 5'-kloonien tunnistamiseksi (kuvat 9 ja 10) .

10 LHR-A:n 5'-alueelta oleva 250 ep:n suuruinen koetin CR1-18, hybridisoitui ei vain 7,9 ja 9,2 ke:n CRl-transkrip-tiotuotteisiin vaan myös ihmisen nielurisojen RNA:n 2 ke:n transkriptiotuotteeseen rajoittavissa olosuhteissa. Tätä ristiinhybridisoituvaa mRNA:ta ei havaittu muilla LHR-jak-15 soista saaduilla CRl-cDNA-koettimilla tai dimetyylisulfok-sidilla indusoiduista HL-60-soluista ja HSB-2-T-lymfoblas-toidisoluista saadun RNA:n northern-bloteissa. CR1 sisältää siten jaksoja, jotka ovat homologisia kahden muun B-solujen proteiinin suhteen, joista yksi on tämän juuri tun-20 nistetun mRNA:n koodaama ja toinen on CR2.

8 Esimerkki: Ihmisen yhdistelmä-CRl:n ilmentäminen Kuten edellä on kuvattu, on eristetty ihmisen CRl-cDNA klooneja, jotka kattavat 7,0 ke. ja sisältävät avoimen lu-25 kukehyksen, joka koodaa 2039 aminohappoa (kuva 1) . Reseptorin ehdotettu prekursorimuoto sisältää 41 aminohaposta koostuvan signaalipeptidin, neljä pitkää homologista tois-tumajaksoa (LHR-jaksoa), joiden koko on 450 aminohappoa ja kukin LHR-jakso käsittää 7 lyhyttä konsensus-toistumajaksoa 30 (SCR-jaksoa), kaksi 65 aminohappoa sisältävää COOH-termi-naalista SCR-jaksoa, 25 aminohaposta koostuvan solukalvon läpäisevän osan ja 43 aminohapon suuruisen sytoplasmassa olevan alueen. CRl:n F-allotyyppi sisältää 30 SCR-jaksoa. NH2-terminaalinen LHR-jakso, LHR-A (ks. kappale 7), on 35 61-%:sesti identtinen vastaavalla LHR-B:n alueella kahden > * « 65 106316 ensimmäisen SCR-jakson suhteen ja 99-%:sesti identtinen viiden COOH-terminaalisen SCR-jakson suhteen. Kahdeksan CRl-cDNA-kloonin restriktiofragmentit katkaistiin siten, että ne muodostivat 6,9 ke:n täysimittaisen konstruktion ja 5 ne sijoitettiin myötäsuuntaan hiiren metallotioneiinipro- * moottorin tai sytomegaloviruksen promoottorin jälkeen ja transfektoitiin L (hiiri) -soluihin tai COS (apina) -soluihin. Solun pinnan yhdistelmä-CRl havaittiin epäsuoralla radioimmuunimäärityksellä ja immuunitluoresenssilla. Anti-10 geeniä ei havaittu ollenkaan soluissa, jotka oli transfek-toitu pelkällä lähtömuotoisella vektorilla (CR1). Trans-fektoitujen, I-pmtaleimalla varustettujen COS (apina) -solujen immuunisaostuksesta CRlrtä vastaan valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella ja saostuman analyysistä 15 pelkistämättömissä olosuhteissa suoritetulla natriumdode-kyylisulfaatti (SDS)-polyakryyliamidigeelielektroforeesil-la saatiin tulokseksi 190 000 daltonin molekyylimassaisen vyöhyke, joka kulkeutui rinnan ihmisen erytrosyyteistä saadun F-allotyypin kanssa. Oikean molekyylimassan omaavan 20 yhdistelmä-CRl -antigeenin ilmentäminen (Klickstein, L.B., et ai., (1988) FASEB J. 2:A1833) on todisteena siitä, että tämä cDNA sisältää ihmisen CRl:n kokonaisen koodaavan jakson.

« ·’ 25 8.1 CRl:n kokonaisen koodaavan alueen sisältävän plasmidin pBSABCD konstruktio

Kuvaamme plasmidin pBSABCD, joka on täysimittaista (SCR-jaksot 1-30) CRl-proteiinia koodaava vektori, konstruktion. cDNA kloonista XT8.2 (Klickstein, L.B., et ai., (1987) J.

s 30 Exp. Med. 165, 1095, ks. kappale 6) saatu 2,3 ke:n liittymä jakso jatkokloonattiin pUC18:aan EcoRI-fragmenttina si-ten, että 5'-pää oli lähimpänä plasmidin moninkertaisen liitosjakson Hindlll-kohtaa. Tälle plasmidille annettiin nimitys pl88.2. pl88.2 katkaistiin Apal:llä ja HindIII:lla, 35 ja tämä suuri 4,7 ke:n fragmentti, joka sisälsi CRl-jakson, ee 106316 joka alkoi SCR-jaksosta 26 ja ulottui translaatioon osallistumattomaan 3'alueeseen sekä vektorijaksot, puhdistettiin geelissä.

5 cDNA kloonista XT50.1 (Klickstein, L.B., et ai., (1987) J. Exp. Med. 165, 1095, ks. kappale 6) peräisin oleva liit-tymäjakso jatkokloonattiin EcoRI-fragmenttina M13mpl8:aan. Tälle faagille annettiin merkintä 18R50.1. Tämän kloonin replikaatiokykyinen muoto katkaistiin HindIII:lla ja 10 Apal:llä ja 1,45 ke:n fragmentti, joka sisälsi CRl:n SCR-jaksot 18-25, eristettiin, liitettiin ligaasin avulla 4,7 ke:n fragmenttiin pl88.2:sta ja liitoksen tulokseksi saatu molekyyli transformoitiin E. coli DH5Q -kantaan. Tälle plasmidille annettiin merkintä p8.250.1.

15 0,75 ke: n ja 0,93 ke: n EcoRI-fragmentit cDNA kloonista XT8.3 (Wong, W.W., et ai., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 22, 7711) jatkokloonattiin plasmidiin pBR327. Näille jatkoklooneille annettiin merkinnät pCRl-1 ja pCRl-2, täs-20 sä järjestyksessä mainittuna, ja ne sisälsivät SCR-jaksot 11-14 ja SCR-jaksot 17-21, tässä järjestyksessä mainittuna. EcoRI-liittymäjaksot puhdistettiin näistä molemmista. 0,75 ke:n pCRl-1 fragmentti pilkottiin Smal:llä ja pilkkoutu-mistulokset liitettiin ligaasin avulla pUC18:n DNA:han, ! 25 joka oli katkaistu EcoRI:llä ja Smal:llä. Eristettiin yksi jatkoklooni, pl81-l.l, johon oli liitetty SCR-jaksoja 12-14 vastaava 0,5 ke:n jakso. pCRl-2:n 0,93 ke:n fragmentti pilkottiin HindIII:lla, ja liitettiin ligaasin avulla EcoRI:llä ja HindIII:lla katkaistuun pUC19:ään ja eristet-30 tiin jatkoklooni, pl91-2.1, joka sisälsi 0,27 ke:n liitty-mäjakson, joka sisälsi SCR-jakson 17.

cDNA klooni XT6.1 (ks. kappale 6, Klickstein, L.B., et ai., (1987) J. Exp. Med. 165, 1095; Wong, W.W. , et ai., (1987) 35 J. Exp. Med. 164, 1531) pilkottiin EcoRI: llä ja CR1 SCR- 67 106316 jaksoja 15 ja 16 vastaava 0,37 kein fragmentti jatko-kloonattiin pBR322:een. Tälle kloonille annettiin merkintä pCRl-4. Klooni pl81-l.l katkaistiin EcoRIillä ja Scalillä ja eristettiin 1,4 ke:n fragmentti. Klooni pl91-2.1 (Klick-5 stein, L.B., et ai., (1987) J. Exp. Med. 165, 1095, ks.

* kappale 6,) pilkottiin EcoRI:llä ja Scalillä ja 2,0 ke:n fragmentti eristettiin, liitettiin ligaasin avulla pl81-l.l:sta saatuun 1,4 ke:n fragmenttiin ja seos transformoitiin E. coli DH5a -kantaan. Tulokseksi saadulle plas-10 midille annettiin merkintä pl-11-2. Plasmidi pl-11-2 pilkottiin EcoRIrllä, ja pCRl-4:stä saatu 0,37 ke:n liitty-mäjakson fragmentti liitettiin ligaasin avulla. Saatua plasmidia käytettiin E. coli DH5a -kannan transformaatioon.

15 Valittiin jatkoklooni, joka sisälsi 0,39 ke:n BamHI-Hindlll -fragmentin. Tälle plasmidille annettiin merkintä pl42 ja se sisälsi CRl:n SCR-jaksot 12-17. p8.250.1:stä saatu 3,5 kein EcoRI-Hindlll liittymäjaksofragmentti siirrettiin pGEM3b:hen. Tälle plasmidille annettiin merkintä pG8.250.1. 20 pl42:sta saatu 1,2 HindIII-fragmentti puhdistettiin ja liitettiin ligaasin avulla pG8.250.1:een, joka oli katkaistu HindIII:lla. Valittiin jatkoklooni, joka sisälsi 2,4 kein Pstl-Apal-liittymäjakson ja joka valikoi siten oikean orientaation. Tälle plasmidille annettiin merkintä pCD ja se I 25 sisälsi CRl-jaksot SCR-jaksosta 12 CRl:n 3’-puoleiseen päähän asti.

cDNA klooni \5'7.1 (Klickstein, L.B., et ai., Syysk. (1987) Complement 4, 180; ks. kappale 7,) katkaistiin Pstlillä ja 30 SCR-jaksoja 6-12 vastaava 1,35 kein fragmentti eristettiin ja liitettiin ligaasin avulla Pstlillä katkaistuun pCDihen. Seos transformoitiin ja valittiin jatkoklooni, joka sisälsi 1,35 kein ja 1,1 kein Hindlll-fragmentit. Tälle kloonille annettiin merkintä pBCD.

35 68 1 0 6 3 1 6 cDNA klooni \5'3.1 (Klickstein, L.B., et ai., (1987, Complement 4, 180; ks. kappale 7, ) katkaistiin EcoRI:llä ja pilkkoutumistulokset liitettiin ligaasin avulla EcoRI:llä katkaistuun pUC18:aan. Eristettiin jatkoklooni p3.1l-l, 5 joka sisälsi SCR-jaksoja 3-7 vastaavan 1,0 ke:n liittymä-jakson, joka liittymäjakso puhdistettiin geelissä. cDNA klooni λ5Ί0.3 (Klickstein, L.B., et ai., (1987) Complement 4, 180; ks. kappale 7) katkaistiin EcoRI:llä ja SCR-jaksot 1 ja 2 sisältävä 0,63 ke:n liittymäjakso jatkokloo-10 nättiin pUC18:aan. Tälle kloonille annettiin merkintä plO.-3.5. Plasmidi plO.3.5 pilkottiin osittain EcoRIrllä ja lineaarista plasmidia vastaava 3,4 ke:n fragmentti eristettiin ja se liitettiin ligaasin avulla p3.11-l:stä saatuun 1 ke:n fragmenttiin. Poimittiin talteen jatkoklooni, pLA, 15 joka sisälsi 1,3 ke:n Pstl-fragmentin oikeassa liittymäkohdassa ja oikein orientoituneena.

cDNA klooni XT109.4 (Klickstein, L.B., et ai., (1987) Complement 4, 180; ks. kappale 7) pilkottiin EcoRI:llä ja 20 jatkokloonattiin pUCl8:aan. Valittiin jatkoklooni, joka sisälsi translaatioon osallistumattomasta 5'-alueesta alkavaa ja johtojaksoon ja SCR-jaksoihin 1 ja 2 ulottuvaa aluetta vastaavan 0,55 ke:n EcoRI-fragmentin. Plasmidi pl09.4 katkaistiin Pstl:llä ja BspMII:lla ja eristettiin 3,0 ke:n 25 fragmentti, joka sisälsi vektorin, johtojakson ja SCR-jakson l. Tämä fragmentti liitettiin ligaasin avulla pLA:sta saatuun SCR-jaksot 2-5 sisältävään 0,81 ke:n Pstl-BspMII-fragmenttiin. Tälle uudelle plasmidille annettiin merkintä pNLA. Plasmidi pNLA pilkottiin osittain EcoRI:llä 30 ja täydellisesti Pstl:llä ja CR1-jakson johtojaksosta alkava ja SCR-jaksoon 5 ulottuva 1,1 ke:n EcoRI-Pstl-fragmentti eristettiin ja liitettiin ligaasin avulla pBluescript KS+ tuotteeseen (Stratagene, San Diego, CA) Xhol-kohdan liittämiseksi cDNA:n 5'-puolelle. Tälle plasmidille annettiin 35 merkintä pXLA.

• · 69 1 0 6 3 1 6

Plasmidi pBCD katkaistiin EcoRVrllä ja se pilkottiin sitten osittain Pstlrllä ja SCR-jaksosta 6 alkavan ja 3'-puoleiseen translaatioon osallistumattomaan alueeseen päättyvän 5 CR1-jakson sisältävä 6,0 ke:n Pstl-EcoRV-fragmentti eristettiin ja liitettiin ligaasin avulla PstI + Smal -pilkottuun pXLA:han. Tuloksena olevalle bakteeriperustaiselle il-mentämisplasmidille, joka sisältää CRl-cDNA:n kokonaisen koodaavan jakson, annettiin merkintä pBSABCD.

10 8.2 Plasmidin piABCD:n, CRl:n kokonaisen koodaavan jakson sisältävän nisäkäsilmentämisvektorin konstruktio ja määritys

Plasmidi pBSABCD pilkottiin Xhol:llä ja Notlrllä ja liitty-15 mäjakso liitettiin ligaasin avulla myötäsuuntaisesti il-mentämisvektorin CDM8 4,4 ke:n fragmentissa olevan CMV-pro-moottorin perään (Seed, B. , (1987) Nature 329, 840-842), joka fragmentti oli myös katkaistu näillä restriktioent-syymeilä. Tulokseksi saadulle konstruktiolle annettiin mer-20 kintä piABCD (kuva 11). Toisen vaihtoehdon mukaan 6,9 ke:n XhoI-Notl-fragmentti liitettiin ligaasin avulla myötäsuuntaisesti ilmentämisvektorissa pMT.neol olevan metallotio-neiinipromoottorin jälkeen, joka vektori oli myös katkaistu näillä restriktioentsyymeillä. Tulokseksi saadulle konst-·. 25 ruktiolle annettiin merkintä pMTABCD (kuva li).

Valmistettiin lampaan erytrosyyttejä, jotka oli herkistetty kaniinin vasta-aineella (EA) ja pienillä määrillä C4b:tä [EAC4b(lim)] ja 12 000 cpm 125I-C3b:tä solua kohti 30 (EAcC4b(lim),3b] suorittamalla EAC4b(lim):n (Diamedix) peräkkäiset käsittelyt Cl:llä, C2:lla ja 125I-C3:lla, jonka 9 jälkeen suoritettiin 60 minuutin pituinen inkubointi 37°C:ssa gelatiinissa ja veronaalilla puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa, joka sisälsi 40 mM EDTA. Toisena 35 vaihtoehtona oli se, että metyyliamiinilla käsitelty C3 106316 [C3(ma)] liitettiin kovalenttisesti lampaan E:hen (eryt-rosyytit), joka oli käsitelty 3-(2-pyridyyliditio)-propionihappo-N-hydroksisukkiini-imidiesterillä (Sigma) (Lambris, J.D., et ai., (1983, J. Immunol. Methods 65, 5 277). EAC4b valmistettiin käyttäen C4:ää (Hammer, C.H., et ai., (1981) J. Biol. Chem. 256, 3995).

Sekä piABCD että pMTABCD transfektoitiin DEAE (dietyylia-minoetyyli) -dekstraanimenetelmällä COS (apina) -soluihin. 10 Yhdistelmä-CRl havaittiin transfektoitujen solujen pinnalla immuunifluoresenssilla käyttäen CRl:tä vastaan valmistettua monoklonaalista vasta-ainetta YZ-1 ja 125I-leimattujen solujen immuunisaostusta, jonka jälkeen suoritettiin pelkistä-mättömissä olosuhteissa tehty SDS-PAGE, jolla saatiin esil-15 le proteiini, jonka liikkuvuus oli identtinen sellaiseen CRl:een verrattuna, joka oli saatu immuunisaostuksella ihmisen erytrosyyteistä, jotka olivat peräisin F-allotyypin suhteen homotsygoottisen luovuttajan (Wong, W.W., et ai., (1983) J. Clin. Invest. 72, 685) ja rosettien muodostuk- 20 sella C3b:llä päällystettyjen lampaan erytrosyyttien kanssa (Fearon, D.T., (1980, J. Exp. Med. 152, 20). Natiivin ja yhdistelmä-CRl -proteiinien identtiset elektroforeettiset liikkuvuudet vahvistivat sen, että CRl:n F-allotyyppi sisältää SCR-jaksot 1-30.

25

Lisäksi hiiren L-soluille suoritettiin rinnakkaistransfek-tio DEAE-dekstraanimenetelmällä (Ausubel, F.M., et ai., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Seidman, J.G. ja Struhl, K., (toim.), John Wiley & Sons, New York, 30 Seed, B., (1987, Nature 329, 840) rinnakkaiskokeina käyttäen 0, 2 tai 4 Mg joko piABCD:tä tai pMTABCD:tä ja 2 Mg pXGH5:ttä, ilmaisijaplasmidia, joka ohjaa kasvuhormonin ilmentymistä (Selden, R.F., et ai., (1986) Mol. Cell. Biol. 6, 3173). Solut kerättiin talteen kahden päivän kuluttua ja 35 niistä määritettiin CRl:n ilmentyminen sen perusteella, 7i 106316 että ne sitoivat CRl:tä vastaan valmistettua mono-klonaalista YZl-vasta-ainetta. Havaittiin annos-vastesuhde yhdistelmäplasmidi-DNA:n ja CRl-antigeenin ilmentymisen välillä (taulukko 2).

5 --------------------------------------------------------

Taulukko 2

Yhdistelmä-CRl:n ja ihmisen kasvuhormonin annosvasteet rinnakkaistransformoiduissa L-soluissa 10 YZ1 Anti- CRl-mAB Kasvu-

Maljan pXGH5 pMTABCD pIABCD RIA* hormoni numero ^μg) (jug) (μg) (cpm) (ng/ml) 15 1 2 0 0 1444 120 2202 6058 130 3202 6531 140 4204 10620 180 5204 9898 80 20 6 2 2 0 3111 180 7220 2747 160 8240 3547 160 9240 3337 140 25 * Radioimmuunimääritystä (RIA) varten käytettiin rinnakkai sia näytteitä, joissa oli 3 x 105 transfektoitua solua 0.1 mlrssa fosfaatilla puskuroitua fysiologista suolaliuosta, joka sisälsi 1% naudan seerumin albumiinia ja 0.02 % nat-riumatsidia ja joita inkuboitiin 0°C:ssa 60 minuutin ajan 30 3 μg/ml YZ-1 IgGl anti-CRl:n kanssa (Changelian, P.S., et ai., (1985) J. Immunol. 134, 1981). Solut pestiin ja sus- * pendoitiin uudelleen 0,1 ml:aan puskuria, joka sisälsi > 125 . .

1—2 βΟι/ml I-F(ab')2 vuohen hiirtä vastaan valmistettua IgG:tä tai I-protenni-A:ta. 1—2 tunnin kuluttua 0C:ssa 35 solut pestiin ja niistä määritettiin 125I.

72 1 0 6 3 1 6

Plasmidi piABCD ohjasi CRl-antigeenin ilmentymistä lähes kolme kertaa paremmin kuin pMTABCD. Kasvuhormonin pitoisuus w kasvatusliuoksessa vaihteli vähemmän kuin kaksikertaisesti 5 maljaa 5 lukuunottamatta. Muissa kokeissa tuli ilmi, että piABCD ohjasi CRl-antigeenin hetkellistä ilmentymistä kolme kertaa paremmin COS-soluissa kuin L-soluissa.

CRl-antigeeni esiintyi ryhminä transfektoitujen COS-solujen 10 pinnalla, kun se määritettiin epäsuoralla immuunitluore-senssillä soluista, jotka oli värjätty YZ1 anti-CRl mAB:lla (kuva 12). Tämä yhdistelmä-CRl:n jakautuma COS-soluissa muistuttaa villityyppisen CRl:n jakautumaa ihmisen leukosyyteissä (Fearon et ai., (1981) J. Exp. Med. 153, 1615).

15

Yhdistelmä-CRl:n molekyylimassa määritettiin suorittamalla piABCD:11a transfektoitujen COS-solujen pinnan käsittely jodin kiinnittämiseksi, solulysaattien immuunisaostus Sepharose-YZl:llä, SDS-PAGE ja autoradiografia. Yhdistelmä-20 CRl:n molekyylimassa oli pelkistämättömänä 190 000, joka on sama kuin erytrosyyttien CRl:n F-allotyypin ja vähemmän kuin S-allotyypin molekyylimassa (kuva 14).

Yhdistelmä-CRl:n C3b:tä sitova ja C4b:tä sitova toiminto 25 määritettiin rosettien muodostumisella transfektoitujen COS-solujen ja EAC4b:n tai EAC4b(lim),3b:n välillä. Suoritetuissa 31 erillisessä transfektiossa 5%-50% piABCD-plas-midilla transfektoiduista COS-soluista sitoi viittä tai useampaa EAC4b:tä tai EAC4b(lim),3b:tä (kuva 13). CRl:tä 30 ilmentävät COS-solut eivät muodostaneet rosetteja EAC4b(lim),3bi:n kanssa, vaikka tämä välituote muodosti rosetteja CR2:ta ilmentävien Raji B -lymfoblastoidisolujen kanssa.

35 8.3 CRl-fragmenttien ilmentäminen 73 106316

Konstruoitiin ilmentämisvektoreita, jotka koodasivat osaa CRl:tä koodaavasta jaksosta (deleetiomutantteja) edellä kuvatulla tavalla ja niiden havaittiin ilmentävän näitä ' vastaavia liittymäjaksoja, kun ne transformoitiin 5 COS-soluihin. CRl-fragmentit ilmentyivät solun pintaproteiineina.

8.3.1 Deleetiomutanttien piBCD, piABD, piACD, piAD, piBD, piCD ja piD konstruointi 10 Näiden deleetiomutanttien konstruointi suoritettiin käyttäen hyödyksi yhden ainoan BsmI-kohdan esiintymistä homologisessa asemassa lähellä kunkin neljän CRl:n pitkän homologisen toistumajakson (LHR-jakson) NH2-terminaalista päätä ja BsmI-kohtien puuttumista muualla CRl-cDNA:ssa ja Blue-15 script -vektorissa (Stratagene, San Diego, CA) . Kymmenen mikrogrammaa plasmidia pBSABCD pilkottiin osittain 50 yksiköllä restriktioentsyymiä BsmI 45 minuutin ajan ja pilkkou-tumistuotteet fraktioitiin agaroosigeelielektroforeesilla. Puhdistettiin 8,55 ke:n, 7,20 ke:n ja 5,85 ke:n DNA-frag-20 mentit, jotka vastasivat parentaalisen plasmidin lineaarisia segmenttejä, joista puuttui yksi, kaksi tai kolme LHR-jaksoa, tässä järjestyksessä mainittuna. Kukin näistä kolmesta fragmentista liitettiin ligaasin avulla itseensä ja ligaatiotuloksia käytettiin erillisissä kokeissa kompeten-• 25 tin E. coli DH5a -kannan transformaatioon ampisil- liiniresistentiksi.

Muodostettiin 8,55 ke:n fragmentti, joka oli tulosta pBSABCD:n pilkkomisesta kahdesta vierekkäisestä Bsml-koh-30 dasta, joten ligaation jälkeen on mahdollista saada tuloksesi kolme plasmidia, pBCD, pACD or pABD, jossa isot kirjaimet edustavat plasmidiin jääviä LHR-jaksoja. Nämä voitiin erottaa toisistaan Smal:llä suoritetulla restriktiokartoituksella. DNA valmistettiin 12 pesäkkeestä, pilkot-35 tiin Smal:llä ja erotettiin agaroosigeelielektroforee- 106316 silla. Viidessä kloonissa oli kaksi Smal-fragmenttia, joiden koko oli 2,5 ke. ja 6,1 ke, jotka vastaavat LHR-A:ta koodaavan jakson deleetiota ja jotka siten edustavat pBCD:tä. Kolmella klooneista oli yksi lineaarinen 8,5 ke:n 5 kokoinen fragmentti, joka vastasi pACD:tä. Neljällä kloonilla oli kaksi Smal-fragmenttia, joiden koko oli 1,2 ke. ja 7,4 ke. ja jotka olivat sen mukaisia kuin mitä LHR-C:tä koodaavan jakson deleetiosta odotettiin ja ne muodostivat pABD:n. Kunkin näiden kolmen konstruktion 5,6 ke:n suurui-10 nen liittymäjakso puhdistettiin geelissä XhoI:llä ja Notlrllä suoritetun kaksinkertaisen pilkkomisen jälkeen ja liitettiin ligaasin avulla ilmentämisvektoriin CDM8, joka oli puhdistettu geelissä samoilla restriktioentsyymeillä suoritetun pilkkomisen jälkeen. E. coli DK1/P3 transformoi-15 tiin näillä ligaatioseoksilla ja DNA valmistettiin kutakin kloonia edustavasta viidestä pesäkkeestä. Deletoidun CRl-cDNA:n esiintyminen ilmentämisvektorin liittymäjaksossa osoitettiin kaikissa tapauksissa pilkkomalla Sacl:llä, jossa havaittiin odotetut kaksi fragmenttia, joiden koko oli 20 4,20 ke. ja 5,75 ke. Näille plasmideille annettiin merkin nät piBCD, piACD ja piABD.

pBSABCD:n osittaisesta pilkkomisesta saatu 7,20 ke:n kokoinen fragmentti oli seurausta Bsml:llä suoritetusta pilkko-25 misesta kolmessa vierekkäisessä kohdassa, tai tämän suhteen samanarvoisessa tapauksessa suuren fragmentin suhteen, kahdessa kohdassa, joiden välille oli jäänyt yksi katkaisema-ton kohta ja näinollen oli mahdollista saada transformaation jälkeen kaksi tulosta, pAD ja pCD. Nämä erotettiin toi-30 sistaan kaksinkertaisella pilkkomisella Xholrllä ja Pstlrllä, joista pAD:n ollessa kyseessä saatiin kaksi fragmenttia, joiden koko oli 1,0 ke. ja 6,2 ke, ja pCD:n ollessa kyseessä saatiin lineaarinen fragmentti, jonka koko oli 7,2 ke. Näistä plasmideista saatu 4,2 ke:n suuruinen 35 liittymäjakso puhdistettiin geelissä XhoI:llä ja Notlillä 9 · 9 75 106316 suoritetun kaksinkertaisen pilkkomisen jälkeen ja se jatko-kloonattiin CDM8:aan kuten edellä. Deletoidun CRl-cDNA:n esiintyminen ilmentämisvektorissa osoitettiin Pstl:llä ja BglII:lla suoritetulla kaksinkertaisella pilkkomisella.

5 Kloonilla piAD oli 2,4 ke:n ja 6,2 ke:n suuruiset fragmentit, kun taas piCD:llä oli yksi fragmentti, jonka koko oli 8,6 ke.

pBSABCD:n pilkkomisesta Bsml:llä saatu 5,85 ke:n suuruinen 10 fragmentti edustaa täydellisen pilkkoutumisen tuotetta ja E. coli DH5a:n transformaation jälkeen saatiin yksi klooni, pD. Tämä vahvistettiin suorittamalla kaksinkertainen pilkkominen HindIII:lla ja BglII:lla, joista oli tuloksena odotetut 3,7 ke: n ja 2,2 ke: n suuruiset fragmentit. Tämän 15 kloonin 2,9 ke:n kokoinen liittymäjakso puhdistettiin geelissä XhoI:llä ja NotI:llä suoritetun kaksinkertaisen pilkkomisen jälkeen ja se liitettiin ligaasin avulla ilmentä-misvektoriin edellä esitetyn tavan mukaisesti. Saadun piD-kloonin HindIII:lla suoritetusta pilkkomisesta saatiin odo-2 0 tettu 7,3 ke:n suuruinen fragmentti, XhoI + Bglll -pilkkomisesta saatiin 2,2 ke:n ja 5,1 ke:n fragmentit ja Sacl:llä suoritetusta pilkkomisesta oli tuloksena odotetut 1,5 ke:n ja 5,8 ke:n fragmentit.

25 Plasmidi pBD valmistettiin pilkkomalla pBCD osittain Bsml:llä. Kahdesta vierekkäisestä BsmI-kohdasta suoritettua pilkkomista vastaava lineaarinen 7,2 ke:n fragmentti puhdistettiin geelissä, liitettiin ligaasin avulla itseensä kuten edellä ja käytettiin E. coli DH5a:n transformoimisek-30 si ampisilliiniresistentiksi. pBD tunnistettiin 1,2 ke:n ja 6,0 ke:n fragmenttien esiintymisestä Smal:llä suoritetun pilkkomisen jälkeen. 4,2 ke:n kokoinen liittymäjakso puhdistettiin XhoI:llä ja NotI:llä suoritetun kaksinkertaisen pilkkomisen jälkeen ja se siirrettiin CDM8:aan kuten edel-35 lä. Klooni piBD vahvistettiin oikeaksi havaitsemalla, että > f · « 76 1 0 6 3 1 6

Hindlllrlla suoritetusta pilkkomisesta oli tuloksena odotetut 0,8 ke:n ja 7,8 ke:n kokoiset fragmentit.

COS-solut, jotka ilmensivät hetkellisesti piABCD-, piBCD-, 5 piCD- ja piD-konstruktioita, tässä järjestyksessä mainittu-na, leimattiin pinnastaan I:llä ja immuunisaostettiin CRl:tä vastaan valmistetulla vasta-aineella. Pelkistyksen jälkeen suoritetussa SDS-PAGE:ssa piABCD-konstruktion tuottama tuote kulkeutui rinnakkain CRl:n F-allotyypin kanssa, 10 kun taas deleetiomutantit osoittivat portaittaista pienentymistä, joka oli suuruudeltaan noin 45 000 daltonia ja joka viittasi yhden, kahden ja kolmen LHR-jakson deleeti-oon, tässä järjestyksessä mainittuna (kuva 17).

15 8.3.2 Deleetiomutanttien piPl, piEl, piE2, piE-2, piUl, piU-2 ja piA/D konstruointi

Plasmidi piABCD pilkottiin täydellisesti BstEII:lla ja kaksi fragmenttia, joiden koko oli 1,35 ke. (tupletti) ja 8,6 ke, puhdistettiin geelissä, sekoitettiin ja liitettiin li-20 gaasin avulla, ja E. coli DK1/P3 transformoitiin ampisil-liini- ja tetrasykliiniresistentiksi. Pesäkkeet seulottiin hybridisoimalla ne CRl-cDNA-koettimella CR1-4 (ks. kappale 8.1) ja vahvasti positiiviset kloonit poimittiin talteen ja seulottiin vielä pilkkomalla Smal:llä. piEl tunnistettiin ·· 25 siitä, että siinä esiintyi kaksi fragmenttia, joiden koko oli 2,7 ke. ja 7,3 ke, ja piE2 tunnistettiin yhden 10,0 ke:n suuruisesta lineaarisesta fragmentista. piE-2 tunnistettiin heikosti CR1-4 positiivisena kloonina, joka sisälsi yhden 8,6 ke:n kokoisen Smal-fragmentin.

30

Plasmidi piPl saatiin piABCD:n täydellisestä pilkkomisesta Pstl:llä ja puhdistamalla geelissä suuri 10,0 ke:n kokoinen fragmentti. Tämä fragmentti liitettiin ligaasin avulla ja E. coli DK1/P3 transformoitiin tällä seoksella. Tästä saatu 35 plasmidi, piPl, sisälsi yhden 10,0 ke:n kokoisen Smal-frag- * * 106316 mentin.

Plasmidit piUl ja piU-2 valmistettiin transformoimalla ensin dcm"-kanta GM271/P3 plasmidilla pXLA ja eristämällä 5 DNA. Tämä DNA pilkottiin samanaikaisesti Stul:llä ja NotI:llä ja 3,3 ke:n suuruinen fragmentti puhdistettiin geelissä. Plasmidi pBSABCD pilkottiin osittain Nsil:llä ja saadut neljän emäsparin suuruiset ylimääräiset 3'-puoleiset nauhan osat poistettiin käsittelemällä E. colirn DNA-po-10 lymeraasi I:n Klenow-fragmentilla. Tämä DNA pilkottiin sitten täysin Notlrllä ja 5,4 ke:n ja 4,0 ke:n suuruiset fragmentit puhdistettiin geelissä. Nämä liitettiin ligaasin avulla pXLA:n 3,3 ke:n kokoiseen StuI-Notl-fragmenttiin ja ligaatioseosta käytettiin transformoimaan E. coli DH5a am-15 pisilliiniresistentiksi. Pesäkkeet seulottiin hybridisoi-malla niihin CRl:n cDNA-koetin CR1-4, ja positiiviset kloonit tarkistettiin vielä restriktiopilkkomisella HindIII:lla, josta oli tuloksena kolme fragmenttia, joiden koko oli 0,8 ke, 1,3 ke. ja 6,5 ke. pUl:n ollessa kyseessä 20 ja kaksi fragmenttia, joiden koko oli 0,8 ke. ja 6,5 ke pU-2:n ollessa kyseessä. Stulrllä tasoitetun Nsil-katkaisu-tuloksen vahvistettiin olevan oikeassa lukukehyksessä sek-venssoimalla näiden plasmidien DNA. pUl:n ja pU-2:n liit-tymäjaksot, jotka olivat kooltaan 5,6 ke. ja 4,2 ke, tässä 25 järjestyksessä mainittuna, puhdistettiin geelissä samanaikaisen pilkkomisen jälkeen Xholrllä ja NotI:llä ja nämä liitettiin ligaasin avulla ilmentämisvektoriin CDM8 aiemmin kuvatulla tavalla. Kloonien piUl ja piU-2 rakenteet vahvistettiin restriktiopilkkomisella XhoI + Pstl:llä, josta saa-

T

30 tiin odotetut kaksi fragmenttia, joiden koko oli 1,2 ke. ja 8,8 ke piUl:n ollessa kyseessä ja lineaarinen 8,7 ke:n

T

fragmentti piU-2:n ollessa kyseessä.

Plasmidi piA/D valmistettiin pilkkomalla piABCD ensin täy-35 dellisesti Pstl:llä. Pstl-pilkkoutumistuotteet pilkottiin 78 106316 sitten osittain Apal:llä ja nauhan vapaat 3'-osat poistettiin E. coli:n DNA polymeraasi I:n Klenow-fragmentilla. DNA fraktioitiin sitten agaroosigeelielektroforeesilla ja tästä eristettiin 7,5 ke:n fragmentti, liitettiin ligaasin avul-5 la ja tätä käytettiin transformoimaan E. coli DK1/P3 aropi-silliini- ja tetrasykliiniresistentiksi. Tämä konstruktio vahvistettiin pilkkomalla samanaikaisesti Kpnl + Saclrllä ja tästä oli tuloksena odotetut neljä fragmenttia, joiden koot olivat 0,8 ke, 1,5 ke, 1,7 ke. ja 3,3 ke.

10 9 Esimerkki: C3b:tä ja C4b:tä sitovien alueiden tunnis taminen 9.1. Määritykset ja tulokset

Plasmidit piABCD, piAD, piCD ja piD, jotka sisältävät ni-15 mitystensä mukaiset isojen kirjainten osoittaman(mat) LHR-jakson(sot), transformoitiin COS-soluihin, joita käytettiin määrityksissä, joiden tarkoituksena oli määrittää niiden koodaamien CRl-fragmenttien kyky sitoa C3b:tä tai C4b:tä. Sitoutumismääritykset suoritettiin havaitsemalla 20 erytrosyyttien rosetinmuodostus, joka on seurausta siitä, että täysimittaista CRl-molekyyliä tai CRl-deleetiomutaa-tiota pinnallaan ilmentävät (hetkellinen ilmentyminen) COS-solut sitovat C3b:llä tai C4b:llä päällystettyjä punasoluja. Transfektoituja soluja, joiden pitoisuus oli 25 1-4 x l06/ml, inkuboitiin C3:a tai C4:ää sisältävien eryt-

O

rosyyttien kanssa, joiden pitoisuus oli 2—6 x 10 /ml, 0,02 ml:n tilavuudessa 60 minuutin ajan 20°C:ssa. Rosetteja muodostavien transfektoitujen solujen prosentuaalinen osuus arvioitiin mikroskooppia käyttämällä siten, että transfek-30 toitu solu katsottiin rosetiksi, jos siihen oli liittynyt ·· ainakin viisi erytrosyyttiä. Tulokset on esitetty taulukos sa 3 .

79 1 0 6 3 1 6

Taulukko 3

Rosettien muodostus CRl:n yhdistelmämuotoja ilmentävien COS-solutransfektanttien ja C3(ma):ta tai C4(ma):ta sisältävien lampaan erytrosyyttien välillä 5 % Rosetteja muodostavia transfektantteja * % Anti-CRl:llä fluoresoivia transfektantteja COS-solutrans- transfektantti EC3(ma)* EC4(ma)# 10 piABCD 109 (3)π 62 (2) piAD 8 " 107 " piBD 107 " 12 " piCD 127 " 32 " piD 0 " 0 " 15 piA/D 11 (2) 83 (2) piE-2 1 (1) 102 (1) C3(ma):n lukumäärät erytrosyyttiä kohti olivat 60 000, 350 ooo ja 900 000, tässä järjestyksessä mainittuna, kol-20 messa kokeessa, joissa tätä välituotetta käytettiin

M

C4(ma):n lukumäärät erytrosyyttiä kohti olivat 160 000 ja 140 000, tässä järjestyksessä mainittuna, kahdessa kokeessa joissa tätä välituotetta käytettiin v Kokeiden lukumäärä.

25 -------------------------------------------------------

Kussakin kolmessa erillisesä kokeessa EC3(ma):n kanssa rosette ja muodostavien täysimittaista piABCD-konstruktiota ilmentävien COS-solujen osuus oli samanlainen kuin se , osuus, jolla oli havaittavissa oleva yhdistelmäreseptori, 30 joka määritettiin immuunifluoresenssilla käyttäen CRl:tä . vastaan valmistettua monoklonaalista YZl-vasta-ainetta tai CRl:tä vastaan valmistettua kaniinin antiseerumia (taulukko 3). Sitävastoin solut, jotka ilmensivät piD:tä, eivät muodostaneet rosetteja, joka viittasi siihen, että C3:a sito-35 van(ien) kohta(ien) on oltava LHR-A:ssa, -B:ssä tai -C:ssä « 80 1 0 6 3 1 6 tai tarvittava näiden läsnäoloa. Yhden kohdan osoitettiin esiintyvän sekä LHR-B:ssä että -C:ssä osoittamalla, että joko piBD- tai piCD -konstruktioita ilmentävät solut muodostivat rosetteja EC3(ma):n kanssa. piAD:tä, piA/D:tä tai 5 piE-2:ta ilmentävillä soluilla ei ollut vastaavaa C3:a sitovaa toimintoa. Koska piE-2-konstruktio eroaa piCD:stä vain sen suhteen, että sillä on LHR-A:n SCR-1- ja -2-jak-sot LHR-C:n ensimmäisen kahden SCR-jakson tilalla, näiden NH2-terminaalisten SCR-jaksojen täytyy olla tarpeellisia 10 LHR-C:ssä olevan C3:a sitovan kohdan toiminnalle.

Niiden EC4(ma):n kanssa rosetteja muodostavien COS-solujen osuus, jotka ilmensivät täysimittaista piABCD-yhdistelmä-molekyyliä oli pienempi kuin se osuus, joka muodosti roset-15 teja EC3(ma):n kanssa, mikä mahdollisesti heijasti sitä, että C4(ma)-molekyylejä oli vähemmän erytrosyyttiä kohti (taulukko 3) tai että C4:ää sitovia kohtia oli reseptoria kohti vähemmän. Deleetiomutantit, joilla oli kokonainen tai osittainen LHR-A-, piAD-, piA/D- ja piE-2 -konstruktio, 20 sitoivat EC4(ma):aa paremmin kuin deleetiomutantit piBD ja piCD; tämä toiminto puuttui piD:ltä. CRl:n C4:ää sitova kohta sijaitsee siten ensisijaisesti LHR-A:ssa, vaikkakin sekundaarisia kohtia voi esiintyä LHR-B:ssä ja -C:ssä. piE-2-konstruktion kohonnut rosetinmuodostuskyky piCD:n 25 vastaavan kykyyn verrattuna viittaa siihen, että LHR-A:n SCR-1 ja -2 liittyvät C4:ää sitovaan kohtaan.

CRl:tä vastaan valmistetulla monoklonaalisella YZl-vasta-aineella suoritettu radioimmuunimääritys osoitti, että sitä 30 liittyi merkittävästi COS-soluihin, jotka ilmensivät piABCD-, piAD-, piBD- ja piCD -konstruktioita (taulukko 4). piD:llä tai piA/D:llä, joka käsittää LHR-A:n viisi NH2-ter-minaalista SCR-jaksoa ja LHR-D:n kolme COOH-terminaalista SCR-jaksoa, transfektoidut solut eivät sitoneet CRl:tä vas-35 taan valmistettua YZl-vasta-ainetta, vaikkakin näiden kon- »i 106316 struktioiden tuotteet sitoivat CRl:tä vastaan valmistettua polyklonaalista antiseerumia (taulukko 4) . YZl-epitooppi esiintyy toistumana LHR-A:ssa, -B:ssä ja -C:ssä, se ei esiinny LHR-A:n NH2-terminaalisissa SCR-jaksoissa eikä se 5 esiinny tai se on saavuttamattomissa LHR-D:ssä.

w

Taulukko 4 CRl:tä vastaan valmistetun monoklonaalisen ja polyklonaa-10 lisen CRl-vasta-aineen sitoutuminen COS-solutransfektant-tieihin, jotka ilmentävät CRl:n yhdistelmämuotoja

Sitoutunut Sitoutunut COS-solu- monoklonaalinen kaniinin polyklonaa- 15 transfektantti YZl-vasta-aine1 linen vasta-aine1 piABCD 2362 12277 piAD 2879 19891 piBD 3646 21922 piCD 2189 19926 20 piA/D 410 23052 piD 404 16386 CDM8 428 4886

Rinnakkaisnäytteitä, jotka sisälsivät 3 x 105 solua 0,1 • · 25 ml:ssa fosfaatilla puskuroitua fysiologista suolaliuosta, joka sisälsi l % naudan seerumin albumiinia ja 0.02% nat-riumatsidia inkuboitiin 0°C:ssa 60 minuuttia CRl:tä vastaan valmistetun YZ1 IgGl -mAb:n kanssa, jonka pitoisuus oli 3 μg/ml (Changelian, P.S., et ai., (1985, J. Immunonol. 134, ? 30 1851) tai CRl:tä vastaan valmistetun kaniinin IgG-vasta- aineen kanssa, jonka pitoisuus oli 90 μg/ml. Solut pestiin

T

ja suspendoitiin uudelleen 0.1 ml:aan puskuriliuosta, joka sisälsi 1—2 /iCi/ml 125I-F(ab,)2 vuohen hiirtä vastaan valmistettua IgG:tä tai 125I-proteiini-A:ta. 1—2 tunnin kulut-35 tua 0°C:ssa solut pestiin ja niistä määritettiin I. Esi- 82 1 0 6 3 1 6 tetyt luvut ovat kahdesta rinnakkaisesta määrityksestä laskettuja keskiarvoja, cpm/3 x 105 COS-solua.

5 9.2 Tarkastelu Säilyvä BsmI-kohta, joka esiintyi kunkin LHR-jakson ensimmäistä SCR-jaksoa koodaavan jakson puolivälissä teki mahdolliseksi konstruoida deleetiomutanttien sarjan, joka vastasi tarkasti LHR-jaksojen rajoja ja piti yllä avoimen lu-10 kukehyksen ja neljän kysteiinien sopivia asemia, jotka ovat tarpeen otaksutulle disulfidisidosten muodostumiselle (kuva 16). Näiden deleetiomutanttien C3(ma):ta ja C4(ma):ta sitovien toimintojen vertailun avulla erotettiin toisistaan ei vain nämä spesifiteetit omaavat LHR-jaksot vaan myös ne 15 SCR-jaksot, jotka ovat kriittisiä ligandispesifisyyden mää räytymisen kannalta. Reseptorin piAD-, piA/D- ja piE-2-muotojen kyky, mutta ei piD-muodon kyky, välittää trans-fektoitujen COS-solujen ja EC4(ma):n välistä rosettimuodos-tusta osoitti siten, että LHR-A:n kaksi NH2-terminaalista 20 SCR-jaksoa sisälsi kohdan tämän komplementtiproteiinin kanssa tapahtuvaa vuorovaikutusta varten (taulukko 3). Tämä kohta oli vain suhteellisen spesifinen C4(ma):ta kohtaan, koska transfektantit, jotka ilmensivät piADrtä ja piA/D:tä, pystyivät myös sitomaan EC3(ma):ta (taulukko 3). piBD- ja · 25 piCD-konstruktioiden koodaama reseptorin C3(ma):a sitova toiminto, joka osoitettiin rosettimäärityksellä ja tekijän I kofaktoritoiminnolla C3(ma):n pilkkomikseksi (taulukko 3; kuva 18) , viittasi siihen C3 (ma):ta kohtaan spesifisten kohtien esiintymiseen Näiden LHR-jaksojen ensimmäisessä 30 kahdessa SCR-jaksossa. Nämä kohdat pystyivät myös vuorovaikutukseen C4(ma):n kanssa (taulukko 3). LHR-A:ssa, -B:ssä ja -C:ssä on siten ensisijaisia mutta toistensa kanssa päällekkäisiä C4:ää ja C3:a sitovia aktiivisuuksia.

35 Vaihtoehtoisesti on piBD- ja piCD-konstruktioita ilmentävi- 83 106316 en COS-solujen kyky sitoa EC4(ma):ta voinut aiheutua niiden nukleotidien siirtymisestä, jotka koodaavat LHR-A:n SCR-l:n 36 NH2-terminaalista aminohappoa LHR-B:hen ja -C:hen %

BsmI-fragmenttien ligaation välityksellä. Nämä 36 5 aminohappoa eivät kuitenkaan yksin tuoneet mukanaan piD:n

X

tuotteelle C4-rosettimuodostustoimintoa. Emme voi sulkea pois näissä reaktioissa esiintyvää LHR-D:n sekundaarista toimintoa, koska tämä LHR-jakso esiintyi kaikissa konstruktioissa, joille tehtiin toimintakyvyn määritys. CRl:n 10 kolmen erillisen ligandin tunnistuskohdan löytyminen, joista kaksi on C3b:tä ja yksi C4b:tä varten (kuva 19), viittaa siihen, että kukin reseptorimolekyyli voi kyetä sitomaan tehokkaasti komplekseja, joissa on useita C4b- ja C3b-molekyylejä huolimatta siitä, että niillä on suhteelli-15 sen matala affiniteetti monovalentteja ligandeja kohtaan (Arnaout, M.A., et ai., (1983) Immunology 48, 229). Tämä havainto tarjoaa myös selityksen sille, että liukoinen C4b ei kykene inhiboimaan rosettien muodostusta C3b:tä sisältävien erytrosyyttien ja ihmisen B-lymfoblastoidisolulinjan 20 kesken (Gaither, T.A. , et ai., (1983) J. Immunol. 131, 899). Mahdolliset ligandit, joita varten CRl olisi voinut erityisesti sopeutua, voivat olla molekulaarisia komplekseja C4b/C3b ja C3b/C3b, jotka muodostuvat klassisen ja vaihtoehtoisen reaktiotien aktivaation aikana, tässä jär- t * ·! 25 jestyksessä mainittuna. Koska erilliset sitoutumiskohdat esiintyvät kolmessa neljästä LHR-jaksosta, LHR-jaksojen lukumäärän suhteen toisistaan poikkeavilla CRl:n rakenteellisilla allotypeillä voi olla merkittäviä toiminnallisia eroavuuksia, jotka aiheutuvat ligandia sitovien kohtien 30 määrän vaihteluista. Vaikkakaan in vitro -tutkimuksissa ei · ole raportoitu erilaisia F, S ja F' (A, B ja C, tässä järj-

T

estyksessä mainittuna) allotyyppien sitoutumisaktiivisuuk-sia, pienehköllä F'-allotyypillä, jolla otaksuttavasti on vain kolme LHR-jaksoa, saattaa olla heikentynyt kyky immuu-35 nikcompleksien poistoon. F'-allotyypin on raportoitu mah- 84 106316 dollisesti liittyvän systeemiseen punahukkaan (van Dyne, S., et al., (1987) Clin. Exp. Immunol. 68, 570).

10 Esimerkki: Tekijän I kofaktoriaktiivisuuden osoittami-5 nen

Yhdistelmä-CRl proteiinin ja sen spesifisten fragmenttien sekä solun pintaan sitoutuneiden että solubilisoitujen muotojen osoitettiin omaavan C3b:n tekijän I kofaktoriaktii-visuutta.

10

Tekijän I kofaktoriaktiivisuusmääritykset suoritettiin käyttäen modifikaatiota julkaistusta menetelmästä (Fearon, D.T., (1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76, 5867).

15 Solubilisoidun CRl:n ja sen fragmenttien tekijän I kofakto riaktiivisuuden määrittämiseksi solun pintaan sitoutunut CRl-proteiini ja sen fragmentit solubilisoitiin Nonidet P-40:llä ja lysaatti immuunisaostettiin CRl:tä vastaan valmistetulla monoklonaalisella vasta-aineella YZ-1, joka oli 20 kytketty Sepharose-rakeisiin. Detergenttilysaatit, jotka valmistettiin 1 x 106 transfektoidusta COS-solusta immuunisaostettiin peräkkäin Sepharose-UPCIO-antilevaanilla ja Sepharose-YZ-l:llä. Immuunisaostumasta määritettiin sitten tekijän I kofaktoriaktiivisuus inkuboimalla pestyjä • · 25 rakeita 60 minuuttia 37°C:ssa seoksessa, jossa oli 0,5 /xg 125I-C3(ma) ja 200 ng tekijää I, 0,05 ml PBS ja 0,5% NP-40. Inkuboinnin jälkeen radioaktiivisella leimalla leimattua C3(ma):ta sisältävä supernatantti analysoitiin SDS-poly-akryyliamidigeelielektroforeesilla ja autoradiografiällä. 30 Tekijän I kofaktoriaktiivisuutta osoitti autoradiogrammissa *' esiin tulevat C3(ma):n alfa-ketjun alemman molekyylimassan omaavat muodot, jotka johtuvat tekijän I proteolyyttisestä pilkkoutumisesta.

35 Solun pinnassa olevan CRl:n ja sen fragmenttien tekijän I

85 1 0 6 3 1 6 kofaktoriaktiivisuuden määrittämiseksi inkuboitiin trans-fektoidut CRl-ilmentämisvektorin (piABCDrn, piAD:n, piBDrn, piCD:n, tai piD:n) sisältävät COS-solut seoksen kanssa, , 125 , , * jossa oli 0,5 I-C3(ma) ja 0,2 μg tekijää I (Fearon, 5 D.T., (1977, J. Immunol. 119, 1248) ja analysoitiin edellä kuvatulla tavalla.

Solun pinnassa esiintyvän yhdistelmä-CRl:n tekijän I kofak-toriaktiivisuus esitetään kuvassa 15. Tekijä I pilkkoi 10 C3(ma):n alfa-ketjun molekyylimassaltaan 76 000 ja 46 000 oleviin fragmentteihin ainoastaan immuuniimmobilisoidun yh-distelmä-CRl:n tai H-tekijän läsnäollessa (kuva 15) . Alueet, jotka vastasivat autoradiogrammiossa olevia vyöhykkeitä, irroitettiin geelistä ja niistä määritettiin 125I alfa-15 ketjun pilkkoutuneen määrän määrittämiseksi. H-tekijän läsnäollessa pilkkoutui alfa-ketjusta 91 %, kun taas kasvavien yhdistelmä-CRl-määrien läsnäollessa pilkkoutui 26 %, 41 %, ja 55 %, tässä järjestyksessä mainittuna. Vaikka pelkästään CDM8-vektorilla transfektoidut COS-solut sisälsivät jonkin 20 verran endogeenistä tekijän I kofaktoriaktiivisuutta, tämän toiminnan lisäys kävi selvästi ilmi piABCD:llä, piBD:llä ja piCDillä transfektoiduissa COS-soluissa (kuva 18).

I-c3 (ma):n pilkkoutumisen ei havaittu käyvän yhtään tehokkaammin piAD:llä tai piD:llä transfektoiduissa COS-so- * t 25 luissa. Näissä konstruktioissa siten vain niillä deleetiomutanteilla, piBDrllä ja piCDrllä, jotka toivat COS-soluihin mukanaan kyvyn C3:n sitomiseen, oli myös tekijän I kofaktoriaktiivisuustta C3:n pilkkomiseksi. Tekijän I kofaktoriaktiivisuusmääritysten tulokset, jotka saatiin 30 CRl:n ja sen fragmenttien solun pintaan sidottua ja so- . *’ lubilisoitua muotoa käyttäen, on esitetty taulukossa 5.

T

86 106316

Taulukko 5 CRl:n ja CRl:n fragmenttien solun pintaan kiinnittyneiden ja solubilisoitujen muotojen tekijän I kofaktoriaktiivisuus 5

Tekijän I kofaktoriaktiivisuus1* Plasmidi* Solun pinnassa Solubilisoituna piABCD + +

10 piAD

piBD + NDC

piCD + + piD - NDd 15 a Koodaa määritettyä CRl-proteiinia tai sen fragmenttia ja transfektoitu COS-soluihin ilmentymistä varten.

b (+) merkitseen kofaktoriaktiivisuuden nousua sen endo-geenisen tason yläpuolelle, joka havaitaan transfektoitaes-sa pelkästään CDM8-vektorilla.

20 c ei määritetty d ei määritetty, koska LHR-D:stä puuttuu epitooppi, jonka CRlrtä vastaan valmistetty monoklonaalinen vasta-aine YZ-1 tunnistaa.

I βββββ — - — — « — — — · — — · — — — — — · — — e········ — — · —— —

1 I I

25

Kuten taulukossa 5 on osoitettu, piABCD:n (koodaa täysimittaista CRl-proteiinia), piBD:n (koodaan LHR-B:tä ja -D:tä) tai piCD:n (koodaa LHR-C:tä ja -D:tä) ilmentyminen tuotti CRl-tuotteen, jolla oli C3b:n tekijän I kofaktoriaktiivi-.. 30 suutta. Taulukon 5 tulokset antavat siten todisteita siitä, että CRl-proteiini tai sen fragmentti voi edistää komplementin inaktivoitumista.

11 Esimerkki: Liukoisen yhdistelmä-CRl:n ilmentäminen 35 CRl-cDNA modifioitiin yhdistelmä-DNA-menetelmillä siten, 87 106316 että muodostui CRl:n tai CRl:n fragmenttien liukoinen muoto (sCRl). sCRl konstruktiot ilmennettiin nisäkässysteemissä, jossa ilmennetty proteiini erittyi soluista. Tuotettiin suuria määriä liukoisia polypeptidejä, joita kalvoon sitou-5 tuneista CRl-proteiinien muodoista poiketen ei ollut tarpeen solubilisoida, jotta ne olisi saatu liuokseen.

11.1 Materiaalit ja menetelmät 11.1.1 Pilkkominen entsyymeillä 10 Kaikki pilkkomiset restriktioentsyymeillä, kytkijäjaksojen ligaatiot ja T4 DNA-ligaasi- ja E. coli DNA polymeraasi-reaktiot suoritettiin valmistajan antamien suositusten mukaan (New England Biolabs, Inc., Beverley, MA). E. Coli DH1- tai DH5a- kannat tehtiin kompetenteiksi Morrisonin 15 menetelmällä, (Morrison, D.A., (1979) Meth. Enzymol. 68, 326—331) . Kompetentit bakteerisolut transformoitiin DNA: 11a Maniatisin, T., et ai., mukaan, (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Plasmidit puhdistettiin alkali-20 sessa liuoksessa suoritetulla solujen hajotuksella tai keittomenetelmällä (Maniatis, T., et ai., ks. yllä).

11.1.2 DNA-fragmenttien eristys DNA fragmentit puhdistettiin agaroosi (BioRad, Richmond, ·: 25 CA) -geeleistä seuraavasti. Sopiva DNA-vyöhyke irrotettiin geelistä veitsen terällä ja agaroosisuikale asetettiin pa-rafilmipalaselle, leikattiin hyvin pieniksi kappaleiksi ja siirrettiin uudelle parafilmipalaselle. Agaroosipalaset rikottiin ja agaroosi siirrettiin 1,5 ml:n vetoiseen put- 7 30 keen. Lisättiin samansuuruinen tilavuus fenolia (Ultra pure, BRL, Gaithersburg, MD) ja seos sekoitettiin pyörre-sekoittajassa ja pakastettiin sitten -70°C:ssa 10 minuuttia ja sentrifugoitiin 10 minuuttia. Vesipitoinen faasi uutettiin vielä kahdesti fenoli/kloroformi -seoksella (1 : 1) ja 35 kahdesti kloroformilla. DNA saostettiin sitten etanolilla, se 106316 sakka pestiin, kuivattiin tyhjiössä ja suspendoitiin uudelleen liuokseen jonka koostumus oli 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 ja 1 bM EDTA.

5 DNA-fragmentit eristettiin matalassa lämpötilassa hyytyvästä agaroosista (FMC, Corp., Rockland, ME) seuraavasti. Asianmukainen DNA-vyöhyke irrotettiin agaroosigeelistä, asetettiin 1,5 ml:n putkeen ja sulatettiin 65°C:ssa 15 minuuttia. Nesteytynyt geeli uutettiin fenolilla, joka si-10 sälsi 0,l-%:sta natriumdodekyylisulfaattia (SDS, ultra pure, BRL, Gaithersburg, MD). Vesifaasi uutettiin vielä kerran fenoli-SDS-seoksella ja kahdesti kloroformilla. DNA saostettiin sitten etanolilla 2,0-molaarisessa NH4-asetaa-tissa, kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen veteen.

15 11.1.3 Transfektio nisäkässoluihin DNA:n transfektio nisäkässoluihin suoritettiin CaP04-saos-tus- ja glyserolisokkimenetelmällä, jonka ovat kuvanneet Graham ja van der Eb ((1973) Virology 52, 456—467) . Kun DUX 20 Bll CHO -soluja oli inkuboitu DNA-kalsiumfosfaatti-preparaatissa 4—6 tuntia, ne altistettiin glyserolisokille poistamalla kasvatusliuos imulla ja lisäämällä 5 ml 20-%:sta glyserolia sisältävää DMEM-liuosta 1 minuutiksi. Solut pestiin sitten kahdesti täydellisessä alfa-MEM -·· 25 liuoksessa ja niitä inkuboitiin tässä liuoksessa 48 tuntia.

11.1.4 CHO-transfektanttisolujen viljely DUX Bll CHO -transfektanttisolut kasvatettiin DHFR (dihy-drofolaattireduktaasi) -selektioliuoksessa, joka koostui 30 alfa-MEM -liuoksesta (Gibco), josta puuttuivat nukleosidit ja joka oli täydennetty 10-%:11a dialysoidulla fetaalisen vasikansikiön seerumilla (Gibco) ja 4-millimolaarisella L-glutamiinilla. Amplifiointi suoritettiin kasvattamalla solut nousevissa metotreksaattipitoisuuksissa (Sigma, A-35 6770, Amethopterin) (Kaufman, R.J., et ai., (1985) Molec.

Cell Biol. 5, 1750-1759).

89 1 0 6 3 1 6

11.1.5 Liukoisen CRl-tasojen määritykseen soveltuva ELISA

11.1.5.1 CRl-standardit 5 CRl-standardina ELISA:ssa (entsyymivälitteinen immuunisor-benttimääritys) käytettiin hemoglobiinista puhtaiden punasolujen (RBC) kuorien detergenttilysaatteja. Kuoret valmistettiin aiemmin kuvatulla tavalla (Wong, W.W. ja Fea-ron D.T., (1987) Meth. Enzymol. 150, 579-585). Lyhyesti, 10 päiväyksen ylittänyt kokoveri hankittiin Punaisesta Rististä. Punasolut pestiin kolme kertaa PBS-liuoksessa ja tämän jälkeen ne hajoitettiin 6 tilavuudessa hypotonista hajotus-puskuria (10 mM Tris pH 8, 0,1 mM PMSF (fenyylimetyylisul-fonyylifluoridi), 0,1 mM TPCK (tosyyliamidifenyylietyyli-15 klorometyyliketoni), aprotoniini, 2 mM EDTA). Kuoret pestiin useita kertoja hajotuspuskuriliuoksessa, laskettiin hemosytometrissä, jaettiin eriin ja pakastettiin -70 °C:ssa kunnes niitä tarvittiin. CRl-ELISA-määritystä varten kuoret laimennettiin pitoisuuteen 1,6 x 108 kuorta/ml solubili-20 sointipuskuriliuoksessa (10 mM Tris, pH 8, 50 mM KC1, 0,2 % NP40, 0,3 % DOC, 6,2 mM PMSF, 0,2 mM jodiasetamidi, aprotoniini, 0,1 mM TPCK, 2 mM EDTA, 0,2 % NaN3) ja sarjalai-mennettiin pitoisuuteen 2,5 x 106 kuorta/ml käytettäväksi standardeina ELISA:ssa. Tehtiin kuvaaja absorbansseista 490 25 nm:ssa ja mitä tahansa tuntemattomalla näytteellä suoritettua määritystä verrattiin tähän kuvaajaan siinä olevien kuoriekvivalenttien määrän määrittämiseksi millilitraa kohti.

30 11.1.5.2 CR1-ELISA

Immulon-II levyt päällystettiin 100 μΐ/kuoppa käyttäen CRl:tä vastaan valmistetun monoklonaalisen vasta-aineen (klooni J3D3, AMAC IOT 17) (Cook, J. et ai., (1985) Molec. Immunol. 22, 531—538) pitoisuutta 0,4 pq/ml PBS-liuoksessa 35 ja inkuboitiin yön yli 4°C:ssa. Tämän jälkeen vasta-aine- 90 1 0 6 3 1 6 liuos heitettiin pois ja levyt blokattiin lisäämällä blok-kauspuskuriliuosta (1,0 % BSA PBS:ssa) 300 μΐ/kuoppa ja inkuboitiin 37°C:ssa 2 tuntia. Blokkauksen jälkeen levyt käytettiin välittömästi tai ne varastoitiin 4°C:ssa kunnes 5 niitä tarvittiin.

Levyt pestiin kolme kertaa käyttäen PBS:aa, joka sisälsi 0. 05% Tween-20:a. Näytteitä lisättiin 100 μΐ/kuoppa kahtena rinnakkaisnäytteenä ja ne inkuboitiin 2 tuntia 37°C:ssa.

10 Näytteet laimennettiin solubilisointipuskuriliuoksessa, mikäli tämä oli tarpeen. RBC-kuoristandardit lisättiin mukaan kuhunkin levyyn. Näytteen inkuboinnin jälkeen levyt pestiin kolme kertaa ja piparjuuriperoxidaasi (HRP) -kon- jugaatti (Wilson, M.B. ja NaKane, P.K., (1978) Immunof- 15 luorescence and Related Staining Techniques, North Holland

Biomedical Press, sivut 215-224) ja monoklonaalinen vasta- aine YZ1 (Changelian, P.S. et al., (1985, J. Immunol 184, 1851—1858)laimennettiin 1:8000 liuoksessa, jonka koostumus oli 50% FCS:ää ja 50 % blokkauspuskuria, ja tätä lisättiin 20 100 μΐ/kuoppa. Kahden tunnin pituisen inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa levyt pestiin uudelleen kolme kertaa PBS:llä, joka sisälsi 0,05 % Tween-20:tä. Lisättiin ortofenyleenidiamiini (OPD) -substraattia, jonka pitoisuus oli 0,2 % substraatti-puskuriliuoksessa (0,36 % sitruunahappo H20, 1,74% Na2HP04 25 x 7H20, 0,1 % timerosaali, 0,4 % H202, pH 6,3), 100 μΐ/kuoppa. Reaktio pysäytettiin 20 minuutin kuluttua huoneenlämmössä käyttäen 2-normaalista H2S04:ää 50 μΐ/kuoppa. Luettiin absorbanssit 490 nm:ssä.

30 11.2 CRl:tä koodaavien jaksojen geneettinen modifiointi CRl:n cDNA koostuu noin 6 951 nukleotidiemäsparista (kuva 1, kappaleet 6 ja 7) . Natiivin cDNA:n translationaalinen lopetussignaali sijaitsee emäsparin 6145 kohdalla. Tämä proteiini on kalvoon kiinnittynyt reseptorimolekyyli, joka 35 koostuu neljästä pitkästä homologisesta toistumajaksosta 91 106316 (LHR-jaksosta), jotka esiintyvät vapaina solun kalvolla ja kalvon läpäisevästä alueesta, jonka koko on noin 25 aminohappoa ja jota seuraa karboksiterminaalinen sytoplasmaan ulottuva alue. Tämä sytoplasmassa sijaitseva alue kä-5 sittää neljäkymmentäköIme aminohappoa. Liukoisten CRl-mole-* kyylien (sCRl) tuottamiseksi käyttämämme strategia oli poistaa solukalvon läpäisevä alue, joka ankkuroi proteiini solukalvoon ja ilmentää sitten lyhennetyt konstruktiot erittyvinä polypeptideinä.

10 11.2.1 pBSCRlc:n konstruointi

Plasmidi pBSABCD (esimerkki 8) sisältää CRl-cDNA:n nukleotideistä 1—6860 ja siitä puuttuvat translaatioon osallistumattomat jaksot, jotka sijaitsevat EcoRV-kohdan 3'puo-15 lella nukleotidin 6860 kohdalla. CRl-cDNA omaa yhden kerran esiintyvän Ball restriktioendonukleaasin tunnistuskohdan emäsparin 5914 kohdalla ja kahdenkymmenenyhdeksän emäsparin etäisyydellä kalvon läpäisevän alueen alusta. PBSABCD pilkottiin ensin Ball:llä sellaisen lineaarisen molekyylin 20 muodostamiseksi, jolla oli tasaiset päät, ja se liitettiin sitten T4 DNA -ligaasia käyttäen synteettiseen oligonukle-otidiin, joka koostui kahdesta 38 nukleotidia käsittävästä komplementaarisesta nauhasta, ja joilla oli seuraava jakso: 5' : CCAAATGTACCTCTCGTGCACATGATGCTTAACTCGAG 25 3' : GGTTTACATGGAGAGCACGTGTACTACGAATTGAGCTC

Tulokseksi saadulla molekyylillä oli ennalleen palautettu Ball-kohta ja muunnettu jakso, joka oli natiivin CRl-jak-son mukainen kalvon läpäisevän alueen alussa sijaitsevaan 30 alaniinin asti tämä mukaanlukien. Tämän lisäksi oli välittömästi alaniinin jälkeen muodostettu translaation lope-tussignaali (pienillä kirjaimilla ja alleviivattuna), jonka jälkeen seurasi Xhol-restriktiokohta muunnetun DNA:n jat-kokloonauksen helpottamiseksi.

35 « 106316 Tämän plasmidin (jolle annettiin merkintä pBSCRlc) pilkkominen XhoI:llä irrotti cDNA-liittymäjakson (jolle annettiin merkintä sCRlc) katkaisemalla cDNA:ssa olevan oli-gonukleotidin välityksellä lisätystä Xhol-kohdasta ja 5 pBSKC+®:n moninkertaisessa liitosjaksossa olevasta

Xhol-kohdasta, joka sijaitsee CRl-cDNA:n 5'-puoleisessa päässä. pBSCRlc sisältää seuraavat C-terminaaliset jaksot: Emäs n: o 5911: CTGGCCAAATGTACCTCTCGTGCACATGATGCTTAACTCGAG

Aminohapot: LAKCTSRAHDA END XhoI

10 -kohta 11.2.2. pBSCRls:n konstruointi

Toinen sCRl-konstruktio, jolta puuttui kalvon läpäisevä alue, muodostettiin seuraavasti. pBSABCD pilkottiin 15 Sacl:llä, joka katkaisi yhdestä ainutlaatuisesta CR1- cDNA:ssa olevan nukleotidiemäsparin 5485 kohdalla sijaitsevasta Sacl-kohdasta ja Sacl-kohdasta, joka sijaitsi CRl-cDNA:n 3'-puoleisessa päässä olevassa isäntäplasmidin moninkertaisessa kloonauskohdassa. Tällä tavoin pilkkomal-20 la saatiin erotetuksi 1375 nukleotidiä cDNA:n 3'-päässä olevasta DNA-jaksosta. Tämä fragmentti poistettiin sitten elektroforettisesti. Vapaat päät saadussa plasmidissa, joka sisälsi jäijelläolevan sCRl-cDNA:n, tasoitettiin T4 DNA -polymeraasia käyttäen ja suoritettiin ligaatio tasoitet-·' 25 tuihin päihin. Ligaatioon käytettiin myös Pharmacian yleis käyttöistä translaation lopetuskohtatuotetta (tuoteluettelon numero 27-4890-01, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) , joka on itsensä suhteen komplementaarinen oligomeeri ja joka sisältää translaation lopetussignaalit kaikissa kol-30 messa lukulukukehyksessä. Kun ligaatio oli tehty, . “ sCRl-cDNA:han saatiin liitetystä oligomeerista käyttöön uusi translaation lopetussignaali.

11.2.3 pBM-CRlc:n konstruointi 35 pBMT3X on eukaryoottinen ilmentämisvektori (Krystal, M., 93 1 0 6 3 1 6 et ai., (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 2709—2713) joka sisältää ihmisen metallotioneiini-lA -geenin, joka tekee solut vastustuskykyisiksi kohonneita raskasmetalli-tasoja vastaan, kuten esimerkiksi kadmiumia vastaan. Vekto-5 ri sisältää myös hiiren metallotioneiini-1 -geenin, joka ' sisältää muokatun Mt-l-proteiinin aloituskodonia edeltävän

Xhol-kohdan. Xhol-kohtaa käytetään liittymäjakson sijoi-tuskohtana hiiren Mt-l-promoottorin ohjaamana tapahtuvaa geenien ilmentämistä varten.

10 sCRlc-liittymäjakso (noin 5,9 ke.) irrotettiin pBSCRlc:stä käyttäen XhoI:tä ja liitettiin sitten ligaasin avulla pBMT3X-vektorin ainutkertaiseen Xhol-kohtaan. pBMT3X:ssä olevan sCRlc-liittymäjakson oikea orientaatio määritettiin 15 pilkkomalla restriktioentsyymeillä (Maniatis, T., et ai., (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Tulokseksi saadulle plasmidille annettiin nimitys pBM-CRlc.

20 11.2.4 Deleetiomutanttien pT-CRlcl, pT-CRlc2, pT-CRlc3, pT-CRlc4 ja pT-CRlc5 konstruktio

Konstruoitiin myös useita eri deleetiomutantteja, joissa olevasta sCRl-cDNA:sta oli poistettu osia spesifisellä tavalla (kuva 20) . Kustakin deleetiomutantista puuttui täysi-25 mittaisen cDNA:n kalvon läpäisevä alue, jotta mutanttien ilmentäminen tuottaisi liukoisia polypeptidejä.

11.2.4.1 pT-CRlcl pBSCRlc pilkottiin Smal:llä, josta oli tuloksena kaksi ' 30 fragmenttia, joiden koot olivat 2,56 ke ja 733 ke. Nämä • fragmentit erotettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja 7,3 ' ke:n fragmentti puhdistettiin ja liitettiin ligaasin avulla takaisin itseensä. E. coli DH5a -solut tehtiin kompetenteiksi (Morrison, D.A. (1979) Meth. Enzymol. 68, 94 106316 326-331) ja transformoitiin sitten ligaatioseoksella. Tulokseksi saadulle plasmidille annettiin nimitys pBL-CRlcl. Tämä konstruktio poisti 38% LHR-B:stä, 100% LHR-C:stä ja 51% LHR-D:sta, jotka kuuluivat CRlc-liittymäjaksoon.

5 Lisäksi se muodosti uudelleen Smal-kohdan 2335/4894 emäspa-rien liittymäkohdan ja säilytti oikean lukukehyksen. pBL-CRlcl pilkottiin XhoI:llä ja CRl-liittymäjakso erotettiin pBluescript®-vektorista. Eristetty CRl-fragmentti liitettiin sitten ilmentämisvektorin pTCSgpt:n vain kerran 10 esiintyvään Xhol-kohtaan plasmidin pT-CRlc muodostamiseksi .

11.2.4.2 pT-CRlc2 pBSCRlc pilkottiin Clal:llä ja Ballillä, josta saatiin tu-15 lokseksi kaksi fragmenttia, joiden koko oli 3,96 ke. ja 5,9 ke. Nämä fragmentit puhdistettiin agaroosigeelistä. Plasmidi pBR322 pilkottiin Clal:llä ja Ballillä ja 2,9 kein kokoinen pBR322 -fragmentti puhdistettiin ja siihen liitettiin ligaasin avulla 5,9 kein kokoinen fragmentti 20 pBSCRlcistä. E. coli DH5a -solut transformoitiin ligaatioseoksella ja tulokseksi saadulle plasmidille annettiin nimitys pBR8.8. Tämä plasmidi pilkottiin Xbalillä, josta muodostui kaksi fragmenttia, joiden koko oli 7,45 ke. ja 1,35 ke. 7,45 kein kokoinen fragmentti puhdistettiin agaroosi-25 geelistä ja liitettiin uudelleen takaisin itseensä. Tulokseksi saatu plasmidi, pBR7.45, pilkottiin Clalillä ja Ball: llä ja eristetty sCRl-cDNA:ta sisältävä 4,5 kein kokoinen fragmentti liitettiin ligaasin avulla pBSCRlcistä saatuun 3,96 kein kokoiseen fragmenttiin, jonka tuloksena saa-30 tin plasmidi pBL-CRlc2. Tämä konstruktio poisti 90 % . sCRl-liittymäjaksossa olevasta LHR-B:stä, muodosti uudel leen emäsparien 1637/2987 yhtymäkohdassa sijaitsevan Xbal-kohdan ja piti yllä oikean lukukehyksen. pBL-CRlc2 pilkottiin Xholillä ja sCRi-liittymäjakso erotettiin 8 ...

35 pBluescnpt vektorista. Eristetty sCRl -fragmentti lutet- 95 106316 tiin sitten ilmentämisvektorissa pTCSgpt vain kerran esiintyvään Xhol-kohtaan plasmidin pT-CRlc2 muodostamiseksi.

11.2.4.3 pT-CRlc3 5 pBSCRlc pilkottiin Nsil:llä, josta saatiin tulokseksi kolme * fragmenttia, joiden koot olivat 1,09 ke, 1,35 ke ja 7,46 ke. 7,46 kein kokoinen fragmentti puhdistettiin agaroosi-geelistä ja liitettiin takaisin itseensä ligaasin avulla, jolloin muodostui plasmidi pBL-CRlc3. Tämä konstruktio 10 poisti 77 % LNR-A:sta ja loppuosan CRl-liittymäjaksosta. Nsil-kohta muodostettiin uudelleen emäsparien 463/2907 yhtymäkohtaan. Translaation kehysjakso muunnettiin siten, että "nonsense" kodoni tuotiin välittömästi uudelleen muodostetun Nsil-kohdan jälkeen. pBL-CRlc3 pilkottiin Xholillä 15 ja sCRl-liittymäjakso erotettiin pBluescript -vektorista. Eristetty sCRl-fragmentti liitettiin sitten ilmentämisvek-torissa pTCSgpt vain kerran esiintyvään Xhol-kohtaan plasmidin pT-CRlc3 muodostamiseksi.

20 11.2.4.4 pT-CRlc4 pBSCRlc pilkottiin Pstlillä. pBluescript :n moninkertaisella liitosjaksoalueella oleva Pstl-kohta oli poistettu tähän vektoriin suoritetun CR1 cDNAin ligaation aikana (esimerkki 8.1). Tulokseksi saadut fragmentit, joiden koko oli 1,35 ·. 25 ke. ja 8,5 ke, erotettiin geelielektroforeesilla ja 8,5 kein kokoinen fragmentti puhdistettiin ja liitettiin takaisin itseensä, jolloin muodostui plasmidi pBL-CRlc4. Tämä konstruktio poisti CRl-liittymäjaksossa olevasta LHR-Aista 31 % ja LHR-Bistä 69 %. Pstl-kohta muodostettiin uudel-30 leen emäsparien 1074/2424 liittymäkohtaan, jolloin oikea . lukukehys säilyi. pBL-CRlc4 pilkottiin Xholillä ja sCRl- liittymäjakso erotettiin pBluescript* -vektorista. Eristetty sCRl fragmentti liitettiin sitten ilmentämisvektori pTCSgptissä vain kerran esiintyvään Xhol-kohtaan plasmidin 35 pT-CRlc4 muodostamiseksi.

96 106316 11.2.4.5 pT-CRlc5 pBL-CRlcl pilkottiin Smal:llä, jonka seurauksena plasmidi linearisoitui siinä vain kerran esiintyvästä Smal-kohdasta. 5 Plasmidi defosforyloitiin ja se liitettiin fosforyloituun Nhel-liitosjaksoon, joka sisälsi "nonsense" kodonin (New England Biolabs, Beverley, MA). Tämän tyyppinen liitosjakso sisältää translaation lopetuskodonin kaikissa kolmessa mahdollisessa lukuvaiheistusjaksossa ja se myös sisältää Nhel-10 restriktiokohdan, joka helpottaa "nonsense"-liitosjakson esiintymisen vahvistamista sCRl-cDNA:ssa. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pBL-CRlc5:ksi ja siinä säilyi sCRl-cDNA:n LHR-A ja 62 % LHR-B:stä. PBL-CR1C5 pilkottiin * , » . ® Xholrllä 3a sCRl-liittymäjakso erotettiin pBluescnpt 15 -vektorista. Eristetty sCRl-fragmentti liitettiin sitten ilmentämisvektorissa pTCSgpt vain kerran esiintyvään

Xhol-kohtaan plasmidin pT-CRlc5 muodostamiseksi.

11.3 Liukoisen CRl:n ilmentäminen 20 Kuten tässä työssä on osoitettu, sellaisen CRltn liukoisen muodon ilmentäminen, joka voidaan erittää soluista saannon ollessa korkea, (i) ei rajoitu yhteen tarkasti määräytyvään CRl-cDNA:ssa olevaan kohtaan, jota käytetään deleetion tai lyhentämisen aikaansaamiseksi ja (ii) ei myöskään rajoitu • 25 tietyn nimenomaisen ilmentämisvektorin käyttöön (ks.

myöh.). Kyky eritetyn sCRl:n tuottamiseen osoitettiin kahdessa erilaisessa ilmentämissysteemissä.

11.3.1 pTCS-ilmentämisvektorisarjän konstruktio 30 Käytetty pTCS-ilmentämisvektorisarja koostuu kolmesta plasmidista, joilla kaikilla on vain kerran esiintyvä Xhol-kloonauskohta cDNA-molekyylien liittämistä varten (kuva 21). Liitetyn cDNA:n transkriptiota ohjaa peräkkäisten promoottorien kokoelma. SV40:n varhainen promoottori, joka 35 sijaitsee vastasuunnassa ennen adenovirus 2:n pääasiallista 97 106316 myöhäistä promoottoria (AD2 MLP). cDNA:n alkukohdan ja AD2 MLPa:n välissä on adenoviruksen kolmiosainen johtojakso. Transkriptiotuotteina olevat mRNA-molekyylit päättyvät po-lyadenylaatiosignaalin kohdalla, joka saadaan hiiren im-5 munoglobuliini kappa (Igk) -jaksoista, jotka sijaitsevat . myötäsuunnassa cDNA:n Xhol-kloonauskohdan jälkeen. Selek- toivat markkerit ksantiini-guaniinifosforibosyylitransfe-raasi (gpt), dihydrofolaattireduktaasi (dhfr) tai neo-mysiiniresistenssi (neor) saatiin liittämällä näitä vastaa-10 vat markkerit pSV2gpt:stä, pSV2dhfr:stä tai pSV2neo:sta, tässä järjestyksessä mainittuna. Nämä plasmidit tarjosivat myös bakteerin replikaatioaloituskohdan ja beta-laktamaasi-geenin ampisilliiniresistenssiä varten. Käytettävän vektorin valinta riippuu yleensä siitä, mitä selektoivaa markke-15 ria tai markkeriyhdistelmää pidetään muita edullisempana rekombinanttien selektioon.

Adenovirus 2:n (Ad2), SV40:n ja pSV2cat:n (Gorman, C., (1985) DNA Cloning, Osa II, A Practical Approach, toim.

20 D.M. Glover, IRL Press, sivut 143—190) ja hiiren kappa-im- munoglobuliinin täydelliset DNA-jaksot tunnetaan. Jaksot . . ® säilytetään GenBank tietokannassa ja ne on viety National Biomedical Research -laitokseen tallennettuina ja viitteinä. Mikä tahansa näistä jaksoista voisi myös toimia sopivi-" 25 en pTCS-vektorisegmenttien lähteenä.

Vektorit pTCSgpt, pTCSneo ja pTCS dhfr konstruoitiin plas-midivälimuodoista pEAXgpt ja pMLEgpt seuraavasti 30 11.3.1.1 pEAXgpt:n konstruktio . Vaihe l. Ad2 MLP DNA-fragmentti oli johdettu M13 * ' mp9/MLP:stä (Concino, M.F., et ai., (1983) J. Biol. Chem.

258, 8493—8496). Tämä plasmidi sisältää adenovirus 2 -jaksot alkaen nukleotidistä 5778 (Xhol-kohta) ja ulottuen nuk-35 leotidiin 6231 (Hindlll-kohta) mukaan lukien PvuII-rest- * 98 106316 riktiokohdan nukleotidin 6069 kohdalla ja SacII-kohdan nukleotidin 5791 kohdalla (ks. NBRF nukleiinihappotietokanta, hakukoodi Gdad2). Xhol-kohdasta Hindlll-kohtaan ulottuva fragmentti oli kloonattu M13mp9:n Hindlll- ja Sali-kohtiin 5 plasmidin M13mp9/MLP muodostamiseksi.

Plasmidi M13mp9/MLP pilkottiin EcoRIillä ja HindIII:lla ja pienempi MLP:n sisältävä fragmentti eristettiin. pUC-plas-midi (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) pilkottiin myös Eco-10 RI:llä ja Hindlllilla ja suurempi fragmentti tästä plasmi-dista liitettiin sitten ligaasin avulla MLP:n EcoRI^-Hindlll fragmenttiin. Tästä oli tuloksena uusi MLP:n sisältävä plasmidi, jolla oli pUC:n plasmidirunko. Tämä plasmidi pilkottiin Smallllä, liitettiin ligaasin avulla Sall-liitos-15 jaksoihin ja siitä muodostettiin uudelleen rengasmainen plasmidi. Tämä uusi plasmidi pilkottiin sitten PvuII:lla, joka katkaisi plasmidin PvuII-kohdasta, joka sijaitsi asemassa 6069 adenovirus 2 -liittymäjaksossa. Tulokseksi saatu lineaarinen fragmentti liitettiin ligaasin avulla Xhol-lii-20 tosjaksoihin ja siitä muodostettiin uudelleen rengasmainen plasmidi. Tämä plasmidi pilkottiin sitten Xholillä ja Sällillä ja pienempi MLP-DNA:ta sisältävä fragmentti eristettiin (fragmentti n:o 1).

.. 25 Vaihe 2. Plasmidi pSV2gpt (American Type Culture Collection (ATCC) hakunumero 37 145) pilkottiin PvuIIilla, liitettiin ligaasin avulla Sall-liitosjaksoihin ja pilkottiin Sällillä. Lopullinen tuote oli lineaarinen pSV2gpt-frag-mentti, jota käytettiin gpt-geenin lähteenä (fragmentti nio 30 2).

Vaihe 3. Hiiren immunoglobuliini Ig/cin fragmentti (Hieter, P.A., et ai., (1980) Cell 22, 197—207) pilkottiin

Haelllilla ja Availi 11a ja polyadenylaatiojaksot sisältävä 35 fragmentti eristettiin. Hiiren Ig:n kappa-jaksossa, joka on 99 1 0 6 3 1 6 saatavilla NBRF nukleiinihappotietokannassa (hakukoodi Kcms), Ig:n lopetuskodoni on asemassa 1296, jota seuraa Avall-kohta asemassa 1306, polyadenylaatiokohta AATAAA asemassa 1484 ja Haelll-kohta asemassa 1714. Tämän fragmen-5 tin vapaat päät täytettiin E. colirn DNA-polymeraasilla ja , fragmentti liitettiin sitten ligaasin avulla Xhol-liitos- jaksoihin ja pilkottiin Xholrllä. Tämä fragmentti (fragmentti n:o 3) toimi polyadenylaatiokohdan lähteenä.

10 Vaihe 4. Fragmentit 1, 2, ja 3 liitettiin yhteen T4 DNA-li-gaasilla rengasmaisen plasmidin muodostamiseksi. Fragmenttien oikea orientaatio tässä plasmidissa vahvistettiin restriktioentsyymianalyysilla. Myötäsuunnassa cDNA-kloo-nauskohdan XhoI jälkeen oli hiiren kappa-polyadenylaatio-15 kohta ja vielä kauempana tästä kohdasta oli SV40-promoot-tori ja gpt-geeni. Vastakkaiseen suuntaan Xhol-kohdasta oli MLP-promoottori ja tässä suunnassa vielä kauempana tästä promoottorista oli bakteerin replikaation alkukohta ja am-pisilliinigeeni. Tämä plasmidi pilkottiin sitten Sallrllä 20 ja vapaat päät täytettiin E. colirn DNA-polymeraasilla. Tulokseksi saatu päistään tasoitettu fragmentti liitettiin ligaasin avulla EcoRI-liitosjaksoihin ja muutettiin uudelleen rengasmaiseksi T4 DNA -ligaasilla. Tälle lopulliselle plasmidille annettiin nimitys pEAXgpt.

25 11.3.1.2 pMLEgptrn konstruktio

Vaihe l. Plasmidi pMLP CAT (Lee, R.F., et ai., (1988) Viro-logy, 165, 51-56) on ilmentämisplasmidi, jolla on pML-vek-torin runko ja se sisältää adenovirus 2 MLPrn ja kolmiosai-, 30 set johtojaksot CAT-geenin 5'-puolella. pMLP CAT pilkottiin

Xholrllä ja SacIIrlla, XhoI katkaisi kohdassa, joka oli ' CAT-geenin ja kolmiosaisen johtojakson L3-alueen välissä ja

SacII katkaisi asemasta 5791, joka oli adenovirus-DNA:ssa mutta MLPrn 5'-puolella. AD2 MLP ja kolmiosainen johtojakso 35 sijaitsivat siten tässä pienessä XhoI—SacII -fragmentissa 100 106316 (fragmentti n:o 4).

Vaihe 2. Plasmidi pEAXgpt pilkottiin XhoI:llä ja SacII:lla ja pienempi MLP:n sisältävä fragmentti heitettiin pois.

5 Suurempi fragmentti (fragmentti n:o 5) eristettiin. Fragmentit 4 ja 5, joissa molemmissa oli SacII- ja Xhol-päät, liitettiin ligaasin avulla plasmidin pMLEgpt muodostamiseksi.

10 11.3.1.3 pTCSgptrn konstruktio

Vaihe 1. pMLEgpt pilkottiin SacII:11a ja päät täytettiin T4 DNA-polymeraasilla tasaiset päät omaavan fragmentin muodostamiseksi (fragmentti 6) . Tämä SacII-kohta sijaitsee nukleotidin 5791 kohdalla adenovirus 2:n jaksossa ja kolmiosai-15 sen MLP-johtojakson 5'-puolella.

Vaihe 2. pSV2dhfr (ATCC hakunumero 37 146) pilkottiin Hin-dIII:lla ja PvuIIrlla. Pienempi 342 nukleotidin fragmentti, joka sisälsi SV40:n varhaisen promoottorin, muunnettiin 20 tasapäiseksi käyttäen E. colin DNA-polymeraasin Kle- now-fragmenttia (fragmentti 7). Fragmentit 6 ja 7 liitettiin T4 DNA-ligaasilla. Restriktioentsyymianalyysi vahvisti, että fragmentit olivat orientoituneet oikein ja että niistä saatiin kaksi peräkkäistä promoottoria, jotka ovat 25 vastasuunnassa ennen cDNA-kloonauskohtaa Xhol ja siten, että kumpikin promoottori kykenee aloittamaan RNA-synteesin samaan suuntaan. Tälle plasmidille annettiin nimi pTCSgpt (kuva 22).

30 11.3.1.4 pTCSdhfr:n konstruktio

Vaihe 1. pSV2dhfr pilkottiin HindIII:lla ja PvuII:lla ja suurempi fragmentti puhdistettiin sitten agaroosigeelistä (fragmentti n:o 8). Pienempi SV40:n varhaisen promoottorin sisältävä fragmentti heitettiin pois.

35 101 106316

Vaihe 2. pTCSgpt pilkottiin EcoRIrllä ja täytettiin sitten E. colin DNA-polymeraasin Klenow-fragmentilla tasaisten päiden muodostamiseksi. Tämä lineaarinen fragmentti pilkottiin sitten HindIII:lla ja tästä eristettiin fragmentti 5 (noin 1600 nukleotidiä), joka sisälsi SV40-promoottorin pTCS-transkriptioyksikön, MLP:n kolmiosaisen johtojakson, cDNA-kloonauskohdan XhoI, hiiren IgA-jaksot ja toisen SV40-promoottorin (fragmentti n:o 9). Tällä fragmentilla oli yksi tasainen pää ja yksi vapaa Hindlll-pää. Fragment-10 tien 8 ja 9 liittäminen ligaasilla muodosti plasmidin pTCSdhfr.

11.3.1.5 pTCSneo:n konstruktio

Vaihe l. pSV2neo (ATCC No. 37149) pilkottiin HindIII:lla ja 15 BamHIilla ja suurempi fragmentti (fragmentti n:o 10) eristettiin. Tämä fragmentti sisälsi plasmidirungon ja neo-geenin.

Vaihe 2. pTCSdhfr pilkottiin HindIII:lla ja BamHI:llä ja 20 pTCS-transkriptioyksikkö (fragmentti n: o 11) eristettiin agaroosigeelistä pilkkoutumistuotteiden elektroforeesin jälkeen. Fragmenttien 10 ja 11 liittäminen ligaasilla muodosti plasmidin pTCSneo.

25 11.3.2 Plasmidien pBSCRlc, pBSCRls ja pBM-CRlc, liukoista CRl:tä koodaavat jaksot sisältävien nisäkäsilmentämisvekto-rien, ilmentäminen ja määritys 11.3.2.1 CRl-cDNA:n eri asemista lyhennettyjen CRl-kon-struktioiden ilmentäminen 30 Konstruoitiin plasmidit pBSCRlc ja pBSCRls (kappale 11.1) siten, että suurin osa cDNA:n koodaavista alueista lukuun-

T

ottamatta kalvon läpäisevää ja sytoplasmassa olevia alueita säilyi (kuva 20) . pBSCRls on lyhempi kuin pBSCRlc, koska siltä puuttuu myös osa LHR-D:tä ja SCR-jaksot 29 ja 30, 35 jotka molemmat esiintyvät pBSCRlc:ssä. Näiden plasmidien 102 1 0 6 3 1 6 sCRl-osat liitettiin pTCSgpt:hen, jonka jälkeen suoritettiin transfektio ja ilmentäminen edellä kuvatulla tavalla.

PBSCRlc/pTCSgpt konstruktio: pBSCRlc pilkottiin XhoI:llä 5 5,9 ke:n kokoisen liittymäjakson, sCRlc:n, muodostamiseksi.

sCRlc liitettiin pTCSgpt:n cDNA-kloonauskohtaan XhoI pBSCRlc/pTCSgpt:n muodostamiseksi.

PBSCRls/pTCSgpt konstruktio: pBSCRls pilkottiin XhoI:llä ja 10 PvuI:llä sCRls-liittymäjakson vapauttamiseksi. Liittymäjak son päät tasoitettiin T4 DNA-polymeraasilla. Tämä liittymä-jakso puhdistettiin agaroosigeelistä. Vektori pTCSgpt pilkottiin XhoI:llä ja vapaat Xhol-päät täytettiin E. colin DNA-polymeraasi I:llä. Seuraavaksi sCRls-liittymäjakso lii-15 tettiin ligaasin avulla tasaisilla päillä varustettuun vektoriin pBSCRls/pTCSgpt:n muodostamiseksi. Plasmidit pBSCRlc/pTCSgpt ja pBSCRls/pTCSgpt pilkottiin Fspl:llä ja saadut lineaariset DNA-molekyylit transfektoitiin kiinan-hamsterin munasarjasoluihin, jotka olivat dhfr-geenin mu-20 tantteja (CHO DUX Bll solut), kalsiumfosfaatilla suoritetun plasmidin pSV2dhfr rinnakkaissaostuksen välityksellä. Transfektantit selektoitiin niiden kyvyn perusteella kasvaa DHFR-selektioliuoksessa. Transfektanttikloonien viljelmien supernatanteista määritettiin erittyvä sCRl käyttäen ELI-25 SA:a. Määritettiin viidestäkymmenestä pBSCRlc/pTCSgpt-re-kombinantista saadut viljelmien supernatantit ja positiivisille rekombinanteille suoritettiin monistus viljelemällä niitä nousevissa metotreksaattipitoisuuksissa. Tämän lisäksi valmistettiin transfektanttien yhdistelmäviljelmä vilje-30 lemällä kahdeksaa pBSCRlc/pTCSgpt -transfektanttia yhdessä ·; yhtä yhdistelmäviljelmää kohti ja suorittamalla näille sa manlainen monistus. Monistuksen tulokset on esitetty taulukossa 6.

103 106316

Taulukko 6 pBSCRlc/pTCSgpt:n ilmentäminen - 5 Erittynyt liukoinen CR1 (Mg/ml)

Klooni 0 MTX 20 nM MTX 50 nM MTX 100 nM MTX 500 nM MTX

• 21 0,7 3,4 11 10,9 10 4 0,04 0,1 6 0,04 9 0,02 10 0,2 11 0,12 15 12 0,14 13 0,07 14 0,2 15 0,45 1,1 7,3 9,0 21 0,07 20 30# 0,27 <0,02 <0,02 351t 0,82 6,3 8,4 10,9 10,9 40 0,05 41 0,05 50 0,12 25 52 0,12

Yhdistelmäviljely A 0,02 30 B 0,04 C 0,23 D <0,02 <0,02 E 0,27 1,1 F 3,6 5,8 9,1 35 G 0,27 H 0,04 kloonit 2 ja 35 valittiin suuressa mittakaavassa tapahtuvaa sCRl:n tuotantoon.

40 t kloni 35 jatkokloonattiin rajalaimenntuksella ja liukoisen CRl:n tuotto määritettiin kustakin jatkokloonista. pBSCRlc/pTCSgpt-klooni 35.6 oli suurin tuottaja, jonka tuottaman sCRl:n pitoisuus osoitattui olevan 17,7 Mg/ml 45 MTX : metotreksaatti

T

106316 104 pBSCRls/pTCSgpt:stä saaduista 12 rekombinantista määritettiin liukoisen CRl:n tuotto ELISA:11a. Kaikista 12 ehdok-kasta havaittiin havaittavissa olevia eritetyn sCRl:n tasoja. Parhaat tuottajat tuottivat sCRl-tasoja, jotka olivat 5 verrattavissa parhaimpien pBSCRlc/pTCSgpt -transfektanttien tuottamiin tasoihin. PBSCRlc/pTCSgpt- ja pBSCRls/pTCSgp -rekombinantit tuottivat liukoista CRl:tä samanlaisilla tuotantotasoilla. Tämä viittasi siihen, että liukoisen CRl-polypeptidin tuottokyky ei riippunut CRl-cDNA:n lyhentämi-10 sestä tietystä tarkasti määräytyvästä kohdasta.

11.3.2.2 sCRlc:n ilmentäminen kahdessa eri ilmentämissys-teemissä

Lyhennetty CRl-cDNA liittymäjakso, sCRlc, liitettiin ilmen-15 tämisvektoriin pTCSgpt ja ilmennettiin edellä kuvatulla tavalla. Se liitettiin myös ilmentämisvektoriin pBMT3X kappaleessa 11.2.3 kuvatulla tavalla pBM-CRlc:n muodostamiseksi. Näillä molemmilla ilmentämisvektoreilla on hyvin vahvat promoottorit. Liukoisen CRltn ilmentäminen testat-20 tiin molemmissa systeemeissä sen määrittämiseksi, voisiko yksi systeemi tuottaa parempia erittyvän polypeptidin saantoja. Hiiren C127I-solut (ATCC hakunumero CR1 1616, Rockville, Maryland) transfektoitiin pBM-CRlc:llä käyttäen kal-siumfosfaattimenetelmää (Graham, F.L. ja van der Eb, A.J., 25 (1973) Virology 52, 456-467). Glyserolisokin jälkeen soluille annettiin uudestaan D-MEM-ravintoliuosta, joka sisälsi 10-%:sta sikiökautisen naudan seerumia ja 2 mM L-glutamiinia, ja niitä inkuboitiin 37°C:ssa 48 tuntia. Tämän jälkeen solut trypsinisoitiin ja jaettiin suhteessa ·· 30 1:5 ja 1:10 täydelliseen D-MEM-kasvatusliuokseen, johon oli '! lisätty 10 /xM kadmiumkloridia. Kadmiumresistenttejä pesäk keitä ilmestyi 10 päivässä. Kymmenen pesäkettä poistettiin kloonaussylintereitä käyttäen. Kukin pesäke siirrettiin 60 mm petrimaljalle, joka sisälsi täydellistä D-MEM-ravintoli-35 uosta, ja inkuboitiin 37°C:ssa, 5-%:sessa C02:ssa kunnes 105 1 0 6 3 1 6 solut saavuttivat konfluentin tilan. Tämän jälkeen kullakin maljalla olevat solut trypsinisoitiin ja jaettiin kolmeen 60 mm maljaan käytettäväksi pakastettujen varastosolukanto-jen valmistamiseen, RNA:n uuttamiseen ja solukasvatusliuok-5 sen ELISA-testeihin erittyneen sCRlc:n esiintymisen mää-5 rittämiseksi.

Kun solujen kasvatusliuos poistettiin kustakin konfluentis-ta petrimaljasta ja sille suoritettiin ELISA-analyysi, oli-10 vat kaikki testatut pBM-CRlc-kloonit positiivisia liukoisen CRl:n tuoton suhteen. Eritetyn sCRl:n tasotpBM-CRlc-rekom-binanteista olivat verrattavissa pBSCRlc/pTCSgpt-rekombi-nanteista saatuihin tuottotasoihin. Tämä viittasi siihen, että eritetyn sCRl-polypeptidin korkeiden tasojen tuottoky-15 ky ei riippunut vain tiettyjen promoottorien tai ilmentä- missysteemien käytöstä.

11.3.3 Plasmidien pT-CRlcl, pT-CRlc2, pT-CRlc3, pT-CRlc4 ja pT-CRlc5, liukoista CRl:tä koodaavia jaksoja sisältävien 20 nisäkäsilmentämisvektorien, ilmentäminen ja määritys pT-CRlc-deleetiomutanttisarjasta puuttuivat kalvon läpäisevät ja sytoplasmassa olevat alueet samalla tavoin kuin konstruktioiden pBSCRlc:n ja pBSCRls:n suhteen oli laita. Tämän lisäksi deleetiomutantit sisälsivät myös melko suuria ' 25 CRl-cDNA:n useiden eri LHR alueiden deleetioita (ks. kuva 20). Deleetiomutantteja ilmennettiin CHO DUX Bll-soluissa ja tuotetut liukoisen CRl-polypeptidin tasot mitattiin. Kustakin deleetiokonstruktiosta valittiin neljäkymmentä eri kloonien yhdistelmäviljelmää ELISA-analyysiin sen määrittä-30 miseksi, tapahtuiko liukoisten CRl-polypeptidien tuottoa.

” Kaikkien viiden pT-CRlc-konstruktioiden havaittiin erittä vän sCRlrtä solujen kasvatusliuokseen joko ELISA:11a tai solujen kasvatusliuoksessa esiintyvän toiminnallisen aktiivisuuden määrityksellä määritettynä. Supernatantit soluis-35 ta, jotka oli transfektoitu neljällä viidestä pT-CRlc-kons- we 1C6316 truktiosta, tuottivat sCRl:tä, joka oli toimintakykyinen hemolyyttisellä määrityksellä määritettynä (ks. taulukko 7 ja kappale 13.2).

5 ---------------------------------------------------------

Taulukko 7

Toimintakykyisten sCRl-fragmenttien tuotto

Konstruktio ELISA Hemolyyttinen määritys 10 --------------------------------------------------------- pT-CRlcl - + pT-CRlc2 + + pT-CRlc3 - + 15 pT-CRlc4 + ei määritetty pT-CRlc5 - + ELISA:n tai hemolyyttisten määritysten suhteen testatut supernatantit saatiin joko viljelmistä, jotka kasvoivat 20 T75-pulloissa tai 24-kuoppaisissa kuoppalevyissä. Koska eri määriä liukoista CRl:tä oli saattanut kertyä viljelmäsuper-natantteihin näissä olosuhteissa, esitetyt tulokset ovat kvalitatiivisia.

(+) tarkoittaa toiminnallisen sCRl:n muodostumista osoite-25 tulla määrityksellä määritettynä.

Se seikka, että deleetiomutantit kykenivät myös tuottamaan liukoista CRl:tä, osoitti lisäksi sen, että kyky ilmentää 30 sCRl:tä ei riippunut yhdestä CRl-cDNA:n tarkkarajaisesta

V

* geneettisestä modifikaatiosta. Sikäli kuin kalvon läpäise vät alueet oli deletoitu, kaikki konstruktiot kykenivät tuottamaan liukoista polypeptidiä.

35 12 Esimerkki: Liukoisen CRl:n tuotto ja puhdistus a 106316 107

Suuria sCRl-määriä tuotettiin ontelokuitubioreaktorisystee-missä. Saadut sCRl:n määrät olivat suhteessa ympättyjen rekombinanttikloonien suhteelliseen saantoon. Optimaalisten puhdistustulosten saavuttamiseksi valittiin sellainen see-5 rumia sisältämätön ravintoliuos, josta oli tuloksena korkeat sCRl:n tuottotasot samalla kun vältyttiin käyttämästä suurta määrää ulkopuolelta lisättyjä sikiökautisen vasikan seerumin polypeptidejä.

10 12.1 Liukoisen CRl:n tuotto suuressa mittakaavassa

TV

Steriileissä olosuhteissa koottiin Cell-Pharm Cell Culture System I (CD Medical, Inc., Miami Lakes, FL), joka oli varustettu mallin IV-L ontelokuitubioreaktorilla (30 kD mole-kyy1imassainen päästöraja). Kaksi kloonia 15 (pBSCRlc/pTCSgptrn klooni 2 ja klooni 35) laajennettiin kahdeksaan T-225-pulloon. Konfluenttisen tilan saavuttaneet solut trypsinisoitiin, pestiin, kerättiin napiksi sentrifu-giputkeen ja suspendoitiin uudelleen kasvatusliuokseen. Noin 5 x 108 solua kloonista 2 ja 10 x 108 solua kloonista 20 35 ympättiin kahteen erilliseen ontelokuitubioreaktoriin.

Käytettiin 20 litran syöttösäiliötä, jossa oli alfa-MEM-kasvatusliuosta, johon oli lisätty l0-%:sta sikiökautisen vasikan seerumia, 8 mM L-glutamiinia, 100 μg/τal penisilliini-streptomysiiniä ja sopiva pitoisuus metotreksaattia (50 25 nM kloonin 2 ollessa kyseessä, 500 nM kloonin 35 ollessa kyseessä). Esisekoitettua kaasua (5-%:nen C02 ilmassa) kup-litettiin säiliössä olevaan liuokseen hapettimen läpi pH:n ylläpitämiseksi. Liuoksen kierrätys, korvaus ja kaasun virtausnopeudet säädettiin maksimaalisen tuoton aikaansaami-30 seksi. Näytteet kerättiin talteen ymppäysläpivientien kautta, sentrifugoitiin 1000 kierroksen minuuttinopeudella 10 minuuttia, suodatettiin 0,22 μιη:η huokoskokoisen suodattimen läpi ja säilytettiin 4°C:ssa ennen puhdistusta. Talteenotetun erän tilavuutta ja ottotiheyttä nostettiin vähi-35 telien viljelmän alkuvaiheessa käytetystä 25 ml:sta ja koi- 108 106316 mesti viikossa tapahtuvasta talteenotosta 40 ml:aan ja viisi kertaa viikossa tapahtuvaan talteenottoon 2-3 kuukauden kuluttua. sCRl:n tuotto määritettiin CR1-ELISA:11a. Kloonin 2 ja kloonin 35 saannot ensimmäisen kuukauden jälkeen ymp-5 päyksestä olivat 66 /ig/päivä ja 1060 jug/päivä, tässä järjestyksessä mainittuna. Nämä saannot suurenivat viljelmien vakiinnuttua.

12.1.1 sCRl:n tuotto seerumittomissa kasvatusliuoksissa 10 Kahdesta kaupallisesti saatavilla olevasta seerumittomasta kasvatusliuoksesta testattiin niiden kyky ylläpitää solujen kasvua ja sCRl:n tuottoa. Konfluentti pBSCRlc/pTCSgpt-kloonin 35 T75-pullo jaettiin kahteen T75-pulloon. Toisen pullon viljelyyn käytettiin alfa-MEM-liuosta, jota oli täy-15 dennetty 10-%:sella sikiökautisen vasikan seerumilla, L-glutamiinilla, antibiooteilla ja 500-nanomolaarisella metotreksaatilla. Toisessa pullossa oleva viljelmä totutettiin kasvamaan vaiheittain 5-%:sessa, l-%:sessa, 0,5-%:ses-sa ja 0-%:sessa sikiökautisen vasikan seerumissa, joka oli 20 lisätty alfa-MEM-kasvatusliuokseen, jossa oli täydennyksenä L-glutamiinia, antibiootteja, 500 μΜ metotreksaattia ja HB CHO -kasvatuslisäaineita (Hana Biologies, Inc., Alameda, CA). Näissä kahdessa pullossa esiintyvää solujen kasvua ja sCRl:n tuottotasoja verrattiin toisiinsa. Solujen kasvu 25 seerumittomissa kasvatusliuoksissa ei koskaan saavuttanut konfluenssia. sCRl:n tuottotasot on esitetty taulukossa 8. Kummassakin tapauksessa sCRl:n tuottotasot olivat parhaat, kun solut kasvatettiin 10-%:sessa sikiökautisen vasikan seerumisa. Vertailun vuoksi 14. päivänä havaitut tasot see-30 rumittomassa liuoksessa olivat 1,4 x 1010 kuorta/ml verrattuna 10-%:sella sikiökautisen vasikan seerumilla täydennettyyn liuokseen, josta saatiin 4,2 x 1010 kuorta/ml.

106316 109

Taulukko 8 sCRl:n tuotto seerumittomassa kasvatusliuoksessa, jota on 5 täydenetty CHO-kasvatuslisäaineilla verrattuna 10-%:sta si-' kiökautisen vasikan seerumi sisältävään liuokseen* 4. päivä 7. päivä 11. päivä 14. päivä 10 Pullo 1 CHO-kasvatus lisäaine

ynnä 5% FCS 1% FCS 0,5% FCS 0% FCS

2,6 2,4 2,95 1,4 15

Pullo 2 10% FCS 4,8 3,85 4,3 4,2 20 * ilmoitettuna 1010 kuorta/ml

Solujen kasvu ja sCRlrn tuotto rekombinanteissa testattiin käyttäen toista seerumittoman kasvatusliuoksen lähdettä ; : 25 (CHO-1, Ventrex Laboratories, Inc., Portland, ME). Koska seerumissa kasvatettuja soluja ei ollut tarpeen totuttaa tähän kasvatusliuokseen, solut sulatettiin ja viljeltiin suoraan tässä seerumittomassa kasvatusliuoksessa. Tämä kas-vatusliuos koostuu DME-F12-perusliuoksesta ja kasvatuslisä-30 aineesta. Sulatettiin sama määrä soluja, jotka vietiin 24-kuoppaisen levyn erillisiin kuoppiin. Sen jälkeen kun solut

T

olivat kiinnittyneet, kasvatusliuos heitettiin pois ja joko 10-%:sta sikiökautisen vasikan seerumia sisältävä kasvatus-liuos tai seerumiton kasvatusliuos lisättiin asianmukaisiin 35 kuoppiin. Kummankin olosuhteen testaus suoritettiin kahtena 106316 110 rinnakkaisena testinä. Aiemmin testatusta seerumittomasta kasvatusliuoksesta poiketen valmistajan Ventrex Laboratories toimittama CHO-1 -kasvatusliuos sai aikaan samanlaisen solujen kasvutason kuin sikiökautisen vasikan seerumia si-5 sältävä kasvatusliuos.

12.1.2 Johtopäätökset

Edellä kuvatut tulokset viittasivat siihen, että sCRlrtä tuottavia CHO-soluja voitiin kasvattaa määritellyssä seeru-10 mittomassa kasvatusliuosksessa. Tästä oli tuloksena kustannussäästöjä, jotka kohdistuivat suurimittakaavaisissa tuo-tantokasvatuksissa käytettäviin kasvatusliuoksiin. Vielä yhtenä etuna oli se, että sCRlrn puhdistus soluviljelmä-supernatanteista tuli yksikertaiseksi, koska sikiökautisen 15 vasikan seerumiproteiineja ei ollut tarpeen poistaa.

12.2 Liukoisen CRl:n puhdistus

Kun saatiin käytettäväksi spesifiset CRl:tä vastaan valmistetut vasta-aineet, kävi mahdolliseksi korvata puhdistetun 20 CRl:n tuottamiseen tarvittavat monet kromatografiset vaiheet yksinkertaisella kaksivaiheisella menetelmällä. Tämä lisäsi saavutettavissa olevia CRl-proteiinien saantoja noin 1-5 mg:aan CRl:tä 5,9 x 1013 erytrosyyttiä kohti (Wong, W.W., et ai., (1985) J. Immunol. Methods 82, 303-313). Kos- i 25 ka tämä raportoitu puhdistus koski kalvoon sitoutuneita CRl-muotoja, oli aina tarpeen solubilisoida CRl:tä sisältävä materiaali detergentteihin.

Rekombinanttitransfektanttien tuottamaa liukoista CRl:tä ei 30 tarvitse solubilisoida detergentteihin sen puhdistamiseksi; se on valmiiksi liukoinen. Vaikkakin liukoinen CR1 voidaan puhdistaa CRl:tä vastaan valmistetulla vasta-aineella suoritettavalla kromatografiällä (katso jäljempänä), tämä menetelmä ei sovellu helposti suurimittakaavaiseen tuotan-35 toon. Mittakaavan nostoa rajoittaa se CRl:tä vastaan vai- L11 106316 mistetun vasta-aineen määrä, joka voidaan saada talteen vasta-ainepuhdistuspylväiden vasta-ainematriisin valmistamiseksi. Tämän lisäksi vasta-aineen kuten YZ-l:n korkea sitoutumisaffiniteetti CRl:tä kohtaan merkitsee sitä, että 5 melko voimakkaasti vaikuttavia olosuhteita, kuten esimerkiksi pH:ta 12,2, on käytettävä sitoutuneen sCRl-tuotteen erottamiseksi vasta-ainematriisista (Wong, W.W., et ai., (1985) J. Immunol. Methods 82, 303-313).

10 Jotta saataisiin kapasiteettia puhdistaa hyvin suuria liukoisen CR1:n määriä, kehitettiin puhdistusmenetelmiä, joissa käytettiin HPLC-pylväitä. Näissä HPLC-pylväissa voidaan helposti nostaa mittakaavaa yhä suurempien puhdistetun liukoisen CRl:n määrien tuottamiseksi. Lisäksi niissä ei tar-15 vita voimakkaasti vaikuttavia olosuhteita sCRlrn eluoimi-seksi ja saamiseksi talteen.

12.2.1 Puhdistus vasta-aineaffiniteettipylväässä 12.2.1.1 Menetelmät 20 sCRltn vasta-aineaffiniteettipuhdistusta varten kytkettiin 100 mg monoklonaalista vasta-ainetta YZ-1 kovalenttisesti 7 mg:aan AffiGel-ΐθ:tä (BioRad, Richmond, CA) valmistajan ohjeiden mukaan. CRl:tä sisältävä soluviljelmistä saatu supernatantti inkuboitiin immobilisoidun YZ-l:n kanssa pul-J 25 lossa, jota heiluteltiin 4°C:ssa yön yli. Tämä materiaali kaadettiin lasipylvääseen ja pestiin hyvin liuoksella, jonka koostumus oli 10 mM Hepes ja 0,1 M NaCl, pH 7. sCRl elu-oitiin käyttäen liuosta, jonka koostumus oli 20 mM natrium-fosfaatti ja 0,7 M NaCl, pH 12 (Yoon, S.H. ja Fearon, D.T., 30 (1985) J. Immunol. 134, 3332—3338) . Eluoiduista fraktioista testattiin proteiinin esiintyminen käyttäen Biorad Protein

T

Assay (BioRad, Richmond, CA) -tuotetta. Proteiinia sisältävät näytteet yhdistettiin välittömästi ja dialysoitiin yön yli 0,1 M Hepes -liuoksessa, jonka pH oli 7, (2x1 litraa) 35 4°C:ssa. Näyte dialysoitiin sitten PBS:ssa. CRl:n esiinty- • ♦ * 112 106316 minen analysoitiin CR1-ELISA:11a.

12.2.1.2 Tulokset pBSCRlc/pTCSgpt -transfektanttikloonin 2 tuottamaa sCRl:tä 5 sisältävä soluviljelmäsupernatantti vietiin CRl:tä vastaan valmistettua vasta-ainetta käyttäen valmistettuun affini-teettipylvääseen ja sCRl-fraktiot yhdistettiin piikin alueelta. Erä tätä puhdistettua materiaalia ajettiin 4—20% SDS-PAGE geelissä (DAIICHI; Inc., polyakryyliamidigeelit; 10 modifioitu julkaisun Laemmli, U.K., (1970) Nature 227, 680—685 mukainen menetelmä). Liukoisen CRl:n näennäinen molekyylimassa pelkistävissä olosuhteissa oli noin 224 000 daltonia (kuva 24). Tämän puhdistetun CRl:n osoitettiin myös olevan aktiivinen sen kyvyn perusteella inhiboida 15 komplementin välittämää hemolyysia sekä C5a:n ja C3a:n tuottoa (kappale 13).

12.2.2 CRl:n puhdistus HPLCtllä 12.2.2.1 Menetelmät 20 12.2.2.1.1 Lähtömateriaali

Kun lähdettiin bioreaktoreihin vasta perustetuista viljelmistä, sCRl:n tuoton tasot olivat matalampia verrattuna siihen kun viljelmät olivat kasvaneet useita kuukausia. Kului yleensä useita viikkoja ennen kuin bioreaktorissa 25 olevat solut saavuttivat konfluenssin ja tuottivat maksi maalisia tasoja sCRlrtä. Soluviljelmäsupernatantit, joissa oli matala sCRl-taso, voitiin väkevöidä ennen puhdistusta joko ammoniumsulfaattisaostuksella tai ultrafiltraatiolla. Supernatanttien ammoniumsulfaattifraktiointi 60—80 % kyl-30 läisyysalueella saosti sCRl:n saantojen ollessa oleellisesti ekvivalenttisia. Sakka liuotettiin minimitilavuuteen ja dialysoitiin lähtöpuskuria vastaan kationinvaihto-HPLC:tä varten. Vaihtoehtoisesti CHO-soluviljelmäsupernatantit voitiin väkevöidä ultrafiltraatiolla ja dialysoida lähtöpusku-35 ria vastaan kationinvaihtokromatografiaa varten.

113 106316

Koska bioreaktorit tuottivat korkeampia liukoisen CRl:n pitoisuuksia, näistä viljelmistä saadut CHO-soluviljelmä-supernatantit voitiin dialysoida suoraan lähtöpuskuria vas-5 taan kationinvaihtokromatografiaa varten .

9 12.2.2.1.2 Kationinvaihto-HPLC-menetelmä Näytteet dialysoitiin lähtöpuskuriliuosta vastaan (0,02 M natriumfosfaatti ja 0,06 N natriumkloridi, pH 7,0) ja suo-10 datettiin sitten 0,2 μιη:η suodattimen läpi minkä tahansa hiukkasmaisen materiaalin poistamiseksi. Näyte vietiin sitten kationinvaihto-nestekromatografiapylvääseen (Raininin valmistama, 10 cm x 10 mm, Hydropore-SCX HPLC -pylväs). Pylväs pestiin ja eluoitiin natriumkloridigradientilla ja 15 kehitettiin käyttäen liuosta, jonka koostumus oli 0,02 M fosfaatti ja 0,5 N NaCl, pH 7,0. sCRl eluoitui alueella, joka sijoittui jollekin alueelle välillä 0,06 N—0,25 N NaCl. Eluutiota monitoroitiin 280 nm:ssa mitatulla absor-banssilla ja ELISA:11a.

20 12.2.2.1.3 Anioninvaihto-HPLC-menetelmä

Haluttaessa voitiin kationi-HPLC:llä puhdistetun sCRl:n jatkopuhdistukseen käyttää anioni-HPLC:tä. Anioni-HPLC:tä varten kationi-HPLC:stä saaadut huipun alaiset fraktiot : 25 dialysoitiin lähtöpuskuriliuosta vastaan. Näytteet vietiin pylvääseen ja pylväs (Rainin valmistama Hydropore-AX) pestiin 0,01 M fosfaatissa, pH 7,5. Pylväs eluoitiin vaiheittain ja gradientit kehitettiin käyttäen 0, 01 M fosfaattia ja 0,5 N NaCl:ää, pH 7,5. sCRl eluoitui alueella 0,0—0,3 N 30 NaCl. Eluutiota monitoroitiin kuten kationinvaihto--HPLCrssä. Kationi- ja anioni-HPLC-pylväiden puskuriliuosten pitoisuudet ja pH ovat vain esimerkkejä. Muut puskuri-liuospitoisuudet, suolaolosuhteet tai pH-olosuhteet voivat olla käyttökelpoisia.

35 114 106316 12.2.2.1.4 Western blot -analyysi Western-blottaus suoritettiin käyttäen modifioitua menetelmää, jonka ovat julkaisseet Towbin, H., et ai., (1979)

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 4350—4354. Lyhyesti esitet-5 tynä, puhdistettu sCRl ajettiin 4-20% SDS-PAGE:ssa, siirrettiin nitroselluloosalle, sille suoritettiin koetinkäsit-tely spesifisellä CRl:tä vastaan valmistetulla vasta-aineella (hiiren mAb YZ-1 tai J3D3) ja se havaittiin vuohen hiirtä vastaan valmistetulla vasta-aineella, joka oli kon-10 jugoitu alkaliseen fosfataasiin.

12.2.2.2 Tulokset

Tyypillisessä suorituksessa käytettiin 50-100 ml bioreakto-riviljelmästä saatua supernatanttia, joka dialysoitiin läh-15 töpuskuriliuosta vastaan ja vietiin 10 cm x 10 mm kationin-vaihto-HPLC-pylvääseen. Huipun fraktiot määritettiin ELISA: 11a ja absorbanssilla 280 nmrssä ja nämä yhdistettiin. Yhdistetyn erän proteiinipitoisuus määritettiin absorbanssilla 280 nm:ssä (1%) 280 nm:ssä = 10, arvioituna CRlc:n 20 aminohappokoostumuksesta). Useita kymmeniä milligrammoja puhdistettiin 100 ml:sta monistetun viljelmän supernatanttia.

Yhtenä esimerkkinä voidaan mainita, että 100 ml viljelmä-25 supernatanttia pBSCRlc/pTCSgpt -transfektanttikloonista 2 tuotti 22 mg puhdistettua sCRl:tä määritettynä absorbanssilla 280 nm:ssä, kun käytettiin puhdistusta kationi--HPLCrllä (kuva 24). CR1-ELISA:11a monitoroituna saannon laskettiin olevan 202 % ja lisäksi 13 % läpivirranneessa ψ 30 tai pylvään pesufraktiossa. 100 % ylittävä saanto heijastaa mahdollisesti matriisivaikutuksia ELISA:ssa.

Kun lähdetään niistä viljelmäsupernatanttimääristä, joita voidaan ottaa bioreaktorista, tulisi tällä metotreksaatti-35 monistuksen tasolla olla mahdollista tuottaa noin 100 mg « · 106316 115 puhdistettua liukoista CRlrtä bioreaktoria kohti viikossa. On joitakin keinoja, joilla tätä tuottotasoa voidaan nostaa ja näihin kuuluvat lähtöviljelmien monistaminen maksimaali-sesti metotreksaatilla ennen niiden lisäystä bioreaktoriin, 5 kulloinkin tuotannossa olevien bioreaktorien määrän lisääminen ja suuremman kapasiteetin omaavien HPLC-pylväiden käyttö.

12.2.2.3 Puhdistetun liukoisen CRlrn luonnehtiminen 10 Kationi-HPLC:stä saatu sCRl:tä sisältävä huipun fraktio (kuva 24) puhdistettiin edelleen anioni-HPLC:llä. sCRl-ma-teriaalin puhtaus eri vaiheissa testattiin SDS-PAGE:lla (kuva 25). Näissä suurta näytemäärää käyttäen tutkituissa geeleissä havaitut pienemmät vyöhykkeet edustavat sCRl 15 fragmentteja sellaisella Western-blottausanalyysillä määri tettynä, jossa käytettiin CRlrtä vastaan valmistettuja mo-noklonaalisia vasta-aineita YZ1 tai J3D3. sCRlrn fragment-tivyöhykkeitä ei havaittu useimmissa preparaateissa.

20 Puhdistetun sCRlrn toiminnallinen aktiivisuus testattiin käyttäen sen kykyä inhiboida klassista komplementtivälit-teistä hemolyysiä 50-%:sesti puhdistetun sCRlrn pitoisuuden ollessa 0,25 μg/ml. Puhdistettu liukoinen CR1 kykeni myös inhiboimaan klassista komplementin C5a tuottoa 50-%rsesti r 25 pitoisuudessa 5 jug/ml ja C3arn tuottoa 50-%rsesti pitoisuudessa 13 μg/ml (ks. kappale 13).

12.2.2.4 Johtopäätökset

Kuten edellä on kuvattu, kehitimme liukoisen CRlrn puhdis-3 0 tautiseksi parannetun menetelmän, jonka mittakaavaa voidaan helposti nostaa sellaisten sCRl-määrien tuottamiseksi, joi-

T

ta tarvitaan terapeuttisissa sovellutuksissa. Tämän menetelmän peruselementteihin kuuluivat lähtömateriaali, joka on jo valmiiksi liukoinen ja joka tekee tarpeettomaksi kal-35 voon sitoutuneen CRlrn detergenteillä tapahtuvan solu- • » » 116 106316 116 bilisoinnin. Sikiökautisen vasikanseerumipitoisuuksien pienetäminen bioreaktoriviljelmissä ja/tai vaihtoehtoisten kasvatusliuosten käyttö näissä viljelmissä teki tarpeettomaksi suurten ulkopuolelta lisättyjen proteiinipitoisuuksi-5 en poiston sCRl:tä sisältävästä lähtömateriaalista myöhempien puhdistusten aikana. Lisäksi HPLC-puhdistusmenetelmän kehittäminen tarjosi käyttöön menetelmän suuressa mittakaavassa tapahtuvaan puhdistukseen. Puhdistukseen voidaan käyttää joko kationi-HPLC:tä tai yhdistelmää, jossa käyte-10 tään kationi-HPLC:tä ja tämän jälkeen tehtyä anioninvaih-to-HPLC:tä. Huomattavan puhdasta liukoista CRlttä, jota saadaan korkealla saannolla, voidaan valmistaa tällä menetelmällä vain 1 tai 2 vaihetta käyttäen.

15 13 Esimerkki: Liukoisen CRl:n in vitro -aktiivisuuden osoittaminen 13.1 Neutrofiilien hapettavan purkauksen inhibitio Sydäninfarktin aikana syntyvän kudosvaurion perfuusion pa-lautumisvauriomallissa aiheuttavat aktivoidut komplementin 20 komponentit neutrofiilien tarttumisen ja aktivoitumisen.

Aktivoidussa neutrofiilisolussa tapahtuu hapettava purkaus, joka muodostaa erittäin toksisia happiradikaaleja. Näitä ja muita potentiaalisia toksiineja vapautuu neutrofiilien de-granulaation aikana, jolloin ympäröivä kudos vaurioituu, •ί 25 Liukoinen CR1 voi pienentää vaurioituneen kudosalueen kokoa estämällä C3a:n ja C5a:n, neutrofiilisolujen aktivaatioon liittyvien komplementin komponenttien, muodostumista.

Jotta oltaisiin voitu monitoroida liukoisen CRl:n kykyä 30 estää C5a:n muodostuminen komplementin aktivaation aikana in vitro, käytettiin biomääritystä, jolla voidaan kvanti-toida neutrofiilisolujen tuottamien happiradikaalien muodostuminen C5a:n aiheuttaman happipurkauksen aikana (Bass, D.A., et ai., (1983) J. Immunol. 130, 1910—1917). Tässä 35 määrityksessä käytetään dikloorifluoreskeiinidiasetaattia v · 9 106316 117 i W w (DCFDA), lipidiliukoista molekyyliä, joka pystyy tunkeutumaan soluihin, jäämään niiden sisään ja muuttumaan hapet-tuessaan erittäin fluoresoivaksi.

5 13.1.1 Materiaalit ja menetelmät ' 13.1.1.1 Materiaalit Käytetyt materiaalit olivat tuore kokoveri, ihmisen komplementin lähttömateriaali (Beth Israel Hospital, Boston, MA), kuivattu leipomohiiva, PBS, jossa oli 0,1 % gelatiinia ja 10 5 mM glukoosia, 100 mM EDTA, 10 mM DCFDA HBSSissa (Kodak), punasolujen (RBC) hajoituspuskuriliuos (Ortho Diagnostics), puhdistettu C5a (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ja liukoinen CR1.

15 13.1.1.2 Neutrofiilisolujen valmistus

Neutrofiilisolut valmistettiin Bassin (1983, J. Immunol. 130, 1910—1917) kuvaamalla tavalla. 2,0 ml kokoverta pestiin 3 kertaa PBS-gelatiini-glukoosi -liuoksessa, suspen-doitiin uudelleen 5 ml:aan 10 μΜ DCFDA:ta, joka oli 20 HBSS:ssä, johon oli lisätty 5 ml PBS-gelatiini-glukoosi -liuosta ja inkuboitiin 15 minuuttia 37°C:ssa. Tämän jälkeen solut sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen 2,0 ml:aan PBS-gelatiini-glukoosi plus 5 mM EDTA -liuokseen.

· 25 13.1.1.3 Hiivapartikkelien valmistus

Kuivattu leipomohiiva suspendoitiin uudelleen H20:hon, pestiin 2 kertaa ja keitettiin 30 minuuttia. Partikkelit pestiin uudelleen 2 kertaa H20:ssa ja suspendoitiin uudelleen H20:hon pitoisuuteen 0,5 g/ml (Simpson, P.J., et ai., ks. 30 edellä).

13.1.1.4 Neutrofiilisolujen aktivaatio puhdistetulla C5a:11a 100 μΐ DCFDA:ta sisältäviä soluja käsiteltiin RBC-hajotus-35 puskuriliuoksella, pestiin kerran PBS-gelatiini-glukoosi- 118 106316 EDTA -liuoksessa ja suspendoitiin uudelleen 1,0 ml:aan PBS-gelatiini-glukoosi -liuosta. Viisikymmentä μΐ puhdistettua C5a:ta, pitoisuus 200 ng/ml, tai kontrolli lisättiin 0,5 ml:aan kohteena olevia soluja 37°C:ssa ja analysoitiin 5 virtaussytometrissä eri aikavälein.

13.1.1.5 Neutrofiilisolujen aktivaatio puhdistetulla C5a:lla ihmisen seerumissa tai plasmassa 10 100 μΐ DCFDA:ta sisältäviä soluja inkuboitiin 30 minuuttia 50 μ1:η kanssa C5a:ta, joka oli laimennettu suhteessa 1:1 ihmisen seerumiin tai heparinisoituun plasmaan (100 ng/ml) tai kontrolliin 37°C:ssa. RBC:t hajotettiin ja neutrofii-lisolut analysoitiin virtaussytometrissä.

15 13.1.1.6 Neutrof iilisolujen aktivaatio hiivapartikkeleilla aktivoidulla ihmisen seerumilla tai plasmalla 425 μΐ tuoreena pakastettua seerumia ja plasmaa sekä 50 μΐ sCRlrtä tai kontrollia inkuboitiin 25 μ1:η kanssa hiivapar-20 tikkeleita 37°C:ssa 30 minuutin ajan. Komplementilla aktivoidut ja kontrollinäytteet sentrifugoitiin sitten hiiva-partikkelien poistamiseksi. Kukin näistä näytteistä laimennettiin kymmenellä 2-kertaisella laimennuksella PBS-gela-tiini-glukoosi-EDTA -liuoksessa. 50 μΐ kontrollin ja akti-25 voidun seerumin ja plasman kustakin sarjalaimennuksesta lisättiin 50 μΙ’.ΆΆη DCFDA:ta sisältäviin kohdesoluihin ja inkuboitiin 37°C:ssa 30 minuuttia. Tämän jälkeen RBC:t ha-joitettiin ja neutrofiilisolut analysoitiin virtaussytome-rissä 30 .*! 13.1.2. Tulokset 13.1.2.1. C5a aiheuttaa ihmisen neutrofiilisoluissa happi-purkauksen, joka voidaan mitata DCFDA:ta käyttäen Kuva 26 esittää ihmisen neutrofiilisolujen fluoresenssivoi-35 makkuuden nopean nousun puhdistetulla C5a:lla suoritetun 119 106316 stimulaation jälkeen. Neljän minuutin kuluessa C5a (lopullinen pitoisuus 20 ng/ml) -lisäyksestä, neutrofiilisolut olivat 10 kertaa kirkkaampia kuin kontrollina olevat DCFDA:ta sisältävät neutrofiilisolut. 20 minuuttiin neutro-5 fiilisolut olivat 20 kertaa kirkaampia kuin kontrollit. Tämä määritys näyttää olevan herkkä C5a-indikaattori.

13.1.2.2 Ihmisen seerumi estää puhdistetun C5a:n happipur-kausvaikutukset neutrofiilisoluihin 10 Fluoresenssin voimakkuuden ei havaittu lisääntyvän neutro-fiilisoluissa, jotka sisälsivät DCFDA:ta ja jotka oli inku-boitu puhdistetun C5a:n kanssa, joka oli laimennettu ihmisen seerumiin. Tämä vaikutus voi johtua verihiutaleista peräisin olevasta kasvutekijästä (PDGF), joka vapautuu ve-15 rihiutaleista hyytymisen aikana. On osoitettu, että pienet PDGF-määrät voivat estää C5a:n aiheuttaman neutrofiilisolu-jen aktivaation (Wilson, E., et ai., (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 2213—2217).

20 13.1.2.3 Heparinisoitu plasma ei estä C5a:n vaikutuksia neutrofiilisoluihin

Heparinisoituun plasmaan laimennussuhteessa 1 : 1 laimennettu C5a aiheutti happipurkauksen DCFDArta sisältävissä neutrofiilisoluissa. Vaikkakin fluoresenssivoimakkuuden " 25 lisäys ei ollut yhtä dramaattinen kuin puskuriliuokseeen tehdyllä C5a:lla, tämä lisäys oli kymmenkertainen neutro-fiilisolujen 30 minuutin inkuboinnin jälkeen. Pienentyneen signaalin on voinut aiheuttaa PDGF:n vapautuminen laskimon leikkauksen tai plasman eristyksen aikana. Hellävaraisempi 30 ja nopeampi plasman eristys veren solukomponenteista voisi *· minimoida PDGF:n vapautumisen ja mahdollistaa C5a:n parem man toiminnan.

13.1.2.4 Komplementin aktivaation aikana esiintyvä sCRl 35 estää C5a:n muodostumisen « 120 106316

Tsymosaanin aiheuttamassa ihmisen komplementin aktivaatiossa esiintyi liukoisen CRl:n läsnäollessa alentunutta C5a-aktiivisuutta DCFDA-määrityksellä mitattuna. Kuten kuvasta 27 voidaan nähdä, suhteessa l : 16 laimennettu ihmisen 5 plasma, joka oli aktivoitu sCRl:n läsnäollessa, synnytti 70 % vähemmän fluoresenssin voimakkuuden kohoamista neutro-fiilisoluissa kuin laimennettu plasma, joka oli aktivoitu ilman, että sCRl oli läsnä. Tämä tarkoittaa sitä, että sCRl inhiboi C5a:n muodostumista. Vielä pidemmälle viedyllä 10 DCFDA-määrityksen ja plasman keruun optimoinnilla päästäisiin vielä dynaamisempaan ja herkempään liukoisen CRl-ak-tiivisuuden määritykseen.

13.2 Komplementin välittämän hemolyysin inhibitio 15 13.2.1 Menetelmät

Komplementin estokyky testattiin määrittämällä komplementin välittämän punasolujen hajoamisen (hemolyysin) inhibitio. Hemolyysin inhibitio määritettiin liukoisen CRl-pitoisuuden funktiona. Testattavat sCRl-näytteet laimennettiin 0,1 M 20 Hepes-puskuriliuoksessa (0,15 N NaCl, pH 7,4) ja jokaisesta näistä otetut 50 μ1:η erät lisättiin V-pohjaisen mirotiit-terilevyn kuoppiin tyypillisesti kolmena rinnakkaisena näytteenä. Komplementin lähteenä käytetty ihmisen seerumi laimennettiin suhteessa 1 : 125 Hepes-puskuriliuokseen ja 25 näistä otetut 50 μ1:η erät lisättiin kuhunkin kuoppaan.

Seuraavassa vaiheessa käytettiin kaupallisesti saatavilla olevia lampaan erytrosyyttejä lammasta vastaan valmistetun vasta-aineen kanssa (Diamedix tuoteluettelon n:o 789-002) toimittajalta saadussa muodossaan ja näitä lisättiin 100 30 μΐ/kuoppa hemolyysiin johtavan komplementin reaktioiden ·; sarjan käynnistämiseksi. Levyä inkuboitiin 60 minuuttia 37°C:ssa, jonka jälkeen sentrifugoitiin 500 x g:ssä 10 minuuttia. Supernatantit poistettiin ja ne vietiin tasapohjaiseen mikrotiitterilevyyn. Hemolyysiaste mitattiin näyt-35 teen absorbanssin funktiona 410 nm:ssa. Maksimaalinen ab- 106316 121 sorbanssi (maksimaalista hemolyysiä vastaava), Amax, saatiin vähentämällä vain ihmisen seerumia sisältävän erytrosyyt-tinäytteen absorbanssi, As, vain punasoluja sisältävän näytteen absorbanssista, A . Näinollen A on A -A . A..

u 'o max s o näyte 5 on määritelty siten, että se vastaa sekä ihmisen seerumia että sCRlrtä sisältävän erytrosyyttinäytteen absorbanssin ja vain sCRl:tä sisältävän solunäytteen absorbanssin välistä erotusta. Inhibitio, IH, on ilmoitettu suhteena (Amax'A näyte/Amax^ 3a ^50 on määritelty sCRl:n pitoisuutena, 10 joka tarvitaan tuottamaan IH-arvo 1/2. Kromatografisten fraktioiden monitorointiin ei liitetty mukaan seerumittomia kontrolleja ja komplementtia vastaan kohdistuvaa aktiivisuutta monitoroitiin kvalitatiivisesti näytteen absorbanssin alenemisena 410 nmtssa.

15

Edellä kuvattua hemolyyttistä määritystä käytettiin arvioitaessa ihmisen yhdistelmä-sCRl:n kykyä inhiboida myös muiden lajien kuten marsun tai rotan komplementin aiheuttamaa lampaan punasolujen hajoamista. Kummankin lajin kyseessäol-20 lessa käytettiin komplementtilähteenä tuoreena pakastettua seerumia tai tuoreena lyofilisoitua seerumia tai plasmaa. Joissakin tapauksissa seerumit saatiin kaupallisesta lähteestä (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO).

t 25 Seerumista titrattiin ensin sen kyky hajoittaa aktivoituja punasoluja. Korkein laimennus, jolla saatiin ainakin 80 % maksimaalisesta punasolujen hajoamisesta, valittiin käytettäväksi lisätyn ihmisen sCRl:n vaikutusten arvioimiseen. Tämän jälkeen suoritettiin määritys edellä kuvatulla taval-30 la käyttäen ihmisen seerumin tilalla edullista eläinseeru-, - min laimennusta.

13.2.2 Tulokset

Kuten kuvasta 28 käy ilmi, puhdistettu sCRl inhiboi klas-35 sista komplementin välittämää hajoamista 50 % sCRl:n pitoi- 122 106316 suuden ollessa 0,12 μ%/τη1. Vasta-aineaffiniteettikromato-grafiällä puhdistetun sCRl:n inhibitiokykyä hemolyyttisessä määrityksessä verrattiin puhdistamattomassa materiaalissa (soluviljelmäsupernatantissa oleva sCRl) esiintyvään vas-5 taavaan kykyyn. Puhdistetulla sCRl:llä oli puhdistamattoman sCRlrn aktiivisuuteen verratavissa oleva aktiivisuus ja kummatkin aiheuttivat 50-%:sen inhibition hemolyyttisessä määrityksessä tasolla 1,6 x 108 kuorta/ml. Tämä viittasi siihen, että puhdistusmenetelmä ei vähentänyt oleellisesti 10 lopputuotteena olevan sCRl:n toiminnallista aktiivisuutta.

Sen määrittämiseksi, voitiinko puhdistettu sCRl varastoida pajastettuna, varastoitiin erä tutkittavaa liuosta -70°C:ssa yhden viikon ajan. Pakastetulla ja pakastamatto-15 maila sCRl:llä oli sama pitoisuus määritettynä absorbanssi-na 280 nm:ssä ja CR1-ELISA:11a. Pakastetulla ja pakastamat-tomalla sCRl:llä oli myös samanlaiset aktiivisuudet hemo-lyysin inhibitiolla määritettynä. Ihmisen yhdistelmä-sCRl:n kyky inhiboida useista eri eläinlajeista peräisin olevan 20 komplementin välittämää hemolyysiä on esitetty yhteenvetona taulukossa 9.

» » I 1 123 106316

Taulukko 9

Herkistetyn lampaan RBC-valmisteen hemolyysi käyttäen eri eläinten seerumeista saatua komplementtia 5 Käytetyn see- Inhibitio rumin loppu- Inhibitio (IH)** IH50**

Eläin pitoisuus sCRI:llä (kuorta/ml) (kuorta/ml) 10 marsu 1:500 Kyllä 66%(2,6xl09) l,0xl„09 ihminen 1:500 Kyllä 94%(2/5xl09) 2,0x10® ihminen 1:312 Kyllä 94%(l,2xl09) ΐ,ΟχΙΟ7 rotta 1:200 Kyllä 85%(2,6xl09 2,4x10® rotta* 1:200 Kyllä 77%(3,8xl09) Ι,ΟχΙΟ9 15 koira 1:50 Ei kaniini* 1:20 Ei hiiri* 1:5 Ei * lyofilisoidut seerumit, jotka saatiin kaupallisesta läh-20 testä (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.

** tekstissä esitetyllä tavalla määritettynä (kappale 13.2) Kävi ilmi, että sekä marsun että rotan komplementti inhi-25 boitui ihmisen sCRl:llä. Selvän inhibition puute muissa lajeissa voi heijastaa sitä, (a) että käytetty systeemi ei ollut sopiva tai (b) että tässä systeemissä tarvitaan suurta seerumipitoisuutta 30 13.3 C3a:n ja C5a:n tuoton inhibitio t 13.3.1 Menetelmät

Komplementin estokyky testattiin myös määrittämällä C3a:n ja C5a:n tuoton spesifinen inhibitio. Kaikissa kokeissa komplementtilähteenä käytettäväksi aiottu yksi ihmisen see-35 rumien yhdistelmä jaettiin eriin ja varastoitiin pakastet- 124 106316 tuna -70°C:ssa. Ihmisen IgG aggregoitiin kuumentamalla, jaettiin eriin ja varastoitiin pakastettuna -70°C:ssa. Kussakin kokeessa seerumieriä tasapainoitettiin 37°C:ssa useiden eri testattavien sCRl-pitoisuuksien kanssa. Komple-5 menttireaktioiden sarja käynnistettiin lisäämällä aggregoi-tua ihmisen IgG:tä. Kontrollinäytteet, jotka eivät sisältäneet lainkaan IgG:tä olivat aina mukana. Kiinteän 15 minuutin reaktioajan kuluttua (joka oli määritetty aiemmassa reaktion jatkumista seuraavassa tutkimuksessa, jonka tar-10 koituksena oli saada käyttöön sopivan pituinen aikaväli, jona aikana aikana C5a:n tai C3a:n tuotto oli lähes täydellinen, ts., yli 90 %). Vapautuneiden komplementtipeptidien tasot (C5a tai C3a) määritettiin radioimmunomäärityksellä käyttäen kaupallisesti saatavilla olevaa radioimmunomääri-15 tys (RIA) -testipakkauksia (C5a RIA, Amersham, RPA.520, C3a RIA, Amersham, tuoteluettelo n: o RPA.518) modifioiduissa menetelmissä.

Koska käytettiin kompetitiivistä immunomääritystä, komple-20 menttipeptidien (c5a ja C3a) pitoisuudet muuttuivat kääntäen verrannollisesti iskujen suhteen. Näytettä kohti sitoutuneet iskut (CB) määritettiin kokonaisiskumäärinä (iskuina minuuttia kohti, cpm) sentrifugoinnissa saadusta napista.

Kuvan 29 y-akseli edustaa suhteellista inhibitiota.

25 Suhteellinen inhibitio vastaa "näytettä" vastaavia sitoutu neita iskuja (CB), joista on vähennetty CB "sCRl:n kanssa oleva näyte" jaettuna CB:llä "kontrolli ilman IgG:tä", josta on vähennetty CB "näyte jossa ei ollut sCRlrtä." w 30 Inhibitio = Γ (CB näyte) - (CB ei sCRUI ; [ (CB ei IgG) - (CB ei sCRl) ] 13.3.2 Tulokset

Puhdistetun sCRl:n aktiivisuus määritettiin testaamalla sen kyky inhiboida C5a:n ja C3a:n tuottoa aktivoidussa ihmisen 35 seeruminäytteessä.

12= 106316

Kuten kuvasta 29 käy ilmi, puhdistettu sCRl kykeni testatuissa olosuhteissa enimmillään inhiboimaan C5a:n muodostumisen 100-%:sesti ja C3a:n 60-%:sesti. 50-%:nen inhibitio 5 havaittiin sCRl-pitoisuuksissa 5 jug/ml C5a:n tuoton ollessa kyseessä ja 15-20 jug/ml C3a:n tuoton ollessa kyseessä. Nämä koetulokset viittaavat siihen, että yhdistelmä-sCRl inhiboi C5-konvertaasia tehokkaammin kuin C3-konvertaasia.

10 14 Esimerkki: Liukoisen CRl:n toimivan terapeuttisen ak tiivisuuden osoittaminen in vivo -olosuhteissa 14.1 Liukoisen CRl:n osoittaminen toimintakykyiseksi käänteisessä passiivisessa Arthus-reaktiossa in vivo Arthus-reaktio on klassinen immunologisesti indusoitu tu-15 lehdusvaste, jonka aiheuttaa paikallisesti injektoitu antigeeni, joka sitten reagoi kiertävien vasta-aineiden kanssa. Pääasiallisimmalle biologiselle vasteelle on luonteenomaista immuunikompleksien kerääntyminen, komplementin sitominen, polymorfonukleaaristen (PMN) leukosyyttien ke-20 rääntyminen, lysosomaalisten entsyymien vapautuminen, verisuoniin vaikuttava amiini ja kudoksen vaurioituminen paikallisesti (Uriuhura, T. ja Movat, H. Z., (1966) Exp. Mol. Pathol. 5, 539—558, Cochrane, C.G., (1968) Adv. Immunol. 9, 97—162). Suoran Arthus-reaktion modifikaatiota, käänteistä 25 passiivista Arthus-reaktiota (RPAR), on käytetty mallina tulehdusta vastaan vaikutavien aineiden tunnistamiseksi (Pflum, L.R. ja Graeme, M.L., (1979) Agents and Actions 9, 184—189) .RPAR:ssa vasta-aine injektoidaan paikallisesti ja antigeeni esiintyy verenkierrossa.

30

Kun liukoisia CRl-molekyylejä testattiin rotan RPAR-mal-lissa, ne kykenivät estämään paikallisen tulehdusreaktion. Tämän liukoisen CRl:n toiminnan vaikutusmekanismi in vivo -olosuhteissa voi tapahtua komplementtireaktiotien entsyy-35 mien inhibition välityksellä.

106316 126 14.1.1 Materiaalit ja menetelmät

Naaraspuoliset viiden viikon ikäiset Sprague Dawley -rotat (CD-kanta), jotka painoivat noin 100—125 grammaa (Charles 5 River Laboratories, Wilmington, MA) nukutettiin vatsaonte-lonsisäisellä Avertin-liuoksen injektiolla, jota annettiin 0,1—0,3 ml. Tämä liuos oli laimennettu 1 : 2 suhteessa kan-taliuoksesta, joka oli tehty 15 ml:aan Amel-etanolia lisätystä 1 g:n erästä tribromietanolia. Eläinten turkki ajeliö tiin selkäpuolelta. Tämän jälkeen lämmitettiin häntä ensin lämpimällä vedellä ja sitten lämpölampulla. 1 ml:n ruiskua käyttäen injektoitiin 0,35 ml ovalbumiinia (Calbiochem Corp., San Diego, CA), jonka pitoisuus oli 5 mg/ml ja joka oli valmistettu 0,15-molaarisella fosfaatilla puskuroituun 15 fysiologiseen suolaliuokseen (PBS), suonensisäisesti häntä-laskimoon noin 2,5—5 cm hännän päästä olevaan kohtaan. Viisi minuuttia myöhemmin rottiin injektoitiin ihonsisäisesti 0,08 ml kaniinin ovalbumiinia vastaan valmistetun vasta-aineen Ig-fraktiota, jonka pitoisuus oli 20 mg/ml ja jonka 20 vasta-ainetiitteri oli 4 mg/ml (Organon Teknika Corp., Cap-pel Division, West Chester, PA) tai 0,08 ml kaniinin IgG:tä (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), jonka pitoisuus oli 20 mg/ml, tai PBS:ää. Kukin injektio suoritettiin kahtena rinnakkaisena kokeena ja injektiokohdan ympärillä oleva alue 25 rengastettiin merkkauskynällä. Tämän jälkeen rottia monitoroitiin 1, 4 ja 18 tunnin kohdalla. 24 tunnin kuluttua rotat tapettiin upottamalla ne kuivajäähän kolmeksi minuutiksi. Ihonäytteet erotettiin leikkaamalla ne irti injektoiduista kohdista. Toinen rinnakkaisnäytteistä kiinnitet-30 tiin 10-%:sessa formaliinissa paraffiinipetausta varten ja toinen pakastettiin kryostaattileikeitä varten. Kudosleik-keet valmistettiin ja ne värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla.

35 14.1.2 Tulokset 127 106316

Heikko RPAR-reaktio (ts. turvotus ja punoitus) alkoi olla näkyvissä 3—5 tunnin kuluttua ovalbumiinia vastaan valmistetun vasta-aineen ihonsisäisestä injektiosta. Reaktion voimakkuus lisääntyi asteittain kunnes reagoinut alue saa-5 vutti 3-5 mm:n suuruisen läpimitan 2 4 tunnin kuluttua (kuva ' 30b). Reaktioita ei havaittu rotan ihossa silloin, kun in jektoitiin vain ei-immunisoivaa kaniinin IgG:tä tai PBS:ää.

Vauriokohdasta valmistettujen kudosleikkeiden mikroskooppi-10 tutkimuksessa näkyi dermiksessä useita äkilliseen tulehdukseen liittyviä soluja erityisesti verisuonten ympärillä (kuva 31b). Tätä pidetään tyyppillisesti vaskuliitin ja perivaskuliitin merkkinä. Kudoksesta näkyi tyypillinen tulehdustila, johon liittyi laajaa PMN-solujen keräytymistä 15 verisuonten ulkopuolelle, erytrosyyttien esiintymistä sidekudoksessa ja kollageenisäikeiden höltymistä.

14.1.3 Ihonsisäisesti annetun liukoisen CRl:n vaikutus Valmistettiin puhdistettua sCRl:tä sisältävä seos ottamalla 20 siihen 40 μΐ sCRl:tä, jonka pitoisuus oli 0,75 mg/ml, ja yhtä suuri tilavuus ovalbumiinia vastaan valmistettua vasta-ainetta tai normaalia kaniinin IgG:tä tai PBS:ää. Joko sCRl-antiovalbumiiniseos tai sCRl-kaniinin IgG -seos tai sCRl-PBS -seos injektoitiin ihonsisäisesti rottiin, joita ·· 25 oli esikäsitelty suonensisäisesti annetulla ovalbumiinilla.

Niihin injektiokohtiin, joihin annettiin sCRl:tä sekä ovalbumiinia vastaan valmistettua vasta-ainetta, kehittyi tuskin havaittava vaurio (kuva 30a). Kuten oli odotettua, vaurioita ei kehittynyt niihin injektiokohtiin, joihin annet-30 tiin sCRl-kaniinin IgGrtä. Kun sCRl-antiovalbumiini-in-·· jektiokohtia ympäröivästä kudoksesta valmistettuja leikkei tä tutkittiin mikroskooppisesti, voitiin havaita pikkulas-kimoiden ympärillä olevia PMN- ja mononukleaarisolujen ryhmiä, mutta ei havaittu laajaa PMN-solujen keräytymistä eikä 35 erytrosyyttien joutumista verisuonten ulkopuolelle (kuva » 128 106316 31a) . Nämä koetulokset osoittavat, että liukoisen CRl:n antaminen aiheutti endoteelisoluihin kohdistuvan vaurion inhiboitumisen ja tulehdusreaktion inhibition.

5 Sellaisen sCRl:n pienimmän tehokkaan annoksen määrittämiseksi, joka tarvitaan estämään RPAR tässä rotan ovalbumiin-mallissa, testattiin kymmenkertaiset sarjalaimennokset (laimentamaton, 1/10, 1/100, 1/1,000 ja 1/10,000) sCRl-va-rastoliuoksesta, jonka pitoisuus oli 0,75 mg/ml. Kukin 10 sCRl-laimennos sekoitettiin yhtä suureen tilavuuteen lai-mentamatonta tai puoliksi laimennettua ovalbumiinia vastaan valmistettua vasta-ainetta. Kuhunkin kohtaan injektoitiin yhteensä 80 μΐ. sCRl:n kyky inhiboida RPARrää riippui annoksesta siten, että tehokas turvotuksen väheneminen 15 havaittiin annoksella, joka oli 300 ng kohtaa kohti (taulukko 10) .

Taulukko 10

Annosvaikutus RPAR:n inhibitiossa sCRlrllä 20 sCRl (/xg/kohta) Jäljellä olevan RPAR:n määrä 30 +/- 3 +/" " 25 0,3 +/- 0,03 ++ 0,003 ++++ o ++++ 30 -------------------------------------------------------- • « . « 14.2 Annetun sCRl:n farmakokinetiikka in vivo -olosuhteissa sCRl:n biologinen puoliintumisaika in vivo -olosuhteissa 35 määritettiin seuraavasti. Samanikäisiin (6 viikkoa) ja ruu- « 129 106316 miinpainoltaan samanlaisiin (110-125 g) rottiin injektoitiin suonensisäisesti 250 μg sCRl:tä 0,35 ml:n tilavuudessa. Rotat tapettiin 2 minuuttia, 5 minuuttia, 10 minuuttia, 60 minuuttia ja 24 tuntia injektion jälkeen ja veri otet-5 tiin neulalla onttolaskimosta. 1-2 ml:n erät kunkin rotan seerumeita saatiin sentrifugoimalla 1800 kierroksen minuut-tinopeudella 10 minuuttia ja kussakin näytteessä olevan sCRl:n määrä määritettiin CRl-ELISA:11a. CRl-standardeina käytettiin kaksinkertaisia laimennoksia puhdistetusta 10 sCRl:stä, jonka pitoisuus oli 1 μg/ml, jotka oli lisätty rotan kontrolliseerumiin tai hemoglobiinia sisältämättömien punasolujen kuorista valmistettuja detergenttilysaatteja (1,6 x 108 kuorta/ml). Tulokset esitetään taulukossa 11.

15 --------------------------------------------------------

Taulukko 11

Farmakokineeettiset tulokset injektoidun sCRlrn pitoisuudesta seerumissa ajan suhteen 20 Aika suonensisäisen sCRl-pitoisuus injektion jälkeen (Mg/ml) kontrolli o,01 2 min 0,17 25 5 min 0,80 10 min 1,01 60 min 0,38 24 h 0,49 30 Nämä koetulokset osoittavat, että sCRl voidaan havaita 24 tuntia suonensisäisen injektion jälkeen. 24 tunnin kohdalla sCRl:n taso seerumissa oli 50% siitä huipputasosta, joka havaittiin 10 minuuttia injektion jälkeen.

35 « 130 1 0 6 3 1 6 14.3 sCRl pienentää infarktin kokoa rotissa, joilla on perfuusion palautumisen läpikäynyt infarktoitunut sydänlihas Tässä esitetyn kuvauksen mukaan sCRl, joka kykeni inhiboi-5 maan komplementtireaktiosarjän C3/C5 konvertaasiaktiivi-suutta in vitro, kykeni myös pienentämään perfuusion palau-tumisvaurion kokoa rotan sydäninfarktimallissa in vivo. Sydäninfarkti voidaan aiheuttaa rotassa sepelvaltimon sitomisella. Jos perfuusion palauttamiseen ryhdytään muutamien 10 ensimmäisten tuntien kuluessa sydäninfarktin jälkeen, perfuusion palautumisen on osoitettu vähentävän infarktin kokoa, parantavan vasemman kammion toimintaa ja vähentävän kuolleisuutta (Braunwald, E. ja Kloner, R.A., (1985) J.

elin. Invest. 76, 1713-1719). Perfuusion palautus sydänli-15 hakseen, joka on pahasti iskeeminen mutta ei palautumattomasta vaurioitunut, voi itse aiheuttaa ja laajentaa vauriota. Perfuusion palautumisen aiheuttamasta vauriosta vastuussa oleviin mekanismeihin voi kuulua vaurio, jota välittävät vapaat happiradikaalit ja solujen saama kalsiumyli-20 määrä. Leukosyytit, jotka toimivat joko yksinään tai yhdessä pienten verisuonten endoteelisolujen kanssa, voivat myötävaikuttaa tämän vaurion syntymiseen. Tähän tapahtumaan voi liittyä komplementin aktivaatio (Rossen, R.D., et ai., (1985) Cir. Res. 57, 119—130, Crawford, M.H., et ai., 25 (1988) Circulation 78, 1449—1458).

14.3.1 Menetelmät 14.3.1.1 Rotan sydäninfarktin induktio

Rotat (n=14), jotka painoivat 200—2 50 grammaa, nukutettiin 30 antamalla metoksifluraani-inhalaatio ja niille suoritettiin oikean kaulalaskimon katkaisu ja kanyylin asettaminen siihen. Puolet rotista (n=7) saivat 2 ml (1 mg) sCRlttä kanyylista ja toinen puoli sai 2 ml fysiologista suolaliuosta plasebona, joka valmistettiin ja annettiin samalla tavalla. 35 Kaulakanyyli poistettiin eläimistä, kaulalaskimo suljettiin »1 106316 ja leikkauskohta suljettiin. Sitten suoritettiin rintakehän avaus vasemmalta puolelta viidennen ja kuudennen kylkiluun välistä samalla kun annettiin jaksottain hengityskoneesta 95-%:sta happea ja 5-%:sta hiilidioksidia siten, että keuh-5 korakkuloiden paine pysyi jatkuvasti positiivisena. Tämän jälkeen suoritettiin sydänpussin leikkaus ja vasen sepelvaltimo tukittiin sitomalla siihen ommel 2—3 mm aortan juuresta vasemmalle. Tämän sepelvaltimon sitomisen tarkoituksena oli aiheuttaa suureen alueeseen kohdistuva riski saada 10 sydänkammion etuosan seinämän läpi ulottuva infarkti. Rinta suljettiin väliaikaisesti rottien jäädessä nukutukseen. 35 minuuttia tukoksen teosta rinta avattiin uudestaan ja sidos purettiin. Tämän pituinen aika oli valittu sellaiseksi, että huomattava osa riskialttiista alueesta oli parannetta-15 vissa. Leikattu rinta suljettiin sitten pysyvästi ja eläinten annettiin herätä nukutuksesta, joka tavallisesti tapahtui 5—10 minuuttia leikkauksen jälkeen. 100 000 yksikköä bentsatiinipenisilliiniä G ja 0,25 mg/kg morfiinisulfaattia annettiin lihaksensisäisesti. Eläimiä ruokittiin vedellä ja 20 rotan normaaliravinnolla yksi viikko ja tapettiin sitten heparinisoinnin ja metoksifluraaninukutuksen jälkeen poistamalla sydän.

14.3.1.2 Kokeellisten infarktien morfologinen analyysi: 25 Sydänten preparointi tutkimusta varten

Sydämen irroittamisen jälkeen aortat kanyloitiin nopeasti ja sepelvaltimot perfusoitiin ensin Krebs Henseleit -liuoksella sydänten puhdistamiseksi verestä ja hyytymistä ja 30 sitten 30 mM KCl:llä diastolisen sydämenpysähdyksen aikaan-saamiseksi. Sydämet kiinnitettiin sepelvaltimonsisäisellä perfuusiolla ja upottamalla 10-%:seen puskuroituun formaliiniin. Täyttöpaineen säätelemiseksi riittävällä tarkkuudella sydämet ilmastettiin hiippaläpän kautta muoviputkel-35 la. Kiinnityksen jälkeen sydämistä valmistettiin poikittai- 132 106316 set 2 mm paksut leikkeet yhdensuuntaisesti eteiskammiouur-teen suhteen sydämen kärjestä tyveen ja valmistettiin his-tologiset leikkeet.

5 14.3.2 Tulokset

Eloonjääminen oli sama molemmissa ryhmissä, ts. 6/7 rotista oli elossa 7 päivää ja nämä analysoitiin. Karkea histologisten leikkeiden tarkastelu paljasti, että viidellä kuudesta plasebolla käsitellystä rotasta oli suuri kammion 10 seinämän läpi ulottuva sydäninfarkti (tämän arvioitiin edustavan ainakin 15 % vasemman kammion kokonaismassasta) Vain yhdellä kuudesta henkiinjääneestä sCRl:llä käsitellystä eläimestä oli löydöksenä tämä suuri kammion seinämän läpi ulottuva infarkti. Muilla sCRl:llä käsitellyillä eläi-15 millä oli pieniä laikukkaita infarkteja, jotka käsittivät paljon pienemmän osan vasemman kammion massasta (vähemmän kuin 15 %) . Itse asiassa useimmat näistä olivat havaittavissa vain mikroskooppisesti, kun taas plasebolla käsitellyissä rotissa infarktit näkyivät karkeassa tutkimuksessa.

20 14.3.3 Johtopäätökset Nämä tulokset viittaavat siihen, että sCRl-käsittely pienentää tehokkaasti perfuusion palautumisvauriota in vivo ja parantaa sydäninfarktin vaikutukset. Siinä määrin kuin per-·· 25 fuusion palautumisvaurio voidaan parantaa, voidaan vaurioi- tumattomaksi jääneen sydänlihaksen absoluttista määrää nostaa ja sitä aikaikkunaa, jossa perfuusion palautus on kliinisesti käyttökelpoinen, voidaan pidentää. sCRl:llä suoritettu käsittely tulisi olemaan käyttökelpoinen rinnakkais-30 hoito tukkeumaa liuotavien aineiden ja sepelvaltimon ilma-angioplastian rinnalla akuutin infarktin aikana.

15. Mikro-organismien talletus E. coli -kanta DK1/P3, jossa oli plasmidi piABCD (varustet-35 tu merkinnällä pCRl-piABCD), joka koodaa täysimittaista 133 1 0 6 3 1 6 CRl-proteiinia, talletettiin talletuslaitokseen Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, 31. maaliskuuta 1988 ja sille annettiin hakunumero B-18355. Kiinanhamsterin munasarjasolulinja DUX Bll, jossa oli plas-5 midin pBSCRlc/pTCSgpt klooni 35.6, joka koodaa liukoista CRl-molekyyliä, talletettiin talletuslaitokseen American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, 23. maaliskuuta 1989 ja sille annettiin hakunumero CR1 10052.

10 Tätä keksintöä ei ole tarkoitus käsittää siten, että talletetut mikro-organismit rajoittavat sitä, koska talletettujen sovellutusesimerkkien tarkoituksena on olla valaisevana esimerkkinä yhdestä tämän keksinnön osasta ja mitkä tahansa mikro-organismit, jotka ovat toiminnallisesti samanarvoi-15 siä, kuuluvat tämän keksinnön suojapiiriin. Itse asiassa useat tämän keksinnnön mukaiset eri modifikaatiot, tässä esitettyjen ja kuvattujen lisäksi, käyvät alan ammattimiehelle selviksi tästä kuvauksesta ja siihen liitetyistä piirroksista. Näiden modifikaatioiden on tarkoitus kuulua 20 mukaan liitettyjen patenttivaatimusten suojapiiriin. On myös selvää, että kaikki mainitut nukleotidien emäsparikoot ovat likimääräisiä ja näitä käytetään vain kuvaamistarkoi-tuksiin.

25 Tässä on siteerattu useita viitteitä, joiden sisältämät kuvaukset liitetään mukaan viittaamalla niihin kokonaisuudessaan.

f

T

134 1 0 6 3 16

Kaavake 134 (jatkoa)

Talletuslaitoksen nimi:

Agricultural Research Culture Collection (NRRL) Talletuslaitoksen osoite: 5 1815 North Univeristy Street

Peoria, IL 61604

Talletuksen jättöpäivämäärä 31. maaliskuuta 1988 Hakunumero: 10 B-18355

Claims (26)

135 1 0 6 3 1 6

1. Isolerad nukleinsyra, kannetecknad av att den innefat- 20 tar (a) en sekvens som kodar ett fullt protein väsentligen av komplementreceptortyp I (CR1) i figur 1 frän nukleotid nummer 28 tili nukleotid nummer 6144, eller (b) en nukleinsyra med en sekvens degenererad tili sekvens (a) i förhällande tili den genetiska koden och som kodar nämnda 25 fulla CRl-protein.

1. Eristetty nukleiinihappo, tunnettu siitä, että se käsittää (a) sekvenssin, joka koodaa täysmittaista, oleellisesti kuvassa l esitettyä komplementtireseptorityypin I ' 5 (CR1) proteiinia nukleotidista numero 28 nukleotidiin nu mero 6144, tai (b) nukleiinihapon, jolla on geneettisen koodin suhteen sekvenssiksi (a) degeneroitunut sekvenssi ja joka koodaa mainittua täysmittaista CR1-proteiinia.

2. Isolerad nukleinsyra, kännetecknad av att den innefat-tar (a) en sekvens som kodar en löslig polypeptid med en aminosyrasekvens av komplementreceptortyp I (SCR1) i figur 1 frän aminosyra Gln42 tili aminosyra Ala1972 eller ett 30 fragment av denna, varvid polypeptiden eller dess fragment 139 1 0 6 3 1 6 saknar en transmembran domän och har en biologisk aktivi-tet av full komplementreceptortyp I (CR1).

2. Eristetty nukleiinihappo, tunnettu siitä, että. se kä- 10 sittää (a) sekvenssin, joka koodaa liukoista, oleellisesti kuvassa l esitetyn aminohapposekvenssin omaavaa komplementtireseptorityypin I (sCRl) polypeptidiä aminohaposta Gln42 aminohappoon Alai972 tai sen fragmenttia, josta poly-peptidistä tai sen fragmentista puuttuu transmembraaninen 15 domeeni ja joka omaa täysmittaisen komplementtireseptori- tyypin I (CR1) biologisen aktiivisuuden.

3. Isolerad nukleinsyra enligt patentkrav 2, kännetecknad av att polypeptiden eller dess fragment innefattar ätmins- 5 tone: (a) korta konsensusupprepningar l och 2 av CR1; (b) korta konsensusupprepningar 8 och 9 av CR1; eller (c) korta konsensusupprepningar 15 och 16 av CR1.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen eristetty nukleiinihap-po, tunnettu siitä, että polypeptidi tai sen fragmentti käsittää vähintään: 20 (a) CRl:n lyhyet konsensustoistot 1 ja 2; (b) CRl:n lyhyet konsensustoistot 8 ja 9; tai t (c) CRl:n lyhyet konsensustoistot 15 ja 16.

4. Isolerad nukleinsyra enligt patentkrav 2, kännetecknad 10 av att den innefattar väsentligen en sekvens enligt figur 1 frän nukleotidnummer 28 till nummer 1533.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen eristetty nukleiinihappo, tunnettu siitä, että se käsittää oleellisesti kuvassa „ 25 l esitetyn jakson nukleotidinumerosta 28 numeroon 1533. ’ 5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen eristetty nukleiinihap- T po, tunnettu siitä, että proteiinia erittää solu, jossa se on ekspressoitu.

5. Isolerad nukleinsyra enligt patentkrav 2, kännetecknad av att proteinet utsöndras av den cell i vilken den uttrycks.

6. Isolerad nukleinsyra enligt patentkrav 5, kännetecknad av att proteinet Sr funktionellt, vilket detekteras med dess förmäga in vitro att inhibera utlosning som oxiderar neutrofilceller, hemolys överförd av komplementet, eller produktion av C3a och C5a.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen eristetty nukleiinihap-30 po, tunnettu siitä, että proteiini on funktionaalinen, mikä havaitaan sen kyvystä inhiboida in vitro neutrofiili- 136 106316 solujen hapettavaa purkausta, komplementin välittämää he-molyysia, tai C3a:n ja C5a:n tuottoa.

7. Nukleinsyra enligt nägot av patentkraven 1-6, känne tecknad av att nukleinsyran är DNA.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen nukleiinihappo, tunnettu siitä, että nukleiinihappo on DNA.

8. Nukleinsyra enligt nägot av patentkraven 1-6, kännetecknad av att nukleinsyran är RNA. *| 9. Rekombinantnukleinsyravektor, kännetecknad av att den , 25 innefattar en sekvens enligt nägot av patentkraven 1-6.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen nukleiinihap po, tunnettu siitä, että nukleiinihappo on RNA.

9. Yhdistelmänukleiinihappovektori, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaisen jakson.

10. Rekombinant-DNA-vektor, kännetecknad av att den innefattar en pBSABCD, säsom beskrivits i exempel 8 i ansökan. 140 106316

10. Yhdistelmä-DNA-vektori, tunnettu siitä, että se käsit tää pBSABCD:n, kuten on kuvattu hakemuksen esimerkissä 8.

11. Rekombinant-DNA-vektor, kännetecknad av att den inne-fattar en piABCD i den form den deponerats i NRRL med depositionsnummer B-18355.

11. Yhdistelmä-DNA-vektori, tunnettu siitä, että se käsittää piABCD:n siinä muodossa kuin se on talletettuna NRRL:ään talletusnumerolla B-18355.

12. Rekombinantexpressionsvektor, kännetecknad av att den 5 innefattar en nukleinsyra enligt nägot av patentkraven 1- 6.

12. Yhdistelmäilmentämisvektori, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaisen nukleiinihapon.

13. Expressionsvektor enligt patentkrav 12, kännetecknad av att den formär uttrycka denna sekvens i en bakterie.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen ilmentämisvektori, tunnettu siitä, että se kykenee ilmentämään tämän sekvens- 20 sin bakteerissa.

14. Expressionsvektor enligt patentkrav 12, kännetecknad 10 av att den förmär uttrycka denna sekvens i en däggdjurs- cell.

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen ilmentämisvektori, tunnettu siitä, että se kykenee ilmentämään tämän jakson nisäkässolussa.

15 CRlcl, pT-CRlc2, pT-CRlc3, pT-CRlc4, eller pT-CRlc5, säsom beskrivits i exempel 11 i ansökan.

15. Expressionsvektor enligt patentkrav 14, kännetecknad av att den valts i gruppen bestäende av följande: pBSCRlc, pBSCRls, pBM-CRlc, pBSCRlc/pTCSgpt, pBSCRls/pTCSgpt, pT-

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen ilmentämisvektori, 25 tunnettu siitä, että se on valittu ryhmästä käsittäen seuraavat pBSCRlc, pBSCRls, pBM-CRlc, pBSCRlc/pTCSgpt, pBSCRls/pTCSgpt, pT-CRlcl, pT-CRlc2, pT-CRlc3, pT-CRlc4 tai pT-CRlc5, kuten on kuvattu hakemuksen esimerkissä 11.

16. Rekombinant DNA-vektor, kännetecknad av att den innefattar plasmiden pBSCRlc/pTCSgpt i den form som den deponerats i ATCC under depositionsnummer CRL 10052.

16. Yhdistelmä-DNA-vektori, tunnettu siitä, että se käsit- 30 tää plasmidin pBSCRlc/pTCSgpt siinä muodossa kuin se on talletettu ATCC:hen talletusnumerolla CRL 10052. 137 106316

17. Rekombinantcel1, kännetecknad av att den innefattar en nukleinsyra enligt nägot av patentkraven 1-6.

17. Yhdistelmäsolu, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaisen nukleiinihapon.

18. Rekombinantcell enligt patentkrav 17, kännetecknad av att den innefattar en bakterie.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen yhdistelmäsolu, tunnettu siitä, että se käsittää bakteerin. *

19. Rekombinantcell, kännetecknad av att den innefattar en . 25 vektor enligt nägot av patentkraven 9-16.

19. Yhdistelmäsolu, tunnettu siitä, että se käsittää jon kin patenttivaatimuksen 9-16 mukaisen vektorin.

20. Escherichia coli som deponerats i NRRL under depositionsnummer B-18355. 21. Äggstockscell DUX Bll av kinesisk hamster, kännetecknad av att den transfekterats med plasmid pBSCRlc/- 30 pTCSgpt i den form som den deponerats i ATCC under deposi tionsnummer CRL 10052. 141 106316

20. Escherichia coli, joka on talletettu NRRL:ään talle-tusnumerolla B-18355.

21. Kiinanhamsterin munasarjasolu DUX Bll, tunnettu siitä, 10 että se on transfektoitu plasmidilla pBSCRlc/pTCSgpt, sii nä muodossa kuin se on talletettuna ATCC:hen talletusnume-rolla CRL 10052.

22. Rekombinantvärdcell, kännetecknad av att den uttrycker ett protein med en aminosyrasekvens som väsentligen motsvarar sekvensen i figur l eller dess fragment, som är funktionell, vilket detekteras in vitro pä ätminstone en 5 av dess biologiska egenskaper som väljs bland foljande: (a) förmäga att binda C3b, (b) förmäga att binda C4b, (c) kofaktoraktiviteten hos faktor I; (d) förmägan att inhibera klassisk C3-konvertasaktivitet; 10 (e) förmägan att inhibera alternativ C3-konvertasaktivi tet ; (f) förmägan att inhibera klassisk C5-konvertasaktivitet; (g) förmägan att inhibera alternativ C5-konvertasaktivitet; 15 (h) förmägan att inhibera neutrofil oxidativ utlösning; (i) förmägan att inhibera kömpiementoverförd hemolys; (j) förmägan att inhibera produktion av C3a; (k) förmdgan att inhibera produktion av C5a.

22. Yhdistelmäisäntäsolu, tunnettu siitä, että se ilmentää proteiinia, jolla on aminohappojakso, joka on olennaisesti 15 kuvassa l esitetyn jakson mukainen tai sen fragmentti, joka on funktionaalinen, mikä havaitaan in vitro sen ainakin yhdestä biologisesta ominaisuudesta valittuna seuraa-vista: (a) kyky sitoa C3b:tä; 20 (b) kyky sitoa C4b:tä; (c) tekijän I kofaktoriaktiivisuus; (d) kyky inhiboida klassista C3-konvertaasiaktiivisuutta; „ (e) kyky inhiboida vaihtoehtoista C3-konvertaasiaktiivi- suutta; 25 (f) kyky inhiboida klassista C5-konvertaasiaktiivisuutta; (g) kyky inhiboida vaihtoehtoista C5-konvertaasiaktiivi-suutta; (h) kyky inhiboida neutrofiilistä oksidatiivista purkausta; 138 1 0 6 3 1 6 (i) kyky inhiboida komplementtivälitteistä hemolyysiä; (j) kyky inhiboida C3a:n tuottoa; (k) kyky inhiboida C5a:n tuottoa.

23. Rekombinantvärdcell enligt patentkrav 22, kännetecknad 20 av att fragmentet har förmäga att binda C3b och C4b.

23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen yhdistelmäisäntäsolu, 5 tunnettu siitä, että fragmentilla on kyky sitoa C3b:tä ja C4b:tä.

24. Rekombinantvärdcell enligt patentkrav 22, kännetecknad .* av att proteinet eller fragmentet innefattar minst 24 ami- 9 » nosyror och är glykosylerat.

24. Patenttivaatimuksen 22 mukainen yhdistelmäisäntäsolu, tunnettu siitä, että proteiini tai fragmentti käsittää vähintään 24 aminohappoa ja on glykosyloitunut.

25. Rekombinantvärdcell enligt patentkrav 22, kännetecknad 25 av att polypeptiden innefattar en aminosyrasekvens som kodas väsentligen av nukleotider frän nummer 28 tili 1533 eller nummer 28 tili 5943 i figur 1. 106316

25. Patenttivaatimuksen 22 mukainen yhdistelmäisäntäsolu, tunnettu siitä, että polypeptidi käsittää aminohapposekvenssin, joka on olennaisesti kuvassa 1 esitettyjen numerosta 28 numeroon 1533 tai numerosta 28 numeroon 5943 jatkuvien nukleotidien koodaama.

26. Menetelmä CR1-molekyylin tuottamiseksi, tunnettu sii tä, että se käsittää sen, että kasvatetaan jonkin patenttivaatimuksen 17-19 mukaista solua.

26. Förfarande för att producera en CRl-molekyl, känne-tecknat av att det innefattar odling av en cell enligt ndgot av patentkraven 17-19.