JPH04500526A - ザ・ソーク・インスチュート・フォー・バイオロジカル・スタディーズ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
GRF類似体 VI IA
本発明はヒトや他の動物の下垂体の機能に影響を及ぼすペプチドに関する。特に
、本発明は下垂体からの成長ホルモン(GH)の分泌を促進するペプチドに関す
る。
長い間、生理学者らは視床下部で産生される特殊な物質が下垂体ホルモンの分泌
を刺激または抑制して下垂体線部の分泌機能を調節していることを認めてきた。
視床下部の抑制性因子は1972年にGHの分泌を抑制するソマトスタチン(s
omatostatin )として同定された。1982年には、ヒト膵臓(腫
瘍)GH放出因子(hpGRF)がヒトの膵臓腫瘍の抽出物から単離さオζ精製
、同定、合成および試験が行われ、下垂体からのGHの分泌を促進することが判
明した。
これらの下垂体因子はともに全合成により再生産され、天然構造の類似体が合成
されていた。ヒト視床下部GH放出因子は完全に同一の構造を有しているため、
以下これをhGRFという。
発明の概要
培養下垂体細胞からGHを分泌させる合成ペプチドが現在合成され試験されてい
るが、これは生体内での酵素による分解を受けにくく実質的効力が極めて高いも
のである。このような長所を有しているのは、ペプチドが安定性の高いα−らせ
ん形をしているためであると考えられる。これらのペプチドは、その5.17.
23.26および27位の残基の少な(とも1つのα−炭素原子上にメチル基が
置換されている(CaMe)のが好ましい。より好ましいのは、これらの残基の
複数がメチル基で置換されているペプチドである。α炭素がメチル基で置換され
ているAlaは、CMAまたはAib (アミノ−インブチル酸つと表記する。
また、α炭素がメチル基で置換されているLeuは、CMLと表記する。
さらにペプチドは、天然ホルモンに見られるような上記以外のさまざまな残基の
置換基を有していてもよい。例えば、2位がD−Ala、NaCNaC1−13
−D−Ala(D−NまたはNMAで置換されていてもよい。また、27位のM
etの代わりにCaMeLeu(CML )またはNIeを有しているのが好ま
しい。しかし、D−MetまたはNvaまたはその他の残基を存在させてもよい
。ペプチドは、さらに1位の次の残基を有していてもよい: Ty r、 D−
Ty r、 Me t、Pbe。
D−Phe、pcl−Phe、Leu、HisおよびDHis これらの残基は
、αアミノ基上またはαアミノ基中にメチル基を有して℃・てもよいt5、ある
いは、αアミノ基がなくてもよい(desアミノ)。また、この残基のαアミノ
基はアシル化、好ましくはアセチル(Ac )またはホルミル(For)化され
ていてもよい。このペプチドは、当業者に知られている置換基を有していてもよ
い。例えば、3位にD−Aspおよび、/または12位にArgおよび/または
10位にPheまたは■)−Tyrおよび/または15位にAlaおよび/また
は28位にAsnを有していてもよい。
本発明による医薬組成物は、薬学的にまたは獣医学的に受容される液体または固
体のキャリアーに分散された、長さ約29から44残基の上記の類似体またはそ
れらのいずれかの無毒性塩を含有する。これらの医薬組成物はヒトおよび動物の
臨床医学の分野において使用され、治療または診断目的のために投与される。
さらにまたこれらの医薬組成物は鳥禽を含む温血動物の成長を促進するのに用い
ペプチドを定義するために用いる命名法はシュレーダー(5chroder )
およびリュブケ(Lubke)の6ザ・ペプチドアカデミツクプレス(196
5)に明記されるものであり、その際慣用的懺示に従ってN末端のアミノ基は左
に、セしてC末端のカルボキシル基は右に表わされる。天然アミノ酸とは、GI
y、Ala、VaI、Leu、Ile、Ser、Thr、Lys、Arg、As
p、Asn、Glu。
Gln、Cys、Met、PheSTyr、Pro、TrpおよびHisからな
るタンパク質中に見出される普通の自然界に存在するアミノ酸のうちの1種を意
味する。
Nleはノルロイシンを意味し、Nvaはノルバリンを意味する。アミノ酸残基
が異性体を有する場合は、特に指定しなし・限り、表示されるアミノ酸のL体を
意味する。D−NMAはα−アミノ基がメチル置換されたアラニンf7)D−異
性体を意味する。
本発明は概して次のアミノ酸配列(I)を有する合成ペプチドを提供する。
(B) RI−R4−R4−k I a −(Ql ) R5−P h e−T
h r −RH−S e r −(Qt )Rlt−Ar g−Rlt−(Qs
) R4OLe u −RH−G I n −(G4 ) −Le u−RIg
−(QB)A I aAr g−R,、−(Qs ) Rn−(Qt ) Le
u −Rb −Rts−(Qi)Rm−(Qt)Rxt−RH−Ar g−G
l n −Gl n −Gl y −G I u−R34−As n−G1 n
−G1 u −RB1−R2O−R4,−Ar g−R4!−R4$−R44(
上式において、R8はTyr、D−Tyr、Met、PheSD−Phe、pC
l−Phe%Leu、HisまたはD−His;BはHlCaMe、N”Me、
desamino、AeまたはFor;R2はAla、D−Al a。
NMAまたはD−NMA;R,はAspまたはD−Asp ; R1はIleま
たはLeu;RsはSer、Asn、Lys%Arg1AspまたはG l u
: RltはTyr。
D−TyrまたはP h e : RItはArgまたはLys;R,、はI
I e、 Va I、 LeuまたはAla;R,、はGiyまたはA I a
: RltはSerまたは’J”yr;R,、はLyslD−Lys、Arg
またはD −A r g : RnはLeu、 I l e、 Al aまたは
Val;RsgはGlnまたはHi S ; R4OはAspまたはQ 1 u
; R4OはIleまたはLeu;R,、はMet、D−Met、Ala、N
le、IIe%Leu、NvaまたはVa 1 ;RtaはAsnまたはSer
;R34はSerまたはA r g + RsaはArgまたはQln;Rnは
GuyまたはA r g : RaoはAlaまたはSer;RuはPhe。
AlaまたはVa l : R43はAsnまたはArg;R44は天然アミノ
酸: Ql −Q−はそれぞれI]またはC”Meである;ただし、R,−R4
4の残基のすべて、またはその一部の配列はC末端で始まる配列から削除され工
いてもよい;また、QlsQ4、G6、G8およびQ、の5ち1以上はCaMe
である。)好ましい実施態様の1つでは、R,はi l e、 RltはSer
、Rh4はGl n、 R,tsはAsp、R46はIle。
R,は5er、RBはArg、l(、、はe+yおよびR4OはAlaである。
ペプチドが44位までのびているときは、R,はLeuまたはValであるのが
好ましい。
他の好適な実施態様では、ペプチドは下記の配列を有する:(B) R1−R1
−RH−Al a −(QH) I I e −P h e−Th r−R4−
8e r −(Qり Rh。
−Ar g−4’LI!−(Qs)RI5−Le u −RI5−Gl n −
(G4 )Le u −Se r −(Qt )Ala−Arg−R,、−(Q
e)Ru−(Qt)Leu−Gln−Asp−(Qa)Ile−(QJRtt−
R,−Arg−Gin−Gln−Gly−Glu−8er−Asn−Gln−G
lu−Arg−Gly−Ala−Arg−R4O−R4O−R44(上式におい
て、R3はTyr、 D−Tyr。
Met、Phe、D−Phe、pCl−Phe、LeulHisまたはD −H
r s : BはH1C3Me、NaMe、desアミノ、AcまたはFor;
R,はAla、D−Ala、NMAまたはD−NMA;R,はA、spまたはD
−Asp : RsはSer、Asn。
Ly s、 Ar g、 As pまたはQl n ; RltはTyr、D−
TyrまたはPhe;RuはArgまたはLys;R,、はI I e、 Va
I、 LeuまたはA I a ; RltはGly またはA I a :
R21はLy s、 D−Ly s、 Ar gまたはD −A r g ;
R2OはLeu、Ile。
AlaまたはVat;R,7はMet、D−Met、Ala、Nle、11e、
Leu、NvaまたはVat;R,、はAsnまたはSer:R12はPhe、
AlaまたはVal:R4゜はAsnまたはA r g ;R44は天然アミノ
M : Q+〜Q、はそれぞれHまたはCaMeである;ただし、R2O−R4
4の残基のすべて、またはその一部の配列はC末端で始まる配列から削除されて
いてもよ℃・;また、Q、、Q、、Q、、QsおよびQ、のうち1以上はC”M
eである。) これらのペプチドのいずれにおいても、C末端のアミノ酸残基の
カルボキシル部分は次の原子団になっていてもよいニーC0OR。
−CROl−CONHNI−IRl−CON(R)(R’)または−CH,OR
(ここで、RおよびR′は低級アルキル、フッ化低級アルキルまたは水素である
。)低級アルキルとして好ましいのはメチル、エチルおよびプロピルである。−
CONHR(RはHまたは低級アルキルである。ンのが好ましい。
本発明のさらに他の好適な実施態様では、ペプチドは下記の配列を有する。
(B) R1−R1−Asり−Al a −(Ql )I 1 e−Phe−T
h r−Rs−Be r −(Qt)R16−Ar g−Rlt−(Qs)RI
5−Le u −R+!l−G l n −(G4)Le LX−Rlt−(Q
s )A I a −At g−R21−(Qa )Rh−(Qy ) Le
u−Ru−Rts−(Qa) Rs−(Qe) RH−RH−Arg−Gin−
Gun−Gl y−Y wherein R,はTy r、 I)−Ty r。
Phe、D−Phe、Hi sまたはD−His;BはH,CaMeまたはNa
Me;R。
はAla、D−Ala、NMAまたはD−NMR;R,はS e r、 As
n、 Ly s。
ArglAspまたはG l u : RltはTyr、D−TyrまたはPh
e;RltはArgまたはLy s + RrsはIle、Val、Leuまた
はA I a : RltはGlyまたはAla ;R4はSerまたはTy
r ; R21はLys、D−Ly5% ArgまたはD−Arg;RuはLe
u、 I !e、 Al aまたはV a I : R4はGlnまたはHi
S + RtiはAspまたはG l u ; RATはMet、Ala、Nl
e、Ile、Leu、NvaまたはVal;R21li!A s nまたlヨs
e r ;YはN i(R(ここでRはHまたは低級アルキル);Q、〜Q、
は七れぞi、、H!プ1、げ(−’、”Mcで、)〉す: Gl)T、Gln−
GlyまたはGin−Gln (Nyは、(−゛末端で削除11て、い゛〔もよ
< : Ql−Q4、Q7、Q、およびQ。
の5ち1以−Lは(、’ aM eでtlろ。)」で述−゛・た、J′:うに、
N末端から2q位の残基までのフラグメントは下垂体に、よる(?、、x H3
)割、((ダ1ψ、を及ぼす゛生物活性を・イイ1.2ており2長さ29または
32残基のC東端がアミドか置換アミド管あ7.)生物i′l!i性フラグメン
トであるのが最も好まし、い。
このペプチドが40またはイ丈以りの残基を有する場合は、C末端部分に対する
明確な好適性はない。
該ペプチドは、完全な固相法、部分的な固相法フラグメントカツノ゛リングある
いは液相カップリングのような適当な方法により合成される。例えば、完全な固
相合成の技術は教科書[−固相べ−7°ブード合成(Solid−Phase
Peptide 5y−nthesis )J、スチュワード(Slewart
)およびヤング(Young)、Free−■市n&Co、、’Jンフランシス
j(1969)において述べられ、ヴエール(yale)らによる1978年8
月8日付米1特許第4,105,603号に例示されている。基本的な液相合成
法は論文1−Methoden dev OrganischenCherni
e (Horben″′Weyl ) :ペプチド合成(Synthcse v
on Pepti−deri月、E、ブンシュ(Wunseh)編集、ゲメルグ
・テイーム出版、シュトウットガルト、***(1974)において詳述される。
合成のフラグメントm合法は、1976/48月3日付米1ffil特¥f第3
.97 ′2.859号に例示される。他の適用可能な合成は1974年10月
15日付米国特許第3.842,067号および1975年1月28目付米国特
3′(−第3,862.925号に例示される。
種六のrミノ酸成分の不安定な側@本を適当な保護基(その基が最終的に除去さ
れるまで、その部位で化学反応か起、−るのを“防ぐ)で保護する・二どは、こ
の種の合成にお(・て一般的である。また、アミノ酸や断片がカルボキシル基の
部位で反応する間その物質のα−アミノ基を・保護することも一般的であり、そ
の後α−アミン保護基を選択的に除去してその位置で次の反応を行わせる。従っ
て、合成の一段階として、ペプチド鎖中に意しjする配タリで位置するアミ7)
酸残基な含み且つ適当なアミ7′酸残基に側鎖保護基を結合し7た中間体化合物
が生成することば普通のことである。
この点から、本発明は次式(II)の中間体を与える。
X’−(B)Rn(XまたはX”)Ry−Rs(Xl)−Ala−(Ql)Rs
−Phe Thr(X’)−Rs(X’) −3e r (X’) −(Qt)
Rno(X”)−Ar g(X6)−R,!(X’またはX” ) −(Qs
)R4++−Le u−RI5−G I n (X’ −(Q4 ) Le u
−RlM(X”またばX’) −(Q5)Al a−Arg(X’)−R4,(
X’ まブこはX’)−(Qs)Rtt−(Q−)Leu−R24(X’または
x)−Rts(X’)−(Qs)Rta−(Qa)Rn−Rzg(X’またはX
’)−Arg(X’、)−Gln(X’)−Gln(X’)−Gly−Glu(
X’)−Rs4(XlまたはX’)−Asn(X’)−Gin(X’)−Glu
(X’)−Rsa(:X’またはX’)−Rso(X’)−R40(X”)Ar
g(X’)−Ru Ru(X’またはX’ ) −R44(XI) Xl
式中、XIは水素またはα−アミノ保護基である。XIに包含されるα−アミノ
保護基は、ポリペプチドの逐次合成の分野において有用であると知られているも
のである。XI として使用し5るα−アミン保護基の種類には(1)芳香族ウ
レタン型保護基、例えばフルオレニルメチルオキシカルボニル(FMOC)、ベ
ンジルオキシカルボニル(Z)、およびp−クロルベンジルオキシカルボニル、
p−ニトロベンジルオギシ力ルボニル、p−ブロムベンジルオキシカルボニル、
p−メトキシベンジルオキシ力ルボニルのような置換z ; (2)脂肪族ウレ
タン型保護基、例えばt−ブチルオキシカルボニル(BOC)、ジイソプロピル
メチルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル
、およびアリルオキシカルボニル;および(3)ジクロアルキルウ1/タン型保
護基、例えばシクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル
、おヨヒシクロヘキシルオキシカルボニル;が含まれる。好適なα−アミノ保護
基は、たとえNaMe−置換アミノ酸残基が1位に存在するときでも、BOCで
ある。もちろんBがd e s N TItのときXlはIlである。
Xは水素原子またはHisのイミダゾール窒素のための保護基(例えばTos)
である。
X2H,Tyrのフェノ−、ル性ヒドロキシル基のための適当な保護基であり、
例えばテトラヒドロピラニル、t−ブチル、トリチル、Bzl、CBZ、4Br
−CHZま6よび2.に−ジ・クロルベンジル(DCB)である。また、X2は
水素原子であってもよ(、この場合はその位置のアミノ酸残基に側鎖保護基が存
在L7ないことを意味する。
Xsは水素原子、もしくはAspまたはGluのカルボキシル基のための適当な
エステル形成保持基、例えばペン、′ル(OBzl)、2.6−ジクロルベンジ
ル、メチルおよびエチルである。
XlはThrまたはS e rのビドロキ・、ル基のための過当な保護基であり
、例えばアセチル、ベンゾイル、t−グ千四、トリチル、テトラヒドロピラニル
、Bzl。
2.6−ジクロ、ルベンジA−およびCBZである。好適な保護基はBzl で
ある。
Xlはまた水素原子であってもよく、この場合はヒ1几壽ンル基に保護基が存在
しないことを意味する。
XIは水素原子、もしくはAsnまたは61口の側鎖アミド基のための適当な保
護基である。女子ましくはそれはキ丈ユ′チル(Xan)である。
X″はArgのグアごジノ基のための過当な保護基、例えばニトロ、Tos、C
BZ、アダマンチルオキシカルボニルおよびB OCであり、またX6は水素涼
fでありうる。
X7は水素原子、もしくはL y sの側鎖アミ、ノ基のための適当な保護基で
ある。
過当す側鎖アミン保護基の例は2−クロルベンジルオキシカルボニル<2:CZ
−2)、Tos、t−アミルオキシカルボニルおよび130Cである。
Xaは水素原子、もしくは一般的に先に示した適当な側鎖保護基である。
Netは任意に酸素原子で保徊しつるが、保護しない方が好ましい。
側鎖”rミノ保護基の選択は、一般に合成中のα−アミン保護基の除去の間に除
去されないものな選ぶということを除いて限定的でない。しがしながら、いくつ
かのアねノ酸例えばHipの場合はカップリング児了後に一般に保護を必要どせ
ず、従ってα−アミ21保護基と側鎖アミ2ノ保膿基は同じものでありうる。
Xlはエステル形成基X3のようなC−末端カルボキシル基に対する)適当な保
護基あるいは固相合成において使用される、固体樹脂支持体への連結のためのア
ンカー結合あるいはdes−X” (この場合、残基はC−末端にお(・て先に
定義したカルボキシル部分Zを有する)である。固体樹脂支持体が使用される場
合、それは−0−CH2−樹脂支持体、−NH−ベンズヒドラミン(BHA)樹
脂支持体または−NHNバーメチルベンズヒドリラミン(MBi(A)樹脂支持
体のように当業者に既知の担体のいずれかでありうる。非置換アミドが望ましい
場合にBHAあるいはMT3HA樹脂の使用が好適なのは、切断で直接該アミド
を与えるからである。N−メチルアミドが望ましい場合はN−メチルBHAから
得られ5る。他の置換アミドが望ましい場合は米国特許第4,569,967号
の方法を用いることができる。また、C末端として遊離酸以外のなお他の基が望
ましい場合はホウベン−ウニイル(Houりen −Wey l )の教科書に
ある基本的な方法を用いてペプチドを合成するのが好ましい。
中間体に対する式においてX−基の少なくとも1つは保護基でありXlは樹脂支
持体を含む。このように本発明はまた以下のような対象となるペプチド製造の方
法を提供する。
(at 少なくとも1つの保り基と式(n)を有するペプチドを形成し〔ここで
X。
Xl、X2、Xl、Xl、X5、X6、X7およびX8は各々水素あるいは保護
基であり、Xlは保護基または樹脂支持体へのアンカー結合であるか、des−
X”(この場合、(+1)式(Il)のペプチドから保護基またはアンカー結合
を除去し;そして(cl 望ましい場合には、結果とし℃できる配列(I)のペ
プチドをその無毒性塩に転化する。
ペプチド合成において使用する個々の側鎖保護基を選択する場合、次の一般規則
に従う。
(al 保護基はカップリング条件下でその保護特性を保持(2て切断されない
。
(bl 保護基は試薬に対して安定であるべきであり、合成の各段階でα−アミ
ン保護基の除去のために選ばtまた反応条件下でXanを除いて、安定であるの
が好ましい。
(cl 側鎖保護基は、意図するアミノ酸配列を含む合成の完了時点に、ペプチ
ド鎖を変性させな(・反応条件Fで除去できなければならない。
ペプチドが組換えDNA技法を用いないで製造される場合、それらは好ましく2
149(1963)に一般的に記述されるような固相合成法を用いて製造される
。しか12、先に述べたように当分野で知られた他の同様の化学合成法も使用し
うる。同相合成法は保護したα−アミノ酸を適当な樹脂にカップリングすること
によって、ペプチドのC末端から開始される。このような出発物質はα−アミン
保護アミノ酸をクロルメチル化樹脂またはヒドロキシメチル樹脂へエステル結合
によって結合するか、ある(・はBIIA樹脂またはMBHA樹脂ヘアミド結合
することによって製造しつる。ヒドロキシメチル樹脂の製法はポダンスキ−(B
od−aosky )らのChem、 Ind、(oンドン)38.1597〜
1598(1966)に開示されている。クロルメチル化樹脂はカリフォルニア
州すッチモノドのバイオランド研究所(Bio Rad Laboratori
es )およびラブシステム社(Lab。
Systems、 Inc、)から市販されている。この種の樹脂の製法はスブ
ユワート(Stewar()らの[固相ペプチド合成(Solid Phase
Peptide 5ynth−esis ) J (Freernan &
Co、、ザンフランシスコ、1969)第1章1〜6頁に開示されている。BH
AおよびMBHA樹脂支持体は市販され℃おり、一般に合成し2ようとする目的
ポリペプチドがそのC末端に未置換アミド基をもつときにだけ使用される。
C末端アミノ酸、例えばBOCおよびXanで保護されたAsnは先ずに、ホリ
キらのChemistry Letters、 165〜168 (1978)
の方法に従ってクロルメチル化樹脂へカップリングされる。即ち、例えばラツ)
GRF(rGRF)の43−残基遊離酸類似体を合成するときには、約60℃で
DMF中KFを用いて24時間攪拌する。樹脂支持体へのBOC保論アミノ酸の
カップリングに続いて、塩化メチレン中トリフルオロ酢酸(TFA)またはTF
A単独を用いてα−保護基が除去される。この脱保諌は約O℃から呈温の間の温
度で行われる。ジオキサン中I(CJのような他の標準的な切断試薬や特定のα
−アミン保護基の除去条件は、シュローダ−(Schroder )とりューブ
ク(Lubke)の「ザ・ペプチド」第1巻72〜75頁(アカデミツクプレス
1965年)に記述されているように選んでもよい。
α−アミノ保護基の除去後、残りのα−アミノ−および側鎖−保護アミ7ノ酸を
意図する順序で段階的にカップリングさせて、先に定義した中間体化合物を得る
。
あるいは各アミノ酸を別個に反応器−\加える代わりに、若干のアミノ酸を互い
にカップリングさせてから固相反応器へ添加してもよい。適当なカップリング試
薬の選択は当分野の技術の範囲内である。カップリング試薬として特に適してい
るものはN 、 N’−ジシクロへキシルカルボジイミド(DCCI )である
。
ペプチド固相合成に用いられる活性化試薬はペプチドの分野においてよく知られ
ている。適当な活性化試薬の例はカルボジイミド類、例えばN 、 N’−ジイ
ソプロピルカルボジイミドおよびN=エチル−N’−(3’−ジメチA・アミノ
プロピル)カルボジイミドである。その他の活性化試薬ならびにペプチドカップ
リングにおけるそれらの使用はシュレーダー&リュプケの上記文献第■章および
カブール(Kapoor )のJ、 Phar、 Sci、、 59.1−27
(1970)に開示されている。
それぞれの保護アミノ酸またはアミノ酸配列は大体4倍以上の過剰菫で固相反応
器へ導入さ汰 カップリング反応はジメチルホルムアミド(DMF):CLC4
(1:1 )の混合媒体中で、あるいはDMFまたはCH2C1z単独中で行わ
れる。不完全なカップリングが起った場合は、α−゛アミン保護基を除去する前
にそのカップリング反応を繰り返し、その後送のアミノ酸なカップリングさせる
。合成の各段階でのカップリング反応の成就は、もしその合成が手動で行われる
なら、カイザー(E、Kaiser)らのAnal、Bioehcm、34.5
95(1970)に記載されるようなニンヒドリン反応で監視するのが好ましい
。カップリング反応は自動的に、例えばペックマン990自動合成機で、リビx
−/l/(Rivier )らのBiopolymers、1978.17.1
927−1938頁に報告されるようなプログラムを用いて行うことができる。
意図するアミノ酸配列が完了l−だ後、液状フン化水素のような試薬で処理1〜
て中間体ペプチドを樹Jib支持体から切り離す。その際液状フッ化水素はペプ
チドを樹脂から切り離すばかりでな(、残っている全ての側鎖保護基x、x’、
x”、x’、XS、X’、X7、X’、アンカー結合X9およびもし使用するな
らα−アミノ保護基X1 ¥も切断して遊離酸の形でペプチドを得る。配列中に
Metが存在する場合、BOC保護基は潜在的S−アルキル化を避けるためKH
Fを用いる樹脂からのペプチド切断の前にトリフルオロ酢酸(TFA)/エタン
ジチオールを使用して好適にまず除去される。切断のためにフッ化水素を使用す
る場合、アニソールおよびメチルエチルスルフィドが反応容器中にスキャベンジ
ャ−として含有される。
次の実施例1は固相法によるペプチド合成の好適な方法を示すものである。これ
と同じ方法でC末端に必要な数のアミノ酸をつなげさえすれば対応する長いペプ
チドを合成し5ることは容易に理解されるであろう。N末端へ残基をつなげるの
は有益とは考えられておらず、現在のところ生物活性7ラグメントのN末端は庚
定の配列を有するべきであると感じられる。
実施例1゜
次式:
%式%
−NH,を、ベール(Vale)らの米国特許第4.292,313号に概要が
記載されるよ5にベックマン990ペプチド合成機を使って市販のMBHA樹脂
上で段階的方法により合成した。この樹脂へのBOC−Arg(Tos )のカ
ップリングは、樹脂1vあたりArg約0.35rnmol!の置換をもたらし
た。
保護基を除去して中和した後、ペプチド鎖を樹脂上に一段づつ付加していった。
保護基の除去、中和および各アミノ酸の付加は一般をこりビニール(J、 Ri
vier)れる方法に従って行った。使用する全ての浴剤は不活性ガス(例えば
ヘリウムや窒素)を散布することによって注意してガス抜きしMet残基の硫黄
を酸化するおそれのある酸素を確実に除いた。
保護基の除去はスケジュールAに従って行った:スケジュールA
試 薬 混合時間(分)
1、 60%T F A/ 2%エタンジチオール10260%TFA′2%エ
タンシナオール 153、IPA/1% 、x タンジ、オ/’ 0.54、C
H,C1z中(’) E t3N (I O”io) 0.55、MeOH0,
5
6、CH,CJt中のEt、N(10%)o、57’、 MeOH(2回)0.
5
8、CH,Clt (2N) 0.5
カツプリングは好ましくはスケジュールBVr、記載されるように行った:スケ
ジュールB
試 薬 混合時間(分)
10、Boc−アミノ酸 50〜90
11、 MeOH(2回)o、5
12、 CH2(J!! (2回)o、5i3. CH,C1t中kcto (
3M) 15.014、 CH,C1,0,5
15、Meo)i 0.5
16、 CHsC6t (2回) O,S簡単に述べれば、樹脂12あたり塩化
メチレン中のBOC−保護アミノ酸1〜2 m molを使用し、塩化メチレン
中の1.0molDCCI 1当量加えて2時間実施した。BOC−Arg(T
os)がカップリングされつつあるとき、5o%DMFと塩化メチレンの混合物
を使用した。SerおよびThrのヒドロキフル側鎖保護基と1−てBy:Iエ
ーテルを使用l、5た。AsnやGlnのアミド基は、有利であるよr)ic
D C(’、、’カノア°リングな使用!f躯場r> s X a 11で保護
し、た。p・−ニトロフェニ)v 、T’、 、Xテ” (ON F) )はA
snやにInのノフル寸、゛キ:’、’、’L末端η′活性化するブこめに使用
し7、例えばB(−N(’、、、’、、−A!1n(ONp)i;IDMFと塩
化) f lz 7 +7) 51) q、、、))混合物■■
H()f(i 1当敞’;c: #i Jイ’C−19,カニ:/ ’、’、、
−7’し、・グさ+:6Cとが−Q:き、この場合はD(′iコ
を加女−なかった。2. 、j o 、A−−−< 77” Aオキシ、む、ル
ボー:ル(2CJ−z )はLysIIliI鎖L′り保護基とし′ξ使用した
0TOSはArgのグアニド基およびTl1sのイミダ:/’、、、、−,−A
9素を保護−!”fwf−め(二使用r:き、G I uまたit、ksH■側
鎖カルボキシル基は0I)zlで保:’!i L、−た。Ty[の7jニハ一ル
性ヒト1′JA゛ンa4%は2.6−ジク0 ルー・ニン、′ル(1)e l−
< )で保護した。合成終了時に次の組成の中間体が得られた二BOC−NaM
e’、I”y r (X’ )−Al a −As p (X3) −A I
a−I 1 e−Phe−Thr(X’ )−A、sn (X’)−8e t
(X’ )−Ty r (XT)−Ar g (X’)−Ly s (X))−
VaI −Leu−Al a−Gl n(X’)−Leu−8er(X’)−A
l a−Arg(X@)−Lys(X’、)−Leu−iyeu−Gln(X’
)−Asp(X’)−Ile−CML−Asn(X’)−Arg(X’)−X’
(ここでSX2はDCB、X3はOBz I%X’はBzl、X5はXan、
X’はTos、X’は2 Ci −zそしてXllはNH−MBHA−樹脂支
持体でt)る。Xanけ、α−アミン保り基を除去するために用いたTFA処理
によって部分的にまたは完全に除去でさた。
保護ペプチド−樹脂を切り離し、て保護基を除去するために、ペプチド−樹脂1
2あたりアニソ−A・l5ynl、メチVLエチルスルノイド0.5ynlおよ
びフッ化水素(HF ) 15+n/を用いて−2000で3()分および0℃
で30分処理した。高真空下でi(Fを除去し、た後、樹脂−ペプチド残留物を
乾燥ジエチルエーテルおよびクロロホルムで交〃に洗い、次いでペプチドをガス
抜きした2N水性酢酸で抽出し、p過により樹脂から分離した。
その後、得られたペプチドを0−5%酢酸に浴解し、七)−アデックスG−50
微細ゲル濾過を含めた精製工程如何した。
103.3178(1981)[示されるような調製用まタハ#調製用HPLC
で精製した。カー トリソジを備えたウォーターズ・アソシエーツ・ブl/ブL
C−500(Waters As5ociates prep LC−500)
はバイダック(vyd−ac)30OAかl−)σ)15〜20μのC□シリカ
を装填した。リビエールのJ、Liq、(’hro+natograI)by
1.343−367(1978)に記載されるように、低圧エルデツクス(El
dex )勾配製造機を使って、TEAP中の(3(、CNの勾配をつくった。
りr]7トグラフ画分は注意して11 P L Cで監視し、実質的純度を示す
両分のみを拒めた1、それぞれ別個に純度を調〆たM製画分の脱塩は0.1%T
F−A中のCI、CNの勾配を用いて行った。その後センターカッ) (cen
tercut)を凍結乾燥I2て目的とするペプチド(純度98%以上でありう
る)を得た。
精製ペプチドの比旋光度を、パーキンエルマー旋光計を用いて測定1−だところ
[α]D==−52,0°±1 (c−1、1%酢酸)であった。
実施例2゜
次式:
%式%
で表わされる40アSノ残基のペプチド[CaMeHis’、D−NMA’、C
ML”E−hGRF(1−40)−NH,を、ベールらの米国特許第4,292
.313号に概要が記載されるように、ベックマン990ペプチド合成機を使っ
てMBHA樹脂上で段階的方法により合成した。本ペプチドはT L Cおよび
HP L Cを用いて実質的に純粋であることが判明した。
実施例3
次式:
%式%
で表わされるペプチド[D −HMA”、CM L 2丁:]−rGRF(1−
43)−OHを、上述のChemistry Lettersに記載されるよ5
に、ベック? ン990ペプチド合成機でクロルメチル化樹脂を用いて最初のカ
ップリングをした後、実施例1と同じように段階的方法により合成した。本ペプ
チドはTLCおよびHPLCを用いて実質的に純粋で多)ること力洋」明17た
。
実施例4゜
次式:
%式%
で表わさhるh G RF類似体フラグメント[N”MeTy r’ 、 Ly
s’、 A I a15、CMI、′7、Asn”13−hGRF(1−29
)−NH,を実施例1に記載されるように、ベックマン99()ペブブド合成機
を使つ−CMBHA樹脂上で段階的方法により合成した13本本ペプチドT I
、 CおよびI(P L Cを用いて実質的に純粋であることが判明1−だ。
N末端残基なかえて合成vhり返し、(: NaMeI−1i s’、 Ly
s’、A I a 15、CML”、Asn”、)−hGRF(1−29)−N
U−1,を得た。
実施例5
次式:
%式%
で表わされるhGRF類似体フラグメント[NaMeTyr’、D −L y
s” 、 CML”)−h GRF (129) −NHzY実施例1に記載さ
れるように、ベックマン990ペプチド合成機を使ってMBHA樹脂上で段階的
方法により合成した。本ペプチドはTLCおよびI(P L Cを用(・て実質
的に純粋であることが判明した。
次式:
%式%
GRF (129)−NH2を、実施例1に記載されるように、 べ7クラン9
90ペプチド合成機を使ってMBHA樹脂上で段階的方法により合成した。本ペ
プチドはTLCおよびHPLCを用いて実質的に純粋であることが判明した。
次式:
%式%
hGRF(1〜29)−NH,を、実施例1に記載されるように、ベックマン9
90ペプチド合成機を使ってMBHA樹脂上で段階的方法により合成した。本ペ
プチドはTLCおよびHP L Cを用いて実質的に純粋であることが判明した
。
実施例8
次式:
%式%
−NH,を、実施例1に記載されるように、ベックマン990ペプチド合成機を
使ってMBHA樹脂上で段階的方法により合成した。本ペプチドはTLCおよび
HPLCを用いて実質的に純粋であることが判明した。
実施例9゜
次式:
%式%
G 1 y −N Hz
で表される[D−Phe’、D−NMA’、Glu’、CaMeTyr”、ll
e”、CML”)−hGRF(]、−32)−NH,を、ベールらの米国特許第
4292313号に記載されるように、ベックマン990ペプチド合成機を使っ
てMBHA樹脂上樹脂路的方法により合成した。本ペプチドはTLCおよびHP
LCを用いて実質的に純粋であることが判明した。
実施例10゜
次式:
%式%
(1−29)−NH2を、ベールらの米国特許第4.292,313号に記載さ
れるように、ベックマン990ペプチド合成機を使ってMBHA樹脂上樹脂路的
方法により合成した。本ペプチドはTLCおよびHPLCを用いて実質的に純粋
であることが判明した。
実施例11゜
次式:
%式%
で表されるhGRF類似体フラグメント[For−Tyr’、D−NIIJA’
、CaMeTyr”、CMA”、CMLffi?、Asn”]−hGRF(13
2)−NHtを、実施例1に記載されるように、ベックマン990ペプチド合成
機を使ってMBHA樹脂上樹脂路的方法により合成した。本ペプチドはTLCお
よびHP L Cを用いて実質的に純粋であることが判明した。
実施例12
次式:
%式%
rGRF(129) NH2を、実施例1に記載されるように、ベックマフ99
0ペプチド合成機を使ってMBHA樹脂上樹脂路的方法により合成した。本ペプ
チドはTLCおよびHPLCを用いて実質的に純粋であることが判明した。
実施例13
次式:
%式%
で表されるhGRF類似体フラグメント[D−NMA”、A r g12、CM
L ”、11e”)−hGRF(1−29)−NHlを、実施例1に記載され
るように、ベックマン990ペプチド合成機を使ってMBHA樹脂上樹脂路的方
法により合成した。本ペプチドはTLCおよびHP L Cを用いて実質的に純
粋であることが判明した。
実施例14゜
次式:
%式%
Me t”) −h (31F (129)−NHtを、実施例1に記載される
よ5に、ペックマン990ペプチド合成機を使ってMBHA樹脂上樹脂路的方法
により合成した。本ペプチドはTLCおよびHP L Cを用いて実質的に純粋
であることが判明した。
実施例15
次式:
%式%
実施例1に記載されるように、ベックマン990ペプチド合成機を使ってMBH
A樹脂上樹脂路的方法により合成した。本ペプチドはTLCおよびHPLCを用
いて実質的に純粋であることが判明した。
実施例16゜
次式:
%式%
:]r
GRF (129)−NHxを、実施例1に記載されるように、ベックマン99
0ペプチド合成機を使ってMBHA樹脂上樹脂路的方法により合成した。本ペプ
チドはTLCおよびHPLCを用いて実質的に純粋であることが判明した。
実施例17゜
次式:
%式%
CML”)−rGRF(129)−NHtを、実施例1に記載されるよ5に、ベ
ックマン990ペプチド合成機を使ってMBHA樹脂上樹脂路的方法により合成
1−た。本ペプチドはTLCおよびHP L Cを用いて実質的に純粋であるこ
とが判明した。
実施例18゜
次式:
%式%
(JiL”1−hGltF(1−32)−NH,を、実施例1に記載されるよう
に、ベックマン990ペプチド合成機を使ってMBHA樹脂上樹脂路的方法によ
り合成した。本ペプチドはTLCおよび■l P L Cを用いて実質的に純粋
であることが判明した。
実施例19
次式:
%式%
A l aI5、D−Ne t”) h GRF (129−NHzを、実施例
1に記載されるように、ベックマン990ペプチド合成機を使ってMB)IA樹
脂指上段階的方法により合成した。本ペプチドはTLCおよびHPLCを用い℃
実質的に純粋であることが判明した。
実施例20゜
次式:
%式%
rGRF(132)−NHtを、実施例1に記載されるように、ベックマフ 9
9 Qペプチド合成機を使ってMBHA4!(指上で段階的方法により合成した
。本ペプチ実施例21゜
次式:
%式%
で表されるrGRF類似体フラグメント[desaminoTyr’、CML2
3]−rGRF(1−29)−NH,を、実施例1に記載されるように、ベック
マン990ペプチド合成機を使ってMBHA樹脂上で段階的方法により合成した
。本ペプチドはT I、 CおよびHP T、 Cを用いて実質的に純粋である
ことが判明した。
実施例22
次式:
%式%
特許第4292313号に記載されるように、ベックマン990ペプチド合成機
を使ってMBHA樹脂上で段階的方法により合成した。本ペプチドはTLCおよ
びHP L Cを用いて実質的に純粋であることが判明した。
実施例23
次式:
%式%
GRPCI−29)−NHlを、実施例1に記載されるよ5に、ペックマン99
0ペプチド合成機を使ってMBHA樹脂上で段階的方法により合成した。本ペプ
チドはT 、T、 CおよびHP L Cを用いて実質的に純粋であることが判
明した。
実施例24
次式:
%式%
CML’、Asn”〕−hGRF(129)−NHzを、ベールらの米国特許第
4.292.313号に記載されるように、ペックマン990ペプチド合成機を
使ってMBHA樹脂上で段階的方法により合成した。本ペプチドはT L Cお
よび1−IPLCを用いて実質的に純粋であることが判明した。
実施例25゜
次式:
%式%
を、ベールらの米[B%許第4.292.313号に記載されるように、ベック
マ二/990ペプチド合成機を使ってMBHA樹崩上樹膜上的方法により合成し
た。本ペプチドはTLCおよびHP L Cを用いて実質的に純粋であることが
判明した。
このペプチドを水に溶解し、IN酢酸を加えた溶液を凍結乾燥することによって
酢酸塩を調製した。
実施例26
次式:
%式%
で表されるhGRF類似体フラグメントCD−NMA”、Arg’、CMAI9
、CML”!、N1e271−hGT(F(1−32)−NH2’a’、実施例
1に記載されるように、ベックマン990ベプヂド合成機を使ってM 13 )
(A樹脂上で段階的方法により合成した。
本ペプチドはT L Cおよびl−(P L Cを用いて実質的に純粋であるこ
とが判明した。
実施例27゜
次式:
%式%
で表されるしCMLll、Arg”、Nle”J−rGRF(1−29)−NH
Iを、実施例1に記載されるように、ベックマン990ペプチド合成機を使って
MBHlt(脂にで段階的方法により合成した。本ペプチドはTLCおよびHP
L Cを用いて実質的に純粋であることが判明した。
実施例28
次式:
%式%
で表されるbGRF類似体フラグメントCD−NMA2、C”MeVaJ”、C
MAI9、CML”、N l e”、As n” 〕−hGRF (1−29)
−NI−(、を、実施例1に記載されるよ5に、ベックマン990ペプチド合成
機を便ってMBHA樹脂上で段階的方法により合成した。本ペプチドはT L
CおよびHP L Cを用いて実質的に純粋であることが判明した。
実施例29
次式:
%式%
(1−29) −NH2havir+g the formula :を、実施
例1に記載されるように、ベックマン990ペプチド合成機を使ってMBHA樹
脂上で段階的方法により合成した。本ペプチドはTLCおよびHP L Cを用
いて実質的に純粋であることが判明した。〔α)、=−43,5°±1(c=1
.1%酢酸)実施例30゜
次式:
%式%
を、実施例1に記載されるように、ベックマン990ペプチド合成機を使つ゛〔
MBIIAff+脂上で段階的方指上より合成した。本ペプチドは’I” L
CおよびHPLCを用いて実質的に純粋であることが判明した。
実施例31
次式:
%式%
CML’):) −rGRF (1−43)−0H’a?、実施例3に記載され
るように、ベックマン990ペプチド合成機を使ってMBHA樹脂上で段階的方
法により合成した。
本ペプチドはTLCおよびHP L Cを用いて実質的に純粋であることが判明
した。
実施例32゜
次式:
%式%
で表さ才するhGR[”U似体フラグメ:l) [N”MeTyr’、Al a
”、C’ML”、Nlc”、As n”]−hURF (1−29,) −1N
I−1,’;<、実施例トベールらの米国特許1Ji4,292;う13情盲;
「1軟、さえ1.3百5Vこ、ベラ外マン99()ペプチド合成機りで使つ(M
BHAm(脂)−で段階的、5法により合成した。本ペプチドはrr、e*;よ
びHi) L C欠相いて実質的に絣、粋C1、ト)イ)ことが11」明した。
精製1−た“くブイドの比旋尤ルーを・光電旋tiff↑で測定し、f−とにl
)(]α]、、=−−44,0°土1(c・−・1.10.。酢!!!!りで、
$)つた。
実施例33
次式:
%式%
で衣さt已h G RF類似体フラグメ゛/) [N”MeTyr’、ChIL
”、Ala”。
CML”、Asn”)−hGRF(1−29)−NH,を、実施例トベー ルら
の米国特許第4292313号に記載されるように、ベックマン990ペプチド
合成機を使ってMBHA樹脂1で段階的方法により合成1〜た。本ペプチドT
I、 CおよびHP L Cを用いて実質的に純粋で麦〕ることが判明した。
実施例34
次式:
%式%
(1−29)−Nl2を、爽り例1に記載されるように、ベックマン990ペプ
チド合成機ケ使つ′″CMB)−IA樹脂指上段h′的方法により合成した。本
ペプチドはTLCおよびHP 1. C”を用も・て実質的に純粋であることが
判明した。精製1−たペプチドの比旋光度を光電比旋titで測定[ゴニところ
C(1] 、=−45,5°±1(c−・1.1%酢酸)であった。
次式:
%式%
(1−29) −NH2?、実施例1に記載されろ、j 5に、ペソ、クマ゛7
99(lベグブード自成機な使ってM I311 A樹月旨士で段階的方法によ
り合成した。本ペプチドはT L e寸、;よびHPLCを用いて実質的に純粋
であることが判明jゴニ。tf4製したベプブードの比旋光度を光電旋尤計で油
j定したとこう、[α:]、−49.0°±1(C−1,1%酢酸)であった。
次式:
%式%
(1−29)−NH2を、実施例IK記載されるように、ベックマン990ペプ
チド合成機を使ってMBHA樹脂上で指上的方法により合成した。本ペプチドは
T L CおよびHPLCを用いて実質的に純粋であることが判明りまた。
実施例37
次式:
%式%
(129) −1’HItを、実施例1に記載されるように、ベックマン990
ペプチド合成機を使ってMBHA樹脂上で指上的方法により合成1−た。本ペプ
チドはT L CおよびI■PLCを用いて実質的に純粋であることが判明した
。精製1〜たペプチドの比旋光度を光電旋光計を用(・て測定したところ、〔α
〕い=−45,0゜±1(c=1.1%酢酸)であった。
次式:
%式%
h GRF (129)−NH2を、実施例1に記載されるように、ベックマン
990ペプチド合成機を使ってMBHA樹脂−トで段階的方法により合成した。
本ペプチドはT L CおよびIf P L Cを用(・て実質的に純粋である
ことが判明した。
実施例39
次式:
%式%
−NIIt’a:、実施例1に記載さオlるよ5に、ベックマン990ペプチド
合成機を使ってMBHA樹脂上で指上的方法により合成した。本ペプチドはTL
CおよびHP I、 Cを用いて実質的に純粋であることが判明した。
実施例40゜
次式:
%式%
h
GRF(129)−NH2を、実施例1に記載されるように、ベックマン990
ペプチド合成機を使ってMBHA樹脂上で指上的方法により合成した。本ペプチ
ドはT I、 CおよびHP L Cを用(・て実質的に粋粋であることが判明
した。
次式:
%式%
(i−29)−Ni(2’r、実施例1に記載されるように、ペックマン990
ペプチド合成機を使ってMBHA樹脂上で指上的方法により合成した1、本ペプ
チドはTLCおよびHP l、Cを用いて実質的に純粋であることが判明しまた
。
実施例42
次式:
%式%
で表される40残基からなるペプチド[:C”MeHis’、I)−NMA”、
CM L 27 ]−hGRF (i −44) −Nl−iz を、ベールら
の米国特許第4,292,313号に記載されるように、ペックマン990ペプ
チド合成機を使ってM、 B HA樹脂上で段階的方法により合成した。本ペプ
チドはT L CおよびnPi、cw用いて実質的に純粋であることが判明した
。
実施例でmVした合成ペプチドは、インビトロ検定によって、合成hpGRF(
1−40)−oHに比べて一般にGHの分泌に対する1智が大きく本質的な活性
は似て(・ることか判明し、た。これらの合成ペプチドは全て生物学的に活性で
あり、下垂体によるGHの分泌を幼果的に刺激する有用な化合物であると考えら
れる。
成長ホルモンの分泌を便通する代表的な合成ペプチドの相対効力を決定するため
に、標品として合成hpGRF(1−40)−OHを用いて等モル凍度の代表的
な合成類似体と並行比較することによりインビトロ検定を行った。ここでは、試
験の3から5日前に摘出したラット下垂体細胞を含む培養物を使用した。比較試
験のために成長ホルモンの分泌が最適であると考えられる培養物を、ベールらの
Endoerinology、 91.562−572(1972) に記載さ
れ、またベー・八記載さオ(る一般的方法により使用した。試験する物質とのイ
ンキュベーションは3から4時間行な(・、培地アリコートをとり出して、それ
らの免疫反応性GH(i r GH)の含有値を周知のラジオイムノアッセイで
測定するために処理し九等七ル礎度の比較試験の結果を表1に示す。
第 1 表
hGRF(1−40)−OH
(標準)1.。
(、N aM e T y r ’ + A I a 15r CM L” +
10,00 (5,220−1)A、、s+戸1) hGR,F(129)
NHt・CNaMeTyr’、AIa”、CML”、 6.44(4,0−10
,3)ILIe″、Asn”’)−hGRF(129)−Nl2・[:NaMe
Tyr’、Ala+5 、CML’) 、 5.4 1 (3,5−8,3)N
le2フ、Asn”)−hGRF(129)−Nl2・[N”MeTyr’、C
MI、’ 、 A I a” 、 3.59 (2,3−5,5)Nle”、A
sn”:]−hGRF(1−29)−N112・成長ホルモン分泌のインビトロ
試験の他に、合成ペプチドをウレタンで麻酔した雄ラットに静脈注射してインビ
ボ試験を(−だところ、外因のGRFに対する反応は継続しながら自発的なGH
分泌は抑えられることが判明した。血液サンプルは注射前、注射後10分、30
分、60分後直ちに採取し、血液中のGHレベルをラジオイムノアッセイで測定
しだ。かかるインビボ試験によって、各々の合成ペプチドはhp(3RF(1−
40)−OHに比べて生物学的効力が大きいことが判明した。これらの合成ペプ
チドは、静脈注射から30分および60分後の血液中の下垂体GHのレベルによ
って示されるように、実質的な効果がより長く持続する。GI−(分泌を検出す
るのに効果的なものとして知られる他のGRインビボ試験を、以上の結果を確紹
するために行った。GH分淋を促すのに効果的な上記ペプチドの投与量は体重1
貯あたり約500ナノグラムから約50ナノグラムであると考えられる。
この種の合成hGRF類世体およびおそう(rGRF類似体は医師が014産土
を高めることを望むヒトへ適用するのに有用であろう。この種の類似体によるG
H分泌の刺激は、内因性GRFの産生低下に起因する完全または相対的GH欠乏
症を有する患者を対象としている。さらに、増大したGH分泌およびそれに伴う
成長増加は正常のGI−ルベルを有するヒトまたは動物に現われるであろう。ま
た、投与は身体の脂肪含蓄を変化させ、その他のGH依存性の代謝、免疫および
発生過程を変更させるであろう。例えば、これらの類似体は火傷を負ったような
情況下にあるヒトの同化過程を刺激する手段と17て有用でありうる。他の例と
してこれらの類似体は鶏、七面鳥、豚、ヤギ、牛および羊のような商業用温面動
物に、または魚や例えばウミガメやウナギのよ5な冷血動物および両生類の養殖
に、有効蓋の本ペプチドを与えることにより成長をはやめ且つタンパク質対脂肪
の比を高めるために使用し5る。
ヒトに投与する場合、これらの合成ペプチドは少なくとも約93%、好ま(−<
は少なくとも98%の純度をもつべきである。本明細書において純度とは意図す
るペプチドが存在する全てのペプチドおよびペプチドフラグメントの表示l菫%
を′占めることを意味する。この種の合成ペプチド¥商業用または他の動物に成
長促進および脂肪含量低下の目的で投与する場合は、低い純度も許容しうるかも
知れなし・。
これらの合成ペプチドまたはその無毒性塩は、医薬組成物をつくるために薬学的
または獣医学的に受容さオ′【るキャリアーど混合されて、ヒトを含めた動物へ
動脈内、皮下、筋肉内、経皮的(例えば鼻控内)、または経口的にさえ投与する
ことができる。投与は治癒しようとする受容者がこのような治療上の処置を必要
とする場合にGHの放出を刺激すべく医師により行われる。必要な投与量は治癒
しようとするそれぞれの症状、その症状の程度、および治療の持続時間により変
化するであろ5゜
この種のペプチドは無毒性塩、例えば酸付加塩または亜鉛や鉄などとの金属錯体
(本明細書においては金槁錯体も塩として考える)の形でしばしば投与される。
酸付加塩の例は塩酸塩、懺酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩
、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アヌコルビン酸塩、酒石酸塩などであ
る。
活性成分を錠剤の形で経口的に投与する場合、錠剤はトンガカント、トウモロコ
シでんぷんまたはゼラチンのような結合剤;アルギン酸のような崩壊剤:および
ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤を含み5る。液体での投与が望まれる
場合は甘味料および/または風味料を使用することができ、また等張塩水やリン
酸緩衝液での静脈内投与を行うこともできる。
本ペプチドは医師の指導のもとでヒトに投与されるべきであり、医薬組成物は通
常薬学的に受容される慣用の固体または液体キャリー1−と共にペプチドを含む
だろう。・一般に、非経口投与蓋は受容者の体重1人lあたりペプチド約o、o
i〜約1μmであるだろう。
かかるペプチドを長時間(例えば単回投与で1週間から1年)提供するのも好ま
しい。徐放性′¥有するデボ−製剤や埋込み製剤とすることができる。例えば、
投与製剤は、例えば高分子塩基酸の酸付加塩、多価金槁カチオンの塩またはこれ
らの塩を組み合わせたものなどの体液における安定性が低い化合物の薬学的に受
容し得る塩を含有することができる。比較的不含性の塩はゲル(例えばステアリ
ン酸アシミニウムゲル)中で製剤してもよい。投与用として適切な徐放性デポ−
製剤は、例えば米国特許第3,773,919号に記載されるようなポリ酢酸/
′ポリグリコール酸のような分解速度が遅い非責性または非抗原性のポリマー内
に分散またはカプセル化したペプチドを言有していてもよい。これらの化合物は
また、シラスティック埋込み製剤中に入れてもよい。
流を使用してヒトに経皮的にペプチドを投与することも可能である。例えば、9
ボルトのバッテリーを使用して0.2ミリアンペア−の電流をヒトの皮膚に流し
、それKよって表皮から血液中にペプチドを効果的に入れるようにした経皮投与
用器具を使用してもよい。
本発明を本発明者が認める最もよい方法である好適な実施態様で説明してきたが
、当分野での通常の知脈を有する者に明らがないろいろな変更および修飾が特許
請求の範囲に記載する本発明の範囲から逸脱することなくされ5ることを理解す
べきである。例えば、ペプチド鎖の修飾、とりわけペプチドのカルボキシル末端
から始まり大体29位までの欠失は今までに知られた実験慣習に従って行われ、
それによりペプチドの生物学的効力の全てがまさに本質的部分を保持するペプチ
ドやペプチドフラグメントがつくり出され、この種のペプチドも本発明の範囲内
に含まれると考えられる。さらに、両末端あるいはそのいずれかでの付加も行わ
才1、かつ/またペプチド化学の分野でよく知られるように自然界に存在する残
基の代わりにほぼ均等の残基な用いて、タンパク質の加水分解に対して増強され
た抵抗性を有し、また本発明の範囲を逸脱しない請求されたポリペプチドの効力
の少なくとも本質的部分を有する他の類似体を製造することができる。さらに現
在の技術によってC末端の好まし7いNl2基に対する修飾を行ってもよい。例
えば、C末端のアミノ酸残基のカルボキシル部分は−COOR1,CRO1−C
ON)INHR1口低級アルキルまたは水素である)とすることができる。この
ような修飾を行っても合成ペプチドの効力は変わらないことから、かがる修飾も
本発明の範囲を逸脱するものではない。
本発明の様々な特徴は上述の特許請求の範囲において強調される。
■続補正書く方式)
1.事件の表示
PCT、”US9(L・’02224
平成 2年特誇願第5071−02号
2、発明の名称
GRF類似体 VISA
1う4補■−をする考
事件との関係 特語出願人
バイオロジカル・スタディーズ
5、補正命令のl付 1’成 ′3年1()月 8E](発送日)6、補111
の対象
(1)出願人の代表名名を記載した国内書面膚PFAi+i+査報告
mlmvl−esll^−””’−”’−PCT/US 90102224国際
詞青報告
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.下式で表わされる合成ペプチド。 【配列があります】; 【配列があります】; 【配列があります】;または 【配列があります】 2.次のアミノ酸配列を有する合成ペプチドまたはその無毒性塩。 【配列があります】 (上式においてR1はTyr、D−Tyr、Met、Phe、D−Phe、pC l−Phe、Leu、HisまたはD−His;BはH、CaMe、NaMe、 デスアミノ(desamino)、AcまたはFor;R2はAla、D−Al a、NMAまたはD−NMA;R3はAspまたはD−Asp;R5はIleま たはLeu;R8はSer、Asn、Lys、Arg、AspまたはGlu;R 10はTyr、D−TyrまたはPhe;R12はArgまたはLys;R13 はIle、Val、LeuまたはAla;R15はGlyまたはAla;R18 はSerまたはTyr;R21はLys、D−Lys、ArgまたはD−Arg ;R22はLeu、Ile、AlaまたはVal;R24はGlnまたはHis ;R25はAspまたはGlu;R26はIleまたはLeu;R27はMet 、D−Met、Ala、Nle、Ile、Leu、NvaまたはVal;R28 はAsnまたはSer;R34はSerまたはArg;R38はArgまたはG ln;R30はGlyまたはArg;R40はAlaまたはSer;R42はP he、AlaまたはVal;R45はAsnまたはArg;R44は天然アミノ 酸;Q1〜Q9はそれぞれHまたはCaMe;但し、R30からR44までの残 基のいずれかあるいは全てはC末端から始まる配列中で削除されていてもよく、 また、Q1、Q4、Q7、Q8およびQ9のうち少なくとも1つはCaMeであ る。)3.R27がNleであり、R30〜R44の残基が削除されている請求 項2のペプチド。 4.R15がAlaであり、R28がAsnである請求項2のペプチド。 5.Q1がCaMeである請求項2のペプチド。 6.Q4がCaMeである請求項2のペプチド。 7.Q7がCaMeである請求項2のペプチド。 8.Q8がCaMeである請求項2のペプチド。 9.Q9がCaMeである請求項2のペプチド。 10.次のアミノ酸配列を有する合成ペプチドまたはその無毒性塩。 【配列があります】 (上式において、R1はTyr、D−Tyr、Phe、D−Phe、Hisまた はD−His;BはH、CaMeまたはNaMe;R2はAla、D−Ala、 NMAまたはD−NMA;R8はSer、Asn、Lys、Arg、Aspまた はGlu;R10はTyr、D−TyrまたはPhe;R12はArgまたはL ys;R13はIle、Val、LeuまたはAla;R15はGlyまたはA la;R18はSerまたはTyr;R21はLys、D−Lys、Argまた はD−Arg;R22はLeu、Ile、AlaまたはVal;R24はGln またはHis;R25はAspまたはGlu;R27はMet、Ala、Nle 、Ile、Leu、NvaまたはVal;R28はAsnまたはSer;YはN HR(RはHまたは低級アルキル);Q1〜Q9はそれぞれHまたはCaMe; 但し、Gly、Glu−GlyまたはGln−Gln−GIyががC末端で削除 されていてもよく;また、Q1、Q4、Q7、Q8およびQ9のうち少なくとも 1つはCaMeである。)発明の詳細な説明
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