DE69025123T2 - Grf-viia-analoge - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, welche die Funktion der Hypophyse bei Menschen und anderen Lebewesen beeinflussen. Insbesondere bezweckt die vorliegende Erfindung die Schaffung von Peptiden, welche die Freisetzung von Wachstumshormon durch die Hypophyse fördern.
- Physiologen haben schon lange erkannt, daß der Hypothalamus die Sekretionsfunktionen der Adenohypophyse steuert, wobei der Hypothalamus spezielle Substanzen erzeugt, die die Sekretion von jedem Hypophysenhormon stimulieren oder inhibieren. Ein Inhibitionsfaktor des Hypothalamus wurde 1972 in Form von Somatostatin charakterisiert, welches die Sekretion von Wachstumshorznon (growth hormone - GH) hemmt. 1982 wurden menschliche Pankreas-(Tumor)-Freigabefaktoren (human pancreatic releasing factors - hpGRF) aus Extrakten von menschlichen Pankreas-Tumoren isoliert, gereinigt, charakterisiert, synthetisiert und getestet, und es wurde gefunden, daß diese die CH-Freigabe durch die Hypophyse fördern. Es wurden beide hypophysiotropen Faktoren vollkommen synthetisch reproduziert und Analoge der nativen Strukturen synthetisiert Der menschliche hypothalamische GH-Freigabefaktor hat genau die gleiche Struktur; somit wird im folgenden der Ausdruck hGRF verwendet.
- Die EF-A-0 292 334 offenbart ein synthetisches Peptid mit der Sequenz: (B) R&sub1;-R&sub2;-R&sub3;-Ala-Ile-Phe-Thr-R&sub8;-Ser-(Q&sub1;)R&sub1;&sub0;-Arg-R&sub1;&sub2;- (Q&sub2;)R&sub1;&sub3;-Leu-R&sub1;&sub5;-Gln-Leu-R&sub1;&sub6;-(Q&sub3;)Ala-Arg-R&sub2;&sub1;-(Q&sub4;)R&sub2;-Leu-R&sub2;&sub4;-R&sub2;&sub5;- Ile-R&sub2;&sub7;-R&sub2;&sub8;-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R&sub3;&sub4;-Asn-Gln-Glu-R&sub3;&sub6;-R&sub3;&sub9;- R&sub4;&sub2;-R&sub4;&sub3;-R&sub4;&sub4;, worin R&sub1; Tyr, D-Tyr, Met, D-Met, Phe, D-Phe, pCl- Phe, Leu, His oder D-His ist; B NaMe, H, CaMe, Desamino, Ac oder For ist; R&sub2; Ala, D-Ala, NMA oder D-NMA ist; R&sub3; Asp oder D- Asp ist; R&sub0; Lys, Ser, Asn, Arg, Asp oder Glu ist; R&sub1;&sub0; Tyr, D- Tyr oder Phe ist; R&sub1;&sub2; Lys oder Arg ist; R&sub1;&sub3; Val, Ile, Leu oder Ala ist; R&sub1;&sub5; Ala oder Gly ist; R&sub1;&sub8; Ser oder Tyr ist; R&sub2;&sub1; Lys, D- Lys, Arg oder D-Arg ist; R&sub2;&sub2; Leu, ne, Ala oder Val ist; R&sub2;&sub4; Gln oder His ist; R&sub2;&sub5; Asp oder Glu ist; R&sub2;&sub7; Nle, Met, D-Met, Ala, Ile, Leu, Nva oder Val ist; R&sub2;&sub8; Asn oder Ser ist; R&sub3;&sub4; Ser oder Arg ist; R&sub3;&sub8; Arg oder Gln ist; R&sub3;&sub9; Gly oder Arg ist; R&sub4; Ala oder Ser ist; R&sub4;&sub2; Ala, Phe oder Val ist; R&sub4;:, Arg oder Asn ist; R&sub2;&sub4; eine natürliche Aminosäure ist; Q&sub1;-Q&sub4; entweder für CaMe oder H stehen; jedoch mit der Maßgabe, daß einer oder alle der Reste zwischen R&sub3;&sub0; und R&sub4;&sub4; inklusive deletiert werden können, und weiters mit der Maßgabe, daß (I) eine oder beide der folgenden weiteren Maßgaben (a) und (b) zur Anwendung kommen, nämlich (a) (i) Ra Arg, Asp oder Glu ist oder (ii) Ra Lys und R&sub1;&sub5; Ala ist, (b) R&sub2;&sub1; D-Lys oder D-Arg ist und (II) der carboxylanteil des Aminosäurerestes am C-Terminus gegebenenfalls chemisch modifiziert sein kann.
- Es wurden nunmehr synthetische Polypeptide synthetisiert und getestet, die GH aus kultivierten Hypophysezellen freigeben, die eine erhöhte Resistenz gegenüber enzymatischem Abbau im Körper haben und die eine ganz wesentlich erhöhte Potenz aufweisen. Diese günstigen Eigenschaften gehen auf die Peptide mit Alphaspiralform und erhöhter Stabilität zurück, welche Peptide mindestens einen Rest in einer oder mehreren der Positionen 5, 17, 23, 26 und 27 aufweisen, der an seinem alpha-Kohlenstoffatom (CaMe) durch eine Methylgruppe substituiert ist, und vorzugsweise sind mehrere dieser Reste substituiert. Ala, dessen alpha-Kohlenstoffatom durch eine Methylgruppe substituiert ist, ist mit der Abkürzung CMA oder Aib (für Aminoisobuttersäure) bezeichnet, wogegen Leu, dessen alpha-Kohlenstoffatom durch eine Methylgruppe substituiert ist, mit CML bezeichnet ist.
- Abgesehen von den obengenannten können die Peptide noch andere Substitutionen für verschiedene Reste enthalten, die in nativen Hormonen zu finden sind. Beispielsweise kann D-Ala, NaCH&sub3;-D-Ala(D-NMA) oder NMA in der 2-Position substituiert sein. In der 27-Position ist entweder CaMeLeu(CML) oder Nle vorzugsweise anstelle von Met vorhanden; D-Met oder Nva oder andere Reste können jedoch auch anwesend sein. Die Peptide können auch einen der folgenden Reste in der 1-Position aufweisen. Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His und D-His, welche Reste gegebenenfalls eine Methylsubstitution entweder am alpha-Kohlenstoff oder in der alpha-Aminogruppe aufweisen können, oder es kann die alpha-Aminogruppe deletiert sein (Desamino); es kann auch die alpha-Aminogruppe dieses Restes acyliert sein, vorzugsweise mit Acetyl (Ac) oder Formyl (For). Die Peptide können gegebenenfalls andere aus dem Stand der Technik bekannte Substitutionen enthalten, z.B. D-Asp an der 3-Position und/oder Arg an der 12-Position und/oder Phe oder D-Tyr an der 10-Position und/oder Ala an der 15-Position und/oder Asn in der 28-Position.
- Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen enthalten solche Analoge, die zwischen etwa 29 und 44 Reste in der Länge aufweisen, oder ein nicht-toxisches Salz eines dieser Reste, dispergiert in einem pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch akzeptablen flüssigen oder festen Träger. Solche pharmazeutische Zusammensetzungen können in der klinischen Medizin, u.zw. sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin, zur Verabreichung für therapeutische Zwecke und auch zur Diagnose verwendet werden. Außerdem können sie zur Förderung des Wachstums von Warmblütern, einschließlich Geflügel, und in der Wassertierzucht verwendet werden.
- Die zur Definition der Peptide verwendete Nomenklatur ist jene, die von Schroder & Lubke, "The Peptides", Academic Press (1965), spezifiziert wurde, worin die Aminogruppe gemäß herkömmlicher Darstellung am N-Terminus links und die Carboxylgruppe am C-Terminus rechts aufscheint. Unter natürlicher Aminosäure wird eine übliche natürlich vorkommende Aminosäure verstanden, die in Proteinen zu finden ist, umfassend Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp und His. Unter Nle wird Norleucin verstanden, und Nva bedeutet Norvalin. Wo der Aminosäurerest isomere Form hat, ist die L-Form der Aminosäure dargestellt, wenn nicht ausdrücklich anders angegeben. D-NMA bezeichnet das D-Isomer von Alanin, worin die alpha- Aminogruppe durch Methyl substituiert ist.
- Die Erfindung sieht allgemein synthetische Peptide mit der folgenden Sequenz (I) vor: (B)R&sub1;-R&sub2;-R&sub3;-Ala-(Q&sub1;)R&sub5;-Phe-Thr- R&sub8;-Ser-(Q&sub2;)R&sub1;&sub0;-Arg-R&sub1;&sub2;-(Q&sub3;)R&sub1;&sub3;-Leu-R&sub1;&sub5;-Gln-(Q&sub4;)Leu-R&sub1;&sub8;- (Q&sub5;)Ala-Arg-R&sub2;&sub1;-(Q&sub6;)R&sub2;&sub2;-(Q&sub7;)Leu-R&sub2;&sub4;-R&sub2;&sub5;-(Q&sub8;)R&sub2;&sub6;-(Q&sub9;)R&sub2;&sub7;-R&sub2;&sub8; Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R&sub3;&sub4;-Asn-Gln-Glu-R&sub3;&sub8;-R&sub3;&sub9;-R&sub4;&sub0;-Arg-R&sub4;&sub2;-R&sub4;&sub3;- R&sub4;&sub4;, worin R&sub1; Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His oder D-His ist; B H, CaMe, NaMe, Desamino, Ac oder For ist; R&sub2; Ala, D-Ala, NMA oder D-NMA ist; R&sub3; Asp oder D-Asp ist; R&sub5; Ile oder Leu ist; R&sub8; Ser, Asn, Lys, Arg, Asp oder Glu ist; R&sub1;&sub0; Tyr, D-Tyr oder Phe ist; R&sub1;&sub2; Arg oder Lys ist; R&sub1;&sub3; Ile, Val, Leu oder Ala ist; R&sub1;&sub5; Gly oder Ala ist; R&sub1;&sub8; Ser oder Tyr ist; R&sub2;&sub1; Lys, D-Lys, Arg oder D-Arg ist; R&sub2;&sub2; Leu, Ile, Ala oder Val ist; R&sub2;&sub4; Gln oder His ist; R&sub2;&sub5; Asp oder Glu ist; R&sub2;&sub6; Ile oder Leu ist; R&sub2;&sub7; Met, D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva oder Val ist; R&sub2;&sub8; Asn oder Ser ist; R&sub3;&sub4; Ser oder Arg ist; R&sub3;&sub8; Arg oder Gln ist; R&sub3;&sub9; Gly oder Arg ist; R&sub4;&sub0; Ala oder Ser ist; R&sub4;&sub2; Phe, Ala oder Val ist; R&sub4;&sub3; Asn oder Arg ist; R&sub4;&sub4; eine natürliche Aminosäure ist; Q&sub1;-Q&sub9; entweder für H oder für CaMe stehen, jedoch mit der Maßgabe, daß alle Reste zwischen R&sub3;&sub0; und R&sub4;&sub4; inklusive, oder jede Sequenz davon, beginnend am C-Terminus, deletiert werden können, und weiters mit der Maßgabe, daß zumindest eines von Q&sub1;, Q&sub4;, Q&sub7;, Q&sub8; und Q&sub9; CaMe ist. Bei einer bevorzugten Unterklasse der Vorstehenden ist R&sub5; Ile, R&sub1;&sub8; Ser, R&sub2;&sub4; Gln, R&sub2;&sub5; Asp, R&sub2;&sub6; Ile, R&sub3;&sub4; Ser, R&sub3;&sub8; Arg, R&sub3;&sub9; Gly und R&sub4;&sub0; Ala. Erstreckt sich das Peptid bis zur Position 44, so ist R&sub4;&sub4; vorzugsweise Leu oder Val.
- Eine andere bevorzugte Unterklasse sind die Peptide mit der folgenden Sequenz:
- (B)R&sub1;-R&sub2;-R&sub3;-Asp-(Q&sub1;)Ile-Phe-Thr-R&sub8;-Ser-(Q&sub2;)R&sub1;&sub0;-Arg-R&sub1;&sub2;- (Q&sub3;)R&sub1;&sub3;-Leu-R&sub1;&sub5;-Gln-(Q4)Leu-Ser-(Q&sub5;)Ala-Arg-R&sub2;&sub1;-(Q&sub6;)R&sub2;&sub2;(Q&sub7;)Leu-Gln-Asp-(Q&sub8;)Ile-(Q&sub9;)R&sub2;&sub7;-R&sub2;&sub8;-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser- Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-R&sub4;&sub2;-R&sub4;&sub3;-R&sub4;&sub4;, worin R&sub1; Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-Phe, pCl-Phe, Leu, His oder D-His ist; B H, CaMe. NaMe, Desamino, Ac oder For ist; R&sub2; Ala, D-Ala, NMA oder D-NMA ist; R&sub3; Asp oder D-Asp ist; R&sub8; Ser, Asn, Lys, Arg, Asp oder Gln ist; R&sub1;&sub0; Tyr, D-Tyr oder Phe ist; R&sub1;&sub2; Arg oder Lys ist; R&sub1;&sub3; Ile, Val, Leu oder Ala ist; R&sub1;&sub5; Gly oder Ala ist; R&sub2;&sub1; Lys, D-Lys, Arg oder D-Arg ist; R&sub2;&sub2; Leu, Ile, Ala oder Val ist; R&sub2;&sub7; Met, D-Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva oder Val ist; R&sub2;&sub8; Asn oder Ser ist; R&sub4;&sub2; Phe, Ala oder Val ist; R&sub4;&sub3; Asn oder Arg ist; R&sub4;&sub4; eine natürliche Aminosäure ist; Q&sub1; bis Q&sub9; entweder für H oder für CaMe stehen, jedoch mit der Maßgabe, daß einer oder alle der Reste zwischen R&sub3;&sub0; und R&sub4;&sub4; inklusive in der Sequenz deletiert werden können, beginnend am C-Terminus, und mit der Maßgabe, daß mindestens eines von Q&sub1;, Q&sub4;, Q&sub7;, Q&sub8; und Q&sub9; CaMe ist. In jedem dieser Peptide kann der Carboxylanteil des Aminosäurerestes am C-Terminus einer der folgenden Radikale sein: -COOR, -CRO, -CONHNHR, -CON(R)(R') oder -CH&sub2;OR, wobei R und R' nied.Alkyl, Fluor-nied.Alkyl oder Wasserstoff sind; Methyl, Ethyl und Propyl sind die bevorzugten nied.Alkylgruppen. Vorzugsweise ist es -CONHR, wobei R H oder nied.Alkyl ist.
- Eine noch andere bevorzugte Unterklasse von Peptiden, die erfindungsgemäß vorgesehen ist, sind jene der Formel (B)R&sub1;-R&sub2;-Asp-Ala-(Q&sub1;)Ile-Phe-Thr-R&sub8;-Ser-(Q&sub2;)R&sub1;&sub0;-Arg-R&sub1;&sub2;- (Q&sub3;)R&sub1;&sub3;-Leu-R&sub1;&sub5;-Gln-(Q&sub4;)Leu-R&sub1;&sub8;-(Q&sub5;)Ala-Arg-R&sub2;&sub1;-(Q&sub6;)R&sub2;&sub2;- (Q&sub7;)Leu-R&sub2;&sub4;-R&sub2;&sub5;(Q&sub8;)R&sub2;&sub6;-(Q&sub9;)R&sub2;&sub7;-R&sub2;&sub8;-Arg-Gln-Gln-Gly-Y, worin R&sub1; Tyr, D-Tyr, Phe, D-Phe, His oder D-His ist; B H, CaMe oder NaMe ist; R&sub2; Ala, D-Ala, NMA oder D-NMA ist; R&sub8; Ser, Asn, Lys, Arg, Asp oder Glu ist; R&sub1;&sub0; Tyr, D-Tyr oder Phe ist; R&sub1;&sub2; Arg oder Lys ist; R&sub1;&sub3; Ile, Val, Leu oder Ala ist; R&sub1;&sub5; Gly oder Ala ist; R&sub1;&sub8; Ser oder Tyr ist; R&sub2;&sub1; Lys, D-Lys, Arg oder D-Arg ist; R&sub2;&sub2; Leu, Ile, Ala oder Val ist; R&sub2;&sub4; Gln oder His ist; R&sub2;&sub5; Asp oder Glu ist; R&sub2;&sub6; Ile oder Leu ist; R&sub2;&sub7; Met, Ala, Nle, Ile, Leu, Nva oder Val ist; R&sub2;&sub8; Asn oder Ser ist; Y NHR ist, wobei R für H oder nied.Alkyl (d.h. C&sub1;-C&sub3;-Alkyl) steht; Q&sub1; bis Q&sub9; entweder H oder CaNe sind, mit der Maßgabe, daß Gly, Gln-Gly oder Gln-Gln-Gly am C-Terminus deietiert werden kann, und weiters mit der Maßgabe, daß mindestens eines von Q&sub1;, Q&sub4;, Q&sub7;, Q&sub8; und Q&sub9; CaMe ist.
- Gemäß obiger Definition haben Fragmente, die sich vom N- Terminus durch den Rest 29 erstrecken, biologische Potenz, indem sie die Freigabe von GH durch die Hypophyse bewirken, und biologisch aktive Fragmente mit 29 oder 32 Resten in Länge, die einen C-Terminus aufweisen, welcher ein Amid oder ein substituiertes Amid ist, sind am meisten bevorzugt. Hat das Peptid 40 oder mehr Reste, gibt es keine klare Präferenz für den Anteil am C-Terminus.
- Die Peptide werden durch ein geeignetes Verfahren synthetisiert, wie z.B. durch ausschließlichliche Festphasen- Methoden, durch teilweise Festphasen-Methoden, durch Fragmentkondensation oder durch Lösungskopplungen. Beispielsweise sind Methoden der ausschließlichen Festphasen-Synthese im Textbuch "Solid-Phase Peptide Synthesis", Stewart & Young, Freeman & Co., San Francisco, 1969, dargelegt und als Beispiel in der Offenbarung der am 8. August 1978 an Vale et al. erteilten US- PS Nr. 4,105,603 zitiert. Die Lösungssynthese ist detailliert in der Abhandlung "Methoden der Organischen Chemie (Houben- Weyl) beschrieben: Synthese von Peptiden", E. Wunsch (Herausg.) (1974) Georg Thieme Verlag, Stuttgart, BRD. Das Fragmentkondensationsverfahren zur Synthese ist beispielhaft in der US-PS Nr. 3,972,859 (3. August 1976) beschrieben. Andere mögliche Synthesen sind in den US-Psen Nr. 3,842,067 (15. Oktober 1974) und 3,862,925 (28. Jänner 1975) als Beispiele angeführt.
- Gemeinsam ist diesen Synthesen der Schutz der labilen Seitenkettengruppen der verschiedenen Aminosäureteile mit geeigneten Schutzgruppen, die das Einsetzen einer chemischen Reaktion an dieser Stelle verhindern, bis die Gruppe schließlich entfernt wird. Allgemein üblich ist auch der Schutz einer alpha-Aminogruppe an einer Aminosäure oder einem Fragment, während diese an der Carboxylgruppe reagieren, gefolgt von der selektiven Entfernung der alpha-Amino- Schutzgruppe, um zu ermöglichen, daß die anschließende Reaktion an dieser Stelle stattfinden kann. Demgemäß ist es üblich, daß als Syntheseschritt eine intermediäre Verbindung erzeugt wird, die jeden der Aminosäurereste in seiner gewünschten Sequenz in der Peptidkette enthält, wobei die Seitenketten-Schutzgruppen an die entsprechenden Reste gebunden sind.
- In diesem Zusammenhang schafft die vorliegende Erfindung Intermedianten der Formel (II): X¹-(B)R&sub1;(X oder X²)-R&sub2;-R&sub3;(X³)- Ala-(Q&sub1;)R&sub5;-Phe-Thr(X&sup4;)-R&sub8;(X&sup8;)Ser(X&sup4;)-(Q&sub2;),R&sub1;&sub0;(X²)-Arg(X&sup6;)- R&sub1;&sub2;(X&sup6; oder X&sup7;)-(Q&sub3;)R&sub1;&sub3;-Leu-R&sub1;&sub5;&submin;Gln(X&sup5;)-(Q&sub4;)Leu-R&sub1;&sub8;(X² oder x&sup4;)-(Q&sub5;)Ala-Arg(X&sup6;)-R&sub2;&sub1;(X&sup6; oder X&sup7;)-(Q&sub6;)R&sub2;&sub2;-(Q&sub7;)Leu-R&sub2;&sub4;(X&sup5; oder X)-R&sub2;&sub5;(X³)-(Q&sub8;)R&sub2;&sub6;-(Q&sub9;)R&sub2;&sub7;-R&sub2;&sub8;(X&sup4; oder X&sup5;)-Arg(X&sup6;)- Gln(X&sup5;)-Gln(X&sup5;)-Gly-Glu(X³)-R&sub3;&sub4;(X&sup4; oder X&sup6;)-Asn(X&sup5;)-Gln(X&sup5;)- Glu(X³)-R&sub3;&sub8;(X&sup6; oder X&sup5;)-R&sub3;&sub9;(X&sup6;)-R&sub4;&sub0;(X²)-Arg(X&sup6;)-R&sub4;&sub2;-R&sub4;&sub3;(X&sup5; oder X&sup6;)R&sub4;&sub4; (X&sup8;)-X&sup9;, worin X¹ entweder Wasserstoff oder eine alpha-Aminoschutzgruppe ist. Die durch X¹ vorgesehenen alpha- Aminoschutzgruppen sind jene, von denen man weiß, daß sie bei der Technik der schrittweisen Synthese von Polypeptiden zweckmäßig sind. Zu den Klassen von alpha-Arninoschutzgruppen, die als X¹ verwendet werden können, gehören (1) aromatische Schutzgruppen vom Urethantyp, wie Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC) Benzyloxycarbonyl (Z) und substituiertes Z, wie p- Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p- Brombenzyloxycarbonyl und p-Methoxybenzyloxycarbonyl; (2) aliphatische Urethan-Schutzgruppen, wie tert.Butyloxycarbonyl (BOC), Diisopropylmethyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl; und (3) Schutzgruppen vom Cycloalkylurethantyp, wie Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl. Die bevorzugte alpha- Aminoschutzgruppe ist BOC, selbst wenn in der 1-Position ein NaMe-substituierter Rest verwendet wird; selbstverständlich ist X¹ H, wenn B Desamino ist.
- X ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für den Imidazolstickstoff von His, wie Tos.
- X² kann eine geeignete Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe von Tyr sein, wie Tetrahydropyranyl, tert.Butyl, Trityl, Bzl, CBZ, 4br-CBZ und 2,6-Dichlorbenzyl (DOB). Die bevorzugte Schutzgruppe ist 2,6-Dichlorbenzyl. X² kann Wasserstoff sein, was bedeutet, daß es keine seitenketten-Schutzgruppe am Aminosäurerest in dieser Position gibt.
- X³ ist Wasserstoff oder eine geeignete esterbildende Schutzgruppe für die Carboxylgruppe von Asp oder Glu, wie Benzyl(OBZl), 2,6-Dichlorbenzyl, Methyl und Ethyl.
- X&sup4; kann eine geeignete Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe von Thr oder Ser sein, wie Acetyl, Benzoyl, tert.Butyl, Trityl, Tetrahydropyranyl, Bzl, 2,6-Dichlorbenzyl und CBZ. Die bevorzugte Schutzgruppe ist Bzl. X&sup4; kann Wasserstoff sein, was bedeutet, daß es keine Schutzgruppe an der Hydroxylgruppe gibt.
- X&sup5; ist Wasserstoff oder eine geeignete Schutzgruppe für die Seitenketten-Amidogruppe von Asn oder Gln. Es ist bevorzugterweise Xanthyl (Xan).
- X&sup6; ist eine geeignete Schutzgruppe für die Guanidogruppe von Arg, wie Nitro, Tos, CBZ, Adamantyloxycarbonyl und BOC, oder Wasserstoff.
- X&sup7; ist Wasserstoff oder eine geeignete Schutzgruppe für die Seitenketten-Aminogruppe von Lys. Repräsentativ für geeignete Seitenketten-Aminoschutzgruppen sind 2-Chlorbenzyloxycarbonyl(2-C1-Z), Tos, tert.Amyloxycarbonyl und BOC.
- X&sup8; ist Wasserstoff oder eine geeignete Seitenketten- Schutzgruppe wie oben allgemein angeführt.
- Met kann gegebenenfalls durch Sauerstoff geschützt sein. wird aber bevorzugterweise ungeschützt gelassen.
- Die Auswahl einer Seitenketten-Aminoschutzgruppe ist nicht kritisch, mit der Ausnahme, daß im allgemeinen eine solche gewählt wird&sub1; die bei der Entschützung der alpha- Aminogruppen während der Synthese nicht entfernt wird. Bei manchen Aminosäuren, z.B. His, ist aber ein Schutz nach der Kopplung im allgemeinen nicht notwendig, und die Schutzgruppen können dieselben sein.
- X&sup9; ist eine geeignete Schutzgruppe für die C-terminale Carboxylgruppe, wie die esterbildende Gruppe X³, oder es wird bei der Festphasen-Synthese eine Ankerbindung für die Bindung an einen festen Harzträger verwendet, oder es ist des-X&sup9;, in welchem Fall der Rest am C-Terminus einen Carboxylanteil, nämlich Y wie zuvor definiert, aufweist. Wird ein fester Harz träger verwendet, so kann dieser irgendein auf diesem Gebiet bekannter sein, wie einer der Formeln -O-CH&sub2;-Harzträger, -NH- Benzhydrylamin(BHA)-Harzträger oder -NH-Paramethylbenzhydrylamin(MBHA)-Harzträger. Ist das unsubstituierte Amid erwünscht, wird die Verwendung von BHA- oder MBHA-Harz bevorzugt, weil die Spaltung unmittelbar das Amid ergibt. Für den Fall, daß das N-Methylamid erwünscht ist, kann dieees aus einem N- Methyl-BHA-Harz erzeugt werden. Sollten andere substituierte Amide erwünscht sein, kann die Lehre der US-PS Nr. 4,569,967 angewendet werden, oder sollten noch andere Gruppen als die freie Säure am C-Terminus erwünscht sein, kann es vorzuziehen sein, das Peptid unter Verwendung von Lösungssynthese verfahren, wie sie im Houben-Weyl-Text dargelegt sind, zu synthetisieren.
- In der Formel für den Intermedienten ist zumindest eine der X-Gruppen eine Schutzgruppe oder enthält X&sup9; den Harzträger. So sieht die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids von Interesse vor, u.zw. durch (a) Bildung eines Peptids mit mindestens einer Schutzgruppe und der Formel (II), worin: X, X¹, X², X³, X&sup4;, X&sup5;, X&sup6;, X&sup7; und X&sup8; jeweils entweder ein Wasserstoff oder eine Schutzgruppe und und X&sup9; entweder eine Schutzgruppe oder eine Ankerbindung an den Harzträger oder des-X&sup9; ist, in welchem Fall der Rest am Terminus den gewünschten Carboxyanteil haben kann; (b) Abspaltung der Schutzgruppe oder -gruppen oder Ankerbindung vom Peptid der Formel (II); und (c) gewünschtenfalls Überführung des resultierenden Peptids der Sequenz (I) in ein nicht-toxisches Salz davon.
- Bei der Auswahl einer speziellen Seitenketten- Schutzgruppe zur Verwendung bei der Synthese der Peptide werden folgende Allgemeinregeln befolgt: (a) die Schutzgruppe behält vorzugsweise ihre schützenden Eigenschaften bei und wird unter Kopplungsbedingungen nicht abgespaltet, (b) die Schutzgruppe sollte stabil gegenüber dem Reagens sein und ist mit Ausnahme von Xan vorzugsweise stabil unter den Reaktionsbedingungen, die zur Entfernung der alpha-Aminoschutzgruppe in jedem Schritt der Synthese gewählt werden, und (c) die Seitenketten-Schutzgruppe muß nach Beendigung der die gewünschte Aminosäuresequenz enthaltenden Synthese unter Reaktionsbedingungen, die die Peptidkette nicht unerwünscht verändern können, entfernt werden können.
- Die Peptide werden vorzugsweise unter Verwendung der Festphasen-Synthese hergestellt, wie sie allgemein von Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, S. 2149 (1963) beschrieben ist, wenn auch auf diesem Gebiet bekannte äquivalente chemische Synthesen, wie die zuvor genannten, anwendbar sind. Mit der Festphasen-Synthese wird am C-Terminus des Peptids durch Kopplung einer geschützten alpha-Aminosäure an ein geeignetes Harz begonnen. Ein solches Ausgangsmaterial kann hergestellt werden durch Koppeln einer alpha-Amino-geschützten Aminosäure mittels einer Esterbindung an ein chiormethyliertes Harz oder ein Hydroxymethylharz oder mittels einer Amidbindung an ein BHA-Harz oder MBHA-Harz. Die Herstellung des Hydroxymethylharzes ist von Bodansky et al., Chem.Ind. (London) 38, 1597-98 (1966) beschrieben. Chlormethylierte Harze sind im Handel erhältlich, u.zw. von Bio Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien und von Lab. Systems, Inc. Die Herstellung eines solchen Harzes ist von Stewart et al., "Solid Phase Pep tide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), Kapitel 1, S 1-6, beschrieben. BHA- und MBHA-Harzträger sind im Handel erhältlich und werden im allgemeinen nur dann verwendet, wenn das gewünschte Folypeptid, welches synthetisiert wird, ein unsubstituiertes Amid am C-Terminal enthält.
- Die C-terminale Aminosäure, z.B. Asn, die durch BOC und durch Xan geschützt ist, kann zuerst gemäß dem in Chemistry Letters, K. Horiki et al., 165-168 (1978) beschriebenen Verfahren unter Verwendung von KF in DMF bei etwa 60ºC während 24 Stunden unter Rühren an das chiormethylierte Harz gekoppelt werden, wenn beispielsweise ein freies Säureanalog von Ratten GRF (rGRF) mit 43 Resten synthetisiert werden soll. Im Anschluß an die Kopplung der BOC-geschützten Aminosäure an den Harzträger wird die alpha-Aminoschutzgruppe entfernt, z.B. unter Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid oder TFA allein. Die Entschützung erfolgt bei einer Temperatur zwischen etwa 0ºC und Raumtemperatur. Es können auch andere Standard-Abspaltreagenzien, wie HCl in Dioxan, und Bedingungen zur Entfernung spezifischer alpha-Aminoschutzgruppen verwendet werden, wie in Schroder & Lubke, "The Peptides", 1, S. 72-75 (Academic Press 1965) beschrieben. Nach Enrfernung der alpha-Aminoschutzgruppe werden die verbleibenden alpha-Amino- und seitenkettengeschützten Aminosäuren zur Erzielung der zuvor definierten Zwischenverbindung schrittweise in der gewünschten Reihenfolge aneinander gekoppelt, oder als Alternative zur Zugabe jeder Aminosäure einzeln in der Synthese können manche davon vor der Zugabe zum Festphasenreaktor aneinandergekoppelt werden. Die Wahl eines geeigneten Kopplungsreagens liegt beim Fachmann. Besonders geeignet als Kopplungsreagens ist N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI).
- Die Aktivierungsreagenzien, die bei der Festphasen Synthese der Peptide verwendet werden, sind auf dem Peptidsektor gut bekannt. Beispiele für geeignete Aktivierungsreagenzien sind Carbodiimide, wie N,N'-Diisopropylcarbodiimid und N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid Andere Aktivierungsreagenzien und ihre Verwendung bei der Peptid kopplung sind von Schroder & Lubke supra in Kapitel III und von Kapoor, J. Phar. Sci., 59, S, 1-27 (1970) beschrieben.
- Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in etwa der vierfachen Menge oder im Überschuß in den Festphasenreaktor eingebracht, und die Kopplung kann in einem Medium aus Dimethylformamid (DMF):CH&sub2;Cl&sub2; (1:1) oder in DMF oder CH&sub2;Cl&sub2; allein ausgeführt werden. Für den Fall, daß es zu einer unvollständigen Kopplung kommt, wird der Kopplungsvorgang vor Entfernen der alpha-Aminoschutzgruppe vor Kopplung der nächsten Aminosäure wiederholt. Der Erfolg der Kopplungsreaktion in jeder Stufe der Synthese wird bei manueller Durchführung vorzugsweise durch die Ninhydrinreaktion überwacht, wie von E. Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 595 (1970) beschrieben. Die Kopplungsreaktionen können automatisch, z.B. auf einem Beckman 990 Autosynthesizer, unter Verwendung eines Programms, wie es in Rivier et al. Biopolymers, 1978, 17, 5. 1927-1938, beschrieben ist, durchgeführt werden.
- Nach Vollendung der gewünschten Aminosäuresequenz kann das Zwischenpeptid durch Behandlung mit einem Reagens, wie flüssigem Fluorwasserstoff, entfernt werden, welcher nicht nur das Peptid vom Harz abspaltet, sondern auch sämtliche verbleibenden Seitenketten-Schutzgruppen X, X², X³, X&sup4;, X&sup5;, X&sup6;, X&sup7; und X&sup8; und die Ankerbindung X&sup9; sowie die alpha- Aminoschutzgruppe X¹, sofern verwendet, abspaltet, um das Peptid in Form der freien Säure zu erhalten. Ist Met in der Sequenz anwesend, so wird die BOC-Schutzgruppe vorzugsweise unter verwendung von Trifluoressigsäure (TFA)/Ethandithiol als erste entfernt, bevor das Peptid mit HF vom Harz abgespalten wird, um eine eventuelle 5-Alkylierung auszuschalten. Bei der Verwendung von Fluorwasserstoff zur Abspaltung werden Anisol und Methylethylsulfid als Scavenger in das Reaktionsgefäß mit eingebracht.
- Das nachstehende Beispiel 1 veranschaulicht ein bevorzugtes Verfahren zur Synthetisierung von Peptiden mittels der Festphasenmethode. Selbstverständlich ist es auch möglich, die Synthese eines entsprechend längeren Peptids auf die gleiche Weise auszuführen, indem einfach die erforderliche Anzahl an Aminosäuren am C-Terminus der Kette hinzugefügt wird. Man ist derzeit der Meinung, daß biologisch aktive Fragmente die angeführte Sequenz am N-Terminus enthalten sollten, und die Hinzufügung von Resten am N-Terminus wird nicht für günstig erachtet.
- Die Synthese des Peptids [NaMeTyr¹, Ala¹&sup5;, CML²&sup7;, Asn²&sup8;]- hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr- Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu- Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem handelbsüblichen MBHA-Harz, wie allgemein n der US-PS Nr. 4,292,313 - Vale et al. beschrieben, schrittweise durchgeführt. Die Kopplung von BOC-Arg(Tos) an das Harz führt zur Substitution von etwa 0,35 mmol Arg pro g Harz.
- Nach der Deblockierung und Neutralisierung wird die Peptidkette Schritt für Schritt auf dem Harz aufgebaut. Die Deblockierung, Neutralisierung und Zugabe jeder Aminosäure erfolgt im allgemeinen gemäß der in Rivier, J., J. Amer. Chem. Soc., 96, 2986-2992 (1974) detailliert beschriebenen Verfahrensweise. Sämtliche verwendeten Lösungsmittel werden sorgfältig entgast, indem sie mit Inertgas, z.B. Helium oder Stickstoff, bespruht werden, um zu gewährleisten, daß kein Sauerstoff vorhanden ist, der den Schwefel des Met-Restes unerwünscht erweise oxidieren könnte.
- Die Deblockierung wird vorzugsweise gemäß der folgenden Aufstellung A durchgeführt: AUFSTELLUNG A Reagens Mischzeit min Ethandithiol (zweimal)
- Die Kopplungen werden vorzugsweise durchgeführt, wie in der nachfolgenden Aufstellung B angeführt: AUFSTELLUNG B Reagens Mischzeit (min) Boc-Aminosäure (zweimal)
- Kurzgesagt werden 1 bis 2 mmol BOC-geschützte Aminosäure in Methylenchlorid pro Gramm Harz verwendet, plus einem Äquivalent von 1,0 molarem DCCI in Methylenchlorid zwei Stunden lang. Bei der Kopplung von BOC-Arg(Tos) wird eine Mischung von 50 %igem DMF und Methylenchlorid verwendet, Bzl- Ether wird als Hydroxyl-Seitenketten-Schutzgruppe für Ser und Thr eingesetzt. Die Amidogruppe von Asn oder Gln wird mit Xan geschützt, wenn, wie bevorzugt, die DCC-Kopplung angewendet wird P-Nitrophenylester (ONp) kann auch zur Aktivierung des Carboxyl-Endes von Asn oder Gln verwendet werden, und beispielsweise kann BOC-Asn(ONp) über Nacht unter Verwendung eines Äquivalents von HOBt in einer 50 %igen Mischung von DMF und Methylenchlorid gekoppelt werden, in welchem Fall kein DCC zugegeben wird. 2-chlorbenzyloxycarbonyl (2Cl-z) wird als Schutzgruppe für die Lys-Seitenkette verwendet. Tos wird zur Schützung der Guanidogruppe von Arg und des Imidazolstickstoffs von His verwendet, und die Seitenketten carboxylgruppe von Glu oder Asp wird mit OBzl geschützt. Die phenolische Hvdroxylgruppe von Tyr wird mit 2,6-Dichlorbenzyl (DCB) geschützt. Am Ende der Synthese wird die folgende Zusammensetzung erhalten:
- BOC-NaMeTyr-X²)-Ala-Asp(X³)-Ala-Ile-Phe-Thr(X&sup4;)-Asn(X&sup5;)- SERCX&sup4;)-Tyr(X²)-Arg(X&sup6;)-Lys(X&sup7;)-Val-Leu-Ala-Gln(X&sup5;)-Leu- Ser(X&sup4;)-Ala-Arg(X&sup6;)-Lys(X&sup7;)-Leu-Leu-Gln(X&sup5;)-Asp(X³)-Ile-CML- Asn-(X&sup5;)-Arg(X&sup6;)-X&sup9;, worin X² ein DCB-, X³ ein OBzl-, X&sup4; ein Bzl-, X&sup5; ein Xan-, X&sup6; ein Tos-, X&sup7; ein 2Cl-Z- und X&sup9; ein NH- MBHA-Harzträger ist. Xan kann teilweise oder zur Gänze durch eine TFA-Behandlung entfernt worden sein, die zur Entblockung der alpha-Aminoschutzgruppe verwendet wurde.
- Zur Abspaltung und Entschützung des geschützten Peptidharzes wird dieses mit 1,5 ml Anisol, 0,5 ml Methylethylsulfid und 15 ml Fluorwasserstoff (HF) pro Gramm Peptid harz eine halbe Stunde bei -20ºC und eine halbe Stunde bi 0ºC behandelt. Nach Entfernen des HF unter Hochvakuum wird der Harz-Peptid-Rückstand abwechselnd mit trockenem Diethylether und Chloroform gewaschen&sub1; und das Peptid wird dann mit entgaster 2N wässeriger Essigsäure extrahiert und durch Filtration vom Harz getrennt.
- Das abgespaltene und entschützte Peptid wird dann in 0 bis 5 % Essigsäure gelöst und einer Reinigung unterzogen, die eine Feingelfutration über Sephadex G-50 einschließen kann (Sephadex ist eine registrierte Marke in einem oder mehreren bezeichneten Staaten).
- Das Peptid wird dann durch präparative oder semi- präparative HPLC, wie von Rivier et al., Peptides: Structure and Biological Function, (1979), S. 125-8 und Marki et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 3178 (1981) beschrieben, gereinigt. Auf Waters Associates Prep LC-500 passende Patronen werden mit 15- 20µ C&sub1;&sub8;-Silika von Vydac (300A) gepackt. Ein Gradient aus CH&sub3;CN in TEAP wird mit einem Eldex-Niedrigdruck-Gradienterzeuger, wie in Rivier, J., J. Lig. Chromatography 1, 343-367 (1978) beschrieben, hergestellt. Die Chromatografie-Fraktionen werden sorgfältig mittels HPLC überwacht, und es werden nur die Fraktionen, die eine wesentliche Reinheit zeigen, gesammelt. Die Entsalzung der gereinigten Fraktionen, die unabhängig voneinander auf Reinheit untersucht werden, wird unter Verwendung eines Gradienten aus CH&sub3;CN in 0,1 % TFA erzielt. Der Mitteischnitt wird dann lyophilisiert, um das gewünschte Peptid zu liefern, dessen Reinheit größer als 98 % sein sollte.
- Die optische Rotation des gereinigten Peptids wird unter Verwendung eines Perkin-Elmer-Polarimeters gemessen und ergab [α]D = 52,0º ± 1 (c 1, 1 % Essigsäure).
- Die Synthese eines amidierten Peptids mit 40 Resten [CaMeHis¹, D-NMA², CML²&sup7;)-hGRF(1-40)-NH&sub2; mit der Formel H- CaMeHis¹-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val- Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-ASP-Ile-CML-Ser- Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz, wie allgemein in der US-PS Nr. 4,292,313 - Vale et al. beschrieben, schrittweise durchgeführt. Unter verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [D-NMA², CML²&sup7;]-rGRF(1-43)-OH mit der Formel H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg- Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-CML- Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe- Asn-OH wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid- Synthetisierers unter Anwendung eines chlormethylierten Harzes mit anfänglicher Kopplung, wie in Chemistry Letters, supra beschrieben, und danach auf die in Beispiel 1 allgemein beschriebene Weise schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese des hGRF-Analogfragments [NaMeTyr¹, Lys&sup8;, Ala¹&sup5;, CML²&sup7;, Asn²&sup8;]-hGRF-(12-9)-NH&sub2; mit der Formel NaMeTyr- Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln- Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß dieses Analog im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese wird wiederholt, indem der N-terminale Rest ausgetauscht wird, um [NaMeHis¹, Lys&sup8;, Ala¹&sup5;, CML²&sup7;, Asn²&sup8;]- hGRF(1-29)-NH&sub2; zu erzeugen.
- Die Synthese des hGRF-Analogfragments (NaMeTyr¹, D-Lys²¹, CML²&sup7;]-hGRF(1-29) NH&sub2; mit der Formel NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile- Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D- Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Ser-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [NaMeHis¹, D-NMA², Lys&sup8;, D-Arg²¹, CML²&sup7;]-rGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel NaMeHis-D-NMA-Asp-Ala- Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala- Arg-D-Arg-Leu-Leu-His-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt. daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [NaMeTyr¹, CaMe-D-Tyr&sub1;&sub0;, D-Lys&sub2;&sub1;, CML²&sup7;]-hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel Na-MeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile- Phe-Thr-Asn-Ser-CaMe-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser- Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-ser-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Feptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [D-NMA², CML&sup5;, D-Lys²¹, Nva²&sup7;]-rGRF(1- 29)-NH&sub2; mit der Formel H-His-D-NMA-Asp-Ala-CML-Phe-Thr-Asn- Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-Arg-D-Lys-Leu-Leu- His-Glu-Ile-Nva-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einern MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [D-Phe¹, D-NMA², Glu&sup8;, CaMeTyr¹&sup0;, Ile¹³, CML²³]-hGRF(1-32)-NH&sub2; mit der Formel h-D-Phe-D-NMA-Asp-Ala- Ile-Phe-Thr-Glu-Ser-CaMeTyr-Arg-Lys-Ile-Leu-Gly-gln-Leu-Ser- Ala-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid- Synthetisierers auf einem MBHA-Harz, wie allgemein in der US- PS Nr. 4,292,313 - Vale et al. beschrieben, schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [NaMeHis¹, D-NMA², CaMeVal¹³, CML²&sup7;]- hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel NaMeHis-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe- Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CML-Ser-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetizierers auf einem MBHA-Harz, wie allgemein in der US-PS Nr. 4,292,313 - Vale et al. beschrieben, schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese des hGRF-Analogfragments [For-Tyr¹, D-NMA², CaMeTyr¹&sup0;, CMA¹&sup9;, CML²&sup7;, Asn²&sup8;]-hGRF(1-32)-NH&sub2; mit der Formel For-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-CaMeTyr-Arg-Lys-Val- Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CMA-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-CNL-Asn- Arg-Gln-Gln-Gly-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 Schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß dieses Analog im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [D-NMA², Lys¹², CaMeIle¹³ CMA¹&sup9;, CML²&sup7;]-rGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel H-His-D-NMA-Asp-Ala-Ile Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeIle-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CMA- Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf eine MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese des hGRF-Analögfragments (D-NMA², Arg¹², CML²³, Ile²&sup7;]-hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel H-Tyr-D-NMA-Asp- Ala-Ile- Phe-Thr-Asn-ser-Tyr-Arg-Arg-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser- Ala-Arg-Lys -Leu-CML-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [D-Phe¹, D-NMA², CaMeVal¹³, Ala¹&sup5;, CML²³, D-Met²&sup7;]-hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel H-D-Phe-D-NMAAsp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Ala-Gln- Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-D-Met-Ser-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß dieses Analog im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [D-NMA², D-Arg²¹, CML²³]-hGRF(1-32)-NH&sub2; mit der Formel H-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr- Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-D-Arg-Leu-CML-Gln-Asp- Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß dieses Analog im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [desaminoHis¹, D-NMA², Lys&sup8;, Asp²&sup5;, CML²&sup6;]-rGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel desNH&sub2;His-D-NMA-Asp-Ala- Ile-Phe-Thr-Lys-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala- Arg-Lys-Leu-Leu-His-Asp-CML-Met-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [Ac-D-His¹, D-NMA², Arg&sup8;, CaMeTyr¹&sup0;, CMA¹³, CML²&sup7;]-rGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel Ac-D-His-D-NMA Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-CaMeTyr-Arg-Arg-CMA-Leu-Gly-Gln- Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz auf die in Beispiel 1 allgemein beschriebene Weise schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist
- Die Synthese von (D-Ala², D-Asp³, CaMeTyr&sub1;&sub0;, CMA¹&sup9;, CML,²³, CML²&sup7;J-hGRF(1-32)-NH&sub2; mit der Formel H-Tyr-D-Ala-D-Asp- Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-CaMeTyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu- Ser-CMA-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-CML-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly- NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß dieses Analog im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [D-Tyr¹, D-NMA², CML&sup5;, Lys&sup8;, CaMe-D- Tyr¹&sup0;, Ala¹&sup5;, D-Met²&sup7;]-hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel H-D-Tyr- D-NMA-Asp-Ala-CML-Phe-Thr-Lys-Ser-CaMe-D-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu- Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-ASP-Ile-D-Met-Ser-Arg- NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid- Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß dieses Analog im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [D-His¹, D-NMA², Arg&sup8;, Leu¹³, CMA¹&sup9;, CML²&sup7;]-rGRF(1-32)-NH&sub2; mit der Formel H-D-His-D-NNA-Asp-Ala- Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CMA- Arg-Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz auf die in Beispiel 1 allgemein beschriebene Weise schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese eines RGRF-Analogfragments, nämlich von [desaminoTyr¹, OML²³]-rGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel desNH&sub2;Tyr- Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-GIy-Gln- Leu-Tyr-Ala-Arg-Lys-Leu-CML-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. U,nter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [Ac-D-Tyr¹, D-NMA², CaMeTyr¹&sup0;, CaMeVal¹³, CMA¹&sup9;, CML²³, Nle²&sup7;]-hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel Ac-D-Tyr-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-CaMeTyr-Arg-Lys- CaMeVal Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-CMA-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Asp-Ile- Nle-Ser-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie allgemein in der US-PS Nr. 4,292,313 - Vale et al. beschrieben, schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [CML¹, D-NMA², Glu&sup8;, CMA¹&sup9;, Glu²&sup5;, CML²&sup7;)-rGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel H-CML-D-NMA-Asp-Ala-Ile- Phe-Thr-Glu-Ser-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CMA-Arg- Lys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [For-D-Tyr¹, D-NMA², CaMevall³, CMA¹&sup9;, Arg²¹, CML²³, Asn²&sup8;]-hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel For-D-Tyr- D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly- Gln-Leu- Ser-CMA-Arg-Arg-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid- Synthetisierers auf einem MDHA-Harz wie allgemein in der US-PS Nr. 4,292,313 - Vale et al. beschrieben, schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [NMA², CaMeVal¹³, CML²&sup7;]-hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel H-Tyr-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg- Lys-CaMeVal-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp- Ile-CML-Ser-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie allgemein in der US-PS Nr. 4,292,313 - Vale et al. beschrieben, schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist. Dann wird das Acetatsalz durch Auflösen des Peptids in Wasser und Zugabe von 1N Essigsäure hergestellt. Die resultierende Lösung wird lyophilisiert, um das Acetatsalz zu liefern.
- Die Synthese des hGRF-Analogs [D-NMA², Arg&sup8;, CMA¹&sup9;, CML²³, Nle²&sup7;,]-hGRF(1-32)-NH&sub2; mit der Formel H-Tyr-D-NMA-Asp- Ala-Ile-Phe-Thr-Arg-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser- CMA-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-Ile-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid- Synthetisierers auf einern MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß dieses Analog im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von (CML¹&sup7;, Arg²¹, Nle²&sup7;]-rGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel H-His-Ala-Asp-Ala Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Arg- Ile-Leu-Gly-Gln-CML-Tyr-Ala-Arg-Arg-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Nle- Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid- Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLKC und HPLC wird festgestellt, daß dss Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese des hGRF-Analogs [D-NMA², CaMeVal¹³, CMA¹&sup9; CML²³, Nle²&sup7;, Asn²&sup8;]-hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel H-Tyr-D- NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CaMeVal-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser-CMA-Arg-Lys-Leu-CML-Gln-Asp-Ile-Nle-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [NaMeTyr¹, Ala¹&sup5;, CML²&sup6;, Nle²&sup7;, Asn²&sup8;, hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr- Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val -Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu- Leu-Gln-Glu-CML-Nle-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie 1:1 Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist. Die optische Drehung des gereinigten Peptids wird unter Verwendung eines fotoelektrischen Polarimeters gemessen und ergibt [α]D 43,5º ± 1 (c = 1, 1 % Essigsäure).
- Die Synthese von [Met¹, CMA¹&sup9;, Arg²¹, OML²&sup7;,]-rGRF(1-29)- NH&sub2; mit der Formel H-Met-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr- Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-CMA-Arg-Arg-Leu-Leu-His-Glu- Ile-CML-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLO wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [pCl-Phe¹, D-NMA², CaMeTyr¹&sup0;, CMA¹&sup9;, Arg²¹, CML²&sup7;]-rGRF(1-43) -OH mit der Formel H-pCl-Phe-D-NMA Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-CaMeTyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln- Leu-Tyr-CMA-Arg-Arg-Leu-Leu-His-Asp-Ile-CML-Asn-Arg-Gln-Gln- Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem chlormethylierten Harz wie in Beispiel 3 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [NaMeTyr¹, Ala¹&sup5;, CML²³, Nle²&sup7;, Asn²&sup8;]- hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel NaMeTyr-Ala-Asp-Ale-Ile-Phr-Thr- Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu- Leu-Gln-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist. Die optische Drehung des gereinigten Peptids wird unter Verwendung eines fotoelektrischen Polarimeters gemessen und ergibt [α]D 44,0º ± 1 (c = 1, 1 % Essigsäure).
- Die Synthese von [NaMeTyr¹, CML¹³, Ala¹&sup5;, CML²&sup7;, Asn²&sup8;]- hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr- Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CML-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu- Leu-Gln-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [NaMeTyr¹, Ala¹&sup5;, CMA¹&sup9;, Nle²&sup7;, Asn²&sup8;]- hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr- Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-CMA-Arg-Lys-Leu- Leu-Gln-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peppid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist. Die optische Drehung des gereinigten Peptids wird unter Verwendung eines fotoelektrischen Polarimeters gemessen und ergibt [α]D = 45,5º ± 1 (c = 1, 1 % Essigsäure).
- Die Synthese von [NaMeTyr¹, Ala¹&sup5;, CML¹&sup7;, N1e²&sup7;, Asn²³]- hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr- Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-CML-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu- Leu-Gln-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist. Die optische Drehung des gereinigten Peptids wird unter Verwendung eines fotoelektrischen Polarimeters gemessen und ergibt [α]D = -49,0º ± 1 (c = 1, 1 % Essigsäure).
- Die Synthese von [NasMeTyr¹, Ala¹&sup5;, CML²³, Nle²&sup7;, Asn²&sup8;]- hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr- Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu- CML-Gln-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [NaMeTyr¹, CML&sup5;, Ala¹&sup5;, Nle²&sup7;, Asn²&sup8;]- hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel [NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-CML-Phe-Thr- Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu- Leu-Gln-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist. Die optische Drehung des gereinigten Peptids wird unter Verwendung eines fotoelektrischen Polarimeters gemessen und ergibt [α]D = -45,0º ± 1 (c 1, 1 % Essigsäure).
- Die Synthese von [NaMeTyr¹, CML&sup5;,¹³,¹&sup7;,²²,²&sup7;, Ala¹&sup5;, CMA¹&sup9;, Asn²&sup8;]-hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel NaMeTyr-Ala-Asp- Ala-CML-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-CML-Leu-Ala-Gln-CML-Ser- CMA-Arg-Lys-CML-Leu-Gln-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von (NaMeTyr¹, Ala¹&sup5;, CML²²,²&sup7;, Asn²&sup8;]- hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr- Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-CML- Leu-Gln-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [NaMeTyr¹, Ala¹&sup5;, CMA¹&sup9;, CMA²³, Nle²&sup7;, Asn²&sup8;]-hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile- Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-CMA-Arg- Lys-Leu-CML-Gln-Glu-Ile-Nle-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese von [NaMeTyr¹, Ala¹&sup5;, CML¹&sup7;,²²,²&sup7;, CMA¹&sup0; Asn²&sup8;]-hGRF(1-29)-NH&sub2; mit der Formel NaMeTyr-Ala-Asp-Ala-Ile- Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-CML-Ser-CMA-Arg- Lys-CML-Leu-Gln-Glu-Ile-CML-Asn-Arg-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid-Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie in Beispiel 1 schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HFLC wird festgestellte daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die Synthese eines amidierten Peptids mit 44 Resten [CaMeHis¹, D-NMA², CML²&sup7;]-hGRF(1-44)-NH&sub2; mit der Formel H-CaMeHis-D-NMA-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val- Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp- Ile-CML-Ser- Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg- Leu-NH&sub2; wird unter Verwendung eines Beckman 990 Peptid- Synthetisierers auf einem MBHA-Harz wie allgemein in der US-PS Nr. 4,292,313 - Vale et al. beschrieben, schrittweise durchgeführt. Unter Verwendung von TLC und HPLC wird festgestellt, daß das Peptid im wesentlichen rein ist.
- Die in den Beispielen beschriebenen synthetischen Peptide werden in in vitro-Versuchen mit synthetischem hpGRF(1-40)-OH verglichen und erwiesen sich im allgemeinen potenter bei der GH-Sektretion und ähnlichen intrinsischen Aktivitäten. Alle diese synthetischen Peptide werden für biologisch aktiv und potentiell nützlich zur Stimulierung der GH-Freigabe durch die Hypophyse erachtet.
- Zwecks Bestimmung der relativen Wirksamkeit bestimmter repräsentativer synthetischer Peptide bei der Förderung der Freigabe von Wachstumshormon werden in vitro-Versuche un:er Verwendung von synthetischem hpGRF(1-40)-OH als Standard im Nebeneinander-Vergleich mit äquimolaren Konzentrationen der repräsentativen Analoge, die synthetisiert worden sind, durchgeführt. Es werden Kulturen verwendet, die Zellen von Ratten-Hypophysen enthalten, welche etwa drei bis fünf Tage zuvor entnommen wurden. Solche Kulturen werden für optimal zur Sekretion von Wachstumshormon erachtet und werden für die vergleichstestreihe verwendet, wie allgemein in Vale et al. Endocrinology, 91, 562-572 (1972) und genauer in Vale et al. Endocrinology, 112, 1553-1555 (1983) beschrieben. Die Inkubation mit der Testsubstanz dauert 3 bis 4 Stunden, und es werden Aliquote vom Kulturmedium entfernt und zur Messung ihree Gehalts an immunreaktivem GH (irGH), durch einen gut charakterisierten Radioimmuntest aufbereitet.
- Die Ergebnisse dieser Vergleichstestreihe für äquimolare Konzentrationen sind in Tabelle I veranschaulicht. TABELLE I Peptid In vitro-Fotenz (Standard für diesen Test)
- Neben der in vitro-Tests für die Sekretion von Wachstumshormon werden die synthetischen Peptide bei in vivo-Versuchen mit Urethan anästhesierten männlichen Ratten intravenös injiziert, und es wird festgestellt, daß sie die GH-Sekretion spontan unterdrücken, ohne aber die Reaktion auf exogene GRF außer Kraft zu setzen. Blutproben werden unmittelbar vor und 10, 30 und 60 Minuten nach den Injektionen genommen und die GH-Gehalte im Blut werden mittels Radioimmuntest gemessen. Diese in vivo-Testreihe dieser synthetischen Peptide zeigt, daß jedes eine größere biologische Potenz hat als hpGRF(1-40)- OH und die Wirkung wesentlich länger anhält, was anhand der Blutgehalte an Hypophysen-GH bei einer Messung sowohl 30 als auch 60 min nach der i.v. Injektion nachgewiesen wird. Andere bekannte GRF-in vivo-Tests, von denen man weiß, daß sie zum Nachweis der GH-Sekretion wirksam sind, werden zur Bestätigung dieser resultate verwendet. Dosierungen zwischen etwa 500 ng und etwa 50 µg von diesen Peptiden pro kg Körpergewicht werden als wirksam bei der Herbeiführung von GH-Sekretion erachtet.
- Derartige synthetische hGRF-Analoge und eventuell rGRF- Analoge sollten für Humanapplikationen nützlich sein, bei denen ein Arzt eine Erhöhung der GH-Produktion wünscht. Die Stimulierung der GH-Sekretion mittels derartiger Analoge ist bei Patienten mit komplettem oder relativem GH-Mangel aufgrund einer Unterproduktion an endogenem GRF von Interesse. Weiters ist es wahrscheinlich, daß eine gesteigerte GH-Sekretion und die damit verbundene Steigerung des Wachstums bei Menschen oder Tieren mit normalen GH-Gehalten erzielt werden könnte. Außerdem sollte die Verabreichung den Körperfettgehalt verändern und andere GH-abhängige metabolische, immunologische und Entwicklungsprozesse modifizieren. Beispielsweise können diese Analoge nützlich als Mittel zur Stimulierung anabolischer Prozesse bei Menschen unter solchen Umständen sein, wie sie nach Verbrennungen auftreten. Als weiteres Beispiel können diese Analoge warmblütigen Nutztieren, wie Hühnern, Truthähnen, Schweinen, Ziegen, Rindern und Schafen verabreicht werden und auch in der Wassertierzucht zum Züchten von Fischen und anderen kaltblütigen Meerestieren, z.B. Meeresschildkröten und Aalen, und von Amphibien, zur Beschleunigung des Wachstums und zur Erhöhung des Protein Fett-Verhältnisses durch Fütterung wirksamer Mengen der Peptide verwendet werden.
- Zur Verabreichung an Menschen sollten diese synthetischen Peptide eine Reinheit von mindestens etwa 93 %, vorzugsweise mindestens 98 %, aufweisen. Reinheit für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung bedeutet, daß von sämtlichen vorhandenen Peptiden und Peptidfragmenten das beabsichtigte Peptid die genannten Gewichtsprozent ausmacht. Für die Verabreichung solcher synthetischer Feptide an Nutztiere und andere Tiere zur Förderung des Wachstums und Reduktion des Fettgehalts sind geringere Reinheiten akzeptabel.
- Diese synthetischen Peptide oder nicht-toxischen Salze davon können in Kombination mit einem pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch akzeptablen Träger zwecks Bildung einer pharmazeutischen Zusammensetzung Tieren und auch Menschen entweder intravenös, subkutan, intramuskulär, perkutan, z.B. intranasal oder auch oral verabreicht werden. Ein Arzt kann dort zur Stimulierung der Freigabe von GH auf die Verabreichung zurückgreifen, wo der Behandelte eine derartige therapeutische Behandlung notwendig hat. Die erforderliche Dosierung variiert je nach der behandelten speziellen Erkrankung, der Schwere der Erkrankung und der Dauer der gewünschten Behandlung.
- Solche Peptide werden oft in Form von nicht-toxischen Salzen, wie Säureadditionssalzen oder Metallkomplexen, z.B. mit Zink, Eisen od. dgl. (die für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung als Salze betrachtet werden) verabreicht. Beispiele für solche Säureadditionssalze sind das Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Maleat, Acetat, Citrat, Benzoat, Succinat, Malat, Ascorbat, Tartrat und dgl. Ist das aktive Ingrediens oral in Tablettenform zu verabreichen, so kann die Tablette ein Bindemittel, wie Tragakanth, Maisstärke oder Gelatine; ein zerfallsförderndes Mittel, wie Algininsäure; und ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, enthalten. Ist ein Verabreichung in flüssiger Form erwünscht, so können Süß- und/oder Geschmackstoffe verwendet werden, und die intravenöse Verabreichung kann in isotonischer Kochsalziösung, Phosphatpufferläsungen od. dgl. erfolgen.
- Die Feptide sollten Menschen unter Anleitung eines Arztes verabreicht werden, und die pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten üblicherweise das Peptid in Verbindung mit einem herkömmlichen festen oder flüssigen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Üblicherweise beträgt die parenterale Dosis etwa 0,01 bis etwa 1 µg Peptid pro kg Körpergewicht des Patienten.
- Es kann auch wünschenswert sein, ein solches Peptid über einen längeren Zeitraum, beispielsweise einen Zeitraum von einer Woche bis zu einem Jahr, mit einer einzigen Verabreichung zuzuführen, und hiefür kännen Dosisformen für langsame Freisetzung, Depot oder Implantation verwendet werden. Beispielsweise kann eine Dosisform ein pharmazeutisch akzeptables nicht-toxisches Salz der Verbindung ntit einer geringen Löslichkeit in Körperfluiden enthalten, beispielsweise ein Säureadditionssalz mit der mehrbasischen Säure, ein Salz mit einem polyvalenten Metallkation oder eine Kombination der beiden Salze. Ein relativ unlösliches Salz kann auch in einem Gel, beispielsweise einem Aluminiumstearat-Gel, formuliert werden. Eine geeignete Depotformulierung mit langsamer Freigabe für Injektion kann das Peptid oder ein Salz davon auch in einem langsam abbauenden, nicht-toxischen oder nicht-antigenen Polymer, wie einem Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Polymer, z.B. wie in der US-PS Nr. 3,773,919 beschrieben, dispergiert oder eingekapselt enthalten. Diese Verbindungen können auch in Silastik-Implantate eingearbeitet werden.
- Es ist auch möglich, die Peptide Menschen perkutan über einen längeren Zeitraum unter Verwendung von elektrischem Strom, wie in Meyer, B.R. et al., Clin. Pharm. & Therapeutics, 44, 6, 607-612 (1988) berichtet, zu verabreichen. So können beispielsweise Perkutanbinden mit einer 9-Volt-Batterie verwendet werden, um kontinuierlich einen Strom von etwa 0,2 mA auf die menschliche Haut anzulegen, wodurch die Peptide über die Epidermis wirkungsvoll in den Blutstrom geleitet werden.
Claims (13)
1. Synthetisches Peptid mit einer der folgenden Formeln:
[NaMeTyr¹, Ala¹&sup5;, CML²³, Nle²&sup7;, Asn²&sup8;]-hGRF(1-29)-NH&sub2;
[NaMeTyr¹, Ala¹&sup5;, CML¹&sup7;, Nle²&sup7;, Asn²&sup8;]-hGRF(1-29)-NH&sub2;
[NaMeTyr¹, Ala¹&sup5;, CML²&sup6;, Nle²&sup7;, Asn²&sup8;]-hGRF(1-29)-NH&sub2;
[NaMeTyr¹, Ala¹&sup5;, CML²&sup7;, Nle²&sup7;, Asn²&sup8;]-hGRF(1-29)-NH&sub2;
2. Synthetisches Peptide mit der Sequenz:
(B)R&sub1;-R&sub2;-R&sub3;-Ala-(Q&sub1;)R&sub5;-Phe-Thr-Ra-Ser-(Q&sub2;)R&sub1;&sub0;-Arg-R&sub1;&sub2;-(Q&sub3;)R&sub1;&sub3;-
Leu-R&sub1;&sub5;-Gln-(Q&sub4;)Leu-R&sub1;&sub8;-(Q&sub5;)Ala-Arg-R&sub2;&sub1;-(Q&sub6;)R&sub2;&sub2;-(Q&sub7;)Leu-R&sub2;&sub4;-
R&sub2;&sub5;-(Q&sub8;)R&sub2;&sub6;-(Q&sub8;)R&sub2;&sub7;-R&sub2;&sub8;-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R&sub3;&sub4;-Asn-Gln-Glu-
R&sub3;&sub8;-R&sub3;&sub9;-R&sub4;&sub0;-Arg-R&sub4;&sub2;-R&sub4;&sub3;-R&sub4;&sub4;, worin R&sub1; Tyr, D-Tyr, Met, Phe, D-
Phe, pCl-Phe, Leu, His oder D-His ist; B H, CaNe, NaMe,
Desamino, Ac oder For ist; R&sub2; Ala, D-Ala, NMA oder D-NMA ist;
R&sub3; Asp oder D-Asp ist; R&sub5; Ile oder Leu ist; R&sub8; Ser, Asn, Lys,
Arg, Asp oder Glu ist; R&sub1;&sub0; Tyr, D-Tyr oder Phe ist; R&sub1;&sub2; Arg
oder Lys ist; R&sub1;&sub3; Ile, Val, Leu oder Ala ist; R&sub1;&sub5; Gly oder Ala
ist; R&sub1;&sub8; Ser oder Tyr ist; R&sub2;&sub1; Lys, D-Lys, Arg oder D-Arg ist;
R&sub2;&sub2; Leu, Ile, Ala oder Val ist; R&sub2;&sub4; Gln oder His ist; R&sub2;&sub5; Asp
oder Glu ist; R&sub2;&sub6; Ile oder Leu ist; R&sub2;&sub7; Met, D-Met, Ala, Nle,
11e&sub1; Leu, Nva oder Val ist; R&sub2;&sub8; Asn oder Ser ist; R&sub3;&sub4; Ser oder
Arg ist; R&sub3;&sub8; Arg oder Gln ist; R&sub3;&sub9; Gly oder Arg ist; R&sub4;&sub0; Ala
oder Ser ist; R&sub4;&sub2; Phe, Ala oder Val ist; R&sub4;&sub3; Asn oder Arg ist;
R&sub4;&sub4; eine natürliche Aminosäure ist; Q&sub1;-Q&sub9; entweder für H oder
für CaMe stehen, mit der Maßgabe, daß einer oder alle der
Reste zwischen R&sub3;&sub0; und R&sub4;&sub4; inklusive in einer Sequenz,
beginnend am C-Terminus, deletiert werden können, und weiters
mit der Maßgabe, daß zumindest eines von Q&sub1;, Q&sub4;, Q&sub7;, Q&sub8; und
Q&sub9; CaMe ist.
3. Peptide nach Anspruch 2, worin R&sub2;&sub7; Nle ist und die Reste
30 bis 44 deletiert sind.
4. Peptide nach Anspruch 2 oder 3, worin R&sub1;&sub5; Ala und R&sub2;&sub8; Asn
ist.
5. Peptid nach einem der Ansprüche 2 bis 4, worin Q&sub1; CaMe
ist.
6. Peptid nach einem der Ansprüche 2 bis 5, worin Q&sub4; CaMe
ist.
7. Peptid nach einem der Ansprüche 2 bis 6, worin Q&sub7; CaMe
ist.
8. Peptid nach einem der Ansprüche 2 bis 7, worin Q&sub8; CaMe
ist.
9. Peptid nach einem der Ansprüche 2 bis 8, worin Q&sub9; CaMe
ist.
10. Synthetisches Peptid mit der Formel:
(B)R&sub1;-R&sub2;-Asp-Ala-(Q&sub1;)Ile-Phe-Thr-R&sub8;-Ser-(Q&sub2;)R&sub1;&sub0;-Arg-R&sub1;&sub2;-
(Q&sub3;)R&sub1;&sub3;-Leu-R&sub1;&sub5;-Gln-(Q&sub4;)Leu-R&sub1;&sub8;-(Q&sub5;)Ala-Arg-R&sub2;&sub1;-(Q&sub6;)R&sub2;&sub2;-
(Q&sub7;)Leu-R&sub2;&sub4;-R&sub2;&sub5;(Q&sub8;)R&sub2;&sub6;-(Q&sub9;)R&sub2;&sub7;-R&sub2;&sub8;-Arg-Gln-Gln-Gly-Y,
worin R&sub1; Tyr, D-Tyr, Phe, D-Phe, His oder D-His ist;
B H, CaMe oder NaMe ist; 82 Ala, D-Ala, NMA oder D-NMA ist; R&sub8;
Ser, Asn, Lys, Arg, Asp oder Glu ist; R&sub1;&sub0; Tyr, D-Tyr oder Phe
ist; R&sub1;&sub2; Arg oder Lys ist; R&sub1;&sub3; Ile, Val, Leu oder Ala ist; R&sub1;&sub5;
Gly oder Ala ist; R&sub1;&sub8; Ser oder Tyr ist; R&sub2;&sub1; Lys, D-Lys, Arg
oder D-Arg ist; R&sub2;&sub2; Leu, Ile, Ala oder Val ist; R&sub2;&sub4; Gln oder
His ist; R&sub2;&sub5; Asp oder Glu ist; R&sub2;&sub6; Ile oder Leu ist; R&sub2;&sub7; Met,
Ala, Nle, Ile, Leu, Nva oder Val ist; R&sub2;&sub8; Asn oder Ser ist; Y
NHR ist, wobei R für H oder C&sub1;-C&sub3;-Alkyl steht; Q&sub1; bis Q&sub9;
entweder für H oder für CaMe stehen, mit der Maßgabe, daß
Gly, Gln-Gly oder Gln-Gln-Gly am C-Terminus deietiert werden
kann, und weiters mit der Maßgabe, daß mindestens eines von
Q&sub1;, Q&sub4;, Q&sub7;, Q&sub8; und Q&sub9; CaMe ist.
11. Nicht-toxisches Salz eines Peptids nach einem der
vorhergehenden Ansprüche.
12. Verfahren zur Verbesserung der Viehhaltung in der
Landwirtschaft, welches Verfahren die Verabreichung eines GRF-
Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder eines Salzes
nach Anspruch 11 an ein warmblütiges Nutztier in einer
ausreichenden Dosis zur Bewirkung einer GH-Sekretion und damit
eschleunigung des Wachstums und Erhöhung des Protein-Fett-
Verhältnisses umfaßt.
13. Verfahren zur Verbesserung der Wassertierzucht, welches
Verfahren die Verabreichung eines GRF-Peptids nach einem der
Ansprüche 1 bis 10 oder eines Salzes nach Anspruch 11 an ein
kaltblütiges Wassertier für Futterzwecke in einer
ausreichenden Dosis zur Bewirkung einer GH-Sekretion und damit
Beschleunigung des Wachstums und Erhöhung des Protein-Fett-
Verhältnisses umfaßt.
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