JPH04229181A - Dna、細胞、n−メチルヒダントイナーゼ活性を有する蛋白質の取得法 - Google Patents
Dna、細胞、n−メチルヒダントイナーゼ活性を有する蛋白質の取得法Info
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- JPH04229181A JPH04229181A JP3165308A JP16530891A JPH04229181A JP H04229181 A JPH04229181 A JP H04229181A JP 3165308 A JP3165308 A JP 3165308A JP 16530891 A JP16530891 A JP 16530891A JP H04229181 A JPH04229181 A JP H04229181A
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、SEQ ID N
O:1で表わされる核酸配列を有するDNA、これで形
質変換された細胞、N−メチルヒダントイナーゼ活性を
有する蛋白質の取得法及び液体中のクレアチニン含分を
測定するための試薬に関する。
O:1で表わされる核酸配列を有するDNA、これで形
質変換された細胞、N−メチルヒダントイナーゼ活性を
有する蛋白質の取得法及び液体中のクレアチニン含分を
測定するための試薬に関する。
【0002】
【従来の技術】酵素N−メチルヒダントイナーゼ(NM
Hアーゼ)は、液体中のクレアチニン含分の測定のため
に必要である。クレアチニン濃度は、腎臓診断のための
重要なパラメータである。世界的に、毎年、約10億の
テストが実施されている。従って、酵素NMHアーゼの
価格的に好都合な提供並びに問題のない醗酵の可能性は
、クレアチニン測定用の診断キットの提供のための基本
的前提である。このNMHアーゼの分子量はSDS−ゲ
ル中で125kDである。その特異活性は2U/mgで
あり、N−メチルヒダントインに関するKмは2×10
−5モル/lである。通常、このNMHアーゼはアルト
ロバクター(Arthrobacter)から単離され
る。しかしながら、この方法は、使用微生物に基づき欠
点を有する。
Hアーゼ)は、液体中のクレアチニン含分の測定のため
に必要である。クレアチニン濃度は、腎臓診断のための
重要なパラメータである。世界的に、毎年、約10億の
テストが実施されている。従って、酵素NMHアーゼの
価格的に好都合な提供並びに問題のない醗酵の可能性は
、クレアチニン測定用の診断キットの提供のための基本
的前提である。このNMHアーゼの分子量はSDS−ゲ
ル中で125kDである。その特異活性は2U/mgで
あり、N−メチルヒダントインに関するKмは2×10
−5モル/lである。通常、このNMHアーゼはアルト
ロバクター(Arthrobacter)から単離され
る。しかしながら、この方法は、使用微生物に基づき欠
点を有する。
【0003】
【発明の解決しようとする課題】従って、多量のNMH
アーゼの提供のためには、改良された濃縮法を開発すべ
きである。このことは本発明の課題でもある。
アーゼの提供のためには、改良された濃縮法を開発すべ
きである。このことは本発明の課題でもある。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明のこの課題は、N
MHアーゼに関してコードするアルトロバクターからの
遺伝子のクローニング及び適当な宿主生物中でのその表
現により解決することができた。
MHアーゼに関してコードするアルトロバクターからの
遺伝子のクローニング及び適当な宿主生物中でのその表
現により解決することができた。
【0005】従って、本発明の目的物は、(1)SEQ
ID NO:1
ID NO:1
【0006】
【化3】
【0007】
【化4】
【0008】で表わされる核酸配列、(2)遺伝子コー
ドの変性の範囲内でそれに相応する配列又は(3)(1
)又は/及び(2)からの配列を用いて厳しいハイブリ
ド形成条件下でハイブリド形成する配列を有し、NMH
アーゼ活性を有する蛋白質に関してコードするDNAで
ある。
ドの変性の範囲内でそれに相応する配列又は(3)(1
)又は/及び(2)からの配列を用いて厳しいハイブリ
ド形成条件下でハイブリド形成する配列を有し、NMH
アーゼ活性を有する蛋白質に関してコードするDNAで
ある。
【0009】本発明の意味における厳しい条件下でのハ
イブリド形成は、マニアチス(Maniatis)等に
よるモレキュラール・クローニング.ア・ラボラトリィ
・マニュアル(Molecular Cloning
.A laboratorymanual,Cold
Spring Harbor Laborat
ory,New York(1982))に記載され
ている。
イブリド形成は、マニアチス(Maniatis)等に
よるモレキュラール・クローニング.ア・ラボラトリィ
・マニュアル(Molecular Cloning
.A laboratorymanual,Cold
Spring Harbor Laborat
ory,New York(1982))に記載され
ている。
【0010】本発明によるDNAは、SEQ ID
NO:2
NO:2
【0011】
【化5】
【0012】
【化6】
【0013】
【化7】
【0014】
【化8】
【0015】で表わされる配列を有するアミノ酸128
8個を有する蛋白質に関してコードする。
8個を有する蛋白質に関してコードする。
【0016】従って、本発明は、NMHアーゼ活性及び
SEQ ID NO:2で表わされるか又はそれか
ら誘導されたアミノ酸配列を有し、遺伝子工学的方法で
、例えば異種生物中、即ち、本発明による蛋白質に関し
てコードする遺伝子が本来は現われない生物中での表現
により得られる蛋白質をも包含する。他方、本発明によ
るDNAの1個以上のコピーを、本発明のDNAをその
中に有する生物中に導入することにより、NMHアーゼ
遺伝子の改良された表現を達成することも可能である。
SEQ ID NO:2で表わされるか又はそれか
ら誘導されたアミノ酸配列を有し、遺伝子工学的方法で
、例えば異種生物中、即ち、本発明による蛋白質に関し
てコードする遺伝子が本来は現われない生物中での表現
により得られる蛋白質をも包含する。他方、本発明によ
るDNAの1個以上のコピーを、本発明のDNAをその
中に有する生物中に導入することにより、NMHアーゼ
遺伝子の改良された表現を達成することも可能である。
【0017】もう1つの本発明の目的物は、本発明によ
るDNAの1個以上のコピーを有する組換えベクターで
ある。本発明による組換えベクターは、原核生物又は真
核生物中での蛋白質表現のために好適であるベクターで
あってよい。これは原核生物ベクターであるのが有利で
ある本発明による組換えベクターは、宿主細胞中で染色
体外に存在するベクター(例えばプラスミド)であるか
又は宿主のゲノム中に組込まれていて(例えばバクテリ
オファージラムダ)よい。
るDNAの1個以上のコピーを有する組換えベクターで
ある。本発明による組換えベクターは、原核生物又は真
核生物中での蛋白質表現のために好適であるベクターで
あってよい。これは原核生物ベクターであるのが有利で
ある本発明による組換えベクターは、宿主細胞中で染色
体外に存在するベクター(例えばプラスミド)であるか
又は宿主のゲノム中に組込まれていて(例えばバクテリ
オファージラムダ)よい。
【0018】本発明による組換えベクターはプラスミド
であるのが有利である。好適な本発明によるプラスミド
は、例えばプラスミドpBP010である。
であるのが有利である。好適な本発明によるプラスミド
は、例えばプラスミドpBP010である。
【0019】本発明による組換えベクター上には、NM
Hアーゼ活性を有する蛋白質に関してコードするDNA
が、有利に、調節可能なプロモータの制御下に、即ち、
本発明によるDNAの表現は、例えばレプレッサーによ
り抑制され得、かつ調節可能なプロモータの所望誘導の
際にのみ起こるような制御下に、存在する。この誘導は
、例えば温度変化又は、化学的誘導物質(例えばlac
−プロモータ−誘導体の場合は、IPTC)の添加によ
り行なうことができる。本発明の特に有利な実施形にお
ける、その制御下に、NMHアーゼ遺伝子を生じる調節
可能なプロモータは、糖例えばグルコース及びフラクト
ースによる異化代謝中間体抑制を介して調節可能なサル
モネラ・チフィムリウム(Salmonella t
yphimurium)からのmgl−プロモータであ
る(WO88/09373)。
Hアーゼ活性を有する蛋白質に関してコードするDNA
が、有利に、調節可能なプロモータの制御下に、即ち、
本発明によるDNAの表現は、例えばレプレッサーによ
り抑制され得、かつ調節可能なプロモータの所望誘導の
際にのみ起こるような制御下に、存在する。この誘導は
、例えば温度変化又は、化学的誘導物質(例えばlac
−プロモータ−誘導体の場合は、IPTC)の添加によ
り行なうことができる。本発明の特に有利な実施形にお
ける、その制御下に、NMHアーゼ遺伝子を生じる調節
可能なプロモータは、糖例えばグルコース及びフラクト
ースによる異化代謝中間体抑制を介して調節可能なサル
モネラ・チフィムリウム(Salmonella t
yphimurium)からのmgl−プロモータであ
る(WO88/09373)。
【0020】グラム陰性菌殊にE.コリー中でのNMH
アーゼの表現のために好適な本発明によるベクターは、
例えばプラスミドpBP006である。pBP006の
製造のために、サルモネラ・チフィムリウムからのmg
l−プロモータの配列を有するDNA−フラグメントを
、プラスミドpPZ07−mgl−lac(WO88/
09373 図8に記載)から単離し、その特有のプ
ロモータなしでアルトロバクターからのNMHアーゼ−
遺伝子のコード配列を含有するDNA−フラグメントの
前でクローニングした。
アーゼの表現のために好適な本発明によるベクターは、
例えばプラスミドpBP006である。pBP006の
製造のために、サルモネラ・チフィムリウムからのmg
l−プロモータの配列を有するDNA−フラグメントを
、プラスミドpPZ07−mgl−lac(WO88/
09373 図8に記載)から単離し、その特有のプ
ロモータなしでアルトロバクターからのNMHアーゼ−
遺伝子のコード配列を含有するDNA−フラグメントの
前でクローニングした。
【0021】更に、本発明の目的物は、本発明によるD
NAで又は本発明による組換えベクターで形質変換され
ている細胞である。この細胞は、細菌細胞特にE.コリ
ー細胞が有利である。
NAで又は本発明による組換えベクターで形質変換され
ている細胞である。この細胞は、細菌細胞特にE.コリ
ー細胞が有利である。
【0022】NMHアーゼ−遺伝子のクローニングによ
り本発明によるDNAを得た。このために、アルトロバ
クターの染色体DNAを慣用の方法で単離し、適当な制
限酵素を用いて切断した。このDNA−フラグメントか
ら、遺伝子バンクをE.コリー中に付加させた。しかし
ながら、慣用法でのNMHアーゼ遺伝子のクローニング
(オリゴヌクレオチド−プローブを用いる遺伝子バンク
の検査及びNMHアーゼ活性を介してのクローンの選択
)は成功しなかった。即ち、E.コリー中でのクローニ
ングの際に、使用アルトロバクターDNA−フラグメン
トにおいてNMHアーゼ活性は測定できなかった。オリ
ゴヌクレオチド−プローブを用いるハイブリド形成に基
づき、スタートコドン及びストップコドンを有する適切
な長さのDNA−フラグメントが同定できたので、この
発見は意想外のことであった。NMHアーゼ活性は、本
来のNMHアーゼ−プロモータを失なったDNA−フラ
グメントのクローニングの際にはじめて検出できた。
り本発明によるDNAを得た。このために、アルトロバ
クターの染色体DNAを慣用の方法で単離し、適当な制
限酵素を用いて切断した。このDNA−フラグメントか
ら、遺伝子バンクをE.コリー中に付加させた。しかし
ながら、慣用法でのNMHアーゼ遺伝子のクローニング
(オリゴヌクレオチド−プローブを用いる遺伝子バンク
の検査及びNMHアーゼ活性を介してのクローンの選択
)は成功しなかった。即ち、E.コリー中でのクローニ
ングの際に、使用アルトロバクターDNA−フラグメン
トにおいてNMHアーゼ活性は測定できなかった。オリ
ゴヌクレオチド−プローブを用いるハイブリド形成に基
づき、スタートコドン及びストップコドンを有する適切
な長さのDNA−フラグメントが同定できたので、この
発見は意想外のことであった。NMHアーゼ活性は、本
来のNMHアーゼ−プロモータを失なったDNA−フラ
グメントのクローニングの際にはじめて検出できた。
【0023】更に、本発明の目的は、1細胞を本発明に
よるDNA又は本発明による組換えベクターを用いて形
質変換し、この形質変換された細胞を適当な培地中で培
養し、この培地又は細胞からの蛋白質を濃縮させること
よりなる、NMHアーゼ活性を有する蛋白質の取得法で
もある。
よるDNA又は本発明による組換えベクターを用いて形
質変換し、この形質変換された細胞を適当な培地中で培
養し、この培地又は細胞からの蛋白質を濃縮させること
よりなる、NMHアーゼ活性を有する蛋白質の取得法で
もある。
【0024】本発明による方法のための宿主生物として
、E.コリー菌を使用するのが有利である。しかしなが
ら、この場合に、形質変換された細胞の培養を、亜適(
suboptimalen)生長条件で行なうのが好適
である。亜適生長条件とは、インキュベーション時の温
度がいくらか低く(30℃又はそれ以下)、酸素導入を
減少しかつ/又は最小培地(即ち培養生物にとって重要
な一定の栄養物が限られた濃度で含有する培地)を使用
することである。
、E.コリー菌を使用するのが有利である。しかしなが
ら、この場合に、形質変換された細胞の培養を、亜適(
suboptimalen)生長条件で行なうのが好適
である。亜適生長条件とは、インキュベーション時の温
度がいくらか低く(30℃又はそれ以下)、酸素導入を
減少しかつ/又は最小培地(即ち培養生物にとって重要
な一定の栄養物が限られた濃度で含有する培地)を使用
することである。
【0025】従って、例えばtac−プロモータの制御
下にNMHアーゼ−遺伝子を含有する組換ベクターを使
用する方法でE.コリーからNMHアーゼを取得する方
法における培養条件は、最小培地、インキュベーション
温度≦30℃及び乳糖0.8%でのtac−プロモータ
の不完全誘導である。
下にNMHアーゼ−遺伝子を含有する組換ベクターを使
用する方法でE.コリーからNMHアーゼを取得する方
法における培養条件は、最小培地、インキュベーション
温度≦30℃及び乳糖0.8%でのtac−プロモータ
の不完全誘導である。
【0026】サルモネラ・チフィムリウムのmgl−プ
ロモータの制御下におけるNMHアーゼ遺伝子の特に有
利な表現は、同様に有利に30℃以下のインキュベーシ
ョン温度で、場合により付加的な酸素導入の減少と結び
ついて起こり、従って生じたNMHアーゼは不活性形で
沈殿体としては生じない。このmgl−プロモータは異
化代謝産物−抑制により調節される(欧州特許EP−A
第0316378号)。
ロモータの制御下におけるNMHアーゼ遺伝子の特に有
利な表現は、同様に有利に30℃以下のインキュベーシ
ョン温度で、場合により付加的な酸素導入の減少と結び
ついて起こり、従って生じたNMHアーゼは不活性形で
沈殿体としては生じない。このmgl−プロモータは異
化代謝産物−抑制により調節される(欧州特許EP−A
第0316378号)。
【0027】一般に、本発明の方法にとって、各々使用
された調節可能なプロモータの誘導は、不完全にのみ実
施されることが有利であり、これは、同様に沈殿体の僅
かな形成に寄与する。
された調節可能なプロモータの誘導は、不完全にのみ実
施されることが有利であり、これは、同様に沈殿体の僅
かな形成に寄与する。
【0028】更に、本発明の方法にとって、安定化のた
めに、有利に、形質変換された細胞又は培地からのNM
Hアーゼの濃縮の間に、蛋白質を酵素基質N−メチルヒ
ダントインと共にインキュベートすることが特に有利で
ある。意外にも、本発明の方法で得られた組換えNMH
アーゼの安定性は、酵素1単位(U)当りN−メチルヒ
ダントイン約3.8nモルの量の存在の際に著るしく高
めることができる。このために、酵素を、有利に1〜1
00mモル/l、特に有利に10〜70mモル/l、最
も有利に50mモル/lの濃度のN−メチルヒダントイ
ン溶液と共にインキュベートする。このインキュベーシ
ョン工程では、温度を例えば55℃まで高めるのが好適
である。意外にも、殊に、特有の基質の存在は、酵素を
安定化させるが同時に組換え酵素の酵素反応に障害性の
影響を及ぼさない。
めに、有利に、形質変換された細胞又は培地からのNM
Hアーゼの濃縮の間に、蛋白質を酵素基質N−メチルヒ
ダントインと共にインキュベートすることが特に有利で
ある。意外にも、本発明の方法で得られた組換えNMH
アーゼの安定性は、酵素1単位(U)当りN−メチルヒ
ダントイン約3.8nモルの量の存在の際に著るしく高
めることができる。このために、酵素を、有利に1〜1
00mモル/l、特に有利に10〜70mモル/l、最
も有利に50mモル/lの濃度のN−メチルヒダントイ
ン溶液と共にインキュベートする。このインキュベーシ
ョン工程では、温度を例えば55℃まで高めるのが好適
である。意外にも、殊に、特有の基質の存在は、酵素を
安定化させるが同時に組換え酵素の酵素反応に障害性の
影響を及ぼさない。
【0029】更に、本発明は、液体中のクレアチニン含
分を測定するための試薬に関し、これは本発明の方法で
得られた蛋白質を慣用の成分と共に含有する。
分を測定するための試薬に関し、これは本発明の方法で
得られた蛋白質を慣用の成分と共に含有する。
【0030】
【実施例】次の例で、配列表及び図1〜10と関連させ
て、本発明を更に詳述する。前記のSEQ ID
NO:1はNMHアーゼ遺伝子のDNA配列であり、S
EQID NO:2はこれから誘導されたNMHアー
ゼのアミノ酸配列である。
て、本発明を更に詳述する。前記のSEQ ID
NO:1はNMHアーゼ遺伝子のDNA配列であり、S
EQID NO:2はこれから誘導されたNMHアー
ゼのアミノ酸配列である。
【0031】図1は、NMHアーゼ−遺伝子の約0.6
kbの大きさのフラグメントを有するアルトロバクター
からの6kbの大きさのEcoRI−フラグメントを示
している。
kbの大きさのフラグメントを有するアルトロバクター
からの6kbの大きさのEcoRI−フラグメントを示
している。
【0032】図2は、NMHアーゼ−遺伝子に関してコ
ードする3.0kbの大きさの領域を有する、アルトロ
バクターからの3.7kbの大きさのSalI−フラグ
メントを示している。
ードする3.0kbの大きさの領域を有する、アルトロ
バクターからの3.7kbの大きさのSalI−フラグ
メントを示している。
【0033】図3は、NMHアーゼ−遺伝子の3′−末
端領域を示している。
端領域を示している。
【0034】図4は、EcoRI/AatII−リンカ
ーを示している。
ーを示している。
【0035】図5は、プラスミドpBP008の製造過
程を示している。
程を示している。
【0036】図6は、プラスミドpBP009の製造過
程を示している。
程を示している。
【0037】図7は、NMHアーゼ−表現プラスミドp
BP010の製造過程を示している。図8は、サルモネ
ラ・チフィムリウムからのmgl−プロモータを有する
プラスミドpBP011の製造過程を示している。
BP010の製造過程を示している。図8は、サルモネ
ラ・チフィムリウムからのmgl−プロモータを有する
プラスミドpBP011の製造過程を示している。
【0038】図9は、pBP010からのNMHアーゼ
−遺伝子のフラグメントの製造過程を示している。
−遺伝子のフラグメントの製造過程を示している。
【0039】図10は、NMHアーゼ−表現−プラスミ
ドpBP006の製造過程を示している。
ドpBP006の製造過程を示している。
【0040】例1
NMHアーゼのクローニング
アルトロバクターSpc.(DSM 2563)から
、慣用法でDNAを単離し(J.Marmer−A
Process for the isolat
ion of deoxyribonucleic
acid from micro−organ
isms,J.Mol.Biol. 3, 208
〜218(1961);S.Visuvanathan
等のSimple enzymicmethod
for isolation of DNA
from diverse bacteria,J
ounal of Microbiologica
l Methods 10, 59〜64(19
89))、制限酵素EcoRI又はHindIIIで切
断した。アルトロバクターDNA用のクローニングベク
ターとして、バクテリオファージλgt10(Boeh
ringer Mannheim)を用いた。このア
ルトロバクターDNAを製造者の指示に依りλgt10
中でクローニングした。
、慣用法でDNAを単離し(J.Marmer−A
Process for the isolat
ion of deoxyribonucleic
acid from micro−organ
isms,J.Mol.Biol. 3, 208
〜218(1961);S.Visuvanathan
等のSimple enzymicmethod
for isolation of DNA
from diverse bacteria,J
ounal of Microbiologica
l Methods 10, 59〜64(19
89))、制限酵素EcoRI又はHindIIIで切
断した。アルトロバクターDNA用のクローニングベク
ターとして、バクテリオファージλgt10(Boeh
ringer Mannheim)を用いた。このア
ルトロバクターDNAを製造者の指示に依りλgt10
中でクローニングした。
【0041】得られたアルトロバクター遺伝子バンクを
、NMHアーゼの部分ペプチド配列から誘導されたオリ
ゴヌクレオチド−プローブで検査した。NMHアーゼの
部分ペプチド配列:Met Lys Arg I
le Gly Val Asp Val G
lyGly Thr Phe Thr Asp
Leu Tyr Phe.この部分ペプチド−
配列から次のオリゴヌクレオチド−プローブを誘導した
: 1. ATG AA(G/A) (C/A)
G(G/A) AT(A/C/T) GG(G/A
/T/C) GT 2. ATG AA(G/A) (C/A)
G(T/C) AT(A/C/T) GG(G/A
/T/C) GT 3. ATG AAG CGC ATC G
GC GTG GAC GTGGGC GGC
ACG TTC ACC GAT CTG
TACTTこのオリゴヌクレオチド−プローブを用
いて、λgt10−遺伝子バンク内に、NMHアーゼ−
遺伝子の1部分(約0.6kb)を有する6kbの大き
さのEcoRI−フラグメントが認められた。
、NMHアーゼの部分ペプチド配列から誘導されたオリ
ゴヌクレオチド−プローブで検査した。NMHアーゼの
部分ペプチド配列:Met Lys Arg I
le Gly Val Asp Val G
lyGly Thr Phe Thr Asp
Leu Tyr Phe.この部分ペプチド−
配列から次のオリゴヌクレオチド−プローブを誘導した
: 1. ATG AA(G/A) (C/A)
G(G/A) AT(A/C/T) GG(G/A
/T/C) GT 2. ATG AA(G/A) (C/A)
G(T/C) AT(A/C/T) GG(G/A
/T/C) GT 3. ATG AAG CGC ATC G
GC GTG GAC GTGGGC GGC
ACG TTC ACC GAT CTG
TACTTこのオリゴヌクレオチド−プローブを用
いて、λgt10−遺伝子バンク内に、NMHアーゼ−
遺伝子の1部分(約0.6kb)を有する6kbの大き
さのEcoRI−フラグメントが認められた。
【0042】このフラグメントの1部分(PstIとE
coRI−切断部位の間の約300bp)を32Pで放
射能標識付けをした。引続き、アルトロバクターDNA
を制限酵素SalIを用いて切断し、アガロースゲル上
で分離し、サザンブロットで、放射能標識されたDNA
−フラグメントとハイブリド形成させた。このハイブリ
ド形成されたDNA−領域をアガロースゲルから切り出
し、pBR328のテトラサイクリン耐性遺伝子(Bo
ehringer Mannheim GmbH)
のSalI−制限切断部位内にクローニングさせた。
coRI−切断部位の間の約300bp)を32Pで放
射能標識付けをした。引続き、アルトロバクターDNA
を制限酵素SalIを用いて切断し、アガロースゲル上
で分離し、サザンブロットで、放射能標識されたDNA
−フラグメントとハイブリド形成させた。このハイブリ
ド形成されたDNA−領域をアガロースゲルから切り出
し、pBR328のテトラサイクリン耐性遺伝子(Bo
ehringer Mannheim GmbH)
のSalI−制限切断部位内にクローニングさせた。
【0043】このプラスミドで形質変換されたE.コリ
ー細胞の検査は、長さ3.7kbのDNA−フラグメン
ト(これはNMHアーゼ遺伝子の3.0kbの大きさの
領域を有する)を示した(図2)。
ー細胞の検査は、長さ3.7kbのDNA−フラグメン
ト(これはNMHアーゼ遺伝子の3.0kbの大きさの
領域を有する)を示した(図2)。
【0044】この挿入部の点線で示されているEcoR
I/HindIII−フラグメントを、ジゴキシゲニン
で標識付けた(Boehringer Mannhe
im,Dig Kit)。このプローブを用いて、再
び前記のλgt10−遺伝子バンクを検査し、この際、
NMHアーゼ−遺伝子の3′−末端領域を有する2.7
kbの大きさの片が認められた(図3)。このDNA−
フラグメントもベクターpBR328内にクローニング
させた。
I/HindIII−フラグメントを、ジゴキシゲニン
で標識付けた(Boehringer Mannhe
im,Dig Kit)。このプローブを用いて、再
び前記のλgt10−遺伝子バンクを検査し、この際、
NMHアーゼ−遺伝子の3′−末端領域を有する2.7
kbの大きさの片が認められた(図3)。このDNA−
フラグメントもベクターpBR328内にクローニング
させた。
【0045】例2
NMHアーゼの表現
2.1 慣用法
3.7kbの大きさのSalI−フラグメント(図2)
を市場で入手されるベクターpUC19(Boehri
nger Mannheim GmbH)中にクロ
ーニングさせた。引続きこのNMHアーゼ遺伝子を、図
3からのEcoRI−フラグメントのクローニング導入
により完結させた。しかしながら、このような構成は活
性NMHアーゼの表現をもたらさなかった。
を市場で入手されるベクターpUC19(Boehri
nger Mannheim GmbH)中にクロ
ーニングさせた。引続きこのNMHアーゼ遺伝子を、図
3からのEcoRI−フラグメントのクローニング導入
により完結させた。しかしながら、このような構成は活
性NMHアーゼの表現をもたらさなかった。
【0046】誘導可能なtac−プロモータの制御下に
おけるクローニング及び常法でのtac−プロモータの
誘導(37℃でのインキュベーション、完全培地及びt
ac−プロモータの完全誘導)によるこの構成の表現を
達成する試みも失敗した。このために、プラスミドpK
K177−3(DSM 3062)を、EcoRI及
びHindIIIで切断し、EcoRI及びHindI
IIを介してpUC19から切断取り出されたポリリン
カーと連結させた。生じたプラスミドをpBP177−
4と称した。引続きこのプラスミドpBP177−4を
EcoRI及びKpnIで切断し、2.5kbの大きさ
のC−末端NMHアーゼフラグメント(同様にEcoR
I及びKpnIで切断)と合体させてプラスミドpBP
008とした(図5)。
おけるクローニング及び常法でのtac−プロモータの
誘導(37℃でのインキュベーション、完全培地及びt
ac−プロモータの完全誘導)によるこの構成の表現を
達成する試みも失敗した。このために、プラスミドpK
K177−3(DSM 3062)を、EcoRI及
びHindIIIで切断し、EcoRI及びHindI
IIを介してpUC19から切断取り出されたポリリン
カーと連結させた。生じたプラスミドをpBP177−
4と称した。引続きこのプラスミドpBP177−4を
EcoRI及びKpnIで切断し、2.5kbの大きさ
のC−末端NMHアーゼフラグメント(同様にEcoR
I及びKpnIで切断)と合体させてプラスミドpBP
008とした(図5)。
【0047】このプラスミドpBP008をXhoI及
びEcoRIで切断し、生じる大きい(5kb)フラグ
メントをNMHアーゼ−N−末端からの1.5kbフラ
グメント(これは末端切断部位AatII及びXhoI
を有する)及びEcoRI−AatIII−リンカー(
図4)と合体させてプラスミドpBP009とした(図
6)。このプラスミドで形質変換されたE.コリー細胞
内に、分子量がこのNMHアーゼのそれとほぼ一致する
蛋白質が表現された。しかしながら、酵素活性は検出で
きなかった。
びEcoRIで切断し、生じる大きい(5kb)フラグ
メントをNMHアーゼ−N−末端からの1.5kbフラ
グメント(これは末端切断部位AatII及びXhoI
を有する)及びEcoRI−AatIII−リンカー(
図4)と合体させてプラスミドpBP009とした(図
6)。このプラスミドで形質変換されたE.コリー細胞
内に、分子量がこのNMHアーゼのそれとほぼ一致する
蛋白質が表現された。しかしながら、酵素活性は検出で
きなかった。
【0048】2.2 本発明の方法
まず、NMHアーゼのC−末端の拡大を行なった。この
ために、プラスミドpBP009(図6)を酵素Xho
I及びSmaIで切断し、この際に生じる5.5kbの
大きさのDNA−フラグメント(これはtac−プロモ
ータ、NMHアーゼのN−末端領域及びアンピシリン耐
性因子を有する)を単離した。このフラグメントをpB
R328からのC−末端NMHアーゼ−フラグメント(
これは、末端切断部位EcoRI(クレノフポリメラー
ゼの処理による平坦末端)及びXhoIを有する)と合
体させてプラスミドpBP010にした(図7)。pB
P010はNMHアーゼを表現することができる。
ために、プラスミドpBP009(図6)を酵素Xho
I及びSmaIで切断し、この際に生じる5.5kbの
大きさのDNA−フラグメント(これはtac−プロモ
ータ、NMHアーゼのN−末端領域及びアンピシリン耐
性因子を有する)を単離した。このフラグメントをpB
R328からのC−末端NMHアーゼ−フラグメント(
これは、末端切断部位EcoRI(クレノフポリメラー
ゼの処理による平坦末端)及びXhoIを有する)と合
体させてプラスミドpBP010にした(図7)。pB
P010はNMHアーゼを表現することができる。
【0049】次の工程で、NMHアーゼ−遺伝子を、サ
ルモネラ・チフィムリウムからのmgl−プロモータ(
WO88/09373に記載)で制御した。このために
、プラスミドpPZ07/mgl lac(WO88
/09373に記載)を酵素NcoI及びAatIIで
切断し、これから、mgl−プロモータを含有する2.
9kbの大きさのDNA−フラグメントを単離させた。 このフラグメントをNcoI−AatII−リンカーと
合体させてプラスミドpBP011とした(図8)。
ルモネラ・チフィムリウムからのmgl−プロモータ(
WO88/09373に記載)で制御した。このために
、プラスミドpPZ07/mgl lac(WO88
/09373に記載)を酵素NcoI及びAatIIで
切断し、これから、mgl−プロモータを含有する2.
9kbの大きさのDNA−フラグメントを単離させた。 このフラグメントをNcoI−AatII−リンカーと
合体させてプラスミドpBP011とした(図8)。
【0050】このプラスミドpBP011をEcoRI
で切断し、平坦な末端を得るためにクレノフ−DNA−
ポリメラーゼで処理し、AatIIで後切断した。引続
き、生じたmgl−プロモータ及びリンカーフラグメン
トを含有する平坦で、AatII−末端を有する0.8
kbの大きさのDNA−フラグメントを単離した(図8
)。
で切断し、平坦な末端を得るためにクレノフ−DNA−
ポリメラーゼで処理し、AatIIで後切断した。引続
き、生じたmgl−プロモータ及びリンカーフラグメン
トを含有する平坦で、AatII−末端を有する0.8
kbの大きさのDNA−フラグメントを単離した(図8
)。
【0051】プラスミドpBP010をNdeIで切断
し、平坦なフラグメントを得るためにクレノフ−DNA
−ポリメラーゼで処理した。引続き、このフラグメント
をXhoIで切断し、NMHアーゼ−遺伝子のC−末端
領域を有する4.9kbの大きさのフラグメントを単離
した(図9)。
し、平坦なフラグメントを得るためにクレノフ−DNA
−ポリメラーゼで処理した。引続き、このフラグメント
をXhoIで切断し、NMHアーゼ−遺伝子のC−末端
領域を有する4.9kbの大きさのフラグメントを単離
した(図9)。
【0052】このプラスミドpBP010は、XhoI
及びAatIIでも切断され、この際、NMHアーゼ遺
伝子のN−末端領域を有する1.5kbの大きさのフラ
グメントが単離された。
及びAatIIでも切断され、この際、NMHアーゼ遺
伝子のN−末端領域を有する1.5kbの大きさのフラ
グメントが単離された。
【0053】このプラスミドpBP010からの2つの
フラグメント(4.9kb及び1.5kb)を、mgl
−プロモータを含有するpBP011からの0.8kb
のフラグメントと連結させた。生じたプラスミドはpB
P006と称され(図10)、これはNMHアーゼを表
現することができる。
フラグメント(4.9kb及び1.5kb)を、mgl
−プロモータを含有するpBP011からの0.8kb
のフラグメントと連結させた。生じたプラスミドはpB
P006と称され(図10)、これはNMHアーゼを表
現することができる。
【0054】例3
醗酵及びE.コリー内での組換えNMHアーゼの濃縮E
.コリーHB101−細胞(DSM 1607)を、
NMHアーゼ表現プラスミドpBP010を用いて形質
変換させた。tac−プロモータの良好な調節可能性を
確保するために、細胞を、付加的に
.コリーHB101−細胞(DSM 1607)を、
NMHアーゼ表現プラスミドpBP010を用いて形質
変換させた。tac−プロモータの良好な調節可能性を
確保するために、細胞を、付加的に
【0055】
【外1】
【0056】を含有し、pBP010に対して相容性の
プラスミドを用いて形質変換させた。この
プラスミドを用いて形質変換させた。この
【0057】
【外2】
【0058】は、当業者にとって従来から公知であり、
入手容易である。pBP010に対して相容性のプラス
ミドとして、例えばpACYC177(DSM 36
93P)又はこれから誘導されたものがこれに該当する
。
入手容易である。pBP010に対して相容性のプラス
ミドとして、例えばpACYC177(DSM 36
93P)又はこれから誘導されたものがこれに該当する
。
【0059】3.1 醗酵及び前培養2個の2000
ml−エーレンマイヤーフラスコ内のカナマイシン及び
アンピシリンを有する2×500ml LB−培地に
、
ml−エーレンマイヤーフラスコ内のカナマイシン及び
アンピシリンを有する2×500ml LB−培地に
、
【0060】
【外3】
【0061】を接種した。次いで、37℃及び150U
pm(Rundschuettler;Braun
Certomat M)で16時間インキュベートし
た。 578nmでのODは、pH約7.6で10時間内で約
3.0〜4.0であった。
pm(Rundschuettler;Braun
Certomat M)で16時間インキュベートし
た。 578nmでのODは、pH約7.6で10時間内で約
3.0〜4.0であった。
【0062】
醗酵経過:
接種(接種菌1%)の後に培養液は直ちに指数生長に移
行する。この醗酵装置の温度を1400のOD578n
mに達するまで28℃に保持する。所望のODの達成時
に、温度を25℃まで低めると、生長は減速する。更に
酸素導入を減少することができる。この手段は、生長を
制限し、それにより沈殿体(封入体)の形成に逆作用す
るために必要である。温度移行の正当な時点は重要であ
り、早すぎて実施すると、生長は数時間遅れ、遅すぎる
と不溶の蛋白質のみが得られる。
行する。この醗酵装置の温度を1400のOD578n
mに達するまで28℃に保持する。所望のODの達成時
に、温度を25℃まで低めると、生長は減速する。更に
酸素導入を減少することができる。この手段は、生長を
制限し、それにより沈殿体(封入体)の形成に逆作用す
るために必要である。温度移行の正当な時点は重要であ
り、早すぎて実施すると、生長は数時間遅れ、遅すぎる
と不溶の蛋白質のみが得られる。
【0063】酸素の減少により、更に活性の上昇が達成
される。温度移行を伴なうこの醗酵の際に、収率は30
時間後に、約2500U/L、最大3000U/L(1
50U/OD)である。付加的な、培地中のO2−量の
減少により、45時間後に4000U/Lまで達する。
される。温度移行を伴なうこの醗酵の際に、収率は30
時間後に、約2500U/L、最大3000U/L(1
50U/OD)である。付加的な、培地中のO2−量の
減少により、45時間後に4000U/Lまで達する。
【0064】例4
E.コリーからの組換えNMHアーゼの取得4.1
酵素活性の測定 酵素活性の測定は、燐酸塩緩衝液(pH7.8)中のカ
ルバモイル−サルコシン−ヒドロラーゼ、サルコシン−
オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、N−メチルヒダント
イン、4−アミノアンチピリン、トリブロム−3−ヒド
ロキシ安息香酸、ATP及びMgCl2を含有する呈色
テストを用いて行なう。
酵素活性の測定 酵素活性の測定は、燐酸塩緩衝液(pH7.8)中のカ
ルバモイル−サルコシン−ヒドロラーゼ、サルコシン−
オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、N−メチルヒダント
イン、4−アミノアンチピリン、トリブロム−3−ヒド
ロキシ安息香酸、ATP及びMgCl2を含有する呈色
テストを用いて行なう。
【0065】測定原理:
NMHアーゼは、添加されたN−メチルヒダントインを
カルバモイル−サルコシンに変換し、カルバモイル−サ
ルコシン−ヒドロラーゼは、これをサルコシンに変じ、
これはサルコシン−オキシダーゼにより分解されてグリ
シン、ホルムアルデヒド及び過酸化水素に変えられる。 このペルオキシダーゼは、生じた過酸化水素の助けによ
り、添加された色基質を暗紫色の色素に変換する。54
6nmの波長で吸光度増加を測定する。この酵素テスト
に関しては、欧州特許(EP−A)第0154269号
明細書中に記載されている。
カルバモイル−サルコシンに変換し、カルバモイル−サ
ルコシン−ヒドロラーゼは、これをサルコシンに変じ、
これはサルコシン−オキシダーゼにより分解されてグリ
シン、ホルムアルデヒド及び過酸化水素に変えられる。 このペルオキシダーゼは、生じた過酸化水素の助けによ
り、添加された色基質を暗紫色の色素に変換する。54
6nmの波長で吸光度増加を測定する。この酵素テスト
に関しては、欧州特許(EP−A)第0154269号
明細書中に記載されている。
【0066】1単位(U)は、カルバモイル−サルコシ
ン−ヒドロラーゼ、サルコシン−オキシダーゼ及びペル
オキシダーゼを用いる連結テストにおける測定条件下で
25℃において、1分当りのカルバモイル−サルコシン
−形成μモルとして定義される。試験培養液5mlで、
0.16U/mlの活性が得られる。このことは、出発
培養液(アルトロバクターspec.DSM 256
3)に比べて約20倍の増加に相当する。
ン−ヒドロラーゼ、サルコシン−オキシダーゼ及びペル
オキシダーゼを用いる連結テストにおける測定条件下で
25℃において、1分当りのカルバモイル−サルコシン
−形成μモルとして定義される。試験培養液5mlで、
0.16U/mlの活性が得られる。このことは、出発
培養液(アルトロバクターspec.DSM 256
3)に比べて約20倍の増加に相当する。
【0067】4.2 酵素精製
バイオマス(例3による)315g(NMHアーゼ16
kUの全活性を有する醗酵培養液10lから生じた)を
、グリセリン10%を含有する0.1モル/l燐酸カリ
ウム−緩衝液(pH8.0)2l中に懸濁させ、リソチ
ームを用いかつ700バールの高圧分散1回を用いる処
理により溶解させた。核酸及び細胞砕片のネガチブ−分
離のために、10%ポリエチレンイミン溶液G20(L
uvalgan,MG20000)の添加を、もはや沈
殿が生ぜず、全NMHアーゼ活性が上澄み中に残るまで
行なった。このために、室温で、G2−溶液3v%を添
加し、30分撹拌し、その後、遠心した。このNMHア
ーゼ上澄に、湿式圧縮したDEAE−セファデックス8
v%を回分的に加え、2時間撹拌の後に、この酵素の9
5%が吸着された。濾過後に、交換体を燐酸塩緩衝液で
洗浄し、NMHアーゼを、0.1モル/l KPO4
−緩衝液(pH8.0)を含有する0.5モル/l
硫酸アンモニウム溶液で溶離させた。溶離液は蛋白質1
.1U/mgの特異活性を有した。引続き、N−メチル
ヒダントイン50mモル/l(最終濃度)の存在で、5
5℃で10分加温すると、障害性の異種蛋白質が沈殿さ
れた。遠心分離の後に、澄明な上澄みに硫酸アンモニウ
ムを2.2モル/lまで飽和させ、この際に生じるNM
Hアーゼを遠心分離した。引続き2回結晶させ、第1の
結晶化は、約60mg/mlの蛋白質濃度(pH8.0
)で、0.1モル/lKPO4−緩衝液、1.277モ
ル/l 硫酸アンモニウムを用いた。短時間後にプリ
ズム晶が生じる。この結晶化は24時間後に終り、遠心
分離された上澄み中には、NMHアーゼ5%が存在した
だけである。NMHアーゼ結晶を0.1モル/l K
PO4−緩衝液中に溶かし、不溶分の分離除去の後に、
酵素溶液の第2の結晶化を行なわせた(硫酸アンモニウ
ム濃度1.05モル/l)。1晩にわたって現われた酵
素結晶を分離し、緩衝液中に入れ、20mモル/l燐酸
塩緩衝液に対して透析させ、ラフィノース2部(蛋白質
量に対して)を加え、凍結乾燥させた。
kUの全活性を有する醗酵培養液10lから生じた)を
、グリセリン10%を含有する0.1モル/l燐酸カリ
ウム−緩衝液(pH8.0)2l中に懸濁させ、リソチ
ームを用いかつ700バールの高圧分散1回を用いる処
理により溶解させた。核酸及び細胞砕片のネガチブ−分
離のために、10%ポリエチレンイミン溶液G20(L
uvalgan,MG20000)の添加を、もはや沈
殿が生ぜず、全NMHアーゼ活性が上澄み中に残るまで
行なった。このために、室温で、G2−溶液3v%を添
加し、30分撹拌し、その後、遠心した。このNMHア
ーゼ上澄に、湿式圧縮したDEAE−セファデックス8
v%を回分的に加え、2時間撹拌の後に、この酵素の9
5%が吸着された。濾過後に、交換体を燐酸塩緩衝液で
洗浄し、NMHアーゼを、0.1モル/l KPO4
−緩衝液(pH8.0)を含有する0.5モル/l
硫酸アンモニウム溶液で溶離させた。溶離液は蛋白質1
.1U/mgの特異活性を有した。引続き、N−メチル
ヒダントイン50mモル/l(最終濃度)の存在で、5
5℃で10分加温すると、障害性の異種蛋白質が沈殿さ
れた。遠心分離の後に、澄明な上澄みに硫酸アンモニウ
ムを2.2モル/lまで飽和させ、この際に生じるNM
Hアーゼを遠心分離した。引続き2回結晶させ、第1の
結晶化は、約60mg/mlの蛋白質濃度(pH8.0
)で、0.1モル/lKPO4−緩衝液、1.277モ
ル/l 硫酸アンモニウムを用いた。短時間後にプリ
ズム晶が生じる。この結晶化は24時間後に終り、遠心
分離された上澄み中には、NMHアーゼ5%が存在した
だけである。NMHアーゼ結晶を0.1モル/l K
PO4−緩衝液中に溶かし、不溶分の分離除去の後に、
酵素溶液の第2の結晶化を行なわせた(硫酸アンモニウ
ム濃度1.05モル/l)。1晩にわたって現われた酵
素結晶を分離し、緩衝液中に入れ、20mモル/l燐酸
塩緩衝液に対して透析させ、ラフィノース2部(蛋白質
量に対して)を加え、凍結乾燥させた。
【0068】収量はNMHアーゼ5.8kU(=特異活
性2.15U/mg蛋白質を有する当初活性の34%)
であった。
性2.15U/mg蛋白質を有する当初活性の34%)
であった。
【0069】各濃縮工程の後に、酵素活性を例4.1に
より試験した。
より試験した。
【0070】異種活性カタラーゼ、クレアチナーゼ、ク
レアチニナーゼ及びカルバモイル−サルコシン−ヒドロ
ラーゼは零であった。0.002%の最小異種オキシダ
ーゼ−活性(=グルコース−オキシダーゼ、ピルベート
−オキシダーゼ、ラクテート−オキシダーゼ、ウリカー
ゼ及びコレステリン−オキシダーゼの合計)が測定され
た。
レアチニナーゼ及びカルバモイル−サルコシン−ヒドロ
ラーゼは零であった。0.002%の最小異種オキシダ
ーゼ−活性(=グルコース−オキシダーゼ、ピルベート
−オキシダーゼ、ラクテート−オキシダーゼ、ウリカー
ゼ及びコレステリン−オキシダーゼの合計)が測定され
た。
【0071】至適pH、pH−安定性、温度依存性、熱
安定性、Kм、ATP−及びマグネシウム依存性、アン
モニウム依存性及び分子量に関する組換えNMHアーゼ
の特性は、アルトロバクターからのNMHアーゼの特性
に一致した。
安定性、Kм、ATP−及びマグネシウム依存性、アン
モニウム依存性及び分子量に関する組換えNMHアーゼ
の特性は、アルトロバクターからのNMHアーゼの特性
に一致した。
【0072】例5
NMHアーゼ−遺伝子の配列決定NMHアーゼをコード
する遺伝子からのフラグメントをクローニングベクター
M13中でサブクローニングし、標準法で配列決定した
。その核酸配列は、SEQ ID NO:1に示さ
れている。これから前記のSEQ ID NO:2
で示される配列を有するアミノ酸1288個を有する蛋
白質が生じた。
する遺伝子からのフラグメントをクローニングベクター
M13中でサブクローニングし、標準法で配列決定した
。その核酸配列は、SEQ ID NO:1に示さ
れている。これから前記のSEQ ID NO:2
で示される配列を有するアミノ酸1288個を有する蛋
白質が生じた。
【図1】NMHアーゼ−遺伝子の約0.6kbの大きさ
のフラグメントを有するアルトロバクターからの6kb
の大きさのEcoRI−フラグメント。
のフラグメントを有するアルトロバクターからの6kb
の大きさのEcoRI−フラグメント。
【図2】NMHアーゼ−遺伝子に関してコードする3.
0kbの大きさの領域を有するアルトロバクターからの
3.7kbの大きさのSalI−フラグメント。
0kbの大きさの領域を有するアルトロバクターからの
3.7kbの大きさのSalI−フラグメント。
【図3】NMHアーゼ−遺伝子の3′−末端領域を示す
図。
図。
【図4】EcoRI/AatII−リンカーを示す図。
【図5】プラスミドpBP008の製造過程を示す図。
【図6】プラスミドpBP009の製造過程を示す図。
【図7】NMHアーゼ−表現−プラスミドpBP010
の製造過程を示す図。
の製造過程を示す図。
【図8】サルモネラ・チフィムリウムからmgl−プロ
モータを有するプラスミドpBP011の製造過程を示
す図。
モータを有するプラスミドpBP011の製造過程を示
す図。
【図9】pBP010からのNMHアーゼ−遺伝子のフ
ラグメントの製造過程を示す図。
ラグメントの製造過程を示す図。
【図10】NMHアーゼ−表現−プラスミドpBP00
6の製造過程を示す図。
6の製造過程を示す図。
Claims (6)
- 【請求項1】 (1)SEQ ID NO:1【
化1】 【化2】 で表わされる核酸配列、(2)この遺伝子コードの変性
の範囲内でそれに相応する配列又は(3)(1)又は/
及び(2)からの配列と厳しい条件下でハイブリド形成
する配列を有し、N−メチルヒダントイナーゼ活性を有
する蛋白質に関してコードすることを特徴とする、DN
A。 - 【請求項2】 請求項1記載のDNAで形質変換され
ていることを特徴とする、細胞。 - 【請求項3】 N−メチルヒダントイナーゼ活性を有
する蛋白質を取得する方法において、 (1) 細胞を請求項1記載のDNAを用いて形質変
換させ、 (2) 形質変換されたこの細胞を適当な培地中で培
養し、かつ (3) この培地又は細胞からの蛋白質を濃縮させる
ことを特徴とする、N−メチルヒダントイナーゼ活性を
有する蛋白質の取得法。 - 【請求項4】 N−メチルヒダントイナーゼに、安定
化のために、N−メチルヒダントイナーゼ1単位(U)
当りN−メチルヒダントイン約3.8nモルを添加する
、請求項3記載の方法。 - 【請求項5】 請求項3又は4記載の方法で得られた
N−メチルヒダントイナーゼ活性を有する蛋白質。 - 【請求項6】 請求項5記載の蛋白質を含有すること
を特徴とする、液体中のクレアニチン含分を測定するた
めの試薬。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4021571.7 | 1990-07-06 | ||
DE4021571A DE4021571A1 (de) | 1990-07-06 | 1990-07-06 | N-methylhydantoinase, kloniert |
Related Child Applications (1)
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