JPH04229181A - Ｄｎａ、細胞、ｎ−メチルヒダントイナーゼ活性を有する蛋白質の取得法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎ
Ｏ：１で表わされる核酸配列を有するＤＮＡ、これで形
質変換された細胞、Ｎ−メチルヒダントイナーゼ活性を
有する蛋白質の取得法及び液体中のクレアチニン含分を
測定するための試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】酵素Ｎ−メチルヒダントイナーゼ（ＮＭ
Ｈアーゼ）は、液体中のクレアチニン含分の測定のため
に必要である。クレアチニン濃度は、腎臓診断のための
重要なパラメータである。世界的に、毎年、約１０億の
テストが実施されている。従って、酵素ＮＭＨアーゼの
価格的に好都合な提供並びに問題のない醗酵の可能性は
、クレアチニン測定用の診断キットの提供のための基本
的前提である。このＮＭＨアーゼの分子量はＳＤＳ−ゲ
ル中で１２５ｋＤである。その特異活性は２Ｕ／ｍｇで
あり、Ｎ−メチルヒダントインに関するＫмは２×１０
−５モル／ｌである。通常、このＮＭＨアーゼはアルト
ロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）から単離され
る。しかしながら、この方法は、使用微生物に基づき欠
点を有する。

【０００３】

【発明の解決しようとする課題】従って、多量のＮＭＨ
アーゼの提供のためには、改良された濃縮法を開発すべ
きである。このことは本発明の課題でもある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明のこの課題は、Ｎ
ＭＨアーゼに関してコードするアルトロバクターからの
遺伝子のクローニング及び適当な宿主生物中でのその表
現により解決することができた。

【０００５】従って、本発明の目的物は、（１）ＳＥＱ
　　ＩＤ　　ＮＯ：１

【０００６】

【化３】

【０００７】

【化４】

【０００８】で表わされる核酸配列、（２）遺伝子コー
ドの変性の範囲内でそれに相応する配列又は（３）（１
）又は／及び（２）からの配列を用いて厳しいハイブリ
ド形成条件下でハイブリド形成する配列を有し、ＮＭＨ
アーゼ活性を有する蛋白質に関してコードするＤＮＡで
ある。

【０００９】本発明の意味における厳しい条件下でのハ
イブリド形成は、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等に
よるモレキュラール・クローニング．ア・ラボラトリィ
・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ
．Ａ　　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ（１９８２））に記載され
ている。

【００１０】本発明によるＤＮＡは、ＳＥＱ　　ＩＤ　
　ＮＯ：２

【００１１】

【化５】

【００１２】

【化６】

【００１３】

【化７】

【００１４】

【化８】

【００１５】で表わされる配列を有するアミノ酸１２８
８個を有する蛋白質に関してコードする。

【００１６】従って、本発明は、ＮＭＨアーゼ活性及び
ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２で表わされるか又はそれか
ら誘導されたアミノ酸配列を有し、遺伝子工学的方法で
、例えば異種生物中、即ち、本発明による蛋白質に関し
てコードする遺伝子が本来は現われない生物中での表現
により得られる蛋白質をも包含する。他方、本発明によ
るＤＮＡの１個以上のコピーを、本発明のＤＮＡをその
中に有する生物中に導入することにより、ＮＭＨアーゼ
遺伝子の改良された表現を達成することも可能である。

【００１７】もう１つの本発明の目的物は、本発明によ
るＤＮＡの１個以上のコピーを有する組換えベクターで
ある。本発明による組換えベクターは、原核生物又は真
核生物中での蛋白質表現のために好適であるベクターで
あってよい。これは原核生物ベクターであるのが有利で
ある本発明による組換えベクターは、宿主細胞中で染色
体外に存在するベクター（例えばプラスミド）であるか
又は宿主のゲノム中に組込まれていて（例えばバクテリ
オファージラムダ）よい。

【００１８】本発明による組換えベクターはプラスミド
であるのが有利である。好適な本発明によるプラスミド
は、例えばプラスミドｐＢＰ０１０である。

【００１９】本発明による組換えベクター上には、ＮＭ
Ｈアーゼ活性を有する蛋白質に関してコードするＤＮＡ
が、有利に、調節可能なプロモータの制御下に、即ち、
本発明によるＤＮＡの表現は、例えばレプレッサーによ
り抑制され得、かつ調節可能なプロモータの所望誘導の
際にのみ起こるような制御下に、存在する。この誘導は
、例えば温度変化又は、化学的誘導物質（例えばｌａｃ
−プロモータ−誘導体の場合は、ＩＰＴＣ）の添加によ
り行なうことができる。本発明の特に有利な実施形にお
ける、その制御下に、ＮＭＨアーゼ遺伝子を生じる調節
可能なプロモータは、糖例えばグルコース及びフラクト
ースによる異化代謝中間体抑制を介して調節可能なサル
モネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　　ｔ
ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）からのｍｇｌ−プロモータであ
る（ＷＯ８８／０９３７３）。

【００２０】グラム陰性菌殊にＥ．コリー中でのＮＭＨ
アーゼの表現のために好適な本発明によるベクターは、
例えばプラスミドｐＢＰ００６である。ｐＢＰ００６の
製造のために、サルモネラ・チフィムリウムからのｍｇ
ｌ−プロモータの配列を有するＤＮＡ−フラグメントを
、プラスミドｐＰＺ０７−ｍｇｌ−ｌａｃ（ＷＯ８８／
０９３７３　　図８に記載）から単離し、その特有のプ
ロモータなしでアルトロバクターからのＮＭＨアーゼ−
遺伝子のコード配列を含有するＤＮＡ−フラグメントの
前でクローニングした。

【００２１】更に、本発明の目的物は、本発明によるＤ
ＮＡで又は本発明による組換えベクターで形質変換され
ている細胞である。この細胞は、細菌細胞特にＥ．コリ
ー細胞が有利である。

【００２２】ＮＭＨアーゼ−遺伝子のクローニングによ
り本発明によるＤＮＡを得た。このために、アルトロバ
クターの染色体ＤＮＡを慣用の方法で単離し、適当な制
限酵素を用いて切断した。このＤＮＡ−フラグメントか
ら、遺伝子バンクをＥ．コリー中に付加させた。しかし
ながら、慣用法でのＮＭＨアーゼ遺伝子のクローニング
（オリゴヌクレオチド−プローブを用いる遺伝子バンク
の検査及びＮＭＨアーゼ活性を介してのクローンの選択
）は成功しなかった。即ち、Ｅ．コリー中でのクローニ
ングの際に、使用アルトロバクターＤＮＡ−フラグメン
トにおいてＮＭＨアーゼ活性は測定できなかった。オリ
ゴヌクレオチド−プローブを用いるハイブリド形成に基
づき、スタートコドン及びストップコドンを有する適切
な長さのＤＮＡ−フラグメントが同定できたので、この
発見は意想外のことであった。ＮＭＨアーゼ活性は、本
来のＮＭＨアーゼ−プロモータを失なったＤＮＡ−フラ
グメントのクローニングの際にはじめて検出できた。

【００２３】更に、本発明の目的は、１細胞を本発明に
よるＤＮＡ又は本発明による組換えベクターを用いて形
質変換し、この形質変換された細胞を適当な培地中で培
養し、この培地又は細胞からの蛋白質を濃縮させること
よりなる、ＮＭＨアーゼ活性を有する蛋白質の取得法で
もある。

【００２４】本発明による方法のための宿主生物として
、Ｅ．コリー菌を使用するのが有利である。しかしなが
ら、この場合に、形質変換された細胞の培養を、亜適（
ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌｅｎ）生長条件で行なうのが好適
である。亜適生長条件とは、インキュベーション時の温
度がいくらか低く（３０℃又はそれ以下）、酸素導入を
減少しかつ／又は最小培地（即ち培養生物にとって重要
な一定の栄養物が限られた濃度で含有する培地）を使用
することである。

【００２５】従って、例えばｔａｃ−プロモータの制御
下にＮＭＨアーゼ−遺伝子を含有する組換ベクターを使
用する方法でＥ．コリーからＮＭＨアーゼを取得する方
法における培養条件は、最小培地、インキュベーション
温度≦３０℃及び乳糖０．８％でのｔａｃ−プロモータ
の不完全誘導である。

【００２６】サルモネラ・チフィムリウムのｍｇｌ−プ
ロモータの制御下におけるＮＭＨアーゼ遺伝子の特に有
利な表現は、同様に有利に３０℃以下のインキュベーシ
ョン温度で、場合により付加的な酸素導入の減少と結び
ついて起こり、従って生じたＮＭＨアーゼは不活性形で
沈殿体としては生じない。このｍｇｌ−プロモータは異
化代謝産物−抑制により調節される（欧州特許ＥＰ−Ａ
第０３１６３７８号）。

【００２７】一般に、本発明の方法にとって、各々使用
された調節可能なプロモータの誘導は、不完全にのみ実
施されることが有利であり、これは、同様に沈殿体の僅
かな形成に寄与する。

【００２８】更に、本発明の方法にとって、安定化のた
めに、有利に、形質変換された細胞又は培地からのＮＭ
Ｈアーゼの濃縮の間に、蛋白質を酵素基質Ｎ−メチルヒ
ダントインと共にインキュベートすることが特に有利で
ある。意外にも、本発明の方法で得られた組換えＮＭＨ
アーゼの安定性は、酵素１単位（Ｕ）当りＮ−メチルヒ
ダントイン約３．８ｎモルの量の存在の際に著るしく高
めることができる。このために、酵素を、有利に１〜１
００ｍモル／ｌ、特に有利に１０〜７０ｍモル／ｌ、最
も有利に５０ｍモル／ｌの濃度のＮ−メチルヒダントイ
ン溶液と共にインキュベートする。このインキュベーシ
ョン工程では、温度を例えば５５℃まで高めるのが好適
である。意外にも、殊に、特有の基質の存在は、酵素を
安定化させるが同時に組換え酵素の酵素反応に障害性の
影響を及ぼさない。

【００２９】更に、本発明は、液体中のクレアチニン含
分を測定するための試薬に関し、これは本発明の方法で
得られた蛋白質を慣用の成分と共に含有する。

【００３０】

【実施例】次の例で、配列表及び図１〜１０と関連させ
て、本発明を更に詳述する。前記のＳＥＱ　　ＩＤ　　
ＮＯ：１はＮＭＨアーゼ遺伝子のＤＮＡ配列であり、Ｓ
ＥＱＩＤ　　ＮＯ：２はこれから誘導されたＮＭＨアー
ゼのアミノ酸配列である。

【００３１】図１は、ＮＭＨアーゼ−遺伝子の約０．６
ｋｂの大きさのフラグメントを有するアルトロバクター
からの６ｋｂの大きさのＥｃｏＲＩ−フラグメントを示
している。

【００３２】図２は、ＮＭＨアーゼ−遺伝子に関してコ
ードする３．０ｋｂの大きさの領域を有する、アルトロ
バクターからの３．７ｋｂの大きさのＳａｌＩ−フラグ
メントを示している。

【００３３】図３は、ＮＭＨアーゼ−遺伝子の３′−末
端領域を示している。

【００３４】図４は、ＥｃｏＲＩ／ＡａｔＩＩ−リンカ
ーを示している。

【００３５】図５は、プラスミドｐＢＰ００８の製造過
程を示している。

【００３６】図６は、プラスミドｐＢＰ００９の製造過
程を示している。

【００３７】図７は、ＮＭＨアーゼ−表現プラスミドｐ
ＢＰ０１０の製造過程を示している。図８は、サルモネ
ラ・チフィムリウムからのｍｇｌ−プロモータを有する
プラスミドｐＢＰ０１１の製造過程を示している。

【００３８】図９は、ｐＢＰ０１０からのＮＭＨアーゼ
−遺伝子のフラグメントの製造過程を示している。

【００３９】図１０は、ＮＭＨアーゼ−表現−プラスミ
ドｐＢＰ００６の製造過程を示している。

【００４０】例１ ＮＭＨアーゼのクローニング アルトロバクターＳｐｃ．（ＤＳＭ　　２５６３）から
、慣用法でＤＮＡを単離し（Ｊ．Ｍａｒｍｅｒ−Ａ　　
Ｐｒｏｃｅｓｓ　　ｆｏｒ　　ｔｈｅ　　ｉｓｏｌａｔ
ｉｏｎ　　ｏｆ　　ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ
　　ａｃｉｄ　　ｆｒｏｍ　　ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎ
ｉｓｍｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　　３，　　２０８
〜２１８（１９６１）；Ｓ．Ｖｉｓｕｖａｎａｔｈａｎ
等のＳｉｍｐｌｅ　　ｅｎｚｙｍｉｃｍｅｔｈｏｄ　　
ｆｏｒ　　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ＤＮＡ　　
ｆｒｏｍ　　ｄｉｖｅｒｓｅ　　ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｊ
ｏｕｎａｌ　　ｏｆ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　１０，　　５９〜６４（１９
８９））、制限酵素ＥｃｏＲＩ又はＨｉｎｄＩＩＩで切
断した。アルトロバクターＤＮＡ用のクローニングベク
ターとして、バクテリオファージλｇｔ１０（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いた。このア
ルトロバクターＤＮＡを製造者の指示に依りλｇｔ１０
中でクローニングした。

【００４１】得られたアルトロバクター遺伝子バンクを
、ＮＭＨアーゼの部分ペプチド配列から誘導されたオリ
ゴヌクレオチド−プローブで検査した。ＮＭＨアーゼの
部分ペプチド配列：Ｍｅｔ　　Ｌｙｓ　　Ａｒｇ　　Ｉ
ｌｅ　　Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　Ａｓｐ　　Ｖａｌ　　Ｇ
ｌｙＧｌｙ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ
　　Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ　　Ｐｈｅ．この部分ペプチド−
配列から次のオリゴヌクレオチド−プローブを誘導した
： １．　　ＡＴＧ　　　　ＡＡ（Ｇ／Ａ）　　（Ｃ／Ａ）
Ｇ（Ｇ／Ａ）　　ＡＴ（Ａ／Ｃ／Ｔ）　　ＧＧ（Ｇ／Ａ
／Ｔ／Ｃ）　　ＧＴ ２．　　ＡＴＧ　　　　ＡＡ（Ｇ／Ａ）　　（Ｃ／Ａ）
Ｇ（Ｔ／Ｃ）　　ＡＴ（Ａ／Ｃ／Ｔ）　　ＧＧ（Ｇ／Ａ
／Ｔ／Ｃ）　　ＧＴ ３．　　ＡＴＧ　　ＡＡＧ　　ＣＧＣ　　ＡＴＣ　　Ｇ
ＧＣ　　ＧＴＧ　　ＧＡＣ　　ＧＴＧＧＧＣ　　ＧＧＣ
　　ＡＣＧ　　ＴＴＣ　　ＡＣＣ　　ＧＡＴ　　ＣＴＧ
　　ＴＡＣＴＴこのオリゴヌクレオチド−プローブを用
いて、λｇｔ１０−遺伝子バンク内に、ＮＭＨアーゼ−
遺伝子の１部分（約０．６ｋｂ）を有する６ｋｂの大き
さのＥｃｏＲＩ−フラグメントが認められた。

【００４２】このフラグメントの１部分（ＰｓｔＩとＥ
ｃｏＲＩ−切断部位の間の約３００ｂｐ）を３２Ｐで放
射能標識付けをした。引続き、アルトロバクターＤＮＡ
を制限酵素ＳａｌＩを用いて切断し、アガロースゲル上
で分離し、サザンブロットで、放射能標識されたＤＮＡ
−フラグメントとハイブリド形成させた。このハイブリ
ド形成されたＤＮＡ−領域をアガロースゲルから切り出
し、ｐＢＲ３２８のテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　　ＧｍｂＨ）
のＳａｌＩ−制限切断部位内にクローニングさせた。

【００４３】このプラスミドで形質変換されたＥ．コリ
ー細胞の検査は、長さ３．７ｋｂのＤＮＡ−フラグメン
ト（これはＮＭＨアーゼ遺伝子の３．０ｋｂの大きさの
領域を有する）を示した（図２）。

【００４４】この挿入部の点線で示されているＥｃｏＲ
Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フラグメントを、ジゴキシゲニン
で標識付けた（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ，Ｄｉｇ　　Ｋｉｔ）。このプローブを用いて、再
び前記のλｇｔ１０−遺伝子バンクを検査し、この際、
ＮＭＨアーゼ−遺伝子の３′−末端領域を有する２．７
ｋｂの大きさの片が認められた（図３）。このＤＮＡ−
フラグメントもベクターｐＢＲ３２８内にクローニング
させた。

【００４５】例２ ＮＭＨアーゼの表現 ２．１　　慣用法 ３．７ｋｂの大きさのＳａｌＩ−フラグメント（図２）
を市場で入手されるベクターｐＵＣ１９（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　　ＧｍｂＨ）中にクロ
ーニングさせた。引続きこのＮＭＨアーゼ遺伝子を、図
３からのＥｃｏＲＩ−フラグメントのクローニング導入
により完結させた。しかしながら、このような構成は活
性ＮＭＨアーゼの表現をもたらさなかった。

【００４６】誘導可能なｔａｃ−プロモータの制御下に
おけるクローニング及び常法でのｔａｃ−プロモータの
誘導（３７℃でのインキュベーション、完全培地及びｔ
ａｃ−プロモータの完全誘導）によるこの構成の表現を
達成する試みも失敗した。このために、プラスミドｐＫ
Ｋ１７７−３（ＤＳＭ　　３０６２）を、ＥｃｏＲＩ及
びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩ
ＩＩを介してｐＵＣ１９から切断取り出されたポリリン
カーと連結させた。生じたプラスミドをｐＢＰ１７７−
４と称した。引続きこのプラスミドｐＢＰ１７７−４を
ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで切断し、２．５ｋｂの大きさ
のＣ−末端ＮＭＨアーゼフラグメント（同様にＥｃｏＲ
Ｉ及びＫｐｎＩで切断）と合体させてプラスミドｐＢＰ
００８とした（図５）。

【００４７】このプラスミドｐＢＰ００８をＸｈｏＩ及
びＥｃｏＲＩで切断し、生じる大きい（５ｋｂ）フラグ
メントをＮＭＨアーゼ−Ｎ−末端からの１．５ｋｂフラ
グメント（これは末端切断部位ＡａｔＩＩ及びＸｈｏＩ
を有する）及びＥｃｏＲＩ−ＡａｔＩＩＩ−リンカー（
図４）と合体させてプラスミドｐＢＰ００９とした（図
６）。このプラスミドで形質変換されたＥ．コリー細胞
内に、分子量がこのＮＭＨアーゼのそれとほぼ一致する
蛋白質が表現された。しかしながら、酵素活性は検出で
きなかった。

【００４８】２．２　　本発明の方法 まず、ＮＭＨアーゼのＣ−末端の拡大を行なった。この
ために、プラスミドｐＢＰ００９（図６）を酵素Ｘｈｏ
Ｉ及びＳｍａＩで切断し、この際に生じる５．５ｋｂの
大きさのＤＮＡ−フラグメント（これはｔａｃ−プロモ
ータ、ＮＭＨアーゼのＮ−末端領域及びアンピシリン耐
性因子を有する）を単離した。このフラグメントをｐＢ
Ｒ３２８からのＣ−末端ＮＭＨアーゼ−フラグメント（
これは、末端切断部位ＥｃｏＲＩ（クレノフポリメラー
ゼの処理による平坦末端）及びＸｈｏＩを有する）と合
体させてプラスミドｐＢＰ０１０にした（図７）。ｐＢ
Ｐ０１０はＮＭＨアーゼを表現することができる。

【００４９】次の工程で、ＮＭＨアーゼ−遺伝子を、サ
ルモネラ・チフィムリウムからのｍｇｌ−プロモータ（
ＷＯ８８／０９３７３に記載）で制御した。このために
、プラスミドｐＰＺ０７／ｍｇｌ　　ｌａｃ（ＷＯ８８
／０９３７３に記載）を酵素ＮｃｏＩ及びＡａｔＩＩで
切断し、これから、ｍｇｌ−プロモータを含有する２．
９ｋｂの大きさのＤＮＡ−フラグメントを単離させた。 このフラグメントをＮｃｏＩ−ＡａｔＩＩ−リンカーと
合体させてプラスミドｐＢＰ０１１とした（図８）。

【００５０】このプラスミドｐＢＰ０１１をＥｃｏＲＩ
で切断し、平坦な末端を得るためにクレノフ−ＤＮＡ−
ポリメラーゼで処理し、ＡａｔＩＩで後切断した。引続
き、生じたｍｇｌ−プロモータ及びリンカーフラグメン
トを含有する平坦で、ＡａｔＩＩ−末端を有する０．８
ｋｂの大きさのＤＮＡ−フラグメントを単離した（図８
）。

【００５１】プラスミドｐＢＰ０１０をＮｄｅＩで切断
し、平坦なフラグメントを得るためにクレノフ−ＤＮＡ
−ポリメラーゼで処理した。引続き、このフラグメント
をＸｈｏＩで切断し、ＮＭＨアーゼ−遺伝子のＣ−末端
領域を有する４．９ｋｂの大きさのフラグメントを単離
した（図９）。

【００５２】このプラスミドｐＢＰ０１０は、ＸｈｏＩ
及びＡａｔＩＩでも切断され、この際、ＮＭＨアーゼ遺
伝子のＮ−末端領域を有する１．５ｋｂの大きさのフラ
グメントが単離された。

【００５３】このプラスミドｐＢＰ０１０からの２つの
フラグメント（４．９ｋｂ及び１．５ｋｂ）を、ｍｇｌ
−プロモータを含有するｐＢＰ０１１からの０．８ｋｂ
のフラグメントと連結させた。生じたプラスミドはｐＢ
Ｐ００６と称され（図１０）、これはＮＭＨアーゼを表
現することができる。

【００５４】例３ 醗酵及びＥ．コリー内での組換えＮＭＨアーゼの濃縮Ｅ
．コリーＨＢ１０１−細胞（ＤＳＭ　　１６０７）を、
ＮＭＨアーゼ表現プラスミドｐＢＰ０１０を用いて形質
変換させた。ｔａｃ−プロモータの良好な調節可能性を
確保するために、細胞を、付加的に

【００５５】

【外１】

【００５６】を含有し、ｐＢＰ０１０に対して相容性の
プラスミドを用いて形質変換させた。この

【００５７】

【外２】

【００５８】は、当業者にとって従来から公知であり、
入手容易である。ｐＢＰ０１０に対して相容性のプラス
ミドとして、例えばｐＡＣＹＣ１７７（ＤＳＭ　　３６
９３Ｐ）又はこれから誘導されたものがこれに該当する
。

【００５９】３．１　　醗酵及び前培養２個の２０００
ｍｌ−エーレンマイヤーフラスコ内のカナマイシン及び
アンピシリンを有する２×５００ｍｌ　　ＬＢ−培地に
、

【００６０】

【外３】

【００６１】を接種した。次いで、３７℃及び１５０Ｕ
ｐｍ（Ｒｕｎｄｓｃｈｕｅｔｔｌｅｒ；Ｂｒａｕｎ　　
Ｃｅｒｔｏｍａｔ　　Ｍ）で１６時間インキュベートし
た。 ５７８ｎｍでのＯＤは、ｐＨ約７．６で１０時間内で約
３．０〜４．０であった。

【００６２】 醗酵経過： 接種（接種菌１％）の後に培養液は直ちに指数生長に移
行する。この醗酵装置の温度を１４００のＯＤ５７８ｎ
ｍに達するまで２８℃に保持する。所望のＯＤの達成時
に、温度を２５℃まで低めると、生長は減速する。更に
酸素導入を減少することができる。この手段は、生長を
制限し、それにより沈殿体（封入体）の形成に逆作用す
るために必要である。温度移行の正当な時点は重要であ
り、早すぎて実施すると、生長は数時間遅れ、遅すぎる
と不溶の蛋白質のみが得られる。

【００６３】酸素の減少により、更に活性の上昇が達成
される。温度移行を伴なうこの醗酵の際に、収率は３０
時間後に、約２５００Ｕ／Ｌ、最大３０００Ｕ／Ｌ（１
５０Ｕ／ＯＤ）である。付加的な、培地中のＯ２−量の
減少により、４５時間後に４０００Ｕ／Ｌまで達する。

【００６４】例４ Ｅ．コリーからの組換えＮＭＨアーゼの取得４．１　　
酵素活性の測定 酵素活性の測定は、燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．８）中のカ
ルバモイル−サルコシン−ヒドロラーゼ、サルコシン−
オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、Ｎ−メチルヒダント
イン、４−アミノアンチピリン、トリブロム−３−ヒド
ロキシ安息香酸、ＡＴＰ及びＭｇＣｌ２を含有する呈色
テストを用いて行なう。

【００６５】測定原理： ＮＭＨアーゼは、添加されたＮ−メチルヒダントインを
カルバモイル−サルコシンに変換し、カルバモイル−サ
ルコシン−ヒドロラーゼは、これをサルコシンに変じ、
これはサルコシン−オキシダーゼにより分解されてグリ
シン、ホルムアルデヒド及び過酸化水素に変えられる。 このペルオキシダーゼは、生じた過酸化水素の助けによ
り、添加された色基質を暗紫色の色素に変換する。５４
６ｎｍの波長で吸光度増加を測定する。この酵素テスト
に関しては、欧州特許（ＥＰ−Ａ）第０１５４２６９号
明細書中に記載されている。

【００６６】１単位（Ｕ）は、カルバモイル−サルコシ
ン−ヒドロラーゼ、サルコシン−オキシダーゼ及びペル
オキシダーゼを用いる連結テストにおける測定条件下で
２５℃において、１分当りのカルバモイル−サルコシン
−形成μモルとして定義される。試験培養液５ｍｌで、
０．１６Ｕ／ｍｌの活性が得られる。このことは、出発
培養液（アルトロバクターｓｐｅｃ．ＤＳＭ　　２５６
３）に比べて約２０倍の増加に相当する。

【００６７】４．２　　酵素精製 バイオマス（例３による）３１５ｇ（ＮＭＨアーゼ１６
ｋＵの全活性を有する醗酵培養液１０ｌから生じた）を
、グリセリン１０％を含有する０．１モル／ｌ燐酸カリ
ウム−緩衝液（ｐＨ８．０）２ｌ中に懸濁させ、リソチ
ームを用いかつ７００バールの高圧分散１回を用いる処
理により溶解させた。核酸及び細胞砕片のネガチブ−分
離のために、１０％ポリエチレンイミン溶液Ｇ２０（Ｌ
ｕｖａｌｇａｎ，ＭＧ２００００）の添加を、もはや沈
殿が生ぜず、全ＮＭＨアーゼ活性が上澄み中に残るまで
行なった。このために、室温で、Ｇ２−溶液３ｖ％を添
加し、３０分撹拌し、その後、遠心した。このＮＭＨア
ーゼ上澄に、湿式圧縮したＤＥＡＥ−セファデックス８
ｖ％を回分的に加え、２時間撹拌の後に、この酵素の９
５％が吸着された。濾過後に、交換体を燐酸塩緩衝液で
洗浄し、ＮＭＨアーゼを、０．１モル／ｌ　　ＫＰＯ４
−緩衝液（ｐＨ８．０）を含有する０．５モル／ｌ　　
硫酸アンモニウム溶液で溶離させた。溶離液は蛋白質１
．１Ｕ／ｍｇの特異活性を有した。引続き、Ｎ−メチル
ヒダントイン５０ｍモル／ｌ（最終濃度）の存在で、５
５℃で１０分加温すると、障害性の異種蛋白質が沈殿さ
れた。遠心分離の後に、澄明な上澄みに硫酸アンモニウ
ムを２．２モル／ｌまで飽和させ、この際に生じるＮＭ
Ｈアーゼを遠心分離した。引続き２回結晶させ、第１の
結晶化は、約６０ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度（ｐＨ８．０
）で、０．１モル／ｌＫＰＯ４−緩衝液、１．２７７モ
ル／ｌ　　硫酸アンモニウムを用いた。短時間後にプリ
ズム晶が生じる。この結晶化は２４時間後に終り、遠心
分離された上澄み中には、ＮＭＨアーゼ５％が存在した
だけである。ＮＭＨアーゼ結晶を０．１モル／ｌ　　Ｋ
ＰＯ４−緩衝液中に溶かし、不溶分の分離除去の後に、
酵素溶液の第２の結晶化を行なわせた（硫酸アンモニウ
ム濃度１．０５モル／ｌ）。１晩にわたって現われた酵
素結晶を分離し、緩衝液中に入れ、２０ｍモル／ｌ燐酸
塩緩衝液に対して透析させ、ラフィノース２部（蛋白質
量に対して）を加え、凍結乾燥させた。

【００６８】収量はＮＭＨアーゼ５．８ｋＵ（＝特異活
性２．１５Ｕ／ｍｇ蛋白質を有する当初活性の３４％）
であった。

【００６９】各濃縮工程の後に、酵素活性を例４．１に
より試験した。

【００７０】異種活性カタラーゼ、クレアチナーゼ、ク
レアチニナーゼ及びカルバモイル−サルコシン−ヒドロ
ラーゼは零であった。０．００２％の最小異種オキシダ
ーゼ−活性（＝グルコース−オキシダーゼ、ピルベート
−オキシダーゼ、ラクテート−オキシダーゼ、ウリカー
ゼ及びコレステリン−オキシダーゼの合計）が測定され
た。

【００７１】至適ｐＨ、ｐＨ−安定性、温度依存性、熱
安定性、Ｋм、ＡＴＰ−及びマグネシウム依存性、アン
モニウム依存性及び分子量に関する組換えＮＭＨアーゼ
の特性は、アルトロバクターからのＮＭＨアーゼの特性
に一致した。

【００７２】例５ ＮＭＨアーゼ−遺伝子の配列決定ＮＭＨアーゼをコード
する遺伝子からのフラグメントをクローニングベクター
Ｍ１３中でサブクローニングし、標準法で配列決定した
。その核酸配列は、ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１に示さ
れている。これから前記のＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２
で示される配列を有するアミノ酸１２８８個を有する蛋
白質が生じた。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＮＭＨアーゼ−遺伝子の約０．６ｋｂの大きさ
のフラグメントを有するアルトロバクターからの６ｋｂ
の大きさのＥｃｏＲＩ−フラグメント。

【図２】ＮＭＨアーゼ−遺伝子に関してコードする３．
０ｋｂの大きさの領域を有するアルトロバクターからの
３．７ｋｂの大きさのＳａｌＩ−フラグメント。

【図３】ＮＭＨアーゼ−遺伝子の３′−末端領域を示す
図。

【図４】ＥｃｏＲＩ／ＡａｔＩＩ−リンカーを示す図。

【図５】プラスミドｐＢＰ００８の製造過程を示す図。

【図６】プラスミドｐＢＰ００９の製造過程を示す図。

【図７】ＮＭＨアーゼ−表現−プラスミドｐＢＰ０１０
の製造過程を示す図。

【図８】サルモネラ・チフィムリウムからｍｇｌ−プロ
モータを有するプラスミドｐＢＰ０１１の製造過程を示
す図。

【図９】ｐＢＰ０１０からのＮＭＨアーゼ−遺伝子のフ
ラグメントの製造過程を示す図。

【図１０】ＮＭＨアーゼ−表現−プラスミドｐＢＰ００
６の製造過程を示す図。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　（１）ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１【
   化１】 【化２】 で表わされる核酸配列、（２）この遺伝子コードの変性
   の範囲内でそれに相応する配列又は（３）（１）又は／
   及び（２）からの配列と厳しい条件下でハイブリド形成
   する配列を有し、Ｎ−メチルヒダントイナーゼ活性を有
   する蛋白質に関してコードすることを特徴とする、ＤＮ
   Ａ。
2. 【請求項２】　　請求項１記載のＤＮＡで形質変換され
   ていることを特徴とする、細胞。
3. 【請求項３】　　Ｎ−メチルヒダントイナーゼ活性を有
   する蛋白質を取得する方法において、 （１）　　細胞を請求項１記載のＤＮＡを用いて形質変
   換させ、 （２）　　形質変換されたこの細胞を適当な培地中で培
   養し、かつ （３）　　この培地又は細胞からの蛋白質を濃縮させる
   ことを特徴とする、Ｎ−メチルヒダントイナーゼ活性を
   有する蛋白質の取得法。
4. 【請求項４】　　Ｎ−メチルヒダントイナーゼに、安定
   化のために、Ｎ−メチルヒダントイナーゼ１単位（Ｕ）
   当りＮ−メチルヒダントイン約３．８ｎモルを添加する
   、請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】　　請求項３又は４記載の方法で得られた
   Ｎ−メチルヒダントイナーゼ活性を有する蛋白質。
6. 【請求項６】　　請求項５記載の蛋白質を含有すること
   を特徴とする、液体中のクレアニチン含分を測定するた
   めの試薬。