JPS60203190A - １‐メチルヒダントイナーゼ、その製出法およびクレアチニンの測定法および測定試薬 - Google Patents
１‐メチルヒダントイナーゼ、その製出法およびクレアチニンの測定法および測定試薬Info
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
従来の技術
分析化学、殊に臨床化学診断法におし・ては、天然物、
生理的代謝物質およびこれから６４された化合物の酵素
的測足方法が仄し、に多く必少とされる。その理由は、
酵素触媒的物質初分解の極めて、妬℃・特異性、イ忌和
な反応条件（普通は中性のＰＨ範囲内で水性媒体中での
１５〜４０℃の間）下でのその迅速、明確かつロスのな
い進行、ならびにそれを、簡単かつ鋭敏な方法で、殊に
直接かまたは組合された指示系反応を使用し？ｔｌｌ１
元法を用℃・て定鎗的に知ることがｉ」能でル）ること
である。
生理的代謝物質およびこれから６４された化合物の酵素
的測足方法が仄し、に多く必少とされる。その理由は、
酵素触媒的物質初分解の極めて、妬℃・特異性、イ忌和
な反応条件（普通は中性のＰＨ範囲内で水性媒体中での
１５〜４０℃の間）下でのその迅速、明確かつロスのな
い進行、ならびにそれを、簡単かつ鋭敏な方法で、殊に
直接かまたは組合された指示系反応を使用し？ｔｌｌ１
元法を用℃・て定鎗的に知ることがｉ」能でル）ること
である。
１−メチルヒダントインには、この化合物を直接または
間接的に解素分析に利用する＃累触媒的複分解法はこれ
まで知られていなかった。
間接的に解素分析に利用する＃累触媒的複分解法はこれ
まで知られていなかった。
しかし、かかる方法はなかんずく、久しく公知のクレア
チニンイミノヒドロラーセ゛（Ｅ、Ｃ。
チニンイミノヒドロラーセ゛（Ｅ、Ｃ。
３．５．４．２１ ）を用いる酵素反応で１−メチルヒ
ダントインとアンモニアとに変換される、臨床診断上重
要な血清および尿成分であるクレアチニンの街り定にと
くに重要である。
ダントインとアンモニアとに変換される、臨床診断上重
要な血清および尿成分であるクレアチニンの街り定にと
くに重要である。
実際に、血清または尿中のクレアチニンの酵素的測定に
は既に若干の方法が公知である（Ｗａｈ’１ｅｆｅｌｄ
、 Ａ、Ｗ、 、 Ｇ、 Ｈｏ１ｚおよびＨ，Ｕ、 Ｂ
ｅｒｇｍｅｙｅｒ、 ｉｎ ｌ（、Ｕ、 Ｂｅｒｇｍｅ
ｙｅｒ ： Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ ｅｎｚｙｍａ
ｔｉｓｃｈｅｎ Ａｎａｌｙｓｅ、 ｇ ３版、第■巻
、Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ、 Ｗｅｉｎｈｅｉｍ
１９７４年、第１８６４頁〜繁１８３８負、Ｆｏｓｓａ
ｔｉ、 Ｐ、 Ｌ、 Ｐｒｅｎｃｉｐｅ、およびａ、
Ｂｅｒｔｉ、 Ｃ１ｎ１ｃｌｌ （’ｈｅｍｉｅｔｒｙ
（１９８６年）第２９巻第１４９４頁〜第１４９６頁
； Ｔａｎｇａｎｅｌｌｉ、 Ｅ、、 Ｌ、 Ｐｒｅｎ
ｚｉｐ、Ｄ、 Ｂａ５ｓｉ、 ｓ、 Ｃａｍｂｉａｇｈ
ｉ、およびＥ、 Ｍｕｒａｄｏｒ、 Ｃ１１ｎｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｓｔｒｙ （１９８３年）第２８巷、第１４
６１負〜第１４６４頁）ニジかしこれらはことごとく、
反応の中間生成物としてクレアチン（Ｗａｈｌｅｆｅｌ
ｄ 守； Ｆｏｓｅａｔｉ 等）またはアン七〇ア（Ｔ
ａｎｇａｎｅｌｌｉ等）を経て進行し、これらの物質が
はじめからクレアチニンに比して明らかに重要な変化帳
度で分析すべき血清ないしは尿試料中に添加されて（・
るという欠点を有する。
は既に若干の方法が公知である（Ｗａｈ’１ｅｆｅｌｄ
、 Ａ、Ｗ、 、 Ｇ、 Ｈｏ１ｚおよびＨ，Ｕ、 Ｂ
ｅｒｇｍｅｙｅｒ、 ｉｎ ｌ（、Ｕ、 Ｂｅｒｇｍｅ
ｙｅｒ ： Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ ｅｎｚｙｍａ
ｔｉｓｃｈｅｎ Ａｎａｌｙｓｅ、 ｇ ３版、第■巻
、Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ、 Ｗｅｉｎｈｅｉｍ
１９７４年、第１８６４頁〜繁１８３８負、Ｆｏｓｓａ
ｔｉ、 Ｐ、 Ｌ、 Ｐｒｅｎｃｉｐｅ、およびａ、
Ｂｅｒｔｉ、 Ｃ１ｎ１ｃｌｌ （’ｈｅｍｉｅｔｒｙ
（１９８６年）第２９巻第１４９４頁〜第１４９６頁
； Ｔａｎｇａｎｅｌｌｉ、 Ｅ、、 Ｌ、 Ｐｒｅｎ
ｚｉｐ、Ｄ、 Ｂａ５ｓｉ、 ｓ、 Ｃａｍｂｉａｇｈ
ｉ、およびＥ、 Ｍｕｒａｄｏｒ、 Ｃ１１ｎｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｓｔｒｙ （１９８３年）第２８巷、第１４
６１負〜第１４６４頁）ニジかしこれらはことごとく、
反応の中間生成物としてクレアチン（Ｗａｈｌｅｆｅｌ
ｄ 守； Ｆｏｓｅａｔｉ 等）またはアン七〇ア（Ｔ
ａｎｇａｎｅｌｌｉ等）を経て進行し、これらの物質が
はじめからクレアチニンに比して明らかに重要な変化帳
度で分析すべき血清ないしは尿試料中に添加されて（・
るという欠点を有する。
従って、クレアチニン測定のためには、２つの別個のま
たは直列に接続された反応バッチによる差異測定即ちま
ず遊離クレアチンなし・しはアンモニアを測定し、第二
にクレアチニン−アミドヒドロラーゼ（Ｋ、ｃ、５．５
．２．１０）またはクレアチニン−イミノヒドロラーゼ
（＝クレアチニンーデイミナーゼ）の添加により付加的
にクレアチニンから形成したクレアチンないしはアンモ
ニアの量を知ることが必要である（ ’ Ｐｒｏｂｅ
／ Ｐｒｏｂｅｎｌｅｅｒｗｅｒｔ法“またはＥ１／Ｂ
２２法）。このような方法は、手動的実施のため比較的
費用がかかりかつ殊に複分解反応の完全な進行のために
長し・保温時間が必要である場合に非′ｌｖ忙制限され
目動的分析装置に使用しうるにすぎない。実際に、大体
にお℃・て反応条件の適当な選択によって、いわゆる動
的固定時間法（ｋｉｎｅｔｉｓｃｈｅ ’ ｆｉｘｅｄ
−ｔｉｍｅ “ｖｅｒｆａｈｒｅｎ ）における試料盲
検値測定を回避するため公知酵素的方法を用いてクレア
チニン測定を実施することはできるが：しかしこれは定
義された温度条件下で測定時点の極めて正確な維持を必
要とし、このことは十分な精度では自動分析装置でしか
成功せず、反対に手動情作を完全に排除する。
たは直列に接続された反応バッチによる差異測定即ちま
ず遊離クレアチンなし・しはアンモニアを測定し、第二
にクレアチニン−アミドヒドロラーゼ（Ｋ、ｃ、５．５
．２．１０）またはクレアチニン−イミノヒドロラーゼ
（＝クレアチニンーデイミナーゼ）の添加により付加的
にクレアチニンから形成したクレアチンないしはアンモ
ニアの量を知ることが必要である（ ’ Ｐｒｏｂｅ
／ Ｐｒｏｂｅｎｌｅｅｒｗｅｒｔ法“またはＥ１／Ｂ
２２法）。このような方法は、手動的実施のため比較的
費用がかかりかつ殊に複分解反応の完全な進行のために
長し・保温時間が必要である場合に非′ｌｖ忙制限され
目動的分析装置に使用しうるにすぎない。実際に、大体
にお℃・て反応条件の適当な選択によって、いわゆる動
的固定時間法（ｋｉｎｅｔｉｓｃｈｅ ’ ｆｉｘｅｄ
−ｔｉｍｅ “ｖｅｒｆａｈｒｅｎ ）における試料盲
検値測定を回避するため公知酵素的方法を用いてクレア
チニン測定を実施することはできるが：しかしこれは定
義された温度条件下で測定時点の極めて正確な維持を必
要とし、このことは十分な精度では自動分析装置でしか
成功せず、反対に手動情作を完全に排除する。
クレアチンまたはアンモニアとは異なり、１−メチルヒ
ダントイン（１Ｎ−メチルヒダントイン“、 ’ ＮＭ
Ｈ”）は、血清または尿の天然の成分ではなく；従って
中間生成物として１−メチルヒダントインを経過するク
レアチニン測定か、もしくは場合により後接された指示
薬反応が同様に、血清または尿中にかなりの濃度で出現
する物質を経過しなし・ことを前提として、この場合に
試料盲検値測定を省略しつると（・う著し℃・利点を提
供した。
ダントイン（１Ｎ−メチルヒダントイン“、 ’ ＮＭ
Ｈ”）は、血清または尿の天然の成分ではなく；従って
中間生成物として１−メチルヒダントインを経過するク
レアチニン測定か、もしくは場合により後接された指示
薬反応が同様に、血清または尿中にかなりの濃度で出現
する物質を経過しなし・ことを前提として、この場合に
試料盲検値測定を省略しつると（・う著し℃・利点を提
供した。
従って、その定検的測定、とくに光度測定による測定が
他の血Ｙ＃または尿成分の同時的検出なしに可能な１−
メチルヒダントインの酵素的分析剤および分析方法の必
要が生じた。
他の血Ｙ＃または尿成分の同時的検出なしに可能な１−
メチルヒダントインの酵素的分析剤および分析方法の必
要が生じた。
問題点を解決するための手段
この課題は、本発明によれば、１−メチルヒダントイン
を少なくとも１つのヌクレオシドトリホスフェート、と
くにアデノシン−５７−トリ＊スフｘ −） （ＡＴＰ
）、多１曲金属イオン、トくにＭｇ またはＭｎ”ｆ
、Ｈらびに場合によりアンモニウム塩の存在で加水分解
しうるｌＪｒ規で従来未知の酵素を見出すことによって
解決される。
を少なくとも１つのヌクレオシドトリホスフェート、と
くにアデノシン−５７−トリ＊スフｘ −） （ＡＴＰ
）、多１曲金属イオン、トくにＭｇ またはＭｎ”ｆ
、Ｈらびに場合によりアンモニウム塩の存在で加水分解
しうるｌＪｒ規で従来未知の酵素を見出すことによって
解決される。
文献には実際に、種々の出所からのゝゝヒダントイナー
ゼ”（ヒドロビリミシン加水分解酵素、ｎ、ｃ、３．５
．２．２）によるヒダントインの種々の酵素的加水分解
が既に記載されて℃・るが、有効性は従来非置換ヒダン
トイン（Ｗａｌｌａｃｈ、 Ｄ、 Ｐ、、およびＳ、
Ｇｒｉｓｏｌｉａ、 Ｊ、 Ｅｉｏｌ Ｃｈｅｍｉ、
（１９５７年）第２２６巻第２７７負〜第２８８頁）な
し・しは５位に置換基を有するヒダントイン（西ドイツ
国特許出願公告第２６６１０４８号；西ドイツ国特許出
願公告第２８１１６０６号明細書； ０１ｉｖｉｅｒｉ
°、 Ｒ，、Ｅ、 Ｆａｓｃｅｔｔｉ、 Ｌ、 Ａｎｇ
ｅｌｉｎｉおよびり、 Ｄｅｇｅｎ、 Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎ。
ゼ”（ヒドロビリミシン加水分解酵素、ｎ、ｃ、３．５
．２．２）によるヒダントインの種々の酵素的加水分解
が既に記載されて℃・るが、有効性は従来非置換ヒダン
トイン（Ｗａｌｌａｃｈ、 Ｄ、 Ｐ、、およびＳ、
Ｇｒｉｓｏｌｉａ、 Ｊ、 Ｅｉｏｌ Ｃｈｅｍｉ、
（１９５７年）第２２６巻第２７７負〜第２８８頁）な
し・しは５位に置換基を有するヒダントイン（西ドイツ
国特許出願公告第２６６１０４８号；西ドイツ国特許出
願公告第２８１１６０６号明細書； ０１ｉｖｉｅｒｉ
°、 Ｒ，、Ｅ、 Ｆａｓｃｅｔｔｉ、 Ｌ、 Ａｎｇ
ｅｌｉｎｉおよびり、 Ｄｅｇｅｎ、 Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎ。
１ｏｇｙ ａｎｃｌ Ｂｉｕｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
（１９８１年）第２３巻＃ｆ２１７３頁〜第２１８６員
）に対して示確認されなかった；ワラツバ（Ｗａｌｌａ
ｃｈ ）等により記載された酵素はヒダントインの加水
分解のために、たとえば多価金属イオンの添加をも必要
とせす、オリビニＩＪ （０１ｉｖｉｅｒｉ ） 等（
１”）研の明瞭な阻止が立証されるが、本発明による酵
素の活性はアンモニウムイオンの添加によってむしろ明
瞭に上昇させることができる。
（１９８１年）第２３巻＃ｆ２１７３頁〜第２１８６員
）に対して示確認されなかった；ワラツバ（Ｗａｌｌａ
ｃｈ ）等により記載された酵素はヒダントインの加水
分解のために、たとえば多価金属イオンの添加をも必要
とせす、オリビニＩＪ （０１ｉｖｉｅｒｉ ） 等（
１”）研の明瞭な阻止が立証されるが、本発明による酵
素の活性はアンモニウムイオンの添加によってむしろ明
瞭に上昇させることができる。
本発明による酵素の出現、単離および性質ならびに１−
メチルヒダントインないしはクレアチニンの測定のため
のその使用は、下記に詳述されて（・る。
メチルヒダントインないしはクレアチニンの測定のため
のその使用は、下記に詳述されて（・る。
本発明による新規酵素１−メチルヒダントイナーゼは広
く微生物中に出現するものと思われる。それで、このも
のはブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ’
ｕｍ ） 属の微生物モラクセラ（ＭａｒａＸｅｌｌａ
）％ ミクロコツカスおよびアルスロバクタ−（Ａｒｔ
ｈｒｏｂａｃｔθｒ）中に見出すことができた。後処理
で本発明による酵素の金蓋が確認されたこの属の菌株の
例は、アルスロバクタ−スペック、ＤＳＭ２５６３．Ｄ
ＳＭ２５６４、モラクセラ スペック、ＤＳＭ２５６２
、ミクロコックススペック、ＤＳＭ２５６５またはブレ
ビバクテリウムスペック、ＤＳＭ２８４３である。
く微生物中に出現するものと思われる。それで、このも
のはブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ’
ｕｍ ） 属の微生物モラクセラ（ＭａｒａＸｅｌｌａ
）％ ミクロコツカスおよびアルスロバクタ−（Ａｒｔ
ｈｒｏｂａｃｔθｒ）中に見出すことができた。後処理
で本発明による酵素の金蓋が確認されたこの属の菌株の
例は、アルスロバクタ−スペック、ＤＳＭ２５６３．Ｄ
ＳＭ２５６４、モラクセラ スペック、ＤＳＭ２５６２
、ミクロコックススペック、ＤＳＭ２５６５またはブレ
ビバクテリウムスペック、ＤＳＭ２８４３である。
従って、本発明による酵素は有利に、上述した微生物の
１つを培養し、バイオマスまたは／および培地から酵素
を単離することにより得られる。
１つを培養し、バイオマスまたは／および培地から酵素
を単離することにより得られる。
新規酵素の下記特性が確認された：
１、分子量
ａ） ８ＤＳ−勾、配デル電気泳動法Ｍｒ ＝ １２５
００ ２、至適Ｐ１］： μＩ＝７．８ 活性（％）、２５℃ ｐＨ−６，５７，０７，５８，０８，５９，０ＴＥＳ−
緩衝液 ５ ７６１００１００ ９５ ６９１５０ミリ
モル／１ ＴＲＩＳ−緩衝液 １ ２６ ６０ ５２ ３８ １９
１５０ミリ９しルシ／１ ６、特異性： 活性率％（ＡＤＰ ／ピルベートキナーゼ／ラクテート
デヒドロゲナーゼ） ａ）基質（それぞれ０．１ ミＩＪモル／１反応混合物
中の最終濃度） 基質特異性の測定のために次のように実施した： １、基礎試薬 燐酸カリウム（ｐＨ８，０） ７５ミリモル／１ＮＡＤ
Ｈ０，２５ミリモル／１ ＡＴＰ １．３０ミリモル／ｌ ホスホエノールビルベー） ０．４２ミリモルｉ１Ｍｇ
ｃｔ２ ２．００ミリモル／／ ピルベートーキナーゼ ４ Ｕ ／ｍｌラクテートーデ
ヒドロデナーゼ １０Ｕ／ｍＪ２．１−メチルヒダント
イプーゼ（１５Ｕ／ｍｌ’５０ ％グリセリン、２０ミ
リモル／ｌトリス・Ｈ（Ｊ緩衝液、ｐｉ（８，０） ６、 ヒダントイン溶液 ヒダントインの濃度（１−メチルヒダントイン、ヒダン
トイン、５−メチルヒダントインならびに５．５−ジメ
チルヒダントイン）：それぞれ０．６ミリモル／１Ｈ２
０ ４、試験の実施 波長３６５ｎｍ：Ｔ＝２５℃、ｄ ＝ １ ｃｍ ：試
験量１．２１Ｍ、タペット中にピペットで秤取混合し、
次℃・で添加 試料のＵ（△ＥＰ）および反応混合物盲検値（Δ−Ｌ） ５、種々のヒダントインを用いて測定した△Ｅ／ｍｉｎ
から、ΔＥ／ｍ１ｎ（１−メチルヒダントイン）＝１０
０ｑｂに関する相対的反応速度の計算次の結果が得られ
た： １ｒＨ３ Ｎ−ＣＨ２ ｂ）ヌクレオチド カルバモイルサルコシンアミドヒドロラーゼ＋サルコシ
ンオキシダーゼによる測定における相対的活性幅（ＡＴ
Ｐ＝１００） ＡＴＰ １００ ＡＤＰ Ｉ ＧＴＰ ７ ＣＴＰ １・５ ＴＴＰ ０ ＵＴＰ ０ ＰＰｉ Ｏ カルブ−ホスフェート ０ トリポリ燐酸Ｎａ Ｏ ヘキサメタ燐酸Ｎａ ０ ４、金属イオン依存性 相対的活性％（５ミリモル／ｌ塩化マグネシウム＝１０
０） Ｄ Ｍｇｃｌ１２１７ ８３ １００ ５ ＭｎＣＪ２ ６０ ５ ＺｎＣｌ２ ２４ ５、活性化剤 すぐれているものＮＨ，”、相対的活性チ（６０ミリモ
ルフ１ Ａｓ’＝１００） 活性化剤物質 ミリモル／ｌ ％ なし ０４４ （ＮＨ４）２ＳＯ４６０１ＤＯ 〃１０ ９５ ｘＨ，ｃｔ ３０ ９１ Ｌｉ２ＳＯ４３０４Ｏ Ｎａ２Ｅ１０４ ３０ ３９ に２ＳＯ４３０５９ ＮａＣ１３０４１ ＮａＨＣＯ３３０４０ ６、抑制剤 すぐれているものＥｉＤＴＡ 、 、ＮａＦＮａＦ ：
Ｉ Ｘ １０−にモル／ｌ １００％阻止ＥＤＴＡ−
明止：” ミリモル／ｌ 相対的活性幅０ １００ ５ １００ １０ ４２ ５０ ２ ”反応混合物中Ｍｇ廿７．５ ミＩＪモル存在Ｚミヒャ
ーエルス定数 ＫｍＡＴＰ （ｒｚｓ ０．１５モル／ １３ 、 ｐ
）Ｉ ７．８ ：サルコシンによる） ： ０．８ミリ
モル／ ｌｊ Ｋｍ ”１−メチルヒダントイン（０，
１５モル／ ｌ ＴＥＳ 。
００ ２、至適Ｐ１］： μＩ＝７．８ 活性（％）、２５℃ ｐＨ−６，５７，０７，５８，０８，５９，０ＴＥＳ−
緩衝液 ５ ７６１００１００ ９５ ６９１５０ミリ
モル／１ ＴＲＩＳ−緩衝液 １ ２６ ６０ ５２ ３８ １９
１５０ミリ９しルシ／１ ６、特異性： 活性率％（ＡＤＰ ／ピルベートキナーゼ／ラクテート
デヒドロゲナーゼ） ａ）基質（それぞれ０．１ ミＩＪモル／１反応混合物
中の最終濃度） 基質特異性の測定のために次のように実施した： １、基礎試薬 燐酸カリウム（ｐＨ８，０） ７５ミリモル／１ＮＡＤ
Ｈ０，２５ミリモル／１ ＡＴＰ １．３０ミリモル／ｌ ホスホエノールビルベー） ０．４２ミリモルｉ１Ｍｇ
ｃｔ２ ２．００ミリモル／／ ピルベートーキナーゼ ４ Ｕ ／ｍｌラクテートーデ
ヒドロデナーゼ １０Ｕ／ｍＪ２．１−メチルヒダント
イプーゼ（１５Ｕ／ｍｌ’５０ ％グリセリン、２０ミ
リモル／ｌトリス・Ｈ（Ｊ緩衝液、ｐｉ（８，０） ６、 ヒダントイン溶液 ヒダントインの濃度（１−メチルヒダントイン、ヒダン
トイン、５−メチルヒダントインならびに５．５−ジメ
チルヒダントイン）：それぞれ０．６ミリモル／１Ｈ２
０ ４、試験の実施 波長３６５ｎｍ：Ｔ＝２５℃、ｄ ＝ １ ｃｍ ：試
験量１．２１Ｍ、タペット中にピペットで秤取混合し、
次℃・で添加 試料のＵ（△ＥＰ）および反応混合物盲検値（Δ−Ｌ） ５、種々のヒダントインを用いて測定した△Ｅ／ｍｉｎ
から、ΔＥ／ｍ１ｎ（１−メチルヒダントイン）＝１０
０ｑｂに関する相対的反応速度の計算次の結果が得られ
た： １ｒＨ３ Ｎ−ＣＨ２ ｂ）ヌクレオチド カルバモイルサルコシンアミドヒドロラーゼ＋サルコシ
ンオキシダーゼによる測定における相対的活性幅（ＡＴ
Ｐ＝１００） ＡＴＰ １００ ＡＤＰ Ｉ ＧＴＰ ７ ＣＴＰ １・５ ＴＴＰ ０ ＵＴＰ ０ ＰＰｉ Ｏ カルブ−ホスフェート ０ トリポリ燐酸Ｎａ Ｏ ヘキサメタ燐酸Ｎａ ０ ４、金属イオン依存性 相対的活性％（５ミリモル／ｌ塩化マグネシウム＝１０
０） Ｄ Ｍｇｃｌ１２１７ ８３ １００ ５ ＭｎＣＪ２ ６０ ５ ＺｎＣｌ２ ２４ ５、活性化剤 すぐれているものＮＨ，”、相対的活性チ（６０ミリモ
ルフ１ Ａｓ’＝１００） 活性化剤物質 ミリモル／ｌ ％ なし ０４４ （ＮＨ４）２ＳＯ４６０１ＤＯ 〃１０ ９５ ｘＨ，ｃｔ ３０ ９１ Ｌｉ２ＳＯ４３０４Ｏ Ｎａ２Ｅ１０４ ３０ ３９ に２ＳＯ４３０５９ ＮａＣ１３０４１ ＮａＨＣＯ３３０４０ ６、抑制剤 すぐれているものＥｉＤＴＡ 、 、ＮａＦＮａＦ ：
Ｉ Ｘ １０−にモル／ｌ １００％阻止ＥＤＴＡ−
明止：” ミリモル／ｌ 相対的活性幅０ １００ ５ １００ １０ ４２ ５０ ２ ”反応混合物中Ｍｇ廿７．５ ミＩＪモル存在Ｚミヒャ
ーエルス定数 ＫｍＡＴＰ （ｒｚｓ ０．１５モル／ １３ 、 ｐ
）Ｉ ７．８ ：サルコシンによる） ： ０．８ミリ
モル／ ｌｊ Ｋｍ ”１−メチルヒダントイン（０，
１５モル／ ｌ ＴＥＳ 。
ｐＨ７，８； ＡＤＰによる） ： ０．０２ミリモル
／１８、安定性 ａ）温度安定性＝５０％グリセリン中；２０ミリモル／
ＩＩ）リス、ｐＨ８，０（２υ／ｍｉ）６０分 残留活
性係 ２５℃ １００ ５０℃ ９４ ６０℃ ・７０ ７０℃ Ｏ ｂ） ｐＨ安定性 ２０％グリセリン、１０ミリモル／ｌトリス、０．２Ｕ
／ｍｌ、＋４℃、３日間暗所で保存（出発１直−１００
％ ） ｐｌ（残留活性係 ６．３８ ６．５ ２０ ７．０ ６１ ８．０ ７２ ９．０ ８６ 問題点を解決するための手段（ｎ） 本発明による酵素は、後処理のしがいのある１−メチル
ヒダントイナーゼの含量を有する微生物から、酵素を精
製するための自体公知の方法により得ることができる。
／１８、安定性 ａ）温度安定性＝５０％グリセリン中；２０ミリモル／
ＩＩ）リス、ｐＨ８，０（２υ／ｍｉ）６０分 残留活
性係 ２５℃ １００ ５０℃ ９４ ６０℃ ・７０ ７０℃ Ｏ ｂ） ｐＨ安定性 ２０％グリセリン、１０ミリモル／ｌトリス、０．２Ｕ
／ｍｌ、＋４℃、３日間暗所で保存（出発１直−１００
％ ） ｐｌ（残留活性係 ６．３８ ６．５ ２０ ７．０ ６１ ８．０ ７２ ９．０ ８６ 問題点を解決するための手段（ｎ） 本発明による酵素は、後処理のしがいのある１−メチル
ヒダントイナーゼの含量を有する微生物から、酵素を精
製するための自体公知の方法により得ることができる。
有利に、微生物を分解し、ポリエチレンイミンの添加に
よって酵製 素を沈殿させる。こうして酵素製剤を〆出し、これは既
に分析の目的に使用できる。さらＫ［製することが望ま
しい場合には、有利に硫酸アンモニウム分別、加熱工程
ならびにクロマトグラフィーが適用される。
よって酵製 素を沈殿させる。こうして酵素製剤を〆出し、これは既
に分析の目的に使用できる。さらＫ［製することが望ま
しい場合には、有利に硫酸アンモニウム分別、加熱工程
ならびにクロマトグラフィーが適用される。
微生物の分解は、自体公知の化学的または物理的方法に
従い、たとえば化学的にリゾチームを用いるかまたは物
理的に超音波、高圧懸濁液中での分解等によって行なわ
れる。分解法は重要ではない。しかしとくに適当なのは
、細胞膜を十分に溶解するような方法である。
従い、たとえば化学的にリゾチームを用いるかまたは物
理的に超音波、高圧懸濁液中での分解等によって行なわ
れる。分解法は重要ではない。しかしとくに適当なのは
、細胞膜を十分に溶解するような方法である。
加熱工程は有利に５０℃で、酵素が良好な安定性を有す
る…範囲内で行なわれる。
る…範囲内で行なわれる。
クロマトグラフィー４４を製には、殊にフェニルセフア
ロースおよびＤＥＡＥ基を有する弱塩基性の陰イオン交
換体が有利であることが立証されでのりゾチームー解、
可溶性ポリエチレンイミンの添加による沈殿、それの沈
殿物の収得、硫酸アンモニウム分別、５０℃、ｐＨ８に
おける加熱処理の実施、フェニルセファロースによるク
ロマトグラフィー、Ｄ］１ＡＥ−セファセル（８ｅｐｈ
ａｃθ１■）によるクロマトグラフィー、引続く有利に
七フアクリル（５ｅｐｈａｃｒｙｉ■）８２００による
分子篩分別である。こうして・ ２・１メ値／タンパク
賀１ｒｎ９の比活性を有する純粋な酵素製剤が得られ、
これで酵素の性貴を迎１定することができる。
ロースおよびＤＥＡＥ基を有する弱塩基性の陰イオン交
換体が有利であることが立証されでのりゾチームー解、
可溶性ポリエチレンイミンの添加による沈殿、それの沈
殿物の収得、硫酸アンモニウム分別、５０℃、ｐＨ８に
おける加熱処理の実施、フェニルセファロースによるク
ロマトグラフィー、Ｄ］１ＡＥ−セファセル（８ｅｐｈ
ａｃθ１■）によるクロマトグラフィー、引続く有利に
七フアクリル（５ｅｐｈａｃｒｙｉ■）８２００による
分子篩分別である。こうして・ ２・１メ値／タンパク
賀１ｒｎ９の比活性を有する純粋な酵素製剤が得られ、
これで酵素の性貴を迎１定することができる。
酵素を得るための微生物は、有利に、炭素源および窒素
諒として１−メチルヒダントインをビタミンおよび痕跡
金属とともに含有する培養基上で培養する。
諒として１−メチルヒダントインをビタミンおよび痕跡
金属とともに含有する培養基上で培養する。
本発明のもう１つの対象は、緩衝せる水溶液中のクレア
チニンを測定するため、クレアチニンをクレアチニンデ
イミナーゼＥ、 Ｃ，３，５゜４．２１で１−メチルヒ
ダントインに変え、これを有利に過剰に存在するヌクレ
オシドトリホスフェートおよび多価金属イオンの存在で
１−メチルヒダントイナーゼを用いて加水分解し、ａ）
１−メチルヒダントインから形成した加水分解生成物
をＮ−カルバモイルサルコシンアミドヒドロラーゼを用
いてサルコシンの形成下に測定し、サルコシンをサルコ
シンオキシダーゼまたはサルコシンヂヒドロデナーゼを
用いて検出するか、またはｂ）同時に形成したヌクレオ
シドジホスフェートを測定する、クレアチニンの測定法
である。
チニンを測定するため、クレアチニンをクレアチニンデ
イミナーゼＥ、 Ｃ，３，５゜４．２１で１−メチルヒ
ダントインに変え、これを有利に過剰に存在するヌクレ
オシドトリホスフェートおよび多価金属イオンの存在で
１−メチルヒダントイナーゼを用いて加水分解し、ａ）
１−メチルヒダントインから形成した加水分解生成物
をＮ−カルバモイルサルコシンアミドヒドロラーゼを用
いてサルコシンの形成下に測定し、サルコシンをサルコ
シンオキシダーゼまたはサルコシンヂヒドロデナーゼを
用いて検出するか、またはｂ）同時に形成したヌクレオ
シドジホスフェートを測定する、クレアチニンの測定法
である。
生成する加水分解生成物は、反応速度および後接された
、Ｎ−カルバモイルサルコシンアミドヒドロラーゼを用
℃・る指示薬反応における測定信号の高さに関して、１
−メチルヒダントインの代りに等モル量のＮ−カルバモ
イルサルコシンを添加した反応バッチと実際に全く同じ
に挙動する（第２図および第３図参照）。
、Ｎ−カルバモイルサルコシンアミドヒドロラーゼを用
℃・る指示薬反応における測定信号の高さに関して、１
−メチルヒダントインの代りに等モル量のＮ−カルバモ
イルサルコシンを添加した反応バッチと実際に全く同じ
に挙動する（第２図および第３図参照）。
緩衝せる水溶液のＰＨ１１ｆＩＩは、有利にｐＨ７，０
と９゜０の間、とくにｐＨ７，３とｐＨ８，５の間、殊
にＰＨ７゜５とｐＨ８，２の間である。ＰＩ−１ｆＩｆ
ｌＩを調節するためには、上記ｐｉ（範囲内で十分な緩
衝力を有する物置、たとえばホスフェート、トリス、ト
リエタノールアミンまたはＴＢＳが挙げられる。殊にＴ
ＢＳ緩衝剤が有利である。緩衝剤の濃度は一般ＶＣ１０
〜５００ ミＩＪ モに／ ｌｊ、とくに５ｏ〜２ｏｏ
ミリモル／ｌの間、とくに有利に７５〜１２５ミリモル
／ｌの間である。
と９゜０の間、とくにｐＨ７，３とｐＨ８，５の間、殊
にＰＨ７゜５とｐＨ８，２の間である。ＰＩ−１ｆＩｆ
ｌＩを調節するためには、上記ｐｉ（範囲内で十分な緩
衝力を有する物置、たとえばホスフェート、トリス、ト
リエタノールアミンまたはＴＢＳが挙げられる。殊にＴ
ＢＳ緩衝剤が有利である。緩衝剤の濃度は一般ＶＣ１０
〜５００ ミＩＪ モに／ ｌｊ、とくに５ｏ〜２ｏｏ
ミリモル／ｌの間、とくに有利に７５〜１２５ミリモル
／ｌの間である。
ヌクレオシＰトリホスフェートとしてはＡＴＰまたはＧ
ＴＰが埜げられ： ＡＴＰがすぐれている。
ＴＰが埜げられ： ＡＴＰがすぐれている。
この場合、濃度範囲は有利に０．０５〜５０ Ｓ ＩＪ
モル／ｌの間、とくに０．５〜２０ミリモル／ｌの間、
殊に有利に１〜１０ミリモル／ｌの間である。
モル／ｌの間、とくに０．５〜２０ミリモル／ｌの間、
殊に有利に１〜１０ミリモル／ｌの間である。
多価金属イオンとしては、有利に２価の金属イオンが使
用され二殊に有利にＭｇイオンおよびＭｎイオン、殊に
ＭｇＣ／２またはＭｇ８０４ ノようなその水溶性塩（
またはＭｇアスパルテート）の形のＭｇイオンが使用さ
れる。この場合、金属イオンの謎度は、有利に０．１〜
５０ミリモル／ｌ、 とくに０．５〜２０ミリモル／ｌ
、殊に有利には１〜１０ミリモル／ｌの間にある。
用され二殊に有利にＭｇイオンおよびＭｎイオン、殊に
ＭｇＣ／２またはＭｇ８０４ ノようなその水溶性塩（
またはＭｇアスパルテート）の形のＭｇイオンが使用さ
れる。この場合、金属イオンの謎度は、有利に０．１〜
５０ミリモル／ｌ、 とくに０．５〜２０ミリモル／ｌ
、殊に有利には１〜１０ミリモル／ｌの間にある。
反応混合物１−あたり、普通０．０１〜１０Ｕ、殊に０
．０５〜２Ｕ、有利に０．１〜Ｉ Ｕ（７）１−メチル
ヒダントイナーゼが使用される。
．０５〜２Ｕ、有利に０．１〜Ｉ Ｕ（７）１−メチル
ヒダントイナーゼが使用される。
１−メチルヒダントイナーゼの活性増加のたメニハ、ア
ンモニウム塩の添加が有利であることが立証された；こ
の場合態度は有利には０．１〜１００ミリモル／ｌ、有
利に１〜３ｏミリモル／１１殊に５〜１０ミリモル／ｌ
の間にある。
ンモニウム塩の添加が有利であることが立証された；こ
の場合態度は有利には０．１〜１００ミリモル／ｌ、有
利に１〜３ｏミリモル／１１殊に５〜１０ミリモル／ｌ
の間にある。
クレアチニン−イミノヒドロラーゼは、有利ニＯ−１〜
２０Ｕ／ｍＪ、とくに０．０５〜１５Ｕ／１１殊に１〜
１０Ｕ／ｌ！で使用される。
２０Ｕ／ｍＪ、とくに０．０５〜１５Ｕ／１１殊に１〜
１０Ｕ／ｌ！で使用される。
ＩＪ−カルバモイルサルコシンアミドヒドロラーゼに対
しては、０．１〜２０ Ｕ ／ｍｌ、有利に０゜５〜１
０ｔｒ／ｍ、殊に１〜５Ｕ／ｍ／の活性濃度にあてはま
る。
しては、０．１〜２０ Ｕ ／ｍｌ、有利に０゜５〜１
０ｔｒ／ｍ、殊に１〜５Ｕ／ｍ／の活性濃度にあてはま
る。
サルコシンオキシダーゼに対する有利な範囲は、１〜２
Ｑ Ｕ／ｍＡ！、殊に２〜１ｏＵ／ｍｌ、と（Ｋ有利
には４〜８Ｕ／ｍｌである。同じことは使用可能なサル
コシンデヒドロゲナーゼについても言える。
Ｑ Ｕ／ｍＡ！、殊に２〜１ｏＵ／ｍｌ、と（Ｋ有利
には４〜８Ｕ／ｍｌである。同じことは使用可能なサル
コシンデヒドロゲナーゼについても言える。
サルコシンオキシダーゼまたはサルコシンデヒドロゲナ
ーゼを用いるサルコシンの検出は公知であり、このため
に記載されかつ当業者に公知の条件は本発明の範囲内で
も適している。同じことは、形成したヌクレオシドジホ
スフェート、つまりＡＤＰまたはＧＤＰの検出について
もあてはまる。このためにも、公知の方法ないしは試薬
を使用することができる。
ーゼを用いるサルコシンの検出は公知であり、このため
に記載されかつ当業者に公知の条件は本発明の範囲内で
も適している。同じことは、形成したヌクレオシドジホ
スフェート、つまりＡＤＰまたはＧＤＰの検出について
もあてはまる。このためにも、公知の方法ないしは試薬
を使用することができる。
形成したサルコシンを検出するためには、公知のサルコ
シンオキシダーゼ反応の使用がとく眞有利である。サル
コシン酸化の経過は電気化学的に反応媒体中の０２消費
量またはＲ２０２形成によって追究するかまたは有利に
酵素的にＨ２Ｏ２またはホルムアルデヒドの形成によっ
て追究することができる。とくに有利に、Ｈ２Ｏ２の測
定は測光的に、しかも殊に２＋ Ｃ６−トリブロム−６
−ヒドロキシ安息香酸と４−アミノアンチピリンとの酸
化的カップリング妊よるペルオキシダーゼ接触の呈色反
応で行なわれる。この場合、ペルオキシダーゼ活性は０
．０５〜２０Ｕ／ ｍｌ 、有利に０．２〜１０ｕ／ｍ
、殊に０．５〜５Ｕ／１ｒＬｌである。トリブロムヒド
ロキシ安息香酸は、１〜２５ミリモル／ｌ、有利に２〜
２０ミリモル／１％殊に５〜１０ミリモル／ｌの濃度で
使用される。４−アミノアンチピリンに対しては０．１
〜２ミリモル／ｌ、有利に０．２〜１．５ミリモル／ｌ
、殊に０．５〜１ミリモル／ ｌ （１１１度が有利で
あることが立証された。しかし、Ｈ２Ｏ２またはホルム
アルデヒドを検出するための他の公知系も同様に使用す
ることができる。
シンオキシダーゼ反応の使用がとく眞有利である。サル
コシン酸化の経過は電気化学的に反応媒体中の０２消費
量またはＲ２０２形成によって追究するかまたは有利に
酵素的にＨ２Ｏ２またはホルムアルデヒドの形成によっ
て追究することができる。とくに有利に、Ｈ２Ｏ２の測
定は測光的に、しかも殊に２＋ Ｃ６−トリブロム−６
−ヒドロキシ安息香酸と４−アミノアンチピリンとの酸
化的カップリング妊よるペルオキシダーゼ接触の呈色反
応で行なわれる。この場合、ペルオキシダーゼ活性は０
．０５〜２０Ｕ／ ｍｌ 、有利に０．２〜１０ｕ／ｍ
、殊に０．５〜５Ｕ／１ｒＬｌである。トリブロムヒド
ロキシ安息香酸は、１〜２５ミリモル／ｌ、有利に２〜
２０ミリモル／１％殊に５〜１０ミリモル／ｌの濃度で
使用される。４−アミノアンチピリンに対しては０．１
〜２ミリモル／ｌ、有利に０．２〜１．５ミリモル／ｌ
、殊に０．５〜１ミリモル／ ｌ （１１１度が有利で
あることが立証された。しかし、Ｈ２Ｏ２またはホルム
アルデヒドを検出するための他の公知系も同様に使用す
ることができる。
″ １−メチルヒダントイナーゼはヌクレオシドホスフ
ェートを化学搦°論的にヌクレオシドジホスフェートに
変えるので、１−メチルヒダントインから形成した反応
生成物の測定に代えて、同時に形成したヌクレオシドジ
ホスフェート、殊にＡＤＰの測定をクレアチニン測冗の
基碇にすることができる。ＡＤＰ １１定の適当な方法
は、殊にベルクマイヤ−（Ｈ，Ｕ、 Ｂｅｒｇｍｅｙｅ
ｒ ト１メトーデン・デルのエンチマテイッシェンΦア
ナリューゼ（Ｍｅｔｈｏｄｅｗ ｄｅｒ ｅｎｚｙｍａ
ｔｉｓｃｈｅｎ Ａｎａｌｙθθ）“第６版（１９７１
年）第２１２８頁以降および２１７８頁以降から公知で
ある。従って、ここでは詳細な記載は不要である。
ェートを化学搦°論的にヌクレオシドジホスフェートに
変えるので、１−メチルヒダントインから形成した反応
生成物の測定に代えて、同時に形成したヌクレオシドジ
ホスフェート、殊にＡＤＰの測定をクレアチニン測冗の
基碇にすることができる。ＡＤＰ １１定の適当な方法
は、殊にベルクマイヤ−（Ｈ，Ｕ、 Ｂｅｒｇｍｅｙｅ
ｒ ト１メトーデン・デルのエンチマテイッシェンΦア
ナリューゼ（Ｍｅｔｈｏｄｅｗ ｄｅｒ ｅｎｚｙｍａ
ｔｉｓｃｈｅｎ Ａｎａｌｙθθ）“第６版（１９７１
年）第２１２８頁以降および２１７８頁以降から公知で
ある。従って、ここでは詳細な記載は不要である。
本発明のも５１つの対象は、１−メチルヒダントイナー
ゼを含有することを特徴とする、クレアチニン測定試薬
である。
ゼを含有することを特徴とする、クレアチニン測定試薬
である。
とくに、この試薬はクレアチニンデイミナーゼ、１−メ
チルヒダントイナーゼ、ＡＴＰまたはＧＴｐ、２価の金
属イオン、Ｎ−カルバモイルサルコシンアミドヒドロラ
ーゼ、サルコシンオキシダーゼまたはサルコシンデヒド
ロゲナーゼおよび緩衝剤ＰＨ７，Ｄ〜９．０を含有する
。
チルヒダントイナーゼ、ＡＴＰまたはＧＴｐ、２価の金
属イオン、Ｎ−カルバモイルサルコシンアミドヒドロラ
ーゼ、サルコシンオキシダーゼまたはサルコシンデヒド
ロゲナーゼおよび緩衝剤ＰＨ７，Ｄ〜９．０を含有する
。
試薬は、とくに付加的にＨ２Ｏ２またはホルムアルデヒ
ドの測定系またはたとえはサルコシンデヒドロゲナーゼ
反応を１１接可視的にするためのテトラゾリウム塩をも
含有する。これらの系は、たとえばベルクマイヤー（Ｈ
，Ｕ、 Ｂｅｒｇｍθｙｅｒ）著“メトーデンΦデル・
エンチマテイッシエン・アナリューゼ’ （Ｖｅｒｌａ
ｇ Ｃｈｅｍｉｅ、 Ｖｅｉｎｈｅｉｍ ）から公知で
ある。
ドの測定系またはたとえはサルコシンデヒドロゲナーゼ
反応を１１接可視的にするためのテトラゾリウム塩をも
含有する。これらの系は、たとえばベルクマイヤー（Ｈ
，Ｕ、 Ｂｅｒｇｍθｙｅｒ）著“メトーデンΦデル・
エンチマテイッシエン・アナリューゼ’ （Ｖｅｒｌａ
ｇ Ｃｈｅｍｉｅ、 Ｖｅｉｎｈｅｉｍ ）から公知で
ある。
上記成分のほかに、反応混合物はなお防腐剤、たとえば
ナトリウムアジド、トリグリセリドに濁 よって泗〆した試料を澄明にするための洗剤およびリパ
ーゼ、ならびに試料中のビリルビンまたはアスコルビン
酸によって惹起される、Ｉ（２０２検出反応の障害物を
除去するだめのアスコルベートオキシダーゼおよびフェ
ロシアン化カリウムのような助剤を含有しうる。反応混
合物を１−メチルヒダントインだけの測定に使用するた
めには、クレアチニンイミノヒドロラーゼを省略するこ
ともできる。
ナトリウムアジド、トリグリセリドに濁 よって泗〆した試料を澄明にするための洗剤およびリパ
ーゼ、ならびに試料中のビリルビンまたはアスコルビン
酸によって惹起される、Ｉ（２０２検出反応の障害物を
除去するだめのアスコルベートオキシダーゼおよびフェ
ロシアン化カリウムのような助剤を含有しうる。反応混
合物を１−メチルヒダントインだけの測定に使用するた
めには、クレアチニンイミノヒドロラーゼを省略するこ
ともできる。
本発明による試薬は、２価の金属イオンとして有利に殊
に、上記に既述したようにマグネシウムイオンまたはマ
ンガンイオンを含有する。
に、上記に既述したようにマグネシウムイオンまたはマ
ンガンイオンを含有する。
上記の反応成分は、多孔性の担持材料上に含浸して存在
し、従ってたとえばいわゆる試験紙を用いるクレアチニ
ンないしは１−メチルヒダントインの定ｉ−げｙ７；ｃ
いしは定性的測定を口」能にすることかできる。
し、従ってたとえばいわゆる試験紙を用いるクレアチニ
ンないしは１−メチルヒダントインの定ｉ−げｙ７；ｃ
いしは定性的測定を口」能にすることかできる。
（ｔ１７の有利な英頒ｊ例においては、本発明による試
薬はクレアチニンデイミナーゼ、１−メチルヒダントイ
ナーゼ、ＡＴＰまたはＧＴＰ、２・１曲の金属イオン、
殊にＭｇ４＋イオンまたはＭｎ”−イオン、ＡＩ）Ｐま
たはＧＤＰ ＋ａｌｌ定糸およびＡｆＬ側創ｐｉ（７，
（Ｊ〜９゜０を含有する。
薬はクレアチニンデイミナーゼ、１−メチルヒダントイ
ナーゼ、ＡＴＰまたはＧＴＰ、２・１曲の金属イオン、
殊にＭｇ４＋イオンまたはＭｎ”−イオン、ＡＩ）Ｐま
たはＧＤＰ ＋ａｌｌ定糸およびＡｆＬ側創ｐｉ（７，
（Ｊ〜９゜０を含有する。
さらにこの場合、緩仙工首１］としては燐酸カリウム緩
衝剤が有利であり：緩衝剤、クレアチニンイミナーゼ、
１−メチルヒダントイナーゼ、ＡＴＰ、Ｍｇ＋イオンま
たは１．Ａｎ＋Ｆイオンならびに場合によりアンモニウ
ム塩のν度につ℃・ては上記の記載が同様にあてはまる
。
衝剤が有利であり：緩衝剤、クレアチニンイミナーゼ、
１−メチルヒダントイナーゼ、ＡＴＰ、Ｍｇ＋イオンま
たは１．Ａｎ＋Ｆイオンならびに場合によりアンモニウ
ム塩のν度につ℃・ては上記の記載が同様にあてはまる
。
ＡＤＰ検出はとくに、ホスホエノールピルベートおよび
ＮＡＤ）（の存在におけるピルベート・キナーゼ／ラク
テートデヒドロゲナーゼの組合せ反応を用いて行なわれ
、その際形成したＡＤＰのにおけるＮＡＤＨ消費量によ
って￥！！握される。この方法は、当業者には公知であ
り、従ってここで詳述する必要はな℃・。
ＮＡＤ）（の存在におけるピルベート・キナーゼ／ラク
テートデヒドロゲナーゼの組合せ反応を用いて行なわれ
、その際形成したＡＤＰのにおけるＮＡＤＨ消費量によ
って￥！！握される。この方法は、当業者には公知であ
り、従ってここで詳述する必要はな℃・。
反応混合物を１−メチルヒダントインだけの測定に使用
するためには、クレアチニンイミノヒドロラーゼを省略
することもできる。
するためには、クレアチニンイミノヒドロラーゼを省略
することもできる。
実施例
下記の略語および記号を使用する：
ＡＳ： 硫酸アンモニウム
Ｃａｒｂ−ホスフェート： カルバミルホス７エート
ミノヒドロラーゼ
クレアチニン測定試薬へゼ： クレアチニン−イミノヒ
ドロラーゼ １−メチルヒダントイナーゼ、ＮＭＨアーセ゛：１−メ
チルヒダントインヒドロラーゼ Ｎ−メチルヒダントイン、ＮＭＨ： １−メチルヒダン
トイン ＱＤｚ 光密度 ＰＡＢＳ ： パラ−アミノ安恩査酸 ｐｐｔ： ピロ燐酸塩 Ｔｍｓ ： ２−（Ｃ）リス−（ヒドロキシメチル）メ
チル〕）アミノエタンスルホン 酸 ＴＲＩＥＩ：）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン 例 １ Ａ）親菌株の培養 アル＼ロバクタースペシイス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃ’ｔ
ｅｒ ５ｐｅｃｉｅｓ ） ＤＩ３Ｍ ２’５６３ （
畑の土から単離）を、次の組成の傾斜寒天上で６週間＃
種状態に保った： １１あたり： Ｎａ２）ＩＰ０４ ｍ２月２０ ７ ＆、 ＫＥ２ＰＯ
４３，９，Ｎａ（Ｊ！１ｔｎｌ、トレーサー１ｇ液２
０．１ ｍｌ！、ビタミン溶液 ｉｍｌ、寒天２０ｇ ｐＨ７，５ ” ト レー サーｌとす７ｅビ ｌ ＭｎＣｌ２ ・４Ｈ２０１００”９、 ＦｅＣＪ３１＋
６）１２０ １ ００即、ＣｏＣｌ２・２）１２０１０
０ ｍ９を蒸留水ＩＱＱｍｌに溶解、滅菌 この溶ｇ１梯を媒体１１に添加 好トレーサー溶液２ ＣａＣ１２・２Ｈ２０１ｍｇ、ＺｎＣｌ２１１ｎ５１、
（ＮＨ４）２ＭｏＯ４１１ｎ９、ＣｏＣｌ２１１６１１
２０ Ｉｌｌ’ｓ’を蒸留水１００〜に溶解、滅菌 この溶液０．１Ｍを媒体１１に添加 ”ビタミン溶液 上記した液状媒体１０ｍ１に、白金丼１杯の傾Ｒ寒天物
質を接種し、１［］Ｑｍｌのエルシンマイヤーフラスコ
中で２８℃で２０〜２４時間振とうする。引続き、この
溶１１０ｍ１（−第１ｍ備培養）を同じ媒体１０Ｑ［ｉ
ｍｌに移し、１１のエルシンマイヤーフラスコ中で２０
０１ｒＬｌスつ２８℃で２４時間引続き発育させる（Ｏ
Ｄｌ：２０＝ ０．４２５ ）。
ドロラーゼ １−メチルヒダントイナーゼ、ＮＭＨアーセ゛：１−メ
チルヒダントインヒドロラーゼ Ｎ−メチルヒダントイン、ＮＭＨ： １−メチルヒダン
トイン ＱＤｚ 光密度 ＰＡＢＳ ： パラ−アミノ安恩査酸 ｐｐｔ： ピロ燐酸塩 Ｔｍｓ ： ２−（Ｃ）リス−（ヒドロキシメチル）メ
チル〕）アミノエタンスルホン 酸 ＴＲＩＥＩ：）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン 例 １ Ａ）親菌株の培養 アル＼ロバクタースペシイス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃ’ｔ
ｅｒ ５ｐｅｃｉｅｓ ） ＤＩ３Ｍ ２’５６３ （
畑の土から単離）を、次の組成の傾斜寒天上で６週間＃
種状態に保った： １１あたり： Ｎａ２）ＩＰ０４ ｍ２月２０ ７ ＆、 ＫＥ２ＰＯ
４３，９，Ｎａ（Ｊ！１ｔｎｌ、トレーサー１ｇ液２
０．１ ｍｌ！、ビタミン溶液 ｉｍｌ、寒天２０ｇ ｐＨ７，５ ” ト レー サーｌとす７ｅビ ｌ ＭｎＣｌ２ ・４Ｈ２０１００”９、 ＦｅＣＪ３１＋
６）１２０ １ ００即、ＣｏＣｌ２・２）１２０１０
０ ｍ９を蒸留水ＩＱＱｍｌに溶解、滅菌 この溶ｇ１梯を媒体１１に添加 好トレーサー溶液２ ＣａＣ１２・２Ｈ２０１ｍｇ、ＺｎＣｌ２１１ｎ５１、
（ＮＨ４）２ＭｏＯ４１１ｎ９、ＣｏＣｌ２１１６１１
２０ Ｉｌｌ’ｓ’を蒸留水１００〜に溶解、滅菌 この溶液０．１Ｍを媒体１１に添加 ”ビタミン溶液 上記した液状媒体１０ｍ１に、白金丼１杯の傾Ｒ寒天物
質を接種し、１［］Ｑｍｌのエルシンマイヤーフラスコ
中で２８℃で２０〜２４時間振とうする。引続き、この
溶１１０ｍ１（−第１ｍ備培養）を同じ媒体１０Ｑ［ｉ
ｍｌに移し、１１のエルシンマイヤーフラスコ中で２０
０１ｒＬｌスつ２８℃で２４時間引続き発育させる（Ｏ
Ｄｌ：２０＝ ０．４２５ ）。
最大の酵素合成は、生長の終り（あとの対叙相）忙生起
する。Ｊ：述したバッチから、１［１［１）および１６
０ Ｕ ／ Ａ！ Ｃ３Ｈａｅｅ （Ｒ−カルバモイル
ザルコシンアミドヒトロラー、＋！＋）を有する湿潤混
合物１１８０Ｊ／が得られる。
する。Ｊ：述したバッチから、１［１［１）および１６
０ Ｕ ／ Ａ！ Ｃ３Ｈａｅｅ （Ｒ−カルバモイル
ザルコシンアミドヒトロラー、＋！＋）を有する湿潤混
合物１１８０Ｊ／が得られる。
ｂ）酵素の単離および精製
湿潤混合物２８Ｃ＃（＝Ｎ養液アルスロバクター２０＃
）から、５ ｏ ＯＵ ＮＭＨＫ％がｉｓされた： マトグラフイー浴出 液 最終製剤： データ： ２２．３ Ｕ ／ｍ１ １０．５ ｔｎｙ ／ ｍ１３ ２、ＩＵ／即蛋白質 ５０係り゛リセリン ５０ミリモル／１Ｔｆ（Ｉｓ 献１＝８．３ 活性度測定は次のようにして実施した＝１、着色剤０ ＴＥＳ ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７，８） １６２ミリモル
／１４−アミノアンチピリン ０．８１ミリモル／１Ｍ
ｇＣ１２８，１ミリモル／１ ＡＴＰ ４．３ミリモル／ｌ （ＨＥ４）２ｓｏ、 ３２ミリモル／ＩＣ８Ｈ７−ゼ
１．ＩＵＺａ サルコシンオキシダーゼ 、６．５Ｕ／ｗＬｌペルオキ
シダーゼ ２・７ｕ７ｍ′ ２．１−メチルヒダントイン溶液 １０ミリモル／１６
、測定の実施 波長５４６ ｎｍ ； Ｔ ＝ ２５℃；層厚Ｉ Ｃｍ
：試験量２．０３ ｍｌ ； 生成した色素の吸光率＝１６ｃｍ ” ／μモル混合し
、契合により試料中に含まれているサルコシンおよびＮ
−カルバモイルサルコシンが反応して消失するまで待ち
、次℃・でと混合し、吸光増加を追跡し、線形範囲から
△Ｅ／ｍｉｎを舗かめる （試料物質）：粗製抽出物の６１１Ｊ定のために、トリ
ス・ｎｃｔ （ｐＨ８，０）、２０ミリモル／ｌならび
にトライトン（Ｔｒｌｔｏｎ ） Ｘ −１０００，１
％を含有する、微生物の高速遠心分離せる超音波分解の
上澄液を使用。
）から、５ ｏ ＯＵ ＮＭＨＫ％がｉｓされた： マトグラフイー浴出 液 最終製剤： データ： ２２．３ Ｕ ／ｍ１ １０．５ ｔｎｙ ／ ｍ１３ ２、ＩＵ／即蛋白質 ５０係り゛リセリン ５０ミリモル／１Ｔｆ（Ｉｓ 献１＝８．３ 活性度測定は次のようにして実施した＝１、着色剤０ ＴＥＳ ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７，８） １６２ミリモル
／１４−アミノアンチピリン ０．８１ミリモル／１Ｍ
ｇＣ１２８，１ミリモル／１ ＡＴＰ ４．３ミリモル／ｌ （ＨＥ４）２ｓｏ、 ３２ミリモル／ＩＣ８Ｈ７−ゼ
１．ＩＵＺａ サルコシンオキシダーゼ 、６．５Ｕ／ｗＬｌペルオキ
シダーゼ ２・７ｕ７ｍ′ ２．１−メチルヒダントイン溶液 １０ミリモル／１６
、測定の実施 波長５４６ ｎｍ ； Ｔ ＝ ２５℃；層厚Ｉ Ｃｍ
：試験量２．０３ ｍｌ ； 生成した色素の吸光率＝１６ｃｍ ” ／μモル混合し
、契合により試料中に含まれているサルコシンおよびＮ
−カルバモイルサルコシンが反応して消失するまで待ち
、次℃・でと混合し、吸光増加を追跡し、線形範囲から
△Ｅ／ｍｉｎを舗かめる （試料物質）：粗製抽出物の６１１Ｊ定のために、トリ
ス・ｎｃｔ （ｐＨ８，０）、２０ミリモル／ｌならび
にトライトン（Ｔｒｌｔｏｎ ） Ｘ −１０００，１
％を含有する、微生物の高速遠心分離せる超音波分解の
上澄液を使用。
■上記２項、３ ｂ）項、４．５および６項による実験
のために、相応する物質濃度または添加される物質の一
類を変えた。
のために、相応する物質濃度または添加される物質の一
類を変えた。
４、計 算
註：八Ｅ／ｍｉｎは０．０６よりも大きくてはならない
、さもないと試料が薄くなる（ Ｌｏｇ相 約５分） 例 ２ モラクセラヴペツク（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ５ｐｅｃ
） ＤＳＭ２５＋１５２ （牛舎試料から単離）を、例
１に記載したように傾斜寒天上に保持し、アル１０バク
ター・スペックと同じ培地中で培養する。
、さもないと試料が薄くなる（ Ｌｏｇ相 約５分） 例 ２ モラクセラヴペツク（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ５ｐｅｃ
） ＤＳＭ２５＋１５２ （牛舎試料から単離）を、例
１に記載したように傾斜寒天上に保持し、アル１０バク
ター・スペックと同じ培地中で培養する。
準備培養
２０ ｒｎｌ ＮＭＨ培地／１００ＷＬｌエルレンマイ
ヤーを傾斜寒天から接種し、２８℃で２１時間振とうす
る（ ＯＤ １ ： ２０ ＝ ０．４３０ ）主培養 １５ ０．４４０ ２６ ２４ ０．５５０ ８０ ３９ Ｑ、６７Ｄ ５９ ４５ ０．７５０ ４６ 例 ４ ミクロコツカス・スペック（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｕθθｐ
ｅｃ、 ） ＤＳＭ ２５６５ （土壌試料から単離）
を、例２におけるモラクセラのように培養する。
ヤーを傾斜寒天から接種し、２８℃で２１時間振とうす
る（ ＯＤ １ ： ２０ ＝ ０．４３０ ）主培養 １５ ０．４４０ ２６ ２４ ０．５５０ ８０ ３９ Ｑ、６７Ｄ ５９ ４５ ０．７５０ ４６ 例 ４ ミクロコツカス・スペック（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｕθθｐ
ｅｃ、 ） ＤＳＭ ２５６５ （土壌試料から単離）
を、例２におけるモラクセラのように培養する。
準備培養
２１ｈ／２８℃、ＯＤ １ ： ２０＝０．６２０２４
０、６９０ ５３ ２７．５ ０．８００ ８３ 例 ５ １．１−メチルヒダントインを測定するための酵素的着
色試験（１−メチルヒダントイナーゼ／Ｎ−カルバモイ
ルサルコシンアミドヒドロラーゼ／？ルコシンオキシダ
ーゼ反応、ベルオキシダーｔ′／４−アミノアンチピリ
ン／２． 、ｉ。
０、６９０ ５３ ２７．５ ０．８００ ８３ 例 ５ １．１−メチルヒダントインを測定するための酵素的着
色試験（１−メチルヒダントイナーゼ／Ｎ−カルバモイ
ルサルコシンアミドヒドロラーゼ／？ルコシンオキシダ
ーゼ反応、ベルオキシダーｔ′／４−アミノアンチピリ
ン／２． 、ｉ。
６−ドリブロムー５−ヒドロキシ安息含酸呈色指示薬系
使用） １．１ 試薬： Ｔｇｓ＠ｘｏｎ （ｐＨ７，８） １００ミリモル／１
ＭｇＣ１２５ミリモル／１ ＡＴＰ ５ミリモル／ｌ Ｎ′Ｈ４Ｃｌ １０ミリモル／１ ４−アミノアンチビ′リン ０．５ミリモル／ｌシンア
ミドヒドロラーゼ サルコシンオキシダーゼ ５ Ｕ／ｌ ペルオキシダーゼ ２ Ｕ／ｌ １．２ 測定の実施 波長 ：５４６ｎｍ 層厚さ”、 １０ ｍｔｎ ｓ温度：２５℃試桑盲検値
に対して測定 クベット中にピペットで秤取 試薬１．１ ２．００１ｄ ’ ２．００１１１／試料
＋）０．１０縦 − 混合し７．１０分間保温し、引続きＲＬに対するＰの吸
光（△Ｅ）を測定 ”）１−メチルヒダントインの水溶液、８７．７〜１７
５４μモル／ｌ 使用した試料中の１−メチルヒダントインのそのつどの
濃度に対する△Ｅの依存性は第１図に表示されている。
使用） １．１ 試薬： Ｔｇｓ＠ｘｏｎ （ｐＨ７，８） １００ミリモル／１
ＭｇＣ１２５ミリモル／１ ＡＴＰ ５ミリモル／ｌ Ｎ′Ｈ４Ｃｌ １０ミリモル／１ ４−アミノアンチビ′リン ０．５ミリモル／ｌシンア
ミドヒドロラーゼ サルコシンオキシダーゼ ５ Ｕ／ｌ ペルオキシダーゼ ２ Ｕ／ｌ １．２ 測定の実施 波長 ：５４６ｎｍ 層厚さ”、 １０ ｍｔｎ ｓ温度：２５℃試桑盲検値
に対して測定 クベット中にピペットで秤取 試薬１．１ ２．００１ｄ ’ ２．００１１１／試料
＋）０．１０縦 − 混合し７．１０分間保温し、引続きＲＬに対するＰの吸
光（△Ｅ）を測定 ”）１−メチルヒダントインの水溶液、８７．７〜１７
５４μモル／ｌ 使用した試料中の１−メチルヒダントインのそのつどの
濃度に対する△Ｅの依存性は第１図に表示されている。
例 ６
例５からの試薬１．１を用いるＮ−カルバモイルサルコ
シンの測定 測定の実施は、例５からの１．２項と同様に行なう、但
し１−メチルヒダントイン水溶液の代りに等モル濃度（
８７，７〜１７５４μモル／ｌ）のＮ−カルバモイルサ
ルコシンな有する相応する試料を試験に使用する。
シンの測定 測定の実施は、例５からの１．２項と同様に行なう、但
し１−メチルヒダントイン水溶液の代りに等モル濃度（
８７，７〜１７５４μモル／ｌ）のＮ−カルバモイルサ
ルコシンな有する相応する試料を試験に使用する。
Ｎ−カルバモイルサルコシンの濃度に対する測定し、た
吸光値の依存性は第２図に表示されている。
吸光値の依存性は第２図に表示されている。
例５および例６により測定した吸光値開の比較は、それ
ぞれ等モル濃度の１−メチルヒダントイン試料およびＮ
−カルバモイルサルコシン試料を用い同じ高さの着色信
号（Ｆａｒｂｓｉｇｎａｌ）が測定される（第６図）こ
とを示す。
ぞれ等モル濃度の１−メチルヒダントイン試料およびＮ
−カルバモイルサルコシン試料を用い同じ高さの着色信
号（Ｆａｒｂｓｉｇｎａｌ）が測定される（第６図）こ
とを示す。
例 ７
１−メチルヒダントイン測定のための酵素的ＵＶ試験（
１−メチルヒダントイナーゼ／ピルベートキナーゼ／ラ
クテートデヒドロゲナーゼ反応） Ｚｌ 試薬 Ｚｌ、１ 試薬Ｉ： 成 分 試薬中の濃度 燐酸カリウム（ｐｉ（８，０） ７５ミリモル／１ＮＡ
Ｄ）１ ０．２５ミリモル／１ ＡＴＰ １．３０ミリモル／ｌ ホスホエノールビルベー） １．、！１２ミリモル／１
ＭｇＣ１２２，［ＪＯミリモル／ｌ ピルベート−キナーゼ ４ Ｕ ／ｒｎＡラクテートー
デヒドロｒナーゼ １０Ｕ〜７．１．２１−メチルヒダ
ントイナーゼ（１５Ｕ／ｍｌ ５０％グリセリン中、Ｐ
Ｈ８，０） Ｚ２ 測定の実施 波長 ：３６５ｎｍ 層厚 ： １０闘 温度 ＝ ２５℃ 反応混合物盲検値に対する測定 クベット中にピペットで秤取二 試薬１ １．００７１１Ｊ １．００７ｄ試料＊＊）
Ｑ、２０ＩＬｌ− 水 ０．２０ｍＪ ４分間保温、試料の涼秋光（Ｅよ、Ｐ）およびＲＬの涼
秋光（Ｅ工、□Ｌ）を迎１定、次いでこれに混入 さらに５〜１０分後に、ｐ （Ｅ２．Ｐ）およびＲＬ（
Ｅ２．ＲＬ）の吸光を測定。
１−メチルヒダントイナーゼ／ピルベートキナーゼ／ラ
クテートデヒドロゲナーゼ反応） Ｚｌ 試薬 Ｚｌ、１ 試薬Ｉ： 成 分 試薬中の濃度 燐酸カリウム（ｐｉ（８，０） ７５ミリモル／１ＮＡ
Ｄ）１ ０．２５ミリモル／１ ＡＴＰ １．３０ミリモル／ｌ ホスホエノールビルベー） １．、！１２ミリモル／１
ＭｇＣ１２２，［ＪＯミリモル／ｌ ピルベート−キナーゼ ４ Ｕ ／ｒｎＡラクテートー
デヒドロｒナーゼ １０Ｕ〜７．１．２１−メチルヒダ
ントイナーゼ（１５Ｕ／ｍｌ ５０％グリセリン中、Ｐ
Ｈ８，０） Ｚ２ 測定の実施 波長 ：３６５ｎｍ 層厚 ： １０闘 温度 ＝ ２５℃ 反応混合物盲検値に対する測定 クベット中にピペットで秤取二 試薬１ １．００７１１Ｊ １．００７ｄ試料＊＊）
Ｑ、２０ＩＬｌ− 水 ０．２０ｍＪ ４分間保温、試料の涼秋光（Ｅよ、Ｐ）およびＲＬの涼
秋光（Ｅ工、□Ｌ）を迎１定、次いでこれに混入 さらに５〜１０分後に、ｐ （Ｅ２．Ｐ）およびＲＬ（
Ｅ２．ＲＬ）の吸光を測定。
ｗ＝（Ｂよ＋Ｐ ”２＋Ｐ）”１＋ＲＬ−Ｅ２＋ＲＬ”
”’軸） １−メチルヒダントイン水溶液、８７゜７〜
８７７μモル／ｌ ”０）註＝ １−メチルヒダントイナーゼ製剤はなお著
量のＡＴＰアーゼまたはＮＡＤＨオキシターセを含有す
る、これは１−メチルヒダントイナーゼ溶液の添加後、
反応混合物盲検値パンチ中でＮＡＤＨの明らかな減少に
現われ、Ｅ２＋Ｐおよび”２＋ｌ（Ｌはそれぞれ、）Ｊ
ＭＨアーゼを混加してから正確に寺Ｌ℃・時間間隔後（
たとえば６．００分後）に読取る。
”’軸） １−メチルヒダントイン水溶液、８７゜７〜
８７７μモル／ｌ ”０）註＝ １−メチルヒダントイナーゼ製剤はなお著
量のＡＴＰアーゼまたはＮＡＤＨオキシターセを含有す
る、これは１−メチルヒダントイナーゼ溶液の添加後、
反応混合物盲検値パンチ中でＮＡＤＨの明らかな減少に
現われ、Ｅ２＋Ｐおよび”２＋ｌ（Ｌはそれぞれ、）Ｊ
ＭＨアーゼを混加してから正確に寺Ｌ℃・時間間隔後（
たとえば６．００分後）に読取る。
に料中の１−メチルヒダントインのそのつどの濃度と測
定された吸光率（△Ｅ）との間の関連性は第４図に表示
されており；１−メチルヒダントインの加水分解の際に
生じたＡＤＰ量の、３６５ ｎｍにおけるＮＡＤＨの分
子吸光率に関する計算から、１−メチルヒダントイン加
水分解に対するＡＴＰ消費なし・しはＡＤＰ生成の反応
化学量論１：１が得られる（第５図）。
定された吸光率（△Ｅ）との間の関連性は第４図に表示
されており；１−メチルヒダントインの加水分解の際に
生じたＡＤＰ量の、３６５ ｎｍにおけるＮＡＤＨの分
子吸光率に関する計算から、１−メチルヒダントイン加
水分解に対するＡＴＰ消費なし・しはＡＤＰ生成の反応
化学量論１：１が得られる（第５図）。
例 ８
クレアチニンの測定のための酵素着色試験８１ 試薬：
クレアチニンイミノヒドロラーゼの添加分２Ｕ／＋＋＋
６（最終０度）を有する例５からの試薬１．１に相当 ８．２ 測定の実施： 例５からの１．２項に一致するが、試料としてクレアチ
ニン水溶液８７．７〜１７５４μモル／ｌを使用し、Ｐ
およびＲＬの保温時間を２０分に延長する。
６（最終０度）を有する例５からの試薬１．１に相当 ８．２ 測定の実施： 例５からの１．２項に一致するが、試料としてクレアチ
ニン水溶液８７．７〜１７５４μモル／ｌを使用し、Ｐ
およびＲＬの保温時間を２０分に延長する。
試料中のクレアチニンの濃度に対する△Ｅの依存性は第
６図にプロットされて℃・る。
６図にプロットされて℃・る。
試薬８．１からクレアチニンイミノヒドロラーゼを省略
すると、呈色反応は認められず、試験パッチ８．２中で
クレアチニン溶液の代りにクレアチニン溶液８８４μモ
ル／ｌを試料として使用する場合も同じ。
すると、呈色反応は認められず、試験パッチ８．２中で
クレアチニン溶液の代りにクレアチニン溶液８８４μモ
ル／ｌを試料として使用する場合も同じ。
添付図面は本発明を実施例と関連して説明するためのも
ので、 第１図は、例５により得られる吸光値の、使用した１−
メチルヒダントイン菫との依存性を示す線図であり、 第２図は、例６における１−メチルヒダントインの代り
にＮ−カルバモイルサルコシンを使用する場合の第１図
による線図であり、第６図は、例５および例６の結果を
対比する同上線図であり、 第４図は、例７に対する第１図による同上線図であり、 第５図は化学量論的ＡＤＰ生成を示す線図であり、 第６図は例８に対する第１図による線図である。
ので、 第１図は、例５により得られる吸光値の、使用した１−
メチルヒダントイン菫との依存性を示す線図であり、 第２図は、例６における１−メチルヒダントインの代り
にＮ−カルバモイルサルコシンを使用する場合の第１図
による線図であり、第６図は、例５および例６の結果を
対比する同上線図であり、 第４図は、例７に対する第１図による同上線図であり、 第５図は化学量論的ＡＤＰ生成を示す線図であり、 第６図は例８に対する第１図による線図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．１−メチルヒダントインをヌクレオシドホスフェー
トおよび多側金属イオンの存在で加水分解する、１−メ
チルヒダントイナーゼ。 ２、分子輩約１２５０００ （ｓ：ｏｓ勾配ケル電気泳
動）、最適ｐＨｐＨ７，８，１−メチルヒダントインに
対するｘＭｏ、ｏ ２ミリモル／ｌ、およ３、アルスロ
バクタ−φスペック、ＤＢＭ２５６３、ＤＥＩＭ ２５
６４、モラクセラ・スペック。 ＤＳＭ ２５６２ 、ミクロコツカス争スペック。 ＤＳＭ ２５６５またはブレビバクテリウム・スペック
、Ｄ８Ｍ２８４３を培養し、酵素を単離することを特徴
とする１−メチルヒダントイナーゼの製出法。 ４、微生物を分解し、酵素をポリエチレンイミンで沈殿
させ、場合により硫酸アンモニウム分別、加熱工程およ
びクロマトグラフィーによって濃縮する、特許請求の範
囲第３項記載の方法。 ５、 クレアチニンをクレアチニン・デイミナーゼＦｌ
ｉ、Ｃ，３，５，４，２１で１−メチルヒダントインに
変え、これをヌクレオシドトリホスフェートおよび多価
金属イオンの存在で１−メチルヒダントイナーゼを用（
・て加水分解し、ａ）１−メチルヒダントインから生成
した加水分解生成物をＮ−カルバモイルサルコシンアミ
ドヒドロラーゼを用（・てサルコシンの形成下に測定し
かつサルコシンをサルコシンオキシダーゼまたはサルコ
シンデヒドロデナーゼを用し・て検出するかまたは＋１
）１同時に生成したヌクレオシドトホスフェートヲ１１
１１１１ 定することを特徴とするクレアチニンの測定
法。 ６、測定を緩衝せる水浴液中で７．０〜ν、０の１８価
で実施する、特許請求の範囲第５項記載の方法。 １７．３〜８．５のＰＨ価で核分解する、特許請求の範
囲第６項記載の方法０ ８、複分解を１０〜５００ ミＩＪモル／ｌの緩衝Ｍ１
１濃度で実施する、特許請求の範囲第５項から第７項ま
でのいずれか１項記載の方法。 ９ 緩衝剤濃度を５０〜２００ミリモル／ｌの間に調節
する、特許請求の範囲幀８項記載の方法。 １０、ヌクレオシドトリホスフェートとしてＡＴＰを特
徴する特許請求の範囲詔５項から第９項までのいずれか
１項記載の方法。 １１、ＡＴＰ Ｏ，０５〜５０ミリモル／ｌを特徴する
特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、多価金属イオンとしてマグネシウムイオンまたは
マンガンイオンを加える、特許請求の範囲第５項から第
１１項までのいずれか１項記載の方法。 １６、マグネシウムイオンを塩化マグネシウム、硫酸マ
グネシウムまたはマグネシウムアスパルテートの形で加
える、特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、二価金属イオン０．１〜５０ミリモル／ｌを加え
る、特許請求の範囲第１２項または第１６項記載の方法
。 １５．１−メチルヒダントイナーゼ０．０１〜１０Ｕ
／ ｍｌを加える、特許請求の範囲第５項から第１４項
までのいずれか１項記載の方法。 １６、アンモニウム塩０．１〜１００ミリモル／ｌを加
える、特許請求の範囲第５項から第１５項までのいずれ
か１項記載の方法。 １７、Ｎ−カルバモイルザルコシン・アミドヒｒロラー
ゼ０．１〜２０Ｕ／酩を加える、特許請求の範囲第５項
から第１６項までのいずれか１項記載の方法。 １８、サルコシンオキシダーゼまたはサルコシンデヒド
ロゲナーゼ２０ Ｕ ／ ｍｌを加える、特許請求の範
囲第１７項記載の方法。 １９１−メチルヒダントイナーゼ９を含有することを特
徴とするクレアチニンのｍ１１定試薬。 ２０ クレアチニン・テ゛イミナーゼ、１−メチルヒダ
ントイナーゼ、ＡＴＰまたはＧＴＰ、２価の金ｋＡイオ
ン、Ｎ−カルバモイルサルコシン・アミドヒドロラーゼ
、サルコシンオキシダーゼまたはサルコシンデヒドロデ
ナーゼおよび緩衝剤ｐＨ７，Ｄ〜９．０を特徴する特許
請求のｆＩ＠囲年１９項記載の試薬。 ２１、Ｈ２Ｏ２またはホルムアルデヒドの測定系、また
はサルコシンデヒドロゲナーゼ反応を直接可視的にする
だめの発色電子受容体系を特徴する特許請求の範囲第２
０項記載の試薬。 ２２、クレアチニンデイミナーゼ、１−メチルヒダント
イナーゼ、ＡＴＰまたはＧＴＰ 、二価の金属イオン、
ＡＤＰまたはＧＤＰの測定系および緩衝剤ｐＨ７，０〜
９．０を特徴する特許請求の範囲第１９項記載の試薬。 ２３、 ＭｇイオンまたはＭｎイオンを特徴する特許請
求の範囲第２０項から第２２項までのいずれか１項記載
の試薬。 ２４、 ＡＤＰの測定系がピルベートキナーゼ、ラクテ
ートデヒドロケゞナーセ゛、ホスホンエノールピルベー
トおよびＮＡＤ）Ｉからなる、特許請求の範囲第２２項
記載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3406770.1 | 1984-02-24 | ||
| DE19843406770 DE3406770A1 (de) | 1984-02-24 | 1984-02-24 | Nucleosidtriphosphat-abhaengige 1-methylhydantoinase und ihre verwendung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60203190A true JPS60203190A (ja) | 1985-10-14 |
| JPH0373276B2 JPH0373276B2 (ja) | 1991-11-21 |
Family
ID=6228749
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60034717A Granted JPS60203190A (ja) | 1984-02-24 | 1985-02-25 | １‐メチルヒダントイナーゼ、その製出法およびクレアチニンの測定法および測定試薬 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4816393A (ja) |
| EP (1) | EP0154269B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60203190A (ja) |
| AT (1) | ATE50789T1 (ja) |
| AU (1) | AU555270B2 (ja) |
| CA (1) | CA1261288A (ja) |
| CZ (1) | CZ277729B6 (ja) |
| DD (1) | DD241919A5 (ja) |
| DE (2) | DE3406770A1 (ja) |
| DK (1) | DK77185A (ja) |
| ES (1) | ES8602114A1 (ja) |
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