JPS60203190A - 1‐メチルヒダントイナーゼ、その製出法およびクレアチニンの測定法および測定試薬 - Google Patents
1‐メチルヒダントイナーゼ、その製出法およびクレアチニンの測定法および測定試薬Info
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- JPS60203190A JPS60203190A JP60034717A JP3471785A JPS60203190A JP S60203190 A JPS60203190 A JP S60203190A JP 60034717 A JP60034717 A JP 60034717A JP 3471785 A JP3471785 A JP 3471785A JP S60203190 A JPS60203190 A JP S60203190A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
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- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
従来の技術
分析化学、殊に臨床化学診断法におし・ては、天然物、
生理的代謝物質およびこれから64された化合物の酵素
的測足方法が仄し、に多く必少とされる。その理由は、
酵素触媒的物質初分解の極めて、妬℃・特異性、イ忌和
な反応条件(普通は中性のPH範囲内で水性媒体中での
15〜40℃の間)下でのその迅速、明確かつロスのな
い進行、ならびにそれを、簡単かつ鋭敏な方法で、殊に
直接かまたは組合された指示系反応を使用し?tll1
元法を用℃・て定鎗的に知ることがi」能でル)ること
である。
生理的代謝物質およびこれから64された化合物の酵素
的測足方法が仄し、に多く必少とされる。その理由は、
酵素触媒的物質初分解の極めて、妬℃・特異性、イ忌和
な反応条件(普通は中性のPH範囲内で水性媒体中での
15〜40℃の間)下でのその迅速、明確かつロスのな
い進行、ならびにそれを、簡単かつ鋭敏な方法で、殊に
直接かまたは組合された指示系反応を使用し?tll1
元法を用℃・て定鎗的に知ることがi」能でル)ること
である。
1−メチルヒダントインには、この化合物を直接または
間接的に解素分析に利用する#累触媒的複分解法はこれ
まで知られていなかった。
間接的に解素分析に利用する#累触媒的複分解法はこれ
まで知られていなかった。
しかし、かかる方法はなかんずく、久しく公知のクレア
チニンイミノヒドロラーセ゛(E、C。
チニンイミノヒドロラーセ゛(E、C。
3.5.4.21 )を用いる酵素反応で1−メチルヒ
ダントインとアンモニアとに変換される、臨床診断上重
要な血清および尿成分であるクレアチニンの街り定にと
くに重要である。
ダントインとアンモニアとに変換される、臨床診断上重
要な血清および尿成分であるクレアチニンの街り定にと
くに重要である。
実際に、血清または尿中のクレアチニンの酵素的測定に
は既に若干の方法が公知である(Wah’1efeld
、 A、W、 、 G、 Ho1zおよびH,U、 B
ergmeyer、 in l(、U、 Bergme
yer : Methoden der enzyma
tischen Analyse、 g 3版、第■巻
、Verlag Chemie、 Weinheim
1974年、第1864頁〜繁1838負、Fossa
ti、 P、 L、 Prencipe、およびa、
Berti、 C1n1cll (’hemietry
(1986年)第29巻第1494頁〜第1496頁
; Tanganelli、 E、、 L、 Pren
zip、D、 Ba5si、 s、 Cambiagh
i、およびE、 Murador、 C11nical
Chemstry (1983年)第28巷、第14
61負〜第1464頁)ニジかしこれらはことごとく、
反応の中間生成物としてクレアチン(Wahlefel
d 守; Foseati 等)またはアン七〇ア(T
anganelli等)を経て進行し、これらの物質が
はじめからクレアチニンに比して明らかに重要な変化帳
度で分析すべき血清ないしは尿試料中に添加されて(・
るという欠点を有する。
は既に若干の方法が公知である(Wah’1efeld
、 A、W、 、 G、 Ho1zおよびH,U、 B
ergmeyer、 in l(、U、 Bergme
yer : Methoden der enzyma
tischen Analyse、 g 3版、第■巻
、Verlag Chemie、 Weinheim
1974年、第1864頁〜繁1838負、Fossa
ti、 P、 L、 Prencipe、およびa、
Berti、 C1n1cll (’hemietry
(1986年)第29巻第1494頁〜第1496頁
; Tanganelli、 E、、 L、 Pren
zip、D、 Ba5si、 s、 Cambiagh
i、およびE、 Murador、 C11nical
Chemstry (1983年)第28巷、第14
61負〜第1464頁)ニジかしこれらはことごとく、
反応の中間生成物としてクレアチン(Wahlefel
d 守; Foseati 等)またはアン七〇ア(T
anganelli等)を経て進行し、これらの物質が
はじめからクレアチニンに比して明らかに重要な変化帳
度で分析すべき血清ないしは尿試料中に添加されて(・
るという欠点を有する。
従って、クレアチニン測定のためには、2つの別個のま
たは直列に接続された反応バッチによる差異測定即ちま
ず遊離クレアチンなし・しはアンモニアを測定し、第二
にクレアチニン−アミドヒドロラーゼ(K、c、5.5
.2.10)またはクレアチニン−イミノヒドロラーゼ
(=クレアチニンーデイミナーゼ)の添加により付加的
にクレアチニンから形成したクレアチンないしはアンモ
ニアの量を知ることが必要である( ’ Probe
/ Probenleerwert法“またはE1/B
22法)。このような方法は、手動的実施のため比較的
費用がかかりかつ殊に複分解反応の完全な進行のために
長し・保温時間が必要である場合に非′lv忙制限され
目動的分析装置に使用しうるにすぎない。実際に、大体
にお℃・て反応条件の適当な選択によって、いわゆる動
的固定時間法(kinetische ’ fixed
−time “verfahren )における試料盲
検値測定を回避するため公知酵素的方法を用いてクレア
チニン測定を実施することはできるが:しかしこれは定
義された温度条件下で測定時点の極めて正確な維持を必
要とし、このことは十分な精度では自動分析装置でしか
成功せず、反対に手動情作を完全に排除する。
たは直列に接続された反応バッチによる差異測定即ちま
ず遊離クレアチンなし・しはアンモニアを測定し、第二
にクレアチニン−アミドヒドロラーゼ(K、c、5.5
.2.10)またはクレアチニン−イミノヒドロラーゼ
(=クレアチニンーデイミナーゼ)の添加により付加的
にクレアチニンから形成したクレアチンないしはアンモ
ニアの量を知ることが必要である( ’ Probe
/ Probenleerwert法“またはE1/B
22法)。このような方法は、手動的実施のため比較的
費用がかかりかつ殊に複分解反応の完全な進行のために
長し・保温時間が必要である場合に非′lv忙制限され
目動的分析装置に使用しうるにすぎない。実際に、大体
にお℃・て反応条件の適当な選択によって、いわゆる動
的固定時間法(kinetische ’ fixed
−time “verfahren )における試料盲
検値測定を回避するため公知酵素的方法を用いてクレア
チニン測定を実施することはできるが:しかしこれは定
義された温度条件下で測定時点の極めて正確な維持を必
要とし、このことは十分な精度では自動分析装置でしか
成功せず、反対に手動情作を完全に排除する。
クレアチンまたはアンモニアとは異なり、1−メチルヒ
ダントイン(1N−メチルヒダントイン“、 ’ NM
H”)は、血清または尿の天然の成分ではなく;従って
中間生成物として1−メチルヒダントインを経過するク
レアチニン測定か、もしくは場合により後接された指示
薬反応が同様に、血清または尿中にかなりの濃度で出現
する物質を経過しなし・ことを前提として、この場合に
試料盲検値測定を省略しつると(・う著し℃・利点を提
供した。
ダントイン(1N−メチルヒダントイン“、 ’ NM
H”)は、血清または尿の天然の成分ではなく;従って
中間生成物として1−メチルヒダントインを経過するク
レアチニン測定か、もしくは場合により後接された指示
薬反応が同様に、血清または尿中にかなりの濃度で出現
する物質を経過しなし・ことを前提として、この場合に
試料盲検値測定を省略しつると(・う著し℃・利点を提
供した。
従って、その定検的測定、とくに光度測定による測定が
他の血Y#または尿成分の同時的検出なしに可能な1−
メチルヒダントインの酵素的分析剤および分析方法の必
要が生じた。
他の血Y#または尿成分の同時的検出なしに可能な1−
メチルヒダントインの酵素的分析剤および分析方法の必
要が生じた。
問題点を解決するための手段
この課題は、本発明によれば、1−メチルヒダントイン
を少なくとも1つのヌクレオシドトリホスフェート、と
くにアデノシン−57−トリ*スフx −) (ATP
)、多1曲金属イオン、トくにMg またはMn”f
、Hらびに場合によりアンモニウム塩の存在で加水分解
しうるlJr規で従来未知の酵素を見出すことによって
解決される。
を少なくとも1つのヌクレオシドトリホスフェート、と
くにアデノシン−57−トリ*スフx −) (ATP
)、多1曲金属イオン、トくにMg またはMn”f
、Hらびに場合によりアンモニウム塩の存在で加水分解
しうるlJr規で従来未知の酵素を見出すことによって
解決される。
文献には実際に、種々の出所からのゝゝヒダントイナー
ゼ”(ヒドロビリミシン加水分解酵素、n、c、3.5
.2.2)によるヒダントインの種々の酵素的加水分解
が既に記載されて℃・るが、有効性は従来非置換ヒダン
トイン(Wallach、 D、 P、、およびS、
Grisolia、 J、 Eiol Chemi、
(1957年)第226巻第277負〜第288頁)な
し・しは5位に置換基を有するヒダントイン(西ドイツ
国特許出願公告第2661048号;西ドイツ国特許出
願公告第2811606号明細書; 01ivieri
°、 R,、E、 Fascetti、 L、 Ang
eliniおよびり、 Degen、 Biotech
n。
ゼ”(ヒドロビリミシン加水分解酵素、n、c、3.5
.2.2)によるヒダントインの種々の酵素的加水分解
が既に記載されて℃・るが、有効性は従来非置換ヒダン
トイン(Wallach、 D、 P、、およびS、
Grisolia、 J、 Eiol Chemi、
(1957年)第226巻第277負〜第288頁)な
し・しは5位に置換基を有するヒダントイン(西ドイツ
国特許出願公告第2661048号;西ドイツ国特許出
願公告第2811606号明細書; 01ivieri
°、 R,、E、 Fascetti、 L、 Ang
eliniおよびり、 Degen、 Biotech
n。
1ogy ancl Biuengineering
(1981年)第23巻#f2173頁〜第2186員
)に対して示確認されなかった;ワラツバ(Walla
ch )等により記載された酵素はヒダントインの加水
分解のために、たとえば多価金属イオンの添加をも必要
とせす、オリビニIJ (01ivieri ) 等(
1”)研の明瞭な阻止が立証されるが、本発明による酵
素の活性はアンモニウムイオンの添加によってむしろ明
瞭に上昇させることができる。
(1981年)第23巻#f2173頁〜第2186員
)に対して示確認されなかった;ワラツバ(Walla
ch )等により記載された酵素はヒダントインの加水
分解のために、たとえば多価金属イオンの添加をも必要
とせす、オリビニIJ (01ivieri ) 等(
1”)研の明瞭な阻止が立証されるが、本発明による酵
素の活性はアンモニウムイオンの添加によってむしろ明
瞭に上昇させることができる。
本発明による酵素の出現、単離および性質ならびに1−
メチルヒダントインないしはクレアチニンの測定のため
のその使用は、下記に詳述されて(・る。
メチルヒダントインないしはクレアチニンの測定のため
のその使用は、下記に詳述されて(・る。
本発明による新規酵素1−メチルヒダントイナーゼは広
く微生物中に出現するものと思われる。それで、このも
のはブレビバクテリウム(Brevibacteri’
um ) 属の微生物モラクセラ(MaraXella
)% ミクロコツカスおよびアルスロバクタ−(Art
hrobactθr)中に見出すことができた。後処理
で本発明による酵素の金蓋が確認されたこの属の菌株の
例は、アルスロバクタ−スペック、DSM2563.D
SM2564、モラクセラ スペック、DSM2562
、ミクロコックススペック、DSM2565またはブレ
ビバクテリウムスペック、DSM2843である。
く微生物中に出現するものと思われる。それで、このも
のはブレビバクテリウム(Brevibacteri’
um ) 属の微生物モラクセラ(MaraXella
)% ミクロコツカスおよびアルスロバクタ−(Art
hrobactθr)中に見出すことができた。後処理
で本発明による酵素の金蓋が確認されたこの属の菌株の
例は、アルスロバクタ−スペック、DSM2563.D
SM2564、モラクセラ スペック、DSM2562
、ミクロコックススペック、DSM2565またはブレ
ビバクテリウムスペック、DSM2843である。
従って、本発明による酵素は有利に、上述した微生物の
1つを培養し、バイオマスまたは/および培地から酵素
を単離することにより得られる。
1つを培養し、バイオマスまたは/および培地から酵素
を単離することにより得られる。
新規酵素の下記特性が確認された:
1、分子量
a) 8DS−勾、配デル電気泳動法Mr = 125
00 2、至適P1]: μI=7.8 活性(%)、25℃ pH−6,57,07,58,08,59,0TES−
緩衝液 5 76100100 95 69150ミリ
モル/1 TRIS−緩衝液 1 26 60 52 38 19
150ミリ9しルシ/1 6、特異性: 活性率%(ADP /ピルベートキナーゼ/ラクテート
デヒドロゲナーゼ) a)基質(それぞれ0.1 ミIJモル/1反応混合物
中の最終濃度) 基質特異性の測定のために次のように実施した: 1、基礎試薬 燐酸カリウム(pH8,0) 75ミリモル/1NAD
H0,25ミリモル/1 ATP 1.30ミリモル/l ホスホエノールビルベー) 0.42ミリモルi1Mg
ct2 2.00ミリモル// ピルベートーキナーゼ 4 U /mlラクテートーデ
ヒドロデナーゼ 10U/mJ2.1−メチルヒダント
イプーゼ(15U/ml’50 %グリセリン、20ミ
リモル/lトリス・H(J緩衝液、pi(8,0) 6、 ヒダントイン溶液 ヒダントインの濃度(1−メチルヒダントイン、ヒダン
トイン、5−メチルヒダントインならびに5.5−ジメ
チルヒダントイン):それぞれ0.6ミリモル/1H2
0 4、試験の実施 波長365nm:T=25℃、d = 1 cm :試
験量1.21M、タペット中にピペットで秤取混合し、
次℃・で添加 試料のU(△EP)および反応混合物盲検値(Δ−L) 5、種々のヒダントインを用いて測定した△E/min
から、ΔE/m1n(1−メチルヒダントイン)=10
0qbに関する相対的反応速度の計算次の結果が得られ
た: 1rH3 N−CH2 b)ヌクレオチド カルバモイルサルコシンアミドヒドロラーゼ+サルコシ
ンオキシダーゼによる測定における相対的活性幅(AT
P=100) ATP 100 ADP I GTP 7 CTP 1・5 TTP 0 UTP 0 PPi O カルブ−ホスフェート 0 トリポリ燐酸Na O ヘキサメタ燐酸Na 0 4、金属イオン依存性 相対的活性%(5ミリモル/l塩化マグネシウム=10
0) D Mgcl1217 83 100 5 MnCJ2 60 5 ZnCl2 24 5、活性化剤 すぐれているものNH,”、相対的活性チ(60ミリモ
ルフ1 As’=100) 活性化剤物質 ミリモル/l % なし 044 (NH4)2SO4601DO 〃10 95 xH,ct 30 91 Li2SO4304O Na2E104 30 39 に2SO43059 NaC13041 NaHCO33040 6、抑制剤 すぐれているものEiDTA 、 、NaFNaF :
I X 10−にモル/l 100%阻止EDTA−
明止:” ミリモル/l 相対的活性幅0 100 5 100 10 42 50 2 ”反応混合物中Mg廿7.5 ミIJモル存在Zミヒャ
ーエルス定数 KmATP (rzs 0.15モル/ 13 、 p
)I 7.8 :サルコシンによる) : 0.8ミリ
モル/ lj Km ”1−メチルヒダントイン(0,
15モル/ l TES 。
00 2、至適P1]: μI=7.8 活性(%)、25℃ pH−6,57,07,58,08,59,0TES−
緩衝液 5 76100100 95 69150ミリ
モル/1 TRIS−緩衝液 1 26 60 52 38 19
150ミリ9しルシ/1 6、特異性: 活性率%(ADP /ピルベートキナーゼ/ラクテート
デヒドロゲナーゼ) a)基質(それぞれ0.1 ミIJモル/1反応混合物
中の最終濃度) 基質特異性の測定のために次のように実施した: 1、基礎試薬 燐酸カリウム(pH8,0) 75ミリモル/1NAD
H0,25ミリモル/1 ATP 1.30ミリモル/l ホスホエノールビルベー) 0.42ミリモルi1Mg
ct2 2.00ミリモル// ピルベートーキナーゼ 4 U /mlラクテートーデ
ヒドロデナーゼ 10U/mJ2.1−メチルヒダント
イプーゼ(15U/ml’50 %グリセリン、20ミ
リモル/lトリス・H(J緩衝液、pi(8,0) 6、 ヒダントイン溶液 ヒダントインの濃度(1−メチルヒダントイン、ヒダン
トイン、5−メチルヒダントインならびに5.5−ジメ
チルヒダントイン):それぞれ0.6ミリモル/1H2
0 4、試験の実施 波長365nm:T=25℃、d = 1 cm :試
験量1.21M、タペット中にピペットで秤取混合し、
次℃・で添加 試料のU(△EP)および反応混合物盲検値(Δ−L) 5、種々のヒダントインを用いて測定した△E/min
から、ΔE/m1n(1−メチルヒダントイン)=10
0qbに関する相対的反応速度の計算次の結果が得られ
た: 1rH3 N−CH2 b)ヌクレオチド カルバモイルサルコシンアミドヒドロラーゼ+サルコシ
ンオキシダーゼによる測定における相対的活性幅(AT
P=100) ATP 100 ADP I GTP 7 CTP 1・5 TTP 0 UTP 0 PPi O カルブ−ホスフェート 0 トリポリ燐酸Na O ヘキサメタ燐酸Na 0 4、金属イオン依存性 相対的活性%(5ミリモル/l塩化マグネシウム=10
0) D Mgcl1217 83 100 5 MnCJ2 60 5 ZnCl2 24 5、活性化剤 すぐれているものNH,”、相対的活性チ(60ミリモ
ルフ1 As’=100) 活性化剤物質 ミリモル/l % なし 044 (NH4)2SO4601DO 〃10 95 xH,ct 30 91 Li2SO4304O Na2E104 30 39 に2SO43059 NaC13041 NaHCO33040 6、抑制剤 すぐれているものEiDTA 、 、NaFNaF :
I X 10−にモル/l 100%阻止EDTA−
明止:” ミリモル/l 相対的活性幅0 100 5 100 10 42 50 2 ”反応混合物中Mg廿7.5 ミIJモル存在Zミヒャ
ーエルス定数 KmATP (rzs 0.15モル/ 13 、 p
)I 7.8 :サルコシンによる) : 0.8ミリ
モル/ lj Km ”1−メチルヒダントイン(0,
15モル/ l TES 。
pH7,8; ADPによる) : 0.02ミリモル
/18、安定性 a)温度安定性=50%グリセリン中;20ミリモル/
II)リス、pH8,0(2υ/mi)60分 残留活
性係 25℃ 100 50℃ 94 60℃ ・70 70℃ O b) pH安定性 20%グリセリン、10ミリモル/lトリス、0.2U
/ml、+4℃、3日間暗所で保存(出発1直−100
% ) pl(残留活性係 6.38 6.5 20 7.0 61 8.0 72 9.0 86 問題点を解決するための手段(n) 本発明による酵素は、後処理のしがいのある1−メチル
ヒダントイナーゼの含量を有する微生物から、酵素を精
製するための自体公知の方法により得ることができる。
/18、安定性 a)温度安定性=50%グリセリン中;20ミリモル/
II)リス、pH8,0(2υ/mi)60分 残留活
性係 25℃ 100 50℃ 94 60℃ ・70 70℃ O b) pH安定性 20%グリセリン、10ミリモル/lトリス、0.2U
/ml、+4℃、3日間暗所で保存(出発1直−100
% ) pl(残留活性係 6.38 6.5 20 7.0 61 8.0 72 9.0 86 問題点を解決するための手段(n) 本発明による酵素は、後処理のしがいのある1−メチル
ヒダントイナーゼの含量を有する微生物から、酵素を精
製するための自体公知の方法により得ることができる。
有利に、微生物を分解し、ポリエチレンイミンの添加に
よって酵製 素を沈殿させる。こうして酵素製剤を〆出し、これは既
に分析の目的に使用できる。さらK[製することが望ま
しい場合には、有利に硫酸アンモニウム分別、加熱工程
ならびにクロマトグラフィーが適用される。
よって酵製 素を沈殿させる。こうして酵素製剤を〆出し、これは既
に分析の目的に使用できる。さらK[製することが望ま
しい場合には、有利に硫酸アンモニウム分別、加熱工程
ならびにクロマトグラフィーが適用される。
微生物の分解は、自体公知の化学的または物理的方法に
従い、たとえば化学的にリゾチームを用いるかまたは物
理的に超音波、高圧懸濁液中での分解等によって行なわ
れる。分解法は重要ではない。しかしとくに適当なのは
、細胞膜を十分に溶解するような方法である。
従い、たとえば化学的にリゾチームを用いるかまたは物
理的に超音波、高圧懸濁液中での分解等によって行なわ
れる。分解法は重要ではない。しかしとくに適当なのは
、細胞膜を十分に溶解するような方法である。
加熱工程は有利に50℃で、酵素が良好な安定性を有す
る…範囲内で行なわれる。
る…範囲内で行なわれる。
クロマトグラフィー44を製には、殊にフェニルセフア
ロースおよびDEAE基を有する弱塩基性の陰イオン交
換体が有利であることが立証されでのりゾチームー解、
可溶性ポリエチレンイミンの添加による沈殿、それの沈
殿物の収得、硫酸アンモニウム分別、50℃、pH8に
おける加熱処理の実施、フェニルセファロースによるク
ロマトグラフィー、D]1AE−セファセル(8eph
acθ1■)によるクロマトグラフィー、引続く有利に
七フアクリル(5ephacryi■)8200による
分子篩分別である。こうして・ 2・1メ値/タンパク
賀1rn9の比活性を有する純粋な酵素製剤が得られ、
これで酵素の性貴を迎1定することができる。
ロースおよびDEAE基を有する弱塩基性の陰イオン交
換体が有利であることが立証されでのりゾチームー解、
可溶性ポリエチレンイミンの添加による沈殿、それの沈
殿物の収得、硫酸アンモニウム分別、50℃、pH8に
おける加熱処理の実施、フェニルセファロースによるク
ロマトグラフィー、D]1AE−セファセル(8eph
acθ1■)によるクロマトグラフィー、引続く有利に
七フアクリル(5ephacryi■)8200による
分子篩分別である。こうして・ 2・1メ値/タンパク
賀1rn9の比活性を有する純粋な酵素製剤が得られ、
これで酵素の性貴を迎1定することができる。
酵素を得るための微生物は、有利に、炭素源および窒素
諒として1−メチルヒダントインをビタミンおよび痕跡
金属とともに含有する培養基上で培養する。
諒として1−メチルヒダントインをビタミンおよび痕跡
金属とともに含有する培養基上で培養する。
本発明のもう1つの対象は、緩衝せる水溶液中のクレア
チニンを測定するため、クレアチニンをクレアチニンデ
イミナーゼE、 C,3,5゜4.21で1−メチルヒ
ダントインに変え、これを有利に過剰に存在するヌクレ
オシドトリホスフェートおよび多価金属イオンの存在で
1−メチルヒダントイナーゼを用いて加水分解し、a)
1−メチルヒダントインから形成した加水分解生成物
をN−カルバモイルサルコシンアミドヒドロラーゼを用
いてサルコシンの形成下に測定し、サルコシンをサルコ
シンオキシダーゼまたはサルコシンヂヒドロデナーゼを
用いて検出するか、またはb)同時に形成したヌクレオ
シドジホスフェートを測定する、クレアチニンの測定法
である。
チニンを測定するため、クレアチニンをクレアチニンデ
イミナーゼE、 C,3,5゜4.21で1−メチルヒ
ダントインに変え、これを有利に過剰に存在するヌクレ
オシドトリホスフェートおよび多価金属イオンの存在で
1−メチルヒダントイナーゼを用いて加水分解し、a)
1−メチルヒダントインから形成した加水分解生成物
をN−カルバモイルサルコシンアミドヒドロラーゼを用
いてサルコシンの形成下に測定し、サルコシンをサルコ
シンオキシダーゼまたはサルコシンヂヒドロデナーゼを
用いて検出するか、またはb)同時に形成したヌクレオ
シドジホスフェートを測定する、クレアチニンの測定法
である。
生成する加水分解生成物は、反応速度および後接された
、N−カルバモイルサルコシンアミドヒドロラーゼを用
℃・る指示薬反応における測定信号の高さに関して、1
−メチルヒダントインの代りに等モル量のN−カルバモ
イルサルコシンを添加した反応バッチと実際に全く同じ
に挙動する(第2図および第3図参照)。
、N−カルバモイルサルコシンアミドヒドロラーゼを用
℃・る指示薬反応における測定信号の高さに関して、1
−メチルヒダントインの代りに等モル量のN−カルバモ
イルサルコシンを添加した反応バッチと実際に全く同じ
に挙動する(第2図および第3図参照)。
緩衝せる水溶液のPH11fIIは、有利にpH7,0
と9゜0の間、とくにpH7,3とpH8,5の間、殊
にPH7゜5とpH8,2の間である。PI−1fIf
lIを調節するためには、上記pi(範囲内で十分な緩
衝力を有する物置、たとえばホスフェート、トリス、ト
リエタノールアミンまたはTBSが挙げられる。殊にT
BS緩衝剤が有利である。緩衝剤の濃度は一般VC10
〜500 ミIJ モに/ lj、とくに5o〜2oo
ミリモル/lの間、とくに有利に75〜125ミリモル
/lの間である。
と9゜0の間、とくにpH7,3とpH8,5の間、殊
にPH7゜5とpH8,2の間である。PI−1fIf
lIを調節するためには、上記pi(範囲内で十分な緩
衝力を有する物置、たとえばホスフェート、トリス、ト
リエタノールアミンまたはTBSが挙げられる。殊にT
BS緩衝剤が有利である。緩衝剤の濃度は一般VC10
〜500 ミIJ モに/ lj、とくに5o〜2oo
ミリモル/lの間、とくに有利に75〜125ミリモル
/lの間である。
ヌクレオシPトリホスフェートとしてはATPまたはG
TPが埜げられ: ATPがすぐれている。
TPが埜げられ: ATPがすぐれている。
この場合、濃度範囲は有利に0.05〜50 S IJ
モル/lの間、とくに0.5〜20ミリモル/lの間、
殊に有利に1〜10ミリモル/lの間である。
モル/lの間、とくに0.5〜20ミリモル/lの間、
殊に有利に1〜10ミリモル/lの間である。
多価金属イオンとしては、有利に2価の金属イオンが使
用され二殊に有利にMgイオンおよびMnイオン、殊に
MgC/2またはMg804 ノようなその水溶性塩(
またはMgアスパルテート)の形のMgイオンが使用さ
れる。この場合、金属イオンの謎度は、有利に0.1〜
50ミリモル/l、 とくに0.5〜20ミリモル/l
、殊に有利には1〜10ミリモル/lの間にある。
用され二殊に有利にMgイオンおよびMnイオン、殊に
MgC/2またはMg804 ノようなその水溶性塩(
またはMgアスパルテート)の形のMgイオンが使用さ
れる。この場合、金属イオンの謎度は、有利に0.1〜
50ミリモル/l、 とくに0.5〜20ミリモル/l
、殊に有利には1〜10ミリモル/lの間にある。
反応混合物1−あたり、普通0.01〜10U、殊に0
.05〜2U、有利に0.1〜I U(7)1−メチル
ヒダントイナーゼが使用される。
.05〜2U、有利に0.1〜I U(7)1−メチル
ヒダントイナーゼが使用される。
1−メチルヒダントイナーゼの活性増加のたメニハ、ア
ンモニウム塩の添加が有利であることが立証された;こ
の場合態度は有利には0.1〜100ミリモル/l、有
利に1〜3oミリモル/11殊に5〜10ミリモル/l
の間にある。
ンモニウム塩の添加が有利であることが立証された;こ
の場合態度は有利には0.1〜100ミリモル/l、有
利に1〜3oミリモル/11殊に5〜10ミリモル/l
の間にある。
クレアチニン−イミノヒドロラーゼは、有利ニO−1〜
20U/mJ、とくに0.05〜15U/11殊に1〜
10U/l!で使用される。
20U/mJ、とくに0.05〜15U/11殊に1〜
10U/l!で使用される。
IJ−カルバモイルサルコシンアミドヒドロラーゼに対
しては、0.1〜20 U /ml、有利に0゜5〜1
0tr/m、殊に1〜5U/m/の活性濃度にあてはま
る。
しては、0.1〜20 U /ml、有利に0゜5〜1
0tr/m、殊に1〜5U/m/の活性濃度にあてはま
る。
サルコシンオキシダーゼに対する有利な範囲は、1〜2
Q U/mA!、殊に2〜1oU/ml、と(K有利
には4〜8U/mlである。同じことは使用可能なサル
コシンデヒドロゲナーゼについても言える。
Q U/mA!、殊に2〜1oU/ml、と(K有利
には4〜8U/mlである。同じことは使用可能なサル
コシンデヒドロゲナーゼについても言える。
サルコシンオキシダーゼまたはサルコシンデヒドロゲナ
ーゼを用いるサルコシンの検出は公知であり、このため
に記載されかつ当業者に公知の条件は本発明の範囲内で
も適している。同じことは、形成したヌクレオシドジホ
スフェート、つまりADPまたはGDPの検出について
もあてはまる。このためにも、公知の方法ないしは試薬
を使用することができる。
ーゼを用いるサルコシンの検出は公知であり、このため
に記載されかつ当業者に公知の条件は本発明の範囲内で
も適している。同じことは、形成したヌクレオシドジホ
スフェート、つまりADPまたはGDPの検出について
もあてはまる。このためにも、公知の方法ないしは試薬
を使用することができる。
形成したサルコシンを検出するためには、公知のサルコ
シンオキシダーゼ反応の使用がとく眞有利である。サル
コシン酸化の経過は電気化学的に反応媒体中の02消費
量またはR202形成によって追究するかまたは有利に
酵素的にH2O2またはホルムアルデヒドの形成によっ
て追究することができる。とくに有利に、H2O2の測
定は測光的に、しかも殊に2+ C6−トリブロム−6
−ヒドロキシ安息香酸と4−アミノアンチピリンとの酸
化的カップリング妊よるペルオキシダーゼ接触の呈色反
応で行なわれる。この場合、ペルオキシダーゼ活性は0
.05〜20U/ ml 、有利に0.2〜10u/m
、殊に0.5〜5U/1rLlである。トリブロムヒド
ロキシ安息香酸は、1〜25ミリモル/l、有利に2〜
20ミリモル/1%殊に5〜10ミリモル/lの濃度で
使用される。4−アミノアンチピリンに対しては0.1
〜2ミリモル/l、有利に0.2〜1.5ミリモル/l
、殊に0.5〜1ミリモル/ l (111度が有利で
あることが立証された。しかし、H2O2またはホルム
アルデヒドを検出するための他の公知系も同様に使用す
ることができる。
シンオキシダーゼ反応の使用がとく眞有利である。サル
コシン酸化の経過は電気化学的に反応媒体中の02消費
量またはR202形成によって追究するかまたは有利に
酵素的にH2O2またはホルムアルデヒドの形成によっ
て追究することができる。とくに有利に、H2O2の測
定は測光的に、しかも殊に2+ C6−トリブロム−6
−ヒドロキシ安息香酸と4−アミノアンチピリンとの酸
化的カップリング妊よるペルオキシダーゼ接触の呈色反
応で行なわれる。この場合、ペルオキシダーゼ活性は0
.05〜20U/ ml 、有利に0.2〜10u/m
、殊に0.5〜5U/1rLlである。トリブロムヒド
ロキシ安息香酸は、1〜25ミリモル/l、有利に2〜
20ミリモル/1%殊に5〜10ミリモル/lの濃度で
使用される。4−アミノアンチピリンに対しては0.1
〜2ミリモル/l、有利に0.2〜1.5ミリモル/l
、殊に0.5〜1ミリモル/ l (111度が有利で
あることが立証された。しかし、H2O2またはホルム
アルデヒドを検出するための他の公知系も同様に使用す
ることができる。
″ 1−メチルヒダントイナーゼはヌクレオシドホスフ
ェートを化学搦°論的にヌクレオシドジホスフェートに
変えるので、1−メチルヒダントインから形成した反応
生成物の測定に代えて、同時に形成したヌクレオシドジ
ホスフェート、殊にADPの測定をクレアチニン測冗の
基碇にすることができる。ADP 11定の適当な方法
は、殊にベルクマイヤ−(H,U、 Bergmeye
r ト1メトーデン・デルのエンチマテイッシェンΦア
ナリューゼ(Methodew der enzyma
tischen Analyθθ)“第6版(1971
年)第2128頁以降および2178頁以降から公知で
ある。従って、ここでは詳細な記載は不要である。
ェートを化学搦°論的にヌクレオシドジホスフェートに
変えるので、1−メチルヒダントインから形成した反応
生成物の測定に代えて、同時に形成したヌクレオシドジ
ホスフェート、殊にADPの測定をクレアチニン測冗の
基碇にすることができる。ADP 11定の適当な方法
は、殊にベルクマイヤ−(H,U、 Bergmeye
r ト1メトーデン・デルのエンチマテイッシェンΦア
ナリューゼ(Methodew der enzyma
tischen Analyθθ)“第6版(1971
年)第2128頁以降および2178頁以降から公知で
ある。従って、ここでは詳細な記載は不要である。
本発明のも51つの対象は、1−メチルヒダントイナー
ゼを含有することを特徴とする、クレアチニン測定試薬
である。
ゼを含有することを特徴とする、クレアチニン測定試薬
である。
とくに、この試薬はクレアチニンデイミナーゼ、1−メ
チルヒダントイナーゼ、ATPまたはGTp、2価の金
属イオン、N−カルバモイルサルコシンアミドヒドロラ
ーゼ、サルコシンオキシダーゼまたはサルコシンデヒド
ロゲナーゼおよび緩衝剤PH7,D〜9.0を含有する
。
チルヒダントイナーゼ、ATPまたはGTp、2価の金
属イオン、N−カルバモイルサルコシンアミドヒドロラ
ーゼ、サルコシンオキシダーゼまたはサルコシンデヒド
ロゲナーゼおよび緩衝剤PH7,D〜9.0を含有する
。
試薬は、とくに付加的にH2O2またはホルムアルデヒ
ドの測定系またはたとえはサルコシンデヒドロゲナーゼ
反応を11接可視的にするためのテトラゾリウム塩をも
含有する。これらの系は、たとえばベルクマイヤー(H
,U、 Bergmθyer)著“メトーデンΦデル・
エンチマテイッシエン・アナリューゼ’ (Verla
g Chemie、 Veinheim )から公知で
ある。
ドの測定系またはたとえはサルコシンデヒドロゲナーゼ
反応を11接可視的にするためのテトラゾリウム塩をも
含有する。これらの系は、たとえばベルクマイヤー(H
,U、 Bergmθyer)著“メトーデンΦデル・
エンチマテイッシエン・アナリューゼ’ (Verla
g Chemie、 Veinheim )から公知で
ある。
上記成分のほかに、反応混合物はなお防腐剤、たとえば
ナトリウムアジド、トリグリセリドに濁 よって泗〆した試料を澄明にするための洗剤およびリパ
ーゼ、ならびに試料中のビリルビンまたはアスコルビン
酸によって惹起される、I(202検出反応の障害物を
除去するだめのアスコルベートオキシダーゼおよびフェ
ロシアン化カリウムのような助剤を含有しうる。反応混
合物を1−メチルヒダントインだけの測定に使用するた
めには、クレアチニンイミノヒドロラーゼを省略するこ
ともできる。
ナトリウムアジド、トリグリセリドに濁 よって泗〆した試料を澄明にするための洗剤およびリパ
ーゼ、ならびに試料中のビリルビンまたはアスコルビン
酸によって惹起される、I(202検出反応の障害物を
除去するだめのアスコルベートオキシダーゼおよびフェ
ロシアン化カリウムのような助剤を含有しうる。反応混
合物を1−メチルヒダントインだけの測定に使用するた
めには、クレアチニンイミノヒドロラーゼを省略するこ
ともできる。
本発明による試薬は、2価の金属イオンとして有利に殊
に、上記に既述したようにマグネシウムイオンまたはマ
ンガンイオンを含有する。
に、上記に既述したようにマグネシウムイオンまたはマ
ンガンイオンを含有する。
上記の反応成分は、多孔性の担持材料上に含浸して存在
し、従ってたとえばいわゆる試験紙を用いるクレアチニ
ンないしは1−メチルヒダントインの定i−げy7;c
いしは定性的測定を口」能にすることかできる。
し、従ってたとえばいわゆる試験紙を用いるクレアチニ
ンないしは1−メチルヒダントインの定i−げy7;c
いしは定性的測定を口」能にすることかできる。
(t17の有利な英頒j例においては、本発明による試
薬はクレアチニンデイミナーゼ、1−メチルヒダントイ
ナーゼ、ATPまたはGTP、2・1曲の金属イオン、
殊にMg4+イオンまたはMn”−イオン、AI)Pま
たはGDP +all定糸およびAfL側創pi(7,
(J〜9゜0を含有する。
薬はクレアチニンデイミナーゼ、1−メチルヒダントイ
ナーゼ、ATPまたはGTP、2・1曲の金属イオン、
殊にMg4+イオンまたはMn”−イオン、AI)Pま
たはGDP +all定糸およびAfL側創pi(7,
(J〜9゜0を含有する。
さらにこの場合、緩仙工首1]としては燐酸カリウム緩
衝剤が有利であり:緩衝剤、クレアチニンイミナーゼ、
1−メチルヒダントイナーゼ、ATP、Mg+イオンま
たは1.An+Fイオンならびに場合によりアンモニウ
ム塩のν度につ℃・ては上記の記載が同様にあてはまる
。
衝剤が有利であり:緩衝剤、クレアチニンイミナーゼ、
1−メチルヒダントイナーゼ、ATP、Mg+イオンま
たは1.An+Fイオンならびに場合によりアンモニウ
ム塩のν度につ℃・ては上記の記載が同様にあてはまる
。
ADP検出はとくに、ホスホエノールピルベートおよび
NAD)(の存在におけるピルベート・キナーゼ/ラク
テートデヒドロゲナーゼの組合せ反応を用いて行なわれ
、その際形成したADPのにおけるNADH消費量によ
って¥!!握される。この方法は、当業者には公知であ
り、従ってここで詳述する必要はな℃・。
NAD)(の存在におけるピルベート・キナーゼ/ラク
テートデヒドロゲナーゼの組合せ反応を用いて行なわれ
、その際形成したADPのにおけるNADH消費量によ
って¥!!握される。この方法は、当業者には公知であ
り、従ってここで詳述する必要はな℃・。
反応混合物を1−メチルヒダントインだけの測定に使用
するためには、クレアチニンイミノヒドロラーゼを省略
することもできる。
するためには、クレアチニンイミノヒドロラーゼを省略
することもできる。
実施例
下記の略語および記号を使用する:
AS: 硫酸アンモニウム
Carb−ホスフェート: カルバミルホス7エート
ミノヒドロラーゼ
クレアチニン測定試薬へゼ: クレアチニン−イミノヒ
ドロラーゼ 1−メチルヒダントイナーゼ、NMHアーセ゛:1−メ
チルヒダントインヒドロラーゼ N−メチルヒダントイン、NMH: 1−メチルヒダン
トイン QDz 光密度 PABS : パラ−アミノ安恩査酸 ppt: ピロ燐酸塩 Tms : 2−(C)リス−(ヒドロキシメチル)メ
チル〕)アミノエタンスルホン 酸 TRIEI:)リス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 例 1 A)親菌株の培養 アル\ロバクタースペシイス(Arthrobac’t
er 5pecies ) DI3M 2’563 (
畑の土から単離)を、次の組成の傾斜寒天上で6週間#
種状態に保った: 11あたり: Na2)IP04 m2月20 7 &、 KE2PO
43,9,Na(J!1tnl、トレーサー1g液2
0.1 ml!、ビタミン溶液 iml、寒天20g pH7,5 ” ト レー サーlとす7eビ l MnCl2 ・4H20100”9、 FeCJ31+
6)120 1 00即、CoCl2・2)12010
0 m9を蒸留水IQQmlに溶解、滅菌 この溶g1梯を媒体11に添加 好トレーサー溶液2 CaC12・2H201mg、ZnCl211n51、
(NH4)2MoO411n9、CoCl211611
20 Ill’s’を蒸留水100〜に溶解、滅菌 この溶液0.1Mを媒体11に添加 ”ビタミン溶液 上記した液状媒体10m1に、白金丼1杯の傾R寒天物
質を接種し、1[]Qmlのエルシンマイヤーフラスコ
中で28℃で20〜24時間振とうする。引続き、この
溶110m1(−第1m備培養)を同じ媒体10Q[i
mlに移し、11のエルシンマイヤーフラスコ中で20
01rLlスつ28℃で24時間引続き発育させる(O
Dl:20= 0.425 )。
ドロラーゼ 1−メチルヒダントイナーゼ、NMHアーセ゛:1−メ
チルヒダントインヒドロラーゼ N−メチルヒダントイン、NMH: 1−メチルヒダン
トイン QDz 光密度 PABS : パラ−アミノ安恩査酸 ppt: ピロ燐酸塩 Tms : 2−(C)リス−(ヒドロキシメチル)メ
チル〕)アミノエタンスルホン 酸 TRIEI:)リス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 例 1 A)親菌株の培養 アル\ロバクタースペシイス(Arthrobac’t
er 5pecies ) DI3M 2’563 (
畑の土から単離)を、次の組成の傾斜寒天上で6週間#
種状態に保った: 11あたり: Na2)IP04 m2月20 7 &、 KE2PO
43,9,Na(J!1tnl、トレーサー1g液2
0.1 ml!、ビタミン溶液 iml、寒天20g pH7,5 ” ト レー サーlとす7eビ l MnCl2 ・4H20100”9、 FeCJ31+
6)120 1 00即、CoCl2・2)12010
0 m9を蒸留水IQQmlに溶解、滅菌 この溶g1梯を媒体11に添加 好トレーサー溶液2 CaC12・2H201mg、ZnCl211n51、
(NH4)2MoO411n9、CoCl211611
20 Ill’s’を蒸留水100〜に溶解、滅菌 この溶液0.1Mを媒体11に添加 ”ビタミン溶液 上記した液状媒体10m1に、白金丼1杯の傾R寒天物
質を接種し、1[]Qmlのエルシンマイヤーフラスコ
中で28℃で20〜24時間振とうする。引続き、この
溶110m1(−第1m備培養)を同じ媒体10Q[i
mlに移し、11のエルシンマイヤーフラスコ中で20
01rLlスつ28℃で24時間引続き発育させる(O
Dl:20= 0.425 )。
最大の酵素合成は、生長の終り(あとの対叙相)忙生起
する。J:述したバッチから、1[1[1)および16
0 U / A! C3Haee (R−カルバモイル
ザルコシンアミドヒトロラー、+!+)を有する湿潤混
合物1180J/が得られる。
する。J:述したバッチから、1[1[1)および16
0 U / A! C3Haee (R−カルバモイル
ザルコシンアミドヒトロラー、+!+)を有する湿潤混
合物1180J/が得られる。
b)酵素の単離および精製
湿潤混合物28C#(=N養液アルスロバクター20#
)から、5 o OU NMHK%がisされた: マトグラフイー浴出 液 最終製剤: データ: 22.3 U /m1 10.5 tny / m13 2、IU/即蛋白質 50係り゛リセリン 50ミリモル/1Tf(Is 献1=8.3 活性度測定は次のようにして実施した=1、着色剤0 TES KOH緩衝液(pH7,8) 162ミリモル
/14−アミノアンチピリン 0.81ミリモル/1M
gC128,1ミリモル/1 ATP 4.3ミリモル/l (HE4)2so、 32ミリモル/IC8H7−ゼ
1.IUZa サルコシンオキシダーゼ 、6.5U/wLlペルオキ
シダーゼ 2・7u7m′ 2.1−メチルヒダントイン溶液 10ミリモル/16
、測定の実施 波長546 nm ; T = 25℃;層厚I Cm
:試験量2.03 ml ; 生成した色素の吸光率=16cm ” /μモル混合し
、契合により試料中に含まれているサルコシンおよびN
−カルバモイルサルコシンが反応して消失するまで待ち
、次℃・でと混合し、吸光増加を追跡し、線形範囲から
△E/minを舗かめる (試料物質):粗製抽出物の611J定のために、トリ
ス・nct (pH8,0)、20ミリモル/lならび
にトライトン(Trlton ) X −1000,1
%を含有する、微生物の高速遠心分離せる超音波分解の
上澄液を使用。
)から、5 o OU NMHK%がisされた: マトグラフイー浴出 液 最終製剤: データ: 22.3 U /m1 10.5 tny / m13 2、IU/即蛋白質 50係り゛リセリン 50ミリモル/1Tf(Is 献1=8.3 活性度測定は次のようにして実施した=1、着色剤0 TES KOH緩衝液(pH7,8) 162ミリモル
/14−アミノアンチピリン 0.81ミリモル/1M
gC128,1ミリモル/1 ATP 4.3ミリモル/l (HE4)2so、 32ミリモル/IC8H7−ゼ
1.IUZa サルコシンオキシダーゼ 、6.5U/wLlペルオキ
シダーゼ 2・7u7m′ 2.1−メチルヒダントイン溶液 10ミリモル/16
、測定の実施 波長546 nm ; T = 25℃;層厚I Cm
:試験量2.03 ml ; 生成した色素の吸光率=16cm ” /μモル混合し
、契合により試料中に含まれているサルコシンおよびN
−カルバモイルサルコシンが反応して消失するまで待ち
、次℃・でと混合し、吸光増加を追跡し、線形範囲から
△E/minを舗かめる (試料物質):粗製抽出物の611J定のために、トリ
ス・nct (pH8,0)、20ミリモル/lならび
にトライトン(Trlton ) X −1000,1
%を含有する、微生物の高速遠心分離せる超音波分解の
上澄液を使用。
■上記2項、3 b)項、4.5および6項による実験
のために、相応する物質濃度または添加される物質の一
類を変えた。
のために、相応する物質濃度または添加される物質の一
類を変えた。
4、計 算
註:八E/minは0.06よりも大きくてはならない
、さもないと試料が薄くなる( Log相 約5分) 例 2 モラクセラヴペツク(Moraxella 5pec
) DSM25+152 (牛舎試料から単離)を、例
1に記載したように傾斜寒天上に保持し、アル10バク
ター・スペックと同じ培地中で培養する。
、さもないと試料が薄くなる( Log相 約5分) 例 2 モラクセラヴペツク(Moraxella 5pec
) DSM25+152 (牛舎試料から単離)を、例
1に記載したように傾斜寒天上に保持し、アル10バク
ター・スペックと同じ培地中で培養する。
準備培養
20 rnl NMH培地/100WLlエルレンマイ
ヤーを傾斜寒天から接種し、28℃で21時間振とうす
る( OD 1 : 20 = 0.430 )主培養 15 0.440 26 24 0.550 80 39 Q、67D 59 45 0.750 46 例 4 ミクロコツカス・スペック(Micrococuθθp
ec、 ) DSM 2565 (土壌試料から単離)
を、例2におけるモラクセラのように培養する。
ヤーを傾斜寒天から接種し、28℃で21時間振とうす
る( OD 1 : 20 = 0.430 )主培養 15 0.440 26 24 0.550 80 39 Q、67D 59 45 0.750 46 例 4 ミクロコツカス・スペック(Micrococuθθp
ec、 ) DSM 2565 (土壌試料から単離)
を、例2におけるモラクセラのように培養する。
準備培養
21h/28℃、OD 1 : 20=0.62024
0、690 53 27.5 0.800 83 例 5 1.1−メチルヒダントインを測定するための酵素的着
色試験(1−メチルヒダントイナーゼ/N−カルバモイ
ルサルコシンアミドヒドロラーゼ/?ルコシンオキシダ
ーゼ反応、ベルオキシダーt′/4−アミノアンチピリ
ン/2. 、i。
0、690 53 27.5 0.800 83 例 5 1.1−メチルヒダントインを測定するための酵素的着
色試験(1−メチルヒダントイナーゼ/N−カルバモイ
ルサルコシンアミドヒドロラーゼ/?ルコシンオキシダ
ーゼ反応、ベルオキシダーt′/4−アミノアンチピリ
ン/2. 、i。
6−ドリブロムー5−ヒドロキシ安息含酸呈色指示薬系
使用) 1.1 試薬: Tgs@xon (pH7,8) 100ミリモル/1
MgC125ミリモル/1 ATP 5ミリモル/l N′H4Cl 10ミリモル/1 4−アミノアンチビ′リン 0.5ミリモル/lシンア
ミドヒドロラーゼ サルコシンオキシダーゼ 5 U/l ペルオキシダーゼ 2 U/l 1.2 測定の実施 波長 :546nm 層厚さ”、 10 mtn s温度:25℃試桑盲検値
に対して測定 クベット中にピペットで秤取 試薬1.1 2.001d ’ 2.00111/試料
+)0.10縦 − 混合し7.10分間保温し、引続きRLに対するPの吸
光(△E)を測定 ”)1−メチルヒダントインの水溶液、87.7〜17
54μモル/l 使用した試料中の1−メチルヒダントインのそのつどの
濃度に対する△Eの依存性は第1図に表示されている。
使用) 1.1 試薬: Tgs@xon (pH7,8) 100ミリモル/1
MgC125ミリモル/1 ATP 5ミリモル/l N′H4Cl 10ミリモル/1 4−アミノアンチビ′リン 0.5ミリモル/lシンア
ミドヒドロラーゼ サルコシンオキシダーゼ 5 U/l ペルオキシダーゼ 2 U/l 1.2 測定の実施 波長 :546nm 層厚さ”、 10 mtn s温度:25℃試桑盲検値
に対して測定 クベット中にピペットで秤取 試薬1.1 2.001d ’ 2.00111/試料
+)0.10縦 − 混合し7.10分間保温し、引続きRLに対するPの吸
光(△E)を測定 ”)1−メチルヒダントインの水溶液、87.7〜17
54μモル/l 使用した試料中の1−メチルヒダントインのそのつどの
濃度に対する△Eの依存性は第1図に表示されている。
例 6
例5からの試薬1.1を用いるN−カルバモイルサルコ
シンの測定 測定の実施は、例5からの1.2項と同様に行なう、但
し1−メチルヒダントイン水溶液の代りに等モル濃度(
87,7〜1754μモル/l)のN−カルバモイルサ
ルコシンな有する相応する試料を試験に使用する。
シンの測定 測定の実施は、例5からの1.2項と同様に行なう、但
し1−メチルヒダントイン水溶液の代りに等モル濃度(
87,7〜1754μモル/l)のN−カルバモイルサ
ルコシンな有する相応する試料を試験に使用する。
N−カルバモイルサルコシンの濃度に対する測定し、た
吸光値の依存性は第2図に表示されている。
吸光値の依存性は第2図に表示されている。
例5および例6により測定した吸光値開の比較は、それ
ぞれ等モル濃度の1−メチルヒダントイン試料およびN
−カルバモイルサルコシン試料を用い同じ高さの着色信
号(Farbsignal)が測定される(第6図)こ
とを示す。
ぞれ等モル濃度の1−メチルヒダントイン試料およびN
−カルバモイルサルコシン試料を用い同じ高さの着色信
号(Farbsignal)が測定される(第6図)こ
とを示す。
例 7
1−メチルヒダントイン測定のための酵素的UV試験(
1−メチルヒダントイナーゼ/ピルベートキナーゼ/ラ
クテートデヒドロゲナーゼ反応) Zl 試薬 Zl、1 試薬I: 成 分 試薬中の濃度 燐酸カリウム(pi(8,0) 75ミリモル/1NA
D)1 0.25ミリモル/1 ATP 1.30ミリモル/l ホスホエノールビルベー) 1.、!12ミリモル/1
MgC122,[JOミリモル/l ピルベート−キナーゼ 4 U /rnAラクテートー
デヒドロrナーゼ 10U〜7.1.21−メチルヒダ
ントイナーゼ(15U/ml 50%グリセリン中、P
H8,0) Z2 測定の実施 波長 :365nm 層厚 : 10闘 温度 = 25℃ 反応混合物盲検値に対する測定 クベット中にピペットで秤取二 試薬1 1.00711J 1.007d試料**)
Q、20ILl− 水 0.20mJ 4分間保温、試料の涼秋光(Eよ、P)およびRLの涼
秋光(E工、□L)を迎1定、次いでこれに混入 さらに5〜10分後に、p (E2.P)およびRL(
E2.RL)の吸光を測定。
1−メチルヒダントイナーゼ/ピルベートキナーゼ/ラ
クテートデヒドロゲナーゼ反応) Zl 試薬 Zl、1 試薬I: 成 分 試薬中の濃度 燐酸カリウム(pi(8,0) 75ミリモル/1NA
D)1 0.25ミリモル/1 ATP 1.30ミリモル/l ホスホエノールビルベー) 1.、!12ミリモル/1
MgC122,[JOミリモル/l ピルベート−キナーゼ 4 U /rnAラクテートー
デヒドロrナーゼ 10U〜7.1.21−メチルヒダ
ントイナーゼ(15U/ml 50%グリセリン中、P
H8,0) Z2 測定の実施 波長 :365nm 層厚 : 10闘 温度 = 25℃ 反応混合物盲検値に対する測定 クベット中にピペットで秤取二 試薬1 1.00711J 1.007d試料**)
Q、20ILl− 水 0.20mJ 4分間保温、試料の涼秋光(Eよ、P)およびRLの涼
秋光(E工、□L)を迎1定、次いでこれに混入 さらに5〜10分後に、p (E2.P)およびRL(
E2.RL)の吸光を測定。
w=(Bよ+P ”2+P)”1+RL−E2+RL”
”’軸) 1−メチルヒダントイン水溶液、87゜7〜
877μモル/l ”0)註= 1−メチルヒダントイナーゼ製剤はなお著
量のATPアーゼまたはNADHオキシターセを含有す
る、これは1−メチルヒダントイナーゼ溶液の添加後、
反応混合物盲検値パンチ中でNADHの明らかな減少に
現われ、E2+Pおよび”2+l(Lはそれぞれ、)J
MHアーゼを混加してから正確に寺L℃・時間間隔後(
たとえば6.00分後)に読取る。
”’軸) 1−メチルヒダントイン水溶液、87゜7〜
877μモル/l ”0)註= 1−メチルヒダントイナーゼ製剤はなお著
量のATPアーゼまたはNADHオキシターセを含有す
る、これは1−メチルヒダントイナーゼ溶液の添加後、
反応混合物盲検値パンチ中でNADHの明らかな減少に
現われ、E2+Pおよび”2+l(Lはそれぞれ、)J
MHアーゼを混加してから正確に寺L℃・時間間隔後(
たとえば6.00分後)に読取る。
に料中の1−メチルヒダントインのそのつどの濃度と測
定された吸光率(△E)との間の関連性は第4図に表示
されており;1−メチルヒダントインの加水分解の際に
生じたADP量の、365 nmにおけるNADHの分
子吸光率に関する計算から、1−メチルヒダントイン加
水分解に対するATP消費なし・しはADP生成の反応
化学量論1:1が得られる(第5図)。
定された吸光率(△E)との間の関連性は第4図に表示
されており;1−メチルヒダントインの加水分解の際に
生じたADP量の、365 nmにおけるNADHの分
子吸光率に関する計算から、1−メチルヒダントイン加
水分解に対するATP消費なし・しはADP生成の反応
化学量論1:1が得られる(第5図)。
例 8
クレアチニンの測定のための酵素着色試験81 試薬:
クレアチニンイミノヒドロラーゼの添加分2U/+++
6(最終0度)を有する例5からの試薬1.1に相当 8.2 測定の実施: 例5からの1.2項に一致するが、試料としてクレアチ
ニン水溶液87.7〜1754μモル/lを使用し、P
およびRLの保温時間を20分に延長する。
6(最終0度)を有する例5からの試薬1.1に相当 8.2 測定の実施: 例5からの1.2項に一致するが、試料としてクレアチ
ニン水溶液87.7〜1754μモル/lを使用し、P
およびRLの保温時間を20分に延長する。
試料中のクレアチニンの濃度に対する△Eの依存性は第
6図にプロットされて℃・る。
6図にプロットされて℃・る。
試薬8.1からクレアチニンイミノヒドロラーゼを省略
すると、呈色反応は認められず、試験パッチ8.2中で
クレアチニン溶液の代りにクレアチニン溶液884μモ
ル/lを試料として使用する場合も同じ。
すると、呈色反応は認められず、試験パッチ8.2中で
クレアチニン溶液の代りにクレアチニン溶液884μモ
ル/lを試料として使用する場合も同じ。
添付図面は本発明を実施例と関連して説明するためのも
ので、 第1図は、例5により得られる吸光値の、使用した1−
メチルヒダントイン菫との依存性を示す線図であり、 第2図は、例6における1−メチルヒダントインの代り
にN−カルバモイルサルコシンを使用する場合の第1図
による線図であり、第6図は、例5および例6の結果を
対比する同上線図であり、 第4図は、例7に対する第1図による同上線図であり、 第5図は化学量論的ADP生成を示す線図であり、 第6図は例8に対する第1図による線図である。
ので、 第1図は、例5により得られる吸光値の、使用した1−
メチルヒダントイン菫との依存性を示す線図であり、 第2図は、例6における1−メチルヒダントインの代り
にN−カルバモイルサルコシンを使用する場合の第1図
による線図であり、第6図は、例5および例6の結果を
対比する同上線図であり、 第4図は、例7に対する第1図による同上線図であり、 第5図は化学量論的ADP生成を示す線図であり、 第6図は例8に対する第1図による線図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.1−メチルヒダントインをヌクレオシドホスフェー
トおよび多側金属イオンの存在で加水分解する、1−メ
チルヒダントイナーゼ。 2、分子輩約125000 (s:os勾配ケル電気泳
動)、最適pHpH7,8,1−メチルヒダントインに
対するxMo、o 2ミリモル/l、およ3、アルスロ
バクタ−φスペック、DBM2563、DEIM 25
64、モラクセラ・スペック。 DSM 2562 、ミクロコツカス争スペック。 DSM 2565またはブレビバクテリウム・スペック
、D8M2843を培養し、酵素を単離することを特徴
とする1−メチルヒダントイナーゼの製出法。 4、微生物を分解し、酵素をポリエチレンイミンで沈殿
させ、場合により硫酸アンモニウム分別、加熱工程およ
びクロマトグラフィーによって濃縮する、特許請求の範
囲第3項記載の方法。 5、 クレアチニンをクレアチニン・デイミナーゼFl
i、C,3,5,4,21で1−メチルヒダントインに
変え、これをヌクレオシドトリホスフェートおよび多価
金属イオンの存在で1−メチルヒダントイナーゼを用(
・て加水分解し、a)1−メチルヒダントインから生成
した加水分解生成物をN−カルバモイルサルコシンアミ
ドヒドロラーゼを用(・てサルコシンの形成下に測定し
かつサルコシンをサルコシンオキシダーゼまたはサルコ
シンデヒドロデナーゼを用し・て検出するかまたは+1
)1同時に生成したヌクレオシドトホスフェートヲ11
1111 定することを特徴とするクレアチニンの測定
法。 6、測定を緩衝せる水浴液中で7.0〜ν、0の18価
で実施する、特許請求の範囲第5項記載の方法。 17.3〜8.5のPH価で核分解する、特許請求の範
囲第6項記載の方法0 8、複分解を10〜500 ミIJモル/lの緩衝M1
1濃度で実施する、特許請求の範囲第5項から第7項ま
でのいずれか1項記載の方法。 9 緩衝剤濃度を50〜200ミリモル/lの間に調節
する、特許請求の範囲幀8項記載の方法。 10、ヌクレオシドトリホスフェートとしてATPを特
徴する特許請求の範囲詔5項から第9項までのいずれか
1項記載の方法。 11、ATP O,05〜50ミリモル/lを特徴する
特許請求の範囲第10項記載の方法。 12、多価金属イオンとしてマグネシウムイオンまたは
マンガンイオンを加える、特許請求の範囲第5項から第
11項までのいずれか1項記載の方法。 16、マグネシウムイオンを塩化マグネシウム、硫酸マ
グネシウムまたはマグネシウムアスパルテートの形で加
える、特許請求の範囲第12項記載の方法。 14、二価金属イオン0.1〜50ミリモル/lを加え
る、特許請求の範囲第12項または第16項記載の方法
。 15.1−メチルヒダントイナーゼ0.01〜10U
/ mlを加える、特許請求の範囲第5項から第14項
までのいずれか1項記載の方法。 16、アンモニウム塩0.1〜100ミリモル/lを加
える、特許請求の範囲第5項から第15項までのいずれ
か1項記載の方法。 17、N−カルバモイルザルコシン・アミドヒrロラー
ゼ0.1〜20U/酩を加える、特許請求の範囲第5項
から第16項までのいずれか1項記載の方法。 18、サルコシンオキシダーゼまたはサルコシンデヒド
ロゲナーゼ20 U / mlを加える、特許請求の範
囲第17項記載の方法。 191−メチルヒダントイナーゼ9を含有することを特
徴とするクレアチニンのm11定試薬。 20 クレアチニン・テ゛イミナーゼ、1−メチルヒダ
ントイナーゼ、ATPまたはGTP、2価の金kAイオ
ン、N−カルバモイルサルコシン・アミドヒドロラーゼ
、サルコシンオキシダーゼまたはサルコシンデヒドロデ
ナーゼおよび緩衝剤pH7,D〜9.0を特徴する特許
請求のfI@囲年19項記載の試薬。 21、H2O2またはホルムアルデヒドの測定系、また
はサルコシンデヒドロゲナーゼ反応を直接可視的にする
だめの発色電子受容体系を特徴する特許請求の範囲第2
0項記載の試薬。 22、クレアチニンデイミナーゼ、1−メチルヒダント
イナーゼ、ATPまたはGTP 、二価の金属イオン、
ADPまたはGDPの測定系および緩衝剤pH7,0〜
9.0を特徴する特許請求の範囲第19項記載の試薬。 23、 MgイオンまたはMnイオンを特徴する特許請
求の範囲第20項から第22項までのいずれか1項記載
の試薬。 24、 ADPの測定系がピルベートキナーゼ、ラクテ
ートデヒドロケゞナーセ゛、ホスホンエノールピルベー
トおよびNAD)Iからなる、特許請求の範囲第22項
記載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3406770.1 | 1984-02-24 | ||
DE19843406770 DE3406770A1 (de) | 1984-02-24 | 1984-02-24 | Nucleosidtriphosphat-abhaengige 1-methylhydantoinase und ihre verwendung |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS60203190A true JPS60203190A (ja) | 1985-10-14 |
JPH0373276B2 JPH0373276B2 (ja) | 1991-11-21 |
Family
ID=6228749
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60034717A Granted JPS60203190A (ja) | 1984-02-24 | 1985-02-25 | 1‐メチルヒダントイナーゼ、その製出法およびクレアチニンの測定法および測定試薬 |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
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EP (1) | EP0154269B1 (ja) |
JP (1) | JPS60203190A (ja) |
AT (1) | ATE50789T1 (ja) |
AU (1) | AU555270B2 (ja) |
CA (1) | CA1261288A (ja) |
CZ (1) | CZ277729B6 (ja) |
DD (1) | DD241919A5 (ja) |
DE (2) | DE3406770A1 (ja) |
DK (1) | DK77185A (ja) |
ES (1) | ES8602114A1 (ja) |
FI (1) | FI82071C (ja) |
HU (1) | HU194303B (ja) |
IE (1) | IE58353B1 (ja) |
ZA (1) | ZA851352B (ja) |
Cited By (2)
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---|---|---|---|---|
JPH04229181A (ja) * | 1990-07-06 | 1992-08-18 | Boehringer Mannheim Gmbh | Dna、細胞、n−メチルヒダントイナーゼ活性を有する蛋白質の取得法 |
JPH0556788A (ja) * | 1990-09-20 | 1993-03-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | 組換えdna、組換えベクター、細胞、n−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ活性を有するタンパク質の取得法、該タンパク質、クレアチニンの測定法 |
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US6524837B1 (en) | 1999-03-29 | 2003-02-25 | California Institute Of Technology | Hydantoinase variants with improved properties and their use for the production of amino acids |
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WO2017173255A1 (en) * | 2016-03-31 | 2017-10-05 | Polymer Technology Systems, Inc. | Systems and methods for electrochemical creatinine assays |
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US4215197A (en) * | 1978-08-04 | 1980-07-29 | Miles Laboratories, Inc. | Test means and method for creatinine determination |
IT1137075B (it) * | 1981-05-28 | 1986-09-03 | Chemical Lab S R L | Procedimento per la determinazione della creattinina (creatininio) in liquidi biologici, e reattivo per la sua attuazione |
DE3248145A1 (de) * | 1982-12-27 | 1984-06-28 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagenz zur bestimmung von n-carbamoylsarcosin und hierfuer geeignetes neues enzym |
-
1984
- 1984-02-24 DE DE19843406770 patent/DE3406770A1/de not_active Withdrawn
-
1985
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- 1985-02-19 AU AU38954/85A patent/AU555270B2/en not_active Ceased
- 1985-02-20 CZ CS851216A patent/CZ277729B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1985-02-20 DK DK77185A patent/DK77185A/da unknown
- 1985-02-22 ES ES540654A patent/ES8602114A1/es not_active Expired
- 1985-02-22 AT AT85101988T patent/ATE50789T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-02-22 CA CA000474964A patent/CA1261288A/en not_active Expired
- 1985-02-22 DE DE8585101988T patent/DE3576358D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-02-22 ZA ZA851352A patent/ZA851352B/xx unknown
- 1985-02-22 DD DD85273484A patent/DD241919A5/de unknown
- 1985-02-22 FI FI850732A patent/FI82071C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-02-22 HU HU85676A patent/HU194303B/hu not_active IP Right Cessation
- 1985-02-22 EP EP85101988A patent/EP0154269B1/de not_active Expired - Lifetime
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