JPH04211396A - 非Ａ１ｃ糖化ヘモグロビンに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
非Ａ１ｃ糖化ヘモグロビンに対するモノクローナル抗体Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、非Ａ１ｃ配置で糖化さ
れているヘモグロビンに対するモノクローナル抗体、
その抗体を産生するハイブリッド細胞系、および該モノ
クローナル抗体の使用法に関するものである。 【０００２】 【従来の技術】非酵素的糖化とは、炭水化物と、タンパ
ク質のアミノ末端の遊離アミノ基またはリジン残基のε
アミノ基との縮合反応である。反応は、非環状グルコー
スのアルデヒド基が求核的付加によってタンパク質アミ
ノ基に結合することで開始され、アルジミン、別名シッ
フ塩基を形成する。この中間産物は続いてアマドリ転位
によって、安定なケトアミン結合を持つ１−アミノ１−
デオキシフルクトース誘導体を形成する（コーエン（Ｃ
ｏｈｅｎ）、Ｍ．Ｐ．、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ， Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， １９８６）。この遊離糖
とタンパク質の２分子縮合は、酵素活性の影響なしにリ
ボソーム後のタンパク質の修飾を行うメカニズムを構成
するものである。 【０００３】糖化は循環の滞留時間中にタンパク質がさ
らされる周囲のグルコース濃度に一次的に依存する非酵
素的な遅い連続的反応であるため、ある種の循環タンパ
ク質の糖化レベルを平均血中グルコース濃度を追跡する
ために使用することができる。これらの二つの因子、グ
ルコース濃度と滞留時間は、増加した血中グルコース濃
度（高血糖）の程度と持続性にｉｎ ｖｉｖｏで翻訳さ
れる。 したがって、糖尿病がよく調節されていない糖尿病患者
のように、血糖値が上昇している場合、糖化されたタン
パク質量が増加する。非酵素的糖化量の測定に有用であ
ることが知られている主要な循環タンパク質は、ヘモグ
ロビンとアルブミンである。ヒトの血中の糖化アルブミ
ン量は、アルブミンが循環期間中にさらされた平均血中
グルコース濃度を反映する。この期間は約２週間である
。ヒト血中の糖化ヘモグロビン量は、ヘモグロビンが循
環期間中にさらされた平均血中グルコース濃度を反映す
る。この期間は約１００日である。 【０００４】糖化アルブミンおよびその他の血漿タンパ
ク質を測定する既知の方法としては、チオバルビツール
酸との反応に基づく呈色反応法、アフィニティークロマ
トグラフィー、フロシンを測定する高圧液体クロマトグ
ラフィー、およびフルクトサミンのアッセイが含まれる
。これらの各試験は、再現性、コスト、高価な装置、正
確度などに関して欠点があり、いずれも他の糖化血漿タ
ンパク質にたいして糖化アルブミンに特異的ではない。 糖化アルブミンは、アルブミンには存在するが他のタン
パク質には存在しない糖化されたエピトープと反応する
モノクローナル抗体で特異的に測定することができる（
米国特許出願第１４７，３６３号）。タルシオ（Ｔａｒ
ｓｉｏ）（米国特許第４，７９７，４７３号）は、糖化
血清タンパク質と優先的に反応するモノクローナル抗体
を報告している。これらの以前に報告された抗体のうち
、糖化ヘモグロビンと反応するものはない。 本分野で
報告されている他の糖化タンパク質に対する抗体は、ボ
ロヒドリド還元によって糖化エピトープがグルシトール
−リジンに転換されてはじめて反応する（カーティス（
Ｃｕｒｔｉｓｓ）とウィツテュム（Ｗｉｔｚｔｕｍ）、
Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７２：１４２７
−１４３８，１９８３； ナカヤマ他、 Ｊ． Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇ． Ｍｅｔｈ． ９９：９５−１００，１
９８７）。 【０００５】糖化ヘモグロビンを測定するための既知の
方法としては、イオン交換またはホウ酸アフィニティー
カラムによるクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、およびア
ガロースゲル電気泳動が含まれる。これらの各試験は、
複雑さ、高価な装置、正確度、変動性などの要素に関し
て欠点があり、ヘモグロビンＡ１ｃ配置におけるもの以
外の糖化エピトープを持つ糖化ヘモグロビンに特異的な
ものはない。 ノウルズ（Ｋｎｏｗｌｅｓ）他、 （米
国特許第４，７２７，０３６号）は、ヘモグロビンＡ１
ｃを決定するための抗体を産生したが、これらの抗体は
ヒトヘモグロビンのβサブユニットのＮ末端以外の部位
でヘモグロビンに存在する糖化エピトープとは反応しな
い。ヘモグロビン分子のβサブユニットのＮ末端以外の
部位で糖化されたヘモグロビンと反応する可能性のある
本分野で報告された他の抗体は、ボロヒドリド還元によ
って糖化されたエピトープがグルシトール−リジンに転
換された場合にのみ反応する（カーティスとウィツテュ
ム、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７２：１４２
７−１４３８， １９８３）。 【０００６】グルコースとヘモグロビン間の反応の主要
な産物は：（１）ヘモグロビンＡ１ｃ（β鎖のアミノ末
端バリン残基にグルコースが結合していることを除いて
は、ヘモグロビンＡ０と同じ）；および（２）αおよび
βサブユニットの他の部位で糖化されたヘモグロビン、
以後糖化ヘモグロビンと呼ぶ。糖化ヘモグロビンはグル
コースがαまたはβ鎖のリジン残基のεアミノ基に連結
していることを除いてはヘモグロビンＡ０と同じである
。ｉｎｖｉｖｏで糖化されるリジン残基は、β−ｌｙｓ
−６６、 α−ｌｙｓ−６１、 β−ｌｙｓ−１７であ
り、 ｉｎ ｖｉｔｒｏではα−ｌｙｓ−１６、 β−
ｌｙｓ−６６、 β−ｌｙｓ−１７、 α−ｌｙｓ−７
およびβ−ｌｙｓ−１２０である。リジン残基と形成さ
れたこれらの糖化ヘモグロビンの量は糖尿病検体中で増
加しており（ガベイ（Ｇａｂｂａｙ）他、 Ｄｉａｂｅ
ｔｅｓ ２８：３３７−３４０、１９７９； ガーリッ
ク（Ｇａｒｌｉｃｋ）他、 Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖ
ｅｓｔ． ７１：１０６２−１０７２， １９８３）、
糖化ヘモグロビンは全ヘモグロビンの１０％以上を占め
る場合がある。 以上のように、以前の９０から１２
０日間の血中グルコース濃度の正確な指標がその測定に
よって与えられるため、糖化ヘモグロビン量を正確に、
および特異的に定量化することが望ましい。 【０００７】 【発明が解決すべき課題】疾病の効果的な診断の目的で
、糖化ヘモグロビンに存在する特異的な糖化エピトープ
であるＮ−デオキシフルクトシルリジンと反応できるモ
ノクローナル抗体を与えることが、本発明の目的である
。 【０００８】本発明の別の目的は、糖化ヘモグロビンに
存在するがヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＡ１ｃまた
は他のタンパク質には存在しない特異的な糖化エピトー
プとは反応するモノクローナル抗体を用いる疾病の診断
法を与えることである。 【０００９】本発明の別の目的は、非酵素的に糖化され
たヘモグロビンの測定のための新しく、改善された方法
を与えることである。 【００１０】本発明のさらに別の目的は、糖尿病患者の
血中の糖化ヘモグロビン量を測定することによって患者
の糖調節を追跡する新しく、改善された方法を与えるこ
とである。 【００１１】本発明の別の目的は、１回の血液試験で糖
尿病の診断を行うための新しい方法を与えることである
。 【００１２】本発明のさらに別の目的は、経口グルコー
ス耐性試験の結果があいまいな場合に、糖尿病診断を確
実に行うための新しい方法を与えることである。 【００１３】本発明の別の目的は、ヒトヘモグロビン検
体中の特異的な糖化エピトープのＮ−デオキシフルクト
シルリジン量を直接測定するための方法を与えることで
ある。 本発明の上記およびそのほかの目的は、糖化
ヘモグロビンの糖化された残基を構成するＮ−デオキシ
フルクトシルリジンを含む糖化ヘモグロビン上のエピト
ープに特異的に結合するモノクローナル抗体を与えるこ
とによって達成される。該抗体は、ヘモグロビンＡ０ま
たはヘモグロビンＡ１ｃあるいは他のタンパク質には、
糖化されているいないに関わらず、結合しない。したが
って、該エピトープは、タンパク質が糖化されていない
場合にもされている場合にも存在するエピトープに対す
るものである他の既知の抗体に認識されるエピトープと
は異なる（タルシオ（Ｔａｒｓｉｏ）他、米国特許第４
，７９７，４７３号）。このモノクローナル抗体に同定
されるエピトープは、人工的な修飾が成されなかったよ
うなｉｎ ｖｉｖｏで生じる配置にある。したがって、
該エピトープは、ボロヒドリド還元によってグルシトー
ル−リジンに転換されたエピトープを持つ糖化タンパク
質に対する他の既知の抗体によって認識される部位とは
異なる（カーティスとウィツテュム、Ｊ． Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ． ７２：１４２７−１４３８； ナカ
ヤマ他、 Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ９９
：９５−１００， １９８７）。 【００１４】本発明の抗体で同定されるエピトープは、
糖化されたＮ末端バリン残基を認識する、ヘモグロビン
Ａ１ｃに対する抗体に認識される部位とも異なる（ノウ
ルス、米国特許第４，７２７，０３６号参照）。正常検
体および糖尿病検体の双方で、糖化ヘモグロビンは、全
ヘモグロビンに占める割合がヘモグロビンＡ１ｃよりも
多い。したがって、糖化ヘモグロビンのアッセイはヘモ
グロビンＡ１ｃのアッセイよりも正確な測定が可能とな
る。 【００１５】 【課題を解決するための手段】本発明は、非Ａ１ｃ配置
で糖化された糖化ヘモグロビンに対するモノクローナル
抗体に関するものである。該モノクローナル抗体は、例
えば糖尿病などの疾病に関連した糖化ヘモグロビンの免
疫学的検出に非常に有用である。このモノクローナル抗
体は糖化ヘモグロビン上に存在するエピトープと反応性
を持つが、Ａ１ｃ位で糖化されているかどうかに関わら
ず他のヘモグロビンと、また、糖化されているかどうか
に関わらず他のタンパク質とは反応しない。本発明の抗
体によって同定されるエピトープはヘモグロビンＡ０に
は存在しない。 【００１６】本発明は、特異的な免疫学的認識および、
モノクローナル抗体と、抗体が唯一特異的に結合する抗
原エピトープとの反応の原理に基づくものである。認識
及び結合は、例えばＥＬＩＳＡタイプの検査によって検
出することが可能であり、それにおいて抗体はプラスチ
ックウェルの底などの固相支持体上に固定化される。ヒ
ト血液を含む試料は、赤血球を溶解することにより調製
し、ヘモグロビンを試薬にさらす。抗体結合のためにエ
ピトープを表出させる目的で、試料タンパク質を変性さ
せる必要はない。試料と酵素標識した試薬、および酵素
基質を固定化した抗体と接触させ、抗体−抗原複合体を
形成させる。大量希釈、インキュベーション、および洗
浄過程により、結合した試薬と遊離試薬が分離される。 抗原の抗体との結合、およびそれに続く酵素の基質との
反応の結果として呈色反応が起こる。呈色は試料中の糖
化エピトープの存在を示唆するものであり、色の強度に
より試料中の糖化エピトープ量の定量的測定を可能にす
る。 ＥＬＩＳＡ型アッセイは、酵素を結合させたモノクロー
ナル抗体を固定化し試料溶液と基質を添加することによ
っても、抗原または試料を固定化しモノクローナル抗体
、酵素標識試薬および基質を添加することによっても行
うことが可能である。もちろん、本発明の抗体を、本分
野で既知の他の免疫学的アッセイにおいて糖化ヘモグロ
ビンの測定に使用することもできる。 【００１７】非酵素的糖化は、グルコースのカルボニル
基（Ｃ１）とアミノ酸の遊離アミノ基とのシッフ塩基の
形成を経て行われる。基本的に、二つの型の遊離アミノ
基、すなわちタンパク質のＮ末端およびリジンまたはヒ
ドロキシリジン（ヘモグロビンはヒドロキシリジンを含
まない）のεアミノ基しか存在しない。形成されたアル
ジミン結合は、アマドリ転位を行って環構造をとること
のできるケトアミンをＣ２のカルボニル基と形成するこ
とによって安定化される。したがって、リジン残基の非
酵素的糖化の安定な産物は、Ｎ−１−（１−デオキシフ
ルクトシル）リジンである（ブン（Ｂｕｎｎ）他、Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５４：３８９２−３８９
８， １９７９； ブン他、 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００
：２１−２７， １９８７）。 【００１８】非糖尿病患者では、ヘモグロビンＡ１ｃは
全ヘモグロビンの３−４％を占め、リジン残基で糖化さ
れた糖化ヘモグロビンは全ヘモグロビンの約８％を占め
る。これらの百分率は糖尿病患者により、２倍から３倍
となる場合もある。ｉｎ ｖｉｖｏでヘモグロビンの非
Ａ１ｃ糖化は、βサブユニットの６６および１７のリジ
ン残基、およびαサブユニットの６１のリジン残基で成
される。これらの部位および他の部位はｉｎ ｖｉｔｒ
ｏでも糖化される。また、これらの部位および他の部位
の反応性は糖尿病患者のほうが非糖尿病患者よりも高い
。ｉｎ ｖｉｖｏのヘモグロビン分子におけるリジン残
基の糖化の優先順位は、β−ｌｙｓ−６６、 α−ｌｙ
ｓ−６１、 およびβ−ｌｙｓ−１７である。 ｉｎ
ｖｉｔｒｏでのヘモグロビン分子のリジン残基の糖化の
優先順位はα−ｌｙｓ−６１、β−ｌｙｓ−６６、 β
−ｌｙｓ−１７、 α−ｌｙｓ−７および、 β−ｌｙ
ｓ−１２０である。 【００１９】本発明のモノクローナル抗体ＧＬＨＢは、
ヒト赤血球抽出物から調製された糖化ヘモグロビンで免
疫したマウスから作成したものである；該抗体は、合成
（ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製）の糖化ヘモグロビンとも天
然（ｉｎ ｖｉｖｏ）の糖化ヘモグロビンとも反応する
。このことは、抗体がαまたはβサブユニットにある多
様な部位のε−Ｄ−フルクトース−リジンを認識するこ
とを示唆する。 β鎖の残基６６および１７での糖化は
ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの糖化ヘモグロ
ビンに共通のものであるため、モノクローナル抗体ＧＬ
ＨＢと反応するエピトープは、これらの糖化残基の一方
または双方を含む。さらに、ＧＬＨＢは関連のないタン
パク質中のε−Ｄ−フルクトース−リジン残基を認識し
ないことから、エピトープ認識においてヘモグロビンに
特異的な立体構造的要素が存在することが明らかである
。 【００２０】天然の糖化ヘモグロビン（抗原）は、健常
者または糖尿病患者由来の赤血球抽出物から得たヘモグ
ロビンをフェニルボロネート上のアフィニティークロマ
トグラフィーにかけ、糖化されていないヘモグロビン（
例えば、ＨｂＡ０）を糖化ヘモグロビンから分離するこ
とによって調製される。糖化画分は、続いてイオン交換
クロマトグラフィーにかけ、塩濃度勾配で溶出して、ヘ
モグロビンＡ１ｃを、Ａ１ｃ配置以外の部位で糖化され
ている糖化ヘモグロビンから分離する。天然の糖化ヘモ
グロビンは、赤血球抽出物から得たヒトヘモグロビンを
、ＰＢＳでｐＨ７．４に緩衝化した５００ｍｇ／ｄｌの
グルコースを含む溶液中２５℃で５−７日間インキュベ
ートすることによっても調製可能である。 調製物は透
析して遊離グルコースを除き、続いて同じアフィニティ
ークロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィー
精製過程を行う。糖化ヘモグロビンの存在と純度はＨＰ
ＬＣおよび、ケトアミン結合におけるグルコースに関す
るチオバルビツール酸反応で確認することができる。 【００２１】ＨｂＡ０（上述のようにフェニルボロネー
トクロマトグラフィーにかけた赤血球抽出物から得られ
たもの）の純度、および糖化エピトープが存在しないこ
とは、ＨＰＬＣおよび／またはチオバルビツール酸反応
によって確認可能である。これらの方法は、フェニルボ
ロネート分離とともに、デオキシフルクトシルリジンが
糖化ヘモグロビン調製物中に存在し、ＨｂＡ１ｃまたは
ＨｂＡ０の調製物中には存在しないことを確認するもの
である。 【００２２】モノクローナル抗体を分泌するハイブリド
ーマの産生のための一般的な方法は、本分野の技術者に
はよく知られている。 本発明の実施で用いた技術の例
は、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｈｉｅｎｃｅ
ＵＳＡ， ７５：３４０５， １９７９に述べられてい
る。 略述すると、メスＢＡＬＢ／ｃマウスを、上述の
ようにヒト赤血球から精製した糖化ヘモグロビンで４週
間ごとに免疫した。最後の免疫後、マウスを殺し、脾臓
細胞をマウス非分泌性骨髄腫細胞系と融合した。抗体産
生に関してハイブリドーマをスクリーニングし、抗体陽
性クローンをモノクローナル抗体の糖化ヘモグロビンへ
の結合に関して検査した。 【００２３】本発明のモノクローナル抗体の特異性を有
するモノクローナル抗体を分泌する他のハイブリドーマ
の単離は、スクリーニングに使用可能な抗イディオタイ
プ抗体を産生することによって（ヘーリン（Ｈｅｒｌｙ
ｎ）他、 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：１００、 １９８
６）、本分野の技術者が行うことができる。抗イディオ
タイプ抗体は、目的のハイブリドーマによって産生され
るモノクローナル抗体上に存在する特異的な決定基を認
識する抗体である。これらの決定基は抗体の超可変領域
に位置する。この領域が与えられたエピトープに結合す
るものであり、したがって、抗体の特異性を担っている
。抗イディオタイプ抗体は、目的のモノクローナル抗体
で動物を免疫することによって調製される。免疫された
動物は、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体を
産生することにより、免疫抗体のイディオタイプ決定基
を認識し、応答する。第２の動物を免疫するために使用
した、単一のハイブリドーマに産生されるモノクローナ
ル抗体に特異的な、第２の動物の抗イディオタイプ抗体
を用いることにより、免疫に用いたハイブリドーマの抗
体と同じイディオタイプを持つ抗体を産生する別のクロ
ーンを同定することが可能となり、それにより、本発明
のモノクローナル抗体の特異性を持つモノクローナル抗
体を分泌する別のハイブリドーマを探すために必要なス
クリーニング量が顕著に単純化され、軽減された。
２つのモノクローナル抗体間のイディオタイプ同一性は
、同一のエピトープ決定基の認識の点で２つのモノクロ
ーナル抗体が同一であることが示されている。したがっ
て、モノクローナル抗体上のエピトープ決定基に対する
抗イディオタイプ抗体を用いることにより、同一のエピ
トープ特異性を持つモノクローナル抗体を発現する別の
ハイブリドーマを同定することが可能である。 【００２４】あるいは、検査されるモノクローナル抗体
が、本発明のモノクローナル抗体が通常反応する特異的
抗原に結合するのを阻害するかどうかを決定することに
より、本発明のモノクローナル抗体と同じ特異性を持つ
かどうかを決定して、過剰な実験を行う事なく評価する
ことが可能である。検査されたモノクローナル抗体が本
発明のモノクローナル抗体と競合し、本発明のモノクロ
ーナル抗体による結合の減少が示されるならば、二つの
モノクローナル抗体は同一のエピトープに結合すると考
えられる。また、モノクローナル抗体は、本発明のモノ
クローナル抗体と同一の、糖化ヘモグロビンおよび他の
ヘモグロビンに対する反応パターンに関して検査するこ
ともできる。 【００２５】ある条件下では、あるアイソタイプのモノ
クローナル抗体は、その診断効率の面で、他のアイソタ
イプよりもより望ましい場合がある。モノクローナル抗
体の特異的なアイソタイプは、最初の融合からの選択に
よって直接に、または、クラススイッチ変異体を同定す
る親族選択技術によって異なるアイソタイプのモノクロ
ーナル抗体を分泌する親のハイブリドーマから二次的に
調製することが可能である（ステプロースキー（Ｓｔｅ
ｐｌｅｗｓｋｉ）他、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙｏｆ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ＵＳＡ， ８２：８６５３， １９８５；
スピラ（Ｓｐｉｒａ）他、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７４：
３０７， １９８４）。 したがって、本発明のモノク
ローナル抗体は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（メリーランド州ロックビル）に受託番号Ｈ
Ｂ１０６１６として寄託されているハイブリドーマによ
って産生されるモノクローナル抗体ＧＬＨＢの特異性を
有するクラススイッチ変異体も含むものである。 【００２６】本発明で用いる“抗体”という語は、 完
全な分子および、エピトープ決定基に結合できる、例え
ばＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２などの断片も含むことを
意図するものである。本発明のモノクローナル抗体は、
液相または固相担体に結合した状態で使用可能である、
イムノアッセイで使用するために特に適している。さら
に、このイムノアッセイでモノクローナル抗体は、いろ
いろな方法で検出できるように標識することができる。 本発明のモノクローナル抗体を使用するイムノアッセイ
のタイプの例としては、直接法または間接法の競合的ま
たは非競合的イムノアッセイである。このようなイムノ
アッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およ
びサンドイッチ（免疫測定）アッセイである。本発明の
モノクローナル抗体を用いる抗原の検出は、生理学的試
料の免疫組織学的アッセイを含む、正、逆、あるいは同
時に行われるイムノアッセイを用いて行われる。使用さ
れるイムノアッセイのタイプに関わらず、用いられる抗
体の濃度は本分野の技術によって容易に決定される。 【００２７】本発明のモノクローナル抗体は多数の異な
る担体に結合し、ＧＬＨＢによって同定される糖化ヘモ
グロビンのエピトープの存在を検出するのに用いられる
。既知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、塩
化ポリビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカ
ーボネート、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天
然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロ
ース、およびマグネタイトが含まれる。担体の性質は、
発明の目的により、可溶性あるいは不溶性である。本分
野の技術者は、モノクローナル抗体結合のための別の適
当な担体を知っている場合もあり、通常の実験技術を用
いてそれを確認することもできるであろう。本分野の技
術者には既知の、多数の異なる標識および標識法が存在
する。本発明で使用可能な標識のタイプの例としては、
酵素、放射性同位体、コロイド金属、蛍光物質、化学発
光物質、および生物発光物質が含まれる。本分野の技術
者は、モノクローナル抗体に結合させるための他の適当
な標識を知っている場合もあるであろうし、通常の実験
技術で確かめることができる。さらに、これらの標識の
、本発明のモノクローナル抗体への結合は、本分野で通
常行われている標準的方法にって行われる。 【００２８】本発明の目的のために、本発明のモノクロ
ーナル抗体に検出される糖化ヘモグロビンエピトープは
、多様な生物溶液および組織中に存在する。検出可能な
量の糖化ヘモグロビンを含むあらゆる試料が使用可能で
ある。通常、試料は、尿、唾液、脳脊髄液、血液などの
液体、または、組織、糞便などの固体または準固体であ
る。 【００２９】感度を向上させる可能性のある別の技術は
、抗体を低分子量ハプテンと結合させることからなる。 ハプテンは、２次反応によって特異的に検出され得るも
のである。例えば、アビジンと反応するビオチン、ある
いは特異的抗ハプテン抗体と反応するジニトロフェニル
、ピリドキサル、およびフルオレセインなどのハプテン
が通常用いられる。 【００３０】本発明で用いられるように、“エピトープ
”という語は、本発明のモノクローナル抗体と特異的に
相互作用できるあらゆる決定基を含むことを意図する。 エピトープ決定基は、通常アミノ酸や糖の側鎖などの分
子の化学的に活性のある表面分子群からなり、通常特異
的な３次元構造的特徴および特異的な電荷特性を持つ。 本発明の抗体は診断に効果的である。すなわち、ヘ
モグロビンＡ０と糖化ヘモグロビンを十分に区別でき、
ヒト血液試料中の糖化ヘモグロビン量を正確に測定す
ることが可能になる。ヒト赤血球中のＨｂＡ０量は糖化
ヘモグロビン量の少なくとも１０倍であるため、 糖化
ヘモグロビンの定量に適している診断に効果的な抗体は
、ＨｂＡ０よりも糖化ヘモグロビンとのはるかに高い反
応性を持つことが必要である；抗体が糖化ヘモグロビン
に存在するがＨｂＡ０には存在しないエピトープを認識
することが最も望ましい。 【００３１】 【作用】本発明の抗体は、タンパク質が糖化されている
かどうかに関わらず、糖化ヘモグロビンと他の非ヘモグ
ロビンタンパク質を区別することができる。ＧＬＨＢ抗
体が結合するエピトープは他の血清タンパク質上には存
在しない。したがって、ＧＬＨＢの使用により、血液中
に存在するヘモグロビン分子が血中に存在する一定期間
、すなわちそれまでの１００日間の血液中のグルコース
レベルを正確に測定することが可能となる。特に顕著な
のは、本発明のモノクローナル抗体が糖化ヘモグロビン
の糖化されたフルクトシルリジンエピトープと特異的に
反応するが、ヘモグロビンＡ１ｃまたはヘモグロビンＡ
０に共通ないかなるエピトープにも結合しないという特
性である。 モノクローナル抗体ＧＬＨＢは本発明で使
用される。ＧＬＨＢは、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０６１
６を持つ細胞系ＧＬＨＢから得られる抗体から得られ、
もしくはそれと同一の特徴を持つものである。 該細胞
系は米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に３０年間
寄託されている。 【００３２】 【実施例】上述の開示は、本発明を一般的に述べたもの
である。より完全な理解は、以下の特異的な実施例を参
考にして得られるであろうが、これは例として示すもの
であって、本発明の本質を制限することを意図するもの
ではない。 【００３３】 【実施例１】 糖化ヘモグロビンに対するモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系の調製メスＢ
ＡＬＢ／ｃマウスを、０．８％ ＮａＣｌ， ０．００
８Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、 および０．００１５Ｍ ＫＨ
２ＰＯ４（ｐＨ７．４）からなるリン酸緩衝化生理食塩
水に溶解した天然糖化ヘモグロビン１００μｇとフロイ
ンド完全アジュバントとを混合したもの（１：１）で免
疫した。 混合液は腹膜内に注射した。 ７日後、 不
完全アジュバントと混合した抗原（１：１）を注射し、
１週間後に抗原のみを注射して、 ４週目に３日間連
続して抗原を注射した。 最後の注射をした翌日にマウ
スを殺し、脾臓を取り除いた。 脾臓細胞をＳＰ ２／
０骨髄腫細胞と融合させ、標準的な方法によってハイブ
リドーマのコロニーを確立した（ケネット（Ｋｅｎｎｅ
ｔ）， Ｒ．Ｈ．， マッキールン（ＭｃＫｅａｒｎ）
， Ｔ．Ｊ． およびベクトル（Ｂｅｃｈｔｏｌ），
Ｋ．Ｂ．編集： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ， プレナム
出版、 ニューヨーク・ロンドン、 １９８２）。 糖
化ヘモグロビンとの結合活性を持つ得られたコロニーを
少なくとも４回、制限希釈をすることによってクローニ
ングした。 【００３４】 【実施例２】 糖化ヘモグロビンと反応するモノクロ
ーナル抗体の解析 糖化されていないヘモグロビン（Ａ０）、Ｎ末端バリン
以外の部位で糖化されている糖化ヘモグロビン（すなわ
ち、デオキシフルクトシルリジンを含むが、デオキシフ
ルクトシルバリンを含まない）、および上述のように得
られた精製ヘモグロビンＡ１ｃ（各２０−５０μｇ）を
それぞれ２試料ずつ、標準的な方法でＳＤＳ−ポリアク
リルアミドスラブゲル電気泳動を行った。 ２枚のゲル
のうち一方はタンパク質を染色して各３種の異なるヘモ
グロビン調製物の電気泳動移動度を決定した。 ２枚の
ゲルの他方は、電気泳動的にニトロセルロースに移し、
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ８．０）
中１％ミルク溶液中に１時間浸し、 つぎに糖化ヘモグ
ロビンに対して作成したモノクローナル抗体ＧＬＨＢ溶
液（ハイブリドーマ培養上清１レーンあたり１０ｍｌ）
溶液中に２時間浸した。 洗浄後、 ニトロセルロース
片をアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗
体の０．１％溶液に浸し、 続いてＴｒｉｓ／生理食塩
水／０．０１％ ミルクで徹底的に洗浄した後、 酵素
基質溶液と呈色液に浸した。 電気泳動的トランスファ
ーとイムノブロッティングは、標準的な方法で行った。 ニトロセルロース片で、モノクローナル抗体が認識す
る抗原への抗体の結合を示唆する呈色バンドの存在を位
置を確認した。 糖化されていないヘモグロビンＡ０は
、 ポリアクリルアミドゲル上で、サブユニットの期待
される分子量に対応する位置に移動した。 糖化ヘモグ
ロビン調製物の電気泳動度はわずかに遅く、 リジン残
基に結合したグルコース部分の存在による分子量の増加
と一致した。 ヘモグロビンＡ１ｃの電気泳動度も糖化
されていないヘモグロビンＡ０のものとはわずかに異な
っていた。 モノクローナル抗体ＧＬＨＢはデオキシフ
ルクトシルリジンエピトープを含まない糖化されていな
いヘモグロビンまたはヘモグロビンＡ１ｃには結合せず
、 これはこれらのタンパク質を電気泳動的にトランス
ファーし、 モノクローナル抗体ＧＬＨＢ、 酵素標識
試薬および基質と反応させた後に呈色バンドが検出され
なかったことにより示された。 それに対して、 天然
糖化ヘモグロビンのモノマー抗原の電気泳動度に対応す
る位置に、モノクローナル抗体ＧＬＨＢおよび酵素標識
試薬と基質で処理後に単一の呈色バンドが見られたこと
から、 モノクローナル抗体ＧＬＨＢは特異的に天然糖
化ヘモグロビンに結合した。 上述の実験を、 ｉｎ
ｖｉｖｏで糖化されたヘモグロビンのかわりにｉｎ ｖ
ｉｔｒｏで糖化されたヘモグロビンを用いても行った。 モノクローナル抗体ＧＬＨＢで処理後に、 糖化ヘモ
グロビンモノマーの電気泳動度に対応する単一の呈色バ
ンドが検出された。 この研究で示されたように、
モノクローナル抗体ＧＬＨＢは糖化ヘモグロビンを特異
的に認識して結合するが、 非糖化ヘモグロビンまたは
ヘモグロビンＡ１ｃは認識せず、結合しない。 モノク
ローナル抗体ＧＬＨＢによる糖化ヘモグロビンに対する
認識と結合は、 抗体が糖化ヘモグロビンとは反応する
がヘモグロビンＡ１ｃとは反応しないことから、 Ｎ−
１−（１−デオキシフルクトシル）リジンに特異的であ
る。 【００３５】 【実施例３】 モノクローナル抗体ＧＬＨＢを用いた
ヒト血液中の糖化ヘモグロビンの検出 ヒト赤血球抽出物試料をアガロースゲルで電気泳動し、
ニトロセルロースに電気泳動的にトランスファーして、
実施例２の方法によってイムノブロッティングを行った
。 【００３６】標準的なタンパク質染色から期待されたよ
うに、ヒト赤血球抽出物由来のヘモグロビンから、ヘモ
グロビンＡ０およびヘモグロビンＡ１ａ１、Ａ１ａ２、
Ａ１ｂおよびＡ１ｃを含む幾つかの微量なヘモグロビン
異形体を示すバンドが検出された。 それに対して、電
気泳動的トランスファーおよびモノクローナル抗体ＧＬ
ＨＢと酵素標識試薬および基質との反応後は、一本のバ
ンドのみが見られた。 このバンドの位置は唯一のモノ
クローナル抗体−抗原複合体の反応によって形成された
呈色産物を示すものであり、天然糖化ヘモグロビンの位
置と一致した。以上のように、 モノクローナル抗体Ｇ
ＬＨＢは幾つかのヘモグロビンを含むヒト血液中の糖化
ヘモグロビンを特異的に認識して結合し、 その幾つか
はβサブユニットのＮ末端バリンで糖化されている。
モノクローナル抗体ＧＬＨＢはＡ１ｃ位あるいはＮ末端
で修飾されている他のヘモグロビンは認識あるいは結合
しない。 【００３７】 【実施例４】 糖化ヘモグロビン以外の糖化タンパク
質とのＧＬＨＢの非反応性 ヒト血漿試料またはＮ−１−（１−デオキシフルクトシ
ル）リジン残基を含む天然の糖化ヘモグロビン試料をＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、 電気泳
動的にニトロセルロースにトランスファーして実施例２
による方法でイムノブロッティングを行った。 ヒト血
漿は標準的なタンパク質染色で複数のバンドを示し、
その分子量は２０，０００以下から２００，０００以上
の範囲にわたった。それに対して、 電気泳動的トラン
スファーおよびモノクローナル抗体ＧＬＨＢおよび酵素
標識試薬と基質による処理後にはバンドは検出されなか
った。 天然糖化アルブミンは標準的なタンパク質染色
で分子量６０，０００の単一のバンドを示すが、 電気
泳動的トランスファーおよびモノクローナル抗体ＧＬＨ
Ｂおよび酵素標識試薬と基質による処理後にはバンドは
検出されなかった。 したがって、 モノクローナル酵
素ＧＬＨＢは糖化または非糖化アルブミン、あるいは、
複数のタンパク質を含み、そのうちの幾つかは糖化され
て存在している、ヒト血漿中の他の構成物は認識せず、
結合しない。 モノクローナル抗体ＧＬＨＢはデオキシ
フルクトシルリジンを含む糖化アルブミンは認識せず、
結合しない。 【００３８】 【実施例５】 非糖化ヘモグロビンと糖化ヘモグロビ
ンのイムノアッセイにおけるＧＬＨＢの相対的反応性５
００ｎｇの非糖化ヘモグロビンＡ０、 糖化ヘモグロビ
ン、 またはヘモグロビンＡ１ｃを、炭酸−重炭酸カッ
プリング緩衝液（ｐＨ ９．６）を用いて２５℃で１８
時間処理し、プラスチックマイクロタイターウェル上に
固定化した。 結合していない抗原を洗浄した後、 炭
酸カップリング緩衝液中、１．０％ミルク溶液で、室温
で４時間反応させて洗浄し、 モノクローナル抗体ＧＬ
ＨＢ（ハイブリドーマ培養上清１００μｌ）を各ウェル
に加え、２時間反応させた。 ０．８５％ ＮａＣｌ中
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄した後、 ０．
０１％ミルク／ＰＢＳ中アルカリホスファターゼ（ＡＰ
）結合−ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を加えて室温で１時間
インキュベートした。 徹底的に水で洗浄した後、 Ａ
Ｐ基質と増幅システムを用い、 ４５０ｎｍの吸光度を
ＥＬＩＳＡリーダーで読み、 呈色産物の存在と強度を
決定した。 【００３９】
表１
抗原
呈色反応（吸光度） 非糖化ヘモグロビンＡ
０ ０．０１０
糖化ヘモグロビン（非Ａ１ｃ）
１．５００ ヘモグロビンＡ１ｃ
０．００５表１
に示すように、 モノクローナル抗体ＧＬＨＢはＥＬＩ
ＳＡタイプのイムノアッセイで、 糖化ヘモグロビンを
非糖化ヘモグロビンおよびヘモグロビンＡ１ｃから選択
的に区別できる。 【００４０】 【実施例６】 ヒト赤血球抽出物中の糖化ヘモグロビ
ンの測定 モノクローナル抗体ＧＬＨＢ（１μｇ）をプラスチック
ウェル上に固定化し、実施例５で述べたように洗浄しブ
ロッキングした。ヒト赤血球抽出物試料を各ウェルに添
加し、反応させた。洗浄後、アルカリホスファターゼ結
合ウサギ抗ヒトヘモグロビン抗体を加え、アルカリホス
ファターゼ基質と増幅システムで呈色させ、吸光度をＥ
ＬＩＳＡリーダーで記録した。試料中の糖化ヘモグロビ
ン量を、既知量の天然精製糖化ヘモグロビンをウェル中
で反応させて同じ方法で処理したものを用いた標準曲線
から算出した。全ヘモグロビンは、既知量の精製ヘモグ
ロビンの標準曲線から得られた４１５ｎｍでの吸光度か
ら算出した。 【００４１】
表２ 試料 糖化ヘモ
グロビン 全ヘモグロビン ％糖化ヘ
モグロビン 非糖尿病 ６７５ｎｇ
１３５００ｎｇ
５％ 糖尿病 １５
６０ｎｇ １３０００ｎｇ
１２％表２に示したよ
うに、 モノクローナル抗体ＧＬＨＢはヒト赤血球抽出
物試料中の糖化ヘモグロビン量を定量的に決定するため
に使用することができる。
れているヘモグロビンに対するモノクローナル抗体、
その抗体を産生するハイブリッド細胞系、および該モノ
クローナル抗体の使用法に関するものである。 【０００２】 【従来の技術】非酵素的糖化とは、炭水化物と、タンパ
ク質のアミノ末端の遊離アミノ基またはリジン残基のε
アミノ基との縮合反応である。反応は、非環状グルコー
スのアルデヒド基が求核的付加によってタンパク質アミ
ノ基に結合することで開始され、アルジミン、別名シッ
フ塩基を形成する。この中間産物は続いてアマドリ転位
によって、安定なケトアミン結合を持つ１−アミノ１−
デオキシフルクトース誘導体を形成する（コーエン（Ｃ
ｏｈｅｎ）、Ｍ．Ｐ．、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ， Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， １９８６）。この遊離糖
とタンパク質の２分子縮合は、酵素活性の影響なしにリ
ボソーム後のタンパク質の修飾を行うメカニズムを構成
するものである。 【０００３】糖化は循環の滞留時間中にタンパク質がさ
らされる周囲のグルコース濃度に一次的に依存する非酵
素的な遅い連続的反応であるため、ある種の循環タンパ
ク質の糖化レベルを平均血中グルコース濃度を追跡する
ために使用することができる。これらの二つの因子、グ
ルコース濃度と滞留時間は、増加した血中グルコース濃
度（高血糖）の程度と持続性にｉｎ ｖｉｖｏで翻訳さ
れる。 したがって、糖尿病がよく調節されていない糖尿病患者
のように、血糖値が上昇している場合、糖化されたタン
パク質量が増加する。非酵素的糖化量の測定に有用であ
ることが知られている主要な循環タンパク質は、ヘモグ
ロビンとアルブミンである。ヒトの血中の糖化アルブミ
ン量は、アルブミンが循環期間中にさらされた平均血中
グルコース濃度を反映する。この期間は約２週間である
。ヒト血中の糖化ヘモグロビン量は、ヘモグロビンが循
環期間中にさらされた平均血中グルコース濃度を反映す
る。この期間は約１００日である。 【０００４】糖化アルブミンおよびその他の血漿タンパ
ク質を測定する既知の方法としては、チオバルビツール
酸との反応に基づく呈色反応法、アフィニティークロマ
トグラフィー、フロシンを測定する高圧液体クロマトグ
ラフィー、およびフルクトサミンのアッセイが含まれる
。これらの各試験は、再現性、コスト、高価な装置、正
確度などに関して欠点があり、いずれも他の糖化血漿タ
ンパク質にたいして糖化アルブミンに特異的ではない。 糖化アルブミンは、アルブミンには存在するが他のタン
パク質には存在しない糖化されたエピトープと反応する
モノクローナル抗体で特異的に測定することができる（
米国特許出願第１４７，３６３号）。タルシオ（Ｔａｒ
ｓｉｏ）（米国特許第４，７９７，４７３号）は、糖化
血清タンパク質と優先的に反応するモノクローナル抗体
を報告している。これらの以前に報告された抗体のうち
、糖化ヘモグロビンと反応するものはない。 本分野で
報告されている他の糖化タンパク質に対する抗体は、ボ
ロヒドリド還元によって糖化エピトープがグルシトール
−リジンに転換されてはじめて反応する（カーティス（
Ｃｕｒｔｉｓｓ）とウィツテュム（Ｗｉｔｚｔｕｍ）、
Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７２：１４２７
−１４３８，１９８３； ナカヤマ他、 Ｊ． Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇ． Ｍｅｔｈ． ９９：９５−１００，１
９８７）。 【０００５】糖化ヘモグロビンを測定するための既知の
方法としては、イオン交換またはホウ酸アフィニティー
カラムによるクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、およびア
ガロースゲル電気泳動が含まれる。これらの各試験は、
複雑さ、高価な装置、正確度、変動性などの要素に関し
て欠点があり、ヘモグロビンＡ１ｃ配置におけるもの以
外の糖化エピトープを持つ糖化ヘモグロビンに特異的な
ものはない。 ノウルズ（Ｋｎｏｗｌｅｓ）他、 （米
国特許第４，７２７，０３６号）は、ヘモグロビンＡ１
ｃを決定するための抗体を産生したが、これらの抗体は
ヒトヘモグロビンのβサブユニットのＮ末端以外の部位
でヘモグロビンに存在する糖化エピトープとは反応しな
い。ヘモグロビン分子のβサブユニットのＮ末端以外の
部位で糖化されたヘモグロビンと反応する可能性のある
本分野で報告された他の抗体は、ボロヒドリド還元によ
って糖化されたエピトープがグルシトール−リジンに転
換された場合にのみ反応する（カーティスとウィツテュ
ム、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７２：１４２
７−１４３８， １９８３）。 【０００６】グルコースとヘモグロビン間の反応の主要
な産物は：（１）ヘモグロビンＡ１ｃ（β鎖のアミノ末
端バリン残基にグルコースが結合していることを除いて
は、ヘモグロビンＡ０と同じ）；および（２）αおよび
βサブユニットの他の部位で糖化されたヘモグロビン、
以後糖化ヘモグロビンと呼ぶ。糖化ヘモグロビンはグル
コースがαまたはβ鎖のリジン残基のεアミノ基に連結
していることを除いてはヘモグロビンＡ０と同じである
。ｉｎｖｉｖｏで糖化されるリジン残基は、β−ｌｙｓ
−６６、 α−ｌｙｓ−６１、 β−ｌｙｓ−１７であ
り、 ｉｎ ｖｉｔｒｏではα−ｌｙｓ−１６、 β−
ｌｙｓ−６６、 β−ｌｙｓ−１７、 α−ｌｙｓ−７
およびβ−ｌｙｓ−１２０である。リジン残基と形成さ
れたこれらの糖化ヘモグロビンの量は糖尿病検体中で増
加しており（ガベイ（Ｇａｂｂａｙ）他、 Ｄｉａｂｅ
ｔｅｓ ２８：３３７−３４０、１９７９； ガーリッ
ク（Ｇａｒｌｉｃｋ）他、 Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖ
ｅｓｔ． ７１：１０６２−１０７２， １９８３）、
糖化ヘモグロビンは全ヘモグロビンの１０％以上を占め
る場合がある。 以上のように、以前の９０から１２
０日間の血中グルコース濃度の正確な指標がその測定に
よって与えられるため、糖化ヘモグロビン量を正確に、
および特異的に定量化することが望ましい。 【０００７】 【発明が解決すべき課題】疾病の効果的な診断の目的で
、糖化ヘモグロビンに存在する特異的な糖化エピトープ
であるＮ−デオキシフルクトシルリジンと反応できるモ
ノクローナル抗体を与えることが、本発明の目的である
。 【０００８】本発明の別の目的は、糖化ヘモグロビンに
存在するがヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＡ１ｃまた
は他のタンパク質には存在しない特異的な糖化エピトー
プとは反応するモノクローナル抗体を用いる疾病の診断
法を与えることである。 【０００９】本発明の別の目的は、非酵素的に糖化され
たヘモグロビンの測定のための新しく、改善された方法
を与えることである。 【００１０】本発明のさらに別の目的は、糖尿病患者の
血中の糖化ヘモグロビン量を測定することによって患者
の糖調節を追跡する新しく、改善された方法を与えるこ
とである。 【００１１】本発明の別の目的は、１回の血液試験で糖
尿病の診断を行うための新しい方法を与えることである
。 【００１２】本発明のさらに別の目的は、経口グルコー
ス耐性試験の結果があいまいな場合に、糖尿病診断を確
実に行うための新しい方法を与えることである。 【００１３】本発明の別の目的は、ヒトヘモグロビン検
体中の特異的な糖化エピトープのＮ−デオキシフルクト
シルリジン量を直接測定するための方法を与えることで
ある。 本発明の上記およびそのほかの目的は、糖化
ヘモグロビンの糖化された残基を構成するＮ−デオキシ
フルクトシルリジンを含む糖化ヘモグロビン上のエピト
ープに特異的に結合するモノクローナル抗体を与えるこ
とによって達成される。該抗体は、ヘモグロビンＡ０ま
たはヘモグロビンＡ１ｃあるいは他のタンパク質には、
糖化されているいないに関わらず、結合しない。したが
って、該エピトープは、タンパク質が糖化されていない
場合にもされている場合にも存在するエピトープに対す
るものである他の既知の抗体に認識されるエピトープと
は異なる（タルシオ（Ｔａｒｓｉｏ）他、米国特許第４
，７９７，４７３号）。このモノクローナル抗体に同定
されるエピトープは、人工的な修飾が成されなかったよ
うなｉｎ ｖｉｖｏで生じる配置にある。したがって、
該エピトープは、ボロヒドリド還元によってグルシトー
ル−リジンに転換されたエピトープを持つ糖化タンパク
質に対する他の既知の抗体によって認識される部位とは
異なる（カーティスとウィツテュム、Ｊ． Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ． ７２：１４２７−１４３８； ナカ
ヤマ他、 Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ９９
：９５−１００， １９８７）。 【００１４】本発明の抗体で同定されるエピトープは、
糖化されたＮ末端バリン残基を認識する、ヘモグロビン
Ａ１ｃに対する抗体に認識される部位とも異なる（ノウ
ルス、米国特許第４，７２７，０３６号参照）。正常検
体および糖尿病検体の双方で、糖化ヘモグロビンは、全
ヘモグロビンに占める割合がヘモグロビンＡ１ｃよりも
多い。したがって、糖化ヘモグロビンのアッセイはヘモ
グロビンＡ１ｃのアッセイよりも正確な測定が可能とな
る。 【００１５】 【課題を解決するための手段】本発明は、非Ａ１ｃ配置
で糖化された糖化ヘモグロビンに対するモノクローナル
抗体に関するものである。該モノクローナル抗体は、例
えば糖尿病などの疾病に関連した糖化ヘモグロビンの免
疫学的検出に非常に有用である。このモノクローナル抗
体は糖化ヘモグロビン上に存在するエピトープと反応性
を持つが、Ａ１ｃ位で糖化されているかどうかに関わら
ず他のヘモグロビンと、また、糖化されているかどうか
に関わらず他のタンパク質とは反応しない。本発明の抗
体によって同定されるエピトープはヘモグロビンＡ０に
は存在しない。 【００１６】本発明は、特異的な免疫学的認識および、
モノクローナル抗体と、抗体が唯一特異的に結合する抗
原エピトープとの反応の原理に基づくものである。認識
及び結合は、例えばＥＬＩＳＡタイプの検査によって検
出することが可能であり、それにおいて抗体はプラスチ
ックウェルの底などの固相支持体上に固定化される。ヒ
ト血液を含む試料は、赤血球を溶解することにより調製
し、ヘモグロビンを試薬にさらす。抗体結合のためにエ
ピトープを表出させる目的で、試料タンパク質を変性さ
せる必要はない。試料と酵素標識した試薬、および酵素
基質を固定化した抗体と接触させ、抗体−抗原複合体を
形成させる。大量希釈、インキュベーション、および洗
浄過程により、結合した試薬と遊離試薬が分離される。 抗原の抗体との結合、およびそれに続く酵素の基質との
反応の結果として呈色反応が起こる。呈色は試料中の糖
化エピトープの存在を示唆するものであり、色の強度に
より試料中の糖化エピトープ量の定量的測定を可能にす
る。 ＥＬＩＳＡ型アッセイは、酵素を結合させたモノクロー
ナル抗体を固定化し試料溶液と基質を添加することによ
っても、抗原または試料を固定化しモノクローナル抗体
、酵素標識試薬および基質を添加することによっても行
うことが可能である。もちろん、本発明の抗体を、本分
野で既知の他の免疫学的アッセイにおいて糖化ヘモグロ
ビンの測定に使用することもできる。 【００１７】非酵素的糖化は、グルコースのカルボニル
基（Ｃ１）とアミノ酸の遊離アミノ基とのシッフ塩基の
形成を経て行われる。基本的に、二つの型の遊離アミノ
基、すなわちタンパク質のＮ末端およびリジンまたはヒ
ドロキシリジン（ヘモグロビンはヒドロキシリジンを含
まない）のεアミノ基しか存在しない。形成されたアル
ジミン結合は、アマドリ転位を行って環構造をとること
のできるケトアミンをＣ２のカルボニル基と形成するこ
とによって安定化される。したがって、リジン残基の非
酵素的糖化の安定な産物は、Ｎ−１−（１−デオキシフ
ルクトシル）リジンである（ブン（Ｂｕｎｎ）他、Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５４：３８９２−３８９
８， １９７９； ブン他、 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００
：２１−２７， １９８７）。 【００１８】非糖尿病患者では、ヘモグロビンＡ１ｃは
全ヘモグロビンの３−４％を占め、リジン残基で糖化さ
れた糖化ヘモグロビンは全ヘモグロビンの約８％を占め
る。これらの百分率は糖尿病患者により、２倍から３倍
となる場合もある。ｉｎ ｖｉｖｏでヘモグロビンの非
Ａ１ｃ糖化は、βサブユニットの６６および１７のリジ
ン残基、およびαサブユニットの６１のリジン残基で成
される。これらの部位および他の部位はｉｎ ｖｉｔｒ
ｏでも糖化される。また、これらの部位および他の部位
の反応性は糖尿病患者のほうが非糖尿病患者よりも高い
。ｉｎ ｖｉｖｏのヘモグロビン分子におけるリジン残
基の糖化の優先順位は、β−ｌｙｓ−６６、 α−ｌｙ
ｓ−６１、 およびβ−ｌｙｓ−１７である。 ｉｎ
ｖｉｔｒｏでのヘモグロビン分子のリジン残基の糖化の
優先順位はα−ｌｙｓ−６１、β−ｌｙｓ−６６、 β
−ｌｙｓ−１７、 α−ｌｙｓ−７および、 β−ｌｙ
ｓ−１２０である。 【００１９】本発明のモノクローナル抗体ＧＬＨＢは、
ヒト赤血球抽出物から調製された糖化ヘモグロビンで免
疫したマウスから作成したものである；該抗体は、合成
（ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製）の糖化ヘモグロビンとも天
然（ｉｎ ｖｉｖｏ）の糖化ヘモグロビンとも反応する
。このことは、抗体がαまたはβサブユニットにある多
様な部位のε−Ｄ−フルクトース−リジンを認識するこ
とを示唆する。 β鎖の残基６６および１７での糖化は
ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの糖化ヘモグロ
ビンに共通のものであるため、モノクローナル抗体ＧＬ
ＨＢと反応するエピトープは、これらの糖化残基の一方
または双方を含む。さらに、ＧＬＨＢは関連のないタン
パク質中のε−Ｄ−フルクトース−リジン残基を認識し
ないことから、エピトープ認識においてヘモグロビンに
特異的な立体構造的要素が存在することが明らかである
。 【００２０】天然の糖化ヘモグロビン（抗原）は、健常
者または糖尿病患者由来の赤血球抽出物から得たヘモグ
ロビンをフェニルボロネート上のアフィニティークロマ
トグラフィーにかけ、糖化されていないヘモグロビン（
例えば、ＨｂＡ０）を糖化ヘモグロビンから分離するこ
とによって調製される。糖化画分は、続いてイオン交換
クロマトグラフィーにかけ、塩濃度勾配で溶出して、ヘ
モグロビンＡ１ｃを、Ａ１ｃ配置以外の部位で糖化され
ている糖化ヘモグロビンから分離する。天然の糖化ヘモ
グロビンは、赤血球抽出物から得たヒトヘモグロビンを
、ＰＢＳでｐＨ７．４に緩衝化した５００ｍｇ／ｄｌの
グルコースを含む溶液中２５℃で５−７日間インキュベ
ートすることによっても調製可能である。 調製物は透
析して遊離グルコースを除き、続いて同じアフィニティ
ークロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィー
精製過程を行う。糖化ヘモグロビンの存在と純度はＨＰ
ＬＣおよび、ケトアミン結合におけるグルコースに関す
るチオバルビツール酸反応で確認することができる。 【００２１】ＨｂＡ０（上述のようにフェニルボロネー
トクロマトグラフィーにかけた赤血球抽出物から得られ
たもの）の純度、および糖化エピトープが存在しないこ
とは、ＨＰＬＣおよび／またはチオバルビツール酸反応
によって確認可能である。これらの方法は、フェニルボ
ロネート分離とともに、デオキシフルクトシルリジンが
糖化ヘモグロビン調製物中に存在し、ＨｂＡ１ｃまたは
ＨｂＡ０の調製物中には存在しないことを確認するもの
である。 【００２２】モノクローナル抗体を分泌するハイブリド
ーマの産生のための一般的な方法は、本分野の技術者に
はよく知られている。 本発明の実施で用いた技術の例
は、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｈｉｅｎｃｅ
ＵＳＡ， ７５：３４０５， １９７９に述べられてい
る。 略述すると、メスＢＡＬＢ／ｃマウスを、上述の
ようにヒト赤血球から精製した糖化ヘモグロビンで４週
間ごとに免疫した。最後の免疫後、マウスを殺し、脾臓
細胞をマウス非分泌性骨髄腫細胞系と融合した。抗体産
生に関してハイブリドーマをスクリーニングし、抗体陽
性クローンをモノクローナル抗体の糖化ヘモグロビンへ
の結合に関して検査した。 【００２３】本発明のモノクローナル抗体の特異性を有
するモノクローナル抗体を分泌する他のハイブリドーマ
の単離は、スクリーニングに使用可能な抗イディオタイ
プ抗体を産生することによって（ヘーリン（Ｈｅｒｌｙ
ｎ）他、 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：１００、 １９８
６）、本分野の技術者が行うことができる。抗イディオ
タイプ抗体は、目的のハイブリドーマによって産生され
るモノクローナル抗体上に存在する特異的な決定基を認
識する抗体である。これらの決定基は抗体の超可変領域
に位置する。この領域が与えられたエピトープに結合す
るものであり、したがって、抗体の特異性を担っている
。抗イディオタイプ抗体は、目的のモノクローナル抗体
で動物を免疫することによって調製される。免疫された
動物は、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体を
産生することにより、免疫抗体のイディオタイプ決定基
を認識し、応答する。第２の動物を免疫するために使用
した、単一のハイブリドーマに産生されるモノクローナ
ル抗体に特異的な、第２の動物の抗イディオタイプ抗体
を用いることにより、免疫に用いたハイブリドーマの抗
体と同じイディオタイプを持つ抗体を産生する別のクロ
ーンを同定することが可能となり、それにより、本発明
のモノクローナル抗体の特異性を持つモノクローナル抗
体を分泌する別のハイブリドーマを探すために必要なス
クリーニング量が顕著に単純化され、軽減された。
２つのモノクローナル抗体間のイディオタイプ同一性は
、同一のエピトープ決定基の認識の点で２つのモノクロ
ーナル抗体が同一であることが示されている。したがっ
て、モノクローナル抗体上のエピトープ決定基に対する
抗イディオタイプ抗体を用いることにより、同一のエピ
トープ特異性を持つモノクローナル抗体を発現する別の
ハイブリドーマを同定することが可能である。 【００２４】あるいは、検査されるモノクローナル抗体
が、本発明のモノクローナル抗体が通常反応する特異的
抗原に結合するのを阻害するかどうかを決定することに
より、本発明のモノクローナル抗体と同じ特異性を持つ
かどうかを決定して、過剰な実験を行う事なく評価する
ことが可能である。検査されたモノクローナル抗体が本
発明のモノクローナル抗体と競合し、本発明のモノクロ
ーナル抗体による結合の減少が示されるならば、二つの
モノクローナル抗体は同一のエピトープに結合すると考
えられる。また、モノクローナル抗体は、本発明のモノ
クローナル抗体と同一の、糖化ヘモグロビンおよび他の
ヘモグロビンに対する反応パターンに関して検査するこ
ともできる。 【００２５】ある条件下では、あるアイソタイプのモノ
クローナル抗体は、その診断効率の面で、他のアイソタ
イプよりもより望ましい場合がある。モノクローナル抗
体の特異的なアイソタイプは、最初の融合からの選択に
よって直接に、または、クラススイッチ変異体を同定す
る親族選択技術によって異なるアイソタイプのモノクロ
ーナル抗体を分泌する親のハイブリドーマから二次的に
調製することが可能である（ステプロースキー（Ｓｔｅ
ｐｌｅｗｓｋｉ）他、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙｏｆ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ＵＳＡ， ８２：８６５３， １９８５；
スピラ（Ｓｐｉｒａ）他、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７４：
３０７， １９８４）。 したがって、本発明のモノク
ローナル抗体は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（メリーランド州ロックビル）に受託番号Ｈ
Ｂ１０６１６として寄託されているハイブリドーマによ
って産生されるモノクローナル抗体ＧＬＨＢの特異性を
有するクラススイッチ変異体も含むものである。 【００２６】本発明で用いる“抗体”という語は、 完
全な分子および、エピトープ決定基に結合できる、例え
ばＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２などの断片も含むことを
意図するものである。本発明のモノクローナル抗体は、
液相または固相担体に結合した状態で使用可能である、
イムノアッセイで使用するために特に適している。さら
に、このイムノアッセイでモノクローナル抗体は、いろ
いろな方法で検出できるように標識することができる。 本発明のモノクローナル抗体を使用するイムノアッセイ
のタイプの例としては、直接法または間接法の競合的ま
たは非競合的イムノアッセイである。このようなイムノ
アッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およ
びサンドイッチ（免疫測定）アッセイである。本発明の
モノクローナル抗体を用いる抗原の検出は、生理学的試
料の免疫組織学的アッセイを含む、正、逆、あるいは同
時に行われるイムノアッセイを用いて行われる。使用さ
れるイムノアッセイのタイプに関わらず、用いられる抗
体の濃度は本分野の技術によって容易に決定される。 【００２７】本発明のモノクローナル抗体は多数の異な
る担体に結合し、ＧＬＨＢによって同定される糖化ヘモ
グロビンのエピトープの存在を検出するのに用いられる
。既知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、塩
化ポリビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカ
ーボネート、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天
然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロ
ース、およびマグネタイトが含まれる。担体の性質は、
発明の目的により、可溶性あるいは不溶性である。本分
野の技術者は、モノクローナル抗体結合のための別の適
当な担体を知っている場合もあり、通常の実験技術を用
いてそれを確認することもできるであろう。本分野の技
術者には既知の、多数の異なる標識および標識法が存在
する。本発明で使用可能な標識のタイプの例としては、
酵素、放射性同位体、コロイド金属、蛍光物質、化学発
光物質、および生物発光物質が含まれる。本分野の技術
者は、モノクローナル抗体に結合させるための他の適当
な標識を知っている場合もあるであろうし、通常の実験
技術で確かめることができる。さらに、これらの標識の
、本発明のモノクローナル抗体への結合は、本分野で通
常行われている標準的方法にって行われる。 【００２８】本発明の目的のために、本発明のモノクロ
ーナル抗体に検出される糖化ヘモグロビンエピトープは
、多様な生物溶液および組織中に存在する。検出可能な
量の糖化ヘモグロビンを含むあらゆる試料が使用可能で
ある。通常、試料は、尿、唾液、脳脊髄液、血液などの
液体、または、組織、糞便などの固体または準固体であ
る。 【００２９】感度を向上させる可能性のある別の技術は
、抗体を低分子量ハプテンと結合させることからなる。 ハプテンは、２次反応によって特異的に検出され得るも
のである。例えば、アビジンと反応するビオチン、ある
いは特異的抗ハプテン抗体と反応するジニトロフェニル
、ピリドキサル、およびフルオレセインなどのハプテン
が通常用いられる。 【００３０】本発明で用いられるように、“エピトープ
”という語は、本発明のモノクローナル抗体と特異的に
相互作用できるあらゆる決定基を含むことを意図する。 エピトープ決定基は、通常アミノ酸や糖の側鎖などの分
子の化学的に活性のある表面分子群からなり、通常特異
的な３次元構造的特徴および特異的な電荷特性を持つ。 本発明の抗体は診断に効果的である。すなわち、ヘ
モグロビンＡ０と糖化ヘモグロビンを十分に区別でき、
ヒト血液試料中の糖化ヘモグロビン量を正確に測定す
ることが可能になる。ヒト赤血球中のＨｂＡ０量は糖化
ヘモグロビン量の少なくとも１０倍であるため、 糖化
ヘモグロビンの定量に適している診断に効果的な抗体は
、ＨｂＡ０よりも糖化ヘモグロビンとのはるかに高い反
応性を持つことが必要である；抗体が糖化ヘモグロビン
に存在するがＨｂＡ０には存在しないエピトープを認識
することが最も望ましい。 【００３１】 【作用】本発明の抗体は、タンパク質が糖化されている
かどうかに関わらず、糖化ヘモグロビンと他の非ヘモグ
ロビンタンパク質を区別することができる。ＧＬＨＢ抗
体が結合するエピトープは他の血清タンパク質上には存
在しない。したがって、ＧＬＨＢの使用により、血液中
に存在するヘモグロビン分子が血中に存在する一定期間
、すなわちそれまでの１００日間の血液中のグルコース
レベルを正確に測定することが可能となる。特に顕著な
のは、本発明のモノクローナル抗体が糖化ヘモグロビン
の糖化されたフルクトシルリジンエピトープと特異的に
反応するが、ヘモグロビンＡ１ｃまたはヘモグロビンＡ
０に共通ないかなるエピトープにも結合しないという特
性である。 モノクローナル抗体ＧＬＨＢは本発明で使
用される。ＧＬＨＢは、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０６１
６を持つ細胞系ＧＬＨＢから得られる抗体から得られ、
もしくはそれと同一の特徴を持つものである。 該細胞
系は米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に３０年間
寄託されている。 【００３２】 【実施例】上述の開示は、本発明を一般的に述べたもの
である。より完全な理解は、以下の特異的な実施例を参
考にして得られるであろうが、これは例として示すもの
であって、本発明の本質を制限することを意図するもの
ではない。 【００３３】 【実施例１】 糖化ヘモグロビンに対するモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系の調製メスＢ
ＡＬＢ／ｃマウスを、０．８％ ＮａＣｌ， ０．００
８Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、 および０．００１５Ｍ ＫＨ
２ＰＯ４（ｐＨ７．４）からなるリン酸緩衝化生理食塩
水に溶解した天然糖化ヘモグロビン１００μｇとフロイ
ンド完全アジュバントとを混合したもの（１：１）で免
疫した。 混合液は腹膜内に注射した。 ７日後、 不
完全アジュバントと混合した抗原（１：１）を注射し、
１週間後に抗原のみを注射して、 ４週目に３日間連
続して抗原を注射した。 最後の注射をした翌日にマウ
スを殺し、脾臓を取り除いた。 脾臓細胞をＳＰ ２／
０骨髄腫細胞と融合させ、標準的な方法によってハイブ
リドーマのコロニーを確立した（ケネット（Ｋｅｎｎｅ
ｔ）， Ｒ．Ｈ．， マッキールン（ＭｃＫｅａｒｎ）
， Ｔ．Ｊ． およびベクトル（Ｂｅｃｈｔｏｌ），
Ｋ．Ｂ．編集： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ， プレナム
出版、 ニューヨーク・ロンドン、 １９８２）。 糖
化ヘモグロビンとの結合活性を持つ得られたコロニーを
少なくとも４回、制限希釈をすることによってクローニ
ングした。 【００３４】 【実施例２】 糖化ヘモグロビンと反応するモノクロ
ーナル抗体の解析 糖化されていないヘモグロビン（Ａ０）、Ｎ末端バリン
以外の部位で糖化されている糖化ヘモグロビン（すなわ
ち、デオキシフルクトシルリジンを含むが、デオキシフ
ルクトシルバリンを含まない）、および上述のように得
られた精製ヘモグロビンＡ１ｃ（各２０−５０μｇ）を
それぞれ２試料ずつ、標準的な方法でＳＤＳ−ポリアク
リルアミドスラブゲル電気泳動を行った。 ２枚のゲル
のうち一方はタンパク質を染色して各３種の異なるヘモ
グロビン調製物の電気泳動移動度を決定した。 ２枚の
ゲルの他方は、電気泳動的にニトロセルロースに移し、
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ８．０）
中１％ミルク溶液中に１時間浸し、 つぎに糖化ヘモグ
ロビンに対して作成したモノクローナル抗体ＧＬＨＢ溶
液（ハイブリドーマ培養上清１レーンあたり１０ｍｌ）
溶液中に２時間浸した。 洗浄後、 ニトロセルロース
片をアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗
体の０．１％溶液に浸し、 続いてＴｒｉｓ／生理食塩
水／０．０１％ ミルクで徹底的に洗浄した後、 酵素
基質溶液と呈色液に浸した。 電気泳動的トランスファ
ーとイムノブロッティングは、標準的な方法で行った。 ニトロセルロース片で、モノクローナル抗体が認識す
る抗原への抗体の結合を示唆する呈色バンドの存在を位
置を確認した。 糖化されていないヘモグロビンＡ０は
、 ポリアクリルアミドゲル上で、サブユニットの期待
される分子量に対応する位置に移動した。 糖化ヘモグ
ロビン調製物の電気泳動度はわずかに遅く、 リジン残
基に結合したグルコース部分の存在による分子量の増加
と一致した。 ヘモグロビンＡ１ｃの電気泳動度も糖化
されていないヘモグロビンＡ０のものとはわずかに異な
っていた。 モノクローナル抗体ＧＬＨＢはデオキシフ
ルクトシルリジンエピトープを含まない糖化されていな
いヘモグロビンまたはヘモグロビンＡ１ｃには結合せず
、 これはこれらのタンパク質を電気泳動的にトランス
ファーし、 モノクローナル抗体ＧＬＨＢ、 酵素標識
試薬および基質と反応させた後に呈色バンドが検出され
なかったことにより示された。 それに対して、 天然
糖化ヘモグロビンのモノマー抗原の電気泳動度に対応す
る位置に、モノクローナル抗体ＧＬＨＢおよび酵素標識
試薬と基質で処理後に単一の呈色バンドが見られたこと
から、 モノクローナル抗体ＧＬＨＢは特異的に天然糖
化ヘモグロビンに結合した。 上述の実験を、 ｉｎ
ｖｉｖｏで糖化されたヘモグロビンのかわりにｉｎ ｖ
ｉｔｒｏで糖化されたヘモグロビンを用いても行った。 モノクローナル抗体ＧＬＨＢで処理後に、 糖化ヘモ
グロビンモノマーの電気泳動度に対応する単一の呈色バ
ンドが検出された。 この研究で示されたように、
モノクローナル抗体ＧＬＨＢは糖化ヘモグロビンを特異
的に認識して結合するが、 非糖化ヘモグロビンまたは
ヘモグロビンＡ１ｃは認識せず、結合しない。 モノク
ローナル抗体ＧＬＨＢによる糖化ヘモグロビンに対する
認識と結合は、 抗体が糖化ヘモグロビンとは反応する
がヘモグロビンＡ１ｃとは反応しないことから、 Ｎ−
１−（１−デオキシフルクトシル）リジンに特異的であ
る。 【００３５】 【実施例３】 モノクローナル抗体ＧＬＨＢを用いた
ヒト血液中の糖化ヘモグロビンの検出 ヒト赤血球抽出物試料をアガロースゲルで電気泳動し、
ニトロセルロースに電気泳動的にトランスファーして、
実施例２の方法によってイムノブロッティングを行った
。 【００３６】標準的なタンパク質染色から期待されたよ
うに、ヒト赤血球抽出物由来のヘモグロビンから、ヘモ
グロビンＡ０およびヘモグロビンＡ１ａ１、Ａ１ａ２、
Ａ１ｂおよびＡ１ｃを含む幾つかの微量なヘモグロビン
異形体を示すバンドが検出された。 それに対して、電
気泳動的トランスファーおよびモノクローナル抗体ＧＬ
ＨＢと酵素標識試薬および基質との反応後は、一本のバ
ンドのみが見られた。 このバンドの位置は唯一のモノ
クローナル抗体−抗原複合体の反応によって形成された
呈色産物を示すものであり、天然糖化ヘモグロビンの位
置と一致した。以上のように、 モノクローナル抗体Ｇ
ＬＨＢは幾つかのヘモグロビンを含むヒト血液中の糖化
ヘモグロビンを特異的に認識して結合し、 その幾つか
はβサブユニットのＮ末端バリンで糖化されている。
モノクローナル抗体ＧＬＨＢはＡ１ｃ位あるいはＮ末端
で修飾されている他のヘモグロビンは認識あるいは結合
しない。 【００３７】 【実施例４】 糖化ヘモグロビン以外の糖化タンパク
質とのＧＬＨＢの非反応性 ヒト血漿試料またはＮ−１−（１−デオキシフルクトシ
ル）リジン残基を含む天然の糖化ヘモグロビン試料をＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、 電気泳
動的にニトロセルロースにトランスファーして実施例２
による方法でイムノブロッティングを行った。 ヒト血
漿は標準的なタンパク質染色で複数のバンドを示し、
その分子量は２０，０００以下から２００，０００以上
の範囲にわたった。それに対して、 電気泳動的トラン
スファーおよびモノクローナル抗体ＧＬＨＢおよび酵素
標識試薬と基質による処理後にはバンドは検出されなか
った。 天然糖化アルブミンは標準的なタンパク質染色
で分子量６０，０００の単一のバンドを示すが、 電気
泳動的トランスファーおよびモノクローナル抗体ＧＬＨ
Ｂおよび酵素標識試薬と基質による処理後にはバンドは
検出されなかった。 したがって、 モノクローナル酵
素ＧＬＨＢは糖化または非糖化アルブミン、あるいは、
複数のタンパク質を含み、そのうちの幾つかは糖化され
て存在している、ヒト血漿中の他の構成物は認識せず、
結合しない。 モノクローナル抗体ＧＬＨＢはデオキシ
フルクトシルリジンを含む糖化アルブミンは認識せず、
結合しない。 【００３８】 【実施例５】 非糖化ヘモグロビンと糖化ヘモグロビ
ンのイムノアッセイにおけるＧＬＨＢの相対的反応性５
００ｎｇの非糖化ヘモグロビンＡ０、 糖化ヘモグロビ
ン、 またはヘモグロビンＡ１ｃを、炭酸−重炭酸カッ
プリング緩衝液（ｐＨ ９．６）を用いて２５℃で１８
時間処理し、プラスチックマイクロタイターウェル上に
固定化した。 結合していない抗原を洗浄した後、 炭
酸カップリング緩衝液中、１．０％ミルク溶液で、室温
で４時間反応させて洗浄し、 モノクローナル抗体ＧＬ
ＨＢ（ハイブリドーマ培養上清１００μｌ）を各ウェル
に加え、２時間反応させた。 ０．８５％ ＮａＣｌ中
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄した後、 ０．
０１％ミルク／ＰＢＳ中アルカリホスファターゼ（ＡＰ
）結合−ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を加えて室温で１時間
インキュベートした。 徹底的に水で洗浄した後、 Ａ
Ｐ基質と増幅システムを用い、 ４５０ｎｍの吸光度を
ＥＬＩＳＡリーダーで読み、 呈色産物の存在と強度を
決定した。 【００３９】
表１
抗原
呈色反応（吸光度） 非糖化ヘモグロビンＡ
０ ０．０１０
糖化ヘモグロビン（非Ａ１ｃ）
１．５００ ヘモグロビンＡ１ｃ
０．００５表１
に示すように、 モノクローナル抗体ＧＬＨＢはＥＬＩ
ＳＡタイプのイムノアッセイで、 糖化ヘモグロビンを
非糖化ヘモグロビンおよびヘモグロビンＡ１ｃから選択
的に区別できる。 【００４０】 【実施例６】 ヒト赤血球抽出物中の糖化ヘモグロビ
ンの測定 モノクローナル抗体ＧＬＨＢ（１μｇ）をプラスチック
ウェル上に固定化し、実施例５で述べたように洗浄しブ
ロッキングした。ヒト赤血球抽出物試料を各ウェルに添
加し、反応させた。洗浄後、アルカリホスファターゼ結
合ウサギ抗ヒトヘモグロビン抗体を加え、アルカリホス
ファターゼ基質と増幅システムで呈色させ、吸光度をＥ
ＬＩＳＡリーダーで記録した。試料中の糖化ヘモグロビ
ン量を、既知量の天然精製糖化ヘモグロビンをウェル中
で反応させて同じ方法で処理したものを用いた標準曲線
から算出した。全ヘモグロビンは、既知量の精製ヘモグ
ロビンの標準曲線から得られた４１５ｎｍでの吸光度か
ら算出した。 【００４１】
表２ 試料 糖化ヘモ
グロビン 全ヘモグロビン ％糖化ヘ
モグロビン 非糖尿病 ６７５ｎｇ
１３５００ｎｇ
５％ 糖尿病 １５
６０ｎｇ １３０００ｎｇ
１２％表２に示したよ
うに、 モノクローナル抗体ＧＬＨＢはヒト赤血球抽出
物試料中の糖化ヘモグロビン量を定量的に決定するため
に使用することができる。
Claims (10)
- 【請求項１】 ε−Ｄ−フルクトシルリジンを含む糖
化ヘモグロビン上にあり、ヘモグロビンＡｏ、ヘモグロ
ビンＡ１ｃまたはその他のタンパク質上には存在しない
エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 合成糖化ヘモグロビンおよび天然糖化
ヘモグロビンに結合する請求項１の抗体。 - 【請求項３】 ＡＴＣＣに受託番号ＨＢ１０６１６と
して寄託されているハイブリドーマＧＬＨＢによって産
生される請求項２記載の抗体。 - 【請求項４】 赤血球を含むヒト血液試料を得ること
；試料中の赤血球を溶解すること；ε−Ｄ−フルクトシ
ルリジンを含む糖化ヘモグロビン上にあり、ヘモグロビ
ンＡｏ、ヘモグロビンＡ１ｃまたはその他のタンパク質
上には存在しないエピトープに特異的に結合するモノク
ローナル抗体と、試料を接触させること；試料中の糖化
ヘモグロビンの量に比例するものである、試料中の成分
に結合したモノクローナル抗体の量を決定すること；の
過程を本質的に含むものである、血液試料中の糖化ヘモ
グロビン量を測定する方法。 - 【請求項５】 モノクローナル抗体ＧＬＨＢがＡＴＣ
Ｃ受託番号ＨＢ１０６１６によって分泌されるものであ
る、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 接触および決定過程がＥＬＩＳＡ法で
行われるものである、請求項４記載の方法。 - 【請求項７】 ε−Ｄ−フルクトシルリジンを含む糖
化ヘモグロビン上にあり、ヘモグロビンＡｏ、ヘモグロ
ビンＡ１ｃまたはその他のタンパク質上には存在しない
エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ。 - 【請求項８】 ＡＴＣＣに受託番号ＨＢ１０６１６と
して寄託されているＧＬＨＢであるところの請求項７記
載のハイブリドーマ。 - 【請求項９】 請求項７記載のハイブリドーマを培地
中で培養すること；ハイブリドーマの増殖後に培地を集
めること；からなる、ε−Ｄ−フルクトシルリジンを含
む糖化ヘモグロビン上にあり、ヘモグロビンＡｏ、ヘモ
グロビンＡ１ｃまたはその他のタンパク質上には存在し
ないエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体
を産生する方法。 - 【請求項１０】 ハイブリドーマがＡＴＣＣに受託番
号ＨＢ１０６１６として寄託されているＧＬＨＢである
、請求項９記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US485878 | 1990-02-27 | ||
| US07/485,878 US5183739A (en) | 1990-02-27 | 1990-02-27 | Monoclonal antibodies specific for non-a1c glycated hemoglobin and immunoassay methods |
Publications (2)
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