JPH04158797A - 融合型での異種蛋白質類を大腸菌中での発現により製造する方法、該蛋白質の用途、発現ベクターおよび組換体株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はバイオテクノロジーおよび組換ＤＮＡ技術に関
する。更に詳細には、組換体大腸菌を用いて融合型で不
溶型の異種蛋白を発現により製造する方法に関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする問題点） 所望の蛋白質を、その起源を問わず、組換ＤＮＡ技術を
利用して大腸菌で製造する方法は広く行なわれている。

数多くのベクターが開発されているが、クローニングを
しそして発現させるべき各遺伝子それぞれのケースによ
るので、新しい変異体が今なお必要である（Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ、　Ｄ、Ｔ、およびＣｏ１ａｓａｎＬ１．　Ｊ、
、　　Ｖｅｃｔｏｒｓ、　　Ｂｕしｔｅｒｗｏｒｔｈｓ
。

Ｓｔｏｎｅｈａｍ、　ＭＡ、　ｐｐ、１７９−２０４．
１９８７、ならびにＬｕｋａｃｓｏｖｉｃｈｉ、　Ｔ、
　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ−ｎｏｌｏｇｙ、　１３．２４３−２５０．１９９
０参照）。

天然からの入手が難しいところの臨床的または工業的に
有用な多くの真核生物のポリペプチドが、それらをコー
ドする遺伝子を大腸菌でクローニング・発現させること
によって得られている。

組換体蛋白の微生物中で産生に関連する重大な問題は、
宿主系自身の酵素による産生品の分解である。蛋白質の
安定性は次のような種々の異なった要因によって影響を
受ける。即ち、その要因は、遺伝子の位Ｍ　（Ｔａｌｍ
ａｄｇｅ　Ｋ、およびＧ１１ｂｅｒｔＷ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ　７９．１８３０−１８３３゜＋９８２　：ならびに
Ｍｏｋｓ　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ２６、５２３９−５２４４．１９８７参照）。宿
主株の選択（Ｂｕｅｌｌ　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３゜＋９２３−
１９３８．　１９８５；　　Ｂ１５ｈａｉ　　Ｗ、Ｒ，
ｅｔ　　ａｌ、、　　、１゜Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１
６９．５１４０−５１５１．１９８７　；ならびにＧｒ
ｏｄｂｅｒｇ　Ｊ、およびＤｕｎｎ、　Ｊ、Ｊ、、　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１７０゜１２４５−１２５３．
１９８８参照）、ならびに次のステップとしての培養お
よび精製の条件などに代表される。

細菌のまたは合成の核酸の配列を伴う相でクローニング
された真核生物の遺伝子は、その発現により細胞質中に
ハイブリッド蛋白質として得ることができる。細菌のプ
ロモーターによる転写およびその後の翻訳により、真核
生物のポリペプチドに加えて細菌のまたは合成のペプチ
ド配列を含む融合蛋白質が得られる（Ｍａｒｓｔｏｎ、
　Ｆ、＾、０．。

８ｉｏｃｈｅａ、　　Ｊ、　　２４０．１−１２．　１
９８６参照）。

所望の異種遺伝子の発現によって、宿主遺伝７−のよく
発現された発現蛋白質に融合した融合蛋白質を細胞内合
成する技術は、異種蛋白質を高度の発現能で得るためと
産生蛋白質の安定性を増すために有効な手段である（Ｉ
ｔａｋｕｒａ、　Ｅ、　ｅＬ　ａｌ、。

５ｃｉｅｎｃｅ、　１９８．１０５６−１０６３．１９
７７８照）。

この目的のため１つの系は、大腸菌のβ−ガラグトシダ
ーゼに融合した蛋白質を得る系である（Ｉｔａｋｕｒａ
、　　Ｅ、　　ｅｔ　　ａｌ、、　　５ｃｉｅｎｃｅ、
　　１９８．　１０５６−１０６３゜１９７７参照）。

しかし、この系の主な欠点は、このβ−ガラクトシダー
ゼ蛋白質のサイズが大きく、そのため、目的の蛋白質が
全ハイブリッド蛋白質のほんの１部しか占めないという
ことである（Ｆｌａｒｅｓ、　Ｎ、　ｅｔ　ａｌ、、＾
ｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎ
ｏｌ、　２５．２６７−２７１．１９８６　；およびＧ
ｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ。

Ｖ、　ｅｔ　ａｌ、、ＰＮＡＳ　ＩＪＳ＾、　７６、１
６−１１０参照）。

***特許用３５４１８５６−Ａ−１（ヘキスト社）には
、ヒト蛋白質インターロイキン−２のＮ端の少なくとも
最初の９部個のアミノ酸を含む安定他剤蛋白質を用いて
、大腸菌の中で合成された不溶型の融合蛋白質を得るや
り方で、プロインスリンおよびヒルジンのような真核生
物の蛋白質を発現により製造する可能性について記載さ
れているが、そこには、その方法で達成される発現能の
程度については何の記載もない。またこの***特許によ
れば、遺伝子構成体の中に、所望蛋白質を安定他剤蛋白
質から分離する目的で、最終産生物の切断のための特定
の配列が含まれている。

遺伝子工学によるウィルス蛋白質の製造は、主に製品が
純粋であることと活性な病原性材料を操作しなくてよい
ということから、診断方法やワクチン製剤の開発にとっ
て非常に興味あるものである１診断の分野では、これら
の製品は、高い特異性と感度が達成されるので、早期の
それに対する抗体の検出に極めて重要なものである。

特に、ヒトのレトロウィルスの場合には、非常に純粋な
特異性の高い抗原を用いる抗体検出のための感度の高い
システムの開発が必要である。ヒトのレトロウィルスは
、ウィルスの属するサブグループに依存して１種々の免
疫的変化を惹き起こし、また更に、Ｔ−リンパ球細胞に
対するその栄養性の故にＴ−細胞の異常な増殖または機
能の損傷（白血病）あるいは該細胞集団の減少（免疫抑
制）を惹き起こす（Ｗｏｎｇ−３ｔａａｌ、　Ｆ、およ
びＧａ１ｌｏ。

Ｒ，Ｃ，、Ｎａｔｕｒｅ、　３１７．３９５−４０３．
１９８５参照）。

それ故、これらの疫病の原因であるウィルスの抗原活性
を有する主蛋白質の効率のよい発現系を開発することが
必要であり、それによって、迅速かつ正確に診断システ
ムが提供でき、ひいては。

保存血液サンプルの処理の際のこれらのウィルスの抗体
検出のための大規模な疫学的研究を可能にし、保存血液
ルートからの疫病の伝播を防ぐことができる。

ヒト免疫不全ウィルス（旧Ｖ）の抗原活性を有する主蛋
白質をコードする遺伝子は、これまで、大腸菌で直接ク
ローニングと発現を行ない、その際宿主に属する遺伝子
に融合されていた。

天然形で発現された蛋白質の中にエイズ（ＡＩＤＳ）の
ペプチド１２＋があり、これは不溶型の形で全蛋白質の
５〜１０％の発現能で得られている（Ｃｈａｎｇ、　Ｔ
。

讐、ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３
．９０５−９０９．１９８５参照）、また同じウィルス
の蛋白質ｇａｇ２４は可溶型で得られているが、そのＦ
ｌ、現能、は計算されていない（Ｄｏｗｂｅｎｋｏ、Ｄ
、Ｊ、　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ
ｌ、　　＾ｃａｄ、　　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　８２．７７４８−７７５２．１９８５参照）
。

スペイン特許第２，０００，８５９号（シンテックス社
（Ｓｙｒ＋ｔｅｘ）］には、大腸菌の丁ｒｐＬＥ蛋白の
ＤＮＡ遺伝子を包含しかつエイズウィルスのＤＮＡ配列
を特異的に挿入したベクターを用いて融合蛋白質を発現
する方法が記載されている。そこでは、Ｃ端のＬＥ領領
域異種蛋白質のＤＮＡ配列で置換して、自己集合性融合
蛋白質を得ており、これより精製が簡単にできるように
なっている。更に、用いたベクターには、所望蛋白質の
単離を容易にする３つの読み取り枠のための結合手段を
含有している。

またこの特許には、全細胞蛋白質の５ｚ以上を産生ずる
高い発現能を有するクローンの構成が記載されている。

（問題を解決するための手段および作用）本発明は、大
腸菌中での発現によ。て異種蛋白質、特に、ヒト免疫不
全ウィルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）に属する抗
原蛋白質を不溶型で製造する方法に関する。そのために
、ヒト　インターロイキン−２のＮ端最初の約５８個の
アミノ酸をコードする安定他剤配列を含むベクターを用
い、それにより、クローニングされた異種蛋白質の発現
能を高めることができる。このベクターは、更に、大腸
菌のトリプトファンプロモーター（ｐｔｒｐ）、バクテ
リオファージＴ４の終止シグナルおよび選択マーカーと
してのアンピシリン耐性遺伝子をコードし、更にまた発
現により得られる異種蛋白質をカップリングするための
制限部位Ｘｂａｌ、ＸｈｏｌおよびＢａｍＨＩとを含有
している。本発明は更に、旧Ｖ−１およびＨＩＶ−２の
異種の抗原蛋白質の大腸菌中でのクローニングと発現を
行なうためのベクターならびにそれにより得られる組換
体株に間するものであり、このベクターを用いることに
より所望の異種蛋白質を全蛋白質の２０〜２５χの発現
能で得ることができる。

特に、発現により得られる蛋白質類は、ヒト免疫不全つ
ィルス旧Ｖ−１に属する核蛋白質（ｇａｇ２４）および
トランスメンブラン蛋白質（ｇｐ４１　）、ならびにヒ
ト免疫不全ウィルスＨＴＶ−２に属するトランスメンブ
ラン蛋白質（ｇｐ３６）である、これらの蛋白質をコー
ドする遺伝子をクローニングするための宿主として用い
られる株は、大腸菌のに−１２１１Ｂ−１０１株。

Ｋ−１２讐−３１１０株およびに−１２Ｃ−６００株で
ある。

本発明の基本的な特徴は、ヒトインターロイキン−２蛋
白質のＮ端の最初の５８個のアミノ酸のみをコードする
安定化剤配列を用いることであり、これは特に旧Ｖウィ
ルスの抗原活性を有する主蛋白質類の発現に有利に用い
られるものである。

ここに記載する方法によって発現により得られる融合蛋
白質は不溶型で合成され、最終工程の精製を簡単かつ効
率的にすることができる。そして、得られる蛋白質類は
高い抗原活性を有しており、しかも融合に用いた安定他
剤断片を切断することなく抗体の検出による診断目的に
用いることができる。本発明はまた。このようにして得
られた融合蛋白質にも関する。

（実施例） 次に本発明を次の実施例により更に詳細に説明するが、
本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。

遺」１１Ｌ 大腸菌中での発現により蛋白を得るために、ヒト由来の
インターロイキン−２（ＩＬ−２）のＮ端の最初の５８
個のアミノ酸よりなる安定化剤ペプチドをコードする配
列を挿入した発現ベクターｐＦＰ−１５を構築した。こ
の配列は大腸菌のトリプトファンプロモーターの制御下
でクローニングされ、上記ベクターは更に転写の終止シ
グナルとしてのバクテリオファージＴ４のターミネータ
−および選択マーカーとしてのアンピシリン耐性遺伝子
を有している。

プラスミドベクターｐＦＰ−１５は、ＩＬ−２のＮ端の
最初の５８個のアミノ酸をコードする安定化剤配列を含
む１９０個の塩基の合成オリゴヌクレオチド（Ｆｉｇ、
　ｌ　）およびその相補的配列と、大腸菌のトリプトフ
ァンプロモーターおよびバクテリオファージＴ４のター
ミネータ−を有するベクターｐＴＰＶ−１（Ｆｉｇ、　
２　）とを結合することによって構築される。

その構成のレイアウトをＦｉｇ、　２に示す。

上記の安定化剤ペプチドをコードするＤＮＡ断片のカッ
プリングは、文献（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ
、。

ＰＮＡＳ、　ＵＳＡ、　７４．５４６３−５４６７．１
９７７４！［）　ニ、Ｌ［Ｖ）ＤＮＡ配列分析方法に従
い、ｐｔｒｐブＯモーターおよび該配列を安定化剤配列
の方向（５′−３′）でハイブリダイズするオリゴヌク
レオチド（Ｆｉｇ、　３　）を用いて、確認することが
できる。このようにして、すべての場合に、適当な読み
取り枠が維持されていることをチエツクすることができ
た。

！１貫１ ＨＩＶ−１ウイルスの核蛋白質（ｇａｇ２４）の遺伝子
のクローニングと発現のために、次の２種のオリゴヌク
レオチドを用いた。

５　’　ＣＡＴ　ＣＴＡ　ＧＡＣＡＴＧ　Ｃ＾＾＾ＴＧ
　ＴＴ＾＾ＡＡ　Ｇ＾＾３′３’　　ＧＴ　ＴＴＡ　Ｇ
ＧＴ　ＣＧＡ　ＴＴＧ　ＡＣＴ　ＡＴＣＣＴＡ　ＧＧＣ
５’これらのオリゴヌクレオチドは、　ｇａｐ２４蛋白
質をコードする遺伝子の５′端および３′端にそれぞれ
相当するものである（＾ｌ１ｚｏｎ、　Ｍ、　ｅｔ　ａ
ｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ　３１２．７５７−７６０．１９８４参照
）、これらのオリゴヌクレオチドと単離した旧ｖ−１の
ゲノムを用い、ポリメラーゼチェーン反応（ｐｏｌｙ＋
＋ｅｒａｚｃ　ｃｈａ’１ｎｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＰＣ
Ｒ）（Ｒａｎｄａｌｌ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃ
ｉｅｎｃｅ。

ＵＳＡ、　２３９．４８７−４９１，１９８８参照）の
技術により蛋白質ｇａｐ２４をコードする遺伝子断片の
遺伝子の増幅を行なった。この断片を、ＰＣＲに用いた
オリゴヌクレオチドに含まれているＸｂａ　Ｉと町υ旧
の制限部位で切断し、　ＸｂａｌとＢａｍｔｌｌで消化
した発現ベクターｐＦＰ−１５に連結した。このように
して、安定化剤ペプチドをコードしトリプトファンプロ
モーターに制御されるセグメントに増幅遺伝子が連結さ
れた。得られる組換体プラスミド［ＶＩＨＣ＾（Ｆｉｇ
、　４　））で大腸菌に−１２）１８−１０１株の細胞
を形質転換した。

形質転換されたコロニーを最終濃度が５０μｇ／麿Ｑと
なるようにアンピシリンを加えたルリア培地（Ｌｕｒｉ
ａ　ｂｒｏｔｈ　ｍｅｄｉｕ＋ｗ）　（Ｍｉｌｌｅｒ、
　Ｊ、Ｈ，、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂ、、　１９７．ｉ’＃照）の皿でアンピシリン耐性
を利用して選択した。１１７４体は、クローニングに用
いた実際の増幅断片を放射性プローブ（″”Ｐでラベル
したもの）として用いて、ハイブリダイゼーションの技
術によって同定した。免疫同定は、オートラジオグラフ
ィーで陽性のものを用い、感染患者の血清および°“６
■でラベルしたプロティン＾（ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ）に
ついて行ない、免役学的手法により、これらのクローン
の陽性によってｇａｇ２４蛋白質遺伝子の発現が同定さ
れた。それらのクローンのそれぞれについて、ウェスタ
ンプロット法による分析（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、　Ｗ、Ｎ
、、　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈ、、１１２．１９５−２０３．１９８１参照
）を行なった結果、約２８．０００ダルトンのバンドが
得られ、それは、安定化剤ペプチド（約５８個のアミノ
酸）とクローニングされたｇａｇ２４蛋白質（約１８０
個のアミノ酸）を加えた長さに相当する。

皇ｌ興ニ トランスメンブラン蛋白質ｇｐ４１の遺伝子のクローニ
ングおよび発現を行なうために、２６９個の配列を有す
るオリゴヌクレオチドおよびその相補的オリゴヌクレオ
チド（Ｆｉｇ、　５参照）をまず合成した。該オリゴヌ
クレオチドはウィルスの上記コート蛋白質の断片に対応
するものである（Ｈａｎ、　Ｂ、Ｈ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１２．　＋６６−１
６９．１９８４参照）０合成したオリゴヌクレオチドを
Ｈａｎ旧で消化し、前もってＸｂａｌで切断した後Ｓ１
ヌクレアーゼで処理してからＢａｍＨＩで消化したｐＰ
Ｆ−１５ベクターにつなげた。

所望の遺伝子は、このベクターの中に、トリプトファン
プロモーターの制御下に安定他剤蛋白質をコードしてい
るセグメントに融合して存在する。

このようにつなげて得られたものがベクターＶｌ）ＩＴ
Ｊ−１（Ｆｉｇ、　６　）　ｔ’ある。コノベクターＶ
ＩＨＴＡ−１で大腸菌に−１２１−３１１０株を形質転
換した。形質転換されたコロニーをアンピシリン耐性を
利用して選択し、組換体をハイブリダイゼーションによ
って同定し、その後、実施例２と同様に陽性のものにつ
いて免疫学的同定を行なった。融合蛋白質の発現を示し
たものについてウェスタンプロットを行なったところ、
約１５．０００ダルトンのバンドが得られ、それは、安
定化剤ペプチドの５８個のアミノ酸と旧Ｖ−１の蛋白質
ｇｐ４１の断片に相当する８３個のアミノ酸とを含有す
る融合蛋白質の大きさと一致するものである。

ヌ」１１先 ＨＩＶ−２のトランスメンブラン蛋白質ｇｐ３６をコー
ドする遺伝子を有する領域をクローニングするために、
３１８ｂｐのオリゴヌクレオチドおよびその相補体（Ｆ
ｉｇ、　７　）を合成した。これは、ＨＩＶ−２（７）
：］−ト蛋白質ｇｐ３６の断片に相当するものである。

（Ｃ１ａｖｅｌ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅ
ｎｃｅ　２３３．３４３−３４６参照）、このＤＮＡセ
グメントを、的もってＸｂａｌ／脂、旧で切断したベク
ターｐＰＥ−１５に連結した。所望の遺伝子断片は、こ
のベクターの中に、トリプトファンプロモーターの制御
下に、安定他剤蛋白質をコードする遺伝子に融合して存
在している。

コノようニシテ得られたベク’）　−ＶＩＨＴＡ−２（
Ｆｉｇ、　８　）により大腸菌に−１２Ｃ−６００株を
形質転換した。形質転換されたコロニーをアンピシリン
耐性を利用して選択し、組換体はハイブリダイゼーショ
ンによって同定し、実施例２と同様にして陽性のものに
ついて免疫学的同定を行なった。

ＤＮＡセグメントの安定他剤蛋白質遺伝子へのカップリ
ングは、文献に記載のＤＮＡ配列分析の方法（Ｓａｎｇ
ｅｒ、　Ｆ、　ｅＬ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ、　ＵＳＡ、
　７４５４６３−５４６７、１９７７参照）によって確
認した。

叉皇豊上 ｇａｇ２４−安定化剤ペプチド融合蛋白質およびｇｐ４
１−安定化剤ペプチド融合蛋白質の場合、それぞれの組
換体株ＨＢ２４およびＷ４１を、ＦｅＣ１，（０，００
１ｍＭ）、Ｍｇ５Ｏ，（０，１ｍＭ）および阿９塩（Ｎ
ａ、）ＩＰ０４６％。

Ｋｌ、Ｐｏ、　３％、　ＮａＣｌ　０．５％ｊ５．ｌヒ
ＮＩｌ、ＣＩ　１％）　ナラヒニアンビシリン５０μｇ
／履Ｑを加えたスーパー培地（ｓｕｐｅｒ　ｂｒｏｔｈ
　ｍｅｄｉｕｍ）（ｈリブトファン３２ｇおよび酵母エ
キス２０ｇを蒸留水ｌαに加えたもの）中で培養した。

ｇｐ３６−安定化剤ペプチド融合蛋白質については、形
質転換した株Ｃ３６を、カゼイン加水分解物２ｚ、クル
コース２％、　Ｉ　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、Ｏ，ｌ　ｍＭ　
ＣａＣ１，オヨび５０μｇ／ｓＱアンピシリンを加えた
最小培地（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｏ１
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、。

ＵＳＡ、　＋９８２）中で培養した。

培地への接種は、光学密度０．０５で行ない、１２時間
３７℃に保持しながら、２６０ｒｐｍでの撹拌とｌｖｖ
ｍでのエアレーションを行ない、最終光学密度を６００
ｎ鳳でｌＯとした。ｍ酵開始から２時間後に、インドー
ルアクリル酸を添加してトリプトファンを消失させた（
Ｓｑｕｉｒｅｓ、　Ｃ，Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊｏｕ
ｒ、　ｏｆ　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、　ＵＳＡ、　９２．９３−１１１．１９７
５参照）、得られた細胞を遠心分離により集め、−２０
℃で保存して、所望製品を後で回収できるようにした。

得られたバイオマスの超音波破砕の後、蛋白の５ＯＳ−
ＰＡＧＥ電気泳動法（Ｌａｅ＋５ｍ１ｉ、　Ｎａｔｕｒ
ｅ、　ＵＫ、　２２７゜６８０−６８５．１９７０）と
スキャナー（ＳＣＡＮＮＥＲ）６５３００（米国）によ
る分析により発現能が全蛋白質の２０〜２５％であるこ
とを確認した。

株の寄託 （１）大１１１１に−１２）１Ｂ−１０１株をヘースト
シプラスミＦｐＶＩＨＣＡヲ含む大腸１１８Ｂ２４　［
ｐＶＩ）ＩｃＡ）　株ハ、第５ンダ国バールンのセント
ラルビューローブーアシメルカルチャーズ（ＣＢＳ）に
１９９０年７月ｌ１日に寄託されている（寄託番号：Ｃ
ＢＳ・・・・９０）。

（２）大腸菌に−＋２　Ｗ−３１１０株をベースとしプ
ラスミドｐＶＩＩＩＴＡ−１を含む大腸菌Ｗ／Ｉ　Ｉ　
（ｐｖ目ＩＴＡ−０株は、オランダ国バールンのセント
ラルビューローブーアシメルカルチャーズ（Ｃ：ＢＳ）
に１９９０年７月目日に寄託されている（寄託番号：Ｃ
ＢＳ・・・・９０）。

（３）大腸菌に−１２Ｃ−６００株をベースとしプラス
ミドｐＶＩＨＴＡ−２を含む大Ｉｌｌ菌Ｃ３６〔ｐｖ　
＋ＩＩＴＡ−２）株は、オランダ国バールンのセントラ
ルビューローブーアシメルカルチャーズ（ＣＳＳ）に１
９９０年７月１１日に寄託されている（寄託番号：　Ｃ
ＢＳ・・・・９０）。

【図面の簡単な説明】

第１図はインターロイキン−２のＮＩＱの最初の５ｓｔ
ｉｉのアミノ酸をコードする配列を含む！９０塩基の合
成オリゴヌクレオチドの配列を示し、５′端には制限部
位りａｌとの接着端ＣＧがあり、相補的ストランドの５
′端には制限部位Ｂａａ旧との接着端ＣＴＡＧがあり、
転写開始コドンは＾ＴＧである。第２図はベクターｐＦ
Ｐ−１５の構築を示す図である。第３図は安定化剤ペプ
チドをコードするＤＮＡ断片のカップリングを確認する
のに用いるオリゴヌクレオチドを示す、第４図は、組換
体プラスミドＶＩＨＣ＾の構築を示す図である。第５図
はトランスメンブラン蛋白質ｇｐ４１の遺伝子のクロー
ニングと発現に用いるオリゴヌクレオチドを示す、第６
図は組換体プラスミドＶＩＨＴ＾−１の構築を示す、第
７図はＨＩＶ−２のトランスメンブラン蛋白質ｇｐ３６
をコードする遺伝子のクローニングを発現に用いるオリ
ゴヌクレオチドを示し、５′には制限部位ＸｂａＩとの
接着端にＴＡＧがあり、相補的ストランドの５′端には
制限部位担旧との接着端ＣＴＡＧがある。第８図は組換
体プラスミドＶｒＨＴ＾−２の構築を示す。 特許出願人　セントロデインヘニエリアヘネテイカイ　
ビオテクノロヒア 代理人　　　弁理士　片　桐　光　治 Ｃ＾ＧＯ＾ＴＧＩＪＣｋｃ＾Ｔ？ＴＩＡＣｉ丁　？Ｔ’
ＴＡＩＪ’ＦＧＣＣＣ入ｘａ＾ｈａａｃｃ　　Ａ（！＾
Ｇ入入ｃｔａ為　入Ａｃ＾ＴｃテＣＣ八ＦＩＧ、１ 図面の浄書 ＦＩＧ、２ ５１　　ＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＡＡＣＴＡＧ　　　３
１ＦＩＧ、３ 図面の浄書 ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ 図面の浄書

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、融合型での異種蛋白質類を大腸菌中での発現によっ
   て得るに際し、ヒトインターロイキン−２のＮ端断片を
   コードする安定化剤配列を用いる該異種蛋白質類を製造
   する方法にして、安定化剤配列がヒトインターロイキン
   −２蛋白質の最初の５８個を超えないアミノ酸をコード
   しており、発現すべき異種蛋白質に相当する配列が該安
   定化剤配列に融合していることを特徴とする方法。 ２、安定化剤ペプチドのアミノ酸配列が 【アミノ酸配列があります】 に対応していることを特徴とする請求項１の方法。 ３、発現によって得られる異種蛋白質が、ヒト免疫不全
   ウィルスＨＩＶ−１に属する核蛋白質（ｇａｇ２４）お
   よびトランスメンブラン蛋白質（ｇｐ４１）、ならびに
   ヒト免疫不全ウィルスＨＩＶ−２に属するトランスメン
   ブラン蛋白質（ｇｐ３６）である請求項１の方法。 ４、インターロイキン−２の最初の５８個のアミノ酸、
   大腸菌のトリプトファンプロモーター、バクテリオファ
   ージＴ４の終止シグナルおよびアンピシリン耐性遺伝子
   をコードする安定化配列と、発現により得られる異種蛋
   白質の融合のための制限部位￥Ｘｂａ￥、￥Ｂａｍ￥Ｈ
   Ｉおよび￥Ｘｈｏ￥Ｉとを含有してなる発現ベクターｐ
   ＦＰ−１５。 ５、ＨＩＶ−１の蛋白質ｇａｇ２４、ＨＩＶ−１の蛋白
   質ｇｐ４１断片およびＨＩＶ−２の蛋白質ｇｐ３６断片
   をそれぞれコードする遺伝子配列を含み、それらの各々
   がそこに存在する制限部位を用いて請求項４に定義した
   ベクターｐＦＰ−１５の安定化剤配列にカップルされて
   いることを特徴とするベクターｐＦＰ−１５由来のベク
   ターであるＶＩＨＣＡ、ＶＩＨＴＡ−１およびＶＩＨＴ
   Ａ−２。 ６、大腸菌のＫ−１２ＨＢ−１０１株、Ｗ−３１１０株
   およびＣ−６００株をそれぞれ請求項５に定義したベク
   ターＶＩＨＣＡ、ベクターＶＩＨＴＡ−１およびベクタ
   ーＶＩＨＴＡ−２により形質転換することにより得られ
   、不溶型の抗原性ＨＩＶ蛋白質を高い発現能で発現する
   ことを特徴とする組換体ＨＢ２４株、組換体Ｗ４１株お
   よび組換体Ｃ３６株。 ７、ヒトインターロキン−２のＮ端の最初の５８個のア
   ミノ酸を含有するペプチドとそれに融合している異種蛋
   白質とにより構成されていることを特徴とする融合蛋白
   質。 ８、該異種蛋白質が、ＨＩＶ−１の蛋白質ｇａｇ２４、
   ＨＩＶ−１の蛋白質ｇｐ４１、またはＨＩＶ−２の蛋白
   質ｇｐ３６であることを特徴とする請求項７の融合蛋白
   質。 ９、請求項７または８の融合蛋白質を含有してなる、ヒ
   トまたは動物抗体の検出のための診断薬。