JP2719917B2 - Ａｉｄｓの原因ウィルスの糖蛋白質、該糖蛋白質の製造方法及びワクチン - Google Patents
Ａｉｄｓの原因ウィルスの糖蛋白質、該糖蛋白質の製造方法及びワクチンInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、やや詳しく言えば、エイズ予防用のワクチ
ンに関するものである。後天性免疫不全症候群（AIDS）
は、現在北米、欧州及び中央アフリカで特に問題となっ
ているウイルス性疾患である。最近の推定によれば、10
0万の米国人がエイズウイルスに曝露されている可能性
が示唆されている。患者は重篤な免疫不全を呈し、この
疾患は一般的に致死的なものである。この疾患は、最も
一般的には、性的接触によって伝播される。麻薬を静脈
内注射で使用する人々も高リスク群をなす。他方では、
汚染された血液または血液薬品を受けたことによって、
多くの人がこのウイルスに感染している。本疾患の原因
因子はレトロウイルスである。動物の多くの状態がレト
ロウイルスによりものであるとされているが、ヒトを冒
すレトロウイルスを記述できるようになったのは、ごく
最近のことである。 Ｉ型及びII型のヒトＴ細胞レトロウイルス（HTLV:ヒ
トＴ細胞白血病ウイルス）が成人に於けるある種のＴ細
胞白血病の原因因子であるとされている一方、III型HTL
V又はエイズ関連ウイルス（ARV）としても知られるリン
パ節症関連レトロウイルス（LAVウイルス）が現在エイ
ズの原因となる因子であると一般に認められている。 LAVレトロウイルスのゲノムは極めて完全に特性記述
されており（Wain−Habsonら、1985年;Ratnerら、1985
年;Muesingら、1985年、Sanchez Pescadorら、1985
年）、配列に関するデータは、レンチウイルス群と極め
て密接な関係にあることを示している。ヒツジビスナウ
イルスを原型とするレンチウイルスは、典型的に長い潜
伏期を示す遅発性の疾患の原因因子である。LAVウイル
スとビスナウイルスには多くの類似点があり、特に向神
経組織性で類似する。 他の周知のレトロウイルスの場合と同様に、LAVゲノ
ムの三つの最も重要な部分は、gag、polおよびenvと呼
ばれている。env遺伝子の配列は、gp110及びgp41の配列
を含めて、トランスメンブレン（transmembrane）エン
ヴェロープ糖蛋白質に対して予期された特性を有し、gp
110とgp41とから構成されるenv蛋白質前駆体gp160の本
質が直接アミノ酸配列決定法により確かめられている。
以下、gp41をgp40又はgp41と呼ぶこともある。 env蛋白質gp160並びにその切断生成物gp120及びgp41
に対して生産される抗体はエイズ患者の血清中に普通に
検出され、env糖蛋白質はエイズウイルスの主たる表面
抗原に該当する。 かくして、env蛋白質は、予防接種戦略を展開するた
めの最も期待される候補であり、そのために、この蛋白
質及びそれをコードする配列が注目を集めている。 多くのグループがenv蛋白質の細胞内での発現を報告
している。しかし、グリコシル化及び翻訳後構造修飾が
行われないために、それら微生物により合成された物質
の免疫力が減じている可能性がある。 それ故に、本発明は、env蛋白質発現ベクターとし
て、グルコシル化及び翻訳後構造修飾を可能ならしめる
であろう環境中で蛋白質を発現させうるウイルスベクタ
ーを使用することを提案する。 すなわち、本発明は、エイズの原因となるウイルスの
env遺伝子の全部又は一部を含有するウイルスベクター
に関するものである。 使用可能なウイルスベクターの中では、特にポックス
ウイルスが挙げられ、とりわけワクシニアウイルス（V
V）が挙げられる。 ワクシニアウイルスは、天然痘の制御及び根絶のため
に世界中で極めて広く用いられている二重鎖DNAウイル
スである。最近の技術の進歩により、このウイルスをク
ローニングベクターとして開発することが可能となり、
更に生きた組換えウイルスによって外来抗原の発現が可
能となり、かつ種々のウイルス性及び寄生虫性の疾患に
対する免疫を得ることさえ可能となっている。 すなわち、数グループが最近このタイプの組換え体を
使用してインフルエンザ抗原、Ｂ型肝炎抗原及び狂犬病
糖蛋白質を発現させ、これらの疾患に対して免疫が得ら
れることを示している（Smithら、1983年、Panicali
ら、1983年、Kienyら、1984年）。 ワクシニアウイルス（VV）による外来蛋白質をコード
する配列の発現には必然的に次の二つの段階が含まれ
る： １）コードする配列がVVのプロモーターと一列にそろえ
られ、VV DNAの非必須区間中に挿入され、適当な細菌プ
ラスミド中にクローン化されなければならない； ２）コードする配列の両側に位置するVV DNAの配列は、
プラスミドとウイルスゲノムとの間の生体内での相同性
組換えを可能にするものでなければならない；二重相互
組換えにより、挿入DNA断片がプラスミドからウイルス
ゲノムへ移り、そこで増殖、発現される（PanicaliとPa
oletti、1982年;Mackettら、1982年;Smithら、1983年;P
anicaliら、1983年）。 当然のことながら、このタイプのベクターの使用に
は、ベクターウイルスのゲノムの部分的欠失処理をしば
しば伴う。 本発明はとりわけ、少なくとも次のものを含有するウ
イルスベクターに関するものである： −ベクターのウイルスのゲノムの一部、 −エイズ原因ウイルスのエンヴェロープの糖蛋白質（g
p）の一つをコードする遺伝子、及び −細胞中でこの糖蛋白質の発現のための諸要素。 本発明はまた、該ウイルスに対応する組換えDNAに関
するものでもある。 エイズの原因となるウイルスのエンヴェロープ中に
は、KD単位でのそれらの質量に応じてgp160、gp120及び
gp41と呼ばれる３種の糖蛋白質を数えうることを指摘し
ておくことが適切である。最初のもの、gp160は実際に
は後の２種の蛋白質の前駆体である。これらの名称は未
だ確立されたものではなく、gp41はgp40又はgp42と呼ば
れることもあるが、これら３種の糖蛋白質は、それらの
名称にも拘らず、質量の差からみて完全に同一とみなし
うるものである。 エイズ原因ウイルスとは、とりわけLAVウイルス、HTL
V IIIウイルス又はARV、またこれらウイルスから生じう
る点変異体または部分欠失体、並びに関連ウイルスを指
すものと理解される。 ベクターウイルス（エイズ原因ウイルスとは別の）の
ゲノムに相当する部分では、ウイルスベクターは任意の
起源のウイルスのゲノムから形成されていてよいが、ポ
ックスウイルスのゲノムの一部、とりわけワクシニアの
ゲノムの一部を用いるのが好ましい。 ワクシニアウイルス中での異種蛋白質の発現に必要な
条件は上に述べられている。 一般に、問題の遺伝子、たとえばenv遺伝子が発現さ
れうるためには、それがワクシニア遺伝子のプロモータ
ーに従属していなければならないであろう；このプロモ
ーターは一般にはワクシニアの7.5K蛋白質プロモーター
であろう。更に、コード配列が、標識遺伝子として役立
ちうるであろうワクシニアの非必須遺伝子中にクローン
化されなければならないであろう。これは大抵の場合TK
遺伝子となろう。 発現を達成したいエンヴェロープ糖蛋白質のうちで
は、上述の３種の蛋白質、gp160、gp41及びgp120を挙げ
るべきである。 一般には、完全なエンヴェロープ遺伝子、即ちこの遺
伝子のシグナル配列及びトランスメンブレン配列を組入
れたenv遺伝子の発現を達成するのが好ましいであろ
う。 env遺伝子蛋白質全体をコードする遺伝子をクローン
化したウイルスベクターを用いての最初の諸試験の結
果、発現生成物の免疫原性を改善するためにこの遺伝子
の装飾が提案された。 培養上澄中へのenv蛋白質のかなりの放出が観察され
た（この放出は生体内では多分循環体液中へ行われるで
あろう）。これは、該蛋白質の細胞膜中での付着が弱い
ことによるのであろう；その上、細胞表面に抗原が現わ
れることが、ワクシニア系による免疫応答の誘発によっ
て極めて重要なことが知られている。従って、該蛋白質
の細胞膜中での係留を向上させるようにenv蛋白質を装
飾することが提案される。 このためには、アルギニンに対応するコドンをイソロ
イシンに対応するコドンで置換えるよう、トランスメン
ブレン領域をコードする部分でenv遺伝子を装飾しても
よいであろう。 異種ウイルスのトランスメンブレン領域、例えば狂犬
病ウイルスのgpのトランスメンブレン領域をenv蛋白質
のトランスメンブレン領域に置換及び／又は付加するこ
とによって該係留を向上させうる可能性もある。 更に、該蛋白質がその発現後に十分に組立てられない
可能性がある。実際上、シグナルペプチドはかなり非定
型的であり、蛋白質の完全な移出を損う可能性もある。
このため、異種ウイルスに由来するシグナル配列、例え
ば狂犬病ウイルスのgpのシグナル配列を置換及び／又は
付加することが提案される。 最後に、細胞により放出されるのはgp160よりもむし
ろgp120であるように思われる。それは一方では免疫系
のためのおとりを提供し、他方では、最近のデータに合
致して、T4細胞に結合することができるであろう。この
結果は、T4細胞を不活性化する効果又はそれらを他のT4
細胞にとっての異物に見えさせる効果をもつものであろ
う。 それ故、放出され得ないgp120env蛋白質を得ることが
有利であろう。これは、env遺伝子を、gp120をコードす
る配列とgp41をコードする配列との間で装飾して、gp12
0とgp41との間に位置するプロテアーゼ切断部位を除去
することにより、とりわけREKR部位を除去することによ
り、達成される。 本発明のプラスミドでは、REKR配列から８アミノ酸下
流に位置するKRR配列に相当する部位で少なくとも１か
所の追加の変異が行われる。そうして得られたgp160は
もはや切断されない。 本発明のベクターは、更に、env蛋白質のシンシチウ
ム（合胞体）形成能、即ちウイルスが細胞融合を起さ
せ、巨細胞又はシンシチウムを生じる能力の原因である
かもしれないと考えられているgp41の疎水性Ｎ末端ペプ
チドに相当する配列を欠いているところのgp41をコード
する配列を含有する。 最後に、本発明は、gp160の細胞質外領域と細胞質内
領域とがＣ末端疎水性ペプチド削除後に同調して融合さ
れ、それによって得られるべき糖蛋白質の分泌を可能な
らしめているウイルスベクターに関するものである。 一般に、本発明のウイルスベクターは次の蛋白質の一
つをコードする配合を含有する： ・Ｓはシグナルペプチドであり、 ・gp120は糖蛋白質120であり、 ・Ｊはgp120とgp40との間のプロテアーゼ切断部位を欠
いた連結部を概念的に示し、 ・gp40は糖蛋白質40であり、 ・tmはトランスメンブレンペプチドである。 又は−Ｓ−gp40−tm− 又は−Ｓ−gp120−tm− なる構造の蛋白質。 シグナルペプチド及びトランスメンブレン配列はエイ
ズ原因ウイルスのそれらであっても、異種のものであっ
てもよく、とりわけ狂犬病ウイルス又はVSV或はエンヴ
ェロープをもつ他のウイルスに由来するものであっても
よい。 gp40はその疎水性Ｎ末端を欠いていてもよい。 第一の発明は主として、LAVウイルスのenv遺伝子によ
りコードされた糖蛋白質を細胞培養で得るためのウイル
スベクターの使用に関するものである。従って、当該細
胞はまずは本発明のウイルスベクターに感染した哺乳動
物細胞であり、或は相当する組換えDNAを含有する哺乳
動物細胞である；これらの細胞のうちでは、とりわけ初
代培養からのヒト二倍体細胞並びにVero細胞を挙げてお
くべきである。当然のことながら、後記実施例からも分
るように、他のタイプの細胞を供することも可能であ
る。 かくして得られた糖蛋白質は精製後ワクチン製造のた
めに使用できる。 本発明のウイルスベクターを予防接種のために直接使
用することも可能で、そのときは所要部位及び生体内で
糖蛋白質が産生される。 ２種以上の予防接種剤、特に上記装飾に付されたgp12
0及びgp40を個別に発現するベクターに相当する予防接
種剤を組合せ使用し、同時に又は別個に投与するのが有
利である。例えば、後記のベクター1136及び1138から誘
導された予防接種剤を合せて使用することが有利でろ
う。 最後に、本発明は、上記糖蛋白質に対して産生された
抗体に関するものでもあり、該抗体は、生体を上記ウイ
ルスベクターに感染させ、一定時間後に誘発された抗体
を回収することによって得られる。 糖蛋白質の取得、細胞培養及び予防接種に用いられる
技法は、既知のワクチンについて現在行われるものと同
じであり、詳しく述べることはしない。 以下の方法及び実施例を読めば、本発明をより十分に
理解できるであろう。 ５つの図は実施例を図解したものである： 第１図は、組換え体VVTGeLAV9−１及びVVTGeLAV1132
により合成され、抗LAV血清を用いて免疫沈降させられ
た蛋白質に対するendo−Ｆの作用を示す。この図に於
て、分子量はキロドルトン単位で示されており、符号は
次の通りである。 ・Ｐ、細胞ペレット、 ・Ｓ、上澄み、 ・ｕ、無処理で得られた生成物、 ・ｅ、endo−Ｆ処理後に得られた生成物。 第２図は、組換え体VVTGeLAV9−１を接種したマウス
の血清によりLAVウイルスの蛋白質が認識される様子を
示す。この図に於て、Ｔは使用血清がエイズ患者のもの
である場合を示す。分子量はキロドルトン単位で示され
ている。 第３図は、env遺伝子を有する組換えワクシニアウイ
ルスにより合成された蛋白質の免疫沈降を示す。この図
では、分子量はキロドルトン単位で表示されている。 第４図は、組換えウイルスVV.TG,eLAV1135、1136、11
37及び1138により合成された蛋白質の免疫沈降を示す。
ウイルス1135は培養上澄み中には現われないgp160を合
成する。ウイルス1136及び1138は、それぞれ、細胞ペレ
ットに関連する関連蛋白質gp120及びgp40を産生する。
ウイルス1137はウイルス1135よりも僅かに小さい蛋白質
を生産し、分子量は予期されるものに一致する。 第５図は、本発明で記載した組換えウイルスにより合
成されたenv蛋白質の構造を示す。 S:シグナルペプチド H:内部疎水性領域 TM:トランスメンブレン係留領域 ↑:gp120/gp40切断部位 ■：狂犬病糖蛋白質由来の配列 方法 クローニング:Maniatisら、1982年。 酵素：供給者の指示に従って使用。 局所変異:ZollerとSmith、1983年に準じた方法。 ワクシニアへの移入:Kienyら、1984年。 唯一の相違点：LMTK+細胞の代りにヒト143B細胞を使
用。 保存ウイルスの調製 「無菌」ニワトリ初代細胞を0.01pfu/細胞で４日間に
わたり温度37℃で感染させる（MEM培地＋５％NCS）。 ウイルスの精製 上記保存ウイルスを2500rpmで15分間遠心分離する
（ローターGSA、Sorvall）。上澄みをとっておく。ペレ
ットをRSB緩衝液（10mM Tris−HCl、pH7.4、10mM KCl、
1mM MgCl2）中４℃で15分間処理する。懸濁液を陶製容
器（Potter）中ですりつぶし、2500rpmで15分間遠心分
離する。上澄みを先述の上澄みに加え、２回目のすりつ
ぶしを同様に行う。 全部の上澄みを、36％（w/v）スクロースクッション
（10mM Tris、pH8）10mlの上にのせる。懸濁液を14,000
rpmで２時間遠心分離する（ローターSW28、Beckman）。 ペレットを取り出し、砕き、別の同一クッションの上
に置く。２回目のペレットをPBS5ml中へとり、20〜40％
スクロース勾配（10mM Tris、pH8）上へのせる（同じロ
ーター）。懸濁液を12,000rpmで45分間遠心分離する。 ウイルスのバンドを回収する。それを20,000rpmで１
時間遠心分離してペレットにする。ペレットを10mM Tri
s、pH8中にとる。 免疫沈降 BHK−21細胞を0.2pfu/細胞で18時間にわたって感染さ
せる（ディッシュ径3cm、細胞個数106／ディッシュ、Ｇ
−MEM＋10％FCS中で培養）。培地をデカントし、メチオ
ニン不含培地1ml及び〔35S〕メチオニン（Amersham）10
μl/ディッシュで置換する。 ２時間後に、過剰量の非放射性メチオニンを加える。 標識後、感染細胞をかき取り、エッペンドルフ遠心器
中で１分間遠心分離し、上澄みとペレット画分を分離
し、ペレットPBS緩衝液で１回洗い、つぎに免疫沈降を
行い、ゲル電気泳動を実施する（Latheら、1980年に従
う）。 Endo−Ｆ処理 標識蛋白質をエイズ患者の血清で免疫沈降したのち、
蛋白質Ａ−セファローズ画分を 0.2M燐酸ナトリウム、pH6.1 0.05％ SDS 0.1％ノニデットP40 0.1％β−メルカプトエタノール 0.1％EDTA pH8 中にとり、５分間煮沸して蛋白質を変性させる。 1ml当り４単位のendo−Ｆを用いて37℃で20時間イン
キベーションを行い、続いて氷中で1/5容の100％TCAに
より２分間沈澱させる。ペレットを80％アセトンで３回
洗い、試料緩衝液を加え、混合物をSDSゲル上にのせ
る。 ELISA法による抗体アッセイ LAV ペルオキシダーゼにリンクさせたヒツジ抗マウス抗体
を第二抗体としてELAVIA試験（Pasteur−Diagnostic）
を採用。 ワクシニア 96平底穴プレート（NUNC）を炭酸緩衝液中107pfuの野
生型ワクシニアウイルスと37℃で18時間インキュベート
する。つぎにプレートを0.01％ゼラチンで飽和させる。
ついでマウス血清をプレートに吸着させ、その余の操作
はLAV ELISAの場合と同様に行う。 492nmで読取り。 実施例１ ハイブリッドプラスミドの構築 env遺伝子のコード配列のVVゲノムへの移入及びその
後のそれの発現に必要な諸要素を合せた寸法の数kbのオ
ーダーである。それ故、必要な操作を容易にするには、
構築作業に用いる大腸菌中の複製のためのプラスミドの
寸法を極小に迄減じることが必要と考えられた。 VVゲノムのHindIII断片（Hin−Ｊ）はキチジンキナー
ゼ（TK）のための完全な遺伝子を含み、この遺伝子はVV
ゲノム中に挿入されたDNAの交換及び組換えのために既
に先に使用されている（Mackettら、1982年）。挿入断
片のVVゲノムのTK遺伝子中への移入は選択可能なTK欠損
ウイルスを生じることに言及しておくことは重要なこと
である。まず、VV Hin−Ｊ断片の組込みに用いうる単一
のHindIII部位をもった小型のプラスミドを製出するこ
とが必要であった。更に、以下の操作を可能ならしめる
よう、不必要な制限配列をプラスミドから除去すること
が必要であった。 構築は、プラスミドpBR322から自然欠失により導かれ
たベクターで、ヌクレオチド1089と2491との間のセグメ
ントが失われているプラスミドpML2（LuskyとBotchan、
1981年）から出発した。先ず、pML2の２か所のAhaIII部
位の間にpuc8（VieiraとMessing、1982年）のAhaIII−A
haIII断片を挿入し、19塩基対を除くことによって、Pst
Ｉ配列を除去した。「リンカーテイリング」法（Lathe
ら、1984年）を用いてこのプラスミドのNruＩ部位とEco
RI部位との間にS1処理後にHindIIIリンカーを挿入し、B
amHI部位を除去した。これにより、機能性β−ラクタマ
ーゼ遺伝子（アンピシリン抵抗性を付与する）を有し、
更に大腸菌中で活性な複製開始点及び単一のHindIII制
限部位を含む2049塩基対のプラスミドが生じる。 この構築物をpTG1Hという。 TK遺伝子を有するVV DNAのHin−Ｊ断片は先に、pBR32
7由来のベクター中にクローン化されている（Drillien
とSpehner、1983年）。この4.6kbの断片をpTG1HのHindI
II部位に再クローン化した。アンピシリン抵抗性をコー
ドする遺伝子よりも遠位にTK遺伝子が位置するクローン
を選択した。 この構築物pTG1H−TKを以下の実験でベクターとして
用いた。 次の段階は、発現されるべき遺伝子をコードする配列
の発現を制御するのに用い得るVVプロモーターを単離す
るものであった。7500ドルトン（7.5K）の蛋白質をコー
ドする初期遺伝子のプロモーターが既に同じ目的のため
に成功裏に使用されている（Smithら、1983年）。それ
故、このセグメントの単離を試みた。 該7.5K遺伝子は、WR型のVVゲノムの最小のSalＩ断片
（Sal−Ｓ断片）の一つの上に位置している（Venkatasa
nら、1981年）。小さい断片の方が優先的にクローン化
されるので、SalＩ切断WR型のVVのDNAをプラスミドpBR3
22中に直接クローニングして得られるクローンの多くが
Sal−Ｓ断片を有している。この断片を、SalＩ消化及び
再結合によって、ベクターバクテリオフアージM13mp701
（Kienyら、1983年参照）に移す。これによりファージM
13TGSal−Ｓが得られる。 このクローンでは、7.5K遺伝子の開始ATGのすぐ近位
にScaＩ部位がある。7.5K遺伝子の下流には、ベクター
に由来する各単一のBamHI部位とEcoRI部位がある。BamH
I部位とScaＩ部位とを、BamHI消化で生じた末端を大腸
菌のクレノー断片を用いて埋めたのち、BglIIリンカー
５′−CAGATCTG−３′により融合する。このプロセスに
よりScaＩ部位が除去されるが、BamHI部位が再形成さ
れ、単一のEcoRI部位が下流へシフトする。同時に、下
流のSalＩ（AccI）部位が除去され、上流のSalＩ部位が
唯一のSalＩ部位となる。 この構築物をM13TG7.5Kと呼ぶ。 VV DNAのHin−Ｊ断片中には、約30塩基対離れたClaＩ
部位とEcoRI部位とがある（WeirとMoss、1983年）。M13
TG7.5K中に存在する7.5Kプロモーター断片をAccＩとEco
RIとにより切り出し、pTG1H−TKのClaＩ部位とEcoRI部
位との間にクローン化し、pTG1H−TK−P7.5Kを生ぜしめ
る。 この構築により、M13ベクターからの各単一のBamHI部
位及びEcoRI部位が7.5Kプロモーター配列のすぐ下流へ
移る。これら各単一のBamHI部位及びEcoRI部位を次の構
築に用いる。 バクテリオファージM13TG131（Kienyら、1983年）の
ポリリンカーセグメントをEcoRI及びBglIIを用いて切り
出し、プラスミドpTG1H−TK−P7.5KのEcoRI部位とBamHI
部位との間に挿入し、pTG7186−POLYを生ぜしめる。こ
の構築物にはP7.5の制御下の外来遺伝子のクローニング
に利用できる制限部位が10か所ある。 実施例２ env配列をもつプラスミドの構築env をコードする配列を得るために、プラスミドPJ19−
６及びPJ19−13中にクローン化された２種のプロウイル
スセグメントを先ず会合させる。 envmRNAが十分に翻訳されるよう、env遺伝子の推定さ
れる翻訳開始部位の周辺のヌクレオチド配列を、真核生
物遺伝子のコンセンサス配列にマッチするように装飾し
た。これは、5767位の近位でのオリゴヌクリレオチドを
用いた定方向特異的変異により達成された。 プラスミドPJ19−13及びPJ19−６は、それぞれヌクレ
オチド1258〜1698及び〜1698〜9173からなるLAVのプロ
ウイルスゲノムのHindIII断片を含有する。 PJ19−13のEcoRI−KpnＩ断片（env開始ATGを含む）を
ファージM13TG130に挿入し、オリゴヌクレオチド（配列
５′−CTCTCATTGTCACTGCAGTCTGCTCTTTC）を用いて定方
向特異的変異を行って、env翻訳開始コドン（5767位）
の上流にPstＩ部位を導入し、３位のＧをＡにより置換
した。次に変異断片をプラスミドpTG1−POLY（pTG1Hに
類似の2.1kbのミニプラスミドであるが、M13TG131のポ
リリンカーセグメントを含有する）のEcoRI部位とKpnＩ
部位との間に導入した。 PJ19−13由来のKpnＩ−HindIII断片を次の同じプラス
ミド中にクローニングし、（KpnＩとHindIIIとの間
に）、続いてPJ19−６のHindIII−XhoＩ断片のクローニ
ングを行って（HindIIIとSalＩとの間に）、２か所のPs
tＩ部位にはさまれた完全なenvコード配列を生じせしめ
た（プラスミドpTG1124）。 これら２か所のPstＩ制限部位の導入により、以後の
構築段階におけるenv遺伝子DNAの操作がより容易にな
る。上述の通り、ワクシニアウイルスでの異種蛋白質の
発現には、コード配列がワクシニアのプロモーター配列
と整列し、ワクシニアDNAの非必須（可欠）セグメント
中へ挿入されることを要する。両側に位置するこのDNA
は、二重相互組換えにより生体内でのワクシニアゲノム
との組換えを可能ならしめ、それによりコード配列及び
付随するプロモーターがワクシニアゲノム中へ移行す
る。 この目的で、上記PstＩ−PstＩ断片をpTG186−POLYの
PstＩ部位にクローニングした。これにより、pTG125と
呼ぶプラスミドを得た。 プラスミドpTG186−POLYは、プラスミドpTG188からPs
tＩ消化及びT4リガーゼによる再結合により生成され得
る。 プラスミドpTG188は、1985年６月20日に、フランス国
75015パリ市ドクトゥール ルー28のパスツール研究所
の国立微生物培養コレクションに次の番号で寄託されて
いる： E.coli 5KpTG 188＝No.I458 env遺伝子のコード配列及び随伴プロモーターのワク
シニアゲノムへの移入は次のようにして達成される。 実施例３ ワクシニアウイルスへのクローニングによるVV.TG.eL
AV9−１の生成 Smithら（1983年）が記載している方法は、VV TK遺伝
子中に挿入片を有するプラスミドと野生型ウイルスゲノ
ムとの間で生体内交換を行わせて、ウイルスがもつTK遺
伝子を不活性化することを基礎としている。TK+ウイル
スは、５−ブロモデオキシウリジン（5BUDR）の存在下
に細胞株（TK欠損）をプレーティングすることにより選
択できる（Mackettら、1982年）。チミジンキナーゼは5
BUDRを燐酸化してモノ燐酸エステルとする。これが次に
トリ燐酸エステルに転化される。この化合物はdTTPのア
ナログであり、DNA中へそれが組込まれると、ウイルス
の適正な発育が阻害される。しかし、TK+ウイルスはそ
のDNAを正常に複製し、やはりTK+の細胞株にて目に見え
るウイルスプラクを生じる。 ワクシニアウイルスは、感染細胞の核内でよりも細胞
室内で増殖する。このため、宿主DNAの複製及び転写機
構を利用することができず、ヴィリオン（ウイルス粒
子）がそのゲノム発現のための諸要素をもつことが必要
である。精製されたVV DNAは非感染性である。 組換え体の生成には、VVヴィリオンによる細胞の感染
とクローン化された対象DNAセグメントによりトランス
フェクションとを同時に行う必要がある。しかし、組換
え体の生成は、DNAによるトランスフェクションに対し
コンピテントな細胞中の小さな割合に限定される。その
ため、組換え体でない親ウイルスからなるバックグラウ
ンドを減じるための間接的「適合（congruence）」法を
採用することが必要であった。これは、生きた感染性ウ
イルスとして、39.5℃という非許容温度では増殖できな
い温度感受性（ts）ワクシニア変異株（DrillienとSpeh
ner、1983年）を用いて達成された。細胞をts変異株に
非許容条件下で感染させ、野生型ウイルスのDNAでトラ
ンスフェクトすると、トランスフェクションに対しコン
ピテントで、野生型ウイルスDNAとtsウイルスのゲノム
との間の組換えが起った細胞内でのみ、ウイルスの増殖
が起るであろう；他の細胞中では、それらが感染してい
ても、ウイルスは増殖しないであろう。pTG1125の如
き、ワクシニアのDNA断片を含有する組換えプラスミド
がトランスフェクション混合物中に適切な濃度で野生型
DNAと共に含まれていると、それをコンピテント（被感
染性）細胞中でのワクシニアDNAとの相同組換えに加わ
らせることも可能である。 ニワトリ胚線維芽細胞（CEF）の初代細胞の単層を33
℃でVV−コペンハーゲンts7（0.1pfu/細胞）に感染さ
せ、野生型VV−コペンハーゲンウイルスのDNA（50ng/10
6細胞）と組換えプラスミド（50ng/106細胞）との燐酸
カルシウム共沈物でトランスフェクトする。 tsウイルスの生育を許容しない温度（39.5℃）で２時
間インキュベーションを行ったのち、細胞を再び39.5℃
で48時間インキュベートする。ts++ウイルスの希釈液を
用いて、ヒト143B細胞の単層を37℃で再感染処理し、次
にそれら細胞を5BUDR（150μg/ml）の存在下にインキュ
ベートする。組換えプラスミドを受容したこれらの細胞
からTK+ウイルスのプラクが種々得られ、一方、プラス
ミドなしの対照培養は目に見えるプラクを示さない。TK
+ウイルスを次に5BUDR存在下に２回目の選択を行うこと
により、サブクローニングする。 ハイブリッドプラスミドpTG1125とVVゲノムとの間で
正しい二重相互組換えが行われると、挿入断片を有する
TK遺伝子とウイルスのTK遺伝子とが交換され、組換え体
がTK+となる。 種々のTK+組換えウイルスから精製したDNAをHindIII
で消化して、アガロースゲル電気泳動に付す。DNA断片
を、Southern（1975年）が記載している手法に従って、
ニトロセルロースフィルターに移す。次にフィルターを
32Pを用いたニックトランスレーション後のプラスミドp
TG1125とハイブリダイスさせる。フィルターを洗浄後、
フルオログラフィを行うと、ワクシニアウイルスがLAV
のenv遺伝子を組込んでおれば、オートラジオグラフ上
に3.85−、2.9−及び0.8−kbのバンドが見える。これら
組換え体の一つであるVV.TG.eLAV9−１を以下の実験用
に選択した。 実施例４ 組換えワクシニア−LAVウイルスから合成されたenv蛋
白質 ハイブリッドワクシニアウイルスからのLAVのenv遺伝
子の発現を証明するために、Ｇ−MEM培地＋10％ウシ胎
児血清中で培養した齧歯動物細胞BHK21を前期組換え体V
V.TG.eLAV9−１に感染させる。 新鮮な半コンフルエントの単層（106細胞）を0.2pfu/
細部で感染処理し、18時間インキュベートする。 ついで培地を除去し、10μg/mlの〔35S〕メチオニン
を加えた低メチオニン濃度の培地（106細胞に対し1ml）
を加える。細胞を37℃でインキュベートし、標識された
蛋白質を遠心分離によって集める。ベレット上澄みに分
離したのち、蛋白質をエイズ患者の血清と共にインキュ
ベートする。該血清と反応する蛋白質をプロテインＡ−
セファローズ樹脂に吸着させて回収し、SDSポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって広げ、オートラジオグラ
フィを行う（Latheら、1980年の手法による）。オート
ラジオグラフは、エイズ患者の血清が感染細胞抽出物中
の３種の蛋白質と特異的に結合することを示す（この結
果は、他の患者の血清を用いて得られるものと同一又は
類似である）。見掛けの分子量160、120及び41KDは、標
準env糖蛋白質調製物中及びLAVウイルス感染細胞の抽出
物中にエイズ患者の血清を用いて確認されたgp160、gp1
20及びgp41のバンドとの同等性を示唆する。LAVのenv遺
伝子のコード配列のみを有する組換えベクターから３種
の蛋白質が発現されるというこの観察は、一次翻訳産物
gp160の蛋白質分解性の切断によってgp120及びgp41が生
成するとする仮説を支持する。 envをコードする配列は約90KDの一次翻訳産物をもた
らす。一方、上記の方法で得られるenv前駆体は約160KD
という見掛け分子量をもつ。この差は、かなりの量のグ
ルコシル化のあることに帰される。グリコシル基を除去
するエンドグリコシダーゼＦで消化することにより、本
発明により得られた生成物と予想生成物との良好な相関
を証明することができた（第１図）。 実施例５ VV.TG.eLAV9−１ウイルス接種マウスでの抗env抗体の証
明 ２週令の雄性Balb/cマウスにVV.TG.eLAV9−１を１頭
当り５×107pfuの皮下注射により接種する。２週間後、
それらマウスに同用量でブースター注射を行い、ブース
ターから１、２及び４週間後に血液サンプルを採取す
る。それらの血清中にLAVウイルス及びワクシニアウイ
ルスの抗原決定基に対する抗体が存在しないか調べる。 接種した動物の全てが、ELISA試験でワクシニアウイ
ルスと反応しうる血清を与える。これに対し、LAVウイ
ルスに対するELISA試験での応答は弱く、再現性も低
い。試験の感度を向上させるべく、「ウェスタンブロッ
ティング」の手法を用いた。この方法は、LAVウイルス
の蛋白質と反応しうる抗体を、それら蛋白質を電気泳動
ゲル中でSDSにより変性し、ニトロセルロース膜へ移し
たのちに証明できるようにする。この実験では、使用し
たニトロセルロース膜は、Diagnostic−Pasteurが販売
しているLAV−BLOTのそれであり、それにはLAVウイルス
の蛋白質が既に結合されている。これらの膜を細片状に
切断し、各細片を接種マウスの血清（1/20希釈）と共に
インキュベートする。ペルオキシダーゼに結合させた第
二抗体（ヒツジ抗マウス）が、マウス抗体に結合したLA
Vウイルス蛋白質の可視化を可能とする。 いくつかの血清（12/27）が、envのgp160に相当する
分子量約160KDの蛋白質と特異的反応を呈する（第２
図）。いくつかの血清では、gp41蛋白質との反応も観察
される。少数のマウスの血清が、ウエスタンブロッティ
ングで、膜に結合させたLAVウイルスの未同定蛋白質に
相当するシグナルを生じることを注記しておくべきであ
ろう。 実施例６ pTG1128の構築 このプラスミドpTG1128は、トランスメンブレン領域
をコードする配列が変異されていて、アルギニンがイソ
ロイシンにより置換されるようになっている以外は、プ
ラスミド1125と同じである。この変異は、細胞膜中での
当該蛋白質の付着を改善するためのものである。 実施例２に記載したenvのトランスメンブレン領域を
含有するpTG1124のHindIII−BamHI断片を、HindIII−Ba
mHI消化後のファージM13TC131へ挿入する。これにより
ファージM13TG154が得られる。 次にこのファージM13TG154について、アルギニンをコ
ードするコドンをイソロイシンをコードするコドンによ
り置換するようデザインされた限局性変異誘発を行う。
この目的のため、次のオリゴヌクレオチドを用いる： ５′GGTTTAATAATAGTTTT3′ かくして、ファージM13TG155が得られ、その配列は次
のように修飾されている： かくして変異したBamHI−HindIII断片をM13 TG155か
らプラスミドpTG1124の相当する部位へ移すと、プラス
ミドpTG1127が得られ、このものは、アルギニンコドン
がイソロイシンコドンにより置換されている以外は上述
のものと同じenv遺伝子を再び形成する。 実施例１に記載した通りにして、pTG1127のPstＩ−Ps
tＩ断片をプラスミドpTG186−POLYのPstＩ部位中にクロ
ーン化して、プラスミドpTG1128を得る。 実施例７ プラスミドpTG1130の構築 このプラスミドでは、狂犬病糖蛋白質のトランスメン
ブレン領域をコードする配列が、env糖蛋白質の疎水性
蛋白質をコードする配列の最初と融合している。 狂犬病糖蛋白質のトランスメンブレン領域は、ファー
ジM13 TGRG151のBamHI−PstＩ断片に由来している。 この断片をファージM13TG154のBamHI部位とPstＩ部位
との間にクローン化する（上記実施例参照）。かくして
ファージM13TG156が得られる。 次に、M13TG156に対して限局性変異誘発を行って、en
v配列と狂犬病配列を、オリゴヌクレオチドを用い、
５′GCTGTGGTATATAAAATATGTATTACTGAGTG3′ループを形
成させることにより同調的に融合させる。 かくしてファージM13TG157を得る。 env遺伝子と融合させたばかりの狂犬病糖蛋白質のト
ランスメンブレン（tm）領域を次にプラスミドpTG1124
に移入する。 この目的のため、M13TG157のHindIII−BglII断片を、
HindIII−BamHI制限を行ったpTG1124中にクローニング
する（これによりBamHI部位及びBglII部位がこわされ
る）。 M13TG157のBglII部位は狂犬病gp断片： に由来する。 かくしてプラスミドpTG1126を得る。 上記と同様に、pTG1126のPstＩ−PstＩ断片をpTG186
−POLYのPstＩ部位にクローニングして、プラスミドpTG
1130を得る。 実施例８ pTG1131の構築 このプラスミドを構築する目的は、env遺伝子のシグ
ナル配列と狂犬病糖蛋白質のシグナル配列とを融合させ
ることである。 狂犬病糖蛋白質のシグナル配列をプラスミドpTG115PR
OからBglII−HindIII断片の形で取り出し、下記配列を
もつ一本鎖アダプターを用いてM13TG130のPstＩ−HindI
II部位にクローニングする： ５′GATCTGCA3′ かくしてファージM13 TG158を得る。 次に、envシグナルペプチドのM13TG158への移行を行
って、これを、狂犬病糖蛋白質のシグナルペプチドをコ
ードする遺伝子と融合させる。 この目的で、S1ヌクレアーゼで、ついでクレノー及び
KpnＩで処理したPstＩ断片を、HindIIIで切断し、クレ
ノー−KpnＩで処理したM13 TG158中にクローニングす
る： かくしてファージM13 TG159を得る。 M13 TG159のKpnＩ−PstＩブロックをM13TG131中へ移
し、プラスミドM13 TG160を得る。 M13 TG160に対して限局性変異誘発を行うと、env配列
と狂犬病糖蛋白質配列とを同調的に融合させうる（ルー
プを形成させて）。これは次のオリゴヌクレオチドを用
いて達成される： かくしてファージM13 TG161を得る。 13 TG161のPvuII−KpnＩ断片を次に、EcoRIで切断
し、クレノー−KpnＩで処理したpTG1126中へクローニン
グする（M13 TG161のPvuII部位は、ポリリンカーの上流
に位置する領域中のM13に由来する）。これによりプラ
スミドpTG1129を得る。 pTG1129のPstＩ−PstＩ断片の、PstＩ切断プラスミド
pTG186−POLY中へのクローニングにより、プラスミドpT
G1131を得る。 実施例９ プラスミドpTG1132の調製 pTG1128のPstＩ−PstＩ断片をM13 TG131のPstＩ部位
にクローニングすることにより、プラスミドM13 TG162
を得る。 次にオリゴヌクリオチド を用いて限界性変異誘発を行う。 これにより、停止コドンをgp120の最後に位置させる
ことができる。得られた配列は次の通りである： かくしてファージM13 TG168を得る。 M13 TG168のPstＩ断片をpTG186−POLYのPstＩ部位に
クローニングすることにより、プラスミドpTG1132を得
る。 実施例10 プラスミドpTG1133の構築 次のオリゴヌクレオチドを用いたM13 TG162の限局性
変異誘発により、gp120とgp40とを分離する潜在性切断
部位が破壊されたバクテリアファージを得る： 装飾された配列は次の通りである： かくしてファージM13 TG165を得る。 M13 TG165のPstＩ−PstＩ断片をpTG186−POLYのPstＩ
部位にクローニングすることにより、プラスミドpTG113
3を得る。 実施例11 プラスミドpTG1134の構築 pTG1131のPstＩ−PstＩ断片をM13 TG131のPstＩ部位
にクローニングすることにより、ファージM13 TG163を
得る。 上記と同じgp120の切断部位を破壊するために、M13 T
G163に対して限局性変異誘発を行う。この目的には、次
のオリゴヌクレオチドを用いる： これにより配列を次のように装飾できる： これらの条件下に、ファージM13 TG166を得る。 ファージM13 TG166のPstＩ−PstＩ断片をpTG186−POL
YのPstＩ部位に再クローニングすることにより、プラス
ミドpTG1134を得る。 実施例12 VV.TG.eLAV組換えウイルスにより合成された蛋白質の免
疫沈降 プラスミドpTG1125について上に記載した通り作業し
て、上記で調製した各種プラスミドに対応するハイブリ
ッドワクシニアベクターを得る。 これらのウイルスベクターをそれぞれ VV.TG.eLAV1128 VV.TG.eLAV1130 VV.TG.eLAV1131 VV.TG.eLAV1132 VV.TG.eLAV1133 VV.TG.eLAV1134. と名付ける。 上記のようにして得た蛋白質を免疫沈降により試験す
る（第３図）。 ウイルス９−１については、免疫沈降物群がgp160、g
p120及びgp41に相当する免疫沈降を示す。 ウイルス1128についても同様である。 ウイルス1130もgp160及びgp120を示す。 gp41に対応する蛋白質はそのＣ末端の装飾のため僅か
に低い分子量をもつ。 ウイルス1131は、ウイルス1130で得られるものと実質
的に同一のスペクトルを示す。 ウイルス1132は当然のことながらgp41に対応する蛋白
質を示さない。ペレット中に存在する105KDの蛋白質はg
p120のイソフォーム（グリコシル化の相違）である。 ウイルス1133に関しては、これは蛋白質160、120及び
41を明瞭に示すが、蛋白質120及び41に対応するバンド
は他のスペクトルの場合よりも弱い。 ウイルス1134についても同で、これの場合にも、41の
分子量は低いが、ウイルスVV.TG.1125（９−１）〜1131
と比較して切断が遅い速度で起っていることが明らかで
ある。 実施例13 プラスミドpTG1135の構築 VV.TG.eLAV1133及び1134について行った放出の速度論
的解析は、gp120とgp41との間の切断の速度は遅いが、
それでも切断は起ることを示す。env遺伝子のDNA配列を
調べると、第一の切断部位から８アミノ酸下流にもう一
つ潜在的切断部位（KRR）のあることが分る。それ故、g
p160のみを発現する組換えワクシニアウイルスを得るに
はこの第二の部位を変異させることが重要であろう。 次のヌクレオチドを用いたM13 TG166の限局性変異誘
発により、第二の切断部位を装飾したファージを得る： 装飾された配列は次の通りである： 得られたファージ（M13 TG181）のPstＩ−PstＩ断面
をpTG186−POLYのPstＩ部位にクローニングして、プラ
スミドpTG135を生ぜしめる。 実施例14 プラスミドpTG1139の構築 組換えワクシニアベクターVV.TG.eLAV1135により合成
されるenv遺伝子のＣ末端部は狂犬病糖蛋白質由来の配
列である。従って、このＣ末端部分がLAVウイルスのenv
遺伝子のＣ末端部分によって置換された他の組換え体を
もつことも有用と思われる。 この目的で、ファージM13 TG166について行った（実
施例13参照）と同じ変異誘発をファージM13TG165に対し
て行って、ファージM13 TG184を生ぜしめる。 M13TG184のPst−PstＩ断片を次にプラスミドpTG186−
POLY中にクローニングして、プラスミドpTG1139を生ぜ
しめる。 実施例15 プラスミドpTG1136の構築 gp120のみを発現する組換えワクシニアウイルスをも
つことも望ましいであろう。このgp120は、VV.TG.eLAV1
132ウイルスで得たものと違い、Ｃ末端係留（アンカレ
ッジ）領域を備えているであろう。 この目的で、次のヌクレオチドを用いた限局性変異誘
発により、ファージM13 TG181中のgp40に対応する配列
を除去する： このオリゴヌクレオチドは、gp120の配列（装飾され
た切断部位を２か所もつ）と狂犬病糖蛋白質のトランス
メンブレン領域の配列とを同調的に融合させることを可
能にする。かくしてファージM13TG182を得る。ファージM13TG182の
PstＩ−PstＩ断片を次にpTG186−POLYのPstＩ部位に挿
入して、プラスミドpTG1136を生ぜしめる。 実施例16 プラスミドpTG1137の構築 gp40のＮ末端部に位置する疎水性領域の役割は殆ど知
られていない。env蛋白質のこの領域は、シンシチウム
形成誘発能の要因となっているのかもしれない。 従って、この配列を有しないgp160を生成させること
も有利であると思われる。 この目的のため、ファージM13TG181中のこの疎水性ペ
プチドをコードしている部分の上流及び下流の配列を、
次のオリゴヌクレオチドを用いて融合させる： これは、下記融合を行うことによってファージM13TG183
を得ることを可能ならしめる： M13TG183のPstI−PstI断片をpTG186−POLYのPstI部位
に再クローニングして、プラスミドpTG1137を生ぜしめ
る。 実施例17 gp160又はgp120を発現する組換えウイルスに加えて、
gp40のみを発現する組換えワクシニアウイルスを生ぜし
めることは有用であろう。 この目的で、シグナルペプチドをコードする配列を、
ファージM13TG163上でgp40をコードする配列と、次のヌ
クレオチドを用いて融合させる： これは、次の融合を含むファージM13TG180の生成を可能
ならしめる： M13TG180のPstＩ−PstＩ断片をpTG186−POLYのPstＩ
部位に挿入して、プラスミドpTG1138を得る。 実施例18 プラスミドpTG1162の構築 gp160の場合（プラスミドpTG1139）の場合と同様に、
係留領域及び細胞質内領域が対応する狂犬病糖蛋白質の
配列ではなくLAVウイルスのenv遺伝子の配列であるgp40
発現組換えウイルスをもつことも重要であろう。 これを得るべく、M13TG180のHindIII−BglＩ断片をM1
3TG165のHindIII−BglＩ断片により置換して、ファージ
M13TG190を生ぜしめる。 ファージM13TG190のPstＩ−PstＩ断片をプラスミドpT
G186−POLYのPstＩ部位にクローニングすることによ
り、プラスミドpTG1162を得る。 実施例19 プラスミドpTG1163の構築 切断されずに培地中へ分泌されるgp160を合成する組
換えワクシニアウイルスを得ることも重要と思われる。
実際には、この蛋白質は、死菌ワクチンとして、アジュ
バントと組合せて又はリポソームやISCOMS〔Moreinら、
Natire（1984）308、5958、p457−60〕中に挿入して使
用することができよう。 この目的で、細胞質外領域及び細胞質内領域をコード
する配列がバクテリオファージM13TG184中で同調的に融
合しているバクテリオファージM13TG194を次のオリゴヌ
クレオチドを用いて構築する： M13TG194のPstＩ−PstＩ断片を次にpTG186−POLYのPs
tＩ部位にクローニングして、pTG1163を得る。 かくして得た組換え蛋白質、特に非切断性gp160は、
該ウイルスと接触した患者の血液中に存在する潜在的抗
体を検出するための診断キットに利用できる。これらの
試験は、当業者によく知られた方法、例えばELISA、RIP
A又は「ウエスタンブロッティング」（免疫インプリン
ティング）により実施できる。 これらの蛋白質は、サンプル中のウイルスの存在を検
出するようでデザインされたモノクローナル抗体及びハ
イブリドーマの生産のためにも使用できる。 用いた種々のプラスミド及びM13ファージは、とりわ
け下記特許出願等に、記載されている： M13 TG131:Kienyら、1983年 M13 TGRG151:WO83/04052 pTG155PRO:FR84 06499 M13TG130:Kienyら、1983年 下記プラスミドは、1984年11月16日にパスツール研究
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ンに関するものである。後天性免疫不全症候群（AIDS）
は、現在北米、欧州及び中央アフリカで特に問題となっ
ているウイルス性疾患である。最近の推定によれば、10
0万の米国人がエイズウイルスに曝露されている可能性
が示唆されている。患者は重篤な免疫不全を呈し、この
疾患は一般的に致死的なものである。この疾患は、最も
一般的には、性的接触によって伝播される。麻薬を静脈
内注射で使用する人々も高リスク群をなす。他方では、
汚染された血液または血液薬品を受けたことによって、
多くの人がこのウイルスに感染している。本疾患の原因
因子はレトロウイルスである。動物の多くの状態がレト
ロウイルスによりものであるとされているが、ヒトを冒
すレトロウイルスを記述できるようになったのは、ごく
最近のことである。 Ｉ型及びII型のヒトＴ細胞レトロウイルス（HTLV:ヒ
トＴ細胞白血病ウイルス）が成人に於けるある種のＴ細
胞白血病の原因因子であるとされている一方、III型HTL
V又はエイズ関連ウイルス（ARV）としても知られるリン
パ節症関連レトロウイルス（LAVウイルス）が現在エイ
ズの原因となる因子であると一般に認められている。 LAVレトロウイルスのゲノムは極めて完全に特性記述
されており（Wain−Habsonら、1985年;Ratnerら、1985
年;Muesingら、1985年、Sanchez Pescadorら、1985
年）、配列に関するデータは、レンチウイルス群と極め
て密接な関係にあることを示している。ヒツジビスナウ
イルスを原型とするレンチウイルスは、典型的に長い潜
伏期を示す遅発性の疾患の原因因子である。LAVウイル
スとビスナウイルスには多くの類似点があり、特に向神
経組織性で類似する。 他の周知のレトロウイルスの場合と同様に、LAVゲノ
ムの三つの最も重要な部分は、gag、polおよびenvと呼
ばれている。env遺伝子の配列は、gp110及びgp41の配列
を含めて、トランスメンブレン（transmembrane）エン
ヴェロープ糖蛋白質に対して予期された特性を有し、gp
110とgp41とから構成されるenv蛋白質前駆体gp160の本
質が直接アミノ酸配列決定法により確かめられている。
以下、gp41をgp40又はgp41と呼ぶこともある。 env蛋白質gp160並びにその切断生成物gp120及びgp41
に対して生産される抗体はエイズ患者の血清中に普通に
検出され、env糖蛋白質はエイズウイルスの主たる表面
抗原に該当する。 かくして、env蛋白質は、予防接種戦略を展開するた
めの最も期待される候補であり、そのために、この蛋白
質及びそれをコードする配列が注目を集めている。 多くのグループがenv蛋白質の細胞内での発現を報告
している。しかし、グリコシル化及び翻訳後構造修飾が
行われないために、それら微生物により合成された物質
の免疫力が減じている可能性がある。 それ故に、本発明は、env蛋白質発現ベクターとし
て、グルコシル化及び翻訳後構造修飾を可能ならしめる
であろう環境中で蛋白質を発現させうるウイルスベクタ
ーを使用することを提案する。 すなわち、本発明は、エイズの原因となるウイルスの
env遺伝子の全部又は一部を含有するウイルスベクター
に関するものである。 使用可能なウイルスベクターの中では、特にポックス
ウイルスが挙げられ、とりわけワクシニアウイルス（V
V）が挙げられる。 ワクシニアウイルスは、天然痘の制御及び根絶のため
に世界中で極めて広く用いられている二重鎖DNAウイル
スである。最近の技術の進歩により、このウイルスをク
ローニングベクターとして開発することが可能となり、
更に生きた組換えウイルスによって外来抗原の発現が可
能となり、かつ種々のウイルス性及び寄生虫性の疾患に
対する免疫を得ることさえ可能となっている。 すなわち、数グループが最近このタイプの組換え体を
使用してインフルエンザ抗原、Ｂ型肝炎抗原及び狂犬病
糖蛋白質を発現させ、これらの疾患に対して免疫が得ら
れることを示している（Smithら、1983年、Panicali
ら、1983年、Kienyら、1984年）。 ワクシニアウイルス（VV）による外来蛋白質をコード
する配列の発現には必然的に次の二つの段階が含まれ
る： １）コードする配列がVVのプロモーターと一列にそろえ
られ、VV DNAの非必須区間中に挿入され、適当な細菌プ
ラスミド中にクローン化されなければならない； ２）コードする配列の両側に位置するVV DNAの配列は、
プラスミドとウイルスゲノムとの間の生体内での相同性
組換えを可能にするものでなければならない；二重相互
組換えにより、挿入DNA断片がプラスミドからウイルス
ゲノムへ移り、そこで増殖、発現される（PanicaliとPa
oletti、1982年;Mackettら、1982年;Smithら、1983年;P
anicaliら、1983年）。 当然のことながら、このタイプのベクターの使用に
は、ベクターウイルスのゲノムの部分的欠失処理をしば
しば伴う。 本発明はとりわけ、少なくとも次のものを含有するウ
イルスベクターに関するものである： −ベクターのウイルスのゲノムの一部、 −エイズ原因ウイルスのエンヴェロープの糖蛋白質（g
p）の一つをコードする遺伝子、及び −細胞中でこの糖蛋白質の発現のための諸要素。 本発明はまた、該ウイルスに対応する組換えDNAに関
するものでもある。 エイズの原因となるウイルスのエンヴェロープ中に
は、KD単位でのそれらの質量に応じてgp160、gp120及び
gp41と呼ばれる３種の糖蛋白質を数えうることを指摘し
ておくことが適切である。最初のもの、gp160は実際に
は後の２種の蛋白質の前駆体である。これらの名称は未
だ確立されたものではなく、gp41はgp40又はgp42と呼ば
れることもあるが、これら３種の糖蛋白質は、それらの
名称にも拘らず、質量の差からみて完全に同一とみなし
うるものである。 エイズ原因ウイルスとは、とりわけLAVウイルス、HTL
V IIIウイルス又はARV、またこれらウイルスから生じう
る点変異体または部分欠失体、並びに関連ウイルスを指
すものと理解される。 ベクターウイルス（エイズ原因ウイルスとは別の）の
ゲノムに相当する部分では、ウイルスベクターは任意の
起源のウイルスのゲノムから形成されていてよいが、ポ
ックスウイルスのゲノムの一部、とりわけワクシニアの
ゲノムの一部を用いるのが好ましい。 ワクシニアウイルス中での異種蛋白質の発現に必要な
条件は上に述べられている。 一般に、問題の遺伝子、たとえばenv遺伝子が発現さ
れうるためには、それがワクシニア遺伝子のプロモータ
ーに従属していなければならないであろう；このプロモ
ーターは一般にはワクシニアの7.5K蛋白質プロモーター
であろう。更に、コード配列が、標識遺伝子として役立
ちうるであろうワクシニアの非必須遺伝子中にクローン
化されなければならないであろう。これは大抵の場合TK
遺伝子となろう。 発現を達成したいエンヴェロープ糖蛋白質のうちで
は、上述の３種の蛋白質、gp160、gp41及びgp120を挙げ
るべきである。 一般には、完全なエンヴェロープ遺伝子、即ちこの遺
伝子のシグナル配列及びトランスメンブレン配列を組入
れたenv遺伝子の発現を達成するのが好ましいであろ
う。 env遺伝子蛋白質全体をコードする遺伝子をクローン
化したウイルスベクターを用いての最初の諸試験の結
果、発現生成物の免疫原性を改善するためにこの遺伝子
の装飾が提案された。 培養上澄中へのenv蛋白質のかなりの放出が観察され
た（この放出は生体内では多分循環体液中へ行われるで
あろう）。これは、該蛋白質の細胞膜中での付着が弱い
ことによるのであろう；その上、細胞表面に抗原が現わ
れることが、ワクシニア系による免疫応答の誘発によっ
て極めて重要なことが知られている。従って、該蛋白質
の細胞膜中での係留を向上させるようにenv蛋白質を装
飾することが提案される。 このためには、アルギニンに対応するコドンをイソロ
イシンに対応するコドンで置換えるよう、トランスメン
ブレン領域をコードする部分でenv遺伝子を装飾しても
よいであろう。 異種ウイルスのトランスメンブレン領域、例えば狂犬
病ウイルスのgpのトランスメンブレン領域をenv蛋白質
のトランスメンブレン領域に置換及び／又は付加するこ
とによって該係留を向上させうる可能性もある。 更に、該蛋白質がその発現後に十分に組立てられない
可能性がある。実際上、シグナルペプチドはかなり非定
型的であり、蛋白質の完全な移出を損う可能性もある。
このため、異種ウイルスに由来するシグナル配列、例え
ば狂犬病ウイルスのgpのシグナル配列を置換及び／又は
付加することが提案される。 最後に、細胞により放出されるのはgp160よりもむし
ろgp120であるように思われる。それは一方では免疫系
のためのおとりを提供し、他方では、最近のデータに合
致して、T4細胞に結合することができるであろう。この
結果は、T4細胞を不活性化する効果又はそれらを他のT4
細胞にとっての異物に見えさせる効果をもつものであろ
う。 それ故、放出され得ないgp120env蛋白質を得ることが
有利であろう。これは、env遺伝子を、gp120をコードす
る配列とgp41をコードする配列との間で装飾して、gp12
0とgp41との間に位置するプロテアーゼ切断部位を除去
することにより、とりわけREKR部位を除去することによ
り、達成される。 本発明のプラスミドでは、REKR配列から８アミノ酸下
流に位置するKRR配列に相当する部位で少なくとも１か
所の追加の変異が行われる。そうして得られたgp160は
もはや切断されない。 本発明のベクターは、更に、env蛋白質のシンシチウ
ム（合胞体）形成能、即ちウイルスが細胞融合を起さ
せ、巨細胞又はシンシチウムを生じる能力の原因である
かもしれないと考えられているgp41の疎水性Ｎ末端ペプ
チドに相当する配列を欠いているところのgp41をコード
する配列を含有する。 最後に、本発明は、gp160の細胞質外領域と細胞質内
領域とがＣ末端疎水性ペプチド削除後に同調して融合さ
れ、それによって得られるべき糖蛋白質の分泌を可能な
らしめているウイルスベクターに関するものである。 一般に、本発明のウイルスベクターは次の蛋白質の一
つをコードする配合を含有する： ・Ｓはシグナルペプチドであり、 ・gp120は糖蛋白質120であり、 ・Ｊはgp120とgp40との間のプロテアーゼ切断部位を欠
いた連結部を概念的に示し、 ・gp40は糖蛋白質40であり、 ・tmはトランスメンブレンペプチドである。 又は−Ｓ−gp40−tm− 又は−Ｓ−gp120−tm− なる構造の蛋白質。 シグナルペプチド及びトランスメンブレン配列はエイ
ズ原因ウイルスのそれらであっても、異種のものであっ
てもよく、とりわけ狂犬病ウイルス又はVSV或はエンヴ
ェロープをもつ他のウイルスに由来するものであっても
よい。 gp40はその疎水性Ｎ末端を欠いていてもよい。 第一の発明は主として、LAVウイルスのenv遺伝子によ
りコードされた糖蛋白質を細胞培養で得るためのウイル
スベクターの使用に関するものである。従って、当該細
胞はまずは本発明のウイルスベクターに感染した哺乳動
物細胞であり、或は相当する組換えDNAを含有する哺乳
動物細胞である；これらの細胞のうちでは、とりわけ初
代培養からのヒト二倍体細胞並びにVero細胞を挙げてお
くべきである。当然のことながら、後記実施例からも分
るように、他のタイプの細胞を供することも可能であ
る。 かくして得られた糖蛋白質は精製後ワクチン製造のた
めに使用できる。 本発明のウイルスベクターを予防接種のために直接使
用することも可能で、そのときは所要部位及び生体内で
糖蛋白質が産生される。 ２種以上の予防接種剤、特に上記装飾に付されたgp12
0及びgp40を個別に発現するベクターに相当する予防接
種剤を組合せ使用し、同時に又は別個に投与するのが有
利である。例えば、後記のベクター1136及び1138から誘
導された予防接種剤を合せて使用することが有利でろ
う。 最後に、本発明は、上記糖蛋白質に対して産生された
抗体に関するものでもあり、該抗体は、生体を上記ウイ
ルスベクターに感染させ、一定時間後に誘発された抗体
を回収することによって得られる。 糖蛋白質の取得、細胞培養及び予防接種に用いられる
技法は、既知のワクチンについて現在行われるものと同
じであり、詳しく述べることはしない。 以下の方法及び実施例を読めば、本発明をより十分に
理解できるであろう。 ５つの図は実施例を図解したものである： 第１図は、組換え体VVTGeLAV9−１及びVVTGeLAV1132
により合成され、抗LAV血清を用いて免疫沈降させられ
た蛋白質に対するendo−Ｆの作用を示す。この図に於
て、分子量はキロドルトン単位で示されており、符号は
次の通りである。 ・Ｐ、細胞ペレット、 ・Ｓ、上澄み、 ・ｕ、無処理で得られた生成物、 ・ｅ、endo−Ｆ処理後に得られた生成物。 第２図は、組換え体VVTGeLAV9−１を接種したマウス
の血清によりLAVウイルスの蛋白質が認識される様子を
示す。この図に於て、Ｔは使用血清がエイズ患者のもの
である場合を示す。分子量はキロドルトン単位で示され
ている。 第３図は、env遺伝子を有する組換えワクシニアウイ
ルスにより合成された蛋白質の免疫沈降を示す。この図
では、分子量はキロドルトン単位で表示されている。 第４図は、組換えウイルスVV.TG,eLAV1135、1136、11
37及び1138により合成された蛋白質の免疫沈降を示す。
ウイルス1135は培養上澄み中には現われないgp160を合
成する。ウイルス1136及び1138は、それぞれ、細胞ペレ
ットに関連する関連蛋白質gp120及びgp40を産生する。
ウイルス1137はウイルス1135よりも僅かに小さい蛋白質
を生産し、分子量は予期されるものに一致する。 第５図は、本発明で記載した組換えウイルスにより合
成されたenv蛋白質の構造を示す。 S:シグナルペプチド H:内部疎水性領域 TM:トランスメンブレン係留領域 ↑:gp120/gp40切断部位 ■：狂犬病糖蛋白質由来の配列 方法 クローニング:Maniatisら、1982年。 酵素：供給者の指示に従って使用。 局所変異:ZollerとSmith、1983年に準じた方法。 ワクシニアへの移入:Kienyら、1984年。 唯一の相違点：LMTK+細胞の代りにヒト143B細胞を使
用。 保存ウイルスの調製 「無菌」ニワトリ初代細胞を0.01pfu/細胞で４日間に
わたり温度37℃で感染させる（MEM培地＋５％NCS）。 ウイルスの精製 上記保存ウイルスを2500rpmで15分間遠心分離する
（ローターGSA、Sorvall）。上澄みをとっておく。ペレ
ットをRSB緩衝液（10mM Tris−HCl、pH7.4、10mM KCl、
1mM MgCl2）中４℃で15分間処理する。懸濁液を陶製容
器（Potter）中ですりつぶし、2500rpmで15分間遠心分
離する。上澄みを先述の上澄みに加え、２回目のすりつ
ぶしを同様に行う。 全部の上澄みを、36％（w/v）スクロースクッション
（10mM Tris、pH8）10mlの上にのせる。懸濁液を14,000
rpmで２時間遠心分離する（ローターSW28、Beckman）。 ペレットを取り出し、砕き、別の同一クッションの上
に置く。２回目のペレットをPBS5ml中へとり、20〜40％
スクロース勾配（10mM Tris、pH8）上へのせる（同じロ
ーター）。懸濁液を12,000rpmで45分間遠心分離する。 ウイルスのバンドを回収する。それを20,000rpmで１
時間遠心分離してペレットにする。ペレットを10mM Tri
s、pH8中にとる。 免疫沈降 BHK−21細胞を0.2pfu/細胞で18時間にわたって感染さ
せる（ディッシュ径3cm、細胞個数106／ディッシュ、Ｇ
−MEM＋10％FCS中で培養）。培地をデカントし、メチオ
ニン不含培地1ml及び〔35S〕メチオニン（Amersham）10
μl/ディッシュで置換する。 ２時間後に、過剰量の非放射性メチオニンを加える。 標識後、感染細胞をかき取り、エッペンドルフ遠心器
中で１分間遠心分離し、上澄みとペレット画分を分離
し、ペレットPBS緩衝液で１回洗い、つぎに免疫沈降を
行い、ゲル電気泳動を実施する（Latheら、1980年に従
う）。 Endo−Ｆ処理 標識蛋白質をエイズ患者の血清で免疫沈降したのち、
蛋白質Ａ−セファローズ画分を 0.2M燐酸ナトリウム、pH6.1 0.05％ SDS 0.1％ノニデットP40 0.1％β−メルカプトエタノール 0.1％EDTA pH8 中にとり、５分間煮沸して蛋白質を変性させる。 1ml当り４単位のendo−Ｆを用いて37℃で20時間イン
キベーションを行い、続いて氷中で1/5容の100％TCAに
より２分間沈澱させる。ペレットを80％アセトンで３回
洗い、試料緩衝液を加え、混合物をSDSゲル上にのせ
る。 ELISA法による抗体アッセイ LAV ペルオキシダーゼにリンクさせたヒツジ抗マウス抗体
を第二抗体としてELAVIA試験（Pasteur−Diagnostic）
を採用。 ワクシニア 96平底穴プレート（NUNC）を炭酸緩衝液中107pfuの野
生型ワクシニアウイルスと37℃で18時間インキュベート
する。つぎにプレートを0.01％ゼラチンで飽和させる。
ついでマウス血清をプレートに吸着させ、その余の操作
はLAV ELISAの場合と同様に行う。 492nmで読取り。 実施例１ ハイブリッドプラスミドの構築 env遺伝子のコード配列のVVゲノムへの移入及びその
後のそれの発現に必要な諸要素を合せた寸法の数kbのオ
ーダーである。それ故、必要な操作を容易にするには、
構築作業に用いる大腸菌中の複製のためのプラスミドの
寸法を極小に迄減じることが必要と考えられた。 VVゲノムのHindIII断片（Hin−Ｊ）はキチジンキナー
ゼ（TK）のための完全な遺伝子を含み、この遺伝子はVV
ゲノム中に挿入されたDNAの交換及び組換えのために既
に先に使用されている（Mackettら、1982年）。挿入断
片のVVゲノムのTK遺伝子中への移入は選択可能なTK欠損
ウイルスを生じることに言及しておくことは重要なこと
である。まず、VV Hin−Ｊ断片の組込みに用いうる単一
のHindIII部位をもった小型のプラスミドを製出するこ
とが必要であった。更に、以下の操作を可能ならしめる
よう、不必要な制限配列をプラスミドから除去すること
が必要であった。 構築は、プラスミドpBR322から自然欠失により導かれ
たベクターで、ヌクレオチド1089と2491との間のセグメ
ントが失われているプラスミドpML2（LuskyとBotchan、
1981年）から出発した。先ず、pML2の２か所のAhaIII部
位の間にpuc8（VieiraとMessing、1982年）のAhaIII−A
haIII断片を挿入し、19塩基対を除くことによって、Pst
Ｉ配列を除去した。「リンカーテイリング」法（Lathe
ら、1984年）を用いてこのプラスミドのNruＩ部位とEco
RI部位との間にS1処理後にHindIIIリンカーを挿入し、B
amHI部位を除去した。これにより、機能性β−ラクタマ
ーゼ遺伝子（アンピシリン抵抗性を付与する）を有し、
更に大腸菌中で活性な複製開始点及び単一のHindIII制
限部位を含む2049塩基対のプラスミドが生じる。 この構築物をpTG1Hという。 TK遺伝子を有するVV DNAのHin−Ｊ断片は先に、pBR32
7由来のベクター中にクローン化されている（Drillien
とSpehner、1983年）。この4.6kbの断片をpTG1HのHindI
II部位に再クローン化した。アンピシリン抵抗性をコー
ドする遺伝子よりも遠位にTK遺伝子が位置するクローン
を選択した。 この構築物pTG1H−TKを以下の実験でベクターとして
用いた。 次の段階は、発現されるべき遺伝子をコードする配列
の発現を制御するのに用い得るVVプロモーターを単離す
るものであった。7500ドルトン（7.5K）の蛋白質をコー
ドする初期遺伝子のプロモーターが既に同じ目的のため
に成功裏に使用されている（Smithら、1983年）。それ
故、このセグメントの単離を試みた。 該7.5K遺伝子は、WR型のVVゲノムの最小のSalＩ断片
（Sal−Ｓ断片）の一つの上に位置している（Venkatasa
nら、1981年）。小さい断片の方が優先的にクローン化
されるので、SalＩ切断WR型のVVのDNAをプラスミドpBR3
22中に直接クローニングして得られるクローンの多くが
Sal−Ｓ断片を有している。この断片を、SalＩ消化及び
再結合によって、ベクターバクテリオフアージM13mp701
（Kienyら、1983年参照）に移す。これによりファージM
13TGSal−Ｓが得られる。 このクローンでは、7.5K遺伝子の開始ATGのすぐ近位
にScaＩ部位がある。7.5K遺伝子の下流には、ベクター
に由来する各単一のBamHI部位とEcoRI部位がある。BamH
I部位とScaＩ部位とを、BamHI消化で生じた末端を大腸
菌のクレノー断片を用いて埋めたのち、BglIIリンカー
５′−CAGATCTG−３′により融合する。このプロセスに
よりScaＩ部位が除去されるが、BamHI部位が再形成さ
れ、単一のEcoRI部位が下流へシフトする。同時に、下
流のSalＩ（AccI）部位が除去され、上流のSalＩ部位が
唯一のSalＩ部位となる。 この構築物をM13TG7.5Kと呼ぶ。 VV DNAのHin−Ｊ断片中には、約30塩基対離れたClaＩ
部位とEcoRI部位とがある（WeirとMoss、1983年）。M13
TG7.5K中に存在する7.5Kプロモーター断片をAccＩとEco
RIとにより切り出し、pTG1H−TKのClaＩ部位とEcoRI部
位との間にクローン化し、pTG1H−TK−P7.5Kを生ぜしめ
る。 この構築により、M13ベクターからの各単一のBamHI部
位及びEcoRI部位が7.5Kプロモーター配列のすぐ下流へ
移る。これら各単一のBamHI部位及びEcoRI部位を次の構
築に用いる。 バクテリオファージM13TG131（Kienyら、1983年）の
ポリリンカーセグメントをEcoRI及びBglIIを用いて切り
出し、プラスミドpTG1H−TK−P7.5KのEcoRI部位とBamHI
部位との間に挿入し、pTG7186−POLYを生ぜしめる。こ
の構築物にはP7.5の制御下の外来遺伝子のクローニング
に利用できる制限部位が10か所ある。 実施例２ env配列をもつプラスミドの構築env をコードする配列を得るために、プラスミドPJ19−
６及びPJ19−13中にクローン化された２種のプロウイル
スセグメントを先ず会合させる。 envmRNAが十分に翻訳されるよう、env遺伝子の推定さ
れる翻訳開始部位の周辺のヌクレオチド配列を、真核生
物遺伝子のコンセンサス配列にマッチするように装飾し
た。これは、5767位の近位でのオリゴヌクリレオチドを
用いた定方向特異的変異により達成された。 プラスミドPJ19−13及びPJ19−６は、それぞれヌクレ
オチド1258〜1698及び〜1698〜9173からなるLAVのプロ
ウイルスゲノムのHindIII断片を含有する。 PJ19−13のEcoRI−KpnＩ断片（env開始ATGを含む）を
ファージM13TG130に挿入し、オリゴヌクレオチド（配列
５′−CTCTCATTGTCACTGCAGTCTGCTCTTTC）を用いて定方
向特異的変異を行って、env翻訳開始コドン（5767位）
の上流にPstＩ部位を導入し、３位のＧをＡにより置換
した。次に変異断片をプラスミドpTG1−POLY（pTG1Hに
類似の2.1kbのミニプラスミドであるが、M13TG131のポ
リリンカーセグメントを含有する）のEcoRI部位とKpnＩ
部位との間に導入した。 PJ19−13由来のKpnＩ−HindIII断片を次の同じプラス
ミド中にクローニングし、（KpnＩとHindIIIとの間
に）、続いてPJ19−６のHindIII−XhoＩ断片のクローニ
ングを行って（HindIIIとSalＩとの間に）、２か所のPs
tＩ部位にはさまれた完全なenvコード配列を生じせしめ
た（プラスミドpTG1124）。 これら２か所のPstＩ制限部位の導入により、以後の
構築段階におけるenv遺伝子DNAの操作がより容易にな
る。上述の通り、ワクシニアウイルスでの異種蛋白質の
発現には、コード配列がワクシニアのプロモーター配列
と整列し、ワクシニアDNAの非必須（可欠）セグメント
中へ挿入されることを要する。両側に位置するこのDNA
は、二重相互組換えにより生体内でのワクシニアゲノム
との組換えを可能ならしめ、それによりコード配列及び
付随するプロモーターがワクシニアゲノム中へ移行す
る。 この目的で、上記PstＩ−PstＩ断片をpTG186−POLYの
PstＩ部位にクローニングした。これにより、pTG125と
呼ぶプラスミドを得た。 プラスミドpTG186−POLYは、プラスミドpTG188からPs
tＩ消化及びT4リガーゼによる再結合により生成され得
る。 プラスミドpTG188は、1985年６月20日に、フランス国
75015パリ市ドクトゥール ルー28のパスツール研究所
の国立微生物培養コレクションに次の番号で寄託されて
いる： E.coli 5KpTG 188＝No.I458 env遺伝子のコード配列及び随伴プロモーターのワク
シニアゲノムへの移入は次のようにして達成される。 実施例３ ワクシニアウイルスへのクローニングによるVV.TG.eL
AV9−１の生成 Smithら（1983年）が記載している方法は、VV TK遺伝
子中に挿入片を有するプラスミドと野生型ウイルスゲノ
ムとの間で生体内交換を行わせて、ウイルスがもつTK遺
伝子を不活性化することを基礎としている。TK+ウイル
スは、５−ブロモデオキシウリジン（5BUDR）の存在下
に細胞株（TK欠損）をプレーティングすることにより選
択できる（Mackettら、1982年）。チミジンキナーゼは5
BUDRを燐酸化してモノ燐酸エステルとする。これが次に
トリ燐酸エステルに転化される。この化合物はdTTPのア
ナログであり、DNA中へそれが組込まれると、ウイルス
の適正な発育が阻害される。しかし、TK+ウイルスはそ
のDNAを正常に複製し、やはりTK+の細胞株にて目に見え
るウイルスプラクを生じる。 ワクシニアウイルスは、感染細胞の核内でよりも細胞
室内で増殖する。このため、宿主DNAの複製及び転写機
構を利用することができず、ヴィリオン（ウイルス粒
子）がそのゲノム発現のための諸要素をもつことが必要
である。精製されたVV DNAは非感染性である。 組換え体の生成には、VVヴィリオンによる細胞の感染
とクローン化された対象DNAセグメントによりトランス
フェクションとを同時に行う必要がある。しかし、組換
え体の生成は、DNAによるトランスフェクションに対し
コンピテントな細胞中の小さな割合に限定される。その
ため、組換え体でない親ウイルスからなるバックグラウ
ンドを減じるための間接的「適合（congruence）」法を
採用することが必要であった。これは、生きた感染性ウ
イルスとして、39.5℃という非許容温度では増殖できな
い温度感受性（ts）ワクシニア変異株（DrillienとSpeh
ner、1983年）を用いて達成された。細胞をts変異株に
非許容条件下で感染させ、野生型ウイルスのDNAでトラ
ンスフェクトすると、トランスフェクションに対しコン
ピテントで、野生型ウイルスDNAとtsウイルスのゲノム
との間の組換えが起った細胞内でのみ、ウイルスの増殖
が起るであろう；他の細胞中では、それらが感染してい
ても、ウイルスは増殖しないであろう。pTG1125の如
き、ワクシニアのDNA断片を含有する組換えプラスミド
がトランスフェクション混合物中に適切な濃度で野生型
DNAと共に含まれていると、それをコンピテント（被感
染性）細胞中でのワクシニアDNAとの相同組換えに加わ
らせることも可能である。 ニワトリ胚線維芽細胞（CEF）の初代細胞の単層を33
℃でVV−コペンハーゲンts7（0.1pfu/細胞）に感染さ
せ、野生型VV−コペンハーゲンウイルスのDNA（50ng/10
6細胞）と組換えプラスミド（50ng/106細胞）との燐酸
カルシウム共沈物でトランスフェクトする。 tsウイルスの生育を許容しない温度（39.5℃）で２時
間インキュベーションを行ったのち、細胞を再び39.5℃
で48時間インキュベートする。ts++ウイルスの希釈液を
用いて、ヒト143B細胞の単層を37℃で再感染処理し、次
にそれら細胞を5BUDR（150μg/ml）の存在下にインキュ
ベートする。組換えプラスミドを受容したこれらの細胞
からTK+ウイルスのプラクが種々得られ、一方、プラス
ミドなしの対照培養は目に見えるプラクを示さない。TK
+ウイルスを次に5BUDR存在下に２回目の選択を行うこと
により、サブクローニングする。 ハイブリッドプラスミドpTG1125とVVゲノムとの間で
正しい二重相互組換えが行われると、挿入断片を有する
TK遺伝子とウイルスのTK遺伝子とが交換され、組換え体
がTK+となる。 種々のTK+組換えウイルスから精製したDNAをHindIII
で消化して、アガロースゲル電気泳動に付す。DNA断片
を、Southern（1975年）が記載している手法に従って、
ニトロセルロースフィルターに移す。次にフィルターを
32Pを用いたニックトランスレーション後のプラスミドp
TG1125とハイブリダイスさせる。フィルターを洗浄後、
フルオログラフィを行うと、ワクシニアウイルスがLAV
のenv遺伝子を組込んでおれば、オートラジオグラフ上
に3.85−、2.9−及び0.8−kbのバンドが見える。これら
組換え体の一つであるVV.TG.eLAV9−１を以下の実験用
に選択した。 実施例４ 組換えワクシニア−LAVウイルスから合成されたenv蛋
白質 ハイブリッドワクシニアウイルスからのLAVのenv遺伝
子の発現を証明するために、Ｇ−MEM培地＋10％ウシ胎
児血清中で培養した齧歯動物細胞BHK21を前期組換え体V
V.TG.eLAV9−１に感染させる。 新鮮な半コンフルエントの単層（106細胞）を0.2pfu/
細部で感染処理し、18時間インキュベートする。 ついで培地を除去し、10μg/mlの〔35S〕メチオニン
を加えた低メチオニン濃度の培地（106細胞に対し1ml）
を加える。細胞を37℃でインキュベートし、標識された
蛋白質を遠心分離によって集める。ベレット上澄みに分
離したのち、蛋白質をエイズ患者の血清と共にインキュ
ベートする。該血清と反応する蛋白質をプロテインＡ−
セファローズ樹脂に吸着させて回収し、SDSポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって広げ、オートラジオグラ
フィを行う（Latheら、1980年の手法による）。オート
ラジオグラフは、エイズ患者の血清が感染細胞抽出物中
の３種の蛋白質と特異的に結合することを示す（この結
果は、他の患者の血清を用いて得られるものと同一又は
類似である）。見掛けの分子量160、120及び41KDは、標
準env糖蛋白質調製物中及びLAVウイルス感染細胞の抽出
物中にエイズ患者の血清を用いて確認されたgp160、gp1
20及びgp41のバンドとの同等性を示唆する。LAVのenv遺
伝子のコード配列のみを有する組換えベクターから３種
の蛋白質が発現されるというこの観察は、一次翻訳産物
gp160の蛋白質分解性の切断によってgp120及びgp41が生
成するとする仮説を支持する。 envをコードする配列は約90KDの一次翻訳産物をもた
らす。一方、上記の方法で得られるenv前駆体は約160KD
という見掛け分子量をもつ。この差は、かなりの量のグ
ルコシル化のあることに帰される。グリコシル基を除去
するエンドグリコシダーゼＦで消化することにより、本
発明により得られた生成物と予想生成物との良好な相関
を証明することができた（第１図）。 実施例５ VV.TG.eLAV9−１ウイルス接種マウスでの抗env抗体の証
明 ２週令の雄性Balb/cマウスにVV.TG.eLAV9−１を１頭
当り５×107pfuの皮下注射により接種する。２週間後、
それらマウスに同用量でブースター注射を行い、ブース
ターから１、２及び４週間後に血液サンプルを採取す
る。それらの血清中にLAVウイルス及びワクシニアウイ
ルスの抗原決定基に対する抗体が存在しないか調べる。 接種した動物の全てが、ELISA試験でワクシニアウイ
ルスと反応しうる血清を与える。これに対し、LAVウイ
ルスに対するELISA試験での応答は弱く、再現性も低
い。試験の感度を向上させるべく、「ウェスタンブロッ
ティング」の手法を用いた。この方法は、LAVウイルス
の蛋白質と反応しうる抗体を、それら蛋白質を電気泳動
ゲル中でSDSにより変性し、ニトロセルロース膜へ移し
たのちに証明できるようにする。この実験では、使用し
たニトロセルロース膜は、Diagnostic−Pasteurが販売
しているLAV−BLOTのそれであり、それにはLAVウイルス
の蛋白質が既に結合されている。これらの膜を細片状に
切断し、各細片を接種マウスの血清（1/20希釈）と共に
インキュベートする。ペルオキシダーゼに結合させた第
二抗体（ヒツジ抗マウス）が、マウス抗体に結合したLA
Vウイルス蛋白質の可視化を可能とする。 いくつかの血清（12/27）が、envのgp160に相当する
分子量約160KDの蛋白質と特異的反応を呈する（第２
図）。いくつかの血清では、gp41蛋白質との反応も観察
される。少数のマウスの血清が、ウエスタンブロッティ
ングで、膜に結合させたLAVウイルスの未同定蛋白質に
相当するシグナルを生じることを注記しておくべきであ
ろう。 実施例６ pTG1128の構築 このプラスミドpTG1128は、トランスメンブレン領域
をコードする配列が変異されていて、アルギニンがイソ
ロイシンにより置換されるようになっている以外は、プ
ラスミド1125と同じである。この変異は、細胞膜中での
当該蛋白質の付着を改善するためのものである。 実施例２に記載したenvのトランスメンブレン領域を
含有するpTG1124のHindIII−BamHI断片を、HindIII−Ba
mHI消化後のファージM13TC131へ挿入する。これにより
ファージM13TG154が得られる。 次にこのファージM13TG154について、アルギニンをコ
ードするコドンをイソロイシンをコードするコドンによ
り置換するようデザインされた限局性変異誘発を行う。
この目的のため、次のオリゴヌクレオチドを用いる： ５′GGTTTAATAATAGTTTT3′ かくして、ファージM13TG155が得られ、その配列は次
のように修飾されている： かくして変異したBamHI−HindIII断片をM13 TG155か
らプラスミドpTG1124の相当する部位へ移すと、プラス
ミドpTG1127が得られ、このものは、アルギニンコドン
がイソロイシンコドンにより置換されている以外は上述
のものと同じenv遺伝子を再び形成する。 実施例１に記載した通りにして、pTG1127のPstＩ−Ps
tＩ断片をプラスミドpTG186−POLYのPstＩ部位中にクロ
ーン化して、プラスミドpTG1128を得る。 実施例７ プラスミドpTG1130の構築 このプラスミドでは、狂犬病糖蛋白質のトランスメン
ブレン領域をコードする配列が、env糖蛋白質の疎水性
蛋白質をコードする配列の最初と融合している。 狂犬病糖蛋白質のトランスメンブレン領域は、ファー
ジM13 TGRG151のBamHI−PstＩ断片に由来している。 この断片をファージM13TG154のBamHI部位とPstＩ部位
との間にクローン化する（上記実施例参照）。かくして
ファージM13TG156が得られる。 次に、M13TG156に対して限局性変異誘発を行って、en
v配列と狂犬病配列を、オリゴヌクレオチドを用い、
５′GCTGTGGTATATAAAATATGTATTACTGAGTG3′ループを形
成させることにより同調的に融合させる。 かくしてファージM13TG157を得る。 env遺伝子と融合させたばかりの狂犬病糖蛋白質のト
ランスメンブレン（tm）領域を次にプラスミドpTG1124
に移入する。 この目的のため、M13TG157のHindIII−BglII断片を、
HindIII−BamHI制限を行ったpTG1124中にクローニング
する（これによりBamHI部位及びBglII部位がこわされ
る）。 M13TG157のBglII部位は狂犬病gp断片： に由来する。 かくしてプラスミドpTG1126を得る。 上記と同様に、pTG1126のPstＩ−PstＩ断片をpTG186
−POLYのPstＩ部位にクローニングして、プラスミドpTG
1130を得る。 実施例８ pTG1131の構築 このプラスミドを構築する目的は、env遺伝子のシグ
ナル配列と狂犬病糖蛋白質のシグナル配列とを融合させ
ることである。 狂犬病糖蛋白質のシグナル配列をプラスミドpTG115PR
OからBglII−HindIII断片の形で取り出し、下記配列を
もつ一本鎖アダプターを用いてM13TG130のPstＩ−HindI
II部位にクローニングする： ５′GATCTGCA3′ かくしてファージM13 TG158を得る。 次に、envシグナルペプチドのM13TG158への移行を行
って、これを、狂犬病糖蛋白質のシグナルペプチドをコ
ードする遺伝子と融合させる。 この目的で、S1ヌクレアーゼで、ついでクレノー及び
KpnＩで処理したPstＩ断片を、HindIIIで切断し、クレ
ノー−KpnＩで処理したM13 TG158中にクローニングす
る： かくしてファージM13 TG159を得る。 M13 TG159のKpnＩ−PstＩブロックをM13TG131中へ移
し、プラスミドM13 TG160を得る。 M13 TG160に対して限局性変異誘発を行うと、env配列
と狂犬病糖蛋白質配列とを同調的に融合させうる（ルー
プを形成させて）。これは次のオリゴヌクレオチドを用
いて達成される： かくしてファージM13 TG161を得る。 13 TG161のPvuII−KpnＩ断片を次に、EcoRIで切断
し、クレノー−KpnＩで処理したpTG1126中へクローニン
グする（M13 TG161のPvuII部位は、ポリリンカーの上流
に位置する領域中のM13に由来する）。これによりプラ
スミドpTG1129を得る。 pTG1129のPstＩ−PstＩ断片の、PstＩ切断プラスミド
pTG186−POLY中へのクローニングにより、プラスミドpT
G1131を得る。 実施例９ プラスミドpTG1132の調製 pTG1128のPstＩ−PstＩ断片をM13 TG131のPstＩ部位
にクローニングすることにより、プラスミドM13 TG162
を得る。 次にオリゴヌクリオチド を用いて限界性変異誘発を行う。 これにより、停止コドンをgp120の最後に位置させる
ことができる。得られた配列は次の通りである： かくしてファージM13 TG168を得る。 M13 TG168のPstＩ断片をpTG186−POLYのPstＩ部位に
クローニングすることにより、プラスミドpTG1132を得
る。 実施例10 プラスミドpTG1133の構築 次のオリゴヌクレオチドを用いたM13 TG162の限局性
変異誘発により、gp120とgp40とを分離する潜在性切断
部位が破壊されたバクテリアファージを得る： 装飾された配列は次の通りである： かくしてファージM13 TG165を得る。 M13 TG165のPstＩ−PstＩ断片をpTG186−POLYのPstＩ
部位にクローニングすることにより、プラスミドpTG113
3を得る。 実施例11 プラスミドpTG1134の構築 pTG1131のPstＩ−PstＩ断片をM13 TG131のPstＩ部位
にクローニングすることにより、ファージM13 TG163を
得る。 上記と同じgp120の切断部位を破壊するために、M13 T
G163に対して限局性変異誘発を行う。この目的には、次
のオリゴヌクレオチドを用いる： これにより配列を次のように装飾できる： これらの条件下に、ファージM13 TG166を得る。 ファージM13 TG166のPstＩ−PstＩ断片をpTG186−POL
YのPstＩ部位に再クローニングすることにより、プラス
ミドpTG1134を得る。 実施例12 VV.TG.eLAV組換えウイルスにより合成された蛋白質の免
疫沈降 プラスミドpTG1125について上に記載した通り作業し
て、上記で調製した各種プラスミドに対応するハイブリ
ッドワクシニアベクターを得る。 これらのウイルスベクターをそれぞれ VV.TG.eLAV1128 VV.TG.eLAV1130 VV.TG.eLAV1131 VV.TG.eLAV1132 VV.TG.eLAV1133 VV.TG.eLAV1134. と名付ける。 上記のようにして得た蛋白質を免疫沈降により試験す
る（第３図）。 ウイルス９−１については、免疫沈降物群がgp160、g
p120及びgp41に相当する免疫沈降を示す。 ウイルス1128についても同様である。 ウイルス1130もgp160及びgp120を示す。 gp41に対応する蛋白質はそのＣ末端の装飾のため僅か
に低い分子量をもつ。 ウイルス1131は、ウイルス1130で得られるものと実質
的に同一のスペクトルを示す。 ウイルス1132は当然のことながらgp41に対応する蛋白
質を示さない。ペレット中に存在する105KDの蛋白質はg
p120のイソフォーム（グリコシル化の相違）である。 ウイルス1133に関しては、これは蛋白質160、120及び
41を明瞭に示すが、蛋白質120及び41に対応するバンド
は他のスペクトルの場合よりも弱い。 ウイルス1134についても同で、これの場合にも、41の
分子量は低いが、ウイルスVV.TG.1125（９−１）〜1131
と比較して切断が遅い速度で起っていることが明らかで
ある。 実施例13 プラスミドpTG1135の構築 VV.TG.eLAV1133及び1134について行った放出の速度論
的解析は、gp120とgp41との間の切断の速度は遅いが、
それでも切断は起ることを示す。env遺伝子のDNA配列を
調べると、第一の切断部位から８アミノ酸下流にもう一
つ潜在的切断部位（KRR）のあることが分る。それ故、g
p160のみを発現する組換えワクシニアウイルスを得るに
はこの第二の部位を変異させることが重要であろう。 次のヌクレオチドを用いたM13 TG166の限局性変異誘
発により、第二の切断部位を装飾したファージを得る： 装飾された配列は次の通りである： 得られたファージ（M13 TG181）のPstＩ−PstＩ断面
をpTG186−POLYのPstＩ部位にクローニングして、プラ
スミドpTG135を生ぜしめる。 実施例14 プラスミドpTG1139の構築 組換えワクシニアベクターVV.TG.eLAV1135により合成
されるenv遺伝子のＣ末端部は狂犬病糖蛋白質由来の配
列である。従って、このＣ末端部分がLAVウイルスのenv
遺伝子のＣ末端部分によって置換された他の組換え体を
もつことも有用と思われる。 この目的で、ファージM13 TG166について行った（実
施例13参照）と同じ変異誘発をファージM13TG165に対し
て行って、ファージM13 TG184を生ぜしめる。 M13TG184のPst−PstＩ断片を次にプラスミドpTG186−
POLY中にクローニングして、プラスミドpTG1139を生ぜ
しめる。 実施例15 プラスミドpTG1136の構築 gp120のみを発現する組換えワクシニアウイルスをも
つことも望ましいであろう。このgp120は、VV.TG.eLAV1
132ウイルスで得たものと違い、Ｃ末端係留（アンカレ
ッジ）領域を備えているであろう。 この目的で、次のヌクレオチドを用いた限局性変異誘
発により、ファージM13 TG181中のgp40に対応する配列
を除去する： このオリゴヌクレオチドは、gp120の配列（装飾され
た切断部位を２か所もつ）と狂犬病糖蛋白質のトランス
メンブレン領域の配列とを同調的に融合させることを可
能にする。かくしてファージM13TG182を得る。ファージM13TG182の
PstＩ−PstＩ断片を次にpTG186−POLYのPstＩ部位に挿
入して、プラスミドpTG1136を生ぜしめる。 実施例16 プラスミドpTG1137の構築 gp40のＮ末端部に位置する疎水性領域の役割は殆ど知
られていない。env蛋白質のこの領域は、シンシチウム
形成誘発能の要因となっているのかもしれない。 従って、この配列を有しないgp160を生成させること
も有利であると思われる。 この目的のため、ファージM13TG181中のこの疎水性ペ
プチドをコードしている部分の上流及び下流の配列を、
次のオリゴヌクレオチドを用いて融合させる： これは、下記融合を行うことによってファージM13TG183
を得ることを可能ならしめる： M13TG183のPstI−PstI断片をpTG186−POLYのPstI部位
に再クローニングして、プラスミドpTG1137を生ぜしめ
る。 実施例17 gp160又はgp120を発現する組換えウイルスに加えて、
gp40のみを発現する組換えワクシニアウイルスを生ぜし
めることは有用であろう。 この目的で、シグナルペプチドをコードする配列を、
ファージM13TG163上でgp40をコードする配列と、次のヌ
クレオチドを用いて融合させる： これは、次の融合を含むファージM13TG180の生成を可能
ならしめる： M13TG180のPstＩ−PstＩ断片をpTG186−POLYのPstＩ
部位に挿入して、プラスミドpTG1138を得る。 実施例18 プラスミドpTG1162の構築 gp160の場合（プラスミドpTG1139）の場合と同様に、
係留領域及び細胞質内領域が対応する狂犬病糖蛋白質の
配列ではなくLAVウイルスのenv遺伝子の配列であるgp40
発現組換えウイルスをもつことも重要であろう。 これを得るべく、M13TG180のHindIII−BglＩ断片をM1
3TG165のHindIII−BglＩ断片により置換して、ファージ
M13TG190を生ぜしめる。 ファージM13TG190のPstＩ−PstＩ断片をプラスミドpT
G186−POLYのPstＩ部位にクローニングすることによ
り、プラスミドpTG1162を得る。 実施例19 プラスミドpTG1163の構築 切断されずに培地中へ分泌されるgp160を合成する組
換えワクシニアウイルスを得ることも重要と思われる。
実際には、この蛋白質は、死菌ワクチンとして、アジュ
バントと組合せて又はリポソームやISCOMS〔Moreinら、
Natire（1984）308、5958、p457−60〕中に挿入して使
用することができよう。 この目的で、細胞質外領域及び細胞質内領域をコード
する配列がバクテリオファージM13TG184中で同調的に融
合しているバクテリオファージM13TG194を次のオリゴヌ
クレオチドを用いて構築する： M13TG194のPstＩ−PstＩ断片を次にpTG186−POLYのPs
tＩ部位にクローニングして、pTG1163を得る。 かくして得た組換え蛋白質、特に非切断性gp160は、
該ウイルスと接触した患者の血液中に存在する潜在的抗
体を検出するための診断キットに利用できる。これらの
試験は、当業者によく知られた方法、例えばELISA、RIP
A又は「ウエスタンブロッティング」（免疫インプリン
ティング）により実施できる。 これらの蛋白質は、サンプル中のウイルスの存在を検
出するようでデザインされたモノクローナル抗体及びハ
イブリドーマの生産のためにも使用できる。 用いた種々のプラスミド及びM13ファージは、とりわ
け下記特許出願等に、記載されている： M13 TG131:Kienyら、1983年 M13 TGRG151:WO83/04052 pTG155PRO:FR84 06499 M13TG130:Kienyら、1983年 下記プラスミドは、1984年11月16日にパスツール研究
所の国立微生物培養コレクション（CNCM）に寄託されて
おり、特許明細書GB−Ａ−84/29,099中に記載されてい
る。 参考資料 1.ドリリアン，アール．（Drillien,R.），スペーナ
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フロントページの続き
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ト リュ デュ シャン デュ フォ
６
(72)発明者 ウェイン‐ホブソン シモン
フランス国 Ｆ‐78180 モンティニ
ル ブルトンヌー リュ ジャン ド
ラ フォンテーヌ ３
(72)発明者 ジラール マルク
フランス国 Ｆ‐75015 パリ リュ
セザール フランク ６
(72)発明者 モンタニエ リュク
フランス国 Ｆ‐92350 ル プレシ
ス‐ロビンソン リュ ド マラブリ
21
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ｐ．193
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．天然のgp160糖蛋白質の配列REKRのプロテアーゼに
よる切断部位を含まない、エイズ原因ウィルスのエンヴ
ェロープの非切断性gp160糖蛋白質。 ２．天然のgp160糖蛋白質の配列REKR及びKRRのプロテア
ーゼによる切断部位を含まない、請求の範囲第１項の非
切断性gp160糖蛋白質。 ３．REKR配列が、NEHQ配列で置換されている請求の範囲
第１項又は第２項の非切断性gp160糖蛋白質。 ４．天然のgp160のREKR及びKRR配列が、NEHQ及びQNH配
列でそれぞれ置換されている請求の範囲第１項又は第２
項の非切断性gp160糖蛋白質。 ５．天然のgp160のトランスメンブレンの係留領域を含
まない請求の範囲第１項〜第４項のいずれかの糖蛋白
質。 ６．狂犬病ウィルスのトランスメンブレン領域を含む請
求の範囲第５項の糖蛋白質。 ７．gp160のトランスメンブレン領域に相当するＣ末端
の疎水性のペプチドが、修飾されてアルギニンがイソロ
イシンに置換されている請求の範囲第５項の糖蛋白質。 ８．全くトランスメンブレン係留領域を含有していない
請求の範囲第５項の糖蛋白質。 ９．天然のgp160のＣ末端の疎水性ペプチドが削除され
ている請求の範囲第３項〜第６項及び第８項のいずれか
の糖蛋白質。 １０．少なくとも ・ウィルスゲノムの一部、 ・エイズ原因ウィルスのエンヴェロープの糖蛋白質gp16
0の前駆体のシグナル配列又は異種ウィルスからのシグ
ナル配列をコードする配列、 ・エイズ原因ウィルスのエンヴェロープの糖蛋白質gp16
0をコードする遺伝子配列であって、配列REKRのプロテ
アーゼによる切断部位を含まない該gp160をコードする
遺伝子及び ・細胞中での該糖蛋白質の発現をもたらす諸要素 を含有するウィルスベクターに感染した又は該ウィルス
ベクターに対応する組換えDNAを含有する哺乳動物細胞
を培養し、産生される糖蛋白質を回収する、エイズ原因
ウィルスのエンヴェロープ糖蛋白質の製造方法。 １１．gp160の遺伝子が、配列REKR及びKRRのプロテアー
ゼによる切断部位を含まないgp160をコードする請求の
範囲第10項の製造方法。 １２．REKR配列が、NEHQ配列で置換されている請求の範
囲第10項の製造方法。 １３．REKR及びKRR配列が、NEHQ及びQNH配列でそれぞれ
置換されている請求の範囲第11項の製造方法。 １４．ウィルスゲノムの一部がポックスウィルスのゲノ
ムの一部である請求の範囲第10項〜第13項のいずれかの
製造方法。 １５．ポックスウィルスがワクシニアウィルスである請
求の範囲第14項の製造方法。 １６．該ウィルスベクターが、天然のgp160のトランス
メンブレン領域をコードする配列を含まない請求の範囲
第10項から第15項のいずれかの製造方法。 １７．天然のgp160のトランスメンブレン（tm）領域に
相当するＣ末端の疎水性のペプチドをコードする配列
が、変更されてArgコドンがIleコドンにより置換されて
いる請求の範囲第10項〜第16項のいずれかの製造方法。 １８．該ウィルスベクターが、異種ウィルス、特に狂犬
病ウィルスからのトランスメンブレン領域をコードする
配列を含む請求の範囲第16項の製造方法。 １９．該ウィルスベクターが、トランスメンブレンの係
留領域をコードする配列を含まない請求の範囲第16項の
製造方法。 ２０．gp160をコードするDNA配列が、ポックスウィルス
遺伝子のプロモーターの依存下にある請求の範囲第10項
〜第19項のいずれかの製造方法。 ２１．プロモーターが、ワクシニアウィルスの遺伝子の
プロモーターである請求の範囲第20項の製造方法。 ２２．gp160をコードするDNA配列が、ワクシニアウィル
スの7.5K蛋白質遺伝子のプロモーターの制御下にある請
求の範囲第21項の製造方法。 ２３．gp160をコードする配列が、ワクシニアウィルス
のTK遺伝子中にクローン化されている請求の範囲第20項
〜第22項のいずれかの製造方法。 ２４．gp160のＣ末端疎水性ペプチドが削除されている
請求の範囲第10項〜第16項及び第18項〜第23項のいずれ
かの製造方法。 ２５．少なくとも ・ウィルスゲノムの一部、 ・エイズ原因ウィルスのエンヴェロープの糖蛋白質gp16
0の前駆体のシグナル配列又は異種ウィルスからのシグ
ナル配列をコードする配列、 ・エイズ原因ウィルスのエンヴェロープの糖蛋白質gp16
0をコードする遺伝子配列であって、配列REKRのプロテ
アーゼによる切断部位を含まない該gp160をコードする
遺伝子及び ・細胞中での該糖蛋白質の発現をもたらす諸要素 を含有するウィルスベクターに感染した又は該ウィルス
ベクターに対応する組換えDNAを含有する哺乳動物細胞
を培養し、産生される糖蛋白質を回収する、エイズ原因
ウィルスのエンヴェロープ糖蛋白質の製造方法によって
得られる請求の範囲第１項に記載のエイズ原因ウィルス
の非切断性gp160糖蛋白質。 ２６．gp160の遺伝子が、配列REKR及びKRRのプロテアー
ゼによる切断部位を含まないgp160をコードする請求の
範囲第25項の糖蛋白質。 ２７．REKR配列が、NEHQ配列で置換されている請求の範
囲第25項の糖蛋白質。 ２８．REKR及びKRR配列が、NEHQ及びQNH配列でそれぞれ
置換されている請求の範囲第26項の糖蛋白質。 ２９．ウィルスゲノムの一部がポックスウィルスのゲノ
ムの一部である請求の範囲第25項〜第28項のいずれかの
糖蛋白質。 ３０．ポックスウィルスがワクシニアウィルスである請
求の範囲第29項の糖蛋白質。 ３１．該ウィルスベクターが、天然のgp160のトランス
メンブレン領域をコードする配列を含まない請求の範囲
第25項から第30項のいずれかの糖蛋白質。 ３２．天然のgp160のトランスメンブレン（tm）領域に
相当するＣ末端の疎水性のペプチドをコードする配列
が、変異されてArgコドンがIleコドンにより置換されて
いる請求の範囲第25項〜第31項のいずれかの糖蛋白質。 ３３．該ウィルスベクターが、異種ウィルス、特に狂犬
病ウィルスからのトランスメンブレン領域をコードする
配列を含む請求の範囲第31項の糖蛋白質。 ３４．該ウィルスベクターが、トランスメンブレンの係
留領域をコードする配列を含まない請求の範囲第31項の
糖蛋白質。 ３５．gp160をコードするDNA配列が、ポックスウィルス
遺伝子のプロモーターの依存下にある請求の範囲第25項
〜第34項のいずれかの糖蛋白質。 ３６．プロモーターが、ワクシニアウィルスの遺伝子の
プロモーターである請求の範囲第35項の糖蛋白質。 ３７．gp160をコードするDNA配列が、ワクシニアウィル
スの7.5K蛋白質遺伝子のプロモーターの制御下にある請
求の範囲第36項の糖蛋白質。 ３８．gp160をコードする配列が、ワクシニアウィルス
のTK遺伝子中にクローン化されている請求の範囲第35項
〜第37項のいずれかの糖蛋白質。 ３９．gp160のＣ末端疎水性ペプチドが削除されている
請求の範囲第25項〜第31項及び第33項〜第38項のいずれ
かの糖蛋白質。
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