JP5000481B2 - 抗原と結合したクラスiimhcリガンドを含む結合産物、その使用方法およびそれを備える免疫原性組成物 - Google Patents
抗原と結合したクラスiimhcリガンドを含む結合産物、その使用方法およびそれを備える免疫原性組成物 Download PDFInfo
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Description
第1の実施形態によれば、本発明の結合産物は、両クラスのタンパク質が水素結合によって結合している事実によって特徴付けられる。
リンカーまたは連結分子の例としては、ポリペプチドまたはアミノ酸、多糖または単糖、ポリヌクレオチドまたは核酸、アルキル、シクロ−アルキルまたはアリル基が挙げられる。
[(Ag)n(X)m(Y)p]q
上式で、Agは第1クラスのタンパク質の抗原を表し、nは結合産物中の抗原分子の数を表し、nは1〜5の整数であり、
Yは第2クラスのタンパク質のクラスIIMHCリガンドを表し、pは結合産物中のクラスIIMHCリガンドの数を表し、pは1〜2の整数であり、
XはAgとYとの間の結合を表し、mは結合産物中のAgとYとの間の結合の数を表し、mは1〜5の整数であり、
qは1〜5の整数である。
各クラスのタンパク質は、抗原のモノマーまたはポリマーと共有結合によって結合したポリマー、例えばクラスIIMHCリガンドの2量体の形で互いに分類されることができ、
抗原および/またはクラスIIMHCリガンドが改変され、これらが反復単位のポリマーを形成することができる。
クラスIIMHC分子を発現するEBVによって形質転換されたB系を使用する、間接的免疫蛍光細胞標識。陽性対照が常に使用される(9.49またはI3で表されるパン−クラスII抗体、次にGAM−FITC)。マーカーの飽和度は、GAH−FITC(第2層)で染色されたLAG−3Ig(第1層)の30μg/mLまたは10μg/mLに達する。3または1μg/mLのLAG−3Igでシグナルが常に検出される。これらの結果は、融合タンパク質LAG−3Ig/Agを用いて得られるはずである。
1100rpmでの5分間の遠心分離、
(37℃での平衡状態後の)PBS1X中での100万個/mLへの細胞の希釈、
300μLの細胞懸濁液をスライドに施し、37℃において30分間、ポリリシンにより被覆されたスライドに細胞を接着させる工程、
流体の除去、および37℃において30分間、500μLのPBS1X/0.1%NaN3/3%ミルクを用いた飽和、
氷上(4℃)にスライドを置き、10〜15分間冷却する工程、
流体の除去、および冷PBS1Xを用いて軽く洗浄する工程、
PBS1X/0.1%NaN3/3%冷ミルクに希釈された400μLの抗体(または30μg/mLでのhLAG−3Igタンパク質)の施し、および30分間、4℃でのインキュベート、
流体の除去、および冷PBS1Xを用いて軽く洗浄する工程、
各他の標識(LAG−3Ig標識に関するGAH−FITC)に関する2つの最後の工程の反復、
(内在化を可能にするためにインキュベータ内で)15〜20分間、37℃でスライドを放置する工程、
400μLの冷PBH1×/2%冷PFAを施し、4℃で15分間細胞を固定する工程、
流体の除去、および冷PBS1×で軽く洗浄する工程、
20〜30μLのFluoromount Gを加え、カバー・スライドを注意深く置き、4℃に置く前に1〜2時間の間、室温において乾燥状態で放置する工程;
共焦点顕微鏡によるスライドの分析。
本発明はさらに、前に定義された結合産物などの結合産物の薬剤としての使用に関する。
Elispotを使用した、これらの高いCD4およびCD8応答(健全なHPV−16−およびHIV−ボランティアでの非投薬T細胞の初回抗原刺激、または健全なHPV−16+およびHIV+ボランティアでの追加抗原刺激による)は、E7またはgag−nef抗原を単独で加えるとき、およびLAG−3IgとE7またはLAG−3Igとgag−nefの混合物を低レベルで加えるときは得られない。
哺乳動物細胞による異なる組換えタンパク質の発現および分泌を可能にするベクターを構築した。
1.1.1)クローニング・ベクター
CHO−K1細胞中で組換えタンパク質を発現させるために、2種の発現ベクターを選択した。
開始プラスミドの確認および増幅:
hLAG−3(D1D4)IgおよびhLAG−3(D1D2)Igを、それぞれpCDNA3−hLAG3(D1D4)−IgG1およびpCDM7−hLAG−3(D1D2)IgG1ベクターから増幅させた。
これらのプラスミドは、−80℃でグリセロール中に保存された形質転換細菌のストック溶液から再増幅させた。異なる制限酵素による消化によって、プラスミドの性質を確認することが可能であった。
hLAG3(D1D4)−IgG1およびhLAG−3(D1D2)IgG1の配列は、プロジェクトの開始時に依然として不完全に知られていたことから、pCDNA3.1+中でのサブ・クローニング後に、それらの配列を完全に決定した。
1.2)hLAG−3IgとHPV−16E7の融合
非発癌性である突然変異形のE7を、前述した発現ベクター中のhLAG−3Ig(D1D4またはD1D2)のCまたはN末端でクローニングした。LAG−3を含まないE7およびIgG1も、対照として融合させた。
HPV−16E7を二重突然変異させて、E7の発癌活性を担う細胞タンパク質Rbとの2量体化を防いだ(リーら(Lee at al)Nature 1998 vol 391 p859;ブルグら(Burg et al)Vaccine 2001 vol 19 p3652;ボウルシュネルら(Boursnell et al)Vaccine vol.14p.1485を参照)。
E7にストラタジーン社(Stratagen)からのQuickchangeキットを使用して部位特定突然変異誘発を施して、アミノ酸C24をGで置換し、E26をGで置換した。所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドの相補対を用いて、PCRによりプラスミドpEF6−E7を増幅させた。
CTGATCTCTACGGTTATGGGCAATTAAATGACAGC(配列番号1)
オリゴ2、E7突然変異3’:
GCTGTCATTTAATTGCCCATAACCGTAGAGATCAG(配列番号2)
PCR産物をその後、メチル化部位に対してのみ活性がある酵素Dpn1と共にインキュベートし、したがってPCR産物上の鋳型DNAを消化した。得られた産物をその後、XL1−Blue細菌に形質転換した。
E7/Rb−(本願では以下において、簡潔化のためにE7と表す)およびhLAG−3Ig挿入体を、オリゴヌクレオチドを用いてPCRによって増幅させ、その両端に制限部位を加えることが可能であった。
クローニング戦略は図2中に要約する。
以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、pEF6_E7/rb−からE7を増幅させた。
CCGCTCGAGATGCATGGAGATACACCTAC(配列番号3)
E7のXho1部位およびATGを含む。
GCTCTAGATTATGGTTTCTGAGACAG(配列番号4)
停止コドンおよびXbaI部位を有するE7の3’領域を含む。
LAG−3(D1D2)IgG1およびLAG−3(D1D4)−IgG1は、以下のオリゴヌクレオチド対を使用して、それぞれpCDM7−LAG−3(D1D2)IgG1およびpCDN3−LAG−3(D1D4)−IgG1から増幅させた。
GGAATTCGCCCAGACCATAGGAGAGATG(配列番号5)
EcoRI部位、hLAG−3のATG、および分泌シグナル・ペプチドを含む、
オリゴ8(IgG13’−XhoI):
CCGCTCGAGTTTACCCGGGGACAGGGAG(配列番号6)
停止コドンを含まないIgG1の3’領域を含む。
pCDNA3.1+へのhLAG−3(D1D4)Ig−E7の挿入を2工程で行った。最初に、hLAG−3(D1D4)Igを、EcoRIおよびXhoIで消化したpCDNA3.1+に連結させた。クローニング中間体pCDNA−hLAG−3(D1D4)Igはこのようにして得た。その後、E7を、XhoIおよびXbaIで事前に消化したpCDNA−hLAG−3(D1D4)Igに挿入した。
pSECtag−hygroAへのE7−hLAG−3Igのクローニング:
以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、pEF6−E7/Rb−からE7を増幅させた。
GGCGCGCCATGCATGGAGATACACCTAC(配列番号7)
E7のAscI部位およびATGを含む、
オリゴ15(E73’−Kpn1):
GGGGTACCTGGTTTCTGAGAACAGATG(配列番号8)
停止コドンを含まないE7の3’領域およびKpnI部位を含む。
LAG−3(D1D2)IgG1およびLAG3(D1D4)−Igを、以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、それぞれpCDM7−LAG−(D1D2)−IgG1およびpCDNA3−LAG−3(D1D4)−IgG1から増幅させた。
GGGGTACCCTCCAGCCAGGGGCTGAG(配列番号9)
シグナル・ペプチドを含まないドメイン1のKpnI部位および5’領域を含む、
オリゴ17(IgGI3’−停止Xhol):
CCGCTCGAGTCATTTACCCGGGGACAG(配列番号10)
停止コドンおよびXhoI部位を有するIgG1の3’領域を含む。
以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、(E7の3’端にpSECにクローニングするため、Lag3を含まない対照として使用するため)pCDNA−LAG−3(D1D4)−IgG1からIgGIを増幅させた。
GGGGTACCCGAGGGTGAGYACTAAGC(配列番号11)
IgG1のAイントロンのKpnI部位および5’領域を含む、
オリゴ19(IgGI3’−stopXhoI):
CCGCTCGAGTCATTTACCCGGGGACAG(配列番号12)
停止コドンおよびXhoI部位を有するIgGIの3’領域を含む。
pSECtag−hygroAへのE7−hLAG−3Ig融合産物の挿入を2工程で行った。
hLAG−3(D1D4)Ig、hLAG−3(D1D2)IgおよびIgGIのPCR産物を、KpnIおよびXhoIで事前に消化したpSEC−E7にその後連結させた。
Dα−LAG3−D1D4−ΔEK−hIgG1融合体へのE7のクローニング:
指定ベクターは、ヘノジェン社(Henogen)からのベクター、Dα−LAG3−DID4−ΔEK−hIgG1融合体である。このベクター中では、LAG−3(D1D4)Igのコード配列が2つのXhoI制限部位の間に挿入されている。前述のように、このベクターはLAG−3(D1D4)Igのコード配列を含み、その中でイントロンA(Igヒンジ領域由来の位置5’のイントロン)は、リンカー配列(DDDDKGSGSGをコードする、配列番号17)によって置換されていた。イントロンAを含まないLAG−3(D1D4)Igのこのコード配列をLAG−3(D1D4)Ig/と表し、さらに同じ表記がこれらの構築体によってコードされるタンパク質に関して保たれると思われる。
Dα−LAG3−D1D4−ΔEK−hIgG1融合体へのE7のクローニングを2工程で行った。
Dα−LAG3−D1D4−ΔEK−hIgG1ベクターをXhoIによって切断し、その粘着末端を酵素T4ポリメラーゼによって平滑状態にした。XhoI平滑末端/XhoI平滑末端挿入体を含まないDαベクターに対応する断片を、最終指定ベクターと同様に保った。XhoI平滑末端/XhoI平滑末端挿入体を、Igをコードする配列のCイントロンのレベルで酵素BsrGIを用いて消化し、停止コドンを含むIgをコードする配列の最後の300塩基対を除去した(LAG−3(D1D4)Ig/XhoI平滑末端/BsrGI挿入体)。
得られたクローンの制限分析の後、pCDNA3−LAG−3(D1D4)Ig/E7を含むクローンを選択した。
pCDNA3中に含まれたLAG−3(D1D4)Ig/E7挿入体を酵素PmeIによって切断し(pCNDA3、平滑末端のマルチ・クローニングサイト周囲の2PmeI部位)、事前にXhoI平滑末端/XhoI平滑末端を切断することによって調製して脱リン酸化させた挿入体を含まないDαに連結させた。
Dα−LAG−3(D1D4)Ig/E7クローンの1つのDNAをDH5α系統に再度形質転換し、maxiprep Endofree(キアゲン社(Qiagen))によって調製し、CHO−K1細胞への一過性のトランスフェクションに使用して、プラスミドの翻訳産物を確認した。元のDα−LAG3−D1D4−ΔEK−hIgG1融合体およびpCDNA3−LAG−3(D1D4)Igベクターを陽性対照として使用し、XhoI、次に連結によってそこから挿入体を除去したDα−ベクターを陰性対照として使用した。トランスフェクション後24時間で、特異的ELISAによって上清中のLAG−3を定量した。平行して、上清および細胞溶解物中に存在する組換えタンパク質をA−セファロース・タンパク質(ファルマシア社(Pharmacia))により沈殿させ、抗LAG3ウエスタン・ブロットにより分析して、それらの大きさを評価した。見かけの分子量は予想された分子量であった。
1.3)hLAG−3IgとHIV−1gag−nefとの間の融合
このHIV−1抗原を、C末端またはN末端のいずれかにおいてhLAG−3Ig(D1D4またはD1D2)と結合させ、前述した発現ベクターにクローニングした。この抗原とLAG−3を含まないIgG1とも、対照として融合させた(図4)。
1.3.1)使用したGag−nef配列
gagp17、gagp24およびnefキメラ・タンパク質の配列を、ヨーロッパの患者(B系統)において検出される多大な可能性を有すると定義した。
B系統の祖先配列(進化系統樹に基づいて実施した、現在のB群のウイルスが由来する理論上の配列)。
LAI系統の配列(ヨーロッパで最初の単離体)。
クローニング戦略を図4中に要約する。
pCR4topo−gagnefからXhoIとXbaIとの間のpCDNA3.1−hLAG−3(D1D4)IgおよびpCDNA3.1−hLAG−3(D1D2)IgベクターにGag−nefをサブ・クローニングした。
このクローニングを3工程で行った。
*第1工程:pCR4topo−gagnefからHind3とNot1との間のpSECtag−hygroBへのgag−nefのサブ・クローニング。pSEC−gagnefクローニング中間体をこのようにして得た。
CCGCTCGAGTCCAGCCAGGGGCTGAG(配列番号13)
シグナル・ペプチドを含まないドメイン1のXhoI部位および5’領域を含む。
CCGCTCGAGTCATTTACCCGGGGACAG(配列番号14)
停止コドンおよびXbaI部位を有するIgGIの3’領域を含む。
オリゴ11(IgG15’XhoI):
CCGCTCGAGCGAGGGTGAGTACTAAGC(配列番号15)
IgGIのAイントロンのXhoI部位および5’領域を含む。
CCGCTCGAGTCATTTACCCGGGGACAG(配列番号16)
停止コドンおよびXbaI部位を有するIgGIの3’領域を含む。
*第3工程:pSEC−gagnefへのhLAG−3(D1D4)IgおよびhLAG−3(D1D2)Ifのクローニング。
Dα−LAG3−D1D4−ΔEK−hIgG1融合体へのgagnefのクローニング:
指定ベクターは、LAG−3(D1D4)Ig、Dα−LAG3−D1D4−ΔEK−hIgG1融合体を生成するためにヘノジェン社(Henogen)によって使用されているベクターである。
Dα−LAG3−D1D4−ΔEK−hIgG1融合体へのgagnefのクローニングを2工程で行った。
Dα−LAG3−D1D4−ΔEK−hIgG1ベクターをXhoIによって切断し、その粘着末端は酵素T4ポリメラーゼによって平滑状態にした。XhoI平滑末端/XhoI平滑末端挿入体を含まないDαベクターに対応する断片を、最終指定ベクターと同様に保った。XhoI平滑末端/XhoI平滑末端挿入体を、BsrGIを用いて消化して、Igのコード配列のCイントロンを切断し、停止コドンを含むIgコードする配列の最後の300塩基対を除去した(LAG−3(D1D4)Ig/XhoI平滑末端/BsrGI挿入体)。
第2工程では、LAG−3(D1D4)Ig/gagnefをDαにクローニングした。
Dα−LAG−3(D1D4)Ig/gagnefクローンの1つのDNAをDH5α系統に再度形質転換し、maxiprep Endofree(キアゲン社(Qiagen))を使用して調製し、CHO−K1細胞への一過性のトランスフェクションに使用してプラスミドの翻訳産物を調べた。元のDα−LAG3−D1D4−ΔEK−hIgG1融合体およびpCDNA3−LAG−3(D1D4)Igベクターを陽性対照として使用し、XhoI次に再連結を使用してその挿入体を除去したDα−ベクターを陰性対照として使用した。トランスフェクション後24時間で、特異的ELISAを使用してLAG−3の上清を分析した。平行して、上清および細胞溶解物中に存在する組換えタンパク質をA−セファロース・タンパク質(ファルマシア社(Pharmacia))により沈殿させ、抗LAG3ウエスタン・ブロットを用いて分析して、それらの大きさを評価した。見かけの分子量は予想された分子量であった。
2)融合タンパク質を発現する安定したCHO細胞系の樹立
2.1)pCDNA3およびpSECベクター由来の融合タンパク質を発現する安定した系の樹立。
2.1.1)クローンのトランスフェクション法および単離
2.1.1.1)プラスミド消化
当該のタンパク質を発現する安定したトランスフェクタントを得る機会を最大にするために、トランスフェクション前に発現ベクターを線状にした。選択した制限酵素は、位置1でpCDNAおよびpSECベクターを消化するが、挿入体hLAG−3Ig、gagnefまたはE7のいずれも消化しないBg12であった。消化は10μgのベクターおよび30Uの酵素を用いて行い、DNAをその後沈殿させ、20μLのH2O UP中に採取した。
8〜14の幾つかの工程を有するトランスフェクションを、いずれもCHO−K1細胞(ECCAC Ref.No.85081005)において個別に3〜4回で行った。
トランスフェクションの24時間後、選択用抗生物質を含む培地の存在下において、細胞をトリプシンで溶解させ、150mmの丸皿に接種した。選択用抗生物質はpCDNAベクター用に0.5mg/mLのG418、およびpSECベクター用に0.4mg/mLのヒグロマイシンBである。単離した細胞クローンが出現するまで(1〜2週間)、培地を2〜3日毎に交換した。
クローンが生成したトランスフェクションの日付およびクローンが含むプラスミドの確認を可能にするコードに従い、クローンに名称をつけた。
A:pCDNA
B:pCDNA−hLAG−3(D1D4)Ig
C:pCDNA−hLAG−3(D1D2)Ig
D:pCDNA−hLAG−3(D1D4)Ig−E7
E:pCDNA−hLAG−3(D1D2)Ig−E7
F:pSEC
G:pSEC−E7−hLAG−3(D1D4)Ig
H:pSEC−E7−hLAG−3(D1D2)Ig
I:pSEC−E7−IgG1
J:pCDNA−hLAG−3(D1D4)Ig−gagnef
K:pCDNA−hLAG−3(D1D2)Ig−gagnef
L:pSEC−gagnef−hLAG−3(D1D4)Ig
M:pSEC−gagnef−hLAG−3(D1D2)Ig
N:pSEC−gagnef−IgG1
2.1.2)最大hLAG−3Ig−E7組換えタンパク質生成クローンの選択
トランスフェクトした最初の一連のプラスミドは、E7を含まない陽性対照としてのpCDNA−LAG−3(D1D4)IgおよびpCDNA−LAG−3(D1D2)Igに加えて、pCDNA−LAG−3(D1D4)−Ig−E7、pCDNA−LAG−3(D1D2)Ig−E7であった。
細胞のトランスフェクション効率を、トランスフェクション後24時間での抗LAG3抗体(17B4)を用いた細胞内標識の後に、FACSによって最初に評価した。一過性トランスフェクション効率は、プラスミドpCDNA−hLAG−3(D1D4)Ig、pCDNA−hLAG−3(D1D2)IgおよびpCDNA−hLAG−3(D1D2)IgE7(陽性細胞の40%および50%の間)に関しては良かったが、pCDNA−hLAG−3(D1D4)−Ig−E7に関してはそれより低かったことが示された。
この一連のトランスフェクションを4回繰り返した(2003年1月7日、2003年1月14日、2003年1月21日および2003年3月27日)。
それぞれのトランスフェクション系の最良クローンを増幅させ、クローン当たり2つのアンプルを凍結させた。これらのクローンの上清をその後ELISAによって比較して、最大生成クローンのみを保存した。
pCDNAに対しては:7−1−A1、14−1−A2、21−1−A2
pCDNA−hLAG−3(D1D4)Igに対しては:7−1−B1、7−1−B3、7−1−B4、14−1−B8、14−1−B14、21−1−B11、27−6−B6
pCDNA−hLAG−3(D1D2)Igに対しては:7−1−C1、7−1−C2、14−1−C12、14−1−C16、21−1−C8、27−5−C5
pCDNA−hLAG−3(D1D4)Ig−E7に対しては:7−1−D3、14−1−D4、14−1−D8、21−1−D1、27−5−D3
pCDNA−hLAG−3(D1D2)Ig−E7に対しては:7−1−E1、7−1−E3、7−1−E5、14−1−E9、14−1−E11、21−1−E6、27−5−E8。
pCDNAに対しては:7−1−A1
pCDNA−hLAG−3(D1D4)Igに対しては:7−1−B4
pCDNA−hLAG−3(D1D2)Igに対しては:21−1−C8
pCDNA−hLAG−3(D1D4)Ig−E7に対しては:7−1−D3
pCDNA−hLAG−3(D1D2)Ig−E7に対しては:14−1−E11
予想通り、hLAG−3(D1D4)Ig−E7はhLAG−3(D1D4)Igより若干高い位置で移動する(図5)。観察された2本のバンドはhLAG−31gの単量体形および2量体形に対応し、β−メルカプトエタノールの存在下での加熱による還元は充分に有効ではなかった。
限られた数の実施後に凍結された2つのストックのアンプルの1つを解凍させ、175cm2フラスコ中でコンフルエントに達するまで再増幅させ、そこから2003年3月3日に「マスター細胞塊」として5つのアンプルを凍結させた。したがって、クローンの単離以降の実施数は、系に従い5と7の間である。
2.1.3)最大E7−hLAG−31g組換えタンパク質生成クローンの選択
2.1.3.1)一過性トランスフェクション効率の分析
細胞のトランスフェクション効率を、トランスフェクション後24時間でのFITCと結合した抗ヒトIgG抗体を用いた細胞内標識の後に、FACSによって最初に評価した。一過性トランスフェクションの効率は、pSEC−E7−hLAG−3(D1D2)IgまたはpSEC−E7−IgG1に関してよりもpSEC−E7−hLAG−3(D1D4)Igに関して高い。DNAの調製物の質は良いが(シグマ社(SIGMA)geneluteキットをmidiprepキアゲン社(Qiagen)キットに置き換えた)、pSECプラスミドの一過性トランスフェクションの効率は、pCDNAプラスミドに関して得られる効率未満である(10%未満対50%)。
この一連のトランスフェクションを4回繰り返した(2003年4月23日、2003年5月7日、2003年6月19日および2003年6月27日)。
pSECに対しては:23−04−F4、07−05−F1
pSEC−E7−hLAG−3(D1D4)Igに対しては:23−04−G3、07−05−G27、07−05−G32、19−06−G8、19−06−G40
pSEC−E7−hLAG−3(D1D2)Igに対しては:23−04−H10、07−05−H11
pSEC−E7−IgG1に対しては:23−04−I12、07−05−I13、19−06−I4、19−06I19。
pSECに対しては:07−05−F1、
pSEC−E7−hLAG−3(D1D4)Igに対しては:19−06−G8
pSEC−E7−hLAG−3(D1D2)Igに関しては:クローンを増幅させなかった。何故なら、その上清のODは、E7−D1D4クローンと比較して低かったからである。それにもかかわらず、07−05−H11の2つのアンプルを液体窒素中に保った、
pSEC−E7−IgG1に対しては:07−05−I13。
2003年5月17日に、175cm2フラスコ由来の19−06−G8および07−05−I13系の5つのアンプルを、「マスター細胞塊」としてコンフルエントで凍結させた。クローンの単離以降の実施数は、この場合考慮する系に従い5と8の間であった。
2.1.4)最大hLAG−3Ig−gagnef組換えタンパク質生成クローンの選択
2.1.4.1)一過性トランスフェクション効率の分析
トランスフェクション効率を、一過的にトランスフェクトした細胞におけるFITCと結合した抗ヒトIgG抗体を用いた細胞内標識の後にFACSによって評価した。一過性トランスフェクション効率は約10%である。
この一連のトランスフェクションを3回繰り返した(2003年5月7日、2003年6月19日および2003年6月27日)。
それぞれのトランスフェクション系の最良クローンを増幅させ、クローン当たり2つのアンプルを凍結させた。以下の凍結クローンをその後互いに比較した。
pCDNA−hLAG−3(D1D4)Ig−gagnefに対しては:07−05−J2、07−05−J23、07−05−J53、07−05−J71、19−06−J18、19−06−J32、19−06−J48
pCDNA−hLAG−3(D1D2)Ig−gagnefに対しては:07−05−K19、07−05−K71、19−06−K33、19−06−K43、19−06−K44、17−06−K7
これらのクローンを、それらの上清のELISAによって、あるいは細胞内標識によってその後互いに比較して、最大生成系のみを保存した。組換えタンパク質生成系として選択したクローンは以下のものであった。
pCDNA−hLAG−3(D1D4)Ig−gagnefに対しては:07−05−J53
pCDNA−hLAG−3(D1D2)Ig−gagnefに対しては:07−05−K19および27−06−K7。
2003年5月17日に、「マスター細胞塊」としての185cm2フラスコ由来の27−06−K7の3つのアンプル以外に、175cm2フラスコ由来の07−05−J53および07−05−K19系の5つのアンプルを凍結させた。クローンの単離以降の実施数は、考慮する系に従い4と8の間であった。
2.2)Dαベクター由来の融合タンパク質を発現する安定した系の樹立。
2.2.1.1)トランスフェクション
Dαベクターにおける構築体のトランスフェクション用に使用したCHO−dhfr−細胞(DSMZ ACC126)を、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドの存在下でインキュベートした(培地MEMα RN/RdN+、ギブコ社(GIBCO)22571−020)。CHO−dhfr−細胞を前日に25cm2フラスコに接種し、2.5μLのlipofectamine2000(インビトロジェン社(Invitrogen))を使用して1μgのDα−LAG−3(D1D4)Ig/E7またはDα−LAG−3(D1D4)Ig/gagnefプラスミドを用いて、2004年7月25日にトランスフェクトした。元のDα−LAG−3−D1D4−ΔEK−hIgG1融合体およびpEGFP(クローンテク社(Clontech)ベクターのトランスフェクション体を、それぞれ陽性および陰性対照として使用した。トランスフェクションの6時間後、トランスフェクション培地をMEMαRN/RdN+培地と交換した。
トランスフェクションの2日後、細胞をトリプシンで溶解させ、MEMαRN/RdN−選択培地(ギブコ社(GIBCO)22561−021)中に5000細胞/ウエルで、4枚の96ウエル・プレートにそれぞれのトランスフェクション用に接種した。約1週間後、それぞれ細胞のプールを表すそれぞれのウエルの上清を、抗LAG−3を用いてELISAにより分析した。最も生産的なプールを凍結用に増幅させ、メトトレキサートの存在下において培養物中に保ち、プラスミド由来配列(およびしたがって当該のタンパク質をコードする遺伝子)の増幅を可能にした。
2.2.2.1)最も生産的なhLAG−3Ig/E7トランスフェクタントのプールの選択
抗LAG−3を用いてELISAにより試験した400個のプールの中で、6個が他のものよりも一層強力な生産者であり、これらを選択した(プール番号3、4、9、11、20、21)。これらのプールそれぞれの2つのアンプルを凍結させた。
これらのプールを150.000細胞/ウエルで6ウエル・プレートに接種し、50nMのメトトレキサートと共に培養した。プール9および11の上清中のhLAG−3Ig/E7の量は、メトトレキサートの存在下において増大した。メトトレキサートの用量は、したがって150および250nMに増大した。
2.2.3.1)hLAG−3Ig/gagnefトランスフェクタントの最も生産的なプールの選択
抗LAG−3を用いてELISAにより試験した400個のプールの中で24個を選択し(1〜24で番号処理したプール)、凍結させた。
これらのプールを150.000細胞/ウエルで6ウエル・プレートに接種し、50nMのメトトレキサートと共に培養した。50nMのメトトレキサートに耐性があった11個のプールを、150および250nMのメトトレキサートと共に培養した。
hLAG−3Ig−E7、hLAG−3Ig/E7およびhLAG−3Ig/gagnefタンパク質、ならびに対照としてhLAG−3Igを生成させ、これらを精製した。
3.1.1)hLAG−3Ig−E7およびhLAG−3Ig生成系からの多量の上清の生成
hLAG−3(D1D4)Ig(CHO7−1−BA)、hLAG−3(D1D4)Ig−E7(CHO7−1−D3)、hLAG−3(D1D2)Ig(CHO21−1−C8)およびhLAG−3(D1D2)Ig−E7(CHO14−1−E11)タンパク質を生成する細胞系を大規模に培養して、数ミリグラムのタンパク質を含む体積の上清を得た(タンパク質当たり1.3リットルと1.6リットルの間の上清)。
hLAG−3(D1D4)Ig(CHO 7−1−BA):1.4mg/L
hLAG−3(D1D4)Ig−E7(CHO 7−1−D3):0.33mg/L
hLAG−3(D1D2)Ig(CHO 21−1−C8):4μg/L
hLAG−3(D1D2)Ig−E7(CHO 14−1−E11):5μg/L
したがって、hLAG−3のただ2つのIgドメインを含む組換えタンパク質の生成は、hLAG−3の4つのIgドメインを含む組換えタンパク質の生成より一層有効であった。
hLAG−3Ig/E7番号11−5およびhLAG−3Ig/gagnef番号1−21クローンのバイオマスの増大を、血清の存在下において接着細胞を用いて得た。コンフルエントで、細胞をPBSで洗浄し、30℃において250nMのメトトレキサートおよび2mMの酪酸を補ったProCHO4−CDM培地(Cambrex BE12−029Q)中で培養した。培地は24または36時間毎に回収した。数個の生成物をこのようにして得て、上清中の生成された量は一般に、この実験系ではhLAG−3Ig−E7に関しては2mg/Lを超え、hLAG−3Ig−gagnef融合タンパク質に関しては1mgであった。
hLAG−3(D1D4)Ig、hLAG−3(D1D4)Ig−E7、hLAG−3(D1D2)Ig、hLAG−3(D1D2)Ig−E7、hLAG−3Ig/E7およびhLAG−3Ig/gagnef組換えタンパク質を、生成した上清のバッチからプロテインAのカラムで精製した。
培養物の上清由来の組換えタンパク質の精製を、PBSを用いて平衡状態にしたプロテインAのカラム(ファルマシア社(Pharmacia)ref−17−5079−01)で行った。
精製タンパク質を含む分画を集め、脱塩カラム(ファルマシア社(Pharmacia)からのHi−trap脱塩5ml)においてPBSバッファー中で後に脱塩した。このようにして得たタンパク質を(機能性試験においてそれらを使用する前に)濃縮器で濃縮し(Vivascience ref.V50201断片10kDa)、SpinXカラム(ref.Costar8160)での濾過によって滅菌した。生成物を等分し、−80℃で凍結させた。
それぞれの精製、脱塩およびCentricon濃縮工程の生成物を、抗hLAG−3Igを用いてELISAによって分析した。
表2は、精製hLAG−3Ig/E7およびhLAG−3Ig/gagnefタンパク質においてLAL(Cambrex)によって推測したエンドトキシンの量に加えて、BCAタンパク質アッセイ(Perbio)によって得られた量を要約する。
4つのhLAG−3(D1D4)Ig、hLAG−3(D1D4)Ig−E7、hLAG−3(D1D2)IgおよびhLAG−3(D1D2)Ig−E7組換えタンパク質の精製産物の性質および純度を、SDS−PAGEによって分析した。10%アクリルアミドを含むゲルをクーマシー・ブルーで染色したか、あるいは抗hLAG3および抗E7を用いるウエスタン・ブロットによる分析用にニトロセルロースに移した(図5における例)。
この方法で精製したhLAG−3(D1D4)Ig、hLAG−3(D1D4)Ig−E7、hLAG−3(D1D4)IgおよびhLAG−3(D1D4)Ig−E7タンパク質を、クラスIIMHCと結合するそれらの能力、樹状細胞によって内在化される樹状細胞の成熟を誘導するそれらの能力、および特異的なCD4および/またはCD8T細胞応答を誘導するそれらの能力に関して試験した。
クラスIIMHCと結合する組換えタンパク質の能力を、LAZ−509細胞(EBVによって形質転換されたヒトB細胞、クラスIIMHCを強く発現する)とタンパク質との結合を測定することによって評価した。FITCと結合したヒト抗Ig抗体によって、結合が明らかになった。クラスIIMHCおよび組換えタンパク質の結合と正比例した、LAZ−509細胞のFITC標識の強度をFACSによって定量した(図6および9)。
末梢血単核球(PBMC)から分化した未成熟樹状細胞を、(陰性刺激対照として)ヒトIgG1細胞、あるいはhLAG−3(D1D4)Ig/E7、hLAG−3(D1D4)Ig/gagnefまたはhLAG−3Ig(10μg/mL)タンパク質と共に2日間インキュベートした。樹状細胞の成熟化を誘導することが知られている可溶性CD40リガンド(sCD40L、3μg/mL)を、陽性刺激対照として使用した。樹状細胞の活性化を、CD40、CD80、CD83、およびCD86活性化マーカーの膜での発現によってその後評価した(図10中の例)。LAG−3/E7またはLAG−3/gagnef融合タンパク質を、陽性対照、LAG−3IgおよびsCD40Lと同様に樹状細胞の成熟化を誘導した。
樹状細胞におけるhLAG−3(D1D4)Ig−E7融合タンパク質の内在化を試験した。
健全なドナーから新たに回収したPBMC細胞を、標準的なFicoll−Paque(アマシャムファルマシアバイオテク社(Amersham Pharmacia Biotech)AB)を使用して精製した。
セルロース・エステル膜を有する96ウエル・プレート(MultiScreen MAHA S4510;Millipore)を、抗γ−インターフェロン抗体(MAB285)で一晩コーティングした。ウエルを洗浄し、10%のヒトAB血清を培地に加え、細胞を4つの異なる濃度で加えた。タンパク質をそれぞれのウエルに加え、プレートは一晩インキュベートした。翌日、培地を捨て、二次ビオチン化抗体(BAF285−ビオチン)を加えることによってウエルを洗浄した。プレートを2時間インキュベートし、洗浄し、ストレプトアビジン−酵素複合体(ストレプトアビジン−AP;Boehringer Mannheim GmbH)をそれぞれのウエルに加えた。プレートを室温で1時間インキュベートし、酵素のBCIP−NBT基質(S3771:プロメガ社フランス(Promega France)をそれぞれのウエルの、アルカリホスファターゼ・バッファー、pH9.5(100mMのトリス−HCl、100mMのNaCl、5mMのMgCl2)中に加え、プレートを10〜20分間室温でインキュベートした。濃い青紫色の斑点が出現するやいなや、水で洗浄することによって反応を終了させた。斑点を、自動式画像分析装置ELISPOTリーダー(AID Strasbourg、ドイツ)を使用して計数した。
Claims (9)
- 抗原に対するCD4T細胞応答およびCD8T細胞応答の少なくともいずれか一方を誘導可能な結合産物であって、
ウイルス抗原、細菌抗原、腫瘍抗原、および寄生虫抗原からなる群から選択される抗原型の第1クラスのタンパク質およびクラスIIMHCリガンドからなる第2クラスのタンパク質を備え、
第1クラスのタンパク質および第2クラスのタンパク質が生物環境中で安定な1個以上の共有結合によって結合しており、かつ、
第2クラスのタンパク質は、第1クラスのタンパク質を標的とするT細胞を介した免疫応答を誘導することが可能であるとともに、LAG−3、LAG−3のD1−D2からなる断片、およびLAG−3のD1−D4からなる断片からなる群から選択されることを特徴とする結合産物。 - 第1クラスのタンパク質および第2クラスのタンパク質がリンカーまたは連結分子を介して共有結合により間接的に連結していることを特徴とする請求項1に記載の結合産物。
- 第1クラスのタンパク質および第2クラスのタンパク質が1個以上の結合によって結合することにより融合タンパク質を形成していることを特徴とする請求項1に記載の結合産物。
- 前記第1クラスのタンパク質が、HPV、HBV、HCV、HIV、EBV、およびCMVウイルスからなる群から選択されるウイルス抗原であることを特徴とする請求項1に記載の結合産物。
- 前記第1クラスのタンパク質が、HPVの抗原E7およびHIVのgag−nef抗原からなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の結合産物。
- 前記第1クラスのタンパク質が、結核、ハンセン病およびリステリアの細胞内細菌の群から選択される細菌抗原であることを特徴とする請求項1に記載の結合産物。
- 前記第1クラスのタンパク質が、CEA、MelanA、PSA、MAGE−3、HER2/neu、HPVのE6およびE7タンパク質からなる群から選択される腫瘍抗原であることを特徴とする請求項1に記載の結合産物。
- 薬剤として許容可能な賦形剤と任意で組み合わされるとともに、腫瘍抗原に対するCD4T細胞応答およびCD8T細胞応答を誘導可能な請求項1から請求項3のいずれか一項に記載の結合産物(ただし、前記第1クラスのタンパク質は腫瘍抗原である)および請求項7に記載の結合産物のうちの少なくとも1つを備えることを特徴とする免疫原性組成物。
- 特異的なCD4T細胞応答およびCD8T細胞応答を誘導することが可能である免疫原性組成物を調製するための請求項1から請求項7のいずれか一項に記載の結合産物の使用方法。
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