JPH05500615A - ヒルジン及び新規のヒルジンの組換え製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒルジン及び新規のヒルジンの組換え製造方法本発明は、ヒルＨｉｒｕｄｏ　ｍ ｅｄｉｃｉｎａｌｉｓから最初に単離されたヒルジン（ｈｉ＋ｏｄｉｎ）の製造 、並びにその誘導体の製造に関する。

最も一般的な抗血液凝固性ペプチドは、おそらくヒルジンファミリーに属するも のである。薬効のあるヒルであるＨ４ｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓから最 初１こ単離されたヒルジンは、よく知られた且つ十分に特徴付けられたトロンビ ンのポリペプチド阻害剤である１・２゜さらに詳細１こ！ヨ、それ（よイオン的 相互作用によってトロンビンと結合し、したがってフィブリノーゲンのフィブリ ンへの切断、及びその後のフイブＩＪンー凝血形成を防止する。動物試験では、 ヒルジンＥよ静脈血栓症、血管吻合閉塞、及びトロンビン誘発性散在性血管向凝 固症を防止する効能が示されている。さらに、ヒルジン（よ低毒性で、はとんど 又は全く抗原性を示さず、循環系からのクリアランス時間が非常に短い。

ヒルジンの３種類の天然変異体が公知である。ＨＶＩと呼（ｆれる第一の変異体 の配列は、Ｄｏｄｔら、ＦＥＢＳ　１６５（１９８４）１８０−１８４により決 定された。３文字コードによるＨＶＩの配列（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１ ３８゜９−３７．１９８４）を以下に示す： Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ。

０３Ｈ ＨＶ２と呼ばれル第二ノ変異体ハ、Ｄｏｄｔら、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ　３６７（１９８６）８０３−８１１によ って記載された。ＨＶ２は以下の点でＨＶＩと異なる： 位置１のＶａｌの代わりにＩｌｅ、位置２のＶａｌの代わりにＴｈｒ、位置２４ のＧｌｎの代わりにＬ　ｙ　ｓ　ｓ位置３３のＡｓｐの代わりにＡ、　ｓ　ｎ　 、位置３５のＧｌｕの代わりにＬｙｓ。

位置３６のＬｙｓの代わりにＧ１７．位置４７のＬｙｓの代わりにＡｓｎ、位置 ４９のＧｌｎの代わりにＧ　ｌ　ｕ　％位置５３のＡｓｐの代わりにＡｓｎ０ ＨＶ３と呼ばれる東三の変異体は、Ｈａ　ｒ　ｖ　ｅ　ｙら。

Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．　Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ　（１９８６）１０８ ４−４０８８により記載された。ＨＶ３は位置１から位置３２まではＨＶ２と同 じで、以下の点でＨＶＩと異なる二位置３３のＡｓｐの代わりにＧｉｎ、位置３ ５のＧｌｕの代わりにＬｙｓ、位置３６のＬｙｓの代わりにＡｓｐ、位置５３の Ａｓｐの代わりにＧ１ｎ１位置５８のＧｌｕの代わりにＰ　ｒ　Ｏ、位置６２の Ｇｌｕの代わりにＡｓｐ、位置６３のＴ　ｙ　ｒ　（Ｓ　Ｏ３Ｈ）の代わりｉ： Ａｌａ、位置６４のＬｅｕの代わりにＡｓｐ、及び位置６５のＧｉｎの代わりに Ｇｌｕ０ヒルジン及びヒルジン様ポリペプチドの製造のための新しいアプローチ がここに創案された。このアプローチは、ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチド をコードするヌクレオチド配列の化学的合成、及び組換え体生物内でのヒルジン 又はヒルジン様ポリペプチドの発現を基礎とする。遺伝的に修飾された生物の培 養により、十分な生物学的活性を示す所望の物質が産生される。

したがって、本発明は、ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードするＤＮ Ａ配列を包含する発現ベクターを提供する。

本発明はさみに、本発明の適合性発現ベクターで形質転換された宿主を提供し、 さらにヒルジン又はヒルレジン様ポ！ノペプチドをコードする合成りＮＡを提供 する。ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片は、−重鎖 であっても二本鎖でもよい。

ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドが発現され得る宿主は、本発明の適合性発 現ベクターで宿主を形質転換することによって製造される。発現ベクターは、一 般に、以下のようにして製造する。

（ａ）ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードするＤＮＡを化学的に合成 し；そして （ｂ）上記のＤＮＡを発現ベクターに挿入するＯヒルジン又はヒルジン様ポリペ プチドはしたがって、ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドが発現されるような 条件下に本発明の形質転換宿主を供給することによって製造される。欠に、ヒル ジン又はヒルジン様ポリペプチドを単離する。この方法では、ヒルジン又はヒル ジン様ポリペプチドは純粋形態で得られる。

本明細書中で用いられる「ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチド」という用語は 、その天然ＨＶＩ、ＨＶ２、及びＨＶ３形機能化、及び化学的修飾によるその誘 導体を指す。したがって本発明は、抗トロンビン活性を有するＨＶＩ、ＨＶ２、 又はＨＶ３の誘導体にも適用し得る。

ＨＶＩ、ＨＶ２、又はＨＶ３のアミノ酸配列は、一つ又はそれ以上のアミノ酸の 置換、挿入及び／又は欠失により、及び／又は一方の末端又は各末端の伸長によ って修飾し得る。このような修飾配列から成る誘導体は、もちろん依然として抗 トロンビン活性を示さねばならない。一般に、Ｈｖｌ、Ｈｖ２、又はＨＶ３のア ミノ酸配列とその誘導体のアミノ酸配列との間には７５％以上の程度の相同性が 認められる。相同性の程度は８５％以上、又は９５％以上でもあり得る。

例えば、ＨＶｌ、Ｈｖ２、又はＨＶ　３の配列の一つ又はそれ以上のアミノ酸残 基が置換又は欠失されるか、あるいは一つ又はそれ以上の付加的アミノ酸残基が 挿入され得る。元の配列の物理化学的特性、即ち電荷密度、疎水性／親水性、サ イズ、及び配置に関しては保存される。１文字コードに基づく、考えられる置換 （Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３８．９−３７．１９８４）を以下に示す ： Ｇの代わりにＡ及びその逆： ■の代わりにＡ、Ｌ、又はＧ； にの代わりにＲ： Ｓの代わりにＴ及びその逆： Ｄの代わりにＥ及びその逆：並びに Ｑの代わりにＮ及びその逆。

伸長に関する限り、５０アミノ酸残基までの短い配列が一方又は各末端に付与さ れ得る。その配列は、３０個まで、例えば２０個まで、又は１０個までのアミノ 酸残基を有する。

ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドは、一つ又はそれ以上が翻訳後修飾、例え ばグリコジル化、硫酸化、Ｃ００Ｈ−アミド化、アシル化、又はポリペプチド鎖 の化学的変化を受ける。

例えば、位１１１６３のＴｙｒ残基が硫酸化され得る。本発明によって得られる 組換え体ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドは、天然ＨＶ１、Ｈｖ２、及びＨ Ｖ３とは異なって、一般にこの位置では硫酸化されない。さらに、本発明はＨＶ Ｉ、ＨＶ２、又はＨＶ３のＮ−末端又はＣ−末端部分を持たな０低分子量の誘導 体の産生にも適用し得る。

本発明は特に、ＨＶＩ、及び、Ｈｖｌの最初の４６残基その後の）（Ｖ２変異体 の４７−６５残基のアミノ酸配列から成るＨＶＩ誘導体の産生に適用し得る： ハイブ’ＪッＦＨＶ１／ＨＶ２　（ＨＶＩ２と呼ぶ）：Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ −Ｇｌｙ−Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ　−Ａｓ　ｎ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ　−Ｔｈｒ −Ｇｌ　ｙ−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌ　ｙ−sｈ　ｒ− ここで、下線を施した配列は、ＨＶ２部分である。上記のようなポリペプチドＨ Ｖ１２及びその誘導体は、本発明の別の態様を成す。

ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって製造される 。ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードする合成遺伝子を製造する。Ｄ ＮＡコード配列は一般に、イントロンを含まない。合成遺伝子を、組換え物質の 産生を推進し得る発現ベクターに挿入する。合成遺伝子は一般に、全体的に所望 の遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドを化学的に合成することによって製造さ れる。次に、オリゴヌクレオチドを集めて遺伝子を得る。

したがって、遺伝子は、４つの化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築 され、各々のオリゴヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡ遺伝子の一本鎖の約半分を表わ す。オリゴヌクレオチドを連結し、アニーリングして、所望の遺伝子を生成する 。所望により、一つ又はそれ以上のコドン変化を導入するために部位特異的突然 変異誘発によって遺伝子配列を修飾してもよい。一般に、その後の操作を容易に するために、各末端に制限部位をもつ遺伝子を作製する。

ＨＶＩをコードする好ましいＤＮＡ配列を、添付の図面の図１に示す。ＨＶＩ２ をコードする好ましいＤＮＡは、図３に示す。いずれの配列も、誘導体をコード するために修飾し得る。

さらにリーダーペプチドをコードするＤＮＡ配列が提供される。リーダーペプチ ドは、ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドが発現さるべき細胞からのヒルジン 又はヒルジン様ポリペプチドの分泌を指示（ｄｉｒｅｃｔ）　シ得る。リーダー ペプチドをコードする配列は一般に、ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコ ードするＤＮＡ配列の５′　−末端に融合される。

リーダーペプチドは、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のような細菌宿主中での発現の場 合には、好ましくはＯｍｐＡリーダーペプチドである。リーダーペプチドは、昆 虫細胞中での発現の場合には、好ましくは＃＃；水庖性ロ内炎ウィつスＧ蛋白質 （ＶＳＶ　Ｇ蛋白質）のリーダーペプチドである。ＯｍｐＡ及びＶＳＶ　Ｇ蛋白 質リーダー配列をコードする適切なりＮＡ配列を、それぞれ図５及び８に示す。

ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドを放出するために切断可能な融合蛋白質を コードするＤＮＡ配列が提供され得る。切断可能な結合を介してヒルジン又はヒ ルジン様ポリペプチドのＮ−末端に融合されるキャリヤーポリペプチド配列をコ ードするＤＮＡ配列を用い得る。切断可能な結合は、臭化シアンによって切断可 能なものであってもよい。

ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドの発現のために、ヒルジン又はヒルジン様 ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、且つ、好適な宿主中に移入された 場合にヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドを発現し得る発現ベクターを作製す る。

ＤＮＡ配列のためのプロモーター、転写終結部位、翻訳開始コドン、及び翻訳停 止コドンを包含する適切な転写及び翻訳制御因子が提供される。ＤＮＡ配列は、 ベクターと適合する宿主中でポリペプチドの発現を起こさせるような正しいフレ ーム内に導入される。

発現ベクターは一般に、複製起点、及び所望により抗生物質耐性遺伝子のような 選択可能なマーカー遺伝子を包含する。プロモーターは、操作可能なように（ｏ ｐｅ１１ｈ１７）ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列 に結合する。発現ベクターはプラスミドであり得る。その場合、好ましくはＰ　 及びＰｌｅｅ／ｌｉｅプロモーターから選択されるプロモータａｐ −は、操作可能なようにＤＮＡ配列に結合される。あるいは、発現ベクターはウ ィルスであってもよい。ウィルスは組換えバキュロウィルスであり得、この場合 には、ポリヘトリン［ｐｏ１７ｈｅｄ＋ｉｎ）プロモーターが、操作可能なよう にヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に結合される。

ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドを発現できる発現ベクターは、任意の便利 な方法で製造され邊る。ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードするＤＮ Ａ断片を発現ベクター、例えばプラスミドベクターの適切な制限部位に挿入する 。組換えバキュロウィルスは、以下のようにして製造し得る：（ｉ）ヒルジン又 はヒルジン様ポリペプチドをコードする遺伝子を、ポリへドリンプロモーターの 下流の制限部位でバキュロウィルス転移ベクター中にクローニングし：そして（ １１）工程（ｉ）からの組換え転移ベクター及び無傷の野生型バキュロウィルス ＤＮＡを用いてバキュロウィルス感染し易い昆虫細胞を同時トランスフェクショ ンする。

相同的組換えが起こり、その結果、ポリへドリンプロモーターの下流にヒルジン 遺伝子、又はヒルジン様ポリペプチドをコードする遺伝子を有する組換えバキュ ロウィルスが生じる。バキュロウィルス転移ベクターは、ポリヘトリンＡＴＧ開 始コドンの下流に非反復性クローニング部位を有するベクターであり得る。得ら れる組換えバキュロウィルスによって発現される物質は、ポリヘトリン蛋白質の Ｎ−末端部分がヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドのＮ−末端に融合した融合 蛋白質である。

上記のように、切断可能な結合は、融合連接部に導入される。

工程（１１）で用いる昆虫細胞は、一般に５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐ ｅｒｄａ細胞である。野生型バキュロウィルスは、一般にＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードする発現ベクターは、適切な宿主 中に導入される。細胞をヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードする遺伝 子で形質転換する。形質転換宿主は、ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドが発 現されるような条件下に供給される。例えば形質転換細胞を、発現を起こさせる ために培養する。任意の適合性宿主−ベクター系を用いることができる。

形質転換宿主は、原核又は真核宿主である。細菌又は酵母菌宿主、例えばＥ、ｃ ｏｌｉ又はＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いてもよい、グラム陽性細菌を用いて もよい。好ましい細菌宿主はＥ、ｃｏｌｉ　Ｂ型株である。あるいは、昆虫細胞 を用いてもよいが、この場合、バキュロウィルス発現系が適切である。昆虫細胞 は一般に、５ｐｏｄ、ｏｐｔｅｒａｆ　ｒｕｇｉｐｅｒｄａ−細胞である。さら にそれに代わるものとしては、哺乳類細胞系の細胞を形質転換してもよい。ヒル ジン又はヒルジン様ポリペプチドを産生ずるトランスジェニック動物（例えばヒ ト以外の哺乳類）が提供される。発現されるヒルジン又はヒルジン様ポリペプチ ドを単離し、精製する。

本発明にしたがって製造されるヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドは、医薬上 許容可能な担体又は賦形剤とともに医薬処方物中に用い得る。このような処方物 は一般に、静脈内投与用である（この場合、担体は一般に許容可能な純度の滅菌 食塩水又は水である）。本発明にしたがって製造されるヒルジン又はヒルジン様 ポリペプチドは抗トロンビン活性をもち、一般にヒト患者における血栓塞栓性症 状、例えば血液凝固の治療に適している。本発明の一つの実施態様において、ヒ ルジン又はヒルジン様ポリペプチドを、プラスミノーゲン活性化因子、例えば組 織プラスミノーゲン活性化因子と一緒に同時投与する。本発明にしたがって製造 されるヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドは、後者、即ち組織プラスミノーゲ ン活性化因子と適合性であることが判明している。

以下の実施例で本発明をさらに説明する。

添付の図面の説明： 図１は、ヒルジンｆ（Ｖｌ鎖の大部分をコードする４つのオリゴヌクレオチドの ヌクレオチド配列を示す。下線を施した配列は、さらなる作製のために用いたＢ ａ１１部位を示す。図の下方部は、４つのオリゴヌクレオチドの組立て形式を示 す。

Ｈｉｎｄｌｌｒ及びＰｓｔＩ部位は、その後の操作を可能にするために含入され た。

図２は、中間プラスミドＭ１３−ＨＶ１の作製の模式図であって、これはさらな る全作製物ためのＢａｌＩ−ＢａｍＨＩ　ＤＮＡ断片の供給源である。

図３は、ヒルジンＨＶ１２鎖の大部分をコードする４つのオリゴヌクレオチドの ヌクレオチド配列を示す。下線を施した配列は、さらなる作製のために用いたＢ ａ１１部位を示す。図の下方部は、４つのオリゴヌクレオチドの組立て形式を示 す。

ＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔ１部位は、その後の操作を可能にするために含入され た。

図４は、中間プラスミドＭ１３−ＨＶ１２の作製の模式図であって、これはさら なる全作製物ためのＢａｌｌ−ＢａｍＨＩ　ＤＮＡ断片の供給源である。

図５は、それぞれＯｍ　ｐ　Ａリーダーペプチドと結合する完全ＨＶＩ遺伝子及 び完全ＨＶ１２遺伝子を保有する、ＯＭＰ−ＨＶＩ及びＯＭＰ−ＨＶＩ　２と呼 ばれる新規の組換え体Ｍ１３の作製を模式的に示す。リーダーペプチド配列には 二重下線を施し、一方Ｂａ１Ｉ平滑末端及びＨｉｎｄｌｌＩ付着末端は一重下線 を施しである。

図６は、Ｅ、ｃｏｌｉ中でのＨｖｌ及びＨＶ１２ｆＪｍ生（Ｄｔ＝めに用いるプ ラスミドであるｐＦＣ−ＨＶＩ及びｐＦＣ−ＨＶｌ２の作製を模式的に示す。

図７は、Ｅ、ｃｏｌｉ中でのヒルジンの産生のため１こ用−するプラスミドｐＯ ＭＰ−ＨＶＩの一般構造を示す。我々【よ、伝統的な遺伝子操作技術を用いてこ の新規のプラスミドを製造したが、この場合、ヒルジン遺伝子は）１イブリツド プロモーターＰ１ｐｐ／ＩＡｃの転写制御下に置かれる。この場合でさえ、Ｏｍ ｐＡリーダーペプチドはＥ、ｃｏｌｉのペリプラズム（ｐｅｒｉｐｌｘｓｍ）へ のヒルジンの分泌を推進する０図８は、ヌクレオチド配列、及び昆虫細胞からの ヒルジンの分泌のために用いる合成オリゴヌクレオチドの組み立てを示す。

下線を施した配列はＶＳＶ　Ｇ蛋白質リーダーペプチドを示す。

図９は、ＶＳＶ−ＨＶｌ２と呼ばれる新規の組換え体Ｍ１３の作製の模式図であ って、この場合、完全遺伝子はｖＳｖＧ蛋白質リーダーペプチドと結合される。

図１０は、バキュロウィルスゲノムへの転移ベクターとして用いたｐＡｃ−ＨＶ ｌ２の作製を模式的に示す。ｐ　Ａ　ｃ　Ｙ　Ｍ　１は、該ウィルスに転移され る異種配列の受容体として広く用（１られる出発プラスミドである。

図１１は、ヒルジン鎖のはじめの部分をコードするヌクレオチド配列及び合成オ リゴヌクレオチドの組み立てを示す。付加的メチオニン残基をコードするＡＴＧ コドンには下線を施している。

図１２は、細胞内ヒルジン発現のために用いたｐＡｃＦＴｌの作製を模式的に示 す。

図１３は、それぞれ、ポリヘトリンの最初の１８個のアミノ酸と結合する完全Ｈ ＶＩ及びＨＶｌ２を保有する、ｐＡｃＦＴｌ−ＨＶＩ及びｐＡｃＦＴｌ−ＨＶｌ ２と呼ばれる新規）転移プラスミドの模式図である。これらのプラスミドは、バ キュロウィルスゲノムに異種配列を転移するために用いられた。

実施例１：ＨＶｌ及びＨＶ１２遺伝子の化学的合成Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ ｏｌｉの好ましいコドンを基礎にして、ヌクレオチドコード配列を設計した４゜ さらに、異なる発現ベクター中にそのコード配列を挿入させるために、合成遺伝 子の５°末端のごく近くにＢａ１ｌ制限部位を作り出した。

実際、細菌細胞及び昆虫細胞における発現のために、同一合成遺伝子を用いた。

昆虫細胞の場合、分泌生成物又は細胞生成物を生じさせる方法を開発した。

プラスミドＤＮＡ操作はすべて、Ｍａｎｉａｔｌｓ２が記載したように実施した 。

Ｈｖ１遺伝子を以下のように合成し１組み立てた０自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌ ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて４つの合成相補的オリゴヌクレオチド を製造した。その配列を図１に示す。酵素的燐酸化後、４つのオリゴ体をＤＮＡ リガーゼを用いて組み立て、その結果生じた二本鎖配列をＭ１３ファージベクタ ーｍｐ１８に挿入して、図２Ｉこ示す組換えプラスミドＭ１３−ＨＶ１を得た。

ヒルジン遺伝子をＭ１３ベクターに挿入させるために、さらにＨｉｎｄｌ　Ｉ　 夏及びＰｓｔＩ部位を合成オリゴ体に付加した。正しいヌクレオチド配列は、− 重鎖ファージＤＮＡで実施するＳａｎｇｅ　ｒ法６によって立証された。

組換えプラスミドＭ１３−ＨＶＩは、実施例で用いる全発現ベクター用のＨＶｌ 遺伝子の供給源として用いた。

同様の方法でＨＶ１２遺伝子を合成し、組み立てた。遺伝子を組み立てるために 用いたオリゴ体を、図３に示す。オリゴ体３及び４は図１のオリゴ体３及び４と は異なるアミノ酸をコードする。図３に示す組換えプラスミドＭ１３−ＨＶ１２ を得た。

蛋白質形態のＨＶｌ及びＨＶ１２分子を合成する必要がある。

さらに、効率のよい分泌に寄与する「リーダーペプチドコと呼ばれるアミノ酸配 列が、Ｈｖｌ又はＨＶｌ２のＮ　Ｈ２末端に存７．８ 在しなければ成らない　。次に、このエキストラ配列（ｅｘｔｒｓ分泌系の多数 の例が文献に記載されている１０“１．１゜それらの中で、発表済みのＥ、ｃｏ ｌｉの外膜タンパク質［ＯｕｔｅｒＭｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　 Ｅ、ｃｏｌｉ（ＯｍｐＡ）］の分泌シグナルに基づいて、系を選択した。したが って、メツセンジャーＲ，Ｎ　Ａの効率のよい翻訳に寄与することが知られてい るＯｍｐＡ　Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎ。

配列によって先行されるＯ　ｍ　ｐ　Ａリーダーペプチドをコードする２つの付 加的な相補的オリゴヌクレオチドを設計した１３゜図５に示すその配列は、最初 の１０個のアミノ酸をコードするＨＶ１遺伝子の開始部分をも含む。Ｂａ１１部 位の存在によりこの合成片と残りのＨＶＩコード配列とが結合し、一方上流Ｈｉ ｎｄＩｒ［部位の存在によってＭ１３ベクターとの結合が可能になった。したが って、合ＥＨｉｎｄＩｒｌ−Ｂａｌｌ断片をＭＬ３−）（ＶｌからのＢａ　ｌ　 Ｔ−ＢａｍＨＩ片とを連結し、ＭＬ　３ｍｐ　１８に挿入して、ＯＭＰ−ＨＶＩ と呼ばれる新規のプラスミドを得た。この新規のプラスミド作製の模式図も、図 ５に示す。同様の操作をＭＬ３−ＨＶｌ２から開始して、ＯＭＰ−ＨＶｌ２を得 た（図５）。

ＯＭＰ−ＨＶｌから、後にヒルジンコード配列が続いて含む、ＯｍｐＡ　Ｓｈｉ ｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ及びリーダーペプチドをコードするＨｉｎｄＩ　ｒ　ｒ −ＢａｍＨ１断片として切り出すことができる。この制限断片は、目下、適切な 発現ベクター中への挿入のために用いられる。細菌中で異種蛋白質を高レベルに 産生ずるために、理論的には、いくつかの発現系を用い得モーターの場合でも、 指定ポリペプチドの発現レベルは予測できない。ヒルジンの発現のためのプロモ ーターＰ　の使用は、ａｐ 今日まで報告されていない。

図６に示すプラスミドｐＦＣ３３は、文献にすでに記載されている１３゜それは 抗生物質アンピシリンに対する耐性、及びプロアポリポ蛋白ｉＡ１の発現を推進 する細菌プロモーターＰｌｒｐを保有する。ＨｉｎｄｌＩＩ及びＢ　ａ　ｍ　Ｈ ＴでｐＦＣ３３を消化した後、抗生物賀耐性遺伝子及びプロモーターを保有する 大きなＨｉｎｄｒ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片を単離して、ヒルジンＨＶ１又はヒ ルジン誘導体ＨＶ　１２をコードするＯＭＰ−ＨＶＩ又ハＯＭ　Ｐ　−ＨＶ　１ ２からのＨｉｎｄｌＩＩ−ＢａｍＨＩ′ｌｆｒ片に結合する。この作製の詳細は 図６に示す。本発明者らは、ｐＦＣ−ＨＶＩ及びｐＦＣ−ＨＶｌ２と呼ばレル新 規のプラスミドを単離したが、これはＥ、ｃｏｌｉ中でのＨＶｌ及びＨＶ　１２ の産生のための最終プラスミドである。

本発明の主な目的は、ヒルジン及びその誘導体の発現及びペリプラズムへの分泌 のためのＥ、ｃｏｌｉのＢ型株の使用である。実際、細菌Ｅ、ｃｏｌｉのＢ型株 中にプラスミドｐＦＣ−ＨＶＩを挿入すると高レベルのヒルジン産生が引き起こ されることを〆見出した。興味深いことに、異なる株型のＥ、ｃｏｌｉは、効率 よくは住僧せず、したがってヒルジンを首尾よく産生ずるには宿主株型が決定的 であると考えられる。

Ｅ、ｃｏｌｊのいくつかのＢ型株が有用であって、ヒルジン又はヒルジン様ポリ ペプチドの産生に用い得る。好ましい株は、ＡＴＣＣ１２４０７、ＡＴＣＣ１１ ３０３、ＮＣＴＣ１０５３７である。以下に、プラスミドｐ　Ｆ　Ｃ−ＨＶ　１ にょるＮＣＴＣ１０５３７の形質転換、及びその後の形質転換体の培養の例を示 す。

４シ ＮＣＴＣ１０５３７株のコピテント細胞を、ＭａｎｄｅｌとＨ４ｇａ”の塩化カ ルシウム法を用いて調製した。１ミリリツトル当たり１ｘ１０９細胞の約２００ μｍのこれらの細胞調製物を２μｌのプラスミドＤＮＡ　（濃度約５μｇ／ｍｌ ）で形質転換した。形質転換体を、１００μｇ　／　ｍ　ｌアンピシリンを含有 するし一寒天平板上で選択した。同一抗生物質を含有するし一寒天上に、木製つ まようじで２つの小コロニーの筋を付けた（各々、約１ｃｍの長さの３本の筋） 。３７℃で１２時間インキュベーションした後、１０ｍ１のＬＢ培地（１５０μ ｇ／ｍｌの濃度でアンピシリンを含有する）上に接種し、３７℃で一晩インキユ ベートすることによって、ヒルジン産生に関して筋の部分を試験した。翌日、培 養物を、同濃度のアンピシリンを含有するＭ９培地中で１　＋　１００に希釈し て、３７℃で６時間インキュベートした。

２０ｍ１のこのような培養物を１２０００ｘｇで、４℃で１０分間遠心分離した 。細菌ペレットを、２ｍｌの３３ｍＭＨＣｌトリスｐＨ８、等容量の３３ｍＭ　 ＥＤＴＡの二次溶液中に再懸濁し、次に４０％ショ糖を加えて、軽く振盪しなが ら３７℃で１０分間、全混合液をインキュベートした。遠心分離後、透過した細 胞（ｐｅｒｍｅｘｂｉｌｉ！ｅｄ　ｅｅｌｌ＋）を２ｍｌの冷水中に再懸濁して 、水中に１０分間放置した。その結果生じた上澄を遠心分離して単離したが、こ れは細菌細胞のペリプラズム画分を示す。

合成基質Ｓ−２２３８を切断する紳トロンビンの能力の阻害を基礎にした発色ア ッセイを用いてヘヒルジン産生細胞のペリプラズム画分中の抗トロンビン活性の 存在を測定した。これらの試料においては、ヒルジン活性は約５０μｇ　／　ｍ 　Ｉのレベルで認められた。この活性は、対照ペリプラズム画分中には存在しな かった。ｐＦＣ−ＨＶｌ２の場合、ヒルジン変異体ＨＶ１２の生産性は８０μｇ 　／　ｍ　＋に相当するものであった。

同様のアプローチを泪いて、ヒルジン用の新規の発現／分泌プラスミドを作製し たが、この場合、プロモーター１６がプロモーターＰｌｒｐの代わりに存在する 。

Ｐｌｔ１９／Ｉｔｃ ｐＯＭＰ−ＨＶｌと呼ばれるこの異なるプラスミドを図７に示す。このプラスミ ドをＥ、ｃｏｌｉ　Ｂ型株に挿入後にも、高レベルの活性ヒルジンが得られた（ ４０〜８０μｇ／ｍｌ）。

ｐＯＭＰ−ＨＶＩ〆の作製のための出発プラスミドとして、Ｇｈｒａｙｂらが記 載したプラスミドｐＩＮ−１１１−ｏｍｐＡ３を用いた。イソプロピル−β−Ｄ −チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いた培養及び発現の誘発のための条 件は、過去に記載されている１６゜ 実施例３：Ｅ、ｃｏｌｉから得られた組換えＨＶＩの抗血液凝固活性 ヒルジン変異体ＨＶＩの抗血液凝固活性を、活性化部分トロンボプラスチン時間 （ａＰＴＴ）試験及びトロンビン時間（Ｔ、Ｔ、）試験でも調べた。両試験は、 自動凝固計（ＡＣＬ３００　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏ ｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）を用０て行った０ クエン酸処理した正常ヒト血漿に漸増濃度の、組換え法で産生じたヒルジンＨＶ Ｉを添加した。次；こ、適切な試薬を血漿に自動的に添加し、凝血の形成速度を 記録すること（こよって、ａＰＴＴ及びＴ、Ｔ、の測定を可能！こする自動凝固 計を用（１て試料をアッセイした。ａＰＴＴは、セファリン及び塩化カルシウム を用いて測定しく自動化ａＰＴＴ試薬、ＧｅｎｅｒａｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ、 ＵＳＡ）、Ｔ、Ｔ、＋よ５　Ｉ　Ｕ　／　ｍ　１の濃度のヒトトロンビン（Ｆｉ ｂｒｉｎｄｅｘ、０ｒｔｈ。

Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）を用（１て測定した。メーカ ーの指示に従って試薬を調製し、保存し、使用した。

ａ　Ｐ　Ｔ　Ｔ及びＴ、Ｔ、試験で得られた凝血時間を組換え蛋白質の濃度に対 してプロットした。各試験にお（１て、正常血漿番二対して凝血時間を２倍にす る濃度を計算した。

ａＰＴＴ試験に関して得られた値は２１０ｎｇ／ｍｌであり、一方Ｔ、Ｔ、試験 に関しては、その値は９０ｎｇ／ｍｌであつた。

実施例４：昆虫細胞からのＨＶｌ２の発現及び分泌組換え昆虫細胞からＨＶｌ２ を分泌させるために、本発明者らは、ＨＶ１２コード配列を、これらの細胞によ って効率よく認識されるリーダーペプチドに結合した。水痘性口内炎ウィルス（ ＶＳＶ）Ｇ蛋白質のリーダーペプチドを用いた１７゜昆虫細胞におけるヒルジン 又はその誘導体の産生のためのこのような配列の使用は、今日まで報告されてい ない。上記のものと同様に、後にＨＶ１２遺伝子の最初の部分が続いて含む、ｖ ＳｖＧ蛋白質リーダーペプチドをコードする合成りＮＡ配列を調製したが、その ヌクレオチド配列を図８に示す。この場合も、残りのＨＶ１２遺伝子に、及び発 現ベクターに結合させるのに便利な制限部位（ＨｉｎｄｒｌＩ、ＢａｍＨＩ及び Ｂａ１Ｉ）を導入した。

合成ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｔ−ＢａｌＩ断片を、ＨＶ１２遺伝子を保有するＭ１３− ＨＶｌ２からの精製Ｂａ　ｌ　Ｉ−ＢａｍＨＴ断片に結合させ、予めＨｉｎｄｌ ｌＩ及びＢａｍＨＩで切断したＭ　１３　ｍ　ｐ　１８１．：：挿入した。ＶＳ Ｖ−ＨＶｌ２と呼ばレルｌ’ｒｆｆｌのプラスミドを生産するこの作製手順を図 ９に模式的に示す。

ＶＳＶ−ＨＶＩ２から、ＶＳｖリーダーペプチドと融合したＨ−Ｖ　１２遺伝子 を保有するＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ　ＤＮＡ断片を切り出し、これを図１０に示 すようにベクターｐＡｃＹＭ３−１８に挿入１．た。その結果生じたプラスミド は、ｐＡｃ−ＨＶＩ２と命名した。

昆虫細胞中で発現を起こすためには、ＶＳＶ−ＨＶ１２コード配列を、ポリへド リンプロモーターの転写制御下でバキュロウィルスゲノムに転移しなければなら ない。このために、昆虫細胞を野生型バキュロウィルスＤＮＡ、及び転移ベクタ ーｐ　Ａ　ｃ　−ＨＶ　１２で同時トランスフェクションした。昆虫細胞として 、５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を宿主として選択した。実 験の詳細を以下に示す：載した方法の改良法を用いて、感染性ＡｃＮＰＶ　ＤＮ Ａと個々の組換え体転移ベクターを表わすプラスミドＤＮＡとの混合物でトラン スフェクションした。１マイクログラムのウィルスＤＮＡを２５〜１００μｇの プラスミドＤＮＡと混合し、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７，５，１ｍＭ オルト燐酸水素二ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウム 、及び１０ｍＭグルコース（総容量１ｍ１）の存在下で、０．１２５Ｍ塩化カル シウムで沈殿させた。（濃度はいずれも呼 麓濃度である。） ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞上に接種し、室温で１時間該細胞に吸着させ、次いで １ｍｌの培地と置換した。２８℃で３日間インキュベージランした後、上澄み液 を取り出し、Ｓ。

ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞単層中にプラークを生成するために用いた。組換えウ ィルスを含有するプラークは、光学顕微鏡でのようなプラークからウィルスを回 収し、さらにプラークを精製した後、ポリへドリンー陰性ウィルスストックを作 るために用いた。

上記の手順により、ポリへドリンプロモーター及びＶＳｖＧ蛋白質リーダーペプ チドの制御下でゲノムがＨＶ１２遺伝子を保育する組換えバキュロウィルスを単 離することができた。本発明者らは、十分確立された手法１９によって、いた。

次に、感染細胞を、発表済みの方法１９にしたがって、１０％ウシ胎仔血清の存 在下で、回転培養中、又は単層中で培養した。感染後の種々の時間に、Ｓ−２２ ３８発色アッセイを用いて上澄み液中て抗トロンビン活性（ＡＴＵ）を測定した 。

結果を、以下の表に要約する： 表：ヒルジン活性 ＡＴＵ／１０６細胞 回転培養　０．８　０．９　１．４　１．８単層　０．８　０．８　２．０　５ ．１の細胞質中でも産生され、蓄積される。このアプローチは一般に、それが非 分泌性ウィルス蛋白質であるポリヘトリンの発現シグナルを利用するため、異種 蛋白質を良好な収量で産生ずる。

大量の組換えＨＶＩ及びＨＶＩ２を生成するためのアプローチは、融合ポリペプ チドの発現に基づいているが、この場合、ポリヘトリンの最初の１８個のアミノ 酸をフレーム内でＨＶ　１又はＨＶＩ２の６５個のアミノ酸と結合させる。ポリ ヘトリンのＮＨ２末端配列の存在によって、高レベルの発現が可能になる２０゜ さらに、ポリヘトリン部分とＨＶＩ又はＨＶ１２配列との間に、本発明者らは、 ＣＮＢ　ｒを用いてハイブリッド蛋白質を処理することによってＨＶ　１又はＨ Ｖ１２部分を分離させるメチオニン残基を置いた。

従来のアプローチと同様に、Ｍ２Ｓ−ＨＶＩ又はＭ２Ｓ−ＨＶＩ２からのＢａ　 ｌ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片を適切な転移ベクターに結合させ得る合成りＮＡ断片を 調製した。図１１に示す新規の合成片は、その後の操作のために、ＢａｍＨＩ及 びＢａｌＩ部位をも含む。

ポリヘトリンの最初の１８個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を保有す る別の転移ベクターｐＡｃＦＴ１が得られた（図１２）。要するに、ｐＡｃＹＭ １’のＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩ断片を、ヌクレオチド−９２〜ヌクレオチド＋５ ５のポリヘトリン遺伝子配列を含有する合成オリゴヌクレオチドと置き換えた。

この配列の後に便利なりａｍＨＩ部位が存在し図１３に示した模式図にしたがっ て完全ＨＶ１又はＨＶ１２コード配列を挿入するためにＢａｍＨＩ部位出−を用 いた。この作製を通じて、ｐＡｃＦＴｌ−ＨＶＩ及びｐＡｃＦＴｌ−ＨＶｌ２と 呼ばれる２つの新規のプラスミドを得たが、これはハイフリット遺伝子をバキュ ロウィルスゲノムに転移するのに用いた。

実施例４に記載のようにして、組換えバキュロウィルスを得た。Ｓ、ｆｒｕｇｉ ｐｅｒｄａ細胞の感染は、標準手法１９にしたがって実施した。感染昆虫細胞を 培養すると、融合蛋白質の細胞質蓄積が生じる。このハイブリッド蛋白質は、組 換えＨＶｌ又はＨＶｌ２の供給源であつた。そのハイブリッドをＣＮＢ　ｒで開 裂するために用い得るいくつかの方法が、文献から利用できる　。Ｏ］ｓｏｎら ２２の方法を用いて、正確な２１．２２ ポリペプチド配列のＨＶＩ及びＨＶｌ２を得ることができた。

これら２つの分子は、抗トロンビン活性を示した。

下記の文献は明細書中に引用されたものであるニア）　Ｂｌｏｂｅユ　Ｇ、ａｎ ｄ　Ｄｏｂｂｅｒｓｔａｉｎ　Ｂ、１９７５．　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂ工ｏｌｏｇｙ 、旦ヱ。

１５）　Ｋｒ５ｔｅｎａｎｓｋｙ、　Ｊ、に、、　ａｎｄ　Ｍａｏ、　Ｓ、Ｊ、 Ｔ、　１９８７．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２１１゜Ｄ、Ｈ，Ｌ、　１９８７． 　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６８．　ｐ、　１２３３１９）　Ｓｕｍｍｅ ｒｓ、Ｍ、Ｄ、、ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、Ｇ、Ｅ、１９８７．　Ｔｅｘａｓ　Ａｇ ｒｉｃｕユｔｕｒａｌＰｅｐｔｉｄｅｓ、！、Ｐ、３０１ オリゴ１　融合 Ｓ’　ＧＡＴＣ［ＡＴＧＧ’ｒＴＴ［ＴＴＡＣＡＣＣＧＡｆｆＧＣＡＣＣＧＡＡ ＴＣＴＧＧ　３’オリゴ　２融合 組み立て Ｈト一 要　約 調ンビン活性をもつヒルジン又はヒルジン様ポリペプチド発現される。ヒルジン 様ポリペプチドは、好ましくは、次のアミノ酸配列をもつ、ＨＶＩ及びＨＶ２か らのハイブリッド蛋白質である： Ｈ′ｖ１２： Ｖａ　ｌ　−Ｖａ　ｌ　−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ− ５ｓｒ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ−ＴＡｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ| Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｖａ　１−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ −Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−工１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ａｓｐ −Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−人５ｎ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ −Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−（ここで、下線を施した配列はＨＶ２部分である） 。

国際調査報告 ＰｃｒｍＰＣ丁Ｉｔｓ＾、７１０１１１１＋１９１・Ｉｌ饗−１１Ｍ言１ｗ＋１ ２１１．Ｐｋ１２Ｂαシ１１国際調査報告 ＥＰ　９１００６４３ Ｓ＾　４６２３９

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒルジン又はヒルジン機ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベ クター。
2. ２．ベクターがプラスミドである請求項１記載のベクター。
3. ３．Ｐｔｒｐ及びＰｌｐｐ／ｌａｃプロモーターから選択されるプロモーターが 、操作可能なように前記ＤＮＡ配列に結合されている請求項２記載のベクター。
4. ４．ベクターがウイルスである請求項１記載のベクター。
5. ５．ウイルスが、ポリヘドリンプロモーターが、操作可能なように前記ＤＮＡ配 列に結合されている組換えバキュロウイルスである請求項４記載のベクター。
6. ６．前記ＤＮＡがさらに、前記ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドが発現され る細胞からの前記ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドの分泌を指示し得るリー ダーペプチドをコードする請求項１〜５のいずれか一項に記載のベクター。
7. ７．リーダーペプチドがＯｍｐＡ又はＶＳＶ　Ｇ蛋白質リーダーペプチドである 請求項６記載のベクター。
8. ８．前記ＤＮＡ配列が、前記ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドを放出させる ために切断可能である融合蛋白質をコードし ている請求項１〜５のいずれか一項に記載のベクター。
9. ９．請求項５による場合、前記融合蛋白質が、切断可能な結合２を介してヒルジ ン又はヒルジン様ポリペプチドのＮ−末端と融合するポリヘドリン蛋白質のＮ− 末端部分を含む請求項８記載のベクター。
10. １０．前記ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドが、【配列があります】 （ここで、下線を施し た配列はＨＶ２部分である）である請求項１〜９のいずれか一項に記載の発現ベ クター。
11. １１．請求項１〜１０のいずれか一項に記載の適合可能な発現ベクターで形質転 換された宿主。
12. １２．宿主が細菌である請求項１１記載の宿主。
13. １３．宿主がＥ．ｃｏｌｉ　Ｂ型株である請求項１２記載の宿主。
14. １４．宿主が酵母菌、哺乳類細胞系、昆虫細胞系及び動物から選択される真核宿 主である請求項１１記載の宿主。
15. １５．宿主がＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞系である請求項 １４記載の宿主。
16. １６．ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードする合成ＤＮＡ。
17. １７．前記ＤＮＡがさらに、前記ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドが発現さ れる細胞からの前記ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドの分泌を指示し得るリ ーダーペプチドをコードする請求項１６記載のＤＮＡ。
18. １８．リーダーペプチドがＯｍｐＡ又はＶＳＶ　Ｇ蛋白質リーダーペプチドであ る請求項１７記載のＤＮＡ。
19. １９．前記ＤＮＡ配列が、前記ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドを放出させ るために切断可能である融合蛋白質をコードする請求項１６記載のＤＮＡ。
20. ２０．前記ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドが、請求項１０に記載のＨＶ１ 又はＨＶ１２である請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
21. ２１．ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドが発現されるような条件下に請求項 １１〜１５のいずれか一項に記載の宿主を供給することを包含する、ヒルジン又 はヒルジン様ポリペプチドの製造方法。
22. ２２．請求項１〜１０のいずれか一項に記載の適合可能な発現ベクターで宿主を 形質転換することを包含する、ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドを発現する ことが可能な宿主の製造方法。
23. ２３．前記発現ベクターを、 （ａ）前記ヒルジン又はヒルジン様ポリペプチドをコードするＤＮＡを化学的に 合成すること、及び、（ｂ）前記ＤＮＡを発現ベクター中に挿入することによっ て製造する請求項２２記載の方法。
24. ２４．請求項１０に記載のポリペプチドＨＶ１２又はその誘導体。
25. ２５．医薬上許容可能な担体又は希釈剤、及び、活性成分としての請求項２１に 記載の方法によって生成されたヒルジン又はヒルジン様ポリペプチド又は請求項 ２４に記載のポリペプチドを含有する医薬組成物。