JPH0394677A - アスパラギン酸ラセマーゼの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、合成甘味料や抗生物質などの原料として極め
て有用なＤ−アスパラギン酸の製造に用いられるアスパ
ラギン酸ラセマーゼ（以下ＡＳＰＲと略す）の新規な製
造方法に関するものである。

（従来技術） 従来、ストレブトコッカス　フェー力リス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　ＡＴＣＣ９７５
０）をはじめとして、ストレブトコッカス属（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓＳｐ）　．ラクトバチルス属（Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｓｐ）、ベディオコッカス属
（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　Ｓｐ）、ロイコノストック
属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　Ｓｐ）、ビフィドバクテ
リア属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｓｐ）など
に属する細菌がアスパラギン酸ラセマーゼを生産するこ
とがしられている。

（発明が解決しようとする問題点） しかし、ＡＳＰＲは細菌中で極めて微量にしか生産され
ないため、これまで利用されることはなかった。本発明
者らは、ＡＳＰＲをコードするＤＮＡ配列を持つ発現ベ
クターを含有する微生物を培養することによりＡＳＰＲ
を大量にかつ安価に製造することに成功し、本発明に至
った。

（問題を解決するための手段） 即ち、本発明はＡＳＰＲをコードするＤＮＡ配列を持つ
発現ベクターを含有する微生物を培養することを特徴と
するＡＳＰＨの製造法である。

本発明で用いる発現ベクターは、ＡＳＰＲをコードする
遺伝子を含むＤＮＡ断片と、プロモーター配列を持つベ
クター、いわゆる発現ベクターにジャーナル　オブ　モ
レキュラー　バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）９６、１７１−１
８４　（１９７５）に記載の方法に従い、制限酵素で消
化し、次いでリガーゼを用いて結合することにより調製
することができる。

発現ベクターの性質は、明らかに使用される微生物に依
存している。微生物が、例えば大腸菌である場合、ｐＢ
Ｒ３２２の複製開始点とｔａｃプロモーターを含んでい
るｐＫＫ２２３−３があげられる。

本発明で用いられるＡＳＰＲをコードする遺伝子として
は、微生物の染色体ＤＮＡ由来の遺伝子が挙げられる。

そのなかでも、安定性などからいってストレブトコッカ
ス　サーモフィラスの遺伝子が好ましい。

制限酵素としては、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩな
どがあげられ、リガーゼとしては例えばＴ４リガーゼが
あげられる。　一般に、発現ベクターの正確な構造は、
本発明の本質的特徴を構成しない。

本発明で用いる発現ベクターの例としては、大腸菌を形
質転換する発現ベクターとしてプラスミドｐＫＫ２２３
−３にストレブトコッカスサーモフィラスの染色体ＤＮ
Ａ由来のＡＳＰＲをコードする遺伝子を導入したプラス
ミドｐＡＧ６−２−　１があげられる。

作製したプラスミドで微生物を形質転換する方法はどの
ようなものでもよい。例えば、大腸菌を形質転換するに
は、ジャーナル　オブ　モレキュラー　バ・イオロジ−
５３、１５９−１６２　（１９７０）の方法に従って、
Ｏ℃付近で塩化カルシウム処理した大腸菌と組換えプラ
スミドを接触させることにより行なえばよい。

以上のようにして形質転換された微生物の例として、プ
ラスミドｐＡＧ６−２−１が導入された大腸菌ＮＭ５２
２／ｐＡＧ６−２−１株があげられる。この菌株は公知
の大腸菌ＮＭ５２２と、ＡＳＰＲ生産能とアンビシリン
耐性を有する点以外は、同じ菌学的性質を有している。

この菌体は、非伝達性を伝達性に変えることなく、安全
性が保持されている。

形質転換して得られた菌株を適当な培地で培養すること
によりアスパラギン酸ラセマーゼを製造することができ
る。製造されたアスパラギン酸ラセマーゼは、そのまま
でも、またイオンクロマトグラフィーなどにより精製し
ても、使用することができる。

（発明の効果） 本発明を用いれば、ＡＳＰＲを大量かつ容易に得る事が
できるので、前述したＤ−アスパラギン酸の製造等に非
常に有用である。

次に実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発
明はこれに限定されるものではない。

（実施例） （１）ＡＳＰＲをコードする遺伝子を有するプラスミド
ｐＡＧ６の調製 後述する（６）に記載したのと同様の方法でプラスミド
ｐＡＧ６を導入した大腸菌ＮＭ５２２株を、１００μｇ
　／　ｍ　ｌアンビシリンを含む１１の２ｘＴＹ　（ト
リブトン１６ｇ．酵母エキスｌｏｇ、塩化ナトリウム５
ｇを含む１１の培地）で３７℃で約１２時間培養した。

培養後、菌体を遠心分離により回収し、溶液Ａ（５０ｍ
Ｍグルコース、２５ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、リゾチーム５ｍｇ／ｍ　
１）２　０ｍ　ｌと激しく混合し３０分間放置した。次
に溶液Ｂ　（０．２　ＮＮａＯＨ、１％　ＳＤＳ　（ソ
ディウムドデシルサルフエイト））４０ｍｌを加え、軽
く撹拌し氷上に１０分間放置後蛋白質、染色体ＤＮＡを
含む沈殿を上清と分離した。粗プラスミドを含む上清を
フェノールークロロホルム（１　：　１）抽出にかけ徐
蛋白した後に１１０ｍｌの冷エタノールを加え、−８０
℃３０分間放置後、遠心分離によりプラスミドＤＮＡを
エタノール沈殿として回収した。沈殿を乾燥後、１６ｍ
ｌＴＥ（ｌＯｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、
１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１０ｍｇ／ｍｌリボヌクレアーゼ
Ａ（Ｓｉｇｍａ社製））２００ｕｌを加え、３７℃で３
０分間反応させ、４０ｍｌのエタノールと１．１２ｍｌ
の５ＭＮａＣｌを加え−８０℃で３０分間放置し、ＤＮ
Ａをエタノール沈殿として遠心分離により回収した。ベ
ツレト状のプラスミドを少量のＴＥに溶解し、塩化セシ
ウム（ｌｍｌのプラスミド溶液にＩｇを添加》及び、エ
チジウムブロマイド（１０ｍｌ塩化セシウム溶液に０．
８ｍｌを添加）を加え４５０００ｒｐｍで１２時間超遠
心分離し、Ｃｃ　ｃ　（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ　ｃｌｏ
ｓｅｄ　ｃｉｒｃｕｌａｒ）　Ｄ　Ｎ　Ａのバンドのみ
を回収し、ｎ−ブタノール抽出によりエチジウムブロマ
イドを除去した後、ＴＥに対して充分透析し、精製ｐＡ
Ｇ６を得た。

プラスミドｐＫＫ２２３−３もｐＡＧ６と同様の方法で
調製した。

（２）プラスミドｐＡＧ６のＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ　断
片の調製 （１）で得られたｐＡＧ６　　４０ｕｇを制限酵素Ｈｉ
ｎｄ　　（宝酒造社製）４０Ｕを含む緩衝液（１０ｍＭ
トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．　５）　，　７　ｍＭ　
　ＭｇＣ１２，６０ｍＭ　　ＮａＣ１）３００μ１で３
７℃３時間反応させ、消化したプラスミドＤＮＡに５Ｍ
　　ＮａＣｌ　　ｕｌ，冷エタノール６５０μ１を添加
しエタノール沈殿として回収した。回収したＤＮＡペッ
レトを５０μ１のＴＥに溶解し、４０Ｕの制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ（宝酒造社製）を含む緩衝液（５０ｍＭ　　トリ
スー塩酸（ｐＨ７．９）　、５０ｍＭ　　ＮａＣｌ，５
ｍＭ　　ＭｇＣｌ２、１ｍＭＤＴＴ）３００μ１中で３
７℃一晩反応させ、５ＭＮａＣ１　　　３μｌ、冷エタ
ノール６５０ｕ　１を添加することによって、ＤＮＡを
エタノール沈殿として回収した。このＤＮＡペツレトを
４０μ１のＴＨに溶解し、１％のＬ　Ｍ　Ｐ　（　ｌｏ
ｗ　ｍｅｌｔｉｎｇ　ｐｏｉｎｔ）アガロース（Ｂｉｏ
　Ｒａｄ社製）を用いて４℃において１　００Ｖで２〜
３時間電気泳動を行ない、ＡＳＰＲをコードする遺伝子
を含む１．２キロ塩基対のＨｉｎｄ　　−ＥｃｏＲＩ断
片を分離し、この断片を含むアガロースを切取り、５倍
容量のＴＥを加え６５℃で５分間加熱しアガロースを溶
解した。この溶液を、フェノール抽出２回、フェノール
ークロロホルム（１　：　１）抽出２回、クロロホルム
抽出２回行ないエタノール沈殿としてＤＮＡ断片を回収
した。

（３）プラスミドｐＡＧ６のＨｉｎｄ　　−ＥｃｏＲＩ
断片の平滑末端化 得られたＤＮＡ断片をＩＯＵのＴ４ボリメラーゼを含む
緩衝液（７ｍＭトリスー塩酸（ｐＨ７．４）　．　５　
０ｍＭ　　Ｎ　ａＣ　１、７　ｍ　Ｍ　］ＭｇＣｌ２、
１ｍＭ　　ＤＴＴ％０．０５ｍＭｄ−ＮＴＰ　（Ａ，Ｇ
，Ｃ．Ｔ））６０μ１中で３７℃、１５分間反応させ、
７０℃で５分間処理した後，ＤＮＡをエタノール沈殿と
して回収した。

（４）プラスミドｐＫＫ２２３−３のＳｍａＩ切断とフ
ォスファターゼによる脱リン処理（１）で得られたプラ
スミドｐＫＫ２２３−３２０ｕｇをＳｍａＩ　（宝酒造
社製）２０Ｕを含む緩衝液（６ｍＭ　　トリスー塩酸（
ｐＨ７．８）２０ｍＭ　　ＫＣＩ，６ｍＭ　　ＭｇＣｌ
２，６ｍＭ２−ＭＥ）３００μ１中で３０℃で一晩反応
させ消化した後、５Ｍ　　ＮａＣ１　　３μｌ、冷エタ
ノール６５０μｌを添加しエタノール沈殿として回収し
た。このＤＮＡペッレトをアルカリフォスファターゼ（
ベーリンガー社製）１０Ｕを含む緩衝液（５０ｍＭ｝リ
スー塩酸緩衝液（　ｐＨ８．　０）、１ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ）５００μｌ中で３７℃３０分反応させた後、フェノ
ールークロロホルム（１：１）抽出２回行ないエタノー
ル沈殿として回収した。

（５）平滑末端化したプラスミドｐＡＧ６のＨｉｎｄ　
　−ＥｃｏＲＩ断片のプラスミドｐＫＫ２２３−３　　
ＳｍａＩ部位への導入 （３》で調′製したＡＳＰＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片を
２０μＩ　　ＴＥに溶解し、（４）で調製したベクター
ＤＮＡを４０ＩＬＩ　　ＴＥに溶解した。ＡＳＰＲ遺伝
子を含むＤＮＡ断片溶液４μ１、ベクターＤＮＡ溶液４
μｌをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）７００Ｕを含
む緩衝液（　６　６　ｍ　Ｍ　トリスー塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．６）　、６．６ｍＭ　　ＭｇＣ１２、ｌｏｍＭ　
　ＤＴＴ．１ｍＭＡＴＰ）４０ｕｌ中で４℃で一晩反応
させＤＮＡ断片を連結した。

（６）連結したＤＮＡによる大腸菌ＮＭ５２２の形質転
換 （５）の連結反応の反応液に５ＭＮａＣｌ３μ１、冷エ
タノール１　ｏｏＩＬｌを加えＤＮＡ沈殿させ遠心分離
により回収し、９０μＩＴＥに溶解した。

次に宿主菌の大腸菌ＮＭ５２２を１００ｍｌの２ｘＴＹ
培地で２〜３時間培養し、遠心分離により回収して冷１
００ｍＭ　　ＭｇＣｌ２で洗浄後、冷１００ｍＭ　　Ｃ
ａＣ１２に懸濁し１時間氷上に放置した。次に遠心分離
にまり上清を除去後、冷１００ｍＭ　　ＣａＣ１２　　
５ｍｌに再懸濁し、コンビテントセルとした。

次に連結したプラスミドＤＮＡ溶液９０ＩＬ１とコンビ
テントセル懸濁液２００μ１をＯ℃で混合し、時々撹拌
しながら氷上に６０分おいた後、４２℃で２分間放置し
、氷上で急冷した。

次にこの懸濁液にｌｍｌの２ｘＴＹ培地を加え、３７℃
で１時間培養した後、アンピシリン１００ｕｇ／ｍｌ含
む２ｘＴＹ培地のプレート（寒点１５ｇ／ｌ）に適当に
希釈してブレーティングした。このプレートを３７℃で
１６時間培養し形質転換体を得た。

（７）目的とするプラスミドを保有する形質転換体の選
択 （６）で得られた形質転換体より１８株を選択し、アン
ビシリン含有（１００Ｉｉｇ／ｍｌ）２ｘＴＹ培地２ｍ
ｌで一晩培養し、該株から（１）と同様の方法，に従い
、小スケールで各プラスミドを単離した。これらのプラ
スミドを（２）の方法に従いＢａｍＨＩで消化したとこ
ろ、３つのプラスミドが、４．３ｋｂと１．５ｋｂの２
本のバンドを生じた。また、ｓｐｈ　Ｉで消化したとこ
ろ、３つのプラスミドのうち２つが５．３ｋｂと０．５
ｋｂの２本のバンドを生じた。この２つのプラスミドが
予想されるｐＡＧ６−２−１と同じ構造をもっており、
ｐＡＧ６−２−１であると判断された。

プラスミドｐＡＧ６−２−１の制限酵素切断図を第１図
に示す。

（７）アスパラギン酸ラセマーゼ活性の測定（６）で得
られたｐＡＧ６−２−１とベクターｐＫＫ２２３−３で
形質転換された大腸菌ＮＭ５２２を１１のアンピシリン
とＩＰＴＧ（イソブロビルーβ−Ｄチオガラクトシド）
含有（それぞれｌｏｏＬＬｌ／ｍｌ）２ｘＴＹ培地で３
７℃一晩培養し、７０００ｒｐｍで５分間の遠心分離に
より菌体を回収した。各菌体を５０ｍｌの緩衝液（５０
ｍＭ　　リン酸緩衝液（ｐＨ７．　０）１．４　ｍＭ　
　２−ＭＥ％　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）に懸濁し１０分間
超音波破砕し、１８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し
無細胞抽出液を得た。

その結果を、ＡＳＰＲ生産菌ストレブトコッカス　サー
モフィラスの活性と併記して表１に示す。

この無細胞抽出液をもちいて、以下の方法に従い各酵素
活性を測定した。

また、蛋白質は、ローリーらの方法（ジャーナル　オブ
　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　ｌ
　９　３、２６５　（１９５１））に従って測定した。

＜ＡＳＰＲ活性の測定方法〉 Ｌ−アスパラギン酸からアスパラギン酸ラセマーゼによ
り生成するＤ−アスパラギン酸をＤ−アミノ酸ラセマー
ゼ（Ｓｉｇｍａ社製）により酸化的脱アミノし、生じた
オキサロ酢酸を２、４−ジニトロフエニルヒドラジンと
反応させて、ヒドラゾンを形成せしめ、ヒドラゾの生成
量を定量することで反応速度を決定する。具体的には、
菌体抽質液５０μｌを１５０μ１の反応液（７０μ１　
　１００ｍＭビロリン酸バッフｙ　−　（ｐＨ８．０）
、６０μｌ　　５０ｍＭ　　Ｌ−アスパラギン酸、２０
ｕ１４０ｍｇ／ｍｌ　　Ｄ　一アミノ酸才キシダーゼを
含む）と混ぜ、３０分間、３７℃でインキユベートし、
２、４ジニトロフエニルヒドラゾン塩酸液を加え、３０
分間３７℃でインキユベートし、Ｉ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｏ　
Ｈ溶液を加え更に３０分間３７℃でインキユベートしヒ
ドラゾンの生成を４３５ｎｍの吸光度により測定する。

表−１ （発明の効果） ＡＳＰＲをコードする遺伝子ＤＮＡを、プロモーター配
列を持つベクターに導入して発現ベクターを構築し、適
当な宿主を選択しＡＳＰＲを大量に生産することを可能
にした。この発明により天然のＡＳＰＲ生産菌をもちい
た場合に比べて、はるかに大量にかつ安価にＡＳＰＲを
生産することを可能にした。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例で合成したプラスミドの制限酵素切断図
である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）アスパラギン酸ラセマーゼをコードするＤＮＡ配
   列の発現ベクターを含む微生物を培養することを特徴と
   するアスパラギン酸ラセマーゼの製造方法
2. （２）微生物が、細菌であることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の製造方法
3. （３）細菌が、発現ベクターを構成するプラスミドで形
   質転換された大腸菌であることを特徴とする特許請求の
   範囲第２項記載の製造方法（４）プラスミドが、大腸菌
   の複製開始点を含み、プロモーターｔａｃがアスパラギ
   ン酸ラセマーゼをコードするＤＮＡ配列の転写を促進せ
   しめることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の製
   造方法