CN116083456A - 一种噬菌体繁殖相关基因的基因敲除方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种噬菌体繁殖相关基因的基因敲除方法，所述方法以噬菌体繁殖相关基因为目的基因进行敲除，该方法在筛选基因缺失突变株时使用噬菌体排除野生型菌株的干扰，同时在含有抗生素的LB培养基验证抗生素敏感性，排除单交换子的干扰；所述方法在基因敲除过程中受sacB基因调控的蔗糖敏感性失活后，仍能够筛选出基因缺失突变株。本发明提供了一种在基因敲除过程中受sacB基因调控的蔗糖敏感性失活后，仍可以快速筛选出基因缺失突变株的方法。利用本发明方法得到的基因缺失突变株后，可以与野生型菌株做生物学特性实验进行比对，进一步研究宿主菌和噬菌体的相互作用分子机制。

Description

一种噬菌体繁殖相关基因的基因敲除方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种噬菌体繁殖相关基因的基因敲除方法和应用。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种革兰氏阴性菌，能在土壤，沼泽和沿海海洋环境以及植物和动物组织中生长。铜绿假单胞菌在过去的一个世纪里是一种主要的人类病原体的条件致病菌，是引发烧伤患者感染，导管***患者***，病人使用呼吸器肺炎感染的重要来源，也是囊性纤维化患者发病率和死亡率的主要原因。治疗铜绿假单胞菌引发的感染的常规处理方法为β-内酰胺酶类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类等一种或几种抗生素的使用，然而，随着大量使用抗生素，铜绿假单胞菌表现出耐药性，多重耐药性，乃至泛耐药性。在世界上多数地方，铜绿假单胞菌的耐药率还在逐渐上升，这面临着严重的治疗困境。
噬菌体是一种原核生物的病毒，在自然界中无处不在。一般来说，有原核生物活动的地方都会存在其相对应的噬菌体。法裔加拿大科学家F.d'Herelle第一次提出用噬菌体作为抗菌素药物，并且他的实验结果证明噬菌体治疗是具有广大潜力的。如今，随着抗生素滥用，细菌的耐药性变得愈加严重。噬菌体是一种特异的病毒，拥有高效的裂解效率，宿主的特异性，不易产生耐药性等优势又重新引发人们的关注。
为了研究噬菌体与细菌的相互作用分子机制，敲除细菌上与噬菌体繁殖相关基因是非常有意义的。
利用负选择标记sacB进行反向筛选基因缺失突变株是基因敲除的传统方法。sacB是蔗糖敏感基因，会在含有蔗糖的平板上抑制细菌的生长。其作用机理为：sacB基因编码分泌型蔗糖果聚糖酶，该酶能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并且将果糖聚合成高分子量的果聚糖，高分子量果聚糖的积累对细胞有毒性，会造成细胞死亡。在蔗糖含量为5％及以上时，sacB基因在革兰氏阴性菌中的表达致使细菌死亡。
但是sacB基因极不稳定，易突变失活，使得细胞对蔗糖变得不敏感，在蔗糖的培养基上可以存活，引起基因缺失突变株筛选困难的问题。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种噬菌体繁殖相关基因的基因敲除方法和应用。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种噬菌体繁殖相关基因的基因敲除方法，所述方法以噬菌体繁殖相关基因为目的基因进行敲除，该方法在筛选基因缺失突变株时使用噬菌体排除野生型菌株的干扰，同时在含有抗生素的LB培养基验证抗生素敏感性，排除单交换子的干扰；
所述方法在基因敲除过程中受sacB基因调控的蔗糖敏感性失活后，仍能够筛选出基因缺失突变株。
进一步地，所述噬菌体繁殖相关基因包括噬菌体吸附、注入、复制、包装、裂解过程有关基因；在敲除基因的过程中，利用烈性噬菌体致使其宿主菌裂解的特性，达到筛选噬菌体繁殖相关基因缺失突变株的目的。
进一步地，所述噬菌体繁殖相关基因为基因pilA和/或基因pilB。
进一步地，包括如下步骤：
(1)目的质粒的构建
(2)目的质粒化转进大肠杆菌DH5α并提质粒酶切验证；
(3)目的质粒化转进大肠杆菌S17-1λpir并提质粒酶切验证；
(4)Mating杂交
(5)筛选单交换子
(6)筛选pilA和/或pilB基因缺失突变株
接单交换子于新鲜的液体LB培养基中，37℃，220rpm过夜培养；
将前培养物即过夜培养物12000rpm，1min，离心，弃上清；
用除菌的噬菌体phiH2裂解液重悬菌体，控制MOI在1-10，室温静置吸附30min；
30min后，12000rpm，1min弃上清，用新鲜液体LB培养基重悬；
将重悬混合培养物转移至已经灭菌的试管中，37℃，220rpm处理4h；
涂布于LB固体培养基上，10倍梯度涂布，于37℃过夜培养；
过夜后，用牙签蘸取单菌落同时在LB固体培养基和庆大抗性为80μg/ml的LB固体培养基点板验证；
将在庆大抗性为80μg/ml的LB固体培养基致死，LB固体培养基存活的菌落进行划线纯化；
挑取单菌落用引物进行PCR验证，电泳结果应只呈现一条条带；
挑取单菌落进行spotting验证，spotting结果显示铜绿假单胞菌噬菌体phiH2不敏感；
将该基因缺失突变株即为敲除铜绿假单胞菌的IV型菌毛PilA蛋白编码基因的基因缺失突变株。
进一步地，挑取单菌落用引物U-pilA-F和引物D-pilA-R进行PCR验证，电泳结果应只呈现一条大小为1160bp的条带；
挑取单菌落用引物U-pilB-F和引物D-pilB-R进行PCR验证，电泳结果应只呈现一条大小为1738bp的条带。
进一步地，包括如下步骤：
(1)目的质粒的构建
基因pilA(在Pseudomonas Genome DB(https://www.pseudomonas.com/)PAO1上搜索pilA基因，在Pseudomonas aeruginosa PAK(Cain et al.,2019)对应的基因为PAKAF_RS23895|pilin)全长453bp，敲除时，保留起始密码子ATG，终止密码子TAA，共敲除447bp；
以铜绿假单胞菌PAK基因组为模板DNA，用U-pilA-F和U-pilA-R扩增上游同源臂，用D-pilA-F和D-pilA-R扩增下游同源臂；其中，U-pilA-F的序列为SEQ ID NO.1，U-pilA-R的序列为SEQ ID NO.2，D-pilA-F的序列为SEQ ID NO.3，D-pilA-R的序列为SEQ ID NO.4；
PCR获得的扩增片段，切胶纯化后，将上游同源臂与下游同源臂重组扩增、切胶纯化，获得pilA重组片段纯化产物；
pilA重组片段纯化产物与质粒pEX18Gm用限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切、连接，得到目的质粒；
(2)目的质粒化转进大肠杆菌DH5α并提质粒酶切验证
氯化钙法制备大肠杆菌DH5α的感受态，化学转化法将构建目的质粒化转进DH5α的感受态细胞中，然后使用庆大抗性进行筛选，长出的转化子接菌，提质粒，限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切质粒，凝胶电泳验证质粒与酶切后质粒片段的正确性，将酶切验证正确质粒命名为pLYY2205；
(3)目的质粒化转进大肠杆菌S17-1λpir并提质粒酶切验证
氯化钙法制备大肠杆菌S17-1λpir的感受态，化学转化法将构建质粒pLYY2205化转进S17-1λpir的感受态细胞中，然后使用庆大抗性进行筛选，长出的转化子接菌，提质粒，限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切质粒，凝胶电泳验证质粒与酶切后质粒片段的正确性；
(4)Mating杂交
接S17-1λpir/pLYY2205于庆大抗性，终浓度为1.5μg/ml的液体LB培养基中，接铜绿假单胞菌PAK于液体LB培养基中；
培养到OD600为0.6，8000rpm，10min分别离心，其中S17-1/pLYY2205清洗2-3次洗去庆大抗性，最后用新鲜液体LB培养基重悬；
将S17-1λpir/pLYY2205和PAK混合在一起，8000rpm，10min离心，弃上清，将菌泥刮到牛肉膏蛋白胨固体培养基，37℃培养箱静置培养，培养12-14h；
(5)筛选单交换子
用液体LB培养基吹匀重悬S17-1λpir/pLYY2205和PAK菌泥，将重悬菌液加到含有终浓度为80μg/ml的庆大抗性和终浓度为100μg/ml的氨苄抗性的液体LB培养基中，目的是去除大肠杆菌S17-1λpir/pLYY2205；
37℃，220rpm，培养4h；
4h后，将培养物以8000rpm，10min离心，新鲜液体LB培养基清洗2-3次；
清洗后，将菌泥重悬至液体LB培养基中，10倍梯度稀释，涂布于含有庆大抗性，终浓度为80μg/ml的固体LB培养基上，37℃培养箱静置，过夜培养；
在庆大抗性为80μg/ml的LB固体培养基上挑取单菌落，在庆大抗性为80μg/ml的PIA平板上划线纯化，(铜绿假单胞菌PAK代谢产生绿脓素，在PIA培养基上呈现绿色，颜色比LB培养基上的更明显，和大肠杆菌易于区分)，在PIA固体培养基挑单菌落进行PCR验证；
用噬菌体phiH2和噬菌体K8进行spotting，验证是否是单交换子；
正确的单交换子用引物U-pilA-F和引物D-pilA-R进行PCR验证后，电泳结果应有两条带，一条为1587bp，另一条为1160bp，且spotting结果是对噬菌体phiH2和噬菌体K8敏感的；
(6)筛选pilA基因缺失突变株
接单交换子于新鲜的液体LB培养基中，37℃，220rpm过夜培养；
将前培养物即过夜培养物12000rpm，1min，离心，弃上清；
用除菌的噬菌体phiH2(NCBI接收号为OP361299)裂解液重悬菌体，控制MOI在1-10，室温静置吸附30min；
30min后，12000rpm，1min弃上清，用新鲜液体LB培养基重悬；
将重悬混合培养物转移至已经灭菌的试管中，37℃，220rpm处理4h；
涂布于LB固体培养基上，10倍梯度涂布，于37℃过夜培养；
过夜后，用牙签蘸取单菌落同时在LB固体培养基和庆大抗性为80μg/ml的LB固体培养基点板验证；
将在庆大抗性为80μg/ml的LB固体培养基致死，LB固体培养基存活的菌落进行划线纯化；
挑取单菌落用引物U-pilA-F和引物D-pilA-R进行PCR验证，电泳结果应只呈现一条大小为1160bp的条带；
挑取单菌落进行spotting验证，spotting结果显示铜绿假单胞菌噬菌体phiH2不敏感；
将该基因缺失突变株命名为PAK/ΔpilA，即得敲除铜绿假单胞菌的IV型菌毛PilA蛋白编码基因的基因缺失突变株。
如上所述的方法在宿主菌和噬菌体的相互作用分子机制研究方面中的应用。
本发明取得的有益效果是：
1、本发明提供了一种在基因敲除过程中受sacB基因调控的蔗糖敏感性失活后，仍可以快速筛选出基因缺失突变株的方法。本发明在筛选基因缺失突变株时使用噬菌体可以排除野生型菌株的干扰，同时在含有抗生素的LB培养基验证抗生素敏感性，排除单交换子的干扰。利用本发明方法得到的基因缺失突变株后，可以与野生型菌株做生物学特性实验进行比对，进一步研究宿主菌和噬菌体的相互作用分子机制。
2、为了克服sacB基因易突变导致的蔗糖敏感性失活问题，在筛选基因缺失突变株时引入噬菌体作为一个筛选条件，来排除部分单交换子和野生型的干扰。本发明所需要解决的技术问题是敲除噬菌体繁殖相关基因，这些基因在噬菌体吸附、注入、复制、包装、裂解等过程中起到一定作用。在敲除过程中，需要宿主菌对应噬菌体的辅助。构建的基因缺失突变株会对其相应噬菌体敏感性表型出现变化。
3、本发明以噬菌体繁殖相关基因为目的基因进行敲除，包括噬菌体吸附、注入、复制、包装、裂解等过程有关基因。在敲除基因的过程中，利用烈性噬菌体致使其宿主菌裂解的特性，达到筛选噬菌体繁殖相关基因缺失突变株的目的。本发明对噬菌体繁殖相关基因的研究，能够更好地理解噬菌体侵染宿主菌和宿主菌对噬菌体的抗性机制。同时理解噬菌体与其宿主菌之间相互作用的分子机制，对于噬菌体治疗具有重要的指导意义。
4、本发明中敲除了铜绿假单胞菌噬菌体phiH2的宿主菌铜绿假单胞菌PAK的pilA基因，pilA基因缺失突变株PAKΔpilA失去了对噬菌体phiH2的敏感性。本发明中也敲除了铜绿假单胞菌噬菌体phiH2的宿主菌铜绿假单胞菌PAK的pilB基因，pilB基因缺失突变株PAKΔpilB失去了对噬菌体phiH2的敏感性。
5、本发明方法是一种噬菌体辅助的基因敲除方法，适用于噬菌体繁殖相关基因，可以推广到所有噬菌体繁殖相关基因的敲除。本发明方法中噬菌体对要敲除基因的菌株敏感，可以去除野生型的干扰。该方法适用于所有噬菌体繁殖相关基因的研究。
6、本发明方法中宿主菌对应噬菌体作为一种筛选条件，在筛选时处理掉全部的野生型菌株和部分单交换子。通过构建重组质粒，对野生型菌株进行基因敲除实验，在敲除过程中，利用噬菌体的筛选，得到基因缺失突变株。对基因缺失突变株进行spotting实验，以野生型菌株为对照组，进一步证实敲除的基因与噬菌体繁殖相关。
附图说明
图1为本发明中目的基因pilA的上下游同源臂的回收产物梯度稀释电泳图；其中，1至11依次分别为：1-5000DNAmarker；2-6：pilA的上游同源臂回收产物，浓度依次是原液、1/2稀释度、1/4稀释度、1/8稀释度、1/16稀释度；7-11：pilA的下游同源臂回收产物，浓度依次是原液、1/2稀释度、1/4稀释度、1/8稀释度、1/16稀释度；12-16依次分别为：pilB的上游同源臂回收产物，浓度依次是原液、1/2稀释度、1/4稀释度、1/8稀释度、1/16稀释度；17-21依次分别为：pilB的下游同源臂回收产物，浓度依次是原液、1/2稀释度、1/4稀释度、1/8稀释度、1/16稀释度；
图2为本发明中pilA目的基因重组片段EcoRI、KpnI酶切回收产物梯度稀释电泳图；其中，1至6依次分别为：1-5000DNAmarker；2-6：pilA的同源重组片段酶切回收产物，浓度依次是原液、1/2稀释度、1/4稀释度、1/8稀释度、1/16稀释度；
图3为本发明中pEX18Gm经EcoRI、KpnI酶切回收产物梯度稀释电泳图；其中，1至6分别为：1-5000DNAmarker；2-6：pEX18Gm酶切回收产物，浓度依次是原液、1/2稀释度、1/4稀释度、1/8稀释度、1/16稀释度；
图4为本发明中pilA单交换子PCR验证电泳图；其中，pilA1、3-7、9-15、23依次分别为：pilA-1单交换子；pilA-3至pilA-7单交换子；pilA-9大肠杆菌S17-1(非pilA基因缺失的单交换子)；pilA-10至pilA-15单交换子；pilA-23单交换子；
图5为本发明中pilA单交换子phiH2 spotting图；
图6为本发明中pilA双交换子PCR验证电泳图；其中，PAK、pilA-3、pilA-I至pilA-IV依次分别为：PAK为野生型菌株、pilA-3单交换子、pilA-I至pilA-IV双交换子；
图7为本发明中pilA双交换子phiH2 spotting图；
图8为本发明中pilB目的基因重组片段EcoRI、KpnI酶切回收产物梯度稀释电泳图；其中，1至6依次分别为：1-5000DNAmarker；2-6：pilB的同源重组片段酶切回收产物，浓度依次是原液、1/2稀释度、1/4稀释度、1/8稀释度、1/16稀释度；
图9为本发明中pilB单交换子PCR验证电泳图；其中，pilB-2、9-10、19-21依次分别为：pilB-2单交换子；pilB-9至pilB-10单交换子；pilB-19至pilB-21单交换子；
图10为本发明中pilB单交换子phiH2 spotting图；
图11为本发明中pilB双交换子PCR验证电泳图；其中，PAK、pilB-2、pilA-I至pilA-II依次分别为：PAK为野生型菌株、pilB-2单交换子、pilB-I和pilB-II为双交换子；
图12为本发明中pilB双交换子phiH2 spotting图。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
一种噬菌体繁殖相关基因的基因敲除方法，所述方法以噬菌体繁殖相关基因为目的基因进行敲除，该方法在筛选基因缺失突变株时使用噬菌体排除野生型菌株的干扰，同时在含有抗生素的LB培养基验证抗生素敏感性，排除单交换子的干扰；
所述方法在基因敲除过程中受sacB基因调控的蔗糖敏感性失活后，仍能够筛选出基因缺失突变株。
较优地，所述噬菌体繁殖相关基因包括噬菌体吸附、注入、复制、包装、裂解过程有关基因；在敲除基因的过程中，利用烈性噬菌体致使其宿主菌裂解的特性，达到筛选噬菌体繁殖相关基因缺失突变株的目的。
较优地，所述噬菌体繁殖相关基因为基因pilA和/或基因pilB。
较优地，包括如下步骤：
(1)目的质粒的构建
(2)目的质粒化转进大肠杆菌DH5α并提质粒酶切验证；
(3)目的质粒化转进大肠杆菌S17-1λpir并提质粒酶切验证；
(4)Mating杂交
(5)筛选单交换子
(6)筛选pilA和/或pilB基因缺失突变株
接单交换子于新鲜的液体LB培养基中，37℃，220rpm过夜培养；
将前培养物即过夜培养物12000rpm，1min，离心，弃上清；
用除菌的噬菌体phiH2裂解液重悬菌体，控制MOI在1-10，室温静置吸附30min；
30min后，12000rpm，1min弃上清，用新鲜液体LB培养基重悬；
将重悬混合培养物转移至已经灭菌的试管中，37℃，220rpm处理4h；
涂布于LB固体培养基上，10倍梯度涂布，于37℃过夜培养；
过夜后，用牙签蘸取单菌落同时在LB固体培养基和庆大抗性为80μg/ml的LB固体培养基点板验证；
将在庆大抗性为80μg/ml的LB固体培养基致死，LB固体培养基存活的菌落进行划线纯化；
挑取单菌落用引物进行PCR验证，电泳结果应只呈现一条条带；
挑取单菌落进行spotting验证，spotting结果显示铜绿假单胞菌噬菌体phiH2不敏感；
将该基因缺失突变株即为敲除铜绿假单胞菌的IV型菌毛PilA蛋白编码基因的基因缺失突变株。
较优地，挑取单菌落用引物U-pilA-F和引物D-pilA-R进行PCR验证，电泳结果应只呈现一条大小为1160bp的条带；
挑取单菌落用引物U-pilB-F和引物D-pilB-R进行PCR验证，电泳结果应只呈现一条大小为1738bp的条带。
较优地，包括如下步骤：
(1)目的质粒的构建
基因pilA(在Pseudomonas Genome DB(https://www.pseudomonas.com/)PAO1上搜索pilA基因，在Pseudomonas aeruginosa PAK(Cain et al.,2019)对应的基因为PAKAF_RS23895|pilin)全长453bp，敲除时，保留起始密码子ATG，终止密码子TAA，共敲除447bp；
以铜绿假单胞菌PAK基因组为模板DNA，用U-pilA-F和U-pilA-R扩增上游同源臂，用D-pilA-F和D-pilA-R扩增下游同源臂；其中，U-pilA-F的序列为SEQ ID NO.1，U-pilA-R的序列为SEQ ID NO.2，D-pilA-F的序列为SEQ ID NO.3，D-pilA-R的序列为SEQ ID NO.4；
PCR获得的扩增片段，切胶纯化后，将上游同源臂与下游同源臂重组扩增、切胶纯化，获得pilA重组片段纯化产物；
pilA重组片段纯化产物与质粒pEX18Gm用限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切、连接，得到目的质粒；
(2)目的质粒化转进大肠杆菌DH5α并酶切验证
氯化钙法制备大肠杆菌DH5α的感受态，化学转化法将构建目的质粒化转进DH5α的感受态细胞中，然后使用庆大抗性进行筛选，长出的转化子接菌，提质粒，限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切质粒，凝胶电泳验证质粒与酶切后质粒片段的正确性，将酶切验证正确质粒命名为pLYY2205；
(3)目的质粒化转进大肠杆菌S17-1λpir并酶切验证
氯化钙法制备大肠杆菌S17-1λpir的感受态，化学转化法将构建质粒pLYY2205化转进S17-1λpir的感受态细胞中，然后使用庆大抗性进行筛选，长出的转化子接菌，提质粒，限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切质粒，凝胶电泳验证质粒与酶切后质粒片段的正确性；
(4)Mating杂交
接S17-1λpir/pLYY2205于庆大抗性，终浓度为1.5μg/ml的液体LB培养基中，接铜绿假单胞菌PAK于液体LB培养基中；
培养到OD600为0.6，8000rpm，10min分别离心，其中S17-1λpir/pLYY2205清洗2-3次洗去庆大抗性，最后用新鲜液体LB培养基重悬；
将S17-1λpir/pLYY2205和PAK混合在一起，8000rpm，10min离心，弃上清，将菌泥刮到牛肉膏蛋白胨固体培养基，37℃培养箱静置培养，培养12-14h；
(5)筛选单交换子
用液体LB培养基吹匀重悬S17-1λpir/pLYY2205和PAK菌泥，将重悬菌液加到含有终浓度为80μg/ml的庆大抗性和终浓度为100μg/ml的氨苄抗性的液体LB培养基中，目的是去除大肠杆菌S17-1λpir/pLYY2205；
37℃，220rpm，培养4h；
4h后，将培养物以8000rpm，10min离心，新鲜液体LB培养基清洗2-3次；
清洗后，将菌泥重悬至液体LB培养基中，10倍梯度稀释，涂布于含有庆大抗性，终浓度为80μg/ml的固体LB培养基上，37℃培养箱静置，过夜培养；
在庆大抗性为80μg/ml的LB固体培养基上挑取单菌落，在庆大抗性为80μg/ml的PIA(铜绿假单胞菌PAK代谢产生绿脓素，在PIA培养基上呈现绿色，颜色比LB培养基上的更明显，和大肠杆菌易于区分)平板上划线纯化，在PIA固体培养基挑单菌落进行PCR验证；
用噬菌体phiH2和噬菌体K8进行spotting，验证是否是单交换子；
正确的单交换子用引物U-pilA-F和引物D-pilA-R进行PCR验证后，电泳结果应有两条带，一条为1587bp，另一条为1160bp，且spotting结果是对噬菌体phiH2和噬菌体K8敏感的；
(6)筛选pilA基因缺失突变株
接单交换子于新鲜的液体LB培养基中，37℃，220rpm过夜培养；
将前培养物即过夜培养物12000rpm，1min，离心，弃上清；
用除菌的噬菌体phiH2(NCBI接收号为OP361299)裂解液重悬菌体，控制MOI在1-10，室温静置吸附30min；
30min后，12000rpm，1min弃上清，用新鲜液体LB培养基重悬；
将重悬混合培养物转移至已经灭菌的试管中，37℃，220rpm处理4h；
涂布于LB固体培养基上，10倍梯度涂布，于37℃过夜培养；
过夜后，用牙签蘸取单菌落同时在LB固体培养基和庆大抗性为80μg/ml的LB固体培养基点板验证；
将在庆大抗性为80μg/ml的LB固体培养基致死，LB固体培养基存活的菌落进行划线纯化；
挑取单菌落用引物U-pilA-F和引物D-pilA-R进行PCR验证，电泳结果应只呈现一条大小为1160bp的条带；
挑取单菌落进行spotting验证，spotting结果显示铜绿假单胞菌噬菌体phiH2不敏感；
将该基因缺失突变株命名为PAK/ΔpilA，即得敲除铜绿假单胞菌的IV型菌毛PilA蛋白编码基因的基因缺失突变株。
如上所述的方法在宿主菌和噬菌体的相互作用分子机制研究方面中的应用。
具体地，相关的制备及检测如下：
以敲除铜绿假单胞菌的IV型菌毛PilA蛋白编码基因敲除筛选双交换为例，说明本发明的的具体实施方式。
材料与方法：
菌株、噬菌体和质粒：
实验中所用到的菌株、噬菌体与质粒，具体见表1，实验中所用到的引物，具体见表2。
表1菌株、噬菌体和质粒说明
Figure BDA0003854020490000101
Figure BDA0003854020490000111
GmR，庆大霉素抗性。
[1]BRADLEY T J,KHAN N H.The production of extracellular lipids byPseudomonas Aeruginosa NCTC 2000in stationary liquid media containingmacrogols[J].Journal of Pharmacy&Pharmacology,2011,26(11):900-2.
[2]Simon R,Priefer U,Puhler A.A Broad Host Mobilization System for inVivo Genetic Engineering:Transposon Mutagenesis in Gram-Negative Bacteria[J].Bio/Technolgy,1983,1(9):37-45.
[3]LINGYAN L,HONGJIANG Y,SHUXIANG L,et al.Classification of 17newlyisolated virulent bacteriophages of Pseudomonas aeruginosa[J].RevueCanadienne De Microbiologie,2010,56(11):925-33.
表2pilA引物序列说明
Figure BDA0003854020490000112
实施例1
1、目的质粒的构建
基因pilA(在Pseudomonas Genome DB(https://www.pseudomonas.com/)PAO1上搜索pilA基因，在Pseudomonas aeruginosa PAK(Cain et al.,2019)对应的基因为PAKAF_RS23895|pilin)全长453bp，敲除时，保留起始密码子ATG，终止密码子TAA，共敲除447bp。
以铜绿假单胞菌PAK基因组为模板DNA，用U-pilA-F和U-pilA-R扩增上游同源臂，用D-pilA-F和D-pilA-R扩增下游同源臂。
扩增体系为：
Figure BDA0003854020490000121
扩增程序为：
Figure BDA0003854020490000122
55℃扩增pilA的上游同源臂。
62℃扩增pilA的下游同源臂。
pilA的上游同源臂长度为398bp，pilA的下游同源臂长度为762bp。
PCR获得的扩增片段，用0.8％琼脂糖凝胶电泳切胶，利用Vazyme公司的
Figure BDA0003854020490000124
Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒进行纯化。
切胶纯化后，2倍稀释度稀释，电泳确定同源重组所用的合适稀释度。
用Vazyme公司的
Figure BDA0003854020490000125
MultiS One Step Cloning Ki同源重组酶将上游同源臂与下游同源臂重组。
Figure BDA0003854020490000123
pilA的上游同源臂1/4稀释度取1μl，pilA的下游同源臂1/4稀释度取1.5μl，如图1所示。
重组体系为：
反应程序：37℃水浴30min，之后立即置于冰上冷却，冷却时间应大于5min，基因重组完成。
用引物U-pilA-F和引物D-pilA-R，PCR大量扩增重组片段，扩增后0.8％琼脂糖凝胶电泳切胶纯化。
重组片段长度为1160bp。
提取pEX18Gm质粒备用。
pilA重组片段纯化产物与质粒pEX18Gm用限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切，限制性内切酶EcoRI和KpnI来自TaKaRa。
酶切体系及反应条件遵循TaKaRa产品说明书。
酶切产物各自切胶纯化(Vazyme回收试剂盒)，2倍稀释度稀释，0.8％琼脂糖凝胶电泳确定连接所用的合适稀释度。
用SolutionI进行连接，SolutionI来自TaKaRa。
连接体系：
Figure BDA0003854020490000131
注：总体积不超过20μl
pilA重组片段酶切回收产物取原液1.2μl，pEX18Gm酶切回收产物取原液1.5μl，如图2、图3所示，加等体积的SolutionI 2.7μl，总体积5.4μl。
2、目的质粒化转进大肠杆菌DH5α并酶切验证
氯化钙法制备大肠杆菌DH5α的感受态。
化学转化法将构建质粒化转进DH5α的感受态细胞中。
取5μl连接产物加入100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞中，混匀后冰浴30min。
混合液于42℃水浴热激45s，立刻冰上放置1-2min。
加入800μl新鲜LB液体培养基，37℃，220rpm培养1h后，取100μl培养液在在含有庆大抗性，终浓度为3μg/ml的LB培养基上涂布，37℃过夜培养。
挑取转化子单菌落接种于含有庆大抗性，终浓度为1.5μg/ml的液体LB培养基中，37℃振荡，过夜培养，提取转化子质粒，用限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳验证质粒的正确性。
将酶切验证正确质粒命名为pLYY2205。
3、目的质粒化转进大肠杆菌S17-1λpir并酶切验证
氯化钙法制备大肠杆菌S17-1λpir的感受态。
化学转化法将构建质粒化转进S17-1λpir的感受态细胞中。
取5μl质粒pLYY2205加入200μl大肠杆菌S17-1λpir感受态细胞中，混匀后冰浴30min。
混合液于42℃水浴热激45s，立刻冰上放置1-2min。
加入800μl新鲜LB液体培养基，37℃，220rpm培养1h后，取100μl培养液在在含有庆大抗性，终浓度为3μg/ml的LB培养基上涂布，37℃过夜培养。
挑取转化子单菌落接种于含有庆大抗性，终浓度为1.5μg/ml的液体LB中，37℃振荡，过夜培养，提取转化子质粒，用限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳验证质粒的正确性。
4、Mating杂交
接S17-1λpir/pLYY2205于庆大抗性，终浓度为1.5μg/ml的液体LB培养基中，接铜绿假单胞菌PAK于液体LB培养基中。
将S17-1λpir/pLYY2205和铜绿假单胞菌PAK的过夜培养物分别以3％转接量转接到300ml与100ml的新鲜液体LB培养基中。
养到OD600约为0.6，8000rpm，10min分别离心，其中S17-1/pLYY2205清洗2-3次洗去庆大抗性，最后用新鲜液体LB培养基重悬。
将S17-1λpir/pLYY2205和PAK混合在一起，8000rpm，10min离心，弃上清，将菌泥刮到牛肉膏蛋白胨固体培养基，37℃培养箱静置培养，培养12-14h。
5、筛选单交换子
用1ml液体LB培养基吹匀重悬S17-1λpir/pLYY2205和PAK的混合菌泥。将重悬菌液加到含有庆大抗性(终浓度为80μg/ml)和氨苄抗性(终浓度为100μg/ml)的100ml液体LB培养基中，目的是去除大肠杆菌S17-1λpir/pLYY2205。
37℃，220rpm，培养4h。
4h后，将培养物以8000rpm，10min离心，新鲜液体LB培养基清洗2-3次。
清洗后，将菌泥重悬至1ml的液体LB中，10倍梯度稀释，涂布于含有庆大抗性，终浓度为80μg/ml的固体LB培养基上，37℃培养箱静置，过夜培养。
在庆大抗性为80μg/ml的LB固体培养基上挑取单菌落，在庆大抗性为80μg/ml的PIA平板上划线纯化，目的是纯化单菌落(铜绿假单胞菌PAK代谢产生绿脓素，在PIA培养基上呈现绿色，颜色比LB培养基上的更明显，和大肠杆菌易于区分)。在PIA固体培养基挑单菌落，于庆大抗性为80μg/ml的LB液体培养基中，过夜培养，取菌液进行PCR验证。
PCR验证结果如图4所示，pilA-1、pilA-3至pilA-7、pilA-10至pilA-15、pilA-23这13株菌菌液PCR后，电泳结果呈现2条带，一条在1000bp上下，另一条在1500bp上下。敲除pilA基因的单交换子应该具有2条带，一条带为野生型菌株条带长度即未缺失pilA基因，条带大小为1587bp，另一条带为pilA缺失，条带大小为1160bp。pilA-1、pilA-3至pilA-7、pilA-10至pilA-15这13株菌PCR结果符合预计大小，是单交换子。而pilA-9的PCR验证结果只有1条带，大小为1160bp，是双交换的条带，但是该菌长于庆大抗性为80μg/ml的平板上，不可能是PAK的双交换，双交换子应该不带庆大抗性，在庆大抗性为80μg/ml的培养基上不生长，推测该菌是大肠杆菌S17-1/pLYY2205。虽然大肠杆菌携带质粒pEX18Gm，其庆大抗性通常为3ug/ml，但是在庆大抗性为80μg/ml的培养基上经常分离到大肠杆菌。
接下来可以用噬菌体phiH2和噬菌体K8进行spotting，进一步验证是否是单交换子。
单交换子的spotting结果应该是对噬菌体phiH2和噬菌体K8敏感的，如图5所示，野生型PAK对噬菌体phiH2和噬菌体K8是敏感的，而单交换子基因组上有一条链和野生型基因组相同，对噬菌体phiH2和噬菌体K8也应该是敏感的，图中pilA单交换子，用phiH2和K8做spotting，出现和野生型表型一致的透明圈，证明pilA单交换子对噬菌体phiH2和噬菌体K8敏感，符合预期结果。
6、筛选pilA基因缺失突变株
接单交换子于5ml新鲜的液体LB培养基中，37℃，220rpm过夜培养。
将前培养物吸取100μl，12000rpm，1min，离心，弃上清。
用1ml除菌的噬菌体phiH2裂解液重悬菌体，控制MOI在1-10，室温静置吸附30min。
30min后，12000rpm，1min弃上清，用1ml新鲜液体LB培养基重悬。
将重悬混合培养物转移至已经灭菌的试管中，37℃，220rpm处理4h。
涂布于LB固体培养基上，10倍梯度涂布，于37℃过夜培养。
过夜后，用牙签蘸取单菌落同时在LB固体培养基和庆大抗性为80μg/ml的LB固体培养基点板验证。
单交换子在液体LB培养基中培养，有概率成为基因缺失突变株或者回复为野生型菌株。单交换子基因组上含有庆大基因，对硫酸庆大霉素耐受，而基因缺失突变株和野生型菌株会因为对庆大霉素敏感而庆大抗性致死。
将在庆大抗性为80μg/ml的LB固体培养基致死，LB固体培养基存活的菌落进行划线纯化。
挑取单菌落于LB液体培养基中，过夜培养，取菌液用引物U-pilA-F和引物D-pilA-R进行PCR验证，电泳结果应只呈现一条大小为1160bp的条带。
如图6所示，野生型PAK有1条带，大小为1578bp；pilA-3为单交换子，有2条带，一条带大小为1587bp，另一条带大小为1160bp；pilA-I至pilA-IV有且只有1条带，条带大小和单交换子的第2条条带1160bp大小一致，说明pilA-I至pilA-IV已经完全敲除了pilA基因。
同时进行spotting验证，spotting结果进一步验证是否完全敲除pilA基因。
如图7所示，野生型PAK对噬菌体phiH2是敏感的，而双交换子(即基因缺失突变株)对噬菌体phiH2表现为不敏感，phiH2 spotting后没有出现透明圈。这是由于基因缺失突变株敲除了pilA基因，pilA基因是phiH2受体相关基因，敲除后造成噬菌体phiH2无法识别受体蛋白，使得phiH2对基因缺失突变株不敏感，spotting后没有透明圈。
将该基因缺失突变株命名为PAK/ΔpilA。
至此完成了筛选噬菌体繁殖相关基因缺失突变株的全过程。
实施例2
噬菌体phiH2辅助敲除pilB基因，pilB基因编码IV菌毛PilB蛋白。
pilB所用到的引物(质粒和菌见表1。)
表3 pilB引物序列说明
Figure BDA0003854020490000161
基因pilB(PAKAF_RS23900，来自Pseudomonas Genome DB(https://www.pseudomonas.com/)Pseudomonas aeruginosa PAK(Cain et al.,2019))全长1701bp，敲除时，保留起始密码子ATG，和末尾174bp，共敲除1524bp。
敲除过程同pilA基因基本一致，不同之处如下：
pilB的PCR扩增程序：
Figure BDA0003854020490000171
62℃扩增pilB的上游同源臂。
65℃扩增pilB的下游同源臂。
pilB的上游同源臂长度为684bp，pilB的下游同源臂长度为1054bp。
同源重组时，pilB的上游同源臂1/8稀释度取1.4μl，pilB的下游同源臂1/8稀释度取2.1μl，如图1所示。
pilB重组片段酶切回收产物取原液1.8μl，pEX18Gm酶切回收产物取原液1.5μl，如图3、图8所示，加等体积的SolutionI 3.3μl，总体积6.6μl。
回收纯化过程、同源重组、酶切、酶切回收、SolutionI连接过程反应条件同pilA一致，酶切过程用到的限制性内切酶均为EcoRI和KpnI。
PCR验证结果如图9所示，pilB-2、pilB-9、pilB-10、pilB-19至pilB-21这6株菌菌液PCR后，电泳结果呈现2条带，一条在1500bp和2000bp之间，另一条在3000bp和5000bp之间。敲除pilB基因的单交换子应该具有2条带，一条带为野生型菌株条带长度即未缺失pilB基因，条带大小为3242bp，另一条带为pilB缺失，条带大小为1738bp。pilB-2、pilB-9、pilB-10、pilB-19至pilB-21这6株菌PCR结果符合预计大小，是单交换子。
接下来可以用噬菌体phiH2和噬菌体K8进行spotting，进一步验证是否是单交换子。
单交换子的spotting结果应该是对噬菌体phiH2和噬菌体K8敏感的，如图10所示，野生型PAK对噬菌体phiH2和噬菌体K8是敏感的，而单交换子基因组上有一条链和野生型基因组相同，对噬菌体phiH2和噬菌体K8也应该是敏感的，图中pilB单交换子，用phiH2和K8做spotting，出现和野生型表型一致的透明圈，证明pilB单交换子对噬菌体phiH2和噬菌体K8敏感，符合预期结果。
挑取单菌落于LB液体培养基中，过夜培养，取菌液用引物U-pilB-F和引物D-pilB-R进行PCR验证，电泳结果应只呈现一条大小为1738bp的条带。
如图11所示，野生型PAK有1条带，大小为3242bp；pilB-2为单交换子，有2条带，一条带大小为1738bp，另一条带大小为3242bp；pilB-I和pilB-II有且只有1条带，条带大小和单交换子的第2条条带1728bp大小一致，说明pilB-I和pilB-II已经完全敲除了pilB基因。
同时进行spotting验证，spotting结果进一步验证是否完全敲除pilB基因。
如图12所示，野生型PAK对噬菌体phiH2是敏感的，而双交换子(即基因缺失突变株)对噬菌体phiH2表现为不敏感，phiH2 spotting后没有出现透明圈。这是由于基因缺失突变株敲除了pilB基因，pilB基因同样是phiH2受体相关基因，敲除后造成噬菌体phiH2无法识别受体蛋白，使得phiH2对基因缺失突变株不敏感，spotting后没有透明圈。
将该基因缺失突变株命名为PAK/ΔpilB。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (6)

1.一种噬菌体繁殖相关基因的基因敲除方法，其特征在于：所述方法以噬菌体繁殖相关基因为目的基因进行敲除，该方法在筛选基因缺失突变株时使用噬菌体排除野生型菌株的干扰，同时在含有抗生素的LB培养基验证抗生素敏感性，排除单交换子的干扰；
所述方法在基因敲除过程中受sacB基因调控的蔗糖敏感性失活后，仍能够筛选出基因缺失突变株。
2.根据权利要求1所述的噬菌体繁殖相关基因的基因敲除方法，其特征在于：所述噬菌体繁殖相关基因包括噬菌体吸附、注入、复制、包装、裂解过程有关基因；在敲除基因的过程中，利用烈性噬菌体致使其宿主菌裂解的特性，达到筛选噬菌体繁殖相关基因缺失突变株的目的。
3.根据权利要求1所述的噬菌体繁殖相关基因的基因敲除方法，其特征在于：所述噬菌体繁殖相关基因为基因pilA和/或基因pilB。
4.根据权利要求1至3任一项所述的噬菌体繁殖相关基因的基因敲除方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)目的质粒的构建
(2)目的质粒化转进大肠杆菌DH5α并提质粒酶切验证；
(3)目的质粒化转进大肠杆菌S17-1λpir并提质粒酶切验证；
(4)Mating杂交
(5)筛选单交换子
(6)筛选pilA和/或pilB基因缺失突变株
接单交换子于新鲜的液体LB培养基中，37℃，220rpm过夜培养；
将前培养物即过夜培养物12000rpm，1min，离心，弃上清；
用除菌的噬菌体phiH2裂解液重悬菌体，控制MOI在1-10，室温静置吸附30min；
30min后，12000rpm，1min弃上清，用新鲜液体LB培养基重悬；
将重悬混合培养物转移至已经灭菌的试管中，37℃，220rpm处理4h；
涂布于LB固体培养基上，10倍梯度涂布，于37℃过夜培养；
过夜后，用牙签蘸取单菌落同时在LB固体培养基和庆大抗性为80μg/ml的LB固体培养基点板验证；
将在庆大抗性为80μg/ml的LB固体培养基致死，LB固体培养基存活的菌落进行划线纯化；
挑取单菌落用引物进行PCR验证，电泳结果应只呈现一条条带；
挑取单菌落进行spotting验证，spotting结果显示铜绿假单胞菌噬菌体phiH2不敏感；
将该基因缺失突变株即为敲除铜绿假单胞菌的IV型菌毛PilA蛋白编码基因的基因缺失突变株。
5.根据权利要求4所述的噬菌体繁殖相关基因的基因敲除方法，其特征在于：挑取单菌落用引物U-pilA-F和引物D-pilA-R进行PCR验证，电泳结果应只呈现一条大小为1160bp的条带；
挑取单菌落用引物U-pilB-F和引物D-pilB-R进行PCR验证，电泳结果应只呈现一条大小为1738bp的条带。
6.如权利要求1至5任一项所述的方法在宿主菌和噬菌体的相互作用分子机制研究方面中的应用。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101003790A (zh) * 2007-01-17 2007-07-25 辽宁大学 一种抗噬菌体的重组棒杆菌及其构建方法
CN102154188A (zh) * 2010-12-22 2011-08-17 中国人民解放军第三军医大学 大肠杆菌DH5α的nfi基因敲除突变株及其制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101003790A (zh) * 2007-01-17 2007-07-25 辽宁大学 一种抗噬菌体的重组棒杆菌及其构建方法
CN102154188A (zh) * 2010-12-22 2011-08-17 中国人民解放军第三军医大学 大肠杆菌DH5α的nfi基因敲除突变株及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUANHUA XUAN等: "Expression of a Phage-Encoded Gp21 Protein Protects Pseudomonas aeruginosa against Phage Infection", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 96, no. 5, 31 March 2022 (2022-03-31), pages 5 *
姚榕: "水稻黄单胞菌感染噬菌体必需基因的筛选及其在致病中的作用", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑, no. 1, 15 January 2021 (2021-01-15), pages 47 *
段怀洋等: "金黄色葡萄球菌感染的治疗新策略—噬菌体", 青海畜牧兽医杂志, vol. 51, no. 1, 31 December 2021 (2021-12-31), pages 58 *

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