JP3592326B2 - ユビキチン特異的プロテアーゼ - Google Patents
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Description
発明の背景
ユビキチン（Ub）は高度に保存された76残基の蛋白質であり、真核細胞において、非常に様々な蛋白質と共有的に結合しているか、又は、フリーの状態で存在している。ユビキチンと他の蛋白質との、翻訳後の結合は、Ub結合（E2）酵素のファミリーにより触媒され、受容蛋白質のLys残基のεアミノ基とユビキチンのＣ端側のGly残基の間のイソペプチド結合の形成を含む。ユビキチンの機能の一つは、選択的に分解される蛋白質をマークすることである。ユビキチンはまた、一時的に（翻訳と同時に）特定のリボゾーム蛋白質と共有結合することによりリボゾームサブユニットの会合を促進するという意味において、シャペロン機能を持つことが示されている。
翻訳後に形成される枝別れしたUb蛋白質結合体と違い、直鎖状のUb蛋白質誘導体は、天然のまたは遺伝子工学で設計された融合遺伝子の翻訳産物として形成される。よって、例えばパン酵母（Saccharomyces cerevisiae）において、ユビキチンは、直鎖状ポリユビキチン蛋白質 Ubi4のようにユビキチン自身に結合しているか、ハイブリッド蛋白質 Ubi1−Ubi3のように関係ないアミノ酸配列と結合している前駆体がタンパクプロセッシングを受けることによってもっぱら生成される。増殖中の酵母細胞において、ユビキチンは、ほとんど、その"tails（尾）”が特異的リボゾーム蛋白質であるUbi1−Ubi3前駆体から産生される。ポリユビキチン（UBI4）遺伝子は増殖している細胞ではなくてもすむが、ストレスのあいだは（ユビキチンの主な供給源として）不可欠になる。成熟ユビキチンをコードしている遺伝子の欠如と、酵母のユビキチン前駆体の融合構成物は他の真核生物においても同様に同定されている。
ユビキチンを、その直鎖状、または分枝状の結合物から分離できる、Ub特異的、ATP非依存的プロテアーゼは、調べた限り全ての真核細胞で検出されたが、大腸菌（Escherichia coli）のような、ユビキチンとユビキチン特異的な酵素のないバクテリアでは検出されない。ミラー（Miller）ら、Biotechnology1,:698−704（1989）は、YUH1と名付けられた、ユビキチンをその比較的短いＣ端側の配列からは分離するが、Ub−β−ガラクトシダーゼ（Ubβgal）のような大きな融合体には事実上不活性な、Ub特異的なプロテアーゼをコードするパン酵母（S.cerevisiae）遺伝子をクローニングした。ウィルキンソン（Wilkinson）ら、Science 246:670−673（1989）は、また、酵母Yuh1プロテアーゼの哺乳類ホモログをコードするcDNAをクローニングした。トビアスとファルシャフスキー（Tobias and Varshavsky）,J.Biol.Chem.266:12021−12028（1991）は、UBP1と名付けられた、Yuh1プロテアーゼやその他の知られている蛋白質に似ていないアミノ酸配列を有するUb特異的プロセッシングプロテアーゼをコードする、他の酵母遺伝子をクローニングし、その機能を解析して報告した。YUH1とその他の種で知られているホモログと違って、Ubp1は、大きさやＮ端側ユビキチン伸長物には関係なく融合蛋白質からユビキチンを分離する。
発明の概要
本発明は、ユビキチン融合蛋白質の大きさに関係なく、ユビキチン融合蛋白質のＣ端側のユビキチン部位を特異的に開裂するユビキチン特異的プロテアーゼの属の種類に関する。より具体的には、本発明は細胞から単離されたこの種類のユビキチン特異的プロテアーゼに関する。本発明は、また、この種類のプロテアーゼをコードする単離されたDNA配列に関する。
ユビキチン特異的プロテアーゼの有用な特性の一つは、それらが、ユビキチン分離位置に隣接している、Ｃ端側伸長物の残基に関係なく、その伸長物から、ユビキチンを分離することにある。Ubpプロテアーゼのこの特性は、in vivo、またはin vitroで、予め定められたＮ端側の残基を有する蛋白質やペプチドを発生させる、バイオテクノロジーと基礎研究の両方に応用できる方法を可能にする。
【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドpJT60を示した図である。
図２は、プラスミドpJTUPを示した図である。
図３は、UBP2の制限酵素地図を示した図である。
図４は、UBP3の制限酵素地図を示した図である。
発明の詳細な説明
本明細書中で使用する、ユビキチン融合蛋白質とは、ユビキチンや、ユビキチンの機能的ホモログが、そのＣ末端アミノ酸残基でユビキチン以外の蛋白質やペプチドのＮ末端アミノ酸残基と融合したものからなる融合蛋白質として定義される。後述する実施例で述べるように、ユビキチン融合蛋白質は、天然に見い出される融合蛋白質、または組換えDNA技術によって産生された融合蛋白質である可能性もある。その特異的な分離は、in vivo、またはin vitroのどちらでも、ユビキチンのＣ末端残基と、蛋白質やペプチドのＮ末端残基の間に位置する。
本明細書中に開示されているユビキチン特異的プロテアーゼの種類と比較して、先に単離されたYUH1酵素は、融合物の非ユビキチン蛋白質が比較的短かい場合（約60残基より短かい場合）にのみ、ユビキチン融合蛋白質からユビキチンを解離させる。このことから、例えば、薬学的に重要な蛋白質の多くは60残基よりはるかに長いため、YUH1プロテアーゼは、ユビキチンとこれらの蛋白質のユビキチン融合物からのユビキチンの解離に使うことはできない。しかしながら、本明細書中に開示されている種類のプロテアーゼは、この目的のために使うことができ、そのために、大きな、または小さな、そして蛋白質やポリペプチドやペプチド（蛋白質やポリペプチドやペプチドという用語は、当技術分野において、しばしば互換的に用いられる）のＮ末端においても要求される残基を産生できる。
本発明に関係するユビキチン特異的プロテアーゼの種類のメンバーである、３つのプロテアーゼをコードするDNA配列を、後の実施例において示した。これらのプロテアーゼはUBP1とUBP2とUBP3に分類された。これらのプロテアーゼをコードするDNA配列と、これらから推定したアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号No3−４、配列番号No5−６、配列番号No7−８に示した。本明細書中に開示されている、これらのプロテアーゼをコードするDNA配列は、後に示す方法によって単離され、またポリメラーゼチェーン反応増幅法（PCR）を利用することによって、先にあげたDNA配列を決定した。
プロテアーゼUBP1とUBP2は、in vivo,in vitroのどちらでも活性を示すが、UBP3プロテアーゼはin vivoでのみ、活性を示す。これらのプロテアーゼはそれぞれ約120キロダルトンの分子量を持つユビキチン融合蛋白質を特異的に解離することが示されている（ユビキチン−メチオニン−β−ガラクトシダーゼ）。対して、YUH1ユビキチン特異的酵素は、in vivo,in vitroのどちらでも、このユビキチン融合物に対しては、事実上、不活性である。この120キロダルトンの融合蛋白質をコードするDNA配列は、配列番号No1に示されている。そのアミノ酸配列は、配列番号No1−２に示されている。
本発明の範囲は、ユビキチン特異的プロテアーゼをコードしている単離されたDNA配列またはその生物学的に活性な部分を含み、それは厳密な（ストリンジェントな）ハイブリダイゼーションの条件下で、配列番号No3、配列番号No5、配列番号No7に示されているDNA配列と特異的にハイブリダイズできることを特徴とする。列挙された配列と厳密なハイブリダイゼーションの条件下でハイブリダイズするDNA配列は、列挙された配列と完全に相補するか、相同性が高いかのどちらかである。本明細書中で使用される相同性とは、列挙された配列とは違うが、その相違が、コードしているプロテアーゼの生物学的な活性（即ち、開裂の性質）には実質的には影響しないDNA配列を意味している。厳密なハイブリダイゼーションの条件となる組み合わせの一つは、45℃で、50％ホルムアミド、５×SSPE（１×SSPEは、0.15mM NaCl,1mM Na−EDTA,10mM リン酸ナトリウム,ph7.0）、５×デンハルト溶液（0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％フィコール）である。
本発明の範囲に入る、単離されたDNA配列は、真核細胞、または原核細胞どちらの宿主細胞においても大量のコードされているプロテアーゼの発現に使用できる。この目的のために、DNAは、適当な制御信号とともに、真核細胞または原核細胞の発現ベクターに組み込まれ、細胞のトランスフォームに使用される。様々なベクターと制御信号がこの目的のために先に開発されており、当業者にはよく知られている。
後の例で述べられるように、本発明のプロテアーゼは、全細胞蛋白質の実質的比率に相当する程度まで大腸菌（E.coli）で高発現された。そのような大きな割合を占めるレベルまで発現された蛋白質の精製およびそのための簡単なアッセイ系の確立は、当業者にとって、簡単なことである。
単離されたUBP1やUBP2や、組み替えDNA発現ベクターから産生されたUBP1やUBP2を含む細胞抽出液は、in vitroでユビキチンをユビキチン融合蛋白質から分離するために使用することができる。細胞抽出液は、培養細胞を単に遠心して、溶解することで組み替えDNA発現ベクターを発現している宿主細胞の培養物から調製できる。細胞溶解液を、ひきつづいて上記に記載されたようにさまざまな程度の精製により処理することができる。in vitroでの開裂のために適当な条件は、日常的実験を越える実験をしなくても、後述の実施例で提供される情報から、当業者により経験的に決定できる。
加えて、UBP1やUBP2やUBP3プロテアーゼは,in vivoで融合蛋白質を脱ユビキチンするためにも使用できる。例えば、これらのプロテアーゼをコードしている発現ベクターを保持する原核細胞はユビキチン融合蛋白質をコードしている発現ベクターで形質転換が可能である。そのような細胞は、予め定めたＮ−末端アミノ酸残基を有する脱ユビキチンされた産生物を産生するだろう。大腸菌（E.coli）のような原核細胞有機体において組み替え蛋白質を産生することにはよく知られている有利な点がたくさんある。
ユビキチンではない蛋白質やペプチドとユビキチンのいくつかの融合物において、ユビキチン部分の存在は、ユビキチンではない蛋白質やペプチドの機能的活性を、修飾したり阻害したりする。この場合、ユビキチン部分を解離するユビキチン特異的プロテアーゼと、対応するユビキチン融合物とを接触させることにより、in vivoまたはin vitroで、いつでも要求される時に本来の機能を回復させうる、非ユビキチン蛋白質やペプチドの機能的な活性の暫定的阻害物（または修飾物）としてユビキチンを使用できる。
本発明は以下の実施例によりさらに例示される。
実施例１ UBP1のクローニングと分析
スクリーニングのための酵母ゲノムcDNAライブラリーと ライセートの調製
酵母（S.cerevisiae）のゲノムライブラリーで形質転換された大腸菌（HB101株）をsib選択法に使用したRB237ライブラリーは、酵母ゲノムDNAをSau III Aで部分消化し、酵母／大腸菌シャトルベクターYCp50のテトラサイクリン耐性遺伝子（TetR）中のBamH I部位に接続して作成した。初期分析では、このライブラリーは平均約19kbのインサートをもっていた。
上記のライブラリーで形質転換された大腸菌は、ルリア培地（LB）とアンピシリン（Amp）（100μg/ml）を含む寒天上に、１プレートにつき約生存細胞40の密度で播いた。プレートは36℃で16時間インキュベートした。そして、コロニーはLB/Ampプレート何枚かに複製した。もとのプレートは４℃で保存しレプリカは36℃で24時間培養した。それぞれの複製プレートは、すべてのコロニーが液中に移りなくなるまで繰り返し洗浄して、1mlのLB/Amp（50μl/ml）に溶出させた。溶出液全量を4mlのLB/Ampに加え、ローラードラム上で36℃で一晩インキュベートした。
これらのオーバーナイト培養液中の大腸菌（静止期）を溶菌させた。それぞれの培養液を1.7mlずつ氷上のマイクロ遠心チューブに入れ、４℃で12,000×ｇで１分間遠心した。沈殿した細胞に25％スクロース（W/V）、250mM トリス−塩酸（pH8.0）を50μｌ加え、高速ボルテックスをかけ再懸濁した。10μｌの新たなリゾチーム液（0.25M トリス−塩酸（pH8.0）中、10ng/mlに調製したニワトリ卵白リゾチーム（シグマ））を加え、軽くボルテックスして撹拌した。この懸濁液を５分間氷冷し、150μｌの75mM EDTA,0.33Mトリス−塩酸（pH8.0）を加え、軽くボルテックスして混合し、そしてチューブをときどき混ぜながら５分間氷冷した。１μｌの10％トリトンＸ−100（ピアーズ）をそれぞれのチューブに加え、ピペットで混合した。細胞ライセートは12,000×ｇ、４℃で15分間遠心した。上清を取って氷上に置き、沈殿は除去した。
標識基質の調製
細胞ライセートは3535Sで標識した基質を用いてUb特異的タンパク分解酵素活性を測定した。35Sで標識されたユビキチンメチオニンジニヒドロ葉酸還元酵素（Ub−Met−DHFR）は次のように調製した:50μg/mlアンピシリンを加えたLB（50ml）に、IPTGで誘導でき、高い活性をもつlacプロモーター誘導体でUb−Met−DHFR融合タンパク質を発現するプラスミドを含む大腸菌JM101の一晩培養して飽和したもの1mlを接種した。細胞はA600が約0.9になるまで37℃で振とうしながら増殖させた。培養物を氷上で15分冷し、3000×ｇで５分遠心し、０℃でM9塩で２回洗った。最後の洗浄の後、0.2％グルコース、1.8μg/mlチアミン、40μg/mlアンピシリン、1mM IPTG、0.0625％（W/V）メチオニンアッセイ培地（Difco）を添加した25mlのM9塩に細胞を再懸濁した。懸濁物は、37℃で１時間振とうし、1mCiの35S−トランスラベル（ICN）を加え、振とうしながら５分間インキュベートして標識した。標識なしのＬ−メチオニンを最終濃度0.0032％（W/V）加え、細胞をさらに10分間振とうした細胞を収穫し（3000×g,5分）、冷却したM9塩で一度洗った。M9で洗浄した後、沈殿細胞を0.5mlの25％スクロース、50mMトリス−塩酸（pH8.0）に再懸濁し、５分間氷冷した。この間に、ニワトリ卵白リゾチーム（Sigma）を250mMトリス−塩酸（pH8.0）に10mg/mlの濃度で新たに溶解した。10μｌのリゾチーム液を細胞懸濁液に加え、混合し、０℃で５分間置いた。５μｌの0.5M EDTA（pH8.0）を加え、ときどき混ぜながら懸濁液を０℃で５分間置いた。細胞懸濁液を、0.975mlの65mM EDTA（pH8.0）、50mMトリス−塩酸（pH8.0）、それぞれ25μl/mlのプロテアーゼ阻害剤、アンチパイン、キモスタチン、ロイペプチン、アプロチニン、ペプスタチンの入った遠心チューブに加えた。10mlの10％トリトン Ｘ−100（Pierce）を加え、ピペットで分散させた。このライセートを39,000×ｇで30分遠心した。上清を取り、液体窒素で急速に凍結し、−85℃で保存した。
35標識Ub−Met−DHFRのアフィニティー精製のために、メトトレキセート（MTX）アガロースアフィニティーマトリックスをカウフマンの方法（Met.Enzymol.34,272−281（1974）で調製した。ベッド容積0.5mlのカラムにMTX−アガロースをつめ、10mlのMTXカラム緩衝液（20mMヘペス,pH7.5,1mM EDTA,200mM NACl,0.2mM ジチオスレイトール（DTT））で洗った。前述の35S標識上清を解かし、MTX−アガロースカラムに通した。カラムは2Mの尿素を含む50mlのMTXカラム緩衝液で洗浄し、再度50mlのMTXカラム緩衝液で洗浄した。標識したUb−Met−DHFRは葉酸溶出緩衝液（0.2Mほう酸カリウムpH9.0,1M KCl,1mM DTT,1mM EDTA,10mM葉酸）で次のように溶出した。溶出緩衝液を1mlづつカラムに通し、1mlずつの分画をあつめた。溶出液分画の35S放射活性を即死、大きな放射活性のピークを含む分画を分離した。プールした書く分画は、40mMトリス−塩酸（非明らか7.5）、1mM MgCl2,0.1mM EDTA,50％グリセロールを含む保存緩衝液を２回交換して、約20時間透析した。精製した35S表Ub−Met−DHFRをSDS−PAGEで分析し、フルオログラフィーを行って、95％を越える純度であることを見いだした。
脱ユビキチンアッセイ
細胞ライセートのUb特異的なプロテアーゼ活性を測定するため、９μｌの細胞ライセート上清を１μｌのアフィニティー精製した35S標識Ub−Met−DHFR融合タンパク質と、0.5mlのマイクロ遠心チューブの中で混合し、36℃で３時間インキュベートした。次に３倍濃度の電気泳動サンプル緩衝液（30％グリセロール、３％SDS（W/V）、15mM EDTA、0.2M ２−メルカプトエタノール、0.3μg/mlブロムフェノールブルー、375mMトリス−塩酸（pH6.8）を加え、それぞれのチューブを浴中で３分間煮沸した。サンプルを10％ポリアクリルアミド−SDSゲルにのせ、ブロムフェノールブルーの色素がゲルの下端にとどくまで50Vで電気泳動した。ゲル中の標識丹野放射活性の位置をフルオログラフィーで視覚化した。ゲルを10％酢酸、25％メタノールで15分間洗浄し、水中で15分間すすぎ、オートフルオール（National Diagnostics）で１時間インキュベートした。次にゲルを真空下80℃で乾燥させ、遮光カセット中でコダックXAR−５フィルムにあて、−85℃で一晩放置した。
上記ので脱ユビキチンアッセイを、ゲル分析でライセートがユビキチン−DHFR結合部でプロテアーゼ活性が働くことを示すまで、異なった形質転換大腸菌からのライセートで繰り返した。このアッセイはもとのLB/Ampプレート（ライセートはここから由来している）上の約40コロニーのうち少なくとも一つがUb特異的なプロテアーゼ活性を与える酵母DNAインサートをもつYCp50に基づくプラスミドを含むことを示していた。
RBP1遺伝子をクローニングするためのこのsibセレクション法の次の段階は、ポジティブプールの約40コロニーのうちどれが希望のプラスミドを含むか決定するため、同様なUb−Met−DHFR開裂アッセイを行うことであった。そのため、プレート上の目体のコロニーをLB/Ampに接種し、一晩培養した。Ub−Met−DHFR開裂アッセイは、正確に上記のように繰り返したが、今回のそれぞれのライセートサンプルは約40個の形質転換大腸菌の混合物ではなく、単一クローンの形質転換大腸菌の代表である。この分析によりUb−DHFR結合部を特異的に開裂する活性を与えるプラスミドを含む単一コロニーがつきとめられた。
UBP−１のクローニングと塩基配列の分析
はじめに分離されたプラスミド（pJT55）の分析は、YCp50ベクター中の約15kbの酵母ゲノムDNAを示していた。このプラスミドをSph I分解して得られた、約14kbの断片をベクターpUC19にサブクローニングすると、同様のプロテアーゼ活性を示した。このプラスミドをpJT57とした。この約14kbの断片をSph IとXho Iで切断して、約5.5kbのインサートDNAを分離し、それをSph IとSal Iで予め切断したpUCベクターにサブクローニングした。これにより、もとのプラスミドと同様のUb特異的プロテアーゼ活性を与える約5.5kbの酵母DNAインサートをもつ約8.1kbのプラスミドpJT60が得られた。
プラスミドpJT60中の制限酵素認識部位を示す地図を図１に示す。地図上で、認識部位の後に示したカッコつきの数字により塩基対の位置が示されている。pJT60中の酵母DNAインサートは、インサートをより小さなＡ、Ｂ二つの断片（423塩基と5830塩基）に分けるKpn Iサイトを中央部分に含んでいた。この断片の中で白矢印はUBP1のオープンリーディングフレーム（ORF）を示す。ORF全体と、それを囲む薄い線は配列番号３中に示された塩基配列が決定されたDNAの範囲を示す。どちらの断片も、pUC19にサブクローニングし、pJT60AとpJT60Bを得た。断片ＡはpJT57をKpn IとＰは出切断した後に分離した。その断片を同じ制限酵素で切断したpUC19にサブクローニングした。断片ＢはKpn IとXho Iで切断したpJT57から分子理、Kpn IとSal Iで切断したpUC19にサブクローニングした。pJT60AもpJT60BもUBP1特異的なプロテアーゼ活性を与えなかった。この結果は、目的の遺伝子はpJT60の約5.5kbインサートのKpn Iサイトに跨がっていることを示している。
クローニングされた遺伝子の配列を決定するため、pJT60AとpJT60BをM13mp19ファージベクターにサブクローニングした。塩基配列は（チェーンターミネーター法）で、pJT60の内部のKpn Iサイトから両方向に配列決定した。このKpn Iサイトはそこから両方向にのびるオープンリーディングフレーム中に存在していることが判明した。デールら（Dale et al.,Plasmid 13:31−40（1989）の方法により、シークエンス用テンプレートに一方向の削除を行い、完全なオープンリーディングフレームを決定した。ORFの5'末端はＢ断片中にあり、終止コドンはＡ断片中にあた。ORFは2427塩基の長さであり、分子量93kDaの809アミノ酸のタンパク質をコードしていた。決定されたORFはpJT60をAcc Iで切断して、5'末端の突出をKlenow pol Iで埋め、Sal Iリンカーを平滑末端にライゲーションして2.8kbの断片上に分離した。この構築物をSal IとBamH Iで消化し、2.8kbの断片を電気泳動で精製し、Sal IとBamH Iで消化したpUC19にライゲーションした。この結果得られたプラスミドをpJT70とした。このプラスミドは、大腸菌を形質転換させたときには、YCp50中のもとの約15kbのインサート、またはpJT70の約2.8kbの断片を含むpJT60プラスミドの約5.5kbインサートと同程度のUb特異的プロテアーゼ活性を与えることができた。プラスミドpJT60は、ATCC（Rockville MD）に寄託され、ATCC番号68211を付与された。2.8kbの断片は、有意な長さの他のオープンリーディングフレームを含まず、配列番号３中のORFは、Ub特異的プロテアーゼをコードしていた。この新しい遺伝子をUbiquitin−specific ｐroteaseから、UBP1と名付けた。
UBP1の基質特異性
UBP1がコードする生産物の試験管中での基質特異性は、様々な基質を用いて分離を調べることによって、検討された。これらの実験では、［35S］Ub−Met−DHFRと［35S］ユビキチン−メチオニン−βガラクトシダーゼ（［35S］Ub−Met−βgal）に対する、Ubp1の脱ユビキチン化活性が示された。［35S］ユビキチン−メチオニン−βガラクトシダーゼ融合蛋白質の作成は既に文献に記載されている バッハマイヤー（Bachmair et al.）Science 234:179−186（1986））。これらの標識された基質は、上記のようにして脱ユビキチンアッセイに用いられた。どちらの融合蛋白質も特異的に脱ユビキチン化された。これらの脱ユビキチン実験の電気泳動のパターンのフルオログラムにより、予想どうりの分子量の脱ユビキチン反応生成物が示された。
Ubp1プロテアーゼは、in vitroで酵母のリボゾーム蛋白質に融合した天然ユビキチン（Ubi2およびUbi3）の脱ユビキチンも示した。酵母（S.cerevisiae）の天然ユビキチン−リボゾーム蛋白質であるUbi2をコードする発現コンストラクトを大腸菌の形質転換に使用した。形質転換された細胞の培養物の細胞抽出液をUbp1を発現している大腸菌抽出液で処理し、ポリアクリルアミド−SDS−ゲルで電気泳動し、ポリビニリデンジフルオリド膜上にブロッティングし、アルカリフォスファターゼを結合させたヤギ抗ウサギ二次抗体およびアルカリフォスファターゼの発色基質を適用して、ウサギ抗ユビキチン抗体を使用して検出した。これらの実験からUbp1遺伝子産物を発現している大腸菌の抽出液は効果的に天然のユビキチン蛋白質Ubi2およびUbi3を脱ユビキチン化することが示された。
Ｎ末端に伸長物を有するユビキチン部分をもつサンドイッチタイプのユビキチン融合蛋白質がUbp1の基質かどうか決定するため、Ｎ端部分のジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）およびグリシン残基３つおよびセリンからなる適応性のあるリンカー領域に続いてユビキチンとMet−βgal部分を有する三重融合蛋白質をコードするプラスミドを構築した。マウスDHFR遺伝子はUb−Met−DHFR（Bachmair and Varshavsky）Cell 56:1019−1032（1989）をコードするプラスミドからBamH I/Hind III断片として単離した。この断片は、クレノウポリメレースＩで末端を埋め、Kpn Iリンカーをつないだ。その断片をKpn Iで切断して678bpの断片をつくり、これをユビキチン部分の２番目のコドンがKpn Iサイトをコードするように変えられている、修正Ub−Met−βgal発現ベクター（Gonda et al.,J.Biol.Chem 264:16700−16712（1989）のKpn Iサイトにクローニングした。その結果得られたプラスミドはDHFRと開始コドンMetのないユビキチンとMet−βgalをコードするが、それぞれの蛋白質の部分のオープンリーディングフレームが、単一のオープンリーディングフレーム中に並べられていない。オープンリーディングフレームの通った配列にし、ベクター中のGALプロモーターに対して正しい位置にてDHFRの開始コドンを存在させるため、プラスミドの中の２ヵ所で部位特異的突然変異誘発を行った。
即ち、プラスミドをBamH IとHnd IIIで切断し、DHFR、ユビキチンおよびMet−βgalの最初の数残基をコードする約2.76kbの断片を同じ酵素で切断したM13mp19にクローニングした。オリゴヌクレオチドを使った部位特異的突然変異誘発は、１本鎖M13誘導体を用い標準的な方法で行った。１つ目のオリゴヌクレオチドはベクターのGAL5プロモーターに関連して適切な位置に、DHFRの開始コドンを入れるために、20bpの欠失を作るように作成された。２つめのオリゴヌクレオチドはDHFRとユビキチンにリーディングフレームを与えDHFRとユビキチンの間に４残基のスペーサー（Gly−Gly−Gly−Ser−）を導入するように作成された。変異形成の後、DNAクローンはチェーンターミネーター法を使用した直接的ヌクレオチドシークエンスによって、２つの変異を確認した。
目的のM13クローンの二本鎖複製型分子（RF）を単離して、BamH I,Xho Iで切断した。その結果得られた約1.2kbの断片は、同じ酵素で切断した、Ub−Met−βgal発現ベクターの約9.87kb断片中にクローニングし、Ub−Metコーディング断片を部位特異的突然変異誘発によって作成したDHFR−Ub−Met断片と組み替えた。この最後の工程により、三重融合体DHFR−Ub−Met−βgalをコードする発現ベクターが生じた。このベクターをpJTUP（図２）と名づけた。
pJTPは、２つの非ユビキチン部分の間に位置するユビキチン融合蛋白質がUbp1による開裂の基質となるかどうか検討するために使用された。［35S］メチオニンで代謝的に標識された大腸菌で発現されたDHFR−Ub−Met−βgalの運命は、β−ガラクトシダーゼに対するモノクローナル抗体での免疫沈降、引き続くポリアクリルアミド−SDSゲル電気泳動およびフルオログラフィーを用いて、Ubp1の存在下、非存在下で決定された。これらの実験により、UBP1が効率的にそのような３重融合蛋白質を開裂することを立証した。
そのようなサンドイッチ構造物を開裂する特性は、はじめの非ユビキチン部分が何らかの望ましい特徴をサンドイッチユビキチン融合蛋白質に与える状況では特に有用である。例えば、はじめの非ユビキチン部分は、ユビキチン融合蛋白質のアフィニティー精製に役立つ可能性がある。そのような場合には、融合蛋白質をユビキチン特異的プロテアーゼをもたない細胞（例えば大腸菌）で発現させて、細胞ライセートをもとの非ユビキチン部分に特異的なアフィニティーカラムを通過させることができる。アフィニティー精製に有用な蛋白質の一つの例はストレプトアビジンである。融合蛋白質をアフィニティー精製の次に、ユビキチン特異的プロテアーゼと接触させる。それにより、二番目の非ユビキチン部分はサンドイッチユビキチン融合蛋白質から遊離される。
実施例２ UBP2とUBP3のクローニングと解析
クローニング方法
Ubp1とYuh1以外の酵母（S.Cerevisiae）のUb特異的プロテアーゼをコードする遺伝子をクローニングするために行った方法は、大腸菌（E.cli）のようなバクテリアはUb特異的プロテアーゼとユビキチンを欠失していることを利用し、また、in vivoでの蛋白質の半減期とそのＮ−末端の残基の間の関係、Ｎ−末端法則は、真核細胞のみならず大腸菌（E.coli）でも同様に適用されるという最近の証明に基いている。真核細胞において、β−ガラクトシダーゼのようなテスト蛋白質とのユビキチン融合物は、Ub−βgal結合部の残基の種類に関係なくUb特異的分解プロテアーゼにより脱ユビキチンされるので、その他の点で同等のテスト蛋白質のＮ−末端の種々の残基をin vivoで露出することが可能になる。真核細胞におけるＮ−末端法則の検出と分析が要求されるこの技術は、UBP1で形質転換された大腸菌（E.coli）はユビキチン融合物を脱ユビキチンする能力を要求することから、酵母のUBP1遺伝子（例１参照）の単離のためにバクテリアでも適用できるようになった。Arg−βgalのようなＸ−βgalテスト蛋白質は大腸菌（E.coli）で短命であるのに、Ub−Arg−βgalは長命であるという発見は、Ub特異的プロテアーゼを大腸菌（E.coli）によりin vivoでスクリーニングする新しい方法を可能にした。βgalのクロモジェニックな基質であるＸ−Galを含むプレート上では、（長命の）Ub−Argβgal融合蛋白質を発現する大腸菌はブルーコロニーを形成する。しかしながら、もし細胞内に脱ユビキチン活性も存在するなら、Ub−Argβgalは、短命なArg−βgalに変換され、その低い定常レベルのためＸ−Galを含むプレート上で白い大腸菌（E.coli）コロニーをつくる。
慣用的な酵母のゲノミックDNAライブラリーを使用してこの技法によるクローニングを可能にするため、酵母遺伝子は、大腸菌（E.coli）で機能するプロモーター（酵母のプロモーターの少数はそのように機能できる）を有しなければならず、そのコーディング領域のイントロンを欠失していて（ほとんどの酵母遺伝子はイントロンを欠失している）、モノマーまたはホモオリゴマーとして機能するUb特異的プロテアーゼをコードしていなければならない。前に使用したUBP1をもたらしたin vitroスクリーンに優る、このin vivoスクリーンの有用性の一つは、これが、関連プロテアーゼがin vivoで活性であることを要求するが、必ずしもin vitoroで（大腸菌（E.coli）抽出液で）活性であることを要求しないことである。
ユビキチン含有テスト蛋白質の発現プラスミド
Ub−Arg−βgalを発現するpACUb−Ｒ−βgalプラスミドを構築するため、GAL10プロモーターの下流のUb−Arg−βgalコーディング領域を含むpUB23−Ｒ（バッハマイヤーら（Bachmair et al.）Science 234:179−186（1986））の〜5kbのSca Iフラグメントを、Hinc IIで切ったpACYC184（P15A複製オリジンがあるため、pMB1（ColE1−）に基づいたpUC19やpBR322のような大腸菌（E.coli）ベクターと相容性である）にサブクローニングした。pACUb−Ｒ−βgalは、大腸菌（E.coli）中で、弱い構成的なプロモーターとして働くガラクトース誘導性酵母GAL10プロモーターから、Ub−Arg−βgalを発現した。Ub−Met−βgalを発現する、pACUb−Ｍ−βgalプラスミドは、pUB23−ＲのかわりにpUB23−Ｍが使用された以外は、pACUb−Ｒ−βgalと同様に構築された。pKKUB−I2とpKKUB I3とpUB17は、大腸菌（E.coli）中で、ベクターpKK223−３のイソプロピルチオガラクトシド（IPTG）で誘導されるプロモーター（アスベル（Ausubel ey al.）Current Protocols in Molecular Biology,J.Wiley＆ Sons,N.Y.（1989））を利用して、天然の酵母ユビキチン融合物（ユビキチン前駆体）Ubi2,Ubi3,Ubi4（ポリユビキチン）をそれぞれ発現する（Ozkaynak et al.EMBO J.6:1429−1439（1987））。それぞれにヒトのジユビキチンとトリユビキチン（そのどちらも天然にシステインの１残基Ｃ−末端付加がおきている）を発現する、pKKHUb2とpKKHUb3プラスミドは、以下のように構築された。プラスミpB8.3由来のヒトUbB（トリユビキチン）遺伝子を含む1.77kbBamH Iフラグメントを、pUC19のポリリンカーのSma IサイトにUbBの3'末端が隣接しているような向きで、BamH I切断したpUC19にライゲートしてpUbBとした。UbBをコードしている領域と、その3'側領域を含むpUbBの1.04kbのDra I/Sma Iフラグメント（Dra IサイトはUbBスタートコドンの10bp上流に位置する）を、Sma I/Hinc II切断したpUC19に、UbBスタートコドンがポリリンカーのEcoR Iサイト側に隣接しているような向きで、サブクローニングし、pHUb3とした。このプラスミドをSal Iで部分消化し、これにより各Ubコーディングリピート内の一箇所を切断した（ポリリンカーサイトのSal Iサイトは、pHUb3を構築する際に除去された）。二つのUbコーディングリピートを保持しているフラグメントを有するベクターを単離し、セルフライゲーションして、pHUb2を得た。pHUb2とpHUb3のインサートを、EcoR IとPst Iで切り出し、EcoR I/Pst Iで切断されたpKK223−３にサブクローニングして、それぞれpKKHUb2とpKKHUb3を得た。これらのプラスミドのUbコーディング領域の開始コドンは、pKK223−３のシャインダルジャーノ配列の36bp下流にある。
スクリーニングの結果
Ub−Arg−βgalを発現するプラスミドを有する大腸菌（E.coli）を、YCp50プラスミドに組込まれているS.cerevisiaeのゲノミックDNAライブラリーRB237で形質転換させ、両方のプラスミドが存在するかを選択する抗生物質を含んだＸ−Galプレートにまいて、37℃で一晩インキュベートした。約800コロニーがスクリーニングされ、そのうち６つ（pRBW1−pRBW6）が白、または淡いブルーで、その他のコロニーはダークブルー（YCp50ベクターのみで形質転換された大腸菌（E.coli）のコントロールコロニーに相当する）であった。６つの候補のうち３つは偽陽性であることがわかり、プラスミドを保持していた２つは（pRBW1とpRBW6と名付けられた）酵母DNAのオーバーラップしたインサートを有し、プラスミドを保持していた残りの１つは（pRBW2と名付けられた）別の酵母DNAインサートを有していた。プラスミドpRBW1とpRBW2を単離し、Ub−Arg−βgalやUb−Met−βgalどちらを発現している大腸菌（E.coli）に再形質転換した。Ub−Arg−βgalを発現する形質転換株は、Ｘ−Galプレート上で白いコロニーを形成して最初の結果を確認したが、Ub−Met−βgalを発現している形質転換株は、これらのプレート上で青いコロニーを形成して、pRBW1とpRBW2挿入によるUb−Arg−βgalの代謝による脱安定化はＮ末端法則特異的であることを示してた（ArgとMetは、それぞれ大腸菌（E.coli）Ｎ末端法則において、それぞれ、不安定化と安定化の残基である）。
おどろくべきことに、pRBW1またはpRBW2を保持している大腸菌（E.coli）の抽出液は、Ub−Met−DHFRのin vitro脱ユビキチンアッセイでは不活性であり、これは、pRBW1とpRBW2にコードされているUb特異的プロテアーゼは細胞抽出液中で不活性化されるか、あるいは、翻訳後ではなく翻訳と同時にユビキチン融合物を脱ユビキチンするかのどちらかのためであることを示唆している。そこで、pRBW1とpRBW2が大腸菌（E.coli）に与えるUb特異的プロテアーゼの活性を、βgalに対するモノクローナル抗体を用いた、Ub−Met−βgalのパルス追跡アッセイによりin vivoでさらに分析した。その結果、pRBW1とpRBW2は（YCp50ベクターのみではだめであったが）大腸菌（E.coli）に脱ユビキチン活性を与えることが確認された。続いて、pRBW1とpRBW2がコードするUb特異的プロテアーゼを過剰発現させると、大腸菌（E.coli）抽出液でも同様にそれらの検出が可能性であった。
pRBW2の脱ユビキチン活性をコードしているORFは、サブクローニング実験と塩基のシークエンスにより同定されて、UBP2遺伝子と命名された（図３と配列番号No5）。UBP2中の開始コドン（ATG）の位置は、酸性（計算上pI4.95）で、1264残基（145kDa）のタンパク質をコードする、一番長い（3715bp）のORFを生じるように推定された。
pRBW1の脱ユビキチンプロテアーゼをコードしているORFは、サブクローニング実験と塩基のシークエンスにより同定されて、UBP3遺伝子と命名された（図４と配列番号No7）。UBP3中の開始コドン（ATG）の位置は、やや塩基性（計算上pI7.92）で、912残基（102kDa）のタンパク質をコードする、一番長い（2736bp）のORFを生じるように推定された。大腸菌（E.coli）プロモーターの下流にこのORFを含むプラスミド（pRB143）は、大腸菌（E.coli）に脱ユビキチン活性を与えた。
大腸菌（E.coli）でのUBP1,UBP2,UBP3の発現
先に構築されたプラスミドpJT70（pUC19由来）とpJT184（pACYC184由来）は、大腸菌（E.coli）中で弱い活性を有する酵母UBP1プロモーターにより、大腸菌（E.coli）で酵母UBP1を発現した。pRBW2の1.9kbのHind IIIサブクローンは大腸菌（E.coli）にユビキチン活性を与えたが、それはUBP2bORFの3'半分のみを含んでいた。予備実験で、端から削っていったUbp2蛋白質は、大腸菌（E.coli）抽出液に様々なレベルの脱ユビキチン活性を生じた。大腸菌（E.coli）で全長のUbp2を発現するプラスミドを構築するため、pRB6から1.56kbHind III/Xba Iフラグメント（図３参照）として単離されたUBP2の5'端部を、UBP2のHind IIIサイトにの近くにEcoR Iサイトが存在するように、ポリリンカーを含むpRS316にサブクローニングした（Sikorski and Hintter,Genetics 122:19−27（1989））。生じたインサートは、1.57kbEcoR I/Xba Iフラグメントとして切り出した。UBP2の3'端部は、pRB11から〜3.4kbXba I/BamH Iフラグメントとして単離され（図３参照）、UBP2のBamH Iサイトにの近くにPst Iサイトが存在するように、pRS316にサブクローニングした。生じたインサートは、続いて〜3.4kbXba I/Pst Iフラグメントとして切り出された。このフラグメントと上記の1.57kbEcoR I/Xba Iフラグメントを、EcoR I/Xba Iで切ったpKK223−３につないで、pKK223−３のシャインダルジャーノ配列から50bp下流に、正確な方向でつながったUBP2を含む、pRB105プラスミドを（他の生成物の中から）得た。大腸菌（E.coli）で２つの違うプラスミドが同時に存在する必要のある実験のために、pRB105のUBP2/rrnBターミネーター領域を、〜6.4kbSph I/Sca Iフラグメントとして切り出し、Sph I/EcoR Vで切ったpACYC184にサブクローニングし、pRB173を得た。
最初の実験において、Ubp3のUb特異的プロテアーゼの活性は、in vivoで検出されたが、大腸菌（E.coli）抽出液では検出されなかったため、UBP3過剰発現プラスミドを構築した。UBP3の完全な遺伝子を含むpRB27の〜2.9kb Kpn I/Dra Iフラグメントを、Kpn I/Hinc II切断pUC19に、プラスミド側のEcoR IとPst Iサイトを、それぞれ、導入されたインサートのKpn IとDra Iサイトの近傍になるようサブクローンした。インサートは、その後、EcoR I/Pst Iで切り出して、EcoR I/Pst I切断pKK223−３にサブクローンし、pKK223−３のシャインダルジャーノ配列から50bp下流に、正確な方向でつながったUBP3を含む、pRB143を得た。大腸菌（E.coli）中で２つの違うプラスミドが同時に存在する必要のある実験のために、pRB143のUBP3/rrnBターミネーター領域を、〜4.2kbSph I/Sca Iフラグメントとして切り出し、Sph I/EcoR Vで切ったpACYC184にサブクローニングし、pRB175を得た。
さらに最近の実験において、UBP1、UBP2、UBP3は、pKK由来の発現ベクターから、大腸菌（E.coli）で過剰発現された（Ausubel et al.）Current Protocols in Molecular Biology,J.Wiley＆Sons,N.Y.（1989）。それぞれのUBP蛋白質は、全細胞蛋白質の実質比率（１−５％）からなるレベルで発現した。
Ub特異的プロテアーゼの配列の比較
809−残基のUbp1と、1264−残基のUbp2と、912−残基のUb3の配列アラインメントから、それぞれのUbp蛋白質において、数百残基離れて位置している統計上有意な類似性を有する、２つの短い領域は存在するが、これらの蛋白質の間には全体的な配列類似性はないことが示された。類似している２つの領域は、システインと２つのヒスチジン残基の周りに集まっている。Ubp1でみられるように、Ubp2もUbp3もどちらも、第４の即ち酵母のUb−特異的プロテアーゼ、Yuh1やその哺乳類のホモログに、厳密な配列類似性を持たない。Yuh1やその哺乳類のホモログの推測上の活性部位であるシステイン残基を含む領域は、Ubp1−Ubp3の保存されたシステイン領域と似ていない。システイン残基を別にすれば、もう一つの残基だけが６つ全ての蛋白質で相同な領域（Asn）である。Yuh1様プロテアーゼ類の保存された２つのヒスチジン残基の相同的なアライメントと、Ubp1−Ubp3の保存されたヒスチジン残基とには、そのような相同性は見られない。
Ub特異的プロテアーゼのin vitroの機能
前に同定されたUbp1プロテアーゼは、in vitroで、天然のユビキチン前駆体Ubi1−Ubi3や、Ub−Ｘ−βgalとUb−Ｘ−DHFRのような遺伝子操作で作られた融合物を含む、様々な直鎖ユビキチン融合蛋白質を、有効に脱ユビキチンできる。Ubp2（pRB105）やUbp3（pRB143）やYuh1（pKKYUH1）のいずれかを発現する高発現ベクター由来のプラスミドを保持する大腸菌（E.coli）の抽出液を、Ub含有テスト蛋白質と一緒にインキュベートする、類似のアッセイを、これらのプロテアーゼのin vitroでの基質特異性を解析するため用いた。UBP1発現プラスミドpJT70やベクターのみを保持している大腸菌（E.coli）の抽出液も、また、これらのアッセイに使用された。その分解産物は、SDS−PAGEにより分画され、抗Ub抗体を用いたイムノブロッティングにより、または35Sラベルしたテスト蛋白質を用いた直接フルオログラフィーで検出された。
これらのin vitroでのアッセイにおいて、Ubp2プロテアーゼは、特異的なリボゾーム蛋白質と融合している天然のユビキチン前駆体である、Ubi2とUbi3と同様に、Ub−Met−βgalとUb−Met−DHFRを、有効に脱ユビキチンした。Ubp1とUbp2のどちらも、Ub−Ub−Cys（Ｃ末端伸長物の一残基に連結しているジユビキチン）からCys残基を遊離したが、Ub−Ub−CysのUb−Ub連結部は開裂できなかった。Ubp1とUbp2は、先にUbp1で報告されたような５つの直鎖型ユビキチンリピートを含む天然のユビキチン前駆体である、酵母のポリユビキチンのUb−Ub連結部もまた開裂できなかった。このように、Ubp1とUbp2は、全ての試されたユビキチン融合体のユビキチンの最後の（Gly76）残基の後でini vitroで効果的に開裂し、ポリユビキチンのUb−Ub連結部が唯一の例外である。しかしながら、先に示したように、これらのプロテアーゼは大腸菌（E.coli）で同時発現したとき、ポリユビキチンを開裂できる。
pKK高発現ベクター由来のプラスミドpBR143により大腸菌（E.coli）でUbp3を発現させると、期待される分子量の蛋白質が実質的に過剰発現しているが、Ubp3を発現している大腸菌（E.coli）の抽出液は、脱ユビキチン活性を欠失していた。Ubp3は大腸菌（E.coli）でin vivoで確かに活性なので、細胞抽出液で不活性になるか、それらのリボゾーム介在される合成の間か直後にのみユビキチン融合体を分離できるのか、どちらかである。
従来報告された結果に一致して、Yuh1を発現している大腸菌（E.coli）の抽出液は、Ubi2とUbi3のような短いユビキチン融合物を効果的に脱ユビキチンした。しかしながら、Yuh1は、より長いUb−Met−DHFR（ユビキチンの229残基Ｃ末端伸長物）に対して、長時間のインキュベートの後でも融合物を最高でも〜50％しか脱ユビキチンせず、より弱い活性を有し、Ub−Met−βgal（配列番号No1）に対してはほとんど不活性であった。
Ub特異的プロテアーゼのin vivoでの特質
大腸菌（E.coli）の抽出液におけるそれらの活性から期待されるように、Ubp1とUbp2とYuh1は、天然のユビキチン融合物Ubi2とUbi3に対してin vivoでは活性があった。Ubp3は大腸菌（E.coli）の抽出液中においては不活性だが、Ubi2とUbi3と共に大腸菌（E.coli）で発現させた時は、それらを効果的に脱ユビキチンした。Ubi1とUbi2はin vitroでポリユビキチンのUb−Ub連結部は開裂できなかったが、それらの両方とも、大腸菌（E.coli）で同時発現させた時は、酵母のポリユビキチンに対して活性があった。対照的に、Ubp3プロテアーゼはUbi2とUbi3のようなユビキチン融合物に対してin vivoでは活性があるが、同じ条件下で、ポリユビキチンに対しては不活性であった。Ub特異的分解プロテアーゼの間でのこれらの相違は、それらが要求する、Ub−Ｘペプチド結合の付近の蛋白質領域の構造が微妙に違うことを示している。Ubp2とUbp3によるUb−Met−βgalのようなユビキチン融合物のin vivoでの脱ユビキチン反応は、最初のｘ−galスクリーンの結果を確かめるためにパルス追跡分析によっても追跡した。期待したように、それらの両方とも、パルス後15分パルスラベルしたUb−Met−βgalのかなりの割合がそのまま残ったことと、Ubp3による分割が不完全であったことを除いては、in vivoでUb−Met−βgalを脱ユビキチンした。これらの結果は、Ubp3は、Ubp2よりも翻訳と同時的な脱ユビキチン化が厳密であるというパターンと一致する。類似のパルス追跡アッセイにおいて、Yuh1は、in vivoでUb−Met−βgalの脱ユビキチン反応はできなかったが、これは、発生途中（成熟型と異なり）のUb−Met−βgal中のUb−Metペプチド結合はあきらかに感受性が大きいが、Yuh1による脱ユビキチン化を許すには不十分であることを示している。対照的に、この違いはUbp3によるUb−Met−βgalの翻訳同時的な（しかしあきらかに翻訳後ではない）脱ユビキチン反応をゆるすのに十分である。
均等範囲
当業者であれば日常の実験方法により、本明細書中に記載された発明の具体的な態様の多数の均等物を確認できるであろう。
これらの均等物は以下の配列表の後に続く請求の範囲により包含されるよう意図される。
（２）配列情報SEQ ID NO:1:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:3365塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ix）特徴：
（Ａ）NAME/KEY:CDS
（Ｂ）存在位置:1..3363
（xi）配列:SEQ ID NO:1:
（２）配列情報SEQ ID NO:2:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:1121アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列:SEQ ID NO:2:
（２）配列情報SEQ ID NO:3:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:2845塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ix）特徴：
（Ａ）NAME/KEY:CDS
（Ｂ）存在位置:193..2619
（xi）配列:SEQ ID NO:3:
（２）配列情報SEQ ID NO:4:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:809アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列:SEQ ID NO:4:
（２）配列情報SEQ ID NO:5:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:6008塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ix）特徴：
（Ａ）NAME/KEY:CDS
（Ｂ）存在位置:983..4774
（xi）配列:SEQ ID NO:5:
（２）配列情報SEQ ID NO:6:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:1264アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列:SEQ ID NO:6:
（２）配列情報SEQ ID NO:7:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:4887塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ix）特徴：
（Ａ）NAME/KEY:CDS
（Ｂ）存在位置:1278..4013
（xi）配列:SEQ ID NO:7:
（２）配列情報SEQ ID NO:8:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:912アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列:SEQ ID NO:8:
ユビキチン（Ub）は高度に保存された76残基の蛋白質であり、真核細胞において、非常に様々な蛋白質と共有的に結合しているか、又は、フリーの状態で存在している。ユビキチンと他の蛋白質との、翻訳後の結合は、Ub結合（E2）酵素のファミリーにより触媒され、受容蛋白質のLys残基のεアミノ基とユビキチンのＣ端側のGly残基の間のイソペプチド結合の形成を含む。ユビキチンの機能の一つは、選択的に分解される蛋白質をマークすることである。ユビキチンはまた、一時的に（翻訳と同時に）特定のリボゾーム蛋白質と共有結合することによりリボゾームサブユニットの会合を促進するという意味において、シャペロン機能を持つことが示されている。
翻訳後に形成される枝別れしたUb蛋白質結合体と違い、直鎖状のUb蛋白質誘導体は、天然のまたは遺伝子工学で設計された融合遺伝子の翻訳産物として形成される。よって、例えばパン酵母（Saccharomyces cerevisiae）において、ユビキチンは、直鎖状ポリユビキチン蛋白質 Ubi4のようにユビキチン自身に結合しているか、ハイブリッド蛋白質 Ubi1−Ubi3のように関係ないアミノ酸配列と結合している前駆体がタンパクプロセッシングを受けることによってもっぱら生成される。増殖中の酵母細胞において、ユビキチンは、ほとんど、その"tails（尾）”が特異的リボゾーム蛋白質であるUbi1−Ubi3前駆体から産生される。ポリユビキチン（UBI4）遺伝子は増殖している細胞ではなくてもすむが、ストレスのあいだは（ユビキチンの主な供給源として）不可欠になる。成熟ユビキチンをコードしている遺伝子の欠如と、酵母のユビキチン前駆体の融合構成物は他の真核生物においても同様に同定されている。
ユビキチンを、その直鎖状、または分枝状の結合物から分離できる、Ub特異的、ATP非依存的プロテアーゼは、調べた限り全ての真核細胞で検出されたが、大腸菌（Escherichia coli）のような、ユビキチンとユビキチン特異的な酵素のないバクテリアでは検出されない。ミラー（Miller）ら、Biotechnology1,:698−704（1989）は、YUH1と名付けられた、ユビキチンをその比較的短いＣ端側の配列からは分離するが、Ub−β−ガラクトシダーゼ（Ubβgal）のような大きな融合体には事実上不活性な、Ub特異的なプロテアーゼをコードするパン酵母（S.cerevisiae）遺伝子をクローニングした。ウィルキンソン（Wilkinson）ら、Science 246:670−673（1989）は、また、酵母Yuh1プロテアーゼの哺乳類ホモログをコードするcDNAをクローニングした。トビアスとファルシャフスキー（Tobias and Varshavsky）,J.Biol.Chem.266:12021−12028（1991）は、UBP1と名付けられた、Yuh1プロテアーゼやその他の知られている蛋白質に似ていないアミノ酸配列を有するUb特異的プロセッシングプロテアーゼをコードする、他の酵母遺伝子をクローニングし、その機能を解析して報告した。YUH1とその他の種で知られているホモログと違って、Ubp1は、大きさやＮ端側ユビキチン伸長物には関係なく融合蛋白質からユビキチンを分離する。
発明の概要
本発明は、ユビキチン融合蛋白質の大きさに関係なく、ユビキチン融合蛋白質のＣ端側のユビキチン部位を特異的に開裂するユビキチン特異的プロテアーゼの属の種類に関する。より具体的には、本発明は細胞から単離されたこの種類のユビキチン特異的プロテアーゼに関する。本発明は、また、この種類のプロテアーゼをコードする単離されたDNA配列に関する。
ユビキチン特異的プロテアーゼの有用な特性の一つは、それらが、ユビキチン分離位置に隣接している、Ｃ端側伸長物の残基に関係なく、その伸長物から、ユビキチンを分離することにある。Ubpプロテアーゼのこの特性は、in vivo、またはin vitroで、予め定められたＮ端側の残基を有する蛋白質やペプチドを発生させる、バイオテクノロジーと基礎研究の両方に応用できる方法を可能にする。
【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドpJT60を示した図である。
図２は、プラスミドpJTUPを示した図である。
図３は、UBP2の制限酵素地図を示した図である。
図４は、UBP3の制限酵素地図を示した図である。
発明の詳細な説明
本明細書中で使用する、ユビキチン融合蛋白質とは、ユビキチンや、ユビキチンの機能的ホモログが、そのＣ末端アミノ酸残基でユビキチン以外の蛋白質やペプチドのＮ末端アミノ酸残基と融合したものからなる融合蛋白質として定義される。後述する実施例で述べるように、ユビキチン融合蛋白質は、天然に見い出される融合蛋白質、または組換えDNA技術によって産生された融合蛋白質である可能性もある。その特異的な分離は、in vivo、またはin vitroのどちらでも、ユビキチンのＣ末端残基と、蛋白質やペプチドのＮ末端残基の間に位置する。
本明細書中に開示されているユビキチン特異的プロテアーゼの種類と比較して、先に単離されたYUH1酵素は、融合物の非ユビキチン蛋白質が比較的短かい場合（約60残基より短かい場合）にのみ、ユビキチン融合蛋白質からユビキチンを解離させる。このことから、例えば、薬学的に重要な蛋白質の多くは60残基よりはるかに長いため、YUH1プロテアーゼは、ユビキチンとこれらの蛋白質のユビキチン融合物からのユビキチンの解離に使うことはできない。しかしながら、本明細書中に開示されている種類のプロテアーゼは、この目的のために使うことができ、そのために、大きな、または小さな、そして蛋白質やポリペプチドやペプチド（蛋白質やポリペプチドやペプチドという用語は、当技術分野において、しばしば互換的に用いられる）のＮ末端においても要求される残基を産生できる。
本発明に関係するユビキチン特異的プロテアーゼの種類のメンバーである、３つのプロテアーゼをコードするDNA配列を、後の実施例において示した。これらのプロテアーゼはUBP1とUBP2とUBP3に分類された。これらのプロテアーゼをコードするDNA配列と、これらから推定したアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号No3−４、配列番号No5−６、配列番号No7−８に示した。本明細書中に開示されている、これらのプロテアーゼをコードするDNA配列は、後に示す方法によって単離され、またポリメラーゼチェーン反応増幅法（PCR）を利用することによって、先にあげたDNA配列を決定した。
プロテアーゼUBP1とUBP2は、in vivo,in vitroのどちらでも活性を示すが、UBP3プロテアーゼはin vivoでのみ、活性を示す。これらのプロテアーゼはそれぞれ約120キロダルトンの分子量を持つユビキチン融合蛋白質を特異的に解離することが示されている（ユビキチン−メチオニン−β−ガラクトシダーゼ）。対して、YUH1ユビキチン特異的酵素は、in vivo,in vitroのどちらでも、このユビキチン融合物に対しては、事実上、不活性である。この120キロダルトンの融合蛋白質をコードするDNA配列は、配列番号No1に示されている。そのアミノ酸配列は、配列番号No1−２に示されている。
本発明の範囲は、ユビキチン特異的プロテアーゼをコードしている単離されたDNA配列またはその生物学的に活性な部分を含み、それは厳密な（ストリンジェントな）ハイブリダイゼーションの条件下で、配列番号No3、配列番号No5、配列番号No7に示されているDNA配列と特異的にハイブリダイズできることを特徴とする。列挙された配列と厳密なハイブリダイゼーションの条件下でハイブリダイズするDNA配列は、列挙された配列と完全に相補するか、相同性が高いかのどちらかである。本明細書中で使用される相同性とは、列挙された配列とは違うが、その相違が、コードしているプロテアーゼの生物学的な活性（即ち、開裂の性質）には実質的には影響しないDNA配列を意味している。厳密なハイブリダイゼーションの条件となる組み合わせの一つは、45℃で、50％ホルムアミド、５×SSPE（１×SSPEは、0.15mM NaCl,1mM Na−EDTA,10mM リン酸ナトリウム,ph7.0）、５×デンハルト溶液（0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％フィコール）である。
本発明の範囲に入る、単離されたDNA配列は、真核細胞、または原核細胞どちらの宿主細胞においても大量のコードされているプロテアーゼの発現に使用できる。この目的のために、DNAは、適当な制御信号とともに、真核細胞または原核細胞の発現ベクターに組み込まれ、細胞のトランスフォームに使用される。様々なベクターと制御信号がこの目的のために先に開発されており、当業者にはよく知られている。
後の例で述べられるように、本発明のプロテアーゼは、全細胞蛋白質の実質的比率に相当する程度まで大腸菌（E.coli）で高発現された。そのような大きな割合を占めるレベルまで発現された蛋白質の精製およびそのための簡単なアッセイ系の確立は、当業者にとって、簡単なことである。
単離されたUBP1やUBP2や、組み替えDNA発現ベクターから産生されたUBP1やUBP2を含む細胞抽出液は、in vitroでユビキチンをユビキチン融合蛋白質から分離するために使用することができる。細胞抽出液は、培養細胞を単に遠心して、溶解することで組み替えDNA発現ベクターを発現している宿主細胞の培養物から調製できる。細胞溶解液を、ひきつづいて上記に記載されたようにさまざまな程度の精製により処理することができる。in vitroでの開裂のために適当な条件は、日常的実験を越える実験をしなくても、後述の実施例で提供される情報から、当業者により経験的に決定できる。
加えて、UBP1やUBP2やUBP3プロテアーゼは,in vivoで融合蛋白質を脱ユビキチンするためにも使用できる。例えば、これらのプロテアーゼをコードしている発現ベクターを保持する原核細胞はユビキチン融合蛋白質をコードしている発現ベクターで形質転換が可能である。そのような細胞は、予め定めたＮ−末端アミノ酸残基を有する脱ユビキチンされた産生物を産生するだろう。大腸菌（E.coli）のような原核細胞有機体において組み替え蛋白質を産生することにはよく知られている有利な点がたくさんある。
ユビキチンではない蛋白質やペプチドとユビキチンのいくつかの融合物において、ユビキチン部分の存在は、ユビキチンではない蛋白質やペプチドの機能的活性を、修飾したり阻害したりする。この場合、ユビキチン部分を解離するユビキチン特異的プロテアーゼと、対応するユビキチン融合物とを接触させることにより、in vivoまたはin vitroで、いつでも要求される時に本来の機能を回復させうる、非ユビキチン蛋白質やペプチドの機能的な活性の暫定的阻害物（または修飾物）としてユビキチンを使用できる。
本発明は以下の実施例によりさらに例示される。
実施例１ UBP1のクローニングと分析
スクリーニングのための酵母ゲノムcDNAライブラリーと ライセートの調製
酵母（S.cerevisiae）のゲノムライブラリーで形質転換された大腸菌（HB101株）をsib選択法に使用したRB237ライブラリーは、酵母ゲノムDNAをSau III Aで部分消化し、酵母／大腸菌シャトルベクターYCp50のテトラサイクリン耐性遺伝子（TetR）中のBamH I部位に接続して作成した。初期分析では、このライブラリーは平均約19kbのインサートをもっていた。
上記のライブラリーで形質転換された大腸菌は、ルリア培地（LB）とアンピシリン（Amp）（100μg/ml）を含む寒天上に、１プレートにつき約生存細胞40の密度で播いた。プレートは36℃で16時間インキュベートした。そして、コロニーはLB/Ampプレート何枚かに複製した。もとのプレートは４℃で保存しレプリカは36℃で24時間培養した。それぞれの複製プレートは、すべてのコロニーが液中に移りなくなるまで繰り返し洗浄して、1mlのLB/Amp（50μl/ml）に溶出させた。溶出液全量を4mlのLB/Ampに加え、ローラードラム上で36℃で一晩インキュベートした。
これらのオーバーナイト培養液中の大腸菌（静止期）を溶菌させた。それぞれの培養液を1.7mlずつ氷上のマイクロ遠心チューブに入れ、４℃で12,000×ｇで１分間遠心した。沈殿した細胞に25％スクロース（W/V）、250mM トリス−塩酸（pH8.0）を50μｌ加え、高速ボルテックスをかけ再懸濁した。10μｌの新たなリゾチーム液（0.25M トリス−塩酸（pH8.0）中、10ng/mlに調製したニワトリ卵白リゾチーム（シグマ））を加え、軽くボルテックスして撹拌した。この懸濁液を５分間氷冷し、150μｌの75mM EDTA,0.33Mトリス−塩酸（pH8.0）を加え、軽くボルテックスして混合し、そしてチューブをときどき混ぜながら５分間氷冷した。１μｌの10％トリトンＸ−100（ピアーズ）をそれぞれのチューブに加え、ピペットで混合した。細胞ライセートは12,000×ｇ、４℃で15分間遠心した。上清を取って氷上に置き、沈殿は除去した。
標識基質の調製
細胞ライセートは3535Sで標識した基質を用いてUb特異的タンパク分解酵素活性を測定した。35Sで標識されたユビキチンメチオニンジニヒドロ葉酸還元酵素（Ub−Met−DHFR）は次のように調製した:50μg/mlアンピシリンを加えたLB（50ml）に、IPTGで誘導でき、高い活性をもつlacプロモーター誘導体でUb−Met−DHFR融合タンパク質を発現するプラスミドを含む大腸菌JM101の一晩培養して飽和したもの1mlを接種した。細胞はA600が約0.9になるまで37℃で振とうしながら増殖させた。培養物を氷上で15分冷し、3000×ｇで５分遠心し、０℃でM9塩で２回洗った。最後の洗浄の後、0.2％グルコース、1.8μg/mlチアミン、40μg/mlアンピシリン、1mM IPTG、0.0625％（W/V）メチオニンアッセイ培地（Difco）を添加した25mlのM9塩に細胞を再懸濁した。懸濁物は、37℃で１時間振とうし、1mCiの35S−トランスラベル（ICN）を加え、振とうしながら５分間インキュベートして標識した。標識なしのＬ−メチオニンを最終濃度0.0032％（W/V）加え、細胞をさらに10分間振とうした細胞を収穫し（3000×g,5分）、冷却したM9塩で一度洗った。M9で洗浄した後、沈殿細胞を0.5mlの25％スクロース、50mMトリス−塩酸（pH8.0）に再懸濁し、５分間氷冷した。この間に、ニワトリ卵白リゾチーム（Sigma）を250mMトリス−塩酸（pH8.0）に10mg/mlの濃度で新たに溶解した。10μｌのリゾチーム液を細胞懸濁液に加え、混合し、０℃で５分間置いた。５μｌの0.5M EDTA（pH8.0）を加え、ときどき混ぜながら懸濁液を０℃で５分間置いた。細胞懸濁液を、0.975mlの65mM EDTA（pH8.0）、50mMトリス−塩酸（pH8.0）、それぞれ25μl/mlのプロテアーゼ阻害剤、アンチパイン、キモスタチン、ロイペプチン、アプロチニン、ペプスタチンの入った遠心チューブに加えた。10mlの10％トリトン Ｘ−100（Pierce）を加え、ピペットで分散させた。このライセートを39,000×ｇで30分遠心した。上清を取り、液体窒素で急速に凍結し、−85℃で保存した。
35標識Ub−Met−DHFRのアフィニティー精製のために、メトトレキセート（MTX）アガロースアフィニティーマトリックスをカウフマンの方法（Met.Enzymol.34,272−281（1974）で調製した。ベッド容積0.5mlのカラムにMTX−アガロースをつめ、10mlのMTXカラム緩衝液（20mMヘペス,pH7.5,1mM EDTA,200mM NACl,0.2mM ジチオスレイトール（DTT））で洗った。前述の35S標識上清を解かし、MTX−アガロースカラムに通した。カラムは2Mの尿素を含む50mlのMTXカラム緩衝液で洗浄し、再度50mlのMTXカラム緩衝液で洗浄した。標識したUb−Met−DHFRは葉酸溶出緩衝液（0.2Mほう酸カリウムpH9.0,1M KCl,1mM DTT,1mM EDTA,10mM葉酸）で次のように溶出した。溶出緩衝液を1mlづつカラムに通し、1mlずつの分画をあつめた。溶出液分画の35S放射活性を即死、大きな放射活性のピークを含む分画を分離した。プールした書く分画は、40mMトリス−塩酸（非明らか7.5）、1mM MgCl2,0.1mM EDTA,50％グリセロールを含む保存緩衝液を２回交換して、約20時間透析した。精製した35S表Ub−Met−DHFRをSDS−PAGEで分析し、フルオログラフィーを行って、95％を越える純度であることを見いだした。
脱ユビキチンアッセイ
細胞ライセートのUb特異的なプロテアーゼ活性を測定するため、９μｌの細胞ライセート上清を１μｌのアフィニティー精製した35S標識Ub−Met−DHFR融合タンパク質と、0.5mlのマイクロ遠心チューブの中で混合し、36℃で３時間インキュベートした。次に３倍濃度の電気泳動サンプル緩衝液（30％グリセロール、３％SDS（W/V）、15mM EDTA、0.2M ２−メルカプトエタノール、0.3μg/mlブロムフェノールブルー、375mMトリス−塩酸（pH6.8）を加え、それぞれのチューブを浴中で３分間煮沸した。サンプルを10％ポリアクリルアミド−SDSゲルにのせ、ブロムフェノールブルーの色素がゲルの下端にとどくまで50Vで電気泳動した。ゲル中の標識丹野放射活性の位置をフルオログラフィーで視覚化した。ゲルを10％酢酸、25％メタノールで15分間洗浄し、水中で15分間すすぎ、オートフルオール（National Diagnostics）で１時間インキュベートした。次にゲルを真空下80℃で乾燥させ、遮光カセット中でコダックXAR−５フィルムにあて、−85℃で一晩放置した。
上記ので脱ユビキチンアッセイを、ゲル分析でライセートがユビキチン−DHFR結合部でプロテアーゼ活性が働くことを示すまで、異なった形質転換大腸菌からのライセートで繰り返した。このアッセイはもとのLB/Ampプレート（ライセートはここから由来している）上の約40コロニーのうち少なくとも一つがUb特異的なプロテアーゼ活性を与える酵母DNAインサートをもつYCp50に基づくプラスミドを含むことを示していた。
RBP1遺伝子をクローニングするためのこのsibセレクション法の次の段階は、ポジティブプールの約40コロニーのうちどれが希望のプラスミドを含むか決定するため、同様なUb−Met−DHFR開裂アッセイを行うことであった。そのため、プレート上の目体のコロニーをLB/Ampに接種し、一晩培養した。Ub−Met−DHFR開裂アッセイは、正確に上記のように繰り返したが、今回のそれぞれのライセートサンプルは約40個の形質転換大腸菌の混合物ではなく、単一クローンの形質転換大腸菌の代表である。この分析によりUb−DHFR結合部を特異的に開裂する活性を与えるプラスミドを含む単一コロニーがつきとめられた。
UBP−１のクローニングと塩基配列の分析
はじめに分離されたプラスミド（pJT55）の分析は、YCp50ベクター中の約15kbの酵母ゲノムDNAを示していた。このプラスミドをSph I分解して得られた、約14kbの断片をベクターpUC19にサブクローニングすると、同様のプロテアーゼ活性を示した。このプラスミドをpJT57とした。この約14kbの断片をSph IとXho Iで切断して、約5.5kbのインサートDNAを分離し、それをSph IとSal Iで予め切断したpUCベクターにサブクローニングした。これにより、もとのプラスミドと同様のUb特異的プロテアーゼ活性を与える約5.5kbの酵母DNAインサートをもつ約8.1kbのプラスミドpJT60が得られた。
プラスミドpJT60中の制限酵素認識部位を示す地図を図１に示す。地図上で、認識部位の後に示したカッコつきの数字により塩基対の位置が示されている。pJT60中の酵母DNAインサートは、インサートをより小さなＡ、Ｂ二つの断片（423塩基と5830塩基）に分けるKpn Iサイトを中央部分に含んでいた。この断片の中で白矢印はUBP1のオープンリーディングフレーム（ORF）を示す。ORF全体と、それを囲む薄い線は配列番号３中に示された塩基配列が決定されたDNAの範囲を示す。どちらの断片も、pUC19にサブクローニングし、pJT60AとpJT60Bを得た。断片ＡはpJT57をKpn IとＰは出切断した後に分離した。その断片を同じ制限酵素で切断したpUC19にサブクローニングした。断片ＢはKpn IとXho Iで切断したpJT57から分子理、Kpn IとSal Iで切断したpUC19にサブクローニングした。pJT60AもpJT60BもUBP1特異的なプロテアーゼ活性を与えなかった。この結果は、目的の遺伝子はpJT60の約5.5kbインサートのKpn Iサイトに跨がっていることを示している。
クローニングされた遺伝子の配列を決定するため、pJT60AとpJT60BをM13mp19ファージベクターにサブクローニングした。塩基配列は（チェーンターミネーター法）で、pJT60の内部のKpn Iサイトから両方向に配列決定した。このKpn Iサイトはそこから両方向にのびるオープンリーディングフレーム中に存在していることが判明した。デールら（Dale et al.,Plasmid 13:31−40（1989）の方法により、シークエンス用テンプレートに一方向の削除を行い、完全なオープンリーディングフレームを決定した。ORFの5'末端はＢ断片中にあり、終止コドンはＡ断片中にあた。ORFは2427塩基の長さであり、分子量93kDaの809アミノ酸のタンパク質をコードしていた。決定されたORFはpJT60をAcc Iで切断して、5'末端の突出をKlenow pol Iで埋め、Sal Iリンカーを平滑末端にライゲーションして2.8kbの断片上に分離した。この構築物をSal IとBamH Iで消化し、2.8kbの断片を電気泳動で精製し、Sal IとBamH Iで消化したpUC19にライゲーションした。この結果得られたプラスミドをpJT70とした。このプラスミドは、大腸菌を形質転換させたときには、YCp50中のもとの約15kbのインサート、またはpJT70の約2.8kbの断片を含むpJT60プラスミドの約5.5kbインサートと同程度のUb特異的プロテアーゼ活性を与えることができた。プラスミドpJT60は、ATCC（Rockville MD）に寄託され、ATCC番号68211を付与された。2.8kbの断片は、有意な長さの他のオープンリーディングフレームを含まず、配列番号３中のORFは、Ub特異的プロテアーゼをコードしていた。この新しい遺伝子をUbiquitin−specific ｐroteaseから、UBP1と名付けた。
UBP1の基質特異性
UBP1がコードする生産物の試験管中での基質特異性は、様々な基質を用いて分離を調べることによって、検討された。これらの実験では、［35S］Ub−Met−DHFRと［35S］ユビキチン−メチオニン−βガラクトシダーゼ（［35S］Ub−Met−βgal）に対する、Ubp1の脱ユビキチン化活性が示された。［35S］ユビキチン−メチオニン−βガラクトシダーゼ融合蛋白質の作成は既に文献に記載されている バッハマイヤー（Bachmair et al.）Science 234:179−186（1986））。これらの標識された基質は、上記のようにして脱ユビキチンアッセイに用いられた。どちらの融合蛋白質も特異的に脱ユビキチン化された。これらの脱ユビキチン実験の電気泳動のパターンのフルオログラムにより、予想どうりの分子量の脱ユビキチン反応生成物が示された。
Ubp1プロテアーゼは、in vitroで酵母のリボゾーム蛋白質に融合した天然ユビキチン（Ubi2およびUbi3）の脱ユビキチンも示した。酵母（S.cerevisiae）の天然ユビキチン−リボゾーム蛋白質であるUbi2をコードする発現コンストラクトを大腸菌の形質転換に使用した。形質転換された細胞の培養物の細胞抽出液をUbp1を発現している大腸菌抽出液で処理し、ポリアクリルアミド−SDS−ゲルで電気泳動し、ポリビニリデンジフルオリド膜上にブロッティングし、アルカリフォスファターゼを結合させたヤギ抗ウサギ二次抗体およびアルカリフォスファターゼの発色基質を適用して、ウサギ抗ユビキチン抗体を使用して検出した。これらの実験からUbp1遺伝子産物を発現している大腸菌の抽出液は効果的に天然のユビキチン蛋白質Ubi2およびUbi3を脱ユビキチン化することが示された。
Ｎ末端に伸長物を有するユビキチン部分をもつサンドイッチタイプのユビキチン融合蛋白質がUbp1の基質かどうか決定するため、Ｎ端部分のジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）およびグリシン残基３つおよびセリンからなる適応性のあるリンカー領域に続いてユビキチンとMet−βgal部分を有する三重融合蛋白質をコードするプラスミドを構築した。マウスDHFR遺伝子はUb−Met−DHFR（Bachmair and Varshavsky）Cell 56:1019−1032（1989）をコードするプラスミドからBamH I/Hind III断片として単離した。この断片は、クレノウポリメレースＩで末端を埋め、Kpn Iリンカーをつないだ。その断片をKpn Iで切断して678bpの断片をつくり、これをユビキチン部分の２番目のコドンがKpn Iサイトをコードするように変えられている、修正Ub−Met−βgal発現ベクター（Gonda et al.,J.Biol.Chem 264:16700−16712（1989）のKpn Iサイトにクローニングした。その結果得られたプラスミドはDHFRと開始コドンMetのないユビキチンとMet−βgalをコードするが、それぞれの蛋白質の部分のオープンリーディングフレームが、単一のオープンリーディングフレーム中に並べられていない。オープンリーディングフレームの通った配列にし、ベクター中のGALプロモーターに対して正しい位置にてDHFRの開始コドンを存在させるため、プラスミドの中の２ヵ所で部位特異的突然変異誘発を行った。
即ち、プラスミドをBamH IとHnd IIIで切断し、DHFR、ユビキチンおよびMet−βgalの最初の数残基をコードする約2.76kbの断片を同じ酵素で切断したM13mp19にクローニングした。オリゴヌクレオチドを使った部位特異的突然変異誘発は、１本鎖M13誘導体を用い標準的な方法で行った。１つ目のオリゴヌクレオチドはベクターのGAL5プロモーターに関連して適切な位置に、DHFRの開始コドンを入れるために、20bpの欠失を作るように作成された。２つめのオリゴヌクレオチドはDHFRとユビキチンにリーディングフレームを与えDHFRとユビキチンの間に４残基のスペーサー（Gly−Gly−Gly−Ser−）を導入するように作成された。変異形成の後、DNAクローンはチェーンターミネーター法を使用した直接的ヌクレオチドシークエンスによって、２つの変異を確認した。
目的のM13クローンの二本鎖複製型分子（RF）を単離して、BamH I,Xho Iで切断した。その結果得られた約1.2kbの断片は、同じ酵素で切断した、Ub−Met−βgal発現ベクターの約9.87kb断片中にクローニングし、Ub−Metコーディング断片を部位特異的突然変異誘発によって作成したDHFR−Ub−Met断片と組み替えた。この最後の工程により、三重融合体DHFR−Ub−Met−βgalをコードする発現ベクターが生じた。このベクターをpJTUP（図２）と名づけた。
pJTPは、２つの非ユビキチン部分の間に位置するユビキチン融合蛋白質がUbp1による開裂の基質となるかどうか検討するために使用された。［35S］メチオニンで代謝的に標識された大腸菌で発現されたDHFR−Ub−Met−βgalの運命は、β−ガラクトシダーゼに対するモノクローナル抗体での免疫沈降、引き続くポリアクリルアミド−SDSゲル電気泳動およびフルオログラフィーを用いて、Ubp1の存在下、非存在下で決定された。これらの実験により、UBP1が効率的にそのような３重融合蛋白質を開裂することを立証した。
そのようなサンドイッチ構造物を開裂する特性は、はじめの非ユビキチン部分が何らかの望ましい特徴をサンドイッチユビキチン融合蛋白質に与える状況では特に有用である。例えば、はじめの非ユビキチン部分は、ユビキチン融合蛋白質のアフィニティー精製に役立つ可能性がある。そのような場合には、融合蛋白質をユビキチン特異的プロテアーゼをもたない細胞（例えば大腸菌）で発現させて、細胞ライセートをもとの非ユビキチン部分に特異的なアフィニティーカラムを通過させることができる。アフィニティー精製に有用な蛋白質の一つの例はストレプトアビジンである。融合蛋白質をアフィニティー精製の次に、ユビキチン特異的プロテアーゼと接触させる。それにより、二番目の非ユビキチン部分はサンドイッチユビキチン融合蛋白質から遊離される。
実施例２ UBP2とUBP3のクローニングと解析
クローニング方法
Ubp1とYuh1以外の酵母（S.Cerevisiae）のUb特異的プロテアーゼをコードする遺伝子をクローニングするために行った方法は、大腸菌（E.cli）のようなバクテリアはUb特異的プロテアーゼとユビキチンを欠失していることを利用し、また、in vivoでの蛋白質の半減期とそのＮ−末端の残基の間の関係、Ｎ−末端法則は、真核細胞のみならず大腸菌（E.coli）でも同様に適用されるという最近の証明に基いている。真核細胞において、β−ガラクトシダーゼのようなテスト蛋白質とのユビキチン融合物は、Ub−βgal結合部の残基の種類に関係なくUb特異的分解プロテアーゼにより脱ユビキチンされるので、その他の点で同等のテスト蛋白質のＮ−末端の種々の残基をin vivoで露出することが可能になる。真核細胞におけるＮ−末端法則の検出と分析が要求されるこの技術は、UBP1で形質転換された大腸菌（E.coli）はユビキチン融合物を脱ユビキチンする能力を要求することから、酵母のUBP1遺伝子（例１参照）の単離のためにバクテリアでも適用できるようになった。Arg−βgalのようなＸ−βgalテスト蛋白質は大腸菌（E.coli）で短命であるのに、Ub−Arg−βgalは長命であるという発見は、Ub特異的プロテアーゼを大腸菌（E.coli）によりin vivoでスクリーニングする新しい方法を可能にした。βgalのクロモジェニックな基質であるＸ−Galを含むプレート上では、（長命の）Ub−Argβgal融合蛋白質を発現する大腸菌はブルーコロニーを形成する。しかしながら、もし細胞内に脱ユビキチン活性も存在するなら、Ub−Argβgalは、短命なArg−βgalに変換され、その低い定常レベルのためＸ−Galを含むプレート上で白い大腸菌（E.coli）コロニーをつくる。
慣用的な酵母のゲノミックDNAライブラリーを使用してこの技法によるクローニングを可能にするため、酵母遺伝子は、大腸菌（E.coli）で機能するプロモーター（酵母のプロモーターの少数はそのように機能できる）を有しなければならず、そのコーディング領域のイントロンを欠失していて（ほとんどの酵母遺伝子はイントロンを欠失している）、モノマーまたはホモオリゴマーとして機能するUb特異的プロテアーゼをコードしていなければならない。前に使用したUBP1をもたらしたin vitroスクリーンに優る、このin vivoスクリーンの有用性の一つは、これが、関連プロテアーゼがin vivoで活性であることを要求するが、必ずしもin vitoroで（大腸菌（E.coli）抽出液で）活性であることを要求しないことである。
ユビキチン含有テスト蛋白質の発現プラスミド
Ub−Arg−βgalを発現するpACUb−Ｒ−βgalプラスミドを構築するため、GAL10プロモーターの下流のUb−Arg−βgalコーディング領域を含むpUB23−Ｒ（バッハマイヤーら（Bachmair et al.）Science 234:179−186（1986））の〜5kbのSca Iフラグメントを、Hinc IIで切ったpACYC184（P15A複製オリジンがあるため、pMB1（ColE1−）に基づいたpUC19やpBR322のような大腸菌（E.coli）ベクターと相容性である）にサブクローニングした。pACUb−Ｒ−βgalは、大腸菌（E.coli）中で、弱い構成的なプロモーターとして働くガラクトース誘導性酵母GAL10プロモーターから、Ub−Arg−βgalを発現した。Ub−Met−βgalを発現する、pACUb−Ｍ−βgalプラスミドは、pUB23−ＲのかわりにpUB23−Ｍが使用された以外は、pACUb−Ｒ−βgalと同様に構築された。pKKUB−I2とpKKUB I3とpUB17は、大腸菌（E.coli）中で、ベクターpKK223−３のイソプロピルチオガラクトシド（IPTG）で誘導されるプロモーター（アスベル（Ausubel ey al.）Current Protocols in Molecular Biology,J.Wiley＆ Sons,N.Y.（1989））を利用して、天然の酵母ユビキチン融合物（ユビキチン前駆体）Ubi2,Ubi3,Ubi4（ポリユビキチン）をそれぞれ発現する（Ozkaynak et al.EMBO J.6:1429−1439（1987））。それぞれにヒトのジユビキチンとトリユビキチン（そのどちらも天然にシステインの１残基Ｃ−末端付加がおきている）を発現する、pKKHUb2とpKKHUb3プラスミドは、以下のように構築された。プラスミpB8.3由来のヒトUbB（トリユビキチン）遺伝子を含む1.77kbBamH Iフラグメントを、pUC19のポリリンカーのSma IサイトにUbBの3'末端が隣接しているような向きで、BamH I切断したpUC19にライゲートしてpUbBとした。UbBをコードしている領域と、その3'側領域を含むpUbBの1.04kbのDra I/Sma Iフラグメント（Dra IサイトはUbBスタートコドンの10bp上流に位置する）を、Sma I/Hinc II切断したpUC19に、UbBスタートコドンがポリリンカーのEcoR Iサイト側に隣接しているような向きで、サブクローニングし、pHUb3とした。このプラスミドをSal Iで部分消化し、これにより各Ubコーディングリピート内の一箇所を切断した（ポリリンカーサイトのSal Iサイトは、pHUb3を構築する際に除去された）。二つのUbコーディングリピートを保持しているフラグメントを有するベクターを単離し、セルフライゲーションして、pHUb2を得た。pHUb2とpHUb3のインサートを、EcoR IとPst Iで切り出し、EcoR I/Pst Iで切断されたpKK223−３にサブクローニングして、それぞれpKKHUb2とpKKHUb3を得た。これらのプラスミドのUbコーディング領域の開始コドンは、pKK223−３のシャインダルジャーノ配列の36bp下流にある。
スクリーニングの結果
Ub−Arg−βgalを発現するプラスミドを有する大腸菌（E.coli）を、YCp50プラスミドに組込まれているS.cerevisiaeのゲノミックDNAライブラリーRB237で形質転換させ、両方のプラスミドが存在するかを選択する抗生物質を含んだＸ−Galプレートにまいて、37℃で一晩インキュベートした。約800コロニーがスクリーニングされ、そのうち６つ（pRBW1−pRBW6）が白、または淡いブルーで、その他のコロニーはダークブルー（YCp50ベクターのみで形質転換された大腸菌（E.coli）のコントロールコロニーに相当する）であった。６つの候補のうち３つは偽陽性であることがわかり、プラスミドを保持していた２つは（pRBW1とpRBW6と名付けられた）酵母DNAのオーバーラップしたインサートを有し、プラスミドを保持していた残りの１つは（pRBW2と名付けられた）別の酵母DNAインサートを有していた。プラスミドpRBW1とpRBW2を単離し、Ub−Arg−βgalやUb−Met−βgalどちらを発現している大腸菌（E.coli）に再形質転換した。Ub−Arg−βgalを発現する形質転換株は、Ｘ−Galプレート上で白いコロニーを形成して最初の結果を確認したが、Ub−Met−βgalを発現している形質転換株は、これらのプレート上で青いコロニーを形成して、pRBW1とpRBW2挿入によるUb−Arg−βgalの代謝による脱安定化はＮ末端法則特異的であることを示してた（ArgとMetは、それぞれ大腸菌（E.coli）Ｎ末端法則において、それぞれ、不安定化と安定化の残基である）。
おどろくべきことに、pRBW1またはpRBW2を保持している大腸菌（E.coli）の抽出液は、Ub−Met−DHFRのin vitro脱ユビキチンアッセイでは不活性であり、これは、pRBW1とpRBW2にコードされているUb特異的プロテアーゼは細胞抽出液中で不活性化されるか、あるいは、翻訳後ではなく翻訳と同時にユビキチン融合物を脱ユビキチンするかのどちらかのためであることを示唆している。そこで、pRBW1とpRBW2が大腸菌（E.coli）に与えるUb特異的プロテアーゼの活性を、βgalに対するモノクローナル抗体を用いた、Ub−Met−βgalのパルス追跡アッセイによりin vivoでさらに分析した。その結果、pRBW1とpRBW2は（YCp50ベクターのみではだめであったが）大腸菌（E.coli）に脱ユビキチン活性を与えることが確認された。続いて、pRBW1とpRBW2がコードするUb特異的プロテアーゼを過剰発現させると、大腸菌（E.coli）抽出液でも同様にそれらの検出が可能性であった。
pRBW2の脱ユビキチン活性をコードしているORFは、サブクローニング実験と塩基のシークエンスにより同定されて、UBP2遺伝子と命名された（図３と配列番号No5）。UBP2中の開始コドン（ATG）の位置は、酸性（計算上pI4.95）で、1264残基（145kDa）のタンパク質をコードする、一番長い（3715bp）のORFを生じるように推定された。
pRBW1の脱ユビキチンプロテアーゼをコードしているORFは、サブクローニング実験と塩基のシークエンスにより同定されて、UBP3遺伝子と命名された（図４と配列番号No7）。UBP3中の開始コドン（ATG）の位置は、やや塩基性（計算上pI7.92）で、912残基（102kDa）のタンパク質をコードする、一番長い（2736bp）のORFを生じるように推定された。大腸菌（E.coli）プロモーターの下流にこのORFを含むプラスミド（pRB143）は、大腸菌（E.coli）に脱ユビキチン活性を与えた。
大腸菌（E.coli）でのUBP1,UBP2,UBP3の発現
先に構築されたプラスミドpJT70（pUC19由来）とpJT184（pACYC184由来）は、大腸菌（E.coli）中で弱い活性を有する酵母UBP1プロモーターにより、大腸菌（E.coli）で酵母UBP1を発現した。pRBW2の1.9kbのHind IIIサブクローンは大腸菌（E.coli）にユビキチン活性を与えたが、それはUBP2bORFの3'半分のみを含んでいた。予備実験で、端から削っていったUbp2蛋白質は、大腸菌（E.coli）抽出液に様々なレベルの脱ユビキチン活性を生じた。大腸菌（E.coli）で全長のUbp2を発現するプラスミドを構築するため、pRB6から1.56kbHind III/Xba Iフラグメント（図３参照）として単離されたUBP2の5'端部を、UBP2のHind IIIサイトにの近くにEcoR Iサイトが存在するように、ポリリンカーを含むpRS316にサブクローニングした（Sikorski and Hintter,Genetics 122:19−27（1989））。生じたインサートは、1.57kbEcoR I/Xba Iフラグメントとして切り出した。UBP2の3'端部は、pRB11から〜3.4kbXba I/BamH Iフラグメントとして単離され（図３参照）、UBP2のBamH Iサイトにの近くにPst Iサイトが存在するように、pRS316にサブクローニングした。生じたインサートは、続いて〜3.4kbXba I/Pst Iフラグメントとして切り出された。このフラグメントと上記の1.57kbEcoR I/Xba Iフラグメントを、EcoR I/Xba Iで切ったpKK223−３につないで、pKK223−３のシャインダルジャーノ配列から50bp下流に、正確な方向でつながったUBP2を含む、pRB105プラスミドを（他の生成物の中から）得た。大腸菌（E.coli）で２つの違うプラスミドが同時に存在する必要のある実験のために、pRB105のUBP2/rrnBターミネーター領域を、〜6.4kbSph I/Sca Iフラグメントとして切り出し、Sph I/EcoR Vで切ったpACYC184にサブクローニングし、pRB173を得た。
最初の実験において、Ubp3のUb特異的プロテアーゼの活性は、in vivoで検出されたが、大腸菌（E.coli）抽出液では検出されなかったため、UBP3過剰発現プラスミドを構築した。UBP3の完全な遺伝子を含むpRB27の〜2.9kb Kpn I/Dra Iフラグメントを、Kpn I/Hinc II切断pUC19に、プラスミド側のEcoR IとPst Iサイトを、それぞれ、導入されたインサートのKpn IとDra Iサイトの近傍になるようサブクローンした。インサートは、その後、EcoR I/Pst Iで切り出して、EcoR I/Pst I切断pKK223−３にサブクローンし、pKK223−３のシャインダルジャーノ配列から50bp下流に、正確な方向でつながったUBP3を含む、pRB143を得た。大腸菌（E.coli）中で２つの違うプラスミドが同時に存在する必要のある実験のために、pRB143のUBP3/rrnBターミネーター領域を、〜4.2kbSph I/Sca Iフラグメントとして切り出し、Sph I/EcoR Vで切ったpACYC184にサブクローニングし、pRB175を得た。
さらに最近の実験において、UBP1、UBP2、UBP3は、pKK由来の発現ベクターから、大腸菌（E.coli）で過剰発現された（Ausubel et al.）Current Protocols in Molecular Biology,J.Wiley＆Sons,N.Y.（1989）。それぞれのUBP蛋白質は、全細胞蛋白質の実質比率（１−５％）からなるレベルで発現した。
Ub特異的プロテアーゼの配列の比較
809−残基のUbp1と、1264−残基のUbp2と、912−残基のUb3の配列アラインメントから、それぞれのUbp蛋白質において、数百残基離れて位置している統計上有意な類似性を有する、２つの短い領域は存在するが、これらの蛋白質の間には全体的な配列類似性はないことが示された。類似している２つの領域は、システインと２つのヒスチジン残基の周りに集まっている。Ubp1でみられるように、Ubp2もUbp3もどちらも、第４の即ち酵母のUb−特異的プロテアーゼ、Yuh1やその哺乳類のホモログに、厳密な配列類似性を持たない。Yuh1やその哺乳類のホモログの推測上の活性部位であるシステイン残基を含む領域は、Ubp1−Ubp3の保存されたシステイン領域と似ていない。システイン残基を別にすれば、もう一つの残基だけが６つ全ての蛋白質で相同な領域（Asn）である。Yuh1様プロテアーゼ類の保存された２つのヒスチジン残基の相同的なアライメントと、Ubp1−Ubp3の保存されたヒスチジン残基とには、そのような相同性は見られない。
Ub特異的プロテアーゼのin vitroの機能
前に同定されたUbp1プロテアーゼは、in vitroで、天然のユビキチン前駆体Ubi1−Ubi3や、Ub−Ｘ−βgalとUb−Ｘ−DHFRのような遺伝子操作で作られた融合物を含む、様々な直鎖ユビキチン融合蛋白質を、有効に脱ユビキチンできる。Ubp2（pRB105）やUbp3（pRB143）やYuh1（pKKYUH1）のいずれかを発現する高発現ベクター由来のプラスミドを保持する大腸菌（E.coli）の抽出液を、Ub含有テスト蛋白質と一緒にインキュベートする、類似のアッセイを、これらのプロテアーゼのin vitroでの基質特異性を解析するため用いた。UBP1発現プラスミドpJT70やベクターのみを保持している大腸菌（E.coli）の抽出液も、また、これらのアッセイに使用された。その分解産物は、SDS−PAGEにより分画され、抗Ub抗体を用いたイムノブロッティングにより、または35Sラベルしたテスト蛋白質を用いた直接フルオログラフィーで検出された。
これらのin vitroでのアッセイにおいて、Ubp2プロテアーゼは、特異的なリボゾーム蛋白質と融合している天然のユビキチン前駆体である、Ubi2とUbi3と同様に、Ub−Met−βgalとUb−Met−DHFRを、有効に脱ユビキチンした。Ubp1とUbp2のどちらも、Ub−Ub−Cys（Ｃ末端伸長物の一残基に連結しているジユビキチン）からCys残基を遊離したが、Ub−Ub−CysのUb−Ub連結部は開裂できなかった。Ubp1とUbp2は、先にUbp1で報告されたような５つの直鎖型ユビキチンリピートを含む天然のユビキチン前駆体である、酵母のポリユビキチンのUb−Ub連結部もまた開裂できなかった。このように、Ubp1とUbp2は、全ての試されたユビキチン融合体のユビキチンの最後の（Gly76）残基の後でini vitroで効果的に開裂し、ポリユビキチンのUb−Ub連結部が唯一の例外である。しかしながら、先に示したように、これらのプロテアーゼは大腸菌（E.coli）で同時発現したとき、ポリユビキチンを開裂できる。
pKK高発現ベクター由来のプラスミドpBR143により大腸菌（E.coli）でUbp3を発現させると、期待される分子量の蛋白質が実質的に過剰発現しているが、Ubp3を発現している大腸菌（E.coli）の抽出液は、脱ユビキチン活性を欠失していた。Ubp3は大腸菌（E.coli）でin vivoで確かに活性なので、細胞抽出液で不活性になるか、それらのリボゾーム介在される合成の間か直後にのみユビキチン融合体を分離できるのか、どちらかである。
従来報告された結果に一致して、Yuh1を発現している大腸菌（E.coli）の抽出液は、Ubi2とUbi3のような短いユビキチン融合物を効果的に脱ユビキチンした。しかしながら、Yuh1は、より長いUb−Met−DHFR（ユビキチンの229残基Ｃ末端伸長物）に対して、長時間のインキュベートの後でも融合物を最高でも〜50％しか脱ユビキチンせず、より弱い活性を有し、Ub−Met−βgal（配列番号No1）に対してはほとんど不活性であった。
Ub特異的プロテアーゼのin vivoでの特質
大腸菌（E.coli）の抽出液におけるそれらの活性から期待されるように、Ubp1とUbp2とYuh1は、天然のユビキチン融合物Ubi2とUbi3に対してin vivoでは活性があった。Ubp3は大腸菌（E.coli）の抽出液中においては不活性だが、Ubi2とUbi3と共に大腸菌（E.coli）で発現させた時は、それらを効果的に脱ユビキチンした。Ubi1とUbi2はin vitroでポリユビキチンのUb−Ub連結部は開裂できなかったが、それらの両方とも、大腸菌（E.coli）で同時発現させた時は、酵母のポリユビキチンに対して活性があった。対照的に、Ubp3プロテアーゼはUbi2とUbi3のようなユビキチン融合物に対してin vivoでは活性があるが、同じ条件下で、ポリユビキチンに対しては不活性であった。Ub特異的分解プロテアーゼの間でのこれらの相違は、それらが要求する、Ub−Ｘペプチド結合の付近の蛋白質領域の構造が微妙に違うことを示している。Ubp2とUbp3によるUb−Met−βgalのようなユビキチン融合物のin vivoでの脱ユビキチン反応は、最初のｘ−galスクリーンの結果を確かめるためにパルス追跡分析によっても追跡した。期待したように、それらの両方とも、パルス後15分パルスラベルしたUb−Met−βgalのかなりの割合がそのまま残ったことと、Ubp3による分割が不完全であったことを除いては、in vivoでUb−Met−βgalを脱ユビキチンした。これらの結果は、Ubp3は、Ubp2よりも翻訳と同時的な脱ユビキチン化が厳密であるというパターンと一致する。類似のパルス追跡アッセイにおいて、Yuh1は、in vivoでUb−Met−βgalの脱ユビキチン反応はできなかったが、これは、発生途中（成熟型と異なり）のUb−Met−βgal中のUb−Metペプチド結合はあきらかに感受性が大きいが、Yuh1による脱ユビキチン化を許すには不十分であることを示している。対照的に、この違いはUbp3によるUb−Met−βgalの翻訳同時的な（しかしあきらかに翻訳後ではない）脱ユビキチン反応をゆるすのに十分である。
均等範囲
当業者であれば日常の実験方法により、本明細書中に記載された発明の具体的な態様の多数の均等物を確認できるであろう。
これらの均等物は以下の配列表の後に続く請求の範囲により包含されるよう意図される。
（２）配列情報SEQ ID NO:1:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:3365塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ix）特徴：
（Ａ）NAME/KEY:CDS
（Ｂ）存在位置:1..3363
（xi）配列:SEQ ID NO:1:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:1121アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列:SEQ ID NO:2:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:2845塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ix）特徴：
（Ａ）NAME/KEY:CDS
（Ｂ）存在位置:193..2619
（xi）配列:SEQ ID NO:3:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:809アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列:SEQ ID NO:4:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:6008塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ix）特徴：
（Ａ）NAME/KEY:CDS
（Ｂ）存在位置:983..4774
（xi）配列:SEQ ID NO:5:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:1264アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列:SEQ ID NO:6:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:4887塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ix）特徴：
（Ａ）NAME/KEY:CDS
（Ｂ）存在位置:1278..4013
（xi）配列:SEQ ID NO:7:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）配列の長さ:912アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列:SEQ ID NO:8:
Claims (7)
- ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、配列番号５に示されるDNAと特異的にハイブリダイズする能力により特徴づけられる、ユビキチン特異的プロテアーゼをコードする単離されたDNA。
- 配列番号５で示される配列により特徴づけられるDNAを発現可能な形態で含んでなる、タンパク質分解活性を有するユビキチン特異的プロテアーゼをコードする単離されたDNA発現構築物。
- 配列番号５で示されるDNA配列を発現可能な形態で含んでなる、タンパク質分解活性を有するユビキチン特異的プロテアーゼをコードする異種のDNA発現構築物で形質転換された細胞。
- 原核細胞である、請求項３の細胞。
- 大腸菌（E.coli）である、請求項３の細胞。
- 請求項１に記載の単離されたDNAによりコードされる、ユビキチン特異的プロテアーゼまたはその生物学的活性部分。
- 興味のある非ユビキチンタンパク質またはペプチドのＮ末端アミノ酸残基と融合したＣ末端アミノ酸残基を有するユビキチンからなるユビキチン融合タンパク質を、脱ユビキチンするための方法であって、
ａ） ユビキチン融合タンパク質を単離し、
ｂ） 配列番号:5で示されるDNA配列に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする能力により特徴づけられるDNA配列によりコードされる、ユビキチン特異的プロテアーゼと、ユビキチン融合タンパク質を接触させる、
ことからなる方法。
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