JPH03503840A - 異種連結抗体およびその治療的使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 異種連結抗体およびその治療的使用 １崖 過去１０年問に、ヒト疾患の治療に対する生物活性剤たとえばＷ素、ホルモンま たはリンホカイン（すなわち、インターフェロン−α、インターフェロンーＴ、 インターロイキン−２）の利用は、驚異的な進歩を示してきている。その＊要Ｕ 、Ｏｌｄｈａｍ、　Ｒ，に、、　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　６　：１２７〜１４３ 　（１９８５）　：０１ｄｈａｎ、Ｒ，に、、　ＣａｎｃｅｒＴｒｅａｔ　Ｒｅ ｐ、　　６　剣、２２１〜２３２　（１９８４）を参照されたい。また、Ｇｕａ ｒｉｎＯ，Ａ、　Ｈ，ＨｅｔｈＯｄＳ　ｉｎ　Ｃａｎ＝ＣｅｒＲｅｓ、　　２０ ：９１〜１７０．１９７９（抗癌剤の薬理学的研究の要約）も参考になる。

このような実験的薬物療法の増加は、その大部分が免疫学と組換えＤＮＡ技術の 同時的な進歩の結果である。

とくに、免疫学における進歩は、にｏｈｌｅｒとＨｉｌＳｔｅｉｎ。

Ｎａｔｕｒｅ　　２５６：４９５　（１９７５）の独創的な仕事によってにｊ激 された。彼らは、リンパ球と骨髄腫ｓ謝の間の体細胞融合法によって、培養液中 で生育し、特異的な抗体を産生ずる不死化「ハイブリドーマ」が得られることを 明らかにした。このような抗体は、本明細書および本技術分野では「モノクロー ナル」と呼ばれる。

この時以来、新しい性質をもち、免疫療法および免疫診断への適用に有用な新世 代の抗体が開発されるようになった。たとえば、異種生物からの免疫グロブリン 可変頃域とＨ鎖領域で構成されるキメラ抗体が合成された。

さらに、異種骨髄腫由来の免疫グロブリンし鎖が特異的な異種会合を形成するこ とも明らかにされている。

Ｐｅａｂｏｄｙ、　Ｄ、　Ｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　１９　：　２　Ｂ　２７　（ １９８０）。２種の異なるリガンドに対して結合親和性を有する抗体フラグメン トのｉｎ　ｖｉｔｒｏｌｌ築も達成されている。

Ｒａ５ｏ、Ｖ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４１　：　２０７３　（１９８１ ）。

基本的なにｏｈｌｅｒ−Ｈｉ　１ｓｔｅｉｎ法をさらに改良づることによって、 ２種の異なる抗原に結合できる単独で：官能性の抗体を産生させることが可能に なった０２種の抗原の一方に特異的な七ツクローナル抗体を産生ずる各母系のハ イブリドーマ１ｉｒＩＡ系２擾を融合させれば「クアドローマ」が生成する。ハ イブリドーマとリンパ球の融合では「トリオーマ」が生成する。このような組合 せは、本明細書および本技術分野では「ポリドーマ」と呼ばれる。

たとえば、米国特許第４．４７４，８９３号（１９８４）；ＰＣＩ−特許第ＷＯ ３３１０３６７９号（１９８３）を参照されたい。これらの記載は参考として本 明細書に導入する。モノクローナル抗体、キメラ抗体、およびポリドーマの多官 能性抗体の用途は多様である。

これらの抗体は、腫瘍の冶＠　（Ｒａｓｏ　＆　Ｇ１ｆｆ１ｎ。

ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、４１　：２０７３．１９８１＞、免疫診断法（Ｌｉｔｌａ ｎら、−Ａｎａ±Ｂｉｏｃｈｃｖ、　　１０６　：　２２３　、　１９８０　） および免疫組織学（Ｓｕｒｅｓｈ、　Ｈ，Ｒら、ＰＮＡＳ　　８３ニア９８９〜 ７９９３　（１９８６）に利用されている。大部分の使用例では、組換えモノク ローナル抗体は、染料、薬剤またはトレーサー化合物に共有結合で付着される。

この点においてはポリドーマがとくに有用である。たとエバ、ヒｖ　（Ｒｉｃｉ ｎｕｓ　ｃｏｍｉｕｎｉｓ）　；Ｉｓ素に特異的な結合部位１個と腫ｓＩＩ胞に 特異的な他の部位とを含有するポリドーマが製造できる。組織特異的抗原を蛍光 プローブに対するモノクロ−サル抗体と一緒に含有するポリドーマを合成するこ とができる。

しかしながら、免疫療法および免疫診断法におけるモノクローナル抗体および生 物活性化合物の両者の使用には欠点がある。各種リンホカインと、植物もしくは 細菌毒素、ｆｌ標識または染料細胞毒素に結合させたモノクローナル抗体の使用 は、患者に注射する際に危険が伴う。

注射した免疫原に対する抗体を発生する可能性があり、その結果、ヒトで抗イデ イオタイプの応答を示し、免疫原性活性カ失われる。Ｔａ１ｌｅ、　Ｈ，Ａら（ ＥＰＯ第８６３゜０８７．８５４号）参照。さらに、絹換え薬剤製品の使用には 、外因的に産生された物質の大壷投与による治療にかかる費用のために限界があ る（すなわち−人の癌患省のインターロイキン−２療法に対して１９．０００ド ル）。しかも、薬剤の開発過程自体に一般的に２〜１０年を要し、ひとつの薬剤 を着想から市場に載せるまでには数千万ドルの経費がかかるとされている。

上述の限界を克服する治療様式を案出することも有用と思われる。はとんどすべ ての疾患または病的状態は、その疾患または病因的因子に対する不→−分なまた は不適当な身体の応答によって生じるものであるから、宿主自身が内因的に産生 する生物活性化合物を利用させまた増加させる処置は、治療の効率を増大させ、 またこのような治療をより安全でより安価なものとする筈である。

本発明は、治療および診所におけるポリドーマおよび生物活性化合物の利用への 新規なアプローチを開示するものである。一つの抗原結合部位が標的と反応性を 有し、他の部位が少なくとも１種の内因性生物活性物質の利用を開始、指図また は促進し得るポリドーマを用いることにより、本発明は、宿主に存在する生体内 分子の局所濃度を変えて標的への生体の正常な応答を増大または集中化する方法 を開示する。以下に述べるように、毒素、染料または放射標識を含まないこれら の多官能性抗体に臨床的有用性が認められる疾患および病躯は多い。

ｌにｌ濃 本発明は、リガンドおよび少なくとも１種の内因性生物学的応答修飾物質と特異 的に反応する多官能性抗体を用いる治療的処置方法を提供する。この抗体は、内 因性生物学的修飾物質を、治療効果を生じる標的リガンドにまたはその付近に、 濃縮する役割を果たす。本発明は、標的リガンドおよび内因性生物学的応答修飾 物質の両者と特異的に反応する多官能性抗体の薬剤学的有効量を投与することを 含む治療方法を提供する。

図面の簡単な説明 第１図は、標的化された異種連結モノクローナル抗体によって腫瘍細胞が殺滅さ れる４種類の機構を模式的に例示する。

第２図は、１７−１ＡｘＢ１４０クアドローマのクロマトグラフィーによる単離 の結果を示す。

第２Ａ図は、プロティン−Ａ　セファロース　クロマトグラフィーを用いる単離 を例示する。

第２８Ｍは、疎水的相■作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いる単離を例示 する。

第３図は、８Ｂ４クアドローマのＳＯＳ　：ポリアクリルアミドゲルを示し、８ Ｂ４が１：１の比の１７−１Ａと８１４０　　ＩＱＨ鎖を含むことを示している 。

第４図は、８Ｂ４の等電点電気泳動ゲルを示し、８Ｂ４の等電点がその母体の抗 体の平均であることを足木発明は、天然の生物活性化合物を、患者体内の１個ま たは複数個の特定部位にまたはその付近に濃縮させる治療方法を提供する。本明 細書において用いられる「生物活性」化合物、「生物学的応答修飾物質、１また は［内因性生物学的ｖｉ飾動物質　（ＥＢＭ）の表現は同等に用いられ、患者の 利益のために生物学的応答を変化させる、患ちによって産生された物質をいう。

本発明に使用するのに適当な内因性生物学的修飾物質の一部を挙げれば、リンホ カインたとえばＢ１１ｇ１因子、インターフェロンおよびインターロイキン；酵 素たとえば組織プラスミノーゲンアクティベーター、ホルモン、免疫グロブリン 、蛋白質、補因子、代謝物、抗原決定基、塩およびイオンがある。本発明の好ま しい態様においては、内因性生物学的応答修飾物質は、リンホカインまたは酵素 、たとえばそれぞれインターフェロン−γまたは組織プラスミノーゲンアクティ ベーター（ＴＰＡ）である。

本発明は、これらの生物活性物質の、特定の標的部位またはりガントにおける濃 度を増大させる方法を包含する。この「標的部位」は生体内に存在し、抗原また は抗原上における１個もしくは２個以上のエピトープである。

「抗原」の語は本技術分野ではよく知られていて、抗原と反応する抗体の産生を 生体内において刺激する、通常は蛋白質または炭水化物の、生物学的構造または 「エピトープ」をいう。本発明において適当な、予め選択される標的部位の一部 を示せば、Ｔ細胞、Ｂ１１胞、内分泌細胞、神経細胞のような正常細ｍ：癌側り 良性の疾患細胞、フィブリンおよび血小板を含む血栓：プラーク、アミロイドお よび炎症関節のような疾病過程：寄生体、ホルモン、細菌、ウィルス、免疫グロ ブリン、毒素及び／または代謝物がある。予め選択される標的部位またはリガン ドは、好ましくは癌細胞または血栓でおる。

本発明の治療方法は、多官能性または「異種連結」抗体の投与を包含する。本明 細書において用いられる「異種連結抗体」の詔は、同−分子上に少なくとも２種 の異本発明の異種連結モノクローナル抗体（以下、ＨＬＭＡｂと略す）は、標的 部位またはリガンドの位置において上述の内因性生物活性分子に結合し、これら を濃縮させるのに有用である。本発明の方法は、予め選択された標的部位および 生物活性物質の両者に′！Ｉ！興的に結合するＨＬＭＡｂの薬剤学的有効量を投 与することを含む。ＨＬＭＡｂは、宿主の内因性生物活性化合物が標的に応答す るかまた標的に対して臨床的に望ましい応答を誘Ｓするように、標的リガンドを 宿主の代謝系及び恒常性制御系の生物活性成分に接近させるものと考えられる。

換言すれば、本発明は、標的リガンド／抗原に対する患者の正常な応答を、宿主 の内因性生物学的応答修飾物質の８Ｗｒ瀧度を変えることによって、増強および ／または集中させる方法である。ＨＬＭＡｂが最初に生物活性分子に結合し、つ いで標的リガンドに結合するか、またはその逆であるかは重要ではない。本発明 の作用様式は、操作的には、標的部位に内因性生物活性物質を濃縮すること、及 び／又は循環している生物活性物質に大壜の受容体を提供するために標的部位の 表面をｌ−Ｉ　ＬＭＡ　ｂ″Ｃ″ｌうことと定義される。本発明はこれを、ＨＬ ＭＡ　ｌ：）の２種またはそれ以上の物質と同時に結合できる能力によって、す なわち２種もしくはそれ以上の異なるａＸ種または２種もしくはそれ以上の異な る生物活性物質を接近させることによって達成する。本明細書に記載された異種 連結抗体の適当な投与量は所望の治療効果によって変動する。

ＨＬＭＡｂの製造方法は、本技術分野においてはよく知られている。一般的には 、本発明のＨＬＭＡｂは、２種（またはそれ以上の）モノクローナル抗体を結合 することによって形成されよう。この場合、モノクローナル抗体の少なくとも１ 種は天然の生物活性分子に、および／または、標的リガンドに対する宿主の生物 学的応答に彰費を与える内因性標的細胞上の表面抗原に、特異的に結合する。Ｈ ＬＭＡｂの他の部分は、予め選択された標的抗原、たとえば！！瘍会合抗ｆｆｌ 　（ＴＡＡ＞　、外来の抗原または正常細胞抗原またはｍ胞生成物に結合するＭ Ａｂからなる（標的および内因性生物学的修飾物質については添付の第Ｉ表参照 ）６ ＭＡｂの結合によるＨＬＭＡｂの形成は、１）２種（またはそれ以上の）母体Ｍ ａｂ産生細胞（ハイブリドーマ）の、天然細胞産生物としてＨＬＭＡｂを産生す る単一細胞への融合、または２）ＭＡｂ産生ハイブリドーマと、他の所望の抗原 に特貢的結合精相性を有する抗体を産生するリンパ球との融合によって行われる 。このハイブリッドハイブリドーマは、ハイブリッドが２種のハイブリドーマ、 または２種もしくはそれ以上のハイブリドーマの融合によって生じた場合は、そ れぞれ「クアドＯ−マ」、または「ポリドーマ」と呼ばれる。ハイブリドーマと 抗体産生リンパ球との融合生成物は「トリオーマ」と呼ばれる。トリオーマを製 造する一方法は米国特許第４．４７４．８９３号に開示されている。その関達配 較を参考として本明細書に導入する。また、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ。

Ａおよびり、　Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ：　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ− も参照のこと。

異種連結ポリクローナル抗体またはＨＬＭＡｂを、抗体または抗体フラグメント の単離および精製侵の化学的組換えによって製造する様々な方法もある。Ｐａｒ ｈａｍ、　Ｐ、。

Ｈｕｍａｎ　１ｍ１ｌｕｎｏ１．、１２　：　２１３−２２２　（１９８５）。

本発明の実施態様に臨床的有用性が見出される疾患および病態は多い。これらの 一部の例を挙げれば、新生物（癌）、心脈管系疾患、自己免疫疾患、ウィルス、 細菌および寄生体ｒｓ染、神経疾患、内分泌系および代謝性疾患、血液および造 血器官の疾患、呼吸器系疾患、皮膚および皮下組織の疾患、筋骨格および結合組 織の疾患、先天性異常、−書ならびに中毒がある。

本発明の一態様においては、異種連結抗体は外因性の天然生物活性物質たとえば Ｉ　Ｌ　−２または１′ンターフエＤンーγとともに投与される。この場合、こ れらは、生物活性化合物がすでに六種連結抗体に結合している抗原−抗体複合体 として技投与され、抗体は、結合した分子がその標的に到達するまでｉｎ　ｖｉ ｖｏの分解からそれを保護するように働く。異種連結抗体はまた、最大ミの抗体 をｌ１１１１１．：結合させるため、かなり長期間にわたって導入することもで きる。このとき標的細胞は生物学的応答修飾物質に対づる受容体を事実上有する こととなり、外因的に投与された同物質の低濃度でのｗｉ期＠処理に選択的な感 受性を示すことかできる。本発明はまた、ｉｎ　ｖｉｔｒ。

では、ざらに効果的に！！瘍細胞を排除、選択、除去するために使用できる。こ の例には、自己骨髄細胞を放射線照射処置癌患者へ戻す前にｉｎ　ｖｉｔｒｏで 癌細胞を除去する場合がある。

本発明の好ましい態様においては、標的抗原および内因性ヒト・インターフェロ ン−７（ＩＦＮ−７）の両者に対する双特異性を有する異種連結抗体を、腫瘍を 有する患者に注射し、これを腫瘍表面抗原またはエピトープに結合させることに より腫瘍部位に局在させることができる。このときクアドローマの抗−ＩＦＮ− １部分は、腫ｌＩＩ［ｌ刷上の内因性ＩＦＮ−γに結合し、これを濃縮する。

ついでＩＦＮ−７は少なくとも３種の別個の独立した機構によって、＠揚細胞の 殺滅を仲介する。すなわち、１＞ＩＦＮ−７’の直接的なｍ胞毒性、２）ＩＦＮ −Ｔによる活性化後の、抗体非依存性の単球仲介ａｍ毒性および３）Ｌ、ＡＫお よびＴＩＢ胞を活性化するモノ力インＩＬ〜１およびＩＬ−２のＩＦＮ−γ誘導 後の、単球非依存性のリンパ球依存性ｉｆ胞毒性である。クアドローマの性質に よっては、第４の機構、すなわち単球上のＦｃ受容体への抗体結合後の単球によ って仲介されるＡＩＤＣ，Ｃ（ｌｌｉ’Ｅ体依存性ｍ脂性細胞毒性）も含まれる 。

内因性［ＦＮ−γを濃縮する際の本発明、その操作およびその効果は第１図に例 示する。第１の機構においては、異種連結ＭＡｂから放出されたＩＦＮ−γ、ま たは腫瘍細胞によって吸飲されたＭＡｂ結合ＩＦＮ−ｒが直接、細胞に対して細 胞毒性を示す。第２の機構においては、放出または結合されたＩＦＮ−γが付近 の単球を活性化し、ついでこれが接触したｉ！瘍細胞を非特異的に溶解する。第 ３の機構においては、単球が上述の場合と同様に活性化されるが、その活性化さ れた単球（マクロファージ）によって分泌されたリンホカインが隣接するリンパ 球の活性化を介して溶解反応を増幅する。第４の機構は、異種連結ＭＡｂが単球 のＦｃ受容体に特異的に結合し、結合された単球に細胞溶解性のＡＤＣＣ反応が 可能な場合に引き起こされる。

本発明は、完全な鎖のＨＬＭＡｂに限定されるものではなく、くＦａｂ′　）２ または（Ｆａｂ）２フラグメントから作られたものも包含する。さらに、本発明 は、悪性腫瘍細胞を標的とするＣとに限定されるものではなく、任意のｍ胞集団 、異常有機体または異常分子を標的とすべく　ｉｎ　ｖｉｙｏまたはｉｎ　Ｖｉ ｔｒＯのいずれにおいても使用される（第１表参照）にの応用例としては、抗− リボ多糖と抗−マクロファージからなるポリドーマによるダラム陰性細菌へのマ クロファージの送達がある。他の可能性としては、リューマチ因子とインターフ ェロン−γの両者に対するポリドーマによる開部リューマチの処置がある。さら に他の例には、血栓溶解剤および線雑素溶解剤として用いられる、抗−血小板お よび抗−ＴＰＡトＩＬＭＡｂを含むＨＬＭＡｂ物質がある。

第工表 異種゛結モノクローナル抗体用の内因性生物学的修飾物ｉｔ　（ＥＢＭ）と標的 の一部 ＥＢＭ　　　　　　　　　　　標的 Ａ、リンホカイン　　　　　　Ａ癌細胞ＯＢ細胞因子　　　　　　８．正常細胞 Ｏインターフェロン　　　　○Ｔｉｔ胞０ＩＬ−２０Ｂ［ｌ胞 Ｂ、モノ力イン　　　　　　　　Ｏ内分泌腺、神軽０ＴＮＦ　　　　　　　　　 Ｃ良性疾患細胞○ＩＬ−１０，血栓 Ｃ「細胞集団　　　　　　　　Ｏフィブリン○細胞毒性細胞　　　　　　○血小 板 Ｏ活性化”ｒ　ｍ胞　　　　　［、疾病過程Ｄマクロファージ　　　　　　Ｏア ミロイドＥ、ＮＫ細胸　　　　　　　　　ＯプラークＦ酵素　　　　　　　　　 　　Ｏ炎症関節Ｇホルモン　　　　　　　　Ｆ、寄生体１　「接触」蛋白質　　 　　　Ｇ、細菌１゛補因子・　　　　　　　　　Ｈ、ウィルス代謝物　　　　　 　　　　１．天然毒素に、「抗原」　　　　　　　　Ｊ免疫グロブリンし、塩、 イオン　　　　　　　にホルモン［代謝物 本発明は、治療効率を増大させ、それをより経済的にするものである。これは、 とくに、外因性生物活性物質を使用する本発明の態様において事実である。生物 活性物質が投与前にＨＬＭＡｂに結合されている場合には、それらはすでにその 部位に対して標的化されているのであるから、低用量を注ｒｊＡすべきである。

次に、本発明を以Ｆの実施例により説明する。

例■：異種連結抗体の製　と精製 標準的なにｏｈｌｅｒ−Ｈｉｌｓｔｅｉｎ免疫処冒およびハイブリドーマ法で製 造したモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を同定した。腫瘍選択性ＭＡｂは、結直ｌ ！癌、乳癌および卵巣癌から発生させた。インターフェロン−Ｔ１インターＯイ ＊ン−２、ｌ！［＠死因子（ＴＮＦ）、およびＴｉ１ｌ胞に対する抗体も発生さ せた。抗体はすべてマウス起源で、免疫グロブリンＩｇＧクラスであった。

これらのハイブリドーマの数種は、プロトプラスト融合技術を用い細菌プラスミ ドベクターでＤＮＡｌ−ランスフエクシＪンを行って、薬剤抵抗性または薬剤選 択可能とした。に旧ｇｈｔ、　Ｄ、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｈ，Ｃ５ｃｒｕｔｔｏｎ、 　Ｂｉｏｃｈｅｇｔ。

Ｊ、　　２３４：４９７．１９８６およびｐｏｔｔｅｒ、　Ｈ；ら、Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　８１　：　７１６１．１９８４１ １、アミノグリコシド３−ホスホトランスフェラーゼ（ａｐｈ）およびキサンチ ン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｑｌ）ｔ＞遺伝子の導入には 、それぞれ、綱！ＷＤＮＡプラスミドベクターｐＳＶ２−ｎｅｏ　（ＡＴＣＣ＃ ３７１４９）およびＤＳＶ２−Ｑｐｔ　（ＡＴＣＣ＃３７１９９）を用いた。ｌ ！瘍抗原に対するＭＡｂを分泌するハイブリドーマはＤＮＡｌ−ランスフエクシ ョンによりＧ４１８抵抗性（ａｐｈ＋）を生ぜしめ、生物学的応答ｆ＆篩物質に 対するＭＡｂを分泌するハイブリドーマはトランスフェクションによりマイコフ ェノール酸抵抗性とした（ｇＤｔ＋）。各薬剤の用量を上界させてトランスフェ クシントの培養を行い、トランスフェクションを受けなかったすべての細胞（ａ ｐｈ−、ｇｏｔ−）の絶対的致死石の少なくとも２〜３倍の薬剤投与量レベルで も生育し続けるようにした。

ハイブリドーマ融合が成功した肯定的な選択は、両薬剤の存在Ｆに融合ハイブリ ドーマを培養することによって達成される。ハイブリドーマの真の融合は二重の 薬剤選択性を示す（ａｓｈ”　、　ｇｐｔ”　）。

数種の細胞−細胞融合は、結直腸癌抗原に対するＭＡｂ（１７−１Ａ、］ＱＧ２ ａ）を分泌するハイブリドーマの１種およびヒトインターフェロン−γ（１３１ ４０；ＩｇＧ１）に対するＭＡｂを分泌するハイブリドーマの１種を用いて行わ れた。融合体は、１述のように、Ｇ４１８およびマイコフェノール酸の両者の存 在下に培養し、クローン化した。二重選択培地上で生育した生存融合細胞系につ いて、次に巽種二宮能性活性を試験した。

この検定には、固相上の免疫アフィニティー精製１７−１ＡＩ瘍抗原と、トレー サーとして放銅標５ｉｌｌ　ＦＮ−７を使用した。放射標識インターフェロント レーサーの結合は異種官能性活性、すなわち、１７−１Ａ抗原およびＩＮＦ−γ の両者への結合部位を有する抗体の存在を指示した。

２種の異種連結クローン、８Ｂ４および１Ｂ１０が更に再クローニングを行うた めに選択された。８１３４および１Ｂ１０両者のために腹水およびハイブリドー マ上澄液を作成した。これらの２種の細胞系は６回置クローニングして、安定な りローンが最終的に見出された。ついでこれらは、上澄液と腹水からの抗体の産 生に使用するため増殖させた。六種二官能性抗体の精製プロトコールは、プロテ ィン−Ａアフィニティー、イオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィー を含む、免疫グロブリンの単離および分離の際の慣用のクロマトグラフィー技術 を用いて開発した。

クローン８Ｂ４によって分泌された免疫グロブリンの特性を調べた。クローン８ Ｂ４は１７−１Ａおよび８１４０両社体ＭＡｂならびに異種二官能性抗体を分泌 する。

この免疫グロブリンは、プロティンＡクロマトグラフィー、ついで疎水性相互作 用クロマトグラフィー（ＨＩＧ）分離によって精製した（それぞれ、第２Ａ図お よび第２Ｂ図）。結果は、クローン８Ｂ４によって産生された抗体の８０％が異 種連結性だったことを示している。腹水には異種二官能性１７−１ＡＸＢ１４０ が１１１１／ｄはど生成した。８Ｂ４クアドローマのＳＤＳ　：ＰＡＧＥゲル上 の挙動（第３図）、および等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル（第４図）は、８８４ が２種の母体抗体の１：１の典型的な結合体である証拠をさらに提供するもので あった。ＳＤＳ　：　ＰＡＧＥゲル検定（第３図〉により８Ｂ４は１７−１Ａお よびＢ１４０の両免疫グロブリンＨ鎖を１：１の比で含有することを明らかにし 、またＩＥ、Ｆでは８８４の等電点が、期待されたように２錫の母体抗体の正確 な平均値であることを示している（第４図）。我々はまた、１７−１Ａ抗原およ びＩＦＮ−γの異種二官能性の相対的親和性を決定する実験を行った。８８４異 種抗体のＩＦＮ−１部分の親和性はほとんど変化していないが、腫１１１７−１ Ａ抗原へのポリドーマの結合能はファクター３〜４倍はど低下している。

これは、８８４の抗原への結合は１１ｉ＋であるのに対し、１７−１Ａの結合は ２価である事実によるものであろう。

両者の間に固有の親和性の差は多分ないが、１７−１Ａ抗体の多価結合は、会合 の自由エネルギーへのエンタルピー寄与を大きくし、したがって同じ抗体濃度で も高い結合性を示すものと考えられる。

本例は、ヒト結謁癌１１胞に対するＩＦＮ−γの　１ｎＶｉｔｒＯ標的化を例示 し、腫瘍Ｉ［胞が殺滅される一機構が抗体依存性のＩＩ胞性細胞毒性によるもの であることを示唆する（機構４；第１図）。

ヒト結＠Ｈ丁２９　（ＡＴＣＣＮｏ、ＨＴＢ　　３８）を１０’　ｉｔ胞／ウェ ルの濃度で培養し、フルオロウラシルデオキシリボース（ＦＵｄＲ）の存在下１ ２５Ｉ−ウラシルデオキシリボース（ＵｄＲ）により約２４時間標識した。細胞 を洗浄し、ついでヒト末梢単球の存在下または非存在下に約７２時間共培養した 。単球濃度は８または１５Ｘ１０’細！ｌｌ！／ウエルとした。ＷＩおよび単球 は、組換えＩ　ＦＮ−７（ｒ　Ｉ　ＦＮ−７）と、ＨＬＭＡｂ８Ｂ４または等モ ルの１７−１Ａ＋８１４０母体抗体の存在下に培養した。すべての抗体は、無視 できる値のエンドトキシン、強力なマクロファージのアクティベーターを含有し ていた（［１リボ多糖１工ンドトキシン単位／■抗体）。

腫瘍細胞を溶解させ、１００μｌの上ｌＷ液から遊離した放射能（Ｉ−ＵｄＲと して）を計測した。細胞毒性パーセントは、上澄液中にｍ胞から放出された総カ ウント数の分画Ｘ１００として計算したく第２表）。

第２表 ＨＬＭＡｂ　　８Ｂ４および８１４０＋１７−１＾混合物のＩＦＮ−γ誘発単球 ＷＡｌｌ毒性に対する作用θ　　　　　なし　　　　　　　　０．４７　　　　 ４．３　　　　　　　　５．３８Ｂ４（１０）　　　　　−１，０６６，０１（ ３９，７）　ａｌｏ、６１（１００）ａＢ１４０（５）４１７−１＾（５）　　 　−０，５８４，７７（１，０９＞　　　　　　８．６６（６３）０５　　　　 なし　　　　　　　　−１，２３５，４２７，０７８Ｂ４（１０）　　　　　　 　−０，５３６鈴（２１，７＞　　　　　＋１．８４（６７，４）Ｂ１４０（５ ＋４１７−１＾（５）−０，Ｂ８　　　　７．１９（３２，６＞　　　　　　８ ．３１（１７，６）５　　　　　なし　　　　　　　　−０，７７８，６０１３ ，０８８Ｂ４（１０１−１，４１６，０７（−２９，４）　　　　’　１１．３ ４（−９，５）Ｂ１４０（５）＋１７−１＾（５）　　　−０，１７７，１９（ −１６，３１８，８４（−３２，４）ａ　カッコ内の数字は、抗体を含まない対 照と比較した場合のｍ胞毒性のパーセント変化を示す。

ＩＦＮ−γおよび単球の存在下におけるＩＩｓ細胞へのＨＬＭＡｂ　　８Ｂ４の 添加は、抗体なしまたは母体ＭＡｂ混合物のいずれの対照と比べても、小さくは あるが一定した細胞毒性効果を示した。これはエフェクター：標的の比が高いほ どとくに顕著である。これは低レベルのＩＦＮ−γ（０および０．５単位／ａｔ ）の存在）において事実であった。単球自体がＩＦＮ−γを分泌するので、実際 にはＩＦＮ−γレベルはもつと高かったと思われる。しかも、この結果は、ＭＡ ｂ　　１７−ＩＡ自体がＨＬＭＡｂ　　８Ｂ４よりもマクロファージｌ”ｃ受容 体を効率的に結合するので、ｌ」ＬＭＡｂ　　８［３４がＩＦＮ−γの標的化に よる局所腫瘍殺滅効果を増強する能力は、実際に過少評価されていると考えられ る。

本発明は、生体内の特定の部位、すなわち結直腸腫瘍への内因性インターフェロ ン−Ｔを濃縮するために使用できるため、治療操作において有用な１７−ＩＡＸ Ｂ１４０（抗−腫瘍×抗−インターフェロンーＴ）クアドローマの発生を開示す るものである。さらに一般的には、本川ｍ書に記載したような種類の多官能性抗 体は、癌、心脈管系疾患、感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患等の治療剤として 有用であり、組換えＤＮＡ技術由来の治療用化合物による高価な、時間のかかる 、毒性の考えられる処置過程を必要としない。

均等物 本技術分野における熟練者によれば、単なる定常的な実験を用いるだけで本明細 書に記載された発明の特定の態様と均等な多くの態様が可能なことは自明であり 、それを確認することができるものである。このような均等な態様は以下の請求 の範囲に包含されるものである。

肖、填Ｉ：　　、！を番孔、テＡ作用 イ剥ト右４２嘗舌イ・王化刈εヰ；１；訳ろｌａヲ＆’オ賢槙３：　リン爪カイ ン活ｌ違イし車ポｌ〕；ろ化Ａゝ４Ｒ−４４：　　ｔノ［＜＊イｂ＠ａｈ記性和 ｆ４１＠−４）主ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、２Ａ ＦＩＧ、　３ ヤレ ＦＩＧ、　４ 国際調査報告 国際調査報告

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．患者の体内の特定の部位に天然の生物活性化合物を濃縮する冶療方法であっ て、少なくとも１種の生物活性化合物と反応しかつ少なくとも１種の予め選択さ れた標的リガンドと反応する異種連結抗体を投与することを含む方法。
2. ２．生体内の標的リガンドの部位に内因性生物学的応答修飾物質を濃縮する方法 であって、少なくとも１種の生物学的応答修飾物質に結合しかつ少なくとも１種 の該標的リガンドに結合する抗体の十分量を投与することを含む方法。
3. ３．生体内の標的リガンドの部位に内因性生物学的応答修飾物質を濃縮する方法 であって、少なくとも１種の生物学的応答修飾物質および標的リガンドと結合可 能な多官能性抗体を、有効量の生物学的応答修飾物質とともに投与することを含 む方法。
4. ４．生物学的応答修飾物質は、リンホカイン、モノカイン、Ｔ細胞集団、マクロ ファージ、ＮＫ細胞、酸素、ホルモン、免疫グロブリン、補因子、代謝物、塩、 イオンおよび抗原決定基からなる群より選ばれる請求項２記載の方法。
5. ５．リンホカインは、Ｂ細胞因子、インターフェロンおよびインターロイキン− ２からなる群より選ばれ、モノカインはＴＮＦおよびインターロイキン−１から なる群より選ばれ、Ｔ細胞集団は細胞毒性細胞および活性化Ｔ細胞からなる群よ り選ばれる請求項４記載の方法。
6. ６．標的リガンドは、癌細胞、正常細胞、良性疾患細胞、血栓、疾患過程、寄生 体、細菌、ウイルス、天然毒素、免疫グロブリン、ホルモンおよび代謝物からな る群より選ばれる請求項２記載の方法。
7. ７．正常細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内分泌および神経細胞からなる群より選ばれ 、血栓は、フィブリンおよび血小板からなる群より選ばれ、疾患過程はアミロイ ド、プラークおよび炎症関節からなる群より選ばれる請求項６記載の方法。
8. ８．生物活性化合物を患者に送達する方法であって、該生物活性化合物と特異的 に反応しかつ生体内の標的リガンドと特異的に反応する異種連結抗体の十分量を 投与することからなる改良。
9. ９．少なくとも１種の内因性生物学的応答修飾物質および少なくとも１種の予め 選択された標的リガンドと特異的に反応する異種連結モノクローナル抗体。
10. １０．生物学的応答修飾物質は、リンホカイン、モノカイン、Ｔ細胞集団、マク ロファージ、ＮＫ細胞、酸素、ホルモン、免疫グロブリン、補因子、代謝物、塩 、イオンおよび抗原決定基からなる群より選ばれる請求項９記載の異種連結モノ クローナル抗体。
11. １１．リンホカインは、Ｂ細胞因子、インターフェロンおよびインターロイキン −２からなる群より選ばれ、モノカインは、ＴＮＦおよびインターロイキン−１ からなる群より選ばれ、Ｔ細胞集団は、細胞毒性細胞および活性化Ｔ軸距からな る群より選ばれる請求項１０記載の異種連結モノクローナル抗体。
12. １２．標的リガンドは、癌細胞、正常細胞、良性疾患細胞、血栓、疾患過程、寄 生体、細胞、ウイルス、天然毒素、免疫グロブリン、ホルモンおよび代謝物から なる群より選ばれる請求項９記載の異種連結モノクローナル抗体。
13. １３．正常細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内分泌および神経細胞からなる群より選ば れ、血栓は、フィブリンおよび血小板からなる群より選ばれ、疾患過程はアミロ イド、プラークおよび炎症関節からなる群より選ばれる請求項１１記載の異種連 結モノクローナル抗体。
14. １４．ａ．リンホカイン、モノカイン、Ｔ細胞集団、マクロファージ、ＮＫ細胞 、酸素、ホルモン、免疫グロブリン、補因子、代謝物、塩、イオンおよび抗原決 定基からなる群より選ばれる生物学的応答修飾物質に特異的に結合する少なくと も１個の抗原結合領域、およびｂ．癌細胞、正常細胞、良性疾患細胞、血栓、疾 患過程、寄生体、細菌、ウイルス、天然毒素、免疫グロブリン、ホルモンおよび 代謝物からなる群より選ばれる標的リガンドに特異的な少なくとも１個の抗原結 合領域を含む二官能性抗体または異種抗体。
15. １５．ａ．インターフェロン−γに特異的な抗体または抗体結合フラグメントお よび ｂ．腫瘍細胞に特異的な抗体または抗体結合フラグメントを含む異種抗体。
16. １６．ａ．マクロファージに特異的な抗体または抗体結合フラグメントおよび ｂ．リポ多糖に特異的な抗体または抗体結合フラグメントを含む異種抗体。
17. １７．ａ．組識プラスミノーゲンアクティベーターに特異的な抗体または抗体結 合フラグメントおよびｂ．血小板に特異的な抗体または抗体結合フラグメントを 含む異種抗体。