JPH06500323A - ウイルス性感染の治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウィルス性感染の治療方法 発明の分野 本発明は哺乳動物におけるウィルス性感染の治療方法に関するもので、哺乳動物 に抗−ＴＮＦＩＪガントを単独で又は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファとの組み 合わせでのいずれか一方で投与することを含んでいる。上記リガンドは、ＴＮＦ にそのリガンドが結合する場合にＴＮＦの生物学的な活性が変更されるような特 徴がある。また本発明はウィルス性感染治療のための組成物にも関係している。

発明の背景 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファは、バチルス　カルメ、テーグエリン（ｉｊＢ ｊｌｊ−）またはコリネバクテリウムバーブム（虹μ区）と誰何される内毒素（ ＬＰＳ；リボ多Ｉｆ）とによって前感受性化した実験動物の血清中で最初に観察 される活性化したマクロファージの生産物である。

ＴＮＦの系統的な投与に引き続いて、出血性壊死が、インビトロでＴＮＦにより 膿瘍細胞系列上に細胞溶解性又は細胞増殖性の効果が生じた間のマウスのい（つ かの移植可能な膿瘍中で観察される。

その宿主−保護性の効果に加えて、ＴＮＦは、敗血症、悪液質及び脳性マラリア における病理学的代替の使役的な薬剤として包含されている。ＴＮＦに対するポ リクローナルなウサギ血清に連合してマウスの受動免疫生産は、毒性ンｉ’ｙり の開始薬剤を感染に先立って投与する時にＬＰＳ内毒素の致命的な効果に対しマ ウスを保護することにより示されている。

ＴＮＦのエリコード遺伝子は、評価されるべき潜在的な癌腫の治療薬のようなこ のモ／カインの有効性を認めるようにクローン化されて０る。癌腫轡者にＴＮＦ を注入した段階ｌの臨床の試行では、腫瘍の退行による結果として、血小板減少 症、す／バ球減少症、肝性毒血症、腎臓障害と高血圧のような副作用が報告され ている。これらの非常に重大な副作用を伴ったＴＮＦの臨床的使用は、多くの既 知のＴＮＦの効果に鑑みて予想されるものであり、そのいくつかについて表１に 記載した。

表１ の　・ 一抗一腫瘍性 一抗−ウイルス性 一抗一寄生虫性 作用 腸瘍細胞の細胞毒作用 発熱性の活性 ７ン＃ｔジエニツク（ａｎｇｉｏｇｅｎ　Ｉｃ）活性リボ蛋白リパーゼの阻害 好球園の活性化 破骨細胞活性化 内皮の誘引、単核細胞と腫瘍細胞 副凝固剤活性化 内皮細胞上の表面抗原の誘引 Ｉ　Ｌ−６の誘引 ｃ　−ｍ　ｙ　ｃとｃ−ｆ　ｏ　ｓの誘引ＥＧＦレセプターの誘引 Ｉ　Ｌ−１の誘引 ＴＮＦ合成の誘引 ＧＭ−Ｃ３Ｆ合成の誘引 プロスタグランジノとコラゲナーゼ合成の増加急性段階プロティンｃ３ 特別の重要性は内皮とやはり末梢の血液単核細胞のＴＮＦ活性化の結果とじて起 こる凝固の活性化である。散在性の脈管内の凝固は毒性／ツノクと、阿−腸の癌 腫、すい臓、前立腺、肺、***及び卵巣の癌腫、黒色腫、急性白血病、骨髄腫、 骨髄増殖性の症候群と骨髄芽胞性白血病を含む多くの癌腫と連合されている。

膿瘍の退行的活性のようなＴＮＦ活性の明確な変更性が全く残余しないなら、凝 固の活性化のような望ましくない効果は除去されるか隠蔽されて癌腫治療の更な る有効性の道が開けるであろう。ＴＮＦ活性の完全な消失は毒性７ｇｙりの治療 の成功のためにめられる。

位置特定性抗体（ポリクローナルとモノクローナルの両方）の使用を通してホル モン活性の分離の結果としてホルモン活性の増大を起こすことができる。（アス トンら、Ｍｏ１．　ｌｓｍｕｎｏｌｌＬ、　４３５（１９８６））　。今日まで いくつかの試みとして、抗原性の割り当て又は現在３次元構造が知られているＴ 　Ｎ　Ｆ分子の特別領域に作用するものが作られている。同じ領域への作用の割 り当ては、治療に用いるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）と他のリガンドの発展を 可能とするであろう。ポリクローナル抗体の１から１５のアミノ酸はＴＮＦによ り結合しているＨｅ１ａＲ１９細胞のレセプターのブロックについて報告されて いる（ソーカーら、ＰＮＡＳ　ＩＬ　８８２９（１９８７））一方モツクローナ ル抗体の認識はＴＮＦ上の順応性エピトープが非明確でありインビトロでの抑制 ＴＮＦ細胞毒性が示されている（ブリノブマンとアガウェルら、Ｈｙｂｒｉｄｏ ｍａ　ｔ、　４Ｈ（１９８７））　ｅ　しかし、他のＴＮＦ活性体上のこれらの 抗体の効果については知られていない。

本発明の説明 本発明者は、ヒトのＴＮＦに対するモノクローナル抗体の活性のパネルを生産し ており、それはＴＮＦの抗−腫瘍効果（インビトロとインビボの両方）、ＴＮＦ レセプターの結合、凝固の活性化（インビトロとインビボの両方）とそれらの位 相幾何学的特異性の明確化の効果に関する特徴を有する。本発明者の導いたこの アプローチは、ＴＮＦアルファの位相幾何学的領域が異なることが活性の差異と 連動することにより示される。この作業については特許協力条約に基づいてオー ストラリア国を受理官庁として１９９０年８月７日の出願に基づいた同時継続出 願にその詳細が開示されており、そしてこの出願の開示は参考資料によりここに 具体化されている。

本発明者は、抗−ウィルス性治療に有効な特定抗−ＴＮＦリガンドの提供と連合 してＴＮＦの投与による意外な発見を行っている。加えて、それは特有な抗−Ｔ ＮＦリガンドの単独投与は、そのリガンドが内因性ＴＮＦによく結合することが ら抗−ウィルス性の治療に有効性を提供できるであろうと確信され、それについ て同様の効果は、抗−ＴＮＦをＴＮＦと組み合わせて投与した場合にも提供され る。この抗−ＴＮＦリガンドの単独投与は、ＴＮＦの内因性レベルが上昇された 状態の疾患における治療の好ましい方法であろう。

発明の要旨 従って、本発明の第１の態様は、哺乳動物に抗−ＴＮＦリガ／ドを単独で又はＴ ＮＦとの組み合わせでのいずれか一方で投与することを含む哺乳動物におけるウ ィルス性感染治療方法において、該リガンドが、ＴＮＦに結合する時に、ｆｆＴ ＮＦの内皮の凝固性活性の発現が妨害され、そして該ＴＮＦの抗−ウィルス性活 性が影響されないか又は増大されることを特徴とするウィルス性感染治療方法よ りなる。

本発明の好適な実施憶様では前記リガンドが、ＴＮＦに結合する時に、ＴＮＦの 内皮細胞上のレセプターへの結合が阻害され；膿瘍フィブリ／沈澱とＴＮＦによ る腫瘍退行活性が増大され；その細胞毒性が影響されず、そしてＴＮＦの膿瘍レ セプター結合活性が影響されないか又は増大されることを更なる特徴とする。

本発明の更に好適な実施管様は、前記リガンドが、残基ｌから１８の位相幾何学 的な領域によって明確化されたＴＮＦのエピトープが自然に発生する生物学的活 性リガンドに結合することを実質的に阻害することを特徴とする。

本発明のまた更に好適な実施蝮様では、残基の位相幾何学的領域１−３０．１１ ７−１２８及び１４１−１３５、さらに好ましくは該残基の位相幾何学的領域１ −２６．１１７−１２８及び１４１−１５３によって明確化されたＴＮＦのエピ トープが自然に発生する生物学的活性リガンドに結合することを実質的に阻害す るようにリガンドをＴＮＦに結合させる。そのような配列領域は図１６中に位相 幾何学的に表現されている。

本発明の第２の態様は、哺乳動物に抗−Ｔ　Ｎ　Ｆ　ＩＪガントを単独で又はＴ ＮＦとの組み合わせでのいずれか一方で投与することを含む哺乳動物におけるウ ィルス性感染治療方法において、該リガンドが、ヒトのＴＮＦの残基ｌから１８ に結合するものであることを特徴とするウィルス性感染治療方法よりなる。

本発明の第３の態様は、哺乳動物に抗−ＴＮＦリガンドを単独で又はＴＮＦとの 組み合わせでのいずれか一方で投与することを含む哺乳動物におけるウィルス性 感染治療方法において、該リガンドが、残基１−３０．１１７−１２８及び１４ １−１５３の位相幾何学的な領域の中でヒトのＴＮＦに結合することを特徴とす るウィルス性感染治療方法よりなる。

本発明のこの書様の好適な実施Ｏ様では、前記リガンドが、残基１−２６．１１ ７−１２８及び１４１−１５３の位相幾何学的な領域の中でヒトのＴＮＦに結合 する。

本発明の好適な実施態様では、前記リガンドが、ヒトのＴＮＦ　（ペプチド３０ １）のアミノ酸１から１８と実質的に一致するアミノ酸配列を有するペプチドに 対して発生した抗体である。

本発明の好適な実施態様では、前記リガンドがＭＡｂ３２で明確化されたモノク ローナル抗体である。ハイブリドーマ生産品のＭＡｂ３２の試料は、ヨーロピア ン・コレク／Ｗン・オブ・アニマル・セル・カチャース（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃ ｏ１１ｅｅｔｉ。

ｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ＋ＥＣＡ　ＣＣ）　−’ イク７ノ研究所（Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、ノくブリック・ヘルス・ラボラトリ−・サ ービス（Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅ ）　、応用マイクロノイイオロノー研究センター（Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ａｐ ｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　、ボー トンダウン、サリスバリー、ウイスト／ヤー　ＳＦ３　０ＪＧ、英国に１９８９ 年８月３日付で寄託され、そして取得番号８９０８０３０２を付与された。

本発明の好適な実施態様では、前記治療方法に、ＩＬ−２，ＡＺＴ又はアノクロ ウイルのような他の抗−ウィルス性薬剤の共同投与を含む。

本発明はガンマインターフェロンと現在結合されたリガンドであるＴＮＦとの間 のウィルス性感染の治療において共同作用があることを又見出して（する。

この共同作用は内因性のＴ　Ｎ　Ｆと内因性のインターフェロンの使用により抗 −ＴＮＦリガ／ド単独投与によっていずれか一方により得ることができる。当業 者であれば明らかなように、それと同様の効果は以下の手段により得られるであ ろう： １、ＴＮＦに結合した抗−ＴＮＦリガンドの投与（内因性のインターフェロンを 使用する）：２、抗−ＴＮＦリガンドをガンマインターフェロンと共に（内因性 のＴＮＦを使用する）；そして３．７ＮＦに結合した抗−ＴＮＦリガンドをガン マインターフェロンと共に投与従って、本発明の治療の方法の好適な実施態様で は、ガンマインターフェロンとともに抗−ＴＮＦリガンドを単独で又はＴＮＦと の組み合わせでのいずれか一方の共同投与を含む。

本発明の第４の態様は、ガンマインターフェロンと、抗−ＴＮＦリガンドを単独 又はそれとＴＮＦとの組み合わせのいずれか一方とを含み、該リガンドが、ＴＮ Ｆに結合する時に該ＴＮＦの内皮の凝固性活性の発現が阻害され、そして該ＴＮ Ｆの抗−ウィルス活性が影響されないか又は増大される、ウィルス性感染治療方 法に使用する組成物よりなる。

本発明の好適な実施態様では、前記リガンドが、ＴＮＦに結合する時にＴＮＦが 内皮細胞上のレセプターと結合するのを阻害され：腫瘍フィブリン沈澱とＴＮＦ による腫瘍退行活性が増大され；その細胞毒性は影響されず、そしてＴＮＦの腫 瘍レセプター結合活性が影響されないか又は増大されることを更なる特徴とする 。

本発明の更に好適な実施態様では、前記リガンドが、残基１から１８の位相幾何 学的な領域によって明確化されたＴＮＦのエピトープが自然に発生する生物学的 活性リガンドに結合することを実質的に阻害することを特徴とする。

本発明のまたさらに好適な実施態様では、残基の位相幾何学的領域１−３０．１ １７−１２８及び１４１−１３５、さらに好ましくは該残基の位相幾何学的領域 １−２６．１１７−１２８及び１４１−１５３によって明確化されたＴＮＦのエ ピトープが自然に発生する生物学的活性リガンドに結合することを実質的に阻害 するようにリガンドをＴＮＦに結合させる。そのような配列領域は図１６中に位 相幾何学的に表現されている。

本発明の第５の態様は、ガ／マインターフエウ／と、抗−ＴＮＦリガンドを単独 又はそれとＴＮＦとの組み合わせのいずれか一方とを含み、該リカ゛ンドカ（、 ヒトのＴＮＦ残基ｌから１８に結合することを特徴とする哺乳動物のウィルス性 感染治療に使用される組成物よりなる。

本発明の第６の態様は、ガンマインターフェロンと、抗−ＴＮＦリガンドを単独 又はそれとＴＮＦとの組み合わせのいずれか一方とを含み、該リガント′力ｆ、 残基１−３０．１１７−１２８、及び＋４１−１５３の位相幾何学的領域の中で ヒトのＴＮＦに結合することを特徴とする哺乳動物のウィルス性感染治療１こ使 用される組成物よりなる。

本発明のこの態様の好適な実施態様では、前記リガンドが、残基１−２６．１１ ７−１２８、及び１４１−１５３の位相幾何学的領域の中でヒトのＴＮＦＩこ結 合する。そのような配列領域は図１６中に位相幾何学的に表現されている。

本発明の好適な実施態様では、前記リガンドが、ヒトのＴＮＦ　（ペプチド３０ １）のアミノ酸ｌから１８と実質的に一致するアミノ酸配列を有するペプチド（ 二対して発生した抗体である。

本発明の好適な実施態様では、前記リガンドが、ＭＡｂ３２で明確化されたモノ クローナル抗体でアル。

本発明の第７の態様は、抗−ＴＮＦリガノドを単独又はそれとＴＮＦとの組み合 わせのいずれか一方の、哺乳動物のウィルス性感染治療薬剤の生産（こお（する 使用において、該リガンドが、ＴＮＦに結合するときに、ＴＮＦの内皮の凝固性 活性の発現が阻害され、そして該Ｔ　Ｎ　Ｆの抗−ウイルス活性が影響されな（ １カ）又（ｉ増大されることを特徴とする抗−ＴＮＦリガンドの使用よりなる。

本発明の好適な実施態様では、ＴＮＦに結合する時にＴＮＦが内皮細胞上のレセ プターと結合するのを阻害され、腫瘍フィブリ／沈澱とＴＮＦＩこよる腫瘍退行 活性が増大され、その細胞毒性は影響されず、そしてＴＮＦの腫瘍レセプター結 合活性が影響されないか又は増大されることを更なる特徴とする。

本発明の更に好適な実施態様では、前記リガンドが、残基ｌから１８の位相幾何 学的な領域によって明確化されたＴＮＦのエピトープが自然（こ発生する生物学 的活性リガンドに結合することを実質的に阻害することを特徴とする。

本発明のまたさらに好適な実施態様では、残基の位相幾何学的領域１−３０．１ １７−１２８及び１４１−１３５、さらに好ましくは該残基の位相幾何学的領域 １−２６．１１７−１２８及び＋４１−１５３によって明確化されたＴＮＦのエ ピトープが自然に発生する生物学的活性リガンドに結合することを実質的に阻害 するようにリガンドをＴＮＦに結合させる。そのような配列領域は図１６中に位 相幾何学的に表現されている。

本発明の第８の態様は、抗−ＴＮＦリガンドを単独又はそれとＴＮＦとの組み合 わせのいずれか一方の、哺乳動物のウィルス性感染治療薬剤の生産における使用 において、該リガンドが、ヒトのＴＮＦ残基１から１８に結合することを特徴と する抗−ＴＮＦリガンドの使用よりなる。

本発明の系９の態様は、抗−ＴＮＦリガンドを単独又はそれとＴＮＦとの組み合 わせのいずれか一方の、哺乳動物のウィルス性感染治療薬剤の生産における使用 において、該リガントが、残基１−３０．１１．７−１２８、及び１４１−１５ ３の位相幾何学的領域の中でヒトのＴＮＦに結合することを特徴とする抗−ＴＮ Ｆリガ／ドの使用よりなる。

本発明のこの態様の好適な実施態様では、前記リガンドが、残基１−２６．１１ ７−１２８、及び１４１−１５３の位相幾何学的領域の中でヒトのＴＮＦに結合 する。そのような配列領域は図１６中に位相幾何学的に表現されている。

本発明の好適な実施態様では、前記リガンドが、ヒトのＴＮＦ　（ペプチド３゜ １）のアミノ酸１から１８と実質的に一致するアミノ酸配列を有するペプチドに 対して発生した抗体である。

本発明の好適な実施態様では、前記リガンドが、ＭＡｂ３２で明確化されたモノ クローナル抗体である。

本発明の全ての態様に好適な実施態様では、前記リガンドが、抗体、Ｆ（ａｂ） フラグメント、再構成した抗体（ＣＤＲ分岐したヒト化抗体）、ノングルドメイ ン抗体（ｄＡＢｓ）、単鎖抗体、抗イデイオタイプ抗体、血清結合タンパク質、 レセプター、及び自然阻害剤の群の中から選択される。このリガンドには合成さ れているものや先のフラグメントのうちの１つに類似したものであるタンパク質 やペプチドがあるであろう。しかしそのリガンドがモノクローナル又はポリクロ ーナル抗体か、またはそれのＦ（ａｂ）フラグメントであることが好まい。

本願中で「腫瘍の退行」、「内皮凝固性の誘発」、「腫瘍フィブリン付着の誘発 」、「細胞毒性」、および「レセプター結合」の用語を用いて表わされる、ＴＮ Ｆの生物学的活性は、以下に示される方法によって決定される。

本願中で用いられる「シングルドメイン抗体」とは、ワードら（ＮａｔｕｒｅＳ ］１．５４４−５４６　（１９８９）　）によって記述されているような抗体フ ラグメントを示すために用いられる。

抗イデイオタイプ抗体に関しては、以下の文献にさらに詳しく記載されている： Ｇ、Ｎ、　ゴールトンおよびＭ、！、　グリー７、「生物学的レセプターのイデ オタイブ擬諒」、（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　ｌｍ５ｕｎｏ１．、　ｉ、２５３−２ ８０（１９８６））　；　Ｋ、ジータおよびＰ、　Ａ、ビーターノン、「細胞表 面レセプタープローブ（ｐｒｏｂｅ＞としての抗イデオタイプ抗体の使用ｊ、（ Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　ＩＪＬ、　 ２４４３−２４４７（１９７８）　）。

本発明の本質をさらに詳しく理解するため、本発明の好ましい聾様を以下の実施 例および図をＩＮして述べる。図において：図１はＴＮＦに対してＭＡｂを滴定 して分析を行った結果を示している。

図２はＷＥＨＩ−１６４中でのＴＮＦ細胞毒性に関して、抗ＴＮＦモノクローナ ル抗体ｌおよび３２の効力を示している。

図３はＴＮＦによる内皮細胞の凝固性活性の誘発に関して、抗ＴＮＦ性のＭＡｂ の効力を示している。

図４はＴＮＦ上のエピトープの模式的説明図である。

図５は放射性同位元素で標識付けしたＴＮＦの、つ／大動脈内皮細胞上のレセプ ターへの結合を示している。

図６は黒色腫細胞系ＭＭ４１８Ｅ上のＭＡｂ３２　（１）、標準抗体（２）、お よびＭＡｂ４７　（３）と複合体を形成しているＴＮＦのレセプター結合の実験 を示している。

図７は黒色腫細胞系ＩＧＲａ上のＭＡｂ３２　（１）、標準抗体（２）、および ＭＡｂ４７　（３）と複合体を形成しているＴＮＦのレセプター結合の実験を示 している。

図８は膀胱癌腫細胞系５６３７上のＭＡｂ３２　（１）　、標準抗体（２）、お よびＭＡｂ４７　（３）と複合体を形成しているＴＮＦのレセプター結合の実験 を示している。

図９は胸癌腫細胞系ＭＣＦＴ上のＭＡｂ３２　（１）　、標準抗体（２）、およ びＭＡｂ４７　（３）と複合体を形成しているＴＮＦのレセプター結合の実験を 示している。

図１Ｏは結腸癌腫細胞系Ｂ１０上のＭＡｂ３２　（１）　、標準抗体（２）、お よびＭＡｂ４７　（３）と複合体を形成しているＴＮＦのレセプター結合の実験 を示している。

図１１１２ＭＡｂ３２　（１）　、標１抗体（２）　、およびＭＡｂ４７　（＊ ）ｋよ６、インビボでのＴＮＦ媒介膿瘍退行に対する効力を示している。

図１２は標１１ＭＡｂ、ＭＡｂ３２、およびＭＡ＋）３２の１価Ｆａｂ’　フラ グメントによる、インビボでのＴＮＦ媒介膿瘍退行に対する効力を示している。

図１３は標準ＭＡｂ（１）　、ＭＡｂ３２　（２）、およびベプ＋ｌ’３０１抗 血清（３）による、ＴＮＦ誘発膿瘍退行に対する効力を示している。

図１４はｌ０ＡＡの長さの重複ペプチドとのＭＡｂ３２の反応性を示している。

　図１５はＴ　Ｎ　Ｆ分子の概略立体図を示している。

図１６は残基１〜２６．１１７〜１２８、および１４１−１５３の領域を位相幾 何学的に示している。

図１７はＴＮＦ単独、および２００μｌのＴＮＦ−ＭＡｂ３２　：（１）２μｇ のＴＮＦ；　（２）２μｇのＴＮＦ　＋　Ａｂ　；　（３）４μｇのＴＮＦ；　 （４）４μｇのＴＮＦ＋Ａｂ：を用いて処理した後の卵巣中のウィルスレベルを 示している。

図１８はＴＮＦ単独、および２００μｌのＴＮＦ−ＭＡｂ３２　；（１）２μｇ のＴＮＦ；　（２）２μｇのＴＮＦ　＋　Ａｂ　；　（３）４μｇのＴＮＦ；　 （４）４μｇのＴＮＦ＋Ａｂ、を投与した後の肺中のウィルスレベルを示してい る。

図１９はＴＮＦ単独、および２００μｌのＴＮＦ−ＭＡｂ３２　：（１）２μｇ のＴＮＦ　；　（２）２μｇのＴＮＦ　十Ａｂ　；　（３）４μｇのＴＮＦ；　 （４）４μｇのＴＮＦ＋Ａｂ；を投与した後の肺臓中のウィルスレベルを示して いる。

図２０１！感染の４日後にＴＮＦ　＋　１１５００のＡｂ３０１　；（１）ＰＢ Ｓ　（Ｎ＝９）；　（２）２μｇＯ）ＴＮＦ　＋　１１５０（１）Ａｂ３０１　 （Ｎ、、、７）：（３）６μｇのＴＮＦ＋１１５００のＡｂ３０１　（Ｎ＝７０ ）；　（４）６μｇ＋７）ＴＮＦ　＋　１１５００のＡｂ３０１　（Ｎ＝４）： （５）８μｇのＴＮＦ　＋１１５０（１）Ａｂ３０１　（Ｎ＝４）：で処理した ＣＢＡ／Ｈ７）スの卵巣がらのウィルスの滴定を示している。

図２１はインビトロでの、ＴＮＦとＭＡｂ３２で治療したＬ９２９細胞での抗− Ｈ３Ｖ−１誘発を示している。

図２２１１Ａｂ３０１　；　（１）ＴＮＦ単独；　（２）ＴＮＦ　＋１１５（１ ）Ａｂ３０１：を含有あるいは非含有の種々の濃度のＴＮＦによって感染２４時 間前に処理されたマウスの卵巣のＨ３Ｖ−ｆｉｇ定を示している。

図２３は１？！１１−７　Ｎ　ＦのＬ９２９細胞への結合を、単独あるいはＭＡ ｂ３２またはＡｂ３０１　： （１）ＴＮＦ単独；　（２）ＴＮＦ　＋ＭＡｂ３２　；　（３）ＴＮＦ　＋Ａ１ ３０１　：が存在する場合について示している。

Ｌ血及話ｌ蚤風思玉 全実験において、Ｃ３ｌＲＯ動物施設より得られた、生後１０〜１２週のＢＡＬ Ｂ／Ｃ雌マウスを用いた。メト（Ｍａｔｈ）　Ａ固体腫瘍及びメトＡ腹水腫瘍細 胞系は、スローン・ケッタリング（Ｓｌｏａｎ　Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ）・癌セ／ ターのロイド・Ｊ・オールド１士の研究室より得た。ＷＥＨＩ−１６４繊維肉腫 系は、オーストラリア国立大学・ノ、７−カーチノ医学研究科（Ｊｏｈｎ　Ｃｕ ｒ！ｉｎ　５ｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）のジータ ・ン璽−ドリ博士より得た。

バイブ皆　ドーマの　４ 完全フロイントアノニバント中のヒト組換え梨ＴＮＦＩＯμｇマウスの腹膜内に 与えて免疫性を与えた。１力月後、不に全７０イントアジ二バント中のＴＮＦ１ ０μｇを投与した。６週間後（融合の４日前）、選別されたマウスにＰＢＳ　（ リン酸緩衝溶液）中のＴＮＦＩＯμｇを与えて追加免疫を与えた（ｂｏｏｓｔ） 。ラドジエン及びアンダーウッド（Ｍｏ１．　Ｉｓｍｕｎｏｌ、、１１．４４１ （１９８６））の手順にしたがって、免疫を与えられたマウスの肺臓細胞を骨髄 腫５ｐ２１０と融合した。マウス腹膜マクロファージの支持細胞層上の希釈度を 制限することにより、ラジオイムノアッセイによって抗−ＴＮＦ抗体を分泌する ことがわかっている細胞系をサブクローニング（ｓｕｂｃｌｏｎｅ）　した。抗 体のサブクラスをエリザ（ＥＬＩＳＡ）　Ｎソテスト（Ｍｉｓｏｔｅｓｔ）　、 連邦血清研究所（Ｃｏｍｍｏｎｖｅｌｔｈ　Ｓｅｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ）　）によって決定した。

一ジオ　ムノア　セイ 標準的な手順にしたがって、ラトクバラオキ／ダーゼを用いてＴＮＦをヨウ素化 した。ハイブリドーマの培養上澄み液５０μｌを１２５１　７ＮＦ（５０μ］あ たり２００００ｃｐｍ）と共に４℃で一晩恒温状管に保ち、サクーセル（５ａｃ −Ｓｅ１）（ロバ抗−マウス／ラット免疫グロブリンで被覆されたセルロース、 ウェルカム・ダイアグノースティックス（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔ ）ａｓ）　）　１００　μｌを加え、さらに２０分間室温く２０℃）に保った。

この培養に続いて、ＰＢ３１ｍｌを加え、試験管を２５０Ｏｒｐｍで５分間遠心 分離した。上澄み液をデカントし、放射能の結合しているペレットを数えた。

近体ｍ腹足 固定された抗原（ＬＡＣＴ）または抗体（ＰＡＣＴ）のいずれかを用いる競合検 定法により、モノクローナル抗体の対照特異性を決定したくアストンおよびイヴ アニル、　Ｐｈａｒｓａｃ、　Ｔｈｅｒａｐｅｕ＋、、ｕ、　４０３（１９８５ ））。

Ｌ五立エ フレキ／プル・マイクロタイター・トレー（ｆｌｅｘｉｂｌｅ　５ｉｃｒｏｔｉ ｔｒｅ　ｒｒａｙｓ）をモノクローナル抗体（マウスの腹水液から硫酸ナトリウ ムで沈殿させたグロブリン、１００μｇ／ｍｌ炭酸水素ナトリウム緩衝液、０． ０５Ｍ、ｐＨ９，６）で被覆し、４℃で一晩おき、非特異性の結合部位を、ＰＢ Ｓ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ／ＰＢＳ）でブロックした。種々の濃度 の二次抗−ＴＮＦモノクローナル抗体の存在下で、１２５１　７ＮＦの固定抗体 への結合を決定した。抗体及びＴＮＦを同時に加え、２４時間恒温に保った後に 、ＰＢＳを用いて４回洗浄し、放射能の結合しているウェル（ｔｅｌｌｓ）を数 えた。異種モノクローナル抗体の非存在下で１００％結合を決定し、過剰の同種 モノクローナル抗体の存在下で１００％競合を決定した。すべての希釈はＢＳＡ ／ＰＢＳを用いて行った。

Ｌ人立工 種々の濃度の二次モノクローナル抗体の存在下で、ブロテイノＡで精製され、放 射性同位元素で標本したモノクローナル抗体の、ＴＮＦで被覆されたマイクロタ イター・ウェルへの結合を決定した。上記と同様にして、マイクロタイター・プ レートをＴＮＦ　（５０Ｍｇ／ｍ　＋　）で被覆した。多量の競合抗体（５０μ Ｉ）を前もってプレート上で４時間、４℃の恒温状態に保ち、次いで１２５■モ ノクローナル抗体（３００００ｃｐｍ）を加え、さらに２４時間恒温状態に保っ た。

ＰＢＳで４回洗浄したのち、ウェルへの結合を算定した。競合抗体の非存在下で １００％結合を決定し、過剰の非標識モノクローナル抗体の存在下で１００％競 合を決定した。

ＷＥＨＩ−１６４ 組換え型ＴＮＦ活性の生物分析をエスベヴイ、りおよび二ノ七ノーマイヤー（Ｊ ｌｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１４．９９（１９８６））に従って行っ た。モノクローナル抗体をＡＢＴ９０で細胞培養に与えることにより、モノクロ ーナル抗体がＴＮＦ活性に与尤る効力を決定した。

１監乏丘実り 以下の３腫の膿瘍モデルにおいて、モノクローナル抗体によるＴＮＦ誘発腫瘍退 行活性の変調を評価した二皮下膿瘍ＷＥＨ！−１６４、メトＡ肉腫、及び腹水メ トＡ膿瘍。皮下腫瘍は約５Ｘ１０５個の細胞を注射して誘発させた。これにより 約１４日後に１０〜１５ｍｍの腫瘍ができた。ヒト組換え盟ＴＮＦ（１０Ｍｇ） とモノクローナル抗体（２００μＩ腹水グロブリン）を４日間連続してマウスの 腹水内に注射した。積重グループにはＰＢＳのみ、あるいはＴＮＦとウシ成長ホ ルモンに対するモノクローナル抗体を注射した。各実験の開始時に、腫瘍の大き さを、固体腫瘍の場合はキャリパ−で、腹水マウスの場合は腫瘍をもつ動物の体 重を計ることにより、それぞれ測定した。これらの測定は実験期間中毎日行った 。

一ジ　−レセブ　−ア　セイ 集密するまで成長したＷＥＨ１−１６４細胞を削り取り、ハングの平衡塩類溶液 （ＨＢＳＳ、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）　）中に１％のＢＳＡを含む溶液で１回洗浄 した。

１００μｌの標識していないＴＮＦ　（１〜１１００００ｎ／試験管）またはモ ノクローナル抗体（腹水グロブリンで１／１０から１／１００００まで、１０倍 ずつ希釈したもの）を１２５１　ＴＮＦ　（５００００ｃｐｍ）５０μｌに加え た。

次いで、ＷＥＨ＋細胞（２００μｌ、２ＸＩ０８個の細胞を含有）を加えた。こ の混合物を３７℃の攪拌水浴中で３時間恒温状態に保った。この恒温状態を終え た時点で、１ｍｌのＨＢＳＳを加え、細胞を１６００Ｏｒｐｍで３０秒間回転し た。上澄み液を捨て、細胞ベレット中の結合している１２５１　７ＮＦを数えた 。

すべての希釈は１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで行った。

の　に　の １０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）　、べ二ンリン、ストレプトマイシン、及び２ −メルカブトエタノールを含むＲＰＭＩ−１８０４中で３７℃、５％ｃｏ２の条 件でつ／大動脈内皮細胞（継代数１０回）を成長させた。凝固性活性をＴＮＦに よって誘発させるため、ペヴイラッ力らの実験（１９８６、ＰＮＡＳ、　８３． ４５３３）に従って、細胞をトリブノン化し、２４ウエルのコースタ−・トレー （Ｃｏｓｔａｒ　ｔｒａｙｓ）にプレート化した。Ｆｌｌｌ細密の単層をＨＢＳ Ｓで洗浄した後、ＴＮＦ　（０〜５００単位／培地）及びモノクローナル抗体（ 腹水グロブリンでｍ／２００に希釈したもの）を加えた。４時間後、細胞を削り 取り、凍らせて音波処理を行った。

通常のドナーの血小板欠乏血漿の、３７℃におけるカルシウム再沈澱時間によっ て、合計細胞凝固性活性をめ、１００μｍの細胞溶解物と１００μ！の塩化カル シウム（３０ｍＭ）に１００μｌのクエン酸塩添加血小板欠乏血漿を加え、血餅 形成時間を計測して記録した。ＴＮＦおよび／またはモノクローナル抗体（最終 濃度ｌ／２）で処理を行った内皮細胞に、腫瘍細胞培養の上澄み液を加える実験 も行った。

ＴＮＦおよびモノクローナル　で　したマウスの　への　１２５１７＜２Ｌ△二 Ｙヱ血ユ入 ＴＮＦおよびモノクローナル抗体の、インビボにおけるフィブリン形成への効力 を調べるため、ＢＡＬＢ、、／ＣマウスにＷＥＨＩ−１６４細胞（＋０５細胞／ 生体）を皮下に注射した。７〜１４日後、膿瘍が約１ｃｍの直径に達した時、生 体にＴＮＦ（１０Ｍｇ／生体）および１２５＋ヒトフイブリノーゲノ（７，５μ ｇ／生体、１２２μＣｉ　／ｍｇ　７メルハム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を、単独 であるいはヒトＴＮＦ　（２００μＩ／生体腹水グロブリノ）の存在下で腹膜内 に注射した。標準モノクローナル抗体として、つ／成長ホルモ／に対するモノク ローナル抗体を用いた。ＴＮＦの融合の２時間後、組轍片を取り除き、計量し、 ガンマカウンターで試料を数えることにより、１２５１フィブリ／−ゲンのマウ スの組織への混入をめた。　ヒトＴＮＦと反応した１３のモノクローナル抗体す べてを分離した。これらのモノクローナル抗体をＭＡｔ１１ＭＡｂｌ１ＭＡｂ１ ２、ＭＡｂ２０、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２５．ＭＡｂ３１．ＭＡｂ３２、ＭＡ　ｔ ＋　３７、ＭＡｂ４２、ＭＡｂ４７、ＭＡｂ５３、およびＭＡｂ５４と名付けた 。ヒトＴＮＦの生物活性↓こ対するこれらのモノクローナル抗体の効力を表２に 示す。

表２かられかるように、いくつかのモノクローナル抗体（ＭＡｂｌ、４７、およ び５４）はヒトＴＮＦによる凝固の促進と抗−腫瘍活性の両方を阻害する力（、 抗−腫瘍活性を阻害するいくつかの抗体はイノビトロあるｔ１ζまインヒ゛ポの 何れ力１で凝固の促進を阻害しない（ＭＡＩ）ＩＩ、１２．２５、および５３） 。実際、膿瘍の退行を阻害するＭＡｂ２＋はインビボでは凝固を促進する。

ＴＮＦ　に・　るモノクローナル　の　果ｉ△ムニニ二土抜止 ＴＮＦ生物活性　１１１１２２０２１２５３１　！２　３７４２４７５３５４細 胞毒性　−−−ｏ−−ｏｏ　ｏｏ−−−腫瘍退行　−−−ｏ−−ｏ＋　ｏｏ−− −凝固性の誘発（内皮）　−００−−００−０−−−−フィブリン付着（膿瘍） 　−−−＋＋＋＋＋　Ｏ−−Ｑ−レセプター結合（ＷＥＩＩ＋−１６４）　−− −０−−０＋／ＨＯＯ−−−Ｏ効力なし −阻害効果 ＊　ＷＥＨＩ−１６４Ｍ瘍細胞および腫瘍タイプの場合には、ＭＡｂ濃度による （図３．１３〜１７参照）。

競合結合の研究からＴＮＦ上のエピトープを共有することがわかっているＭＡｂ ｌ、４７および５４は、毒性７１ツクや他の症状（ＴＮＦの完全な中和が要求さ れるような高ＴＮＦレベルのバクテリア性、ウィルス性、および寄生性の感染症 ）の治療において非常に好ましい性質が認められる。ＭＡｂ３２のような他のモ ノクローナル抗体は、腫瘍の退行は阻害しないが、凝固の促進は阻害するので、 癌腫治療の際にＴＮＦと共に投与する助剤としてより適切である。この様な治療 形態は、ＴＮＦによって凝固を促進する可能性のある癌腫治療において用いられ る細胞毒薬（例えば、ビブラスチン、アンクロウイル、ＩＦＮアルファ、ＩＬ− ２、アクチノマイ／ンＤ、ＡＺＴ、放射線治療、アトリアマイ／）、マイロマイ ノンＣ１／ト／ン、アラビノノド、ドウノルとン／、／スーブラチン、ビンクリ スチン、５−フルオロウラノル、プレオマイ／ン（ワタナヘＮう、１−鵬ｕｎｏ ｐｈａｒｍａｅｏｌ、Ｉ＋ｕｕｎｏｔｏｘｉｃｏ１．、　Ｉｌｌ、１１７−１２ ７（１９８８＞）　、あるいはある段階でＴＮＦのレベルが低（なるような疾！ ！（例丸ばＡ　Ｉ　ＤＳ）やＡＩＤＳに由来する個々の癌腫（例えばカポジ肉騰 、非ホジキンス（ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｌｎｓ）リンパ腫、および扁平上皮）疾患 の細胞毒薬と共に、特に必要である。

ＭＡｔ＋３２（図１）はヒトＴＮＦアルファに対する親和性が、スチャッチャー ド分析に基づいて８．７７ｘｌ　Ｏ−ｍｏ　Ｉ／ｌと決定されたＩｇＧ２ＪＫ抗 体である。このモノクローナル抗体は、ヒトＴＮＦベータ（リンフォトキノン） およびマウスＴＮＦアルファのいずれとも反応しない。

図２に示されるように、ＷＥＨＩ−１６４検定によれば、インビトロでは、ＭＡ ｂ３２はＴＮＦの細胞毒性を防止しない。

モノクローナル抗体３２は、１日あたりＩＯμｇのＴＮＦの投与による、ＢＡＬ Ｂ／Ｃマウスの皮下に移植したＷＥＨＩ−１６４繊維肉腫腫瘍に対するＴＮＦ誘 発性の腫瘍退行活性を、可変的に促進する（図１１％照）。この特徴はＴＮＦに 対するすべてのモノクローナル抗体に共通のものではないが、より大きなレセプ ターがＴＮＦの膿瘍細胞への取り込みを媒介するようなＭＡｂ３２の結合部分の 特異性であるく図４）（表３参照）。

牲人見主主亘互旦　でのＷＥＨＩ−１６４のレセブ　−へのＴＮＦの　４％結合 １２５　（−７８Ｆ ＭＡｂ希釈度　標１１ＭＡＢ　ＭＡＢ　３２１／＋０　１４１ １／ｌｏ０　８ｇ １／１．０００　１０１　８３ １／１０．０００　９２　８２ １／１００．０００　９７　９３ 少ないＴＮＦの投与量でのＭＡｂ３２にょるＴＮＦ活性の促進は、同程度の膿瘍 の退行を達成するのに、少なくとも１ｏ分の１以下のＴＮＦＬか必要でないのと 同じことになる（図１１１１Ｐ！り。ｐ＜ｏ、ｏｔのレベルでのＴ−テストにお いては、第１８目の２．５μｇおよびｌμｇ　ＴＮＦおよび第２８目の５μｇ１ ２゜５μｇ、およびｌμｇは統計的に有意である。この程度の促進はまた、少量 のＴＮＦの投与は毒性がないため、被検体の生存率を高める。図１２はＭＡｂ３ ２の１価のＦａｂフラグメントもまた、ＭＡｂ３２全体と同様にＴＮＦによって 誘発される腫瘍退行を促進することを示している（下記参照）。

ＭＡｂ３２は、培養細胞をＴＮＦとともに培養することによって通常引き起こさ れる内皮細胞上の凝固因子の発現を阻害する（図３参照）。この応答は、他の細 胞上に見られるレセプターとは明らかに異なるが、予め特定はできないＴＮＦレ セプターによって媒介される。

逆に、ＭＡｂ３２は、放射線標識されたフィブリノーゲンの組織化に見られるよ うに、腫瘍支持体（ｔｕｍｏｕｒ　ｂｅｄ）の凝固のインビボ活性化を促進する 。これは、単核細胞／マクロファージ凝固性の活性化によるものであり、ＴＮＦ −誘引腫瘍退行の機構にさらなる洞察を与えるものである。

ＭＡｂ３２を用いて得られた結果を、他の抗−ＴＮＦのＭＡｂと比較して表２に 示す。

ＭＡｂ３２とＭＡｂ４７の、ＴＮＦの内皮細胞への結合を阻害する可能性につい ても試験した。ウシ大動脈内皮（ＢＡＥ）細胞（継代数１１）を、２４−ウェル で、予めゼラチン（０・２％）を塗布された培養皿（コーニング（ｅｏｒｎｊｎ ｇ＞）に植え込み、２０％のつ／胎児腓血清を加えた、（変性した）ＭｃＣｏｙ ｓ５Ａ媒体中で融合するまで成長させた。放射性レセプター検定の、（コールド ＴＮＦとＭＡｂの）すべての希釈は、この媒体中で行われた。そのＢＡＥ細胞は 、コールドＴＮＦ　（Ｏから１０１００ｎ、又はＭＡｂ　（１／１００から１／ １０００００に希釈された腹水グロブリン）とヨウ素化されたＴＮＦ　（５００ ００ｃｐｍ）の存在下で１時間培養した。この時間の最後に、その媒体を取り去 り、溶菌に先立って細胞を１Ｍ水酸化ナトリウムで洗浄した。その細胞ｍｓｌ液 で結合した放射性ＴＮＦを計数した。細胞に対する標識されたＴＮＦの特定結合 は、このようにして決定される。

ＭＡｂ３２、ＭＡ１４７そしてＩ！ＩＩＭＡｂを用いたこの検定で得られた結果 を図５に示す。

ＴＮＦと抗−ＴＮＦのＭＡ＋）の存在下で培養したＢＡＥ細胞を用いた凝固検定 で得られた結果は、ＢＡＥ放射性レセプター検定で得られた結果と連関している 。

即ち、内皮細胞表面の凝固因子の発現を阻害しくＴＮＦ単独に比較して凝固時間 が増大していることによって示されている）、さらにＴＮＦのそのレセプターと の結合も阻害する。このことは、ＭＡｂ３２とＭＡｂ４７で例示されている。

ＴＮＦのＷＥＨＩ−１６４細胞への結合を阻害しないＭＡｂ３２は、ＴＮＦの内 皮細胞への結合は阻害する。この結果は、ＴＮＦ分子に別の機能部位が存在し、 これらの機能部位が、異なった細胞種の別のレセプター亜個体群（ｓｕｂｐｏｐ ｕｌａｔｉｏｎ３）と相互作用をするという仮説を支持するものである。従って 、ＴＮＦの決められた領域に結合するリガンドは、ＴＮＦの特別なレセプター亜 種（ｓｕｂｔｙｐｅｓ）への結合を制限することにより、ＴＮＦの生物学的効果 を修正することが可能である。

図５に示したように、ＭＡｂ４７はＴＮＦの内皮細胞との相互作用の特に強力な 阻害剤である。１／１００からＩ／１００００の希釈における特定結合のノイー セントは実質的に零である。

１上隻腫亙１五　に・　Ｍ　２”　かヒト　ＦのインビトロにおＣるレセブ　− 　Δ ＭＡｂ３２は、ヒトＴＮＦの抗−腫瘍活性を強化するものであることはすでに述 べた。その強化の後ろにある機構は、ＴＮＦの結合を特定の（Ｗ瘍）レセプター 亜種のみに限定し、他のもの（内皮的なもの）には結合しないように制限し、引 き続いて、非腫瘍細胞に対するＴＮＦの毒性を低減することにあると考えられる 。この機構においては、インビトロ試験において、腫瘍細胞によるＴＮＦの取込 みを補強する必要がない。さらに、ＭＡｂ３２は、ある種のヒト癌腫細胞系統に あるＴＮＦレセプターに対するヒトＴＮＦの直接的な結合を促進する。

１区之立ま 下記のヒト癌腫細胞系統について、ＭＡｂ３２が存在することによって強化され た、ＴＮＦのレセプターに媒介された取込みを検定した。そのヒト癌腫細胞系統 は、ＢＩＯｌＣａＣｏ、ＨＴ２９．５ＫＣＯＩ（以上はすべて結腸癌腫）、５６ ３７（膀胱癌腫）、ＭＭ４１８Ｅ（黒色腫）、ＩＧＲ３（黒色腫）　、ＭＣＦ７ （***癌腫）である。これらの細胞は、１０％のつ７胎児血清、ベニ／リン／ス トレブトマインノ、及びＬ−グルタミンを加えた、ＲＰＭＩ−１６４０（ＭＭ４ １８Ｅ）ＤＭＥＭ　（ＣａＣｏ及びＩＧＲ３）またはアイスコープ（ｌｓｃｏｖ ｅｓ　）変性ＤＭＥＭ　（ＢＩＯ１ＨＴ２９．５ＫＯＩ、５６３７、ＭＣＦ７） ＋７）いずれかの中で増殖させた。レセプター検定は、前述のようにして内皮細 胞に対して行った。

ただし、ヨウ素化ＴＮＦでは培養時間をすべて３時間に延長し、また、放射線標 識したＢＩＯ細胞のみは１時間として培養した。

ＭＡ　ｂ　３２の存在によって、試験した黒色腫細胞系統ＭＭ４１８　Ｅ及びＩ ＧＲ３（図１３．１４に示す）、膀胱癌１１５６３７（図８に示す）、及び*** 癌腫ＭＣＦ７　（図９に示す）による強化されたＴＮＦの取込みが観察された。

ＭＡｂ３２は、Ｂ１０（図１Ｏに示す）について示すように、他のいかなる細胞 系統におけるＴＮＦ−レセプターの相互作用にも影響を及ぼさなかった。ＭＡｂ ４７の場合は、ＷＥＨＩ−１６４細胞及び内皮細胞へのＴＮＦ結合を阻止するこ とが示され、またＴＮＦ媒介の腫瘍退行をも阻害し、このものは試験した全ての 細胞系統ｌ対して、ＴＮＦ結合を著しく阻害することが分かった（図６〜１０） 。

１渣 レセプター結合分析は、ＭＡｂ３２がＴＮＦの抗−腫瘍活性を促進する第二の機 構を示している。この、ＴＮＦの強化に対する第二の経路は、ＭＡｂ３２の存在 下で腫瘍のすべてのレセプターによるＴＮＦの取り込みが増加した結果である。

ＭＡｂ３２　たはＭＡｂ３２の−　ＦＡｂ’　フラグメントによるインビトロの ＴＮ　−′−の 前述のようにして、ＷＥＨＩ−１６４皮下腫瘍を持つマウス（Ｎ−５動物／群） について腸瘍退行試験を行った。膿瘍の大きさは試験期間を通じて毎日測定した 。

ＭＡｂ３２を用いて得られた結果を図１１に示す。この結果は、処理完了時（２ 日）における腸瘍領域の平均＋／−８Ｄ％変化を示している（ＭＡｂ３２：［３ 準ＭＡｂ：會ＭＡｂ４７）。標準ＭＡｂ−ＴＮＦとＭＡｂ３２−ＴＮＦとの処理 群の間に観測される差異は、ｐｒｏ、０１水準におけるＴ−試験で統計的に意味 がある。

ＭＡｂ３２の１価ＦＡｂ’　フラグメントを用いた結果を図１２に示す。腫瘍の 大きさは試験期間を通じて毎日測定した。この結果は、処理完了時（２日）にお ける腫瘍領域の平均＋／−３Ｄ％変化を示している。標準−ＴＮＦとＭＡｂ３２ −ＴＮＦとの処理群の間に観測される！！興は、ｐ＜０．０１水準におけるＴ− 試験で統計的に有意であった。

′−：　−ペブ　ド　の 図１３は、３日間にわたって、ペプチド３０１に対してＴＮＦ十標準ＭＡｂ（ラ ン成長ホルモンに対する抗体）、ＴＮＦ＋ＭＡｂ３２またはＴＮＦ十抗血清（グ ロブリン分画）で処理した膿瘍保持マウスにおける腫瘍領域のパー七ノド変化を 示している。対を形成しない丁−試験において、標準群は試験群（ＭＡｂ３２、 抗血清３０１）の双方と明かに興なっている。一方、ＭＡｂ３２とペプチド抗血 清３０１とは相互にほとんど差異が認められない。（標準対ＭＡｂ３２ではｐく ０．００２；標準対抗〜ペプチド３０１ではｐ＜ｏ、０２５）。このように、Ｍ Ａｂ３２の特異性の一部を構成するペプチドを用いて得られる抗血清もまた、Ｔ ＮＦのｆｆｌ瘍退行を増強する。

図４に見られるように、競合結合試験は、！３のモノクローナル抗体が２大別で きることを示した。即ち、ＭＡｂ＋、２１．４７．５４．３７．３２及び２５か らなる群と、ＭＡｂｌｌ、１２．５３及び４２からなる群である。次いで、これ らのモノクローナル抗体によって確認されるヒトＴＮＦ上の領域を同定するため の試験を行った。

モノクローナル゛　によって確′ηされるヒトＴＮＦ゛のワ　の５ム １、ゲイスンらの方法（ゲイスンら、　ＰＮＡＳ、　１１．３９９８−４００２ （１９８４＞）ｌｉ：従ッテ、ポリプロピレンのビン上で、７及び１０アミノ酸 残基長の重複（ｏｖｅｒｌａｐ）　しているペプチドを合成した。この重複部は それぞれ６個及び９個の残基からなっていて、これらのペプチドは正確にＴＮＦ 全体のアミノ酸配列を充足している。これらのペプチドについて、ＥＬＩＳＡに よって、ＭＡｂとの反応性を検査した。同時に、ＴＮＦ総体とともに予め培養さ れて、それらから吸収したＴＮＦ活性を有するＭＡｂ類についても、不活性標準 として、そのペプチド活性を試験した。

２、ＴＮＦのさらに長鎖のペプチドは、下記のようにして合成した。これらのペ プチドは、下記の定法を用いてヒツジの抗血清性を高めるために用いられたもの である。７９７種のヒツジをオバルブミンと結合したＴＮＦペプチドで処理し、 完全フロイントアジニバント中で乳化し、ペプチドーオパルブミノと血清で４週 間増１させ、ラジオイムノア、セイによって抗−ＴＮＦ抗体の存在を分析した。

これらのペプチドの中で、ペプチド２７５．３０１．３０５．３０６及び３０７ のみがＴＮＦ総体と反応する血清を引き出した。次いでこれらの活性血清につい て、ＭＡＩｌ類とともに競合結合試験（ＰＡＣＴ試験法）を行った。

下記のペプチドを合成した。これらのペプチドは、各アミノ酸について常用され ている３文字記号を用いて記述し、そのＴＮＦ配列領域は括弧内に示した。

ニエ二二！二１ Ｈ−Ａｌ　ａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌ　ｕ−Ｐｒｏ−＋　１　 ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＯＨ（１１１−１２０） 二二！上 Ｈ−Ｖａｔ−Ａｒｇ−３ｅｒ−８ｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−３ｅ ｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌ ａ−ＯＨ（１−１８） ニヱニニ１Ｌｌ Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｔ−Ｖａｌ−Ｐｒ ｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−ＯＨ（４３− ニブ１ＪＬＬＬＬ Ｈ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−３ｅ ｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｌｓ−Ｔｈｒ−１１ ｅ−９ｅｒ−Ａｒｇ−１１ｅ−ＯＨ（６３−８３）ニコシーＬ１１」− Ｈ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌ　ａ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａ ｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−９ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇ ｌｎ−Ｖａｌ　−ＯＨ（１３２−１５０）ペプチド３０６ ！（−Ｖａ　ｌ−、Ａｌ　ａ−Ｈｉ　５−Ｖａ　１−Ｖａｌ−Ａｌ　ａ−Ａｓｎ −Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ＯＨ（１３−２ ６）二ゴｌ」ＳＬＬＬ Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓ ｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌ　ａ−Ａ ｓｎ−ＧＩ　Ｙ−ＯＨ（２２−４０） ペプチド３０８ Ｈ−ＧＩＹ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａ ｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−１，ｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＯＨ（５４−６８） ペプチド３０９ Ｈ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−１１ｅ−３ｅ ｒ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ａｌ　ａ−Ｖａ　ｌ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ− Ｌｙｓ−Ｖａ　１−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＣＯＯＨ（７３−９４）ニブｌ」 二ｍ Ｈ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｈ ｒ−Ｇｌ　ｎ−Ｔｈｒ　−ＯＨ（７９−８９）これらのペプチドは下記の一般的 な定法を用いて合成した。

すべてのペプチドは、固相ペプチド合成法であるＦｍｏ　ｃ−ポリアミド法（ア サート／ら、　Ｊ、　Ｃｈａｔ　Ｓｏｃ、　Ｃｈｅｔ　Ｃｏ＋ｎｕｎ、　、　１ １．５３７−５３９（１９７８））を用０て合成した。用いた固体樹脂はＰｅｐ Ｓｙｎ　ＫＡでｉち、これはキーゼルグール（ＫｉｅｓｅＬｇｕｈｒ）支持体上 のポリジメチルアクリルアミドゲルに官能基連結剤として４−ヒドロキシメチル フェノキン酢酸を担持させたものである（アサ−トンらｊ、Ａｍ、ｃｈｅ閣、　 ５ａｃ１．ｕ、６５ｇ４−６５８５（１９７５））。

カルボキン末端基のアミノ酸は、ＤＣＣ／ＤＭＡＰ−媒介の対称性無水物エステ ル化法によって支持固体に固定した。

すべてのＦｍｏｃ一群をピペリジン／ＤＭＦで洗浄除去し、次いでペプチド結合 を、若干のアミノ酸を除いて、ペンタフルオロフェニル活性エステル経由か、も しくはＢＯＰ／ＮＭＭ／ＨＯＢ　ｔ　（カストＣ’　（Ｃａｓｔｒｏ）の試薬） （フルニエら。

Ｉｎｔ、　Ｊ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｄ、　、ｉｌ、　＋３３ −１３９（１９８３））による直接法によって形成した。

その方法を表４に示す。

アミノ酸の側鎖保護基は、解離と同時に除去した。ただし、／ステモノ上のＡｃ ｍは合成後まで残した。

表４ Ｌ工Ｌ１（ｉＬＩＬｉｌ　”　’ヱｆｉＡｒｇ　ＭｔｒまたはＰｍｃ　いずれか Ａｓｐ　０Ｂｕｔ　いずれか Ｃｙｓ　Ａｒｎｃ（恒久的）　いずれかＧｌｕ　０Ｂｕｔ　いずれか Ｈｉｓ　ＢｏＣ０Ｐｆｐ法のみ Ｌｙｓ　ＢｏＣＬ）ずれか Ｓｅｒ　Ｂｕｔ　ＢＯＰ法のみ Ｔｈｒ　Ｂｕｔ　ＢＯＰ法のみ Ｔｙｒ　Ｂｕｔ　いずれか Ｔｒｐ　なし　いずれか Ａｓｎ　なし　ＯＦ’ｆｐ法のみ Ｇｌｎ　なし　ＱＰｆｐ法のみ 鯉ＪＬＪＬＩＬ ペプチド３０１．３０２．３０５は、９５％ＴＦＡと５％チオアニソールを用い て樹脂から解離しく１．５時間）、逆相Ｃ４カラム（バフファＡ−０，１％ＴＦ Ａ水溶液、バブファ８−８０％ＡＣＮ２０％Ａ）上で精製した。

ペプチド３０３．３０４は、９５％ＴＦＡと５％フェノールを用いて樹脂から解 離しく５−６時間）、逆相Ｃ４カラム（バフ７ア類は上記と同じ）上で精製した 。　ペプチド３０６．３０８は、９５％ＴＦＡと５％水を用いて樹脂から解離し く１．５時間）、逆相Ｃ４カラム（バブフッ類は上記と同じ）上で精製した。

ペプチド３０９は、９５％ＴＦＡと５％チオアニソールを用いて樹脂から解離し く１．５時間）、逆相Ｃ４カラム（バッフｙｌｌは上記と同じ）上で精製した。

ペプチド３０７は、９３％ＴＦＡ、３．１％アニソール、２．９７％エチルメチ ルサルファイド及び０．９５％エタンジチオールの混合物を用いて樹脂から解離 しく３時間）、逆相Ｃ４カラム（バッファ類は上記と同じ）上で精製した。

１来 ７及びｌＯ連鎖体を用いたＭＡｂのＥＬＩＳＡの典型的な結果を図２１に示す。

ヒツジの抗−ペプチド血清（表６に示した）を用いたＰＡＣＴ試験の結果と併せ て、ＴＮＦの以下の領域が、抗−ＴＮＦのＭＡｂの結合位置を含んでいる。

ＭＡｂｌ：残基１−１８．５ｇ−６５，１１５−１２５，１３８−１４９ＭＡｂ ｌｌ：残基４９−９８ ＭＡｂｌ２：残基２２−４０．７０−８７ＭＡｂ２１：残基１−１８．７６−９ ０７６−９Ｏ：残基１２−２２．３６−４５．９６−１０５．１３２−１５７Ｍ Ａｂ３２：残基１−２６．１１７−１１８．１４１−１５３ＭＡｂ３７：残基２ ２−３１．１４６−１５７ＭＡｂ４２：残基２２−４０．４９−９６．１１０− １２７．１３６−１５３ＭＡｂ４７：残基１−１８．１０８−１１０８−ｌ２８ ：残基２２−４０．６９−９７．１０５−１２８．１３５−１５５ＭＡｂ５４： 残基５６−７９．１１０−１２７．１３６−１５５表５ 抗ペプチド血清存在下における抗−ＴＮＦモノクローンによるＴＮＦの競合結合 ＭＡｂ／ペプチド血清 注１ニーは競合なしを示しい＋は抗ペプチド抗血清の高濃度（ｔ／ＳＯ）におけ る僅かな競合を示し、＋＋＋＋は同種のＭＡｂのそれと同等な抗ペプチド血清に よる強い競合を示す。注２＝この試験では、ＴＮＦ総体を確認する血清を引き出 スベブチドのみを用いた。

１差」」」− ７０インズアジ１バンド中、オバルブミンと結合したペプチド３０１で、ヒツジ を免疫性にした。ペプチド３０１と反応性のある抗血清をこの免疫ヒツジから得 た。

級ｎ 各ＭＡｂによって確認された領域の配置は、次のことを示している。即ち、グル ープ■のＭＡｂ（ＭＡｂｌ、２１．４７．５４．３７．３２及び２５）は、模式 図に示すように、ＭＡ　ｂ　３７及び５４を除いては、残基１−１８の領域にお いてＴＮＦと結合している。一方、模式図のグループＩＩのＭＡｔ＋　（ＭＡｂ Ｉ　１゜１２．５３及ヒ４２）　Ｉｔ、ＴＮＦの三次元構造上にいわゆるバレン ドロミック環を取り囲んで７０−９６残基の領域中でＴＮＦと結合する。内皮細 胞の凝血性活性の誘引を阻害するＭＡｂ（ＭＡｂｌ、３２．４２．４７．５４及 び５３）はすべて、これも三次元モデルで環状構造を含む残基１０８−１２８の 領域内で結合する。このことは、この領域が腫瘍細胞ではなく内皮細胞にみられ るＴＮＦレセプターと相互作用することを示していると考えられる。生体内での 腫瘍退行とＴＮＦの抗ウィルス活性とを促進するＭＡｂ３２は、残基１−２６． １１７−１２８、及び＋４１−１５３と対応するすべての環状領域と結合する唯 一の抗体であり、従ってこれらの領域との結合は、ＴＮＦの生物活性を強化し、 同時に正常細胞への毒性を低減することに決定的な要因となっている。

表２から明らかなように、ＭＡｂｌ、４７及び５４は、ＴＮＦの生物活性に同一 の効果をもたらす。上記の結果から、これら３種のモノクローナルはＴＮＦ分子 の同じ領域に結合する。従って、主として残基１−２０の領域、残基５６−７７ の領域、残基１０８−１２８の領域、及び残基１３８−１４９の領域からなるグ ループから選ばれた少なくと６２領域においてＴＮＦと結合するリガンドは、Ｍ Ａｂｌ、４７及び５４と同様な方法でＴＮＦの生物活性に貢献していると思われ る。同様に、主として残基１−２０及び７６−９０の領域においてＴＮＦと結合 するりガントは、ＴＮＦの生物活性にＭＡｂ２１と同様な効果をもたらすと信ぜ られる。主として残基２２−４０及び６９−９７の領域においてＴＮＦと結合す るリガンドは、ＴＮＦの生物活性にＭＡｂｌ２と同様な効果をもたらすであろう 。主として残基１−３０．１１７−１２８、及び１４１−１５３の領域において ＴＮＦと結合するりガツトは、ＴＮＦの生物活性にＭＡｂ３２と同様な効果をも たらすことが期待される。また、主として残基２２−４０．４９−９７．１１０ −１２フ及び＋３６−１５３の領域においてＴＮＦと結合するリガンドは、ＴＮ Ｆの生物活性にＭＡｂ４２と同様な効果をもたらすことが期待される。主として 残基２２−３１及び１４６−１５７の領域においてＴＮＦと結合するリガンドは 、ＴＮＦの生物活性にＭＡｂ３７と同様な効果をもたらすことが期待される。

主として残基２２−４０，６９−９７．１０５−１２８及び１３５−１５ｆｌＮ ７）領域においてＴＮＦと結合するリガンドは、ＴＮＦの生物活性にＭＡｂ５３ と同様な効果をもたらすことが期待される。

本発明者らは、ＴＮＦの生物活性が、リガンドのＴＮＦへの結合によって変えら れること、また、その生物活性にもたらす効果はリガンドの特異性に関係してい ることをきわめて明瞭に示した。例えば、残基１−２６．１１７−１２８、及び １４１−１５３の領域におけるＭＡｂ３２のＴＮＦへの結合は、ＴＮＦの内皮凝 固性活性の誘引と、内皮細胞上のレセプターへのＴＮＦの結合を阻止する結果を もたらし、腫瘍フィブリン沈澱の誘発とＴＮＦの腫瘍退行活性とを増進し、また 、細胞毒性には影響を及ぼさず、ＴＮＦの腫瘍レセプター結合活性には影響を及 ぼさないか、または増進する。ＴＮＦの生物活性に及ぼすこの効果は、ＭＡｂ３ ２によって確認された、ＴＮＦのエピトープの自然に発生する生物学的活性リガ ンドへの結合の妨害に由来すると信ぜられる。従って、ＭＡ　ｂ　３２によって もたらされる同様な効果も、ＭＡｂ３２によって確認されるエピトープが自然に 発生する生物学的活性リガンドに結合することがら防止されるのと同様な仕組み でＴＮＦの領域に結合するリガンドによってもたらされると信ぜられる。この結 合の妨害は立体障害または他の機構によるものであろう。

従って、自然に発生する生物学的活性リガンドに対するここに記したＭＡｂ３２ 及びＡｂ３０１により確認されるエピトープの結合の防止も本発明の視点に含ま れることを強調してお（。

ヒト　アルフ　の　−ウ　ルス　に　−ＮＦの　ｂ　のヅＴＮＦは、インビトロ （メスタンら、　Ｎａｔｕｒｅ、　’ＪｊＪ、　８１６−８１９（１９８６）、 ウォングとゴーデル、　Ｎａｔｕｒｅ、　ム１．８１９−Ｈ２（１９８６））　 、及びインビボ（ドハーティーら。

Ｊ、１ｊｎｕｎｏ１．、　工、　３７６−３１１０（１９８９））の両方におい て、抗−ウィルス効果を発揮することが知られている。本発明者らは、ＴＮＦ− ＭＡｂ３２複合体の、種痘疹感染マウスのＴＮＦの抗−ウィルス効果に対する影 響を実験した。

ＣＢＡ−Ｈマウスを種痘疹（１０７ｐ　ｆ　ｕ　ＶＶ−ＨＡ−ＴＫ、ラム７１− ら。

Ｎａｔｕｒｅ、　ｌｊＪ、　４４−４６（１０７））に感染させる２４時間前に 、そのマウスをＴＮＦ単独（再構成ヒ）ＴＮＦ）、または接種前に２４分間混合 したＴＮＦとＭＡｔ）３２（２００μｍ腹水グロブリン）で処理した。均質化し 、トリプシン（１ｍｇ／ｍｌ）で処理した卵巣、肺、肺臓サンプルで、４日後に １４３Ｂインジケーター・セル・ライン（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ　ｃｅｌｌ　１ｉ ｎｅ）を用いてウィルス滴定値を決定した。

ＴＮＦ−ＭＡｂ３２で処理したマウスは、ＴＮＦ単独で処理したマウスに比較し て、卵巣（図１７）、肺（図１８）、肺臓（図１９）でウィルスレベルが減少し ていることがわかる。

ＴＮＦと抗体３０１で処理したマウスでも同様の結果が得られた（図２０）。

インビボ　にお１　ウィルス　Ｈｖ−）ＣＢＡ／Ｈマウスを、１０７ｐｆｕの単 純庖疹ウィルスｌ　（Ｈ８Ｖ−１）に感染させる２４時間前に、適切なＴＮＦ　 ＋／−Ａｂ３０１投与で処理した。抗体を１１５０に希釈した後、６．０マイク ログラムのＴＮＦを混合し、その混合物を１時間室温で放置した。このＴＮＦ＋ Ａｂ３０１のストックから、種々の濃度のＡｔ＋と複合したＴＮＦを取り出し、 ＰＢＳ中で希釈したく即ち、０．５〜２゜０マイクログラム）。そのマウスは、 感染後３日間放置し、その動物を殺傷して卵巣を無菌的に取り出した。これらの 器官は、ＰＢＳ中で均質化し、１００μｌをＯ，１％トリブンノン３０分間処理 した。トリブ／／処理はＦｅ２を加えることによって終了させた。このサンプル を、１／１０ずつに連続して希釈した。これらの希釈液を３７℃で１時間ベロ・ セル（Ｖｅｒｏ　ｃｅｌｌ）に吸収させ、Ｆ１５＋５％ＦＣ９を上塗りして２日 間３７℃で放置した。斑点を計数し、ウィルス濃度を計算した。結果を図２２に 示す。

ンビトロ　に゛（ｖ− Ｌ９２９細胞を（リンプロ（Ｌｉｎｂｒｏ）　２４　ｗ　ｅ　ｌ　！プレートに ）５０００００細胞／ｗｅｌｌの濃度で、ＴＮＦ単独（１０−４ｏｏｎｇ）又は ＴＮＦとＭＡＩ）３２の複合体（複合方法は上記の通り）存在下で植え付けた。

これらの培養物は、２４時間放置し、その後ＨＳＶ−１（０，１−２，０）　で 感染させた。１００μ五のウィルス含有ＰＢＳを吸収させるために細胞上に１時 間３７℃で放置し、過剰のウィルスを取り除いてＦ１５＋５％ＦＣ３を上塗りし た。これらの培養物を４８時間放置した。

その時間の後、細胞を凍結し解凍する操作を２回繰り返し、上澄み液を連続的に 希釈した（トリプシン処理は必要ない）。そして、上記の通りベロ・セル上で吸 収、成長させた。結果を図２１に示す。

１２５　−　の　（ｂ　２　いζ　ｂ　の鉦朧ユニ監ま ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中の、ＭＡｂ３２またはＡｔ）３０１の異なった希釈液 に、やはりＲＰＭＩ中の２．０Ｘ１０ＢのＬ９２９細胞に引き続いて、ヨウ素化 したＴＮＦ　（５００００ｃｐｍ１５０μｌ）を加えた。これらの処理物を３時 間培養し、その後細胞を一度洗浄してベレット（ｐｅｌｌｅｔ）を計数した。す べての処理を３回行った。結果を図２３に示す。

−ＴＮＦＩガント　ＴＮＦの　ウィルス　に・　るガンマイン　−フェロン盆左 風没星旦［！ ＴＮＦと複合したＡｂ３ｏ１を、Ａｂ３０１を１１５０１ｍ希釈した後６μｇＯ ）ＴＮＦを混合することにより作製した。そのＴＮＦ十抗体を投与した。また、 １０５υ／マウスのネズミのガンマイノターフェロン（ｍｌＦＮ−γ）を単独で 投与した。Ａｂ３０１＋ｍ１ＦＮ−γ処理物とともにＴＮＦもまた投与した。ｍ １ｐｓ−７は、ＴＮＦと抗体の１時間の室温培養の後まで、ＴＮＦ：Ａｂ３０１ ？１合体に混合しなかった。

２４時間後、そのマウスに１０８ｐｆｕの種痘を静脈注射した。この実験の結果 を表６に示す。

シトキン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）処理　ＬｏｇＩＯウィルス滴定（ｐｆｕ／ｍｌ） ±ＥＭ ＰＢＳ　（ｎ＝５）　８．２０±０．２９６μｇＴＮＦ＋１１５０　Ａｂ３０１ 　５．９３±０．３３１０５Ｕ　ｍ１ＦＮ−７（ｎ＝５）　５．６６±０．３５ ６μｇＴＮＦ＋１１５０　Ａｂ３０１　＜２．０＋１０５Ｕ　ｍ１ＦＮ−７ 表６に示した結果かられかるように、ｍ１ＦＮ−７とＭＡＩ）３０１　：ＴＮＦ 複合体との間で、特筆すべき共同抗−ウイルス効果がある。

すでに図１７．１８及び１９に見られた結果のように、抗−ＴＮＦリガンドのＭ Ａｂ３２と組み合わせたＴＮＦの投与は、感染した動物から回復できるウィルス 粒子の数の減少をもたらす。科学的理論に裏付けられてはいないが、抗−ＴＮＦ リガンドと組み合わされたＴＮＦの投与によってもたらされる増進した抗−ウィ ルス効果は、内皮のレセプターへのＴＮＦの結合の妨害又はウィルスに感染した 細胞のレセプターへのＴＮＦの結合の直接的な増加（図２３）に見られるＴＮＦ 量の増加したリガンドの結果であると考えられる。従って、本発明の方法は、内 皮表面の感染に限られないウィルス性感染の治療に特に応用することができると 信ぜられる。特に、本発明の方法は、以下のウィルスによる感染の治療に適用で きる、即ち、肝炎、Ａ　Ｉ　ＤＳ、庖疹、ウィルス性髄膜炎、グリーンモン牟− （ｇｒｓｅｎ　５ｏｎｋｅｙ）ウィルス及び種痘疹である。

当業者には、上記で説明した発明は、広く知られている発明の精神や視点から離 れることなく、多くの変更や修正をなすことができることが認められるであろう 。

図５ モノクローナル抗体 （ＩｏｇｌＯｎｇ） 図６ モノクローナル抗体 （ｌｏｇｌｏ　ｎｇ） 図７ 図８ モノクローナル抗体 （ｌｏｇｌＯｎｇ） 図９ モノクローナル抗体 （ｌｏｇｌｏ　ｎｇ） 図１０ ＸＪＩＩ 門Ａり 図１２ 処理 （２００μｉグロブリン＋１０μｇＴＮＦ　注射／日／マウス）図１３ ＝噂Ｃ・喝■°電ｏ４ 図１５ 図１６ ｌｏｇｌ　Ｏウィルス滴定値（ｐｆｕ／ｍｌ）ＬｏｇＩＯウィルス滴定値（ｐｆ ｕ／ｍｌ）ＬｏｇＩ　Ｏウィルス滴定値（ｐｆｕ／ｍｌ）フロントページの続き オーストラリア国　２６１１　オーストラリア

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳動物に抗−ＴＮＦリガンドを単独で又はＴＮＦとの組合せでのいずれか 一方で投与することを含心哺乳動物のウイルス住感染治療方法において、該リガ ンドが、ＴＮＦに結合するときに、該ＴＮＦの内皮の凝固性活性の発現が阻害さ れ、そして該ＴＮＦの抗−ウイルス活性が影響されないか又は増進されることを 特徴とするウイルス性感染の治療方法。 ２．前記リガンドが、ＴＮＦに結合するときに、ＴＮＦの内皮細胞上のレセプタ ーへの結合が阻害され；腫瘍フィブリン沈澱とＴＮＦによる腫瘍退行活性が増進 され；その細胞毒性が影響されず、そしてＴＮＦの腫瘍レセプター結合活性が影 響されないか又は増進されることを更なる特徴とする請求項１記載のウイルス性 感染の治療方法。 ３．前記リガンドが、残基１から１８の位相幾何学的な領域によって明確化され たＴＮＦのエピトーブが、自然に発生する生物学的活性リガンドに結合すること を実質的に阻害することを特徴とする請求項１又は２記載のウイルス性感染の治 療方法。 ４．残基の位相幾何学的領域１−３０、１１７−１２８、及び１４１−１３５、 さらに好ましくは、該残基の位相幾何学的な領域１−２６、１１７−１２８、及 び１４１−１５３によって明確化されたＴＮＦのエピトーブが、自然に発生する 生物学的活性リガンドに結合することを実質的に阻害するように、リガンドをＴ ＮＦに結合させる請求項１又は２記載のウイルス性感染の治療方法。 ５．哺乳動物に抗−ＴＮＦリガンドを単独で又はＴＮＦとの組合せでのいずれか 一方で投与することを含む哺乳動物のウイルス性感染治療方法において、該リガ ンドが、ヒトのＴＮＦの残基１から１８に結合することを特徴とするウイルス性 感染の治療方法。 ６．哺乳動物に抗−ＴＮＦリガンドを単独で又はＴＮＦとの組合せでのいずれか 一方で投与することを含む哺乳動物のウイルス性感染治療方法において、該リガ ンドが、残基１−３０、１１７−１２８、及び１４１−１５３の位相幾何学的領 域の中でヒトのＴＮＦに結合することを特徴とするウイルス性感染治療方法。 ７．前記リガンドが、残基１−２６、１１７−１２８及び１４１−１５３の位相 幾何学的領域の中でヒトのＴＮＦに結合することを特徴とする請求項６記載のウ イルス性感染の治療方法。 ８．前記リガンドが、ヒトのＴＮＦ（ペプチド３０１）のアミノ酸１から１８と 実質的に一致するアミノ酸配列を有するペプチドに対して発生した抗体であるこ とを特徴とする請求項３又は５記載のウイルス性感染の治療方法。 ９．前記リガンドが、ＭＡｂ３２で明確化されたモノクローナル抗体であること を特徴とする請求項１から７のいずれかに記載のウイルス性感染の治療方法。 １０．前記治療方法に、ＩＬ−２、ＡＺＴ又はアシクロウイルのような他の抗− ウイルス薬剤の共同投与を含むことを特徴とする請求項１から９のいずれかに記 載のウイルス性感染の治療方法。 １１．前記治療方法に、ガンマインターフェロンと、抗−ＴＮＦリガンドを単独 又はＴＮＦとの組合せのいずれか一方の共同投与を含むことを特徴とする請求項 １から１０のいずれかに記載のウイルス性感染の治療方法。 １２．ガンマインターフェロンと、抗−ＴＮＦリガンドを単独またはそれとＴＮ Ｆとの組み合わせのいずれか一方とを含み、該リガンドが、ＴＮＦに結合すると きに該ＴＮＦの内皮の凝固性活性の発現が阻害され、そして該ＴＮＦの抗−ウイ ルス活性が影響されないか又は増進されることを特徴とするウイルス性感染の治 療に使用する組成物。 １３．前記リガンドが、ＴＮＦに結合するときに、ＴＮＦの内皮細胞上のレセプ ターへの結合が阻害され；腫瘍フィブリン沈澱とＴＮＦによる腫瘍退行活性が増 進され；その細胞毒性が影響されず、そしてＴＮＦの腫瘍レセプター精舎活性が 影響されないか又は増進されることを更なる特徴とする請求項１２記載の組成物 。 １４．前記リガンドが、残基１から１８の位相幾何学的な領域によって明確化さ れたＴＮＦのエピトーブが、自然に発生する生物学的活性リガンドに結合するこ とを実質的に阻害することを特徴とする請求項１２又は１３記載の組成物。 １５．残基の位相幾何学的領域１−３０、１１７−１２８、及び１４１−１３５ 、さらに好ましくは、該残基の位相幾何学的な領域１−２６、１１７−１２８、 及び１４１−１５３によって明確化されたＴＮＦのエピトーブが、自然に発生す る生物学的活性リガンドに結合することを実質的に阻害するように、リガンドを ＴＮＦに結合させる請求項１２又は１３記載の組成物。 １６．ガンマインターフェロンと、抗−ＴＮＦリガンドを単独またはそれとＴＮ Ｆとの組み合わせのいずれか一方とを含み、該リガンドが、ヒトのＴＮＦ残基１ から１８に結合することを特徴とする哺乳動物のウイルス性感染の治療に使用さ れる組成物。 １７．ガンマインターフェロンと、抗−ＴＮＦリガンドを単独またはそれとＴＮ Ｆとの組合せのいずれか一方とを含み、該リガンドが、残基１−３０、１１７− １２８、及び１４１−１５３の位相幾何学的領域の中でヒトのＴＮＦに結合する ことを特徴とする哺乳動物のウイルス性感染の治療に使用される組成物。 １８．前記リガンドが、残基１−２６、１１７−１２８及び１４１−１５３の位 相幾何学的領域の中でヒトのＴＮＦに結合することを特徴とする請求項１５また は１７記載の組成物。 １９．前記リガンドが、ヒトのＴＮＦ（ペプチド３０１）のアミノ酸１から１８ と実質的に一致するアミノ酸配列を有するペプチドに対して発生した抗体である ことを特徴とする請求項１５または１７記載の組成物。 ２０．前記リガンドが、ＭＡｂ３２で明確化されたモノクローナル抗体であるこ とを特徴とする請求項１１から１９のいずれか記載の組成物。 ２１．抗−ＴＮＦリガンドの単独又はＴＮＦとの組合せのいずれか一方の、哺乳 動物のウイルス性感染治療用薬剤の生産における使用において、該リガンドが、 ＴＮＦに結合するときに、該ＴＮＦの内皮の凝固性活性の発現が阻害され、そし て該ＴＮＦの抗ウイルス活性が影響されないか又は増進されることを特徴とする 抗−ＴＮＦリガンドの使用。 ２２．前記リガンドが、ＴＮＦに結合するときに、ＴＮＦの内皮細胞上のレセプ ターへの待合が阻害され：腫瘍フィブリン沈澱とＴＮＦによる腫瘍退行活性が増 進され：その細胞毒性が影響されず、そしてＴＮＦの腫瘍レセプター結合活性が 影響されないか又は増進されることを更なる特徴とする請求項２１記載の使用。 ２３．前記リガンドが、残基１から１８の位相幾何学的な領域によって明確化さ れたＴＮＦのエピトーブが、自然に発生する生物学的活性リガンドに結合するこ とを実質的に組害することを特徴とする請求項２１又は２２記載の使用。 ２４．残基の位相幾何学的領域１−３０、１１７−１２８、及び１４１−１３５ 、さらに好ましくは、該残基の位相幾何学的な領域１−２６、１１７−１２８、 及び１４１−１５３によって明確化されたＴＮＦのエピトーブが、自然に発生す る生物学的活性リガンドに結合することを実質的に阻害するように、リガンドを ＴＮＦに結合させる請求項２１又は２２記載の使用。 ２５．抗−ＴＮＦリガンドの単独又はＴＮＦとの組合せのいずれか一方の、哺乳 動物のウイルス性感染治療用薬剤の生産における使用において、該リガンドが、 ヒトのＴＮＦの残基１から１８に結合することを特徴とする抗−ＴＮＦリガンド の使用。 ２６．抗−ＴＮＦリガンドの単独又はＴＮＦとの組合せのいずれか一方の、哺乳 動物のウイルス性感染治療用薬剤の生産における使用において、該リガンドが、 残基１−３０、１１７−１２８、及び１４１−１５３の位相幾何学的領域の中で ヒトのＴＮＦに結合することを特徴とする抗−ＴＮＦリガンドの使用。 ２７．前記リガンドが、残基１−２６、１１７−１２８及び１４１−１５３の位 相幾何学的領域の中でヒトのＴＮＦに結合することを特徴とする請求項２６記載 の使用。 ２８．前記リガンドが、ヒトのＴＮＦ（ペプチド３０１）のアミノ酸１から１８ と実質的に一致するアミノ酸配列を有するペプチドに対して発生した抗体である ことを特徴とする請求項２５記載の使用。 ２９．前記リガンドが、ＭＡｂ３２で明確化されたモノクローナル抗体であるこ とを特徴とする請求項２１から２８のいずれかに記載の使用。 ３０，前記リガンドが、抗体、Ｆ（ａｂ）フラグメント、再構成した抗体（ＣＤ Ｒ分岐したヒト化抗体）、シングルドメイン抗体（ｄＡＢｓ）、単鎖抗体、抗イ ディオタイプ抗体、血清結合タンパク質、レセプター、及び自然阻害剤の群の中 から選択されることを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の方法。 ３１．前記リガンドが、モノクローナル又はポリクローナル抗体か、またはそれ のＦ（ａｂ）フラグメントであることを特徴とする請求項３０記載の方法。