JPH03503530A - ヒト腫瘍治療薬およびその製造方法 - Google Patents
ヒト腫瘍治療薬およびその製造方法Info
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- JPH03503530A JPH03503530A JP1505817A JP50581789A JPH03503530A JP H03503530 A JPH03503530 A JP H03503530A JP 1505817 A JP1505817 A JP 1505817A JP 50581789 A JP50581789 A JP 50581789A JP H03503530 A JPH03503530 A JP H03503530A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ヒト腫瘍治療薬およびその製造方法
本発明は薬品、特にヒトの腫瘍の治療に用いる薬品に関する。
現在、腫瘍は化学療法、放射線療法または外科的処置により治屋されている。こ
れらの治療法のいずれも不都合な点を有している。
化学療法、放射線療法および外科的処置の不都合な点を回避することは好都合で
ある。
本発明の1つの目的は、ヒトの腫瘍の薬学的治療法を提供することである。
本発明の別の目的は知られた治療法よりも副作用の小さい治療法を提供すること
である。
更に別の本発明の目的は、1種類より多い腫瘍で用いる治療法を提供することで
ある。
また更に別の本発明の目的はヒトの腫瘍の治療のための知られた治療法を改良す
ることである。
本発明によれば、ヒトの腫瘍を治療するための薬品が提供される。その薬品は薬
14000〜16000ダルトンの分子量を有し、特徴的な等電点およびアミノ
酸組成を有する実賞的に純粋な蛋白質である。薬品が受精に付されるカエル卵か
ら誘導されることは必然的ではないが有利である。即ち、好ましい実施態様では
薬品はrana 1piensカエルの胚および卵から誘導される。肺の発生
を1腸形成の前、そして好適には完全胞胚(128細胞)段階またはその前に好
都合に停止し、胚を弱酸性緩衝液の存在下にホモゲナイズし、次に遠心分離して
上澄み液を得る。
次にこれをイオン交換クロマトグラフィーおよび径分別(5ize−Exclu
sion)クロマトグラフィーに付す。
図面の簡単な説明
本発明は後に示す説明の為の限定しない図面を参照することにより、5り良く理
解される。
第1図は本発明の好ましい実施態様における方法の70−チャートである。
第2図は臭化シアンを用いた薬剤の分解を示す模式図である。
第3図は臭化シアンを用いた分解の後の薬剤の長断片のアミノ酸配列を示すもの
である。
好ましい実施態様の詳細な説明
A、胚/卵混合物の調製
好ましい実施態様においてはrana pipiensの卵を誘発***により生
産しく高度に制御された状態で発生を行なうt;め)、そして雌カエルの体外の
制御された条件下で受精させる。***は9月〜3月に誘発させる。その他の月間
は誘発***は不可能である。その理由はranapipiensは4月に自発的
に***し、その繁殖時期は5月から8月まで継続するI;めである。
大聖で健康な精力的な妊娠中の雌rana pipiensを誘発***のために
選択する。これらを雄rana pipiensから隔離し、水道水1インチを
満たしt;水槽中で、3日間、6℃で飼育する。この温度が好ましいが、受精過
程において他の条件を適宜調製する場合はその他の温度を用いることもできる。
即ち、卵の発生速度は温度に依存する。
選択されt;メス各々につき、各ベトリ皿に好ましくは試験済みの涌き水10立
方センチメートルを入れる。試験済みの涌き水はrana pipiensおよ
びその胚の生命を維持するために試験された新鮮な涌き水である。
好都合には、選択された雌各々の体内に5つの新!二に単離された雌rana
pipiens下垂体を導入することにより***を誘発する。雄の下垂体を雌下
垂体の代わりに用いてもよいが、雌下垂体1個は雄下垂体2個に等しく、使用量
を適切に調節しなければならない。
適切な数の下垂体を相当する液体含有ペトリ皿に入れる。選択された雌各々を室
温(22℃)とする。皿ごとに下垂体をシリンジに導入し、相当する選択されt
;雌の腹部の右下4分の1に、18ゲージの注射針で導入する。
次に選択された雌を涌き水1インチの入った水槽に入れる。各水槽の底に平板の
岩を入れ、雌がその上で休み、水位より高位置にあることができるようにする。
(これが有利である理由は、妊娠中の雌は嗜眠性を示す場合があり、水位より高
く保持しなければ溺死する場合があるためである。)水槽を倉庫用布で覆い(こ
れによりカエルが水槽から飛び出すのを防止し)、そして48時間、好都合に室
温(22℃)に維持する。次に妊娠中の雌より生産された卵を好ましい実施態様
に従って雌カエルの体外で、好都合にはベトリ皿中で、そして好ましくは各妊娠
雌につき4枚のベトリ皿を用いて、受精させる。
受精を達成するために、雄のrana pipiensを層殺(エーテル過剰麻
酔)し、その精巣を取出し、結合組織と脂肪を除く。受精すべき卵の各ベトリ皿
に少なくとも4つの精巣が供給できるよう十分な数の雄を層殺する(即ち妊娠雌
当り16精巣)。この量は、ペトリ皿の大きさを考慮した場合の***懸濁液p最
適な量を与える。(好都合には、雄rana pipiensの下垂体もまた摘
出し、後に他の雌の***を誘発するのに用いる。)
次に各ベトリ皿に精巣4個を入れ、精巣を崩壊させ(切り崩しによる)て牛乳状
の***懸濁液を形成する。。
精巣の崩壊は***を破壊しないような方法で行なわなければならない。次に各妊
娠雌の腹部を後部に向けて圧迫することにより卵を取出す。多錐の産卵は4つの
懸濁液充填ベトリ皿に均一に分布させる。これにより皿内の卵の過剰集中を防止
する。
卵を室温で3〜4.5時間懸濁液中に放置する。最初の1時間は、皿中の***懸
濁液および卵を間欠的に撹拌し、卵が常時、***懸濁液に被覆されているように
する。3〜4.5時間経過後、皿を切開用顕微鏡の下で検査し、***の徴候を観
察する。rana pipiens胚の80%***が観察された時に、相当する
皿を回収し、その時点で胚は少なくとも4細胞期の発生段階にある。4細胞期は
それが即刻を確立し、そして受精の観察事実が誤判断でないことを示すことから
、指標として用いる。
胚の100%***は通常は3〜4.5時間では達成されないため、収集した皿は
通常は胚(受精卵)および未受精卵の両方を含む。この混合物をしばしば受精魁
理卵混合物と称し、卵と胚の両方が存在することを指す。好ましい実施態様にお
いては80%***を指標として用いるため、混合物中の卵の胚に対する比はほぼ
l:4となる。
受精処理に付した全回収卵を、次に、容器内に掻き入れ、−15〜−20℃で凍
結保存する。この保存は本発明の実施に対して本質的なものではなく、これはバ
ッチで次の処理を行なうために好都合である場合にのみ好ましい。
B、受精処理卵の機械的処理
混合物が凍結しt;ら、過熱の起こらないような何らかの方法でこれを解凍する
。解凍した、または非凍結の混合物を、好ましくは汚染を防止するために層流気
流下で、弱酸性緩衝液の存在下、ホモゾナイズする。
好ましい実施態様においては、受精処理卵の混合物を、室温で、受精処理卵の混
合物の1容量に対し2容量の緩衝液を用いて、0.15M酢酸ナトリウム(pH
4,8〜4.9)と混合する。緩衝液は酢酸ナトリウムである必要はないが、弱
酸性であることが必要であり、好ましい実施態様においては、CM−セファロー
スクロマトグラフィーを行ない、そして酢酸ナトリウムが4〜5.8のpH領域
では良好な緩衝液である(この領域でCM−セファロース交換カラムが効果的で
ある)ことから、酢酸ナトリウムを使用するのである。ホモゾナイズは、全卵が
目視により破壊されたことが解るまでWaring Blenderで行なうが
%WaringBlenderが特に必要ではなく完全なホモゾナイズを達成で
きる衛生的な方法の何れを使用することもできる。ホモゾナイズは、懸濁液が均
質になり、未損傷の卵が目視不能となった段階で、終了する。次にホモジネート
を2時間室温で撹拌する。
好ましい実施態様においては、ホモゾナイズし撹拌された受精処理卵混合物を2
段階で遠心分離(4℃〜8℃)する。第1の段階では、撹拌したホモジネートを
平均加速度350 、000 x cで遠心分離し、そして得られた上澄みを確
保する。この段階に要する時間は通常は30分であるが、透明でゲルを含まない
上澄みを得る必要があり、時間は、これを達成するために必要に応じて増加させ
る。
第2の段階では、遠心分離の第1段階で得られた沈殿を上記したように再ホモゲ
ナイズするが、今回は沈殿l容量に対し緩衝液1容量を用いる。再度ホモゾナイ
ズしl;沈殿を上記したように遠心分離し、得られた上澄みを、第1段階で得ら
れた上澄みと合わせる。
上記した遠心分離段階の時間、速度および他の条件は、使用可能な装置を用い、
最も好都合な方法で、ホモジネートおよび沈殿に最大の重力を付与するように選
択した。
これらは本発明の実施のためには必要ではないが、本発明の好ましい実施態様の
ために至適化しである。
上澄み液の各バッチをデカンテーションし、滅菌ガーゼで濾過し、そして、好ま
しい実施態様ではGe1man超厚ガラス繊維フィルターで加圧濾過することに
より精製する。これにより後述する処理段階においてカラムを目詰まりさせる残
渣を除去できるが、Ge1man超厚ガラス繊維フィルターが特に必要なわけで
はなく、他の適当なフィルターで代用してもよい。
好ましい実施態様では、濾過しt;抽出物の所定の細胞系統に対する生物活性を
検定する。これは特に必要ではないが、2つの主要な理由から、好都合である。
第1の理由は、商業的生産量に合った規模の工程においては、濾過抽出液のバッ
チを合わせた後に、次の処理段階を行なうことである。不活性の濾過抽出液のバ
ッチを検査して廃棄することにより、非生物活性のバッチの生物活性バッチへの
不都合な混入を防止する。もう1つの理由は、次の処理段階に費用がかかるが、
非生物活性物質の同定と排除を行なうことにより、その処理に要する実質的費用
を調節できることである。
好ましい実施態様で使用する実際の検定は、ヒト顎下類表皮癌A−253細胞お
よびNTT商標のもとで販売されているテトラゾリウム化合物(Chemico
n International。
夏nc、、 100 Lomita 5treet、 EI Se
gundo、 Ca1ifornia)を用いて行なう。しかしながらこれが
特に必要なわけではなく、その他の生物検定を用いてもよい。あるいは、生物検
定と良好な相関性を有する代替の非生物検定法がある場合は、生物検定は不必要
である。
濾過した抽出液は−15〜−20℃で凍結保存するか、速やかにさらに精製段階
に付す。凍結保存により抽出物中の細菌の成育、蛋白の分解および変性が防止で
きるため、凍結保存が好ましい。
C9イオン交換クロマトグラフィー
濾過した抽出液を凍結した場合は、過熱の起こらない方法でこれを解凍する。解
凍した、または非凍結抽出液をイオン交換クロマトグラフィーに付す、好ましい
実施態様においては、イオン交換クロマトグラフィーは僅かに条件の異なる2段
階で行なう。第1の段階においては、活性蛋白質を先ず単離し、本質的に内毒素
非含有とする。
第2の段階においては、蛋白質を、第1段階で活性蛋白質と共精製された他の蛋
白質から精製すると同時に、残存している可能性のある内毒素からも精製する。
好ましい実施態様においては、第1のイオン交換クロマトグラフィ一段階を直径
11cm長さ20cmのカラムを用いて行なう。後述する条件は、この寸法のカ
ラムに対して至適化しである。しかしながら、異なる寸法のカラムを使用する場
合は、条件を変えてよい。
好ましい実施態様においては、連続する2つのイオン交換クロマトグラフィ一段
階の目的は、大きさで蛋白を分離する前に、等電点p+ 9□5〜1O95の蛋
白を単離することである。第1のイオン交換クロマトグラフィ一段階では、濾過
抽出液を酢酸でpH4、5まで酸性化し、CM−セファロースゲルを充填したカ
ラムに適用する。カラムは0.15M酢酸ナトリウム緩衝液(pH4,5)で平
衡化し、カラムは平衡化緩衝液中の塩化ナトリウムの連続−次濃度勾配(0〜0
.7M)で展開する。これらの条件は本発明の実施に必須ではないが、好都合で
あり、現時点では生物活性蛋白を高収率で生成すると考えられる。
好ましい実施態様においては、溶出した蛋白を発熱物質非含有の(pyroge
n−free)水で2倍に希釈し、異なる条件下で行なう第2のイオン交換クロ
マトグラフィ一段階に付す。この第2のイオン交換クロマトグラフィ一段階は直
径5cm長さ20cyxのCM−セファロースゲルを充填した第2のカラムで行
なう。カラムは0.15M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH4,8)で平衡化させ
、平衡化緩衝液中の塩化ナトリウムの連続−次濃度勾配(0〜0.4M )で展
開する。
好都合には、両方のクロマトグラフィ一段階を18〜20℃(空調室)で行なう
が、これは厳密ではない。カラムクロマトグラフィ・−は4°C(冷蔵質)より
高温でより高価的であることが知られており、工程は生成した薬剤の安定性に見
合った最も高い温度で行なう。
好ましい実施態様においては、第2のイオン交換段階から得られた溶出液を50
00ダルトンの分子量カットオフの膜を用いて限外濾過し、浸透液を廃棄するこ
とにより濃縮する。適する膜は、5pectora−Por (Speetru
o+Medical Industries製)およびAm1con YM5
(A+++1con製)であるが、その他の膜および他の濃縮方法で代用しても
よい。
D、 径分別りロマトグラフィー
次に濃縮した物質を直径5c+m長さ90ci+のBlo−Ge1 P−30ゲ
ルを充填し、0.075重炭酸アンモニウムで平衡化したカラムに適用する。主
要蛋白ピークを単離する。
これらの特定の条件は、本発明の実施のために特に必要ではなく、他の大きさ、
ゲルおよび他の径分別法で代用してもよい。しかしながら、径分別クロマトグラ
フィーをイオン交換クロマトグラフィーの次に用いることが推奨される。その理
由は、この順序でクロマトグラフィーを行なうことにより、径分別クロマトグラ
フィーのための合理的な大きさのカラムを用いることが可能になるからである。
E、最終処理
径分別カラムからの溶出液を0.22ミクロンのフィルターで濾過滅菌し、次に
凍結乾燥する。これらの処理段階は製薬産業において標準的なものであり、本発
明の部分ではない。得られt;製剤は生菌を含有しない。
薬品の生物活性
in vivoおよびin vitroの確認動物試験結果によれば、薬剤はヒ
ト顎下類表皮癌A−253細胞およびヒト卵巣腺癌NIB−OVCAR−3細胞
に対し活性を有することが解る。薬剤はまt:、ヒト白血病HL−60細胞、大
腸腺癌から本来単離されt;ヒトC0LO320D)1細胞、ビトLOX黒色騰
、およびヒト肺扁平上皮癌HT−520細胞に対しても活性を示した。
化学分析および薬剤の組成
上記した薬剤はある範囲で特性化されている。薬剤はrana pipiens
から単離された蛋白であるが、薬剤は、最終製品が以下の化学的特徴および構造
を有する限り、遺伝子工学により製造してもよいと考えられる。
薬剤は実質的に純粋な蛋白質(即ち、蛋白質の等質性を検定するのに用いる通常
の試験により実質的に均質であることが明らかである)である。電気泳動による
薬剤の分子量は約14.000ダルトン以上であり、アミノ酸分析によりその分
子量が実質的に16,000ダルトンを超えないことが示される。薬剤は等電点
piが9.5〜10.5である。
薬剤はブロックされ!;アミノ末端基を有し、実質的に炭水化物(アンスロンお
よびオルシノール法によす測定)および他の蛋白を含有しない。
アミノ酸分析により、薬剤は以下のアミノ酸組成を有することが解っている。
分子量たりの
アスパラギン酸/アスパラギン 20スレオニン
13セリン 11グルタミン
酸/グルタミン 9フエニルアラニン
8トリプトフアン 2概算合計
142薬剤をG、 A11enがT、S、 Wor
kとR,H,Burdon編集の「蛋白およびペプチドの配列決定(Seque
ncing of Proteinsand Peptides)J (Els
ecier/North−Hall and、 1981)に記載した方法で臭
化シアンを用いてメチオニン残基で分解し、次に前記G、 Al1enの方法(
pp 17−142)で還元し、カルボキシメチル化した場合、長さの異なる2
種類の断片が得られる。次にこれらの断片を径分別クロマトグラフィーで分離す
る。これらの断片のアミノ酸組成は以下のとおりである。
短 い 断 片
分子量たりの
アスパラギン酸/アスパラギン 6グルタミン酸/グルタミン
2プロリン 0フエ
ニルアラニン l概算合計
23本 (力Jレボキシメチルシーシスティンとして)草本 (
ホモセリン+ホモセリンラクトンとして)長 い 断 片
分子量たりの
アスパラギン酸/アスパラギン 15スレオニン
IOセリン 10グルタミン
酸/グルタミン 7概算合計
121シスチン/2(システィン)残基は、ジスルフィド架橋の還元およ
びアルキル化のため、カルボキシメチル−システィンとして現われる。メチオニ
ン残基は、メチオニンの後ろの鎖のCNBr分解のためホモセリンとホモセリン
ラクトンとの混合物として現われる。
短い断片は明らかにブロックされI;アミノ末端、ホモセリンカルボキシ末端お
よび約23残基の鎖長を有している。(薬剤の活性に対するアミノ末端のブロッ
ク状態または遊離状態の影響は未測定である。)長い断片は遊離アミノ末端およ
び約121残基の鎖長を有する。長い断片はメチオニン残基の直後から始まる以
下のように表現されるアミノ酸配列を有する。
5er−Th r−A”−Leu−Phe−H1s−Cys−Lys −Asp
−Lys−丑−Th r−5p
Phe−11e−Tyr−Ser−Arg−Pro−G Iu−Pro−Va
1−Lys−A la−11e−(Cys )−Lys−G Iy−+ 1e−
11e−A l a−5er−Lys−Asn−A 1a−Va l −Leu
−Thr−Th r−3e r−G 1u−Phe−Ty r −Leu−3e
r−A 5p−Xxx−Asn−Va 1−Th r−Xxx−(Lys)−
Pro−Xxx−Lys−(Tyr)−(Cys)−(Phe)この表現では、
100%未満80%以上のある信頼水準で同定される残基を括弧内に示した。X
xxは未同定の残基であり、下線を施した残基は順番が逆の場合も考えられる。
Asnの多形性は対立多形性またはアミド化の程度が異なAsp
ることを示す。
以上のとおり好ましい実施態様を記載したが、本発明の範囲は以下の請求範囲に
よってのみ限定される。
FIG、1
FIG、3
補正音の翻訳文搏出誓
(特許法第184条の8)
平成2年10月5日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)約14.000〜16.000ダルトンの分子量を有し、おおむね以下に示 すようなアミノ酸組成を有する実質的に純粋な蛋白質。 分子当たりのアミノ酸 残基の概数物質 アスパラギン酸/アスパラギン 20 スレオニン 13 セリン 11 グルタミン酸/グルタミン 9 プロリン 6 グリシン 4 アラニン 4 シスチン/2 10 バリン 11 メチオニン 1 イソロイシン 8 ロイシン 7 チロシン 3 フェニルアラニン 8 ヒスチジン 4 リジン 17 アルギニン 4 トリプトファン 2 概算合計 142 2)受精処理されたカエル卵から誘導した実質的に純粋な蛋白質であって、その 蛋白質の分子量は約15,000ダルトンであり、等電点pIは9.5〜10. 5であり、そしてブロックされたアミノ末端を有し、炭水化物および他の蛋白質 を実質的に含有しないような上記蛋白質。 3)単一メチオニン残基を有し、側鎖で具化シアン分解した場合に短い断片と長 い断片を形成し、短い断片はブロックされたアミノ末端、ホモセリン+ホモセリ ンラクトンカルボキシ末端および約23残基の鎖長を有し、そして長い断片は遊 離のアミノ末端基および約121残基の鎖長を有し、そして、長い断片が下記; 【配列があります】 〔式中、100%末満80%以上のある信頼水準で同定された配列アミノ酸残基 は括孤内に示され、Xxxは末同定の残基であり、下線を旅した残基は順序が逆 になる可能性があり、共通の位置に示されるAsnおよびAspの明らかな多形 性がある〕で表現されるアミノ酸配列を含む実質的に純粋な蛋白質。 4)単一のメチオニン残基を有し、この残基の位置で臭化シアン分解した場合に 角い断片と長い断片を形成し、断片のアミノ酸組成がおおむね以下に示すもので あるような実質的に純粋な蛋白質。 短い断片、 分子当たりのアミノ酸 残基の概数物質 アスパラギン霞/アスパラギン 6 スレオニン 3 セリン 0 グルタミン酸/グルタミン 2 プロリン 0 グリシン 0 アラニン 0 シスチン/2 1* バリン 1 メチオニン 1**イソロイシン 2 ロイシン 1 チロシン 0 フェニルアラニン 1 ヒスチジン 1 リジン 2 アルギニン 1 トリプトフアン 1 概算合計 23 *(カルボキシメチル−システインとして)**(ホモセリン+ホモセリンラク トンとして)長い断片 分子当たりのアミノ酸 残基の概数物質 アスパラギン酸/アスパラギン 15 スレオニン 10 セリン 10 グルタミン酸/グルタミン 7 プロリン 6 グリシン 5 アラニン 4 シスチン/2 9 バリン 10 メチオニン 0 イソロイシン 6 ロイシン 6 チロシン 4 フェニルアラニン 7 ヒスチジン 3 リジン 15 アルギニン 3 トリプトファン 1 概算合計 121 5)下記段階: a)カエル卵を受精処理に付し、これにより胚を形成すること; b)胚の発生を原腸形成前に停止すること;c)胚および未受精卵を、弱酸性緩 衝液の存在下に、機械的にホモゲナイズすること; d)上記ホモゲナイズした胚および卵を遠心分離して、それより上澄みを得るこ と;および、 e)上澄み液をイオン交換クロマトグラフィーに付すこと、 を包含する薬剤の調製方法。 6)上記イオン交換クロマトグラフィー段階で回収された物質を濃縮する段階を さらに包含する請求項5記載の方法。 7)上記回収され濃縮された物質を径分別クロマトグラフィーに付す段階をさら に包含する請求項6記載の方法。 8)カエルがrana pipiensである請求項5記載の方法。 9)緩衝荊が酢酸ナトリウムである請求項5記載の方法。 10)イオン交換クロマトグラフィーが陽イオン交換型である請求項5記載の方 法。 11)上澄みをイオン交換クロマトグラフィーに付す前に上澄み液を濾過する段 階をさらに包含する請求項5記載の方法。 12)Gelman超厚ガラス繊維フィルターで上澄みを濾過することにより濾 過段階を実施する請求項11記載の方法。 13)下記段階: a)カエル卵を受精処理に付し、これにより胚を形成すること; b)胚の発生を原腸形成的に停止すること;c)胚および未受精卵を、弱酸性緩 衝液の存在下に、機械的にホモゲナイズすること; d)上記ホモゲナイズした胚および卵を遠心分離して、それより上澄みを得るこ と;および、 e)上澄み液から等電点9.5〜10.5の物質を抽出すること、 を包含する薬剤の調製方法。 14)抽出段階がイオン交換クロマトグラフィーの段階を包含する請求項13記 載の方法。 15)上記物質から分子量約14,000〜16,000の物質を単離ずる段階 をさらに包含する請求項13記載の方法。 16)単離段階が径分別クロマトグラフィーを包含する請求項15記載の方法。 17)記載する順序で実施される下記段階:a)カエル卵を受精処理に付し、こ れにより胚を形成すること; b)圧の発生を原腸形成前に停止すること;c)胚および未受精卵を、弱酸性緩 衝液の存在下に、機械的にホモゲナイズすること; d)上記ホモゲナイズした胚および卵を遠心分離して、それより上澄みを得るこ と; e)上澄み液をイオン交換クロマトグラフィーに付して物質を回収すること; f)上記物質を異なる条件下の第2段階のイオン交換クロマトグラフィーに付し てより純粋な物質を回収すること;および g)上記のより純粋な物質を径分別クロマトグラフイーに付すこと、 を包含する薬剤の製造方法。 18)2回のイオン交換クロマトグラフィー段階の第1段階を、酢酸ナトリウム 緩衝液で平衝化され、第1の連続一次濃度勾配塩化ナトリウムで展開するM−セ フアロースゲルを用いて行ない、そして、上記2回のイオン交換クロマトグラフ ィーの第2段階を、塩化ナトリウム緩衝液で平衝化され、第1の連続一次濃度勾 配塩化ナトリウムとは異なる第2の連続一次濃度勾配塩化ナトリウムを用いて展 開する同様のCM−セフアロースゲルを用いて実施するような請求項17記載の 方法。 19)上記径分別クロマトグラフィー段階を、Bio−GelP−30を充填し 、重炭酸アンモニウムで平衝化したカラムを用いて行なう請求項17記載の方法 。 20)記載の順序で下記段階: a)雌rana pipiens体外でrana pipiens***によりr ana pipiens卵を受精させることによりrana pipi−ens の胚を形成すること; b)ほぼ4細胞期で胚の発生を停止すること;c)胚および末受精卵を弱酸性緩 衝液中で機械的にホモゲナイズすること; d)上記ホモゲナイズした胚および卵を遠心分離してこれより上澄み液を得るこ と; e)上澄み液を濾過すること; f)濾過した上澄み液をイオン交換クロマトグラフィーに付して物質を回収する こと; g)回収された物質を、僅かに異なる条件下の第2段階のイオン交換クロマトグ ラフィーに再度付してより純粋な物質を回収すること;および、h)上記のより 純粋な物質を径分別クロマトグラフィーに付して精製された物質を回収すること 、を包含する薬剤の製造方法。 21)上記の精製された物質を連結乾燥する段階をさらに包含する請求項20記 載の方法。
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