JPH03502200A - クロマトグラフィーによる高純度の非感染性抗血友病因子の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 クロマトグラフィーによる高純度の非感染性抗血友病因子の生産方法 本発明は、高純度の非感染性抗血友病因子（ＡＨＦまたは■因子）を血漿から、 生物的に許容できる有機溶媒／洗浄剤を用いて■因子が豊富な分画を処理し、次 いで洗浄工程を実施することにより、生産する方法に関する。

欧州特許公開公報（ＥＰ−Ａ）　０２３８７０１号には、高純度の非感染性抗血 友病因子の生産方法が記載されている。その方法において、前処理した分画とは 、エタノール沈降を用いてフィブリノーゲン、グロブリン、アルブミンおよび他 の干渉物質を除去した寒冷沈降物である。■因子は素材中に非常に少量しか含ま れていないため、寒冷沈降物の蓄積が必要である。しかしながら、蓄積工程は、 最終生産物中のＡＨＦ含有量を減少させる。従来知られている■因子の生産方法 では、活性物質が非常に少量しか生産されない。よって、従来の方法により生産 された■因子を投与する場合、患者は多量の抗原性物質を負担することになる。

このような処理は、危険を伴う。

従って、分離処理により■因子をさらに蓄積するため、多くの試みがなされてき た。そして、■因子に対する動物の抗体を用いるアフィニティークロマトグラフ ィーにより高度に特異的な活性を有する産物を得ることが試みられてきた。しか し、この技術は非常に高価であり、経費がかかりすぎる。他方では、それぞれの クロマトグラフィー分離において、カラムから常に一定量の動物性タンパク質も 溶離するため、この技術も問題なしとすることはできない。

欧州特許出願８８１０８４５８．６号明細書には、寒冷沈降反応によるウィルス 不活性化処理後、イオン交換体を用いてクロマトグラフィー分離を実施すること が提案されている。これにより、■因子の産物における収量が増加するという結 果が得られるが、寒冷沈降反応処理を実際に含むものである。血漿中に含まれて いる■因子を定量的に沈降させることができないため、かなりの収量の損失を伴 なうので、この寒冷沈降反応の処理工程は有利とは言えない。

本発明の目的は、生物的に許容できる有機溶媒／洗浄剤の処理により、血漿から 高純度の非感染性抗血友病因子（ＡＨＦまたは■因子）を、高収量かつタンパク 質単位重量当り高度の生物活性に調製する方法を提供することである。さらに、 寒冷沈降反応を回避することも目的である。

上記目的は、クロマトグラフィー処理を用いて■因子が豊富な分画を回収するこ とにより、驚くべき簡単な方法で達成することができる。

本発明に従う方法の有利な５様の一つにおいて、寒冷沈降反応に代えて、ゲル浸 透クロマトグラフィーをイオン交換物質と共に用いることにより、■因子を高収 量で得ることが達成された。その過程において、凍結した血漿を水浴中で解凍す る。一定の温度（好ましくは２５℃）に達した後、直ちに血漿を（好ましくは５ ０容量％の水を用いて）希釈し、濾過する。次いで、このように処理した血漿を 、フラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）■−ＤＥＡＥ＠詣のようなイオン交換物 買上でゲル浸透クロマトグラフィーにかける。フラクトゲル■は、オリゴエチレ ングリコール、グリシジルメタクリレートおよびペンタエリスリトールジメタク リレートのコポリマーをベースとする親水性のクロマトグラフィー用物質である 。カラム中の分離用物質は、グリシン、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウムお よびヘパリンを含む１１衝液で予め平衡状態にしておく。緩衝液は、１０乃至５ ０ｍＭの塩化ナトリウム、２乃至１８ｍＭのクエン酸ナトリウム、３０乃至２１ ０ｍＭのグリシンおよび２０乃至１８００／Ｉｔのヘパリンからなる組成を有し ていることが好ましい。この緩衝液については、■因子がカラム物質に吸着する ようなイオン強度条件で実施する。他の血漿成分は、ｐ’Ｈ値が６．５から６． ９の間で最初に用いた緩衝液の数カラムの容量と共に、洗浄により除かれる。

その後、塩濃度（好ましくは塩化ナトリウム濃度）を増加させることにより、緩 衝液の条件を変化させる。この変化は、連続的に実施しても、不連続に実施して も良い。上記の緩衝液系の例においては、塩化ナトリウム濃度を、２０乃至８０ ｍＭ、３０乃至１８０ｍＭおよび４０乃至３６０ｍＭの３段階で増加させること が好ましい。カラム物質は、さらに塩濃度が高いｉｉｗ液で数回洗浄し、これに より不純物を除去する。そして、■因子が高イオン強度において溶離する。

■因子を含む分画を集め、ヒトのアルブミンを加えて安定化する。ヒトの血清ア ルブミン（Ｈ５Ａ）の濃度は、１　ｍ　ｇ　／　ｍ　１１であることが好ましい 。次いで、溶液を水酸化アルミニウムで処理し、プロトロンビン複合因子の残量 を除去し、その後、混合物を濾過しても良い。

ウィルスの不活性化は、欧州特許公開公報（ＥＰ−Ａ）０１３１７４０号に記載 の方法に従い、生物的に許容できる有機溶媒／洗浄剤（好ましくはトゥイーン／ ＴＮＢＰ（リン酸トリーｎ−ブチル））を用いる処理により実施される。コール 酸ナトリウム／ＴＮＢＰを用いても、良い結果が得られる。

本発明のさらに有利な態様において、ウィルスを除去後のサンプルをイオン交換 物質上でゲル浸透クロマトグラフィーにかけることにより、高度に特異的な活性 を伴なう■因子を高収量で得ることができる。

ウィルスの不活性化後、粗製分画を希釈し、さらに濾過しても良い。

欧州特許公開公報（ＥＰ−Ａ）　０２３９８５９号において、ウッズ・ケイ（Ｗ ｏｏｄｓ、に、）およびオルム・ティー・エイチ（Ｏｒｍｅ、　Ｔｈ、）は、ウ ィルスの不活性化後、サンプルのクロマトグラフィー分離前に、サンプルをオイ ル、好ましくは大豆油、ひまし油及び／または綿実油で抽出することが有利であ ると説明している。

出発物質として解凍した血漿あるいは新鮮な血漿を使用する代りに、市販されて いる寒冷沈降物を使用する場合は、次のように処理することが好ましい。市販さ れている寒冷沈降物を室温で３乃至４時間かけて解凍し、約１乃至２ｃｍの小片 に分割する。これらの小片を攪拌しながら、１乃至３　Ｕ　／　ｍ　１のヘパリ ン−ナトリウムを含む約２倍容量の水に懸濁する。懸濁液を、０．１Ｍの酢酸を 用いてｐＨ値を少なくとも７．０乃至８、好ましくは７．０乃至７．１の範囲に 調整する。それを室温で１５乃至６０分間、好ましくは３０分間攪拌する。次い で、１ｋｇの寒冷沈降物当り約１０８ｇの２％水酸化アルミニウム懸濁液を加え て、混合物を室温で１乃至１ｏ分間、好ましくは５分間攪拌する。酸、好ましく は０．１Ｍの酢酸を用いて、酸の含有量をｐＨ値が６．０乃至７．０、好ましく は６．５乃至６．６の範囲になるように調整する。サンプルを１０℃乃至１８℃ 、好ましくは１４℃乃至１６℃に冷却し、（例えば、シャープルズ（Ｓｈａｒｐ ｌｅｓ）Ａ　Ｓ　−１６（（、ｅｐａ　６１）遠心分離機中で１．０１／分の速 度で）遠心分離し、次いで上澄みを（例えば、パール（Ｐａｉｌ）ＡＢ−Ｉ　　 ＵＯＩＯＺＰフィルターを用いて）濾過する。ウィルスの不活性化は、遠心分離 と濾過の後、実施することが好ましい。トゥイーン／ＴＮＢＰ（リン酸トリーｎ −ブチル））を用いるウィルスの不活性化処理は、特に有効であることが証明さ れている。コール酸ナトリウム／ＴＮＢＰを用いても、良い結果が得られる。ト ウィーン／ＴＮＢＰまたはコール酸ナトリウム／ＴＮＢＰ混合物は、次いで、例 えばオイル抽出を用いることで、除去することができる。

ウィルスの不活性化後、サンプルを、フラクトゲル■−ＤＥＡＥ樹脂のようなイ オン交換活性を有するゲル浸透物質を含むクロマトグラフィーカラム上にのせる 。カラムが１ｋｇの寒冷沈降物当り０．５ｋｇのカラム物質を維持するように、 酸の許容量を設定することが好ましい。カラムにサンプルを充填し、緩衝液で洗 浄する。

イオン強度がさらに高い緩衝液を用いてサンプルを溶離後、得られた産物を塩素 量が低い緩衝液で希釈し、ｐＨを６．５乃至７．５、好ましくは６．９乃至７． １に調整する。そして、（好ましくは、ニトロセルロースフィルターを用いて） さらに濾過を実施し、次いで滅菌濾過を行う。

本発明に従う方法を用いることで、これまで達成されていなかった特異的な活性 を有する高純度の抗血友病因子を、高収量で生産することが初めて可能になった 。これまでに得られた結果が示すところによれば、■因子のかなりの部分は、エ タノール沈降または寒冷沈降反応により不可逆的に破壊される。

以上の方法を以下の各側を用いて、さらに説明する。

第１例 新鮮な、または急速冷凍したヒトの血漿を、任意に水浴中で、混合物が２０℃の 温度に到達するまで調温する。血漿を５０％容量の水で希釈し、次いで濾過する 。血漿の濾液を、フラクトゲル■−ＤＥＡＥ樹脂を含むイオン交換カラム上にの せる。カラムは、下記の組成を有する緩衝液で予め平衡状態とした。

塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　５０ｍＭクエン酸ナトリウム　　　　　 　　　　１０ｍＭグリシン　　　　　　　　　　　　　　１２０ｍＭヘパリン　 　　　　　　　　　　　　１００　Ｕ／ｊ！ｐＨ６，５乃至６．９ サンプルを適用後、イオン交換樹脂を洗浄用緩衝液で数回洗浄する。そして、１ ００ｍＭの塩化ナトリウムを含む緩衝液で最初に洗浄し、次いで１６０ｍＭの塩 化ナトリウムを含む緩衝液で、さらに２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む緩衝液 で洗浄することにより、塩化ナトリウム濃度を段階的に上昇させる。■因子を含 む分画を集めて、ヒトの血清アルブミン１．０ｍｇ／ｍＪ！を加えて安定化する 。それ以後の操作は、■因子を含むカラム分画を、以下に用いる市販の寒冷沈降 物に代えて用いる以外は、以下の各側と同様に実施した。

第２例 ■因子の蓄積 市販の寒冷沈降物を室温で３乃至４時間かけて解凍し、約１乃至２ｃｍの小片に 分割する。得られた小片を攪拌しながら、２Ｕ／ｍｆＬのヘパリン−ナトリウム を含む約２倍容量の水に懸濁する。懸濁液を、０．１Ｍの酢酸を用いてｐＨ値を ７．０乃至７．１の範囲に調整する。それを室温で３０分間攪拌する。次いで、 １ｋｇの寒冷沈降物当り１０８ｇの２％水酸化アルミニウム懸濁液を加えて、混 合物を室温でさらに５分間攪拌する。０．１Ｍの酢酸を用いて、酸の含有量をｐ Ｈ値が６．５乃至６．６の範囲になるように調整する。サンプルを１４℃乃至１ ６℃に冷却し、シャープルズＡＳ−１６（Ｃｅｐａ　６１）遠心分離機中で１． ０４２７分の速度で遠心分離する。次いで上澄みを、バールＡＢ−Ｉ　　ＵＯＩ ＯＺＰフィルターを通して濾過する。

第３例 粗製分画からウィルス除去後のクロマトグラフィーに用いるクロマトグラフィー カラムの調製 抽出した寒冷沈降物を分離するために、１ｋｇの寒冷沈降物当り少なくとも０． ５Ｊ２のフラクトゲル■−ＤＥＡＥ樹脂を含むカラムを用いる。カラムの高さは 直径以下とする。カラムに樹脂を充填後、クロマトグラフィーカラムを５倍容量 の０．１Ｍの塩化ナトリウム溶液で洗浄する。次いで、上記カラムを下記の組成 を有する緩衝液Ａで洗浄する。

塩化ナトリウム　　　　　　　　　　１１０ｍＭクエン酸ナトリウム・５Ｈ２０ １０ｍＭグリシン　　　　　　　　　　　　　　１２０ｍＭ塩化カルシウム・２ Ｈ，０１ｍＭ １Ｍ塩酸でｐＨ値６６９乃至７６０に調整以下の操作を寒冷沈降物のウィルスを 含まない抽出物を用いて実施するため、緩衝液は全て、ウィルスを含まないもの とする。

第４例 サンプルをカラム上に充填し、２８０ｎｍの波長で流動の吸収を観察する。濾液 を集め、■因子の活性を調べ、カラム分離前の生成物とした。そして、カラムを 、その吸収が初期値と認められるまで、緩衝液Ａで洗浄する。次いで、カラムを 緩衝液Ｂで洗浄する。

緩衝液Ｂを用いる洗浄は、吸収が基本線に戻るまで継続する。

緩衝液Ｂは、下記の組成を有する。

塩化ナトリウム　　　　　　　　　　１６０ｍＭクエン酸ナトリウム・５）１２ ０　　　　１０ｍＭグリシン　　　　　　　　　　　　　　１２０ｍＭ塩化カル シウム・２Ｈ，０１ｍＭ ｐＨ値６．９乃至７．０ 生成物の溶離は、緩衝ＷＣを用いて実施する。緩衝液Ｃを加えて後、現われるタ ンパク質分画を集める。緩衝液Ｃは、下記の組成を有する。

塩化ナトリウム　　　　　　　　　　２５０ｍＭクエン酸ナトリウム・５Ｈ２０ ２０ｍＭ塩化カルシウム・２Ｈ２０２，５ｍＭ ｐＨ値６．９乃至７．０ 求める分画の溶離に続いて、カラムを５倍容量のＩＭの塩化ナトリウム溶液を含 む緩衝液りで洗浄する。

０、ＩＮのＮａＯＨ（３カラム容量）で洗浄し、そして０．ＩＮ塩Ｍ（３カラム 容量）でカラムを洗浄し、さらに５カラム容量の２５％アルコール水溶液でカラ ムを洗浄することにより、カラムの再生を実施する。

第５例 集めた分画は、以下の成分からなる緩衝液Ｅで、２６乃至３５０／　ｍ　ＩＬの 活性を示すまで希釈する。

クエン酸ナトリウム　　　　　　　　　２０ｍＭグリシン　　　　　　　　　　 　　　　　８０ｍＭリジン　　　　　　　　　　　　　　　　１６ｍＭ塩化カル シウム赤、２Ｈ，８２，５ｍＭＰＨ値６．９乃至７．１ そして、必要ならｐＨ値を６．９乃至７．１に調整し、次に生成物を０．４５μ ｍのシールクリーン（Ｓｅａｌｋｌｅａｎ）フィルターを通して濾過する。その 後、さらに滅菌濾過を実施する。

国際調査報告 −一一一一一一−ｎ銖ＰＣＴ／ＥｐＨ９１０１２４７

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．高純度の非感染性抗血友病因子（ＡＨＦまたはＶＩＩＩ因子）を血漿から、 生物的に許容できる有機溶媒／洗浄剤を用いてＶＩＩＩ因子が豊富な分画を処理 し、次いで洗浄工程を実施することにより、生産する方法において、ＶＩＩＩ因 子が豊富な分画をクロマトグラフィー処理を用いて回収することを特徴とする生 産方法。
2. ２．クロマトグラフィー処理がイオン交換体をベースとするゲル浸透クロマトグ ラフィーを用いる処理であることを特徴とする特許請求の範囲第１項に従う方法 。
3. ３．イオン交換体がＤＥＡＥ変性体のようなアニオン交換樹脂であることを特徴 とする特許請求の範囲第２項に従う方法。
4. ４．ＶＩＩＩ因子を含む分画を水酸化アルミニウム懸濁液と混合し、ｐＨ７未満 で１０℃乃至１８℃に冷却後、遠心分離または濾過することを特徴とする特許請 求の範囲第１項乃至第３項のいずれかの項に従う方法。
5. ５．ＶＩＩＩ因子を含む分画の精密検査をクロマトグラフィー処理を用いて実施 することを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第４項の何れかの項に従う方法 。
6. ６．クロマトグラフィー処理がイオン交換体をベースとするゲル浸透クロマトグ ラフィーを用いる処理であることを特徴とする特許請求の範囲第５項に従う方法 。
7. ７．クロマトグラフィー物質がＤＥＡＥ変性体のようなアニオン交換樹脂である ことを特徴とする特許請求の範囲第５項または第６項に従う方法。
8. ８．クロマトグラフィー処理による血漿の分離で生産されたＶＩＩＩ因子を含む 粗製分画。
9. ９．クロマトグラフィー処理がイオン交換体をベースとするゲル浸透クロマトグ ラフィーを用いる処理であることを特徴とする特許請求の範囲第８項に従うＶＩ ＩＩ因子を含む粗製分画。
10. １０．血漿からＶＩＩＩ因子を含む分画を生産するための、ＤＥＡＥ変性体のよ うなイオン交換体をベースとするゲル浸透クロマトグラフィー用物質の使用。