KR100436857B1 - 생물학적 공급원으로부터 인자나인을 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 어떠한 크로마토그래피 분리 단계이전에 생물학적 공급원을 단백질 침전제로 처리하는 것을 특징으로 하는, 크로마토그래피에 의하여 생물학적 공급원으로부터 인자 IX 를 분리시키는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 크로마토그래피에 의하여 생물학적 공급원으로부터 인자 IX 를 제조하는 방법 및 본 발명의 방법에 의하여 획득 가능한 인자 IX 에 관한 것이다.
예를 들어 혈장으로부터 인자 IX 을 제조하였을 경우, 냉동 침전물 (cryoprecipitate) 이 제일 먼저 분리된다. 동결 시트레이트 혈장을 해동시킨후 원심 분리에 의하여 다량의 인자 VIII 및 피브리노겐을 분리한다. 그러므로 획득된 냉동 결핍성 혈장 (cryopoor plasma) 은 단백질 활성이 0.01 IU/mg 인 비타민 K 의존성 응집 인자를 함유한다.
선행 기술에 의하여 공지된 방법에 의하면, 상기 비타민 K 의존성 응집 인자는 알부민 회수에 역효과를 끼치지 않고, DEAE Sephadex 와 같은 음이온 교환기로 추출되어 교환기에 결합된다. 그러나, DEAE Sephadex 의 유동성은 양호하지 못하므로, 상기 단계는 일반적으로 배취 작동 단계중 고체상 추출법으로 수행되어야 한다. 상기 DEAE Sephadex 에 용리시켜 얻은 상기 분획물은 이후 인자 IX 의 정제시 출발 물질로서 사용된다. 그러나, 상기 혈장에 함유된 프로테아제 또한 상기 분획물에 다량 함유되어 있어서 단백질 분해성 소화 (proteolytic digestion) 에 의하여 관심 있는 물질, 즉 인자 IX 의 수율은 저하되며 제조물의 트롬빈이 생성 (thrombogenity) 될 위험성은 증가한다.
본 발명의 목적은 단백질 저해제를 가하지 않고 상기된 위험성을 감소시키는방법을 제공하는 것이다.
놀랍게도, 본 목적은 본 청구항의 방법에 의하여 달성된다. 이에는 인자 IX 을 함유하는 생물학적 공급원을 단백질 침전제로 처리하는 것을 포함한다. 구체적으로, 이에 해당하는 생물학적 공급원에는 인자 VIII 및 피브리노겐이 존재하지 않는 냉동 침전물 (cryoprecipitate) 또는 혈장이 있다. (냉동 결핍성 혈장 ; cryopoor plasma)
상기 단백질 침전제의 농도는 구체적으로, 1.5 - 2.3 mol/l, 바람직하게는 1.75 - 1.9 mol/l 이다. 상기 수치들은 인자 IX 를 함유하는 공급원에 존재하는 단백질 침전제의 농도 (최종 농도) 에 관한 것이다.
단백질 침전제로서는, 구체적으로 암모늄 설페이트를 생각할 수 있다.
본 발명에 의한 방법은 단백질 분해 활성을 1 이상의 양만큼 감소시키는 방법에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 인자 IX 를 크로마토그래피에 의하여 실제로 정제시키기 이전에 침전 단계를 거쳐 인자 VII 및 인자 II 와 같은 방해 성분 (interfering component) 들을 제거시킨다.
단백질 C 및 단백질 S 또한 제거시킨다. 인자 VII 의 경우, 대부분이 제거될 수 있다. 인자 II 또한 거의 완전히 제거되며 (70 - 90 %) 반면에, 단백질 C 및 단백질 S는 약 50 % 만큼 제거된다.
단백질 침전제로 처리된 분획물의 상등액에서, 인자 IX 의 활성은 통상적으로 20 - 30 IU/ml 인데, 이는 1 - 5 IU /mg 의 비활성에 상당하는 양이다.
본 발명에 의한 침전 단계, 바람직하게는 암모늄 설페이트를 사용한 침전 단계후, 인자 IX 이 농축된 분획물은 크로마토그래피에 의하여 분리된다. 이는 단백질이 고농도로 존재할 경우 각각의 단계로 소수성 반응을 수행시킬 수 있다는 점에서 이점을 갖는다. 본 발명에 의하면, 인자 IX 는 바람직하게는 상대적으로 고농도의 염 (단백질 침전물로부터 얻어지는) 이 존재할 경우 소수성 반응 크로마토그래피 (Hydrophobic interaction chromatography : HIC) 에 사용될 수 있는 크로마토그래피 물질에 결합된다. 동시에 이는 단백질 침전물로부터 생성되는 고농도 염을 감소시킨다. 특히, 기판 재료에 친수성 유연 팔 (돌기체 ; tentacle) 이 결합된 크로마토그래피 재료가 사용될 수 있다. 상기 스페이서에 공유적으로 결합되는 것들은 리간드, 구체적으로 프로필, 부틸, 페닐 그룹들과 같은 소수성 리간드이다.
단백질 침전제로 처리된 분획물의 상등액은 적당한 크로마토그래피 재료에 적용된후 임의로 세척된다. 칼럼에 결합되어 있으며 아직도 인자 X 을 함유하는 인자 IX 를 저농도의 단백질 침전제를 함유하는 완충액과 함께 용리시키면, 적용 용액의 이온 세기에 비하여 용리 용액의 이온 세기는 감소된다. HIC 재료를 함유하는 크로마토그래피 칼럼으로부터 용리된 인자 IX 를 포함하는 분획물을 수집한후 적당한 방법을 사용하여 탈염 단계 (desalting step)를 거치게 한다. 상기 단계는 예를 들어, 한외 여과법 (ultrafiltration) 및 /또는 투석 여과법 (diafiltration) 에 의하여 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서는, 예를 들어 친화 크로마토그래피에 의하여 헤파린 개질 기판 (heparin modified substrate)상에서 인자 X 과 함께 인자 IX 를 추가로 분리할 수 있다. 상기 인자들을 함유하는 용액의 이온 세기가 상대적으로낮은 경우, 후자가 크로마토그래피 재료상에 결합할 것이다. 방해 인자 X 이 만일 존재한다면, 150 - 300 mmole/l 의 농도로 소듐 클로라이드를 함유하는 용액으로 처리하여 상기 인자를 용리시킬 수 있다. 이와 같은 조건하에서, 인자 IX 는 헤파린 친화성 기판에 결합되어 남아있을 것이다. 수성 용액의 이온 세기를 현 수치의 2 배로 증가시키면, 인자 IX 는 상기 기판의 표면으로부터 분리되기 시작할 것이다.
바이러스는 화학적 및 / 또는 물리적 방법으로 불활성화될 수 있다. 물리적 바이러스 불활성화 방법은 본질적으로 각각의 분획물을 60 - 65 ℃ 에서 5 - 30 시간 동안 열처리시키는 과정을 포함한다. 특히, 이와 같은 열처리 과정을 수행한후 헤파린 친화성 크로마토그래피를 수행시킨다. 화학적 바이러스 불활성화 방법은 예를 들어, 인자 IX 를 함유하는 분획물을 비이온성 계면 활성제 및 디알킬 또는 트리알킬포스페이트로 처리하는 과정을 포함한다. 특히 Tween 및 트리 - n - 부틸 포스페이트 (TNBP) 가 함께 사용될 수 있다. 바이러스 불활성화 방법은 EP 0131740 호 또는 Horowitz 와 그의 동료에 의한, Blood, 79 (1992) 826 에 기술되어 있다.
바이러스 불활성화 방법은 WO 94/17834 호에 기술된 것과 같은 방법과 함께 사용될 수 있다. 바람직하게는, 화학적 바이러스 불활성화 방법은 소수성 크로마토그래피 이후의 한외 여과법 /투석 여과법 이후 수행된다.
본 발명에 의한 방법을 수행함으로써, 고순도의 인자 IX 의 전체 수율은 혈장을 기준으로 20 - 30 % 증가될 수 있다.
도면은 본 발명에 따른 방법 및 후속의 크로마토그래피 정제 단계를 흐름도형태로 나타낸 것이다. 화살표는 어느 분획물이 분리되어 나갔으며 어느 것이 용리액이고 어느 것이 상등액인지를 나타낸다.
하기 실시예는 본 발명을 예시해줄 것이다.
동결 시트레이트 혈장을 해동시킨후 0 - 3 ℃ 에서 교반시켰다. 인자 VIII 및 피브리노겐을 원심 분리에 의하여 분리시켰다. 상기 얻어진 냉동 결핍성 혈장 분획물은 단백질 비활성이 약 0.01 IU/mg 인 비타민 K 의존성 응집 인자를 함유하였다. 이후의 포집 (capture) 단계에는 IgG 및 알부민을 분리시키는, 고체상 추출법 또는 DEAE 이온교환기상에서의 크로마토그래피를 포함한다. 상기 비타민 K 의존성 응집 인자의 활성은 10 - 50 IU/ml 인데, 이는 인자 IX 를 기준으로 약 3500 의 농축 인자에 해당하는 것이다.
상기 포집 단계 이후에는 실질적으로 정제 단계를 수행하였다. 상기 포집 단계로부터 얻어진 분획물에 암모늄 설페이트 용액을 가하였더니 최종 농도 약 1.9 mol /l 였다. C 및 S 단백질은 약 50 % 까지 제거된 반면에 인자 II 는 70 - 90 % 까지 그리고 인자 VII 는 거의 전부가 제거되었다. 암모늄 설페이트 침전물로부터 획득한 상등액을 적당히 개질된 돌기성 겔 (tentacle gel) 상에서 소수성 반응 크로마토그래피시켰다. 적용 용액내 암모늄 설페이트의 농도는 약 1.75 mol / l 였다. 적용 완충액도 포스페이트 이온을 함유하였다. 소수성 반응 크로마토그래피의 결과, 결합된 인자 VII 및 인자 IX 를 얻을 수 있었다. 인자 X 은 상기 재료에 70 - 80 % 정도로 결합될 것이다. 인자 IX / 인자 X 의 혼합물은 1.2 - 1.4 mol/l 의 암모늄 설페이트를 함유하는 용액으로 용리시켰다. 상기 용리액에는 인자 VII 이존재하지 않았으며 근본적으로 단백질 분해 활성도 갖지 않았다. 인자 IX/인자 X 내의 인자 IX 의 비활성은 5 - 15 IU/mg 단백질 이었다.
용리액내에 존재하는 암모늄 설페이트는 한외 여과법 및 투석 여과법으로 분리할 수 있었다. 세제를 사용하는 바이러스 불활성화는 약 1 % Tween 80 / 0.3 % TNBP 로 처리하여 수행되었다.
상기 세제로써 분리시킨 이후, 얻어진 분획물을 헤파린 친화성 크로마토그래피시켰다. 인자 X 및 인자 IX 은 낮은 삼투압에서 헤파린 겔에 결합할 것이다. 인자 X 은 0.25 mol/l 의 NaCl 을 함유하는 완충액으로 세척시켜 얻어진다. 인자 IX 은 소듐 클로라이드 농도가 0.45 mol/l 까지 증가되었을 때 용리될 것이다. 이후, 인자 IX 은 비활성이 100 이상이었으며 용리액내 30 - 50 IU/ml 의 농도로 존재하였다.
그러므로 인자 IX 을 함유하는 분획물을 탈염화시킨후 냉동 건조시켰다.
Claims (11)
- 친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography) 로 분리시키기 이전에 혈장 또는 냉동 침전물 (cryoprecipitate) 을 분리시켜 인자 VIII 및 피브리노겐을 제거한 혈장 (냉동 결핍성 혈장 ; cryopoor plasma)을 단백질 침전제로서 암모늄 설페이트를 1.5 - 2.3 mol/l의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는, 혈장 또는 냉동 침전물 (cryoprecipitate) 을 분리시켜 인자 VIII 및 피브리노겐을 제거한 혈장 (냉동 결핍성 혈장 ; cryopoor plasma)으로부터 크로마토그래피에 의하여 인자 IX 을 분리하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 단백질을 침전시킨 다음, 인자 IX을 소수성 반응 크로마토그래피 (Hydrophobic Interaction Chromatography ; HIC) 재료에 흡착시켜 암모늄 설페이트를 제거하고 인자 IX을 농축하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 인자 IX 가 흡착된 크로마토그래피 재료를 상기 HIC 재료로부터 인자 IX 를 분리시키는 이온 세기를 갖는 수성 용액으로 처리시키는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 HIC 재료로부터 인자 IX을 분리시킨 후 얻어진 용액에 대하여 인자 IX을 함유하는 용액의 염 농도를 감소시키는 처리단계를 수행하는방법.
- 제 3 항에 있어서, 헤파린 개질된 기판 재료상에서 친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography)를 뒤이어 수행하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 바이러스를 불활성화하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 바이러스 불활성화는 60 - 65 ℃ 에서 5 - 30 시간 동안 열처리하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 바이러스 불활성화는 인간 IX을 포함하는 시료를 비이온성 세제, 디알킬화 포스페이트 또는 트리알킬화 포스페이트로 처리하는 것을 포함하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 바이러스 불활성화는 헤파린 친화성 크로마토그래피 전에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 바이러스 불활성화는 60 - 65 ℃ 에서 5 - 30 시간 동안 열처리하는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 바이러스 불활성화는 인자 IX을 포함하는 시료를 비이온성 세제, 디알킬화 포스페이트 또는 트리알킬화 포스페이트로 처리하는 것을 포함하는 방법.
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