JPH0348696A - ヒトリンパ球表面抗原およびそれをコードする遺伝子 - Google Patents
ヒトリンパ球表面抗原およびそれをコードする遺伝子Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明は、ヒトリンパ球表面抗原を構成する純化された
タンパク質およびそれをコードする遺伝子に関する。さ
らに詳しくは、本発明はマウスのリンパ球抗原Ly6に
対応する純化されたヒトリンパ球抗原およびそれをコー
ドする遺伝子を提供するものである。
タンパク質およびそれをコードする遺伝子に関する。さ
らに詳しくは、本発明はマウスのリンパ球抗原Ly6に
対応する純化されたヒトリンパ球抗原およびそれをコー
ドする遺伝子を提供するものである。
[従来の技術]
Ly6抗原はマウスのリンパ球に見い出された表面抗原
であり、主として1928球、NK細胞、単球などの表
面にホスファチジルイノシトールで細胞膜に錨を下した
(PIアンカリングタンパク質)形で存在する。Ly6
はリンパ球の活性化に強く関与し、L)/6に対するモ
ノクローナル抗体は、ある場合には単独で、ある場合に
は架橋などの処理を行なうことによって、マウスリンパ
球の機能を活性化する。
であり、主として1928球、NK細胞、単球などの表
面にホスファチジルイノシトールで細胞膜に錨を下した
(PIアンカリングタンパク質)形で存在する。Ly6
はリンパ球の活性化に強く関与し、L)/6に対するモ
ノクローナル抗体は、ある場合には単独で、ある場合に
は架橋などの処理を行なうことによって、マウスリンパ
球の機能を活性化する。
一方、L/6抗原に対する抗体を用いたフローサイトメ
ーターによる解析では、例えばMRL/αマウス(MR
L/Mp−4,r/Q、、)などの自己免疫疾患モデル
マウスにおいて、L16陽性細胞の数と細胞あたりのL
y6抗原の数が顕著に多くなっていることが知られてい
る。
ーターによる解析では、例えばMRL/αマウス(MR
L/Mp−4,r/Q、、)などの自己免疫疾患モデル
マウスにおいて、L16陽性細胞の数と細胞あたりのL
y6抗原の数が顕著に多くなっていることが知られてい
る。
マウスにおけるLy6抗原は数種からなるファミリーを
形成し、またマウスの遺伝的系列によって配列がわずか
に異なる亜型の存在が報告されている。ただし、それら
の間の類似性(ホモロジー)はかなり大きい。
形成し、またマウスの遺伝的系列によって配列がわずか
に異なる亜型の存在が報告されている。ただし、それら
の間の類似性(ホモロジー)はかなり大きい。
以上のことから、Ly6はリンパ球活性化のメカニズム
の少なくとも1つに強く関与し、また自己免疫疾患に伴
なう現象として、Ly6陽性細胞が多くなっていること
がわかる。従って、Ly6そのものおよびそれの関与す
るリンパ球活性化のメカニズムをより詳しく研究するこ
とは、リンパ球活性化を利用する抗ガン薬や抗感染症薬
の開発につながり、一方、Ly6の機能を抑制すること
による免疫抑制薬の開発につながることが期待できる。
の少なくとも1つに強く関与し、また自己免疫疾患に伴
なう現象として、Ly6陽性細胞が多くなっていること
がわかる。従って、Ly6そのものおよびそれの関与す
るリンパ球活性化のメカニズムをより詳しく研究するこ
とは、リンパ球活性化を利用する抗ガン薬や抗感染症薬
の開発につながり、一方、Ly6の機能を抑制すること
による免疫抑制薬の開発につながることが期待できる。
しかしながら、マウスリンパ球のLy6抗原に対応する
ヒトリンパ球の抗原は未だ同定されていない。このよう
な場合の一般的な手法である、マウス遺伝子をプローブ
とした対応するヒト遺伝子のハイブリダイゼーションに
よるクローニングの試みは成功していない。
ヒトリンパ球の抗原は未だ同定されていない。このよう
な場合の一般的な手法である、マウス遺伝子をプローブ
とした対応するヒト遺伝子のハイブリダイゼーションに
よるクローニングの試みは成功していない。
本発明者らは、まず本発明者らが独自に作成したマウス
LGL (大顆粒リンパ球)に対する抗体の中から選ん
だモノクローナル抗体F4が、その免疫化学的解析から
マウスリンパ球抗原Ly6を認識する抗体であるとの確
信を得た。このことは後に、Br1an 5eed法(
Brian 5eed、 Nature、 329゜8
40〜842 (1987); Br1an 5eed
ら、 Proc、 Natl。
LGL (大顆粒リンパ球)に対する抗体の中から選ん
だモノクローナル抗体F4が、その免疫化学的解析から
マウスリンパ球抗原Ly6を認識する抗体であるとの確
信を得た。このことは後に、Br1an 5eed法(
Brian 5eed、 Nature、 329゜8
40〜842 (1987); Br1an 5eed
ら、 Proc、 Natl。
Acad、 Sci、 LISA、 84.3365−
3369 (1987))により、F4抗体を足がかり
にして本発明者らによりクロニングされたcDNAが、
既知のLy6(Ly6C1)の遺伝子であることを証明
することによって確認された。
3369 (1987))により、F4抗体を足がかり
にして本発明者らによりクロニングされたcDNAが、
既知のLy6(Ly6C1)の遺伝子であることを証明
することによって確認された。
そこで本発明者らは、第一段階として、前記のF4抗体
を用いて、ヒト末梢血リンパ球や各種ヒト白血病細胞株
をフローサイトメーターで解析してみたが、それらのど
の細胞もF4抗体とは特異的な結合性を示さなかった。
を用いて、ヒト末梢血リンパ球や各種ヒト白血病細胞株
をフローサイトメーターで解析してみたが、それらのど
の細胞もF4抗体とは特異的な結合性を示さなかった。
このことよりF4抗体は、マウスLy6に対応するヒト
リンパ球抗原をクローニングするための手がかりにはな
らないことがわかった。
リンパ球抗原をクローニングするための手がかりにはな
らないことがわかった。
同時に本発明者らは、本発明者らのクローニングしたマ
ウスLy6C1のcDNAをプローブとして、ヒト末梢
血リンパ球や各種ヒト白血病細胞株のmRNAをノザン
法によって解析したが、特異的な陽性信号は認められな
かった。また同時に、ヒト末梢血リンパ球や数種のヒト
白血病細胞株のcDNAライブラリーを、ラジオアイソ
トープラベルした前記マウスLy6C2のcDNAをプ
ローブとしてハイブリダイゼーションによってスクリー
ニングしたが、特異的な陽性クローンは得られなかった
。このことから、マウスL16のcDNAをプローブと
して用いるハイブリダイゼーション法による方法では、
マウスLy6に対応するヒトのリンパ球抗原をクローニ
ングすることは、困難もしくは不可能であることがわか
った。
ウスLy6C1のcDNAをプローブとして、ヒト末梢
血リンパ球や各種ヒト白血病細胞株のmRNAをノザン
法によって解析したが、特異的な陽性信号は認められな
かった。また同時に、ヒト末梢血リンパ球や数種のヒト
白血病細胞株のcDNAライブラリーを、ラジオアイソ
トープラベルした前記マウスLy6C2のcDNAをプ
ローブとしてハイブリダイゼーションによってスクリー
ニングしたが、特異的な陽性クローンは得られなかった
。このことから、マウスL16のcDNAをプローブと
して用いるハイブリダイゼーション法による方法では、
マウスLy6に対応するヒトのリンパ球抗原をクローニ
ングすることは、困難もしくは不可能であることがわか
った。
一方、ヒトリンパ球に対するモノクローナル抗体の中の
1種MEM43は、その認識する細胞および抗原の挙動
から、マウスLy6に対応するリンパ球抗原を認識して
いるらしいという示唆がある(Stefanova、1
.ら、 Mo1ecular 1mmunology、
26゜153−161 (1989))。
1種MEM43は、その認識する細胞および抗原の挙動
から、マウスLy6に対応するリンパ球抗原を認識して
いるらしいという示唆がある(Stefanova、1
.ら、 Mo1ecular 1mmunology、
26゜153−161 (1989))。
さらに、ヒトリンパ球細胞の細胞抽出画分をMEM43
抗体を用いて精製することによって、均一な精製タンパ
ク質が得られ、そのタンパク質のN末端17アミノ酸の
配列がLQCYNCPNPTADCKTAVであると報
告されている(上記文献)。
抗体を用いて精製することによって、均一な精製タンパ
ク質が得られ、そのタンパク質のN末端17アミノ酸の
配列がLQCYNCPNPTADCKTAVであると報
告されている(上記文献)。
また最近、MEM43抗体の認識する抗原をCD59と
命名しようという提案がある(第4回Internat
ional Workshop and Confer
ence on Iluman Leukocyte
Differentiatlon、およびStepha
nShaw、 Nature、 338.539−54
0 (1989)参照)。これらの研究結果は、あくま
でもMEM43抗体が認識する抗原が、マウスLy6に
対応するヒトリンパ球抗原であるかも知れないという示
唆にすぎず、また、これらの過去の研究結果からは、M
EM43抗体の認識するヒト抗原の特定化は極めて不十
分である。
命名しようという提案がある(第4回Internat
ional Workshop and Confer
ence on Iluman Leukocyte
Differentiatlon、およびStepha
nShaw、 Nature、 338.539−54
0 (1989)参照)。これらの研究結果は、あくま
でもMEM43抗体が認識する抗原が、マウスLy6に
対応するヒトリンパ球抗原であるかも知れないという示
唆にすぎず、また、これらの過去の研究結果からは、M
EM43抗体の認識するヒト抗原の特定化は極めて不十
分である。
[発明が解決しようとする課題]
本発明はかかる状況に鑑み、マウスLV6に対応する純
化されたヒトリンパ球抗原タンパク質と、それをコード
する遺伝子を取得することを目的とする。
化されたヒトリンパ球抗原タンパク質と、それをコード
する遺伝子を取得することを目的とする。
[課題を解決するための手段]
本発明者らは、第3図(a)に示したMEM43抗体の
認識する抗原タンパク質のN末端アミノ酸配列に基づい
て、その遺伝子をクローニングすることによって全遺伝
子配列を明らかにし、同時に全アミノ酸配列を明らかに
することによってタンパク質としての全容を明らかにし
、これによってこのタンパク質が明らかにマウスLy6
に対応するヒトリンパ球抗原であることが確認され、も
って本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、第
1図に示すアミノ酸配列を有するヒトリンパ球表面抗原
およびその同効物、さらにそれをコードする遺伝子を提
供するものである。
認識する抗原タンパク質のN末端アミノ酸配列に基づい
て、その遺伝子をクローニングすることによって全遺伝
子配列を明らかにし、同時に全アミノ酸配列を明らかに
することによってタンパク質としての全容を明らかにし
、これによってこのタンパク質が明らかにマウスLy6
に対応するヒトリンパ球抗原であることが確認され、も
って本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、第
1図に示すアミノ酸配列を有するヒトリンパ球表面抗原
およびその同効物、さらにそれをコードする遺伝子を提
供するものである。
本発明の遺伝子配列の一例を第2図に示す。
以下、本発明の詳細な説明する。
プローブおよびプライマーとしてのDNAオリゴマーは
、第3図(a)に基づいて、第3図(b)(C)、(d
)に示される3種類Ly61、Ly2およびLy3を合
成した。Ly61は、アミノ酸配列をコードするmRN
A鎖側の配列であり、Ly2とLy3はm RN Aに
相補な側の配列として合成した。図中、■はデオキシイ
ノシンを示し、■の相補鎖はIとする。2種類の塩基を
タテに並べたものは混合物として合成した。
、第3図(a)に基づいて、第3図(b)(C)、(d
)に示される3種類Ly61、Ly2およびLy3を合
成した。Ly61は、アミノ酸配列をコードするmRN
A鎖側の配列であり、Ly2とLy3はm RN Aに
相補な側の配列として合成した。図中、■はデオキシイ
ノシンを示し、■の相補鎖はIとする。2種類の塩基を
タテに並べたものは混合物として合成した。
次に、種々のヒトリンパ球系細胞を培養し、通常の方法
でmRNAを含むRNA画分を抽出した。
でmRNAを含むRNA画分を抽出した。
用いた細胞は、次のとおりである。
ヒト末梢血リンパ球画分をLPS (リポポリサッカラ
イド)で刺激したもの、ヒト扁桃腺リンパ球をConA
(コンカナバリンA)で刺激したもの、ヒト扁桃腺リ
ンパ球をTPA/PHAで刺激したもの、ヒト単球性白
血病細胞株J111、ヒト前骨髄性白血病細胞株HL6
0、ヒト急性骨髄性白血病細胞株KGI、ヒト前付髄性
白血病細胞株ML 3 (Minowada、J、
rLeukemiaJ (Gunz、F、 &Hend
cxson、E、編) pI)、119−139.
Grune & 5tratton。
イド)で刺激したもの、ヒト扁桃腺リンパ球をConA
(コンカナバリンA)で刺激したもの、ヒト扁桃腺リ
ンパ球をTPA/PHAで刺激したもの、ヒト単球性白
血病細胞株J111、ヒト前骨髄性白血病細胞株HL6
0、ヒト急性骨髄性白血病細胞株KGI、ヒト前付髄性
白血病細胞株ML 3 (Minowada、J、
rLeukemiaJ (Gunz、F、 &Hend
cxson、E、編) pI)、119−139.
Grune & 5tratton。
New York (1982))、ヒトT細胞白血病
細胞株RPM I 8402 (Sahai 5r1v
astere、 J、 Nat、 Canecr In
5t、 55.11−14 (1975))、ヒトリン
パ球性白血病細胞株Mo1t4および扁桃腺リンパ球細
胞株BecIIである。上記細胞株のうち、Jlll、
HL60、KGI、Mo1t4およびBecIIは、A
TCCから人手可能である。
細胞株RPM I 8402 (Sahai 5r1v
astere、 J、 Nat、 Canecr In
5t、 55.11−14 (1975))、ヒトリン
パ球性白血病細胞株Mo1t4および扁桃腺リンパ球細
胞株BecIIである。上記細胞株のうち、Jlll、
HL60、KGI、Mo1t4およびBecIIは、A
TCCから人手可能である。
得られたRNAをホルマリン含有RNAゲルで電気泳動
後、ナイロン膜にRNAを移し、固定後、第3図(C)
、(d)のDNAオリゴ7− L y 2とLy3をラ
ジオアイソトープ標識したものをプローブとして、ノザ
ン解析を行なった。ヒト末梢血リンパ球画分およびJl
llのRNAにおいて、陽性信号が約900塩基長、1
300塩基長および1800塩基長のところに認められ
た。従って、この2種の細胞は、Ly2およびLy3D
NAオリゴマーと相補的な配列を有するmRNAを合成
していることがわかったが、陽性信号が微弱なことから
、その量は通常のmRNA、例えばβ−アクチンのmR
NAに比べて極めて微量であることが推定された。
後、ナイロン膜にRNAを移し、固定後、第3図(C)
、(d)のDNAオリゴ7− L y 2とLy3をラ
ジオアイソトープ標識したものをプローブとして、ノザ
ン解析を行なった。ヒト末梢血リンパ球画分およびJl
llのRNAにおいて、陽性信号が約900塩基長、1
300塩基長および1800塩基長のところに認められ
た。従って、この2種の細胞は、Ly2およびLy3D
NAオリゴマーと相補的な配列を有するmRNAを合成
していることがわかったが、陽性信号が微弱なことから
、その量は通常のmRNA、例えばβ−アクチンのmR
NAに比べて極めて微量であることが推定された。
まず、Br1an 5eed法(前述文献)によって、
上記2種の細胞由来(末梢血リンパ球およびJlll)
のmRNAを出発物質としてcDNAライブラリーを作
製した。ライブラリーの大きさは(ライブラリーサイズ
)約5〜10万であった。これらのライブラリー(cD
NAがベクターにっながったプラスミドが宿主大腸菌に
入ったもの)を寒天培地にまき、通常の方法でオリゴマ
ーLy2およびLy3をプローブとして、コロニーハイ
ブリダイゼーション法でスクリーニングしたが、特異的
な陽性クローンは得られなかった。理由として、ライブ
ラリーの大きさに比して目的とするmRNAが少なすぎ
るために、目的クローンがc DNAライブラリーの中
に含まれていないことが強く推定された。
上記2種の細胞由来(末梢血リンパ球およびJlll)
のmRNAを出発物質としてcDNAライブラリーを作
製した。ライブラリーの大きさは(ライブラリーサイズ
)約5〜10万であった。これらのライブラリー(cD
NAがベクターにっながったプラスミドが宿主大腸菌に
入ったもの)を寒天培地にまき、通常の方法でオリゴマ
ーLy2およびLy3をプローブとして、コロニーハイ
ブリダイゼーション法でスクリーニングしたが、特異的
な陽性クローンは得られなかった。理由として、ライブ
ラリーの大きさに比して目的とするmRNAが少なすぎ
るために、目的クローンがc DNAライブラリーの中
に含まれていないことが強く推定された。
そこで次に、PCR(ポリメラーゼ伸長連鎖反応、ポリ
メラーゼ・チエイン・リアクション)の手法を独自に修
飾して応用することにした。PCRの一般的な参照文献
としては、Er1ich、H,A、ら。
メラーゼ・チエイン・リアクション)の手法を独自に修
飾して応用することにした。PCRの一般的な参照文献
としては、Er1ich、H,A、ら。
Nature、 33L 481−462 (1988
)が挙げられる。
)が挙げられる。
PCRは、通常ある距離(遺伝子の長さ)を離れたとこ
ろに、明確な、既知の短い(15〜20塩基)配列が必
要であるが、本発明の目標タンパク質の遺伝子について
は、そのような配列は不明であり、単にN末端のアミノ
酸配列(17アミノ酸)がわかっているだけである。
ろに、明確な、既知の短い(15〜20塩基)配列が必
要であるが、本発明の目標タンパク質の遺伝子について
は、そのような配列は不明であり、単にN末端のアミノ
酸配列(17アミノ酸)がわかっているだけである。
そこで、本発明者らは鋭意工夫をこらし、PCR反応に
おける第1のプライマーとして複数オリゴマーの混合物
である第3図(b)のオリゴマーLy61を、第2のプ
ライマーとして15塩基からなるオリゴdTを用いた。
おける第1のプライマーとして複数オリゴマーの混合物
である第3図(b)のオリゴマーLy61を、第2のプ
ライマーとして15塩基からなるオリゴdTを用いた。
Taqポリメラーゼと、基質として4種の(A。
T、G、C)デオキシヌクレオシド3リン酸を用い、鋳
型として前記2種の細胞(LPS刺激した末梢血リンパ
球と7111)由来のmRNA 2μgから、通常の
方法で合成した2本鎖cDNAを用いて、パー牟ンエル
マー・シータス社のPCR反応装置を用いて、熱変性、
アニーリングおよび鎖伸長反応の40サイクル反応を行
なった。
型として前記2種の細胞(LPS刺激した末梢血リンパ
球と7111)由来のmRNA 2μgから、通常の
方法で合成した2本鎖cDNAを用いて、パー牟ンエル
マー・シータス社のPCR反応装置を用いて、熱変性、
アニーリングおよび鎖伸長反応の40サイクル反応を行
なった。
この反応混合物をアガロースゲル電気泳動したところ、
エチジウムブロマイド染色では明瞭なバンドは認められ
ず、特異的なバンドがどれかは不明であったが、ナイロ
ン膜に転写後、標識したLy2オリゴマーをプローブと
してサザンハイプリダイゼーションを行なったところ、
約400bp付近に明瞭な陽性バンドが認められた。そ
こで、この反応混合物を一度、DNAポリメラーゼ・フ
レノウ断片で反応させて、末端を平滑化処理した後、1
3rian 5eed法で用いられるアダプター(DN
Aオリゴマー2本)を結合させ、KOAc濃度勾配の超
遠心で分配した。分配フラクションをアガロースゲル電
気泳動、サザンハイプリダイゼーション法で分析し、標
識Ly2オリゴマーのプローブで陽性なフラクション(
分画)をCDM8ベクターにつなぎ、大腸菌MC106
1/P3に形質転換した。
エチジウムブロマイド染色では明瞭なバンドは認められ
ず、特異的なバンドがどれかは不明であったが、ナイロ
ン膜に転写後、標識したLy2オリゴマーをプローブと
してサザンハイプリダイゼーションを行なったところ、
約400bp付近に明瞭な陽性バンドが認められた。そ
こで、この反応混合物を一度、DNAポリメラーゼ・フ
レノウ断片で反応させて、末端を平滑化処理した後、1
3rian 5eed法で用いられるアダプター(DN
Aオリゴマー2本)を結合させ、KOAc濃度勾配の超
遠心で分配した。分配フラクションをアガロースゲル電
気泳動、サザンハイプリダイゼーション法で分析し、標
識Ly2オリゴマーのプローブで陽性なフラクション(
分画)をCDM8ベクターにつなぎ、大腸菌MC106
1/P3に形質転換した。
こうして得られた形質転換体約12万個(末梢血リンパ
球由来)と約17万個(J 111由来)を、前記Ly
2オリゴマーをプローブとして通常のコロニーハイブリ
ダイゼーション法でスクリーニングしたところ、末梢血
リンパ球由来のものから2個、1111由来のものから
4個の陽性クローンが得られた。このうち、1個のクロ
ーン・Plを選び、DNAを通常の方法で取得してイン
サートを調べたところ、約350bpであった。このイ
ンサートを切り出して精製し、このDNA断片をニック
トランスレーション法でラジオアイソトープ標識し、ハ
イブリダイゼーションで他の陽性クローンとの異同を見
たところ、他の陽性クローンと結合したので、これらの
クローンはすべてほぼ同じ配列を有していることが推定
された。
球由来)と約17万個(J 111由来)を、前記Ly
2オリゴマーをプローブとして通常のコロニーハイブリ
ダイゼーション法でスクリーニングしたところ、末梢血
リンパ球由来のものから2個、1111由来のものから
4個の陽性クローンが得られた。このうち、1個のクロ
ーン・Plを選び、DNAを通常の方法で取得してイン
サートを調べたところ、約350bpであった。このイ
ンサートを切り出して精製し、このDNA断片をニック
トランスレーション法でラジオアイソトープ標識し、ハ
イブリダイゼーションで他の陽性クローンとの異同を見
たところ、他の陽性クローンと結合したので、これらの
クローンはすべてほぼ同じ配列を有していることが推定
された。
そこで、前記のクローンP1のDNA塩基配列解析を行
なった。得られた塩基配列を第2図に示した。第2図に
はCDM8のベクタ一部分およびアダプタ一部分を示さ
ず、インサート部分のみを示した。
なった。得られた塩基配列を第2図に示した。第2図に
はCDM8のベクタ一部分およびアダプタ一部分を示さ
ず、インサート部分のみを示した。
第2図のDNA塩基配列を両方向から各3種のフレーム
でアミノ酸配列に翻訳したところ、第2図に示した方向
の第1フレームのみが長いオープンリーディングフレー
ムをつくった。そのアミノ酸配列を、DNA塩基配列と
ともに第4図に示した。はじめの16アミノ酸は、第3
図(a)に示したMEM43をもとに精製され、決定さ
れたヒトリンパ球由来のタンパク質のN末端配列の17
アミノ酸のうち、2番目から17番目と全く同じであっ
た。従って、第1図と第4図に示されたアミノ酸配列は
、MEM43の認識するタンパク質のアミノ酸配列であ
ると結論できる。PCR反応に用いたプライマー(オリ
ゴマーLy61)の合成の都合上、第4図のDNA配列
は第2番目のQ(グルタミン)からはじまっているが、
その前にL(ロイシン)がついていることは前述のこと
から明らかなので、第4図の先頭(Qの前)にはLを付
加して示した。
でアミノ酸配列に翻訳したところ、第2図に示した方向
の第1フレームのみが長いオープンリーディングフレー
ムをつくった。そのアミノ酸配列を、DNA塩基配列と
ともに第4図に示した。はじめの16アミノ酸は、第3
図(a)に示したMEM43をもとに精製され、決定さ
れたヒトリンパ球由来のタンパク質のN末端配列の17
アミノ酸のうち、2番目から17番目と全く同じであっ
た。従って、第1図と第4図に示されたアミノ酸配列は
、MEM43の認識するタンパク質のアミノ酸配列であ
ると結論できる。PCR反応に用いたプライマー(オリ
ゴマーLy61)の合成の都合上、第4図のDNA配列
は第2番目のQ(グルタミン)からはじまっているが、
その前にL(ロイシン)がついていることは前述のこと
から明らかなので、第4図の先頭(Qの前)にはLを付
加して示した。
第1図および第4図に示したアミノ酸配列のタンパク質
は、以下に述べるいくつかの事実から、マウスLy6抗
原に対応するヒトリンパ球抗原であることが結論される
。
は、以下に述べるいくつかの事実から、マウスLy6抗
原に対応するヒトリンパ球抗原であることが結論される
。
■ N末端配列がMEM43をもとに精製されたタンパ
ク質のN末端配列と完全に一致する。MEM43抗体を
用いた免疫化学的な、細胞および抗原の解析から、ME
M43抗体の認識する抗原は、マウスLy6に対応する
ヒトリンパ球抗原であるらしいことが示唆されている。
ク質のN末端配列と完全に一致する。MEM43抗体を
用いた免疫化学的な、細胞および抗原の解析から、ME
M43抗体の認識する抗原は、マウスLy6に対応する
ヒトリンパ球抗原であるらしいことが示唆されている。
■ 第5図に示したマウスLy6C2aのアミノ酸配列
と、約25%(成熟ペプチド部分)の類似性があり、特
にN末端部分と中央部分でよ(似ている。大きさもほぼ
同じである。約25%しかホモロジーがないことは、逆
にマウスのcDNAをプローブとしてヒトの遺伝子が同
定できなかったことをよく説明している。本発明のアミ
ノ酸配列とマウスLy6C2aのそれを並べ、マキシマ
ムマツチングさせたものを第5図に示した。
と、約25%(成熟ペプチド部分)の類似性があり、特
にN末端部分と中央部分でよ(似ている。大きさもほぼ
同じである。約25%しかホモロジーがないことは、逆
にマウスのcDNAをプローブとしてヒトの遺伝子が同
定できなかったことをよく説明している。本発明のアミ
ノ酸配列とマウスLy6C2aのそれを並べ、マキシマ
ムマツチングさせたものを第5図に示した。
マウスLy6C2aの遺伝子配列は、米国ロスアラモス
研究所の遺伝子配列データバンクLA S L −Ge
n Bankに登録された配列(ID名:MLISLY
6C2A)からとり、それをアミノ酸配列に翻訳した。
研究所の遺伝子配列データバンクLA S L −Ge
n Bankに登録された配列(ID名:MLISLY
6C2A)からとり、それをアミノ酸配列に翻訳した。
第5図の下側に示したアミノ酸配列は成熟タンパク質を
示し、L(ロイシン)からはじまっている。マウスLy
6C2aの遺伝子配列の原報は、Pa1free、 R
,G、E、らによるJournal ofIa+mun
ology、 140.305−310 (1988)
である。
示し、L(ロイシン)からはじまっている。マウスLy
6C2aの遺伝子配列の原報は、Pa1free、 R
,G、E、らによるJournal ofIa+mun
ology、 140.305−310 (1988)
である。
第5図に示したように、本発明のアミノ酸配列はN末端
にL(ロイシン)を加えると、マウスLy6C2aのア
ミノ酸配列と33%の類似性を示す。また、C(システ
ィン)の数と配置がほとんど全く同じであり、このこと
は両タンパク質が同一の機能を有する類似体であること
を強(示唆する。
にL(ロイシン)を加えると、マウスLy6C2aのア
ミノ酸配列と33%の類似性を示す。また、C(システ
ィン)の数と配置がほとんど全く同じであり、このこと
は両タンパク質が同一の機能を有する類似体であること
を強(示唆する。
さらに、本発明のヒトタンパク質のアミノ酸組成では、
D(アスパラギン酸)とE(グルタミン酸)を加えたも
のは11個であり、K(リジン)とR(アルギニン)と
H(ヒスタミン)を加えたものは8個である。一方、マ
ウスLy6C2aでは、DとEの和は10個、KとRと
Hの和は9個であり、それぞれ酸性アミノ酸と塩基性ア
ミノ酸の比率は非常によく似ている。
D(アスパラギン酸)とE(グルタミン酸)を加えたも
のは11個であり、K(リジン)とR(アルギニン)と
H(ヒスタミン)を加えたものは8個である。一方、マ
ウスLy6C2aでは、DとEの和は10個、KとRと
Hの和は9個であり、それぞれ酸性アミノ酸と塩基性ア
ミノ酸の比率は非常によく似ている。
加えて、両者のアミノ酸数も分子量も非常によく似てい
る。
る。
■ 本発明のタンパク質アミノ酸配列をDoo l i
を法によって疎水性分布を示したものを第6図に、マ
ウスL”/6C2aのそれを第7図に示した。
を法によって疎水性分布を示したものを第6図に、マ
ウスL”/6C2aのそれを第7図に示した。
第6図と第7図かられかるように、両者は中央部の一部
を除いて非常に類似性が高く、とりわけC末端部分には
全く共通して強疎水性部分があり、これはホスファチジ
ルイノシトールアンカードプロティン(PIアンカリン
グタンパク質)であることを強(示している。マウスL
y6C2aについては、このことは証明されており、従
って本発明のタンパク質もリンパ球表面抗原であること
が強く示唆される。この疎水性/!11水性の解析は、
ソフトウェア開発■のGENETYXプログラムを使用
した。
を除いて非常に類似性が高く、とりわけC末端部分には
全く共通して強疎水性部分があり、これはホスファチジ
ルイノシトールアンカードプロティン(PIアンカリン
グタンパク質)であることを強(示している。マウスL
y6C2aについては、このことは証明されており、従
って本発明のタンパク質もリンパ球表面抗原であること
が強く示唆される。この疎水性/!11水性の解析は、
ソフトウェア開発■のGENETYXプログラムを使用
した。
以上のことより、本発明のタンパク質およびその遺伝子
は、マウスリンパ球表面抗原Ly6に対応するヒトリン
パ球表面抗原であることが結論される。
は、マウスリンパ球表面抗原Ly6に対応するヒトリン
パ球表面抗原であることが結論される。
本発明は、ヒトリンパ球におけるマウスLy6に対応す
る表面抗原(CD59と命名される)の完全な特定化を
含むものであり、それゆえに今後の開発研究の基礎とな
る重要な発明であると規定できる。マウスLy6におい
ては、若干の配列の違いによる亜型を含むファミリーが
同定されており、従って、ヒトにおいてもそのようなも
のの同定は当然予測できることであり、本発明の遺伝子
配列は、そのための有力な手段となるものである。
る表面抗原(CD59と命名される)の完全な特定化を
含むものであり、それゆえに今後の開発研究の基礎とな
る重要な発明であると規定できる。マウスLy6におい
ては、若干の配列の違いによる亜型を含むファミリーが
同定されており、従って、ヒトにおいてもそのようなも
のの同定は当然予測できることであり、本発明の遺伝子
配列は、そのための有力な手段となるものである。
従って当然のことながら、それらヒトCD59フアミリ
ー、すなわち同効物の遺伝子配列とアミノ酸配列も本発
明に含まれる。
ー、すなわち同効物の遺伝子配列とアミノ酸配列も本発
明に含まれる。
例えば、本発明のタンパク質のC末端には、約20個弱
の疎水性アミノ酸が並んでおり、これが細胞膜表面タン
パク質であるための要素となっているが、このC末端疎
水性領域をとったタンパク質を遺伝子組換え技術などの
手法によって人為的に調製すれば、ヒトCD59抗原を
介したリンパ球活性化を抑制することができる可能性も
ある。
の疎水性アミノ酸が並んでおり、これが細胞膜表面タン
パク質であるための要素となっているが、このC末端疎
水性領域をとったタンパク質を遺伝子組換え技術などの
手法によって人為的に調製すれば、ヒトCD59抗原を
介したリンパ球活性化を抑制することができる可能性も
ある。
このような応用展開は、本発明の記載するタンパク質と
なかんずくその遺伝子によって可能となる技術であるの
で、当然本発明の範囲に含まれる。
なかんずくその遺伝子によって可能となる技術であるの
で、当然本発明の範囲に含まれる。
従って、本発明のヒトリンパ球表面抗原は、第1図に示
すアミノ酸配列を有するが、実質的にこれと同等の機能
を有するものであれば、アミノ酸配列の置換、欠失、挿
入があっても本発明に含まれる。
すアミノ酸配列を有するが、実質的にこれと同等の機能
を有するものであれば、アミノ酸配列の置換、欠失、挿
入があっても本発明に含まれる。
また、本発明で示されるリンパ球表面抗原は、マウスL
y6の場合、リンパ球活性化に関与し、自己免疫疾患と
強く関連があることが知られているので、本発明はヒト
におけるCD59抗原の機能を科学的に解明し、またそ
れを工業的に利用する場合に、最も重要な材料を提供す
るものである。
y6の場合、リンパ球活性化に関与し、自己免疫疾患と
強く関連があることが知られているので、本発明はヒト
におけるCD59抗原の機能を科学的に解明し、またそ
れを工業的に利用する場合に、最も重要な材料を提供す
るものである。
すなわち、本発明のタンパク質をもとにして抗体(モノ
クローナル抗体を含む)を作成すれば、その抗体はリン
パ球機能の研究に重要な役割を果すと理解でき、同時に
その抗体を用いて自己免疫疾患のような免疫過剰応答の
診断に有用である。
クローナル抗体を含む)を作成すれば、その抗体はリン
パ球機能の研究に重要な役割を果すと理解でき、同時に
その抗体を用いて自己免疫疾患のような免疫過剰応答の
診断に有用である。
また、その抗体がヒトリンパ球を活性化するものである
場合には、該抗体を抗がんあるいは抗感染症の治療に応
用することもでき、抗体がヒトリンパ球の機能を抑制す
るものである場合には、該抗体を免疫応答過剰疾患(自
己免疫疾患)の治療に応用することもできる。
場合には、該抗体を抗がんあるいは抗感染症の治療に応
用することもでき、抗体がヒトリンパ球の機能を抑制す
るものである場合には、該抗体を免疫応答過剰疾患(自
己免疫疾患)の治療に応用することもできる。
[実 施 例]
以下には実施例によって、本発明をさらに具体的に説明
する。
する。
以下の実施例において、用いられた方法の一部は一般的
なものであり、次に示す装置にそれらの実験処方が詳し
く記載されている。
なものであり、次に示す装置にそれらの実験処方が詳し
く記載されている。
Au5ubcl 、F、M、ら編、 ’Curren
t Protocols inMolecular B
iology″John Wiley & 5ons、
1987年およびManiatiS、T、ら著、
’Mo1e(Lllar Cloning: A La
boratory ManuaビCo1d Sprin
g HarborLaboratory、 1982年
。
t Protocols inMolecular B
iology″John Wiley & 5ons、
1987年およびManiatiS、T、ら著、
’Mo1e(Lllar Cloning: A La
boratory ManuaビCo1d Sprin
g HarborLaboratory、 1982年
。
以下、実施例中では上述の装置を前述底置として引用す
る。
る。
実施例1
mRNAの調製
株化細胞Jlll (、ヒト単球性白血病細胞)の培養
は、10%牛脂児血清を含むダルベツコMEM培地にラ
スイ社)で行なった。株化細胞HL60(ヒト前骨髄性
白血病細胞’) 、KGI (ヒト急性骨髄性白血病細
胞)、ML3(ヒト前骨髄性白血病細胞) 、RPMI
8402 (ヒトT細胞白血病細胞)、Mo1t4(
ヒトリンパ芽球性白血病細胞)、およびBecII (
扁桃腺リンパ球細胞)の培養は、10%牛脂児血清と最
終濃度5×10−5Mの2−メルカプトエタノールを含
むRP M11640培地にラスイ社)で行なった。
は、10%牛脂児血清を含むダルベツコMEM培地にラ
スイ社)で行なった。株化細胞HL60(ヒト前骨髄性
白血病細胞’) 、KGI (ヒト急性骨髄性白血病細
胞)、ML3(ヒト前骨髄性白血病細胞) 、RPMI
8402 (ヒトT細胞白血病細胞)、Mo1t4(
ヒトリンパ芽球性白血病細胞)、およびBecII (
扁桃腺リンパ球細胞)の培養は、10%牛脂児血清と最
終濃度5×10−5Mの2−メルカプトエタノールを含
むRP M11640培地にラスイ社)で行なった。
ヒト末梢血リンパ球画分は、正常人より採血した後、ヘ
パリン処理した遠沈管での遠心を含む通常の方法で取得
したフィーコート分画の細胞を遠心分離により集め、R
PM11640培地に懸濁し、10μg/mlのLPS
を加え、15時間培養した。ヒト扁桃腺リンパ球は、通
常の方法で細胞を採取した後、RPMI 1640培地
に懸濁し、ConA (10μg/ml)あるいはTP
A : PHA (5mg/ml : 1%)を加え、
20時間培養した。
パリン処理した遠沈管での遠心を含む通常の方法で取得
したフィーコート分画の細胞を遠心分離により集め、R
PM11640培地に懸濁し、10μg/mlのLPS
を加え、15時間培養した。ヒト扁桃腺リンパ球は、通
常の方法で細胞を採取した後、RPMI 1640培地
に懸濁し、ConA (10μg/ml)あるいはTP
A : PHA (5mg/ml : 1%)を加え、
20時間培養した。
細胞の培養は、すべてCO2インキュベーターで行なっ
た。細胞に塩化リチウム/グアニジンチオシアネート溶
液(50gのグアニジンチオシアネートを25%の塩化
リチウム溶液58m1に融解し、0.45μのフィルタ
ーで一過した後、2mlの2−メルカプトエタノールを
加えたもの)を加え、得られた粘稠溶液を40秒間2回
ポリトロンをかけ、染色体DNAを分断した。
た。細胞に塩化リチウム/グアニジンチオシアネート溶
液(50gのグアニジンチオシアネートを25%の塩化
リチウム溶液58m1に融解し、0.45μのフィルタ
ーで一過した後、2mlの2−メルカプトエタノールを
加えたもの)を加え、得られた粘稠溶液を40秒間2回
ポリトロンをかけ、染色体DNAを分断した。
この細胞ホモジネートを1/3量の5.7M塩化セシウ
ム(100mMのEDTAを含む)溶液の上に重層し、
35.00Orpmで20時間20°Cで遠心した。遠
心管の底に沈殿した全RNAを、少量の塩化リチウム/
グアニジンチオシアネート溶液に溶かし、1/10量の
3M酢酸ナトリウム溶液と2.5倍量のエタノールを加
え、−20℃に一晩放置し沈殿させた。
ム(100mMのEDTAを含む)溶液の上に重層し、
35.00Orpmで20時間20°Cで遠心した。遠
心管の底に沈殿した全RNAを、少量の塩化リチウム/
グアニジンチオシアネート溶液に溶かし、1/10量の
3M酢酸ナトリウム溶液と2.5倍量のエタノールを加
え、−20℃に一晩放置し沈殿させた。
ヒト末梢血リンパ球、ヒト扁桃、Jlll、ML3、K
GI、HL60については、続いて全RNAを常法に従
って、オリゴdTセルロースカラムクロマトグラフィー
にかけてポリA RNAを選別収集した。
GI、HL60については、続いて全RNAを常法に従
って、オリゴdTセルロースカラムクロマトグラフィー
にかけてポリA RNAを選別収集した。
実験に使用した細胞数は以下のとおりである。
Jlll:3X108細胞、ヒト末梢血リンパ球:1.
2X109細胞、ヒト扁桃:5×108細胞、ML3
: 1.4X109細胞、KGI:2×108細胞、H
L60 : 3X10B細胞、RPMI8402 :4
X107細胞、Mo1t4:4×107細胞、Be c
II−5X107細胞。
2X109細胞、ヒト扁桃:5×108細胞、ML3
: 1.4X109細胞、KGI:2×108細胞、H
L60 : 3X10B細胞、RPMI8402 :4
X107細胞、Mo1t4:4×107細胞、Be c
II−5X107細胞。
実施例2
ヒトLy6mRNAの検出
(A)DNAプローブの合成
第3図(a)上に示したMEM43抗体の認識する抗原
タンパク質のN末端アミノ酸配列に基づいて、第3図(
b)〜(d)に示した3種類のオリゴヌクレオチド(オ
リゴマー)Ly61、Ly2、Ly3を合成した。Ly
2、Ly3はその相補鎖の配列を示した。
タンパク質のN末端アミノ酸配列に基づいて、第3図(
b)〜(d)に示した3種類のオリゴヌクレオチド(オ
リゴマー)Ly61、Ly2、Ly3を合成した。Ly
2、Ly3はその相補鎖の配列を示した。
従って、実際に合成して使用したDNAオリコマ−の配
列は、次のとおりである。
列は、次のとおりである。
L V 2 : ACIGCIGTTTTACAA
TCIGCIGTIGGATTCGG
G ノザンハイブリダイゼーションのプローブとしては、L
y2とLy3を用いた。5′水酸基をT4キナーゼとγ
(”2P)ATPを用いてリン酸化標識した。
TCIGCIGTIGGATTCGG
G ノザンハイブリダイゼーションのプローブとしては、L
y2とLy3を用いた。5′水酸基をT4キナーゼとγ
(”2P)ATPを用いてリン酸化標識した。
(B)ノザンハイブリダイゼーション
実施例1で得た全RNA(10〜20μg)あるいはポ
リARNA(2〜5μg)をホルマリン含有1%アガロ
ースゲルで電気泳動後、ナイロン膜(アマジャム社“バ
イホントN”)に移した後、ゲルとの接触面を下にして
紫外線固定(2分30秒間)した。プレハイブリダイゼ
ーションを42°Cで1時間行なった後、ハイブリダイ
ゼーションも42℃で1晩行なった。洗いも42℃で行
なった。ハイブリダイゼーション溶液の組成は、5 x
S S P E、 5 XDenhardt’s、
0. 1%SDS。
リARNA(2〜5μg)をホルマリン含有1%アガロ
ースゲルで電気泳動後、ナイロン膜(アマジャム社“バ
イホントN”)に移した後、ゲルとの接触面を下にして
紫外線固定(2分30秒間)した。プレハイブリダイゼ
ーションを42°Cで1時間行なった後、ハイブリダイ
ゼーションも42℃で1晩行なった。洗いも42℃で行
なった。ハイブリダイゼーション溶液の組成は、5 x
S S P E、 5 XDenhardt’s、
0. 1%SDS。
100μg/mlサケ***DNA (熱変性)、洗い液
は、2xSSC,0,1%SDSである。これらの方法
は、前述底置に準じて行なった。
は、2xSSC,0,1%SDSである。これらの方法
は、前述底置に準じて行なった。
オートラジオグラフィーの結果、Ly2、Ly3の両プ
ローブでJ111細胞のポリA RNAにおいて、約
900塩基長、1300塩基長、1800塩基長のとこ
ろに陽性バンドが認められた。
ローブでJ111細胞のポリA RNAにおいて、約
900塩基長、1300塩基長、1800塩基長のとこ
ろに陽性バンドが認められた。
J111細胞と比較すると非常に弱い信号であるが、ヒ
ト末梢血リンパ球のポリA RNAでも認められた。
ト末梢血リンパ球のポリA RNAでも認められた。
他の細胞では検出できなかった。
実施例3
eDNAライブラリーの作製
Jlllとヒト末梢血リンパ球より調製したポリA
RNA5μgを用いて、ブライアン争シード(Bria
n 5eed)の方法(前述文献)によりcDNAライ
ブラリーを作製した。2本鎖のc DNA合或は、cD
NA合成キット〔アマ−ジャム(A[Ilersham
)製〕を利用し、そのプロトコールに準じて行なった。
RNA5μgを用いて、ブライアン争シード(Bria
n 5eed)の方法(前述文献)によりcDNAライ
ブラリーを作製した。2本鎖のc DNA合或は、cD
NA合成キット〔アマ−ジャム(A[Ilersham
)製〕を利用し、そのプロトコールに準じて行なった。
2本鎖cDNAに、T4DNAリガーゼを用いて、リン
酸化されたアダプター(12mer : CTTTAG
AGCACAおよび8[l1erCTCTAAAG)を
連結した。余分なアダプターと短いcDNAを取り除く
ために、5〜20%酢酸カルシウム密度勾配遠心(50
,00Orpm。
酸化されたアダプター(12mer : CTTTAG
AGCACAおよび8[l1erCTCTAAAG)を
連結した。余分なアダプターと短いcDNAを取り除く
ために、5〜20%酢酸カルシウム密度勾配遠心(50
,00Orpm。
22°Cで3時間)を行なった。遠心管の底に注射針を
刺し、0.4mlずつ分画した。6番目までの分画をC
DM8ベクター(Br1an 5eed 前述文献)
のBst)(1部位に、T 4 D N A IJガー
セニヨリ連結した。大腸菌MC1061/P3株(前述
文献)を通常の方法で形質転換して得られたcDNAラ
イブラリーの大きさは、Jlllの場合約10万、末梢
血リンパ球の場合約5万であった。
刺し、0.4mlずつ分画した。6番目までの分画をC
DM8ベクター(Br1an 5eed 前述文献)
のBst)(1部位に、T 4 D N A IJガー
セニヨリ連結した。大腸菌MC1061/P3株(前述
文献)を通常の方法で形質転換して得られたcDNAラ
イブラリーの大きさは、Jlllの場合約10万、末梢
血リンパ球の場合約5万であった。
これらのライブラリーを実施例2で作成したLy2とL
y3DNAプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼ
ーション法でスクリーニングを行なった。プレートあた
り約2.000個のコロニーが出るように組換え大腸菌
をまいた。各々のプレートについて、2枚のレプリカプ
レートを作製した。レプリカプレート上のコロニーを5
41ペーパー〔ワットマン(Whatmann)製〕に
移したあと、アルカリ変性、中和、洗いの操作を行ない
、プラスミドDNAをフィルター上に固定した。プレハ
イブリダイゼーションを42℃で1〜数時間行なった後
、ハイブリダイゼーションを42℃で一晩行なった。洗
いも42℃で行なった。これらの操作は、前述代書に準
じて行なった。
y3DNAプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼ
ーション法でスクリーニングを行なった。プレートあた
り約2.000個のコロニーが出るように組換え大腸菌
をまいた。各々のプレートについて、2枚のレプリカプ
レートを作製した。レプリカプレート上のコロニーを5
41ペーパー〔ワットマン(Whatmann)製〕に
移したあと、アルカリ変性、中和、洗いの操作を行ない
、プラスミドDNAをフィルター上に固定した。プレハ
イブリダイゼーションを42℃で1〜数時間行なった後
、ハイブリダイゼーションを42℃で一晩行なった。洗
いも42℃で行なった。これらの操作は、前述代書に準
じて行なった。
オートラジオグラフィーの結果、Ly2プローブ、Ly
3プローブとも非特異的な結合が強いことがわかった。
3プローブとも非特異的な結合が強いことがわかった。
J111ライブラリーについては、約20万個、ヒト末
梢血リンパ球ライブラリーについては、約5万個スクリ
ーニングを行なったが、特異的な陽性クローンは得られ
なかった。
梢血リンパ球ライブラリーについては、約5万個スクリ
ーニングを行なったが、特異的な陽性クローンは得られ
なかった。
実施例4
PCR法によるヒトL y 6 c DNAの増幅前述
のJlll、ヒト末梢血リンパ球(LPS刺激)由来の
ポリA”RNA 1μgより、cDNA合成キット(
前述)を用いて2本鎖cDNAを合成した。合成したc
DNAの1/3ffi(100ng以上の2本鎖cDN
Aを含むものと推定した)を1回のPCR(ポリメラー
ゼ伸長連鎖反応、前述文献)実験に用いた。PCR反応
における第1のプライマーとして第3図(b)のオリゴ
マーLy61を、第2のプライマーとしてオリゴdT(
15mer)を用いた。反応液組成は次のとおりである
。
のJlll、ヒト末梢血リンパ球(LPS刺激)由来の
ポリA”RNA 1μgより、cDNA合成キット(
前述)を用いて2本鎖cDNAを合成した。合成したc
DNAの1/3ffi(100ng以上の2本鎖cDN
Aを含むものと推定した)を1回のPCR(ポリメラー
ゼ伸長連鎖反応、前述文献)実験に用いた。PCR反応
における第1のプライマーとして第3図(b)のオリゴ
マーLy61を、第2のプライマーとしてオリゴdT(
15mer)を用いた。反応液組成は次のとおりである
。
DNAサーマルサイクラ−PJlooO(パーキンエル
マー・シータス社)を用いて、熱変性94°C:1分、
アニーリング40℃:2分、鎖伸長反応72℃=3分の
条件で40サイクル反応を行なった。
マー・シータス社)を用いて、熱変性94°C:1分、
アニーリング40℃:2分、鎖伸長反応72℃=3分の
条件で40サイクル反応を行なった。
この反応混合物の115量を、1%アガロースゲル電気
泳動したところ、エチジウムブロマイド染色では明瞭な
バンドは認められなかった。ゲルをアルカリ変性30分
間、中和15分間の2回行なった後、ナイロン膜〔アマ
ジャム・ハイボンドN (Amasham、 1lyb
ond N) )にDNAを転写し、紫外線で固定(2
分30秒間)した。実施例2で合成したLy2オリゴマ
ーをプローブとしてサザンハイプリダイゼーションを行
なった。この操作は、前述代書に準じて行なった。プレ
ハイブリダイゼーションを42℃で1〜数時間行なった
後、ハイブリダイゼーションを42℃で1晩行なった。
泳動したところ、エチジウムブロマイド染色では明瞭な
バンドは認められなかった。ゲルをアルカリ変性30分
間、中和15分間の2回行なった後、ナイロン膜〔アマ
ジャム・ハイボンドN (Amasham、 1lyb
ond N) )にDNAを転写し、紫外線で固定(2
分30秒間)した。実施例2で合成したLy2オリゴマ
ーをプローブとしてサザンハイプリダイゼーションを行
なった。この操作は、前述代書に準じて行なった。プレ
ハイブリダイゼーションを42℃で1〜数時間行なった
後、ハイブリダイゼーションを42℃で1晩行なった。
洗いも42℃で行なった。オートラジオグラフィーの結
果、約400塩基長付近に明瞭なバンドが認められた。
果、約400塩基長付近に明瞭なバンドが認められた。
反応混合物の残り415量を、フェノール:クロロホル
ム(1: 1)処理2回、クロロホルム処理1回した後
、エタノール沈殿を行ないDNAを回収した。このDN
Aの115量を用いて、前述と同じ反応組成、反応条件
でさらに40サイクルの反応を行なったところ、サザン
ハイプリダイゼーションで陽性バンドの増加が認められ
た。
ム(1: 1)処理2回、クロロホルム処理1回した後
、エタノール沈殿を行ないDNAを回収した。このDN
Aの115量を用いて、前述と同じ反応組成、反応条件
でさらに40サイクルの反応を行なったところ、サザン
ハイプリダイゼーションで陽性バンドの増加が認められ
た。
実施例5
Ly2プローブと交叉するcDNAのクローニング
7 実施例4で得られた反応混合物(40サイクル2回)を
フェノール:クロロホルム(1: 1)処理2回、クロ
ロホルム処理1回を行なった後、エタノール沈殿を行な
いDNAを回収した。DNAポリメラーゼ(フレノウ断
片)処理を22℃で30分間行ない末端を平滑化した。
7 実施例4で得られた反応混合物(40サイクル2回)を
フェノール:クロロホルム(1: 1)処理2回、クロ
ロホルム処理1回を行なった後、エタノール沈殿を行な
いDNAを回収した。DNAポリメラーゼ(フレノウ断
片)処理を22℃で30分間行ない末端を平滑化した。
実施例3で使用したものと同じリン酸化アダプターをT
4DNAリガーゼにより連結した(16℃、−晩)。余
分なアダプターとPCR反応に用いたプライマーを取り
除くために、酢酸カリウム密度勾配超遠心(前述)を行
なった。前述のように0.4mlずつ12フラクシヨン
に分配した。各々の1/10量を1%アガロースゲル電
気泳動し、標識Ly2オリゴマーをプローブとしてサザ
ンハイプリダイゼーション(前述)を行なった。オート
ラジオグラフィーの結果、Jlllの場合も末梢血リン
パ球の場合も8番目のフラクションに陽性バンド(約4
00塩基長)が認められた。
4DNAリガーゼにより連結した(16℃、−晩)。余
分なアダプターとPCR反応に用いたプライマーを取り
除くために、酢酸カリウム密度勾配超遠心(前述)を行
なった。前述のように0.4mlずつ12フラクシヨン
に分配した。各々の1/10量を1%アガロースゲル電
気泳動し、標識Ly2オリゴマーをプローブとしてサザ
ンハイプリダイゼーション(前述)を行なった。オート
ラジオグラフィーの結果、Jlllの場合も末梢血リン
パ球の場合も8番目のフラクションに陽性バンド(約4
00塩基長)が認められた。
8番目のフラクションからエタノール沈殿によりDNA
を回収し、このDNAをCDM8ベクター(前述)のB
stX1部位にT4DNAリガーゼにより連結した(1
6℃、−晩)。大腸菌MCl061/P3 (前述)を
通常の方法で形質転換したところ、Jlllの場合約1
2万個、末梢血リンパ球の場合約17個の形質転換体が
得られた。
を回収し、このDNAをCDM8ベクター(前述)のB
stX1部位にT4DNAリガーゼにより連結した(1
6℃、−晩)。大腸菌MCl061/P3 (前述)を
通常の方法で形質転換したところ、Jlllの場合約1
2万個、末梢血リンパ球の場合約17個の形質転換体が
得られた。
各々のライブラリー約2,500個について、前述のL
y2オリゴマーをプローブとしてコロニーハイブリダイ
ゼーション法(前述文献)でスクリーニングしたところ
、J111由来4個(J−2、J−6、J−7、J−9
)、末梢血リンパ球由来2個(P−1、P−2)の陽性
クローンが得られた。このうち1個のクローンP−1を
選び、DNAを前述底置に準じて取得した。このDNA
をXho Iで切断し、インサートcDNAの長さを調
べたところ、約350塩基長であった。このインサート
を切り出しシーンクリーン〔バイ第101 (Bio
101)社製)で精製した。DNA断片をニックトラン
スレーション法でα(32P)CTPで標識した。この
操作は、前述底置に準じて行なった。この標識DNA断
片をプローブとしてノ1イブリダイゼーション(プレハ
イブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション65℃
、洗い50℃)で他の陽性クローンとの異同を調べたと
ころ、他の陽性クローンと結合した。それゆえに、これ
らのクローンはすべてほぼ同じ配列を有していることが
推定された。
y2オリゴマーをプローブとしてコロニーハイブリダイ
ゼーション法(前述文献)でスクリーニングしたところ
、J111由来4個(J−2、J−6、J−7、J−9
)、末梢血リンパ球由来2個(P−1、P−2)の陽性
クローンが得られた。このうち1個のクローンP−1を
選び、DNAを前述底置に準じて取得した。このDNA
をXho Iで切断し、インサートcDNAの長さを調
べたところ、約350塩基長であった。このインサート
を切り出しシーンクリーン〔バイ第101 (Bio
101)社製)で精製した。DNA断片をニックトラン
スレーション法でα(32P)CTPで標識した。この
操作は、前述底置に準じて行なった。この標識DNA断
片をプローブとしてノ1イブリダイゼーション(プレハ
イブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション65℃
、洗い50℃)で他の陽性クローンとの異同を調べたと
ころ、他の陽性クローンと結合した。それゆえに、これ
らのクローンはすべてほぼ同じ配列を有していることが
推定された。
実施例6
cDNAクローンの塩基配列の決定
CDM8ベクターのシーフェンス用プライマー(5’
TAATACGACTCACTATA3’5’ CT
TCACAAAGATCCTCT3”)を用い、デオキ
シ−7−ジアザグアニントリホスフェートを用いたジデ
オキシ法で配列解析を行なった。
TAATACGACTCACTATA3’5’ CT
TCACAAAGATCCTCT3”)を用い、デオキ
シ−7−ジアザグアニントリホスフェートを用いたジデ
オキシ法で配列解析を行なった。
得られた塩基配列を第2図に示した。PCR反応に使用
したLy61プライマーの配列に続いてLy2プローブ
に対応する配列があり、これらはMEM43が認識する
抗原タンパク質のN末端アミノ酸配列より推定される塩
基配列(第3図(a))のうちの1種と一致していた。
したLy61プライマーの配列に続いてLy2プローブ
に対応する配列があり、これらはMEM43が認識する
抗原タンパク質のN末端アミノ酸配列より推定される塩
基配列(第3図(a))のうちの1種と一致していた。
また、塩基配列に対応する翻訳アミノ酸配列は第1図に
示すとおりで、グルタミン酸からバリンまで16アミノ
酸が完全に一致していた。
示すとおりで、グルタミン酸からバリンまで16アミノ
酸が完全に一致していた。
[発明の効果]
本発明によって得られたcDNAをプローブとして用い
ることにより、マウスのように類似遺伝子からなるファ
ミリーが存在するかどうか、またリンパ球活性化とどの
ように関わっているか、また自己免疫疾患などの免疫過
剰と関連があるかどうかなど、ヒトの免疫系の研究にと
って重要な進展がなされることが期待できる。また同時
に、本発明のヒトリンパ球抗原を、例えばそれに対する
特異的抗体を作成するなどの方法によって、抑制するこ
とによる自己免疫疾患治療薬や、活性化することによる
抗ガン薬、抗感染症薬の開発につながることが期待でき
る。すなわち、本発明によってはじめてマウスLy6に
対応するヒトリンパ球抗原の研究および工業的応用の可
能性が大きく開けるといえる。
ることにより、マウスのように類似遺伝子からなるファ
ミリーが存在するかどうか、またリンパ球活性化とどの
ように関わっているか、また自己免疫疾患などの免疫過
剰と関連があるかどうかなど、ヒトの免疫系の研究にと
って重要な進展がなされることが期待できる。また同時
に、本発明のヒトリンパ球抗原を、例えばそれに対する
特異的抗体を作成するなどの方法によって、抑制するこ
とによる自己免疫疾患治療薬や、活性化することによる
抗ガン薬、抗感染症薬の開発につながることが期待でき
る。すなわち、本発明によってはじめてマウスLy6に
対応するヒトリンパ球抗原の研究および工業的応用の可
能性が大きく開けるといえる。
第1図は、本発明のヒトリンパ球表面抗原のアノ酸配列
を、第2図は、それをコードする遺伝子配列の1例を示
す。 第3図(a)は、MEM43抗体が認識する抗原タンパ
ク質のN末端アミノ酸配列および該アミノ酸配列を指定
しうるDNA配列を示し、第3図(b)、(c)、(d
)は、本発明で用いた合成オリゴマーLy61、Ly2
、Ly3の配列を示す。タテに並んだものは核酸塩基の
混合物を、■はデオキシイノシンを示す。 第4図は、本発明のヒトリンパ球表面抗原のアミノ酸配
列を、その遺伝子配列とともに示したものである。 第5図は、本発明のアミノ酸配列とマウスLy6C2a
のアミノ酸配列をマキシマムマツチングさせたものであ
る。図中*印は一致するアミノ酸配列を、十印はシステ
ィンを示す。 第6図は、本発明のアミノ酸配列のDoo l i を
法による疎水性分布を示すものであり、第7図は、同法
によるマウス6C2aの疎水性分布を示すものである。
を、第2図は、それをコードする遺伝子配列の1例を示
す。 第3図(a)は、MEM43抗体が認識する抗原タンパ
ク質のN末端アミノ酸配列および該アミノ酸配列を指定
しうるDNA配列を示し、第3図(b)、(c)、(d
)は、本発明で用いた合成オリゴマーLy61、Ly2
、Ly3の配列を示す。タテに並んだものは核酸塩基の
混合物を、■はデオキシイノシンを示す。 第4図は、本発明のヒトリンパ球表面抗原のアミノ酸配
列を、その遺伝子配列とともに示したものである。 第5図は、本発明のアミノ酸配列とマウスLy6C2a
のアミノ酸配列をマキシマムマツチングさせたものであ
る。図中*印は一致するアミノ酸配列を、十印はシステ
ィンを示す。 第6図は、本発明のアミノ酸配列のDoo l i を
法による疎水性分布を示すものであり、第7図は、同法
によるマウス6C2aの疎水性分布を示すものである。
Claims (2)
- (1)下記のアミノ酸配列を有するヒトリンパ球表面抗
原およびその同効物。 Leu_1GlnCysTyrAsnCysProAs
nProT_1h_0rAlaAspCysLysTh
rAlaValAsnCysS_2e_0rSerAs
pPheAspAlaCysLeuIleThrL_3
y_0sAlaGlyLeuGlnValTyrAsn
LysCysT_4r_0pLysPheGluHis
CysAsnPheAsnAspV_5a_0lThr
ThrArgLeuArgGluAsnGluLeuT
_6h_0rTyrTyrCysCysLysLysA
spLeuCysA_7s_0nPheAsnGluG
lnLeuGluAsnGlyGlyT_8h_0rS
erLeuSerGluLysThrValLeuLe
uL_9e_0uValThrProPheLeuAl
aAlaAlaTrpS_1e_0r_0LeuHis
P_1r_0o_3 - (2)請求項(1)記載のヒトリンパ球表面抗原または
その同効物をコードする遺伝子。(3)下記の塩基配列
を有する請求項(2)記載の遺伝子。 CAGTGCTAC^1A^0ACTGTCCTA^2
A^0CCCAACTGC^3T^0GACTGCAA
A^4A^0CAGCCGTCA^5A^0TTGTT
CATC^6T^0GATTTTGAT^7G^0CG
TGTCTCA^8T^0TACCAAAGC^9T^
0GGGTTACA^1A^0G^0TGTATAAC
^1A^1A^0GTGTTGGA^1A^2G^0T
TTGAGCA^1T^3T^0GCAATTTC^1
A^4A^0CGACGTCA^1C^5A^0ACC
CGCTT^1G^6A^0GGGAAAAT^1G^
7A^0GCTAACGT^1A^8C^0TACTG
CTG^1C^9A^0AGAAGGAC^2C^0T
^0GTGTAACT^2T^1T^0AACGAAC
A^2G^2C^0TTGAAAAT^2G^3G^0
TGGGACAT^2C^4C^0TTATCAGA^
2G^5^A0AAACAGTT^2C^6T^0TC
TGCTGG^2T^7G^0ACTCCATT^2T
^8C^0TGGCAGCA^2G^9C^0CTGG
AGCC^3T^0T^0CATCCCTA^3A^1
G^0TCAACACC^3A^2G^0GAGAGC
TT^3C^3T^0CCCAAA^3^4^0
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18326489A JPH0348696A (ja) | 1989-07-14 | 1989-07-14 | ヒトリンパ球表面抗原およびそれをコードする遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18326489A JPH0348696A (ja) | 1989-07-14 | 1989-07-14 | ヒトリンパ球表面抗原およびそれをコードする遺伝子 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0348696A true JPH0348696A (ja) | 1991-03-01 |
Family
ID=16132625
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP18326489A Pending JPH0348696A (ja) | 1989-07-14 | 1989-07-14 | ヒトリンパ球表面抗原およびそれをコードする遺伝子 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0348696A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5468612A (en) * | 1993-11-19 | 1995-11-21 | Cytomed, Inc. | 9804 gene and methods of use thereof |
WO1997000320A1 (fr) * | 1995-06-16 | 1997-01-03 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | Polypeptide modifie, adn codant ce dernier, transformant et composition pharmaceutique contenant le polypeptide |
WO2000017345A1 (fr) * | 1998-09-17 | 2000-03-30 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Gene ly6h |
-
1989
- 1989-07-14 JP JP18326489A patent/JPH0348696A/ja active Pending
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5468612A (en) * | 1993-11-19 | 1995-11-21 | Cytomed, Inc. | 9804 gene and methods of use thereof |
WO1997000320A1 (fr) * | 1995-06-16 | 1997-01-03 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | Polypeptide modifie, adn codant ce dernier, transformant et composition pharmaceutique contenant le polypeptide |
WO2000017345A1 (fr) * | 1998-09-17 | 2000-03-30 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Gene ly6h |
US7432363B2 (en) | 1998-09-17 | 2008-10-07 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Ly6H gene |
US7582732B2 (en) | 1998-09-17 | 2009-09-01 | Osaka Pharmaceutical Co., Ltd. | Ly6h polypeptide |
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