JPH0348696A

JPH0348696A - ヒトリンパ球表面抗原およびそれをコードする遺伝子

Info

Publication number: JPH0348696A
Application number: JP18326489A
Authority: JP
Inventors: Ritsuko Sawada; 沢田　律子; Masanobu Naruto; 成戸　昌信
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1989-07-14
Filing date: 1989-07-14
Publication date: 1991-03-01

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、ヒトリンパ球表面抗原を構成する純化された
タンパク質およびそれをコードする遺伝子に関する。さ
らに詳しくは、本発明はマウスのリンパ球抗原Ｌｙ６に
対応する純化されたヒトリンパ球抗原およびそれをコー
ドする遺伝子を提供するものである。

［従来の技術］Ｌｙ６抗原はマウスのリンパ球に見い出された表面抗原
であり、主として１９２８球、ＮＫ細胞、単球などの表
面にホスファチジルイノシトールで細胞膜に錨を下した
（ＰＩアンカリングタンパク質）形で存在する。Ｌｙ６
はリンパ球の活性化に強く関与し、Ｌ）／６に対するモ
ノクローナル抗体は、ある場合には単独で、ある場合に
は架橋などの処理を行なうことによって、マウスリンパ
球の機能を活性化する。

一方、Ｌ／６抗原に対する抗体を用いたフローサイトメ
ーターによる解析では、例えばＭＲＬ／αマウス（ＭＲ
Ｌ／Ｍｐ−４，ｒ／Ｑ、、）などの自己免疫疾患モデル
マウスにおいて、Ｌ１６陽性細胞の数と細胞あたりのＬ
ｙ６抗原の数が顕著に多くなっていることが知られてい
る。

マウスにおけるＬｙ６抗原は数種からなるファミリーを
形成し、またマウスの遺伝的系列によって配列がわずか
に異なる亜型の存在が報告されている。ただし、それら
の間の類似性（ホモロジー）はかなり大きい。

以上のことから、Ｌｙ６はリンパ球活性化のメカニズム
の少なくとも１つに強く関与し、また自己免疫疾患に伴
なう現象として、Ｌｙ６陽性細胞が多くなっていること
がわかる。従って、Ｌｙ６そのものおよびそれの関与す
るリンパ球活性化のメカニズムをより詳しく研究するこ
とは、リンパ球活性化を利用する抗ガン薬や抗感染症薬
の開発につながり、一方、Ｌｙ６の機能を抑制すること
による免疫抑制薬の開発につながることが期待できる。

しかしながら、マウスリンパ球のＬｙ６抗原に対応する
ヒトリンパ球の抗原は未だ同定されていない。このよう
な場合の一般的な手法である、マウス遺伝子をプローブ
とした対応するヒト遺伝子のハイブリダイゼーションに
よるクローニングの試みは成功していない。

本発明者らは、まず本発明者らが独自に作成したマウス
ＬＧＬ　（大顆粒リンパ球）に対する抗体の中から選ん
だモノクローナル抗体Ｆ４が、その免疫化学的解析から
マウスリンパ球抗原Ｌｙ６を認識する抗体であるとの確
信を得た。このことは後に、Ｂｒ１ａｎ　５ｅｅｄ法（
Ｂｒｉａｎ　５ｅｅｄ、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２９゜８
４０〜８４２　（１９８７）；　Ｂｒ１ａｎ　５ｅｅｄ
ら、　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、　８４．３３６５−
３３６９　（１９８７））により、Ｆ４抗体を足がかり
にして本発明者らによりクロニングされたｃＤＮＡが、
既知のＬｙ６（Ｌｙ６Ｃ１）の遺伝子であることを証明
することによって確認された。

そこで本発明者らは、第一段階として、前記のＦ４抗体
を用いて、ヒト末梢血リンパ球や各種ヒト白血病細胞株
をフローサイトメーターで解析してみたが、それらのど
の細胞もＦ４抗体とは特異的な結合性を示さなかった。

このことよりＦ４抗体は、マウスＬｙ６に対応するヒト
リンパ球抗原をクローニングするための手がかりにはな
らないことがわかった。

同時に本発明者らは、本発明者らのクローニングしたマ
ウスＬｙ６Ｃ１のｃＤＮＡをプローブとして、ヒト末梢
血リンパ球や各種ヒト白血病細胞株のｍＲＮＡをノザン
法によって解析したが、特異的な陽性信号は認められな
かった。また同時に、ヒト末梢血リンパ球や数種のヒト
白血病細胞株のｃＤＮＡライブラリーを、ラジオアイソ
トープラベルした前記マウスＬｙ６Ｃ２のｃＤＮＡをプ
ローブとしてハイブリダイゼーションによってスクリー
ニングしたが、特異的な陽性クローンは得られなかった
。このことから、マウスＬ１６のｃＤＮＡをプローブと
して用いるハイブリダイゼーション法による方法では、
マウスＬｙ６に対応するヒトのリンパ球抗原をクローニ
ングすることは、困難もしくは不可能であることがわか
った。

一方、ヒトリンパ球に対するモノクローナル抗体の中の
１種ＭＥＭ４３は、その認識する細胞および抗原の挙動
から、マウスＬｙ６に対応するリンパ球抗原を認識して
いるらしいという示唆がある（Ｓｔｅｆａｎｏｖａ、１
．ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、
　２６゜１５３−１６１　（１９８９））。

さらに、ヒトリンパ球細胞の細胞抽出画分をＭＥＭ４３
抗体を用いて精製することによって、均一な精製タンパ
ク質が得られ、そのタンパク質のＮ末端１７アミノ酸の
配列がＬＱＣＹＮＣＰＮＰＴＡＤＣＫＴＡＶであると報
告されている（上記文献）。

また最近、ＭＥＭ４３抗体の認識する抗原をＣＤ５９と
命名しようという提案がある（第４回Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ａｎｄ　Ｃｏｎｆｅｒ
ｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｉｌｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｌｏｎ、およびＳｔｅｐｈａ
ｎＳｈａｗ、　Ｎａｔｕｒｅ、　３３８．５３９−５４
０　（１９８９）参照）。これらの研究結果は、あくま
でもＭＥＭ４３抗体が認識する抗原が、マウスＬｙ６に
対応するヒトリンパ球抗原であるかも知れないという示
唆にすぎず、また、これらの過去の研究結果からは、Ｍ
ＥＭ４３抗体の認識するヒト抗原の特定化は極めて不十
分である。

［発明が解決しようとする課題］本発明はかかる状況に鑑み、マウスＬＶ６に対応する純
化されたヒトリンパ球抗原タンパク質と、それをコード
する遺伝子を取得することを目的とする。

［課題を解決するための手段］本発明者らは、第３図（ａ）に示したＭＥＭ４３抗体の
認識する抗原タンパク質のＮ末端アミノ酸配列に基づい
て、その遺伝子をクローニングすることによって全遺伝
子配列を明らかにし、同時に全アミノ酸配列を明らかに
することによってタンパク質としての全容を明らかにし
、これによってこのタンパク質が明らかにマウスＬｙ６
に対応するヒトリンパ球抗原であることが確認され、も
って本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、第
１図に示すアミノ酸配列を有するヒトリンパ球表面抗原
およびその同効物、さらにそれをコードする遺伝子を提
供するものである。

本発明の遺伝子配列の一例を第２図に示す。

以下、本発明の詳細な説明する。

プローブおよびプライマーとしてのＤＮＡオリゴマーは
、第３図（ａ）に基づいて、第３図（ｂ）（Ｃ）、（ｄ
）に示される３種類Ｌｙ６１、Ｌｙ２およびＬｙ３を合
成した。Ｌｙ６１は、アミノ酸配列をコードするｍＲＮ
Ａ鎖側の配列であり、Ｌｙ２とＬｙ３はｍ　ＲＮ　Ａに
相補な側の配列として合成した。図中、■はデオキシイ
ノシンを示し、■の相補鎖はＩとする。２種類の塩基を
タテに並べたものは混合物として合成した。

次に、種々のヒトリンパ球系細胞を培養し、通常の方法
でｍＲＮＡを含むＲＮＡ画分を抽出した。

用いた細胞は、次のとおりである。

ヒト末梢血リンパ球画分をＬＰＳ　（リポポリサッカラ
イド）で刺激したもの、ヒト扁桃腺リンパ球をＣｏｎＡ
　（コンカナバリンＡ）で刺激したもの、ヒト扁桃腺リ
ンパ球をＴＰＡ／ＰＨＡで刺激したもの、ヒト単球性白
血病細胞株Ｊ１１１、ヒト前骨髄性白血病細胞株ＨＬ６
０、ヒト急性骨髄性白血病細胞株ＫＧＩ、ヒト前付髄性
白血病細胞株ＭＬ　３　（Ｍｉｎｏｗａｄａ、Ｊ、　　
ｒＬｅｕｋｅｍｉａＪ　（Ｇｕｎｚ、Ｆ、　＆Ｈｅｎｄ
ｃｘｓｏｎ、Ｅ、編）　　ｐＩ）、１１９−１３９．　
　Ｇｒｕｎｅ　　＆　　５ｔｒａｔｔｏｎ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２））、ヒトＴ細胞白血病
細胞株ＲＰＭ　Ｉ　８４０２　（Ｓａｈａｉ　５ｒ１ｖ
ａｓｔｅｒｅ、　Ｊ、　Ｎａｔ、　Ｃａｎｅｃｒ　Ｉｎ
５ｔ、　５５．１１−１４　（１９７５））、ヒトリン
パ球性白血病細胞株Ｍｏ１ｔ４および扁桃腺リンパ球細
胞株ＢｅｃＩＩである。上記細胞株のうち、Ｊｌｌｌ、
ＨＬ６０、ＫＧＩ、Ｍｏ１ｔ４およびＢｅｃＩＩは、Ａ
ＴＣＣから人手可能である。

得られたＲＮＡをホルマリン含有ＲＮＡゲルで電気泳動
後、ナイロン膜にＲＮＡを移し、固定後、第３図（Ｃ）
、（ｄ）のＤＮＡオリゴ７−　Ｌ　ｙ　２とＬｙ３をラ
ジオアイソトープ標識したものをプローブとして、ノザ
ン解析を行なった。ヒト末梢血リンパ球画分およびＪｌ
ｌｌのＲＮＡにおいて、陽性信号が約９００塩基長、１
３００塩基長および１８００塩基長のところに認められ
た。従って、この２種の細胞は、Ｌｙ２およびＬｙ３Ｄ
ＮＡオリゴマーと相補的な配列を有するｍＲＮＡを合成
していることがわかったが、陽性信号が微弱なことから
、その量は通常のｍＲＮＡ、例えばβ−アクチンのｍＲ
ＮＡに比べて極めて微量であることが推定された。

まず、Ｂｒ１ａｎ　５ｅｅｄ法（前述文献）によって、
上記２種の細胞由来（末梢血リンパ球およびＪｌｌｌ）
のｍＲＮＡを出発物質としてｃＤＮＡライブラリーを作
製した。ライブラリーの大きさは（ライブラリーサイズ
）約５〜１０万であった。これらのライブラリー（ｃＤ
ＮＡがベクターにっながったプラスミドが宿主大腸菌に
入ったもの）を寒天培地にまき、通常の方法でオリゴマ
ーＬｙ２およびＬｙ３をプローブとして、コロニーハイ
ブリダイゼーション法でスクリーニングしたが、特異的
な陽性クローンは得られなかった。理由として、ライブ
ラリーの大きさに比して目的とするｍＲＮＡが少なすぎ
るために、目的クローンがｃ　ＤＮＡライブラリーの中
に含まれていないことが強く推定された。

そこで次に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ伸長連鎖反応、ポリ
メラーゼ・チエイン・リアクション）の手法を独自に修
飾して応用することにした。ＰＣＲの一般的な参照文献
としては、Ｅｒ１ｉｃｈ、Ｈ，Ａ、ら。

Ｎａｔｕｒｅ、　３３Ｌ　４８１−４６２　（１９８８
）が挙げられる。

ＰＣＲは、通常ある距離（遺伝子の長さ）を離れたとこ
ろに、明確な、既知の短い（１５〜２０塩基）配列が必
要であるが、本発明の目標タンパク質の遺伝子について
は、そのような配列は不明であり、単にＮ末端のアミノ
酸配列（１７アミノ酸）がわかっているだけである。

そこで、本発明者らは鋭意工夫をこらし、ＰＣＲ反応に
おける第１のプライマーとして複数オリゴマーの混合物
である第３図（ｂ）のオリゴマーＬｙ６１を、第２のプ
ライマーとして１５塩基からなるオリゴｄＴを用いた。

Ｔａｑポリメラーゼと、基質として４種の（Ａ。

Ｔ、Ｇ、Ｃ）デオキシヌクレオシド３リン酸を用い、鋳
型として前記２種の細胞（ＬＰＳ刺激した末梢血リンパ
球と７１１１）由来のｍＲＮＡ　　２μｇから、通常の
方法で合成した２本鎖ｃＤＮＡを用いて、パー牟ンエル
マー・シータス社のＰＣＲ反応装置を用いて、熱変性、
アニーリングおよび鎖伸長反応の４０サイクル反応を行
なった。

この反応混合物をアガロースゲル電気泳動したところ、
エチジウムブロマイド染色では明瞭なバンドは認められ
ず、特異的なバンドがどれかは不明であったが、ナイロ
ン膜に転写後、標識したＬｙ２オリゴマーをプローブと
してサザンハイプリダイゼーションを行なったところ、
約４００ｂｐ付近に明瞭な陽性バンドが認められた。そ
こで、この反応混合物を一度、ＤＮＡポリメラーゼ・フ
レノウ断片で反応させて、末端を平滑化処理した後、１
３ｒｉａｎ　５ｅｅｄ法で用いられるアダプター（ＤＮ
Ａオリゴマー２本）を結合させ、ＫＯＡｃ濃度勾配の超
遠心で分配した。分配フラクションをアガロースゲル電
気泳動、サザンハイプリダイゼーション法で分析し、標
識Ｌｙ２オリゴマーのプローブで陽性なフラクション（
分画）をＣＤＭ８ベクターにつなぎ、大腸菌ＭＣ１０６
１／Ｐ３に形質転換した。

こうして得られた形質転換体約１２万個（末梢血リンパ
球由来）と約１７万個（Ｊ　１１１由来）を、前記Ｌｙ
２オリゴマーをプローブとして通常のコロニーハイブリ
ダイゼーション法でスクリーニングしたところ、末梢血
リンパ球由来のものから２個、１１１１由来のものから
４個の陽性クローンが得られた。このうち、１個のクロ
ーン・Ｐｌを選び、ＤＮＡを通常の方法で取得してイン
サートを調べたところ、約３５０ｂｐであった。このイ
ンサートを切り出して精製し、このＤＮＡ断片をニック
トランスレーション法でラジオアイソトープ標識し、ハ
イブリダイゼーションで他の陽性クローンとの異同を見
たところ、他の陽性クローンと結合したので、これらの
クローンはすべてほぼ同じ配列を有していることが推定
された。

そこで、前記のクローンＰ１のＤＮＡ塩基配列解析を行
なった。得られた塩基配列を第２図に示した。第２図に
はＣＤＭ８のベクタ一部分およびアダプタ一部分を示さ
ず、インサート部分のみを示した。

第２図のＤＮＡ塩基配列を両方向から各３種のフレーム
でアミノ酸配列に翻訳したところ、第２図に示した方向
の第１フレームのみが長いオープンリーディングフレー
ムをつくった。そのアミノ酸配列を、ＤＮＡ塩基配列と
ともに第４図に示した。はじめの１６アミノ酸は、第３
図（ａ）に示したＭＥＭ４３をもとに精製され、決定さ
れたヒトリンパ球由来のタンパク質のＮ末端配列の１７
アミノ酸のうち、２番目から１７番目と全く同じであっ
た。従って、第１図と第４図に示されたアミノ酸配列は
、ＭＥＭ４３の認識するタンパク質のアミノ酸配列であ
ると結論できる。ＰＣＲ反応に用いたプライマー（オリ
ゴマーＬｙ６１）の合成の都合上、第４図のＤＮＡ配列
は第２番目のＱ（グルタミン）からはじまっているが、
その前にＬ（ロイシン）がついていることは前述のこと
から明らかなので、第４図の先頭（Ｑの前）にはＬを付
加して示した。

第１図および第４図に示したアミノ酸配列のタンパク質
は、以下に述べるいくつかの事実から、マウスＬｙ６抗
原に対応するヒトリンパ球抗原であることが結論される
。

■　Ｎ末端配列がＭＥＭ４３をもとに精製されたタンパ
ク質のＮ末端配列と完全に一致する。ＭＥＭ４３抗体を
用いた免疫化学的な、細胞および抗原の解析から、ＭＥ
Ｍ４３抗体の認識する抗原は、マウスＬｙ６に対応する
ヒトリンパ球抗原であるらしいことが示唆されている。

■　第５図に示したマウスＬｙ６Ｃ２ａのアミノ酸配列
と、約２５％（成熟ペプチド部分）の類似性があり、特
にＮ末端部分と中央部分でよ（似ている。大きさもほぼ
同じである。約２５％しかホモロジーがないことは、逆
にマウスのｃＤＮＡをプローブとしてヒトの遺伝子が同
定できなかったことをよく説明している。本発明のアミ
ノ酸配列とマウスＬｙ６Ｃ２ａのそれを並べ、マキシマ
ムマツチングさせたものを第５図に示した。

マウスＬｙ６Ｃ２ａの遺伝子配列は、米国ロスアラモス
研究所の遺伝子配列データバンクＬＡ　Ｓ　Ｌ　−Ｇｅ
ｎ　Ｂａｎｋに登録された配列（ＩＤ名：ＭＬＩＳＬＹ
６Ｃ２Ａ）からとり、それをアミノ酸配列に翻訳した。

第５図の下側に示したアミノ酸配列は成熟タンパク質を
示し、Ｌ（ロイシン）からはじまっている。マウスＬｙ
６Ｃ２ａの遺伝子配列の原報は、Ｐａ１ｆｒｅｅ、　Ｒ
，Ｇ、Ｅ、らによるＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆＩａ＋ｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ、　１４０．３０５−３１０　（１９８８）
である。

第５図に示したように、本発明のアミノ酸配列はＮ末端
にＬ（ロイシン）を加えると、マウスＬｙ６Ｃ２ａのア
ミノ酸配列と３３％の類似性を示す。また、Ｃ（システ
ィン）の数と配置がほとんど全く同じであり、このこと
は両タンパク質が同一の機能を有する類似体であること
を強（示唆する。

さらに、本発明のヒトタンパク質のアミノ酸組成では、
Ｄ（アスパラギン酸）とＥ（グルタミン酸）を加えたも
のは１１個であり、Ｋ（リジン）とＲ（アルギニン）と
Ｈ（ヒスタミン）を加えたものは８個である。一方、マ
ウスＬｙ６Ｃ２ａでは、ＤとＥの和は１０個、ＫとＲと
Ｈの和は９個であり、それぞれ酸性アミノ酸と塩基性ア
ミノ酸の比率は非常によく似ている。

加えて、両者のアミノ酸数も分子量も非常によく似てい
る。

■　本発明のタンパク質アミノ酸配列をＤｏｏ　ｌ　ｉ
　を法によって疎水性分布を示したものを第６図に、マ
ウスＬ”／６Ｃ２ａのそれを第７図に示した。

第６図と第７図かられかるように、両者は中央部の一部
を除いて非常に類似性が高く、とりわけＣ末端部分には
全く共通して強疎水性部分があり、これはホスファチジ
ルイノシトールアンカードプロティン（ＰＩアンカリン
グタンパク質）であることを強（示している。マウスＬ
ｙ６Ｃ２ａについては、このことは証明されており、従
って本発明のタンパク質もリンパ球表面抗原であること
が強く示唆される。この疎水性／！１１水性の解析は、
ソフトウェア開発■のＧＥＮＥＴＹＸプログラムを使用
した。

以上のことより、本発明のタンパク質およびその遺伝子
は、マウスリンパ球表面抗原Ｌｙ６に対応するヒトリン
パ球表面抗原であることが結論される。

本発明は、ヒトリンパ球におけるマウスＬｙ６に対応す
る表面抗原（ＣＤ５９と命名される）の完全な特定化を
含むものであり、それゆえに今後の開発研究の基礎とな
る重要な発明であると規定できる。マウスＬｙ６におい
ては、若干の配列の違いによる亜型を含むファミリーが
同定されており、従って、ヒトにおいてもそのようなも
のの同定は当然予測できることであり、本発明の遺伝子
配列は、そのための有力な手段となるものである。

従って当然のことながら、それらヒトＣＤ５９フアミリ
ー、すなわち同効物の遺伝子配列とアミノ酸配列も本発
明に含まれる。

例えば、本発明のタンパク質のＣ末端には、約２０個弱
の疎水性アミノ酸が並んでおり、これが細胞膜表面タン
パク質であるための要素となっているが、このＣ末端疎
水性領域をとったタンパク質を遺伝子組換え技術などの
手法によって人為的に調製すれば、ヒトＣＤ５９抗原を
介したリンパ球活性化を抑制することができる可能性も
ある。

このような応用展開は、本発明の記載するタンパク質と
なかんずくその遺伝子によって可能となる技術であるの
で、当然本発明の範囲に含まれる。

従って、本発明のヒトリンパ球表面抗原は、第１図に示
すアミノ酸配列を有するが、実質的にこれと同等の機能
を有するものであれば、アミノ酸配列の置換、欠失、挿
入があっても本発明に含まれる。

また、本発明で示されるリンパ球表面抗原は、マウスＬ
ｙ６の場合、リンパ球活性化に関与し、自己免疫疾患と
強く関連があることが知られているので、本発明はヒト
におけるＣＤ５９抗原の機能を科学的に解明し、またそ
れを工業的に利用する場合に、最も重要な材料を提供す
るものである。

すなわち、本発明のタンパク質をもとにして抗体（モノ
クローナル抗体を含む）を作成すれば、その抗体はリン
パ球機能の研究に重要な役割を果すと理解でき、同時に
その抗体を用いて自己免疫疾患のような免疫過剰応答の
診断に有用である。

また、その抗体がヒトリンパ球を活性化するものである
場合には、該抗体を抗がんあるいは抗感染症の治療に応
用することもでき、抗体がヒトリンパ球の機能を抑制す
るものである場合には、該抗体を免疫応答過剰疾患（自
己免疫疾患）の治療に応用することもできる。

［実　施　例］以下には実施例によって、本発明をさらに具体的に説明
する。

以下の実施例において、用いられた方法の一部は一般的
なものであり、次に示す装置にそれらの実験処方が詳し
く記載されている。

Ａｕ５ｕｂｃｌ　、Ｆ、Ｍ、ら編、　　’Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ″Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、
　１９８７年およびＭａｎｉａｔｉＳ、Ｔ、ら著、　　
’Ｍｏ１ｅ（Ｌｌｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａビＣｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２年
。

以下、実施例中では上述の装置を前述底置として引用す
る。

実施例１ｍＲＮＡの調製株化細胞Ｊｌｌｌ　（、ヒト単球性白血病細胞）の培養
は、１０％牛脂児血清を含むダルベツコＭＥＭ培地にラ
スイ社）で行なった。株化細胞ＨＬ６０（ヒト前骨髄性
白血病細胞’）　、ＫＧＩ　（ヒト急性骨髄性白血病細
胞）、ＭＬ３（ヒト前骨髄性白血病細胞）　、ＲＰＭＩ
　８４０２　（ヒトＴ細胞白血病細胞）、Ｍｏ１ｔ４（
ヒトリンパ芽球性白血病細胞）、およびＢｅｃＩＩ　（
扁桃腺リンパ球細胞）の培養は、１０％牛脂児血清と最
終濃度５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノールを含
むＲＰ　Ｍ１１６４０培地にラスイ社）で行なった。

ヒト末梢血リンパ球画分は、正常人より採血した後、ヘ
パリン処理した遠沈管での遠心を含む通常の方法で取得
したフィーコート分画の細胞を遠心分離により集め、Ｒ
ＰＭ１１６４０培地に懸濁し、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ
を加え、１５時間培養した。ヒト扁桃腺リンパ球は、通
常の方法で細胞を採取した後、ＲＰＭＩ　１６４０培地
に懸濁し、ＣｏｎＡ　（１０μｇ／ｍｌ）あるいはＴＰ
Ａ　：　ＰＨＡ　（５ｍｇ／ｍｌ　：　１％）を加え、
２０時間培養した。

細胞の培養は、すべてＣＯ２インキュベーターで行なっ
た。細胞に塩化リチウム／グアニジンチオシアネート溶
液（５０ｇのグアニジンチオシアネートを２５％の塩化
リチウム溶液５８ｍ１に融解し、０．４５μのフィルタ
ーで一過した後、２ｍｌの２−メルカプトエタノールを
加えたもの）を加え、得られた粘稠溶液を４０秒間２回
ポリトロンをかけ、染色体ＤＮＡを分断した。

この細胞ホモジネートを１／３量の５．７Ｍ塩化セシウ
ム（１００ｍＭのＥＤＴＡを含む）溶液の上に重層し、
３５．００Ｏｒｐｍで２０時間２０°Ｃで遠心した。遠
心管の底に沈殿した全ＲＮＡを、少量の塩化リチウム／
グアニジンチオシアネート溶液に溶かし、１／１０量の
３Ｍ酢酸ナトリウム溶液と２．５倍量のエタノールを加
え、−２０℃に一晩放置し沈殿させた。

ヒト末梢血リンパ球、ヒト扁桃、Ｊｌｌｌ、ＭＬ３、Ｋ
ＧＩ、ＨＬ６０については、続いて全ＲＮＡを常法に従
って、オリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィー
にかけてポリＡ　　ＲＮＡを選別収集した。

実験に使用した細胞数は以下のとおりである。

Ｊｌｌｌ：３Ｘ１０８細胞、ヒト末梢血リンパ球：１．
２Ｘ１０９細胞、ヒト扁桃：５×１０８細胞、ＭＬ３　
：　１．４Ｘ１０９細胞、ＫＧＩ：２×１０８細胞、Ｈ
Ｌ６０　：　３Ｘ１０Ｂ細胞、ＲＰＭＩ８４０２　：４
Ｘ１０７細胞、Ｍｏ１ｔ４：４×１０７細胞、Ｂｅ　ｃ
ＩＩ−５Ｘ１０７細胞。

実施例２ヒトＬｙ６ｍＲＮＡの検出（Ａ）ＤＮＡプローブの合成第３図（ａ）上に示したＭＥＭ４３抗体の認識する抗原
タンパク質のＮ末端アミノ酸配列に基づいて、第３図（
ｂ）〜（ｄ）に示した３種類のオリゴヌクレオチド（オ
リゴマー）Ｌｙ６１、Ｌｙ２、Ｌｙ３を合成した。Ｌｙ
２、Ｌｙ３はその相補鎖の配列を示した。

従って、実際に合成して使用したＤＮＡオリコマ−の配
列は、次のとおりである。

Ｌ　Ｖ　２　　　：　ＡＣＩＧＣＩＧＴＴＴＴＡＣＡＡ
ＴＣＩＧＣＩＧＴＩＧＧＡＴＴＣＧＧ　　　　　　　　
　Ｇノザンハイブリダイゼーションのプローブとしては、Ｌ
ｙ２とＬｙ３を用いた。５′水酸基をＴ４キナーゼとγ
（”２Ｐ）ＡＴＰを用いてリン酸化標識した。

（Ｂ）ノザンハイブリダイゼーション実施例１で得た全ＲＮＡ（１０〜２０μｇ）あるいはポ
リＡＲＮＡ（２〜５μｇ）をホルマリン含有１％アガロ
ースゲルで電気泳動後、ナイロン膜（アマジャム社“バ
イホントＮ”）に移した後、ゲルとの接触面を下にして
紫外線固定（２分３０秒間）した。プレハイブリダイゼ
ーションを４２°Ｃで１時間行なった後、ハイブリダイ
ゼーションも４２℃で１晩行なった。洗いも４２℃で行
なった。ハイブリダイゼーション溶液の組成は、５　ｘ
　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ、　５　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、　
０．　１％ＳＤＳ。

１００μｇ／ｍｌサケ***ＤＮＡ　（熱変性）、洗い液
は、２ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳである。これらの方法
は、前述底置に準じて行なった。

オートラジオグラフィーの結果、Ｌｙ２、Ｌｙ３の両プ
ローブでＪ１１１細胞のポリＡ　　ＲＮＡにおいて、約
９００塩基長、１３００塩基長、１８００塩基長のとこ
ろに陽性バンドが認められた。

Ｊ１１１細胞と比較すると非常に弱い信号であるが、ヒ
ト末梢血リンパ球のポリＡ　　ＲＮＡでも認められた。

他の細胞では検出できなかった。

実施例３ｅＤＮＡライブラリーの作製Ｊｌｌｌとヒト末梢血リンパ球より調製したポリＡ　　
ＲＮＡ５μｇを用いて、ブライアン争シード（Ｂｒｉａ
ｎ　５ｅｅｄ）の方法（前述文献）によりｃＤＮＡライ
ブラリーを作製した。２本鎖のｃ　ＤＮＡ合或は、ｃＤ
ＮＡ合成キット〔アマ−ジャム（Ａ［Ｉｌｅｒｓｈａｍ
）製〕を利用し、そのプロトコールに準じて行なった。

２本鎖ｃＤＮＡに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、リン
酸化されたアダプター（１２ｍｅｒ　：　ＣＴＴＴＡＧ
ＡＧＣＡＣＡおよび８［ｌ１ｅｒＣＴＣＴＡＡＡＧ）を
連結した。余分なアダプターと短いｃＤＮＡを取り除く
ために、５〜２０％酢酸カルシウム密度勾配遠心（５０
，００Ｏｒｐｍ。

２２°Ｃで３時間）を行なった。遠心管の底に注射針を
刺し、０．４ｍｌずつ分画した。６番目までの分画をＣ
ＤＭ８ベクター（Ｂｒ１ａｎ　５ｅｅｄ　　前述文献）
のＢｓｔ）（１部位に、Ｔ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガー
セニヨリ連結した。大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３株（前述
文献）を通常の方法で形質転換して得られたｃＤＮＡラ
イブラリーの大きさは、Ｊｌｌｌの場合約１０万、末梢
血リンパ球の場合約５万であった。

これらのライブラリーを実施例２で作成したＬｙ２とＬ
ｙ３ＤＮＡプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼ
ーション法でスクリーニングを行なった。プレートあた
り約２．０００個のコロニーが出るように組換え大腸菌
をまいた。各々のプレートについて、２枚のレプリカプ
レートを作製した。レプリカプレート上のコロニーを５
４１ペーパー〔ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎｎ）製〕に
移したあと、アルカリ変性、中和、洗いの操作を行ない
、プラスミドＤＮＡをフィルター上に固定した。プレハ
イブリダイゼーションを４２℃で１〜数時間行なった後
、ハイブリダイゼーションを４２℃で一晩行なった。洗
いも４２℃で行なった。これらの操作は、前述代書に準
じて行なった。

オートラジオグラフィーの結果、Ｌｙ２プローブ、Ｌｙ
３プローブとも非特異的な結合が強いことがわかった。

Ｊ１１１ライブラリーについては、約２０万個、ヒト末
梢血リンパ球ライブラリーについては、約５万個スクリ
ーニングを行なったが、特異的な陽性クローンは得られ
なかった。

実施例４ＰＣＲ法によるヒトＬ　ｙ　６　ｃ　ＤＮＡの増幅前述
のＪｌｌｌ、ヒト末梢血リンパ球（ＬＰＳ刺激）由来の
ポリＡ”ＲＮＡ　　１μｇより、ｃＤＮＡ合成キット（
前述）を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成した。合成したｃ
ＤＮＡの１／３ｆｆｉ（１００ｎｇ以上の２本鎖ｃＤＮ
Ａを含むものと推定した）を１回のＰＣＲ（ポリメラー
ゼ伸長連鎖反応、前述文献）実験に用いた。ＰＣＲ反応
における第１のプライマーとして第３図（ｂ）のオリゴ
マーＬｙ６１を、第２のプライマーとしてオリゴｄＴ（
１５ｍｅｒ）を用いた。反応液組成は次のとおりである
。

ＤＮＡサーマルサイクラ−ＰＪｌｏｏＯ（パーキンエル
マー・シータス社）を用いて、熱変性９４°Ｃ：１分、
アニーリング４０℃：２分、鎖伸長反応７２℃＝３分の
条件で４０サイクル反応を行なった。

この反応混合物の１１５量を、１％アガロースゲル電気
泳動したところ、エチジウムブロマイド染色では明瞭な
バンドは認められなかった。ゲルをアルカリ変性３０分
間、中和１５分間の２回行なった後、ナイロン膜〔アマ
ジャム・ハイボンドＮ　（Ａｍａｓｈａｍ、　１ｌｙｂ
ｏｎｄ　Ｎ）　）にＤＮＡを転写し、紫外線で固定（２
分３０秒間）した。実施例２で合成したＬｙ２オリゴマ
ーをプローブとしてサザンハイプリダイゼーションを行
なった。この操作は、前述代書に準じて行なった。プレ
ハイブリダイゼーションを４２℃で１〜数時間行なった
後、ハイブリダイゼーションを４２℃で１晩行なった。

洗いも４２℃で行なった。オートラジオグラフィーの結
果、約４００塩基長付近に明瞭なバンドが認められた。

反応混合物の残り４１５量を、フェノール：クロロホル
ム（１：　１）処理２回、クロロホルム処理１回した後
、エタノール沈殿を行ないＤＮＡを回収した。このＤＮ
Ａの１１５量を用いて、前述と同じ反応組成、反応条件
でさらに４０サイクルの反応を行なったところ、サザン
ハイプリダイゼーションで陽性バンドの増加が認められ
た。

実施例５Ｌｙ２プローブと交叉するｃＤＮＡのクローニング　　
７実施例４で得られた反応混合物（４０サイクル２回）を
フェノール：クロロホルム（１：　１）処理２回、クロ
ロホルム処理１回を行なった後、エタノール沈殿を行な
いＤＮＡを回収した。ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ断
片）処理を２２℃で３０分間行ない末端を平滑化した。

実施例３で使用したものと同じリン酸化アダプターをＴ
４ＤＮＡリガーゼにより連結した（１６℃、−晩）。余
分なアダプターとＰＣＲ反応に用いたプライマーを取り
除くために、酢酸カリウム密度勾配超遠心（前述）を行
なった。前述のように０．４ｍｌずつ１２フラクシヨン
に分配した。各々の１／１０量を１％アガロースゲル電
気泳動し、標識Ｌｙ２オリゴマーをプローブとしてサザ
ンハイプリダイゼーション（前述）を行なった。オート
ラジオグラフィーの結果、Ｊｌｌｌの場合も末梢血リン
パ球の場合も８番目のフラクションに陽性バンド（約４
００塩基長）が認められた。

８番目のフラクションからエタノール沈殿によりＤＮＡ
を回収し、このＤＮＡをＣＤＭ８ベクター（前述）のＢ
ｓｔＸ１部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結した（１
６℃、−晩）。大腸菌ＭＣｌ０６１／Ｐ３　（前述）を
通常の方法で形質転換したところ、Ｊｌｌｌの場合約１
２万個、末梢血リンパ球の場合約１７個の形質転換体が
得られた。

各々のライブラリー約２，５００個について、前述のＬ
ｙ２オリゴマーをプローブとしてコロニーハイブリダイ
ゼーション法（前述文献）でスクリーニングしたところ
、Ｊ１１１由来４個（Ｊ−２、Ｊ−６、Ｊ−７、Ｊ−９
）、末梢血リンパ球由来２個（Ｐ−１、Ｐ−２）の陽性
クローンが得られた。このうち１個のクローンＰ−１を
選び、ＤＮＡを前述底置に準じて取得した。このＤＮＡ
をＸｈｏ　Ｉで切断し、インサートｃＤＮＡの長さを調
べたところ、約３５０塩基長であった。このインサート
を切り出しシーンクリーン〔バイ第１０１　（Ｂｉｏ　
１０１）社製）で精製した。ＤＮＡ断片をニックトラン
スレーション法でα（３２Ｐ）ＣＴＰで標識した。この
操作は、前述底置に準じて行なった。この標識ＤＮＡ断
片をプローブとしてノ１イブリダイゼーション（プレハ
イブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション６５℃
、洗い５０℃）で他の陽性クローンとの異同を調べたと
ころ、他の陽性クローンと結合した。それゆえに、これ
らのクローンはすべてほぼ同じ配列を有していることが
推定された。

実施例６ｃＤＮＡクローンの塩基配列の決定ＣＤＭ８ベクターのシーフェンス用プライマー（５’　
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ３’５’　　ＣＴ
ＴＣＡＣＡＡＡＧＡＴＣＣＴＣＴ３”）を用い、デオキ
シ−７−ジアザグアニントリホスフェートを用いたジデ
オキシ法で配列解析を行なった。

得られた塩基配列を第２図に示した。ＰＣＲ反応に使用
したＬｙ６１プライマーの配列に続いてＬｙ２プローブ
に対応する配列があり、これらはＭＥＭ４３が認識する
抗原タンパク質のＮ末端アミノ酸配列より推定される塩
基配列（第３図（ａ））のうちの１種と一致していた。

また、塩基配列に対応する翻訳アミノ酸配列は第１図に
示すとおりで、グルタミン酸からバリンまで１６アミノ
酸が完全に一致していた。

［発明の効果］本発明によって得られたｃＤＮＡをプローブとして用い
ることにより、マウスのように類似遺伝子からなるファ
ミリーが存在するかどうか、またリンパ球活性化とどの
ように関わっているか、また自己免疫疾患などの免疫過
剰と関連があるかどうかなど、ヒトの免疫系の研究にと
って重要な進展がなされることが期待できる。また同時
に、本発明のヒトリンパ球抗原を、例えばそれに対する
特異的抗体を作成するなどの方法によって、抑制するこ
とによる自己免疫疾患治療薬や、活性化することによる
抗ガン薬、抗感染症薬の開発につながることが期待でき
る。すなわち、本発明によってはじめてマウスＬｙ６に
対応するヒトリンパ球抗原の研究および工業的応用の可
能性が大きく開けるといえる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のヒトリンパ球表面抗原のアノ酸配列
を、第２図は、それをコードする遺伝子配列の１例を示
す。第３図（ａ）は、ＭＥＭ４３抗体が認識する抗原タンパ
ク質のＮ末端アミノ酸配列および該アミノ酸配列を指定
しうるＤＮＡ配列を示し、第３図（ｂ）、（ｃ）、（ｄ
）は、本発明で用いた合成オリゴマーＬｙ６１、Ｌｙ２
、Ｌｙ３の配列を示す。タテに並んだものは核酸塩基の
混合物を、■はデオキシイノシンを示す。第４図は、本発明のヒトリンパ球表面抗原のアミノ酸配
列を、その遺伝子配列とともに示したものである。第５図は、本発明のアミノ酸配列とマウスＬｙ６Ｃ２ａ
のアミノ酸配列をマキシマムマツチングさせたものであ
る。図中＊印は一致するアミノ酸配列を、十印はシステ
ィンを示す。第６図は、本発明のアミノ酸配列のＤｏｏ　ｌ　ｉ　を
法による疎水性分布を示すものであり、第７図は、同法
によるマウス６Ｃ２ａの疎水性分布を示すものである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記のアミノ酸配列を有するヒトリンパ球表面抗
原およびその同効物。Ｌｅｕ＿１ＧｌｎＣｙｓＴｙｒＡｓｎＣｙｓＰｒｏＡｓ
ｎＰｒｏＴ＿１ｈ＿０ｒＡｌａＡｓｐＣｙｓＬｙｓＴｈ
ｒＡｌａＶａｌＡｓｎＣｙｓＳ＿２ｅ＿０ｒＳｅｒＡｓ
ｐＰｈｅＡｓｐＡｌａＣｙｓＬｅｕＩｌｅＴｈｒＬ＿３
ｙ＿０ｓＡｌａＧｌｙＬｅｕＧｌｎＶａｌＴｙｒＡｓｎ
ＬｙｓＣｙｓＴ＿４ｒ＿０ｐＬｙｓＰｈｅＧｌｕＨｉｓ
ＣｙｓＡｓｎＰｈｅＡｓｎＡｓｐＶ＿５ａ＿０ｌＴｈｒ
ＴｈｒＡｒｇＬｅｕＡｒｇＧｌｕＡｓｎＧｌｕＬｅｕＴ
＿６ｈ＿０ｒＴｙｒＴｙｒＣｙｓＣｙｓＬｙｓＬｙｓＡ
ｓｐＬｅｕＣｙｓＡ＿７ｓ＿０ｎＰｈｅＡｓｎＧｌｕＧ
ｌｎＬｅｕＧｌｕＡｓｎＧｌｙＧｌｙＴ＿８ｈ＿０ｒＳ
ｅｒＬｅｕＳｅｒＧｌｕＬｙｓＴｈｒＶａｌＬｅｕＬｅ
ｕＬ＿９ｅ＿０ｕＶａｌＴｈｒＰｒｏＰｈｅＬｅｕＡｌ
ａＡｌａＡｌａＴｒｐＳ＿１ｅ＿０ｒ＿０ＬｅｕＨｉｓ
Ｐ＿１ｒ＿０ｏ＿３
（２）請求項（１）記載のヒトリンパ球表面抗原または
その同効物をコードする遺伝子。（３）下記の塩基配列
を有する請求項（２）記載の遺伝子。ＣＡＧＴＧＣＴＡＣ＾１Ａ＾０ＡＣＴＧＴＣＣＴＡ＾２
Ａ＾０ＣＣＣＡＡＣＴＧＣ＾３Ｔ＾０ＧＡＣＴＧＣＡＡ
Ａ＾４Ａ＾０ＣＡＧＣＣＧＴＣＡ＾５Ａ＾０ＴＴＧＴＴ
ＣＡＴＣ＾６Ｔ＾０ＧＡＴＴＴＴＧＡＴ＾７Ｇ＾０ＣＧ
ＴＧＴＣＴＣＡ＾８Ｔ＾０ＴＡＣＣＡＡＡＧＣ＾９Ｔ＾
０ＧＧＧＴＴＡＣＡ＾１Ａ＾０Ｇ＾０ＴＧＴＡＴＡＡＣ
＾１Ａ＾１Ａ＾０ＧＴＧＴＴＧＧＡ＾１Ａ＾２Ｇ＾０Ｔ
ＴＴＧＡＧＣＡ＾１Ｔ＾３Ｔ＾０ＧＣＡＡＴＴＴＣ＾１
Ａ＾４Ａ＾０ＣＧＡＣＧＴＣＡ＾１Ｃ＾５Ａ＾０ＡＣＣ
ＣＧＣＴＴ＾１Ｇ＾６Ａ＾０ＧＧＧＡＡＡＡＴ＾１Ｇ＾
７Ａ＾０ＧＣＴＡＡＣＧＴ＾１Ａ＾８Ｃ＾０ＴＡＣＴＧ
ＣＴＧ＾１Ｃ＾９Ａ＾０ＡＧＡＡＧＧＡＣ＾２Ｃ＾０Ｔ
＾０ＧＴＧＴＡＡＣＴ＾２Ｔ＾１Ｔ＾０ＡＡＣＧＡＡＣ
Ａ＾２Ｇ＾２Ｃ＾０ＴＴＧＡＡＡＡＴ＾２Ｇ＾３Ｇ＾０
ＴＧＧＧＡＣＡＴ＾２Ｃ＾４Ｃ＾０ＴＴＡＴＣＡＧＡ＾
２Ｇ＾５＾Ａ０ＡＡＡＣＡＧＴＴ＾２Ｃ＾６Ｔ＾０ＴＣ
ＴＧＣＴＧＧ＾２Ｔ＾７Ｇ＾０ＡＣＴＣＣＡＴＴ＾２Ｔ
＾８Ｃ＾０ＴＧＧＣＡＧＣＡ＾２Ｇ＾９Ｃ＾０ＣＴＧＧ
ＡＧＣＣ＾３Ｔ＾０Ｔ＾０ＣＡＴＣＣＣＴＡ＾３Ａ＾１
Ｇ＾０ＴＣＡＡＣＡＣＣ＾３Ａ＾２Ｇ＾０ＧＡＧＡＧＣ
ＴＴ＾３Ｃ＾３Ｔ＾０ＣＣＣＡＡＡ＾３＾４＾０