JPH07504813A - 新規蛋白質チロシンキナーゼ類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規蛋白質チロシンキナーゼ類 発明の背景 細胞の増殖および分化を調節するシグナルの伝達は、部分的に、種々の細胞蛋白 質のホスホリル化によって調節されている。蛋白質チロシンキーナーゼ類はこの ような過程を触媒する酵素である。更に、それらの多くは成長因子レセプタとし て働く。

発明の要約 本発明は、ヒト巨核球およびリンパ球細胞内に存在している新規な蛋白質チロシ ンキナーゼ遺伝子、これらの遺伝子がコード化する蛋白質、これらのコード化さ れた蛋白質に特異的な抗体、これらの遺伝子にハイブリッド形成するＲＮＡ核酸 配列、並びにそれらの使用方法に関する。

本明細書に記述する如く単離した遺伝子を、集合的に、蛋白質チロシンキナーゼ （ｐＴＫ）遺伝子と呼ぶ。本明細書に考察する如く単離した上記遺伝子の核酸配 列は、成長因子レセプタとして機能する細胞外ドメインを含んでいる、既に同定 されている蛋白質チロシンキナーゼ類に有意な相同性を示す。これらのｐＴＫ遺 伝子は目積球およびリンパ球両方の細胞内に存在していることが示された。

本発明のｐＴＫ遺伝子は、蛋白質チロシンキナーゼ活性を示すＣ−キラ）（ｃ− ｋｉｔ）サブグループの成長因子レセプタ類の一員に有意な配列相同性を示す。

このＣ−キットサブグループのレセプタチロシンキナ（Ｕｌ　ｌ　ｒ　ｉｃｈ、 　Ａ、およびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｊ、　、Ｃｅ１１．６１　：　２０３ 　（１９９０）。このＣ−キットサブグループの一員には、ＦＬＴ／ＦＬＫ　（ 胎児肝臓キナーゼ）　、ＦＧＦ　（線維芽細胞成長因子レセプタ）およびＮＧＦ 　（神経成長因子レセプタ）が含まれる。

特に、１４種のｐＴＫ遺伝子を同定した。５ＡＬ−３１および５ＡＬ−Ｄ４と呼 ぶ２種のｐＴＫ遺伝子（また、目積球由来ＦＧＦ様レセプタチロシンキナーゼと も呼ぶ）を目積球細胞内で同定した。ＬｐＴＫ類と呼ぶ５種のｐＴＫ遺伝子をリ ンパ球細胞内で同定し、そしてこれらは同様に目積球内にも存在していることが 示された。ＨｐＴＫと呼ぶ１種のｐＴＫ遺伝子をヒト肝癌細胞内で同定した。ｂ ｐＴＫ遺伝子と呼ぶ６種のｐＴＫ遺伝子がヒト脳組織内で見付かった。

５ＡＬ−３１はＦＬＴ／ＦＬＫ系群（ファミリー）のｐＴＫに関係している。５ ＡＬ−Ｄ４はＦＧＦレセプタ系群（ファミリー）のｐＴＫに関係しており、そし て１種のＬｐＴＫ　（ＬｐＴＫ３）はＮＧＦレセプタ系群（ファミリー）のｐＴ Ｋに関係している。

２組の変性オリゴヌクレオチドプライマーを用いて本発明の主題であるｐＴＫ遺 伝子を同定したが、その１番目の組は、全てのｐＴＫ　ＤＮＡ配列（配列同定番 号：１−２）を増幅するものであり、そして２番目の組は、Ｃ−キットサブグル ープのｐＴＫの触媒ドメイン内に存在している高度に保存されている配列（配列 同定番号：　３−４）を増幅するものである。このようにして同定したｐ　Ｔ　 Ｋ遺伝子を以下に記述する。

５ＡＬ−３１は、いくつかの目積球細胞系内で発現するが、赤芽球細認された。

この単離したＤＮＡフラグメントは、ＦＬＴ／ＦＬＫ系群（ファミリー）の公知 蛋白質チロシンキナーゼ類に有意な配列相同性を示すアミノ酸配列（配列同定番 号；６）をコードしていた。この全長遺伝子配列（配列同定番号：１７）は、６ ８２７個の塩基対（ｂ、ｐ、　）を含んでおり、そしてその推定アミノ酸配列（ 配列同定番号＝１８）は３４９個の残基を含んでいる。

目積球細胞内でも発現する５ＡＬ−Ｄ４は、１４１個の塩基対から成るヌクレオ チド配列を含んでいるＤＮＡフラグメントである（配列同定番号ニア）。この単 離したＤＮＡフラグメントは、ＦＧＦレセプタ系群（ファミリー）の公知蛋白質 チロシンキナーゼに有意な配列相同性を示すアミノ酸配列（配列同定番号：８） をコード化した。

ＬｐＴＫ２、ＬｐＴＫ３、ＬｐＴＫ４およびＬｐＴＫ１３およびｔ、ｐＴＫ２５ を含むＬｐＴＫ類は、リンパ球細胞内で発現すると共に目積球細胞内で発現する 。このＬｐＴＫ３遺伝子のヌクレオチド配列（１５１個の塩基対）を入手しく配 列同定番号：１１）、そしてこれはＮＧＦレセプタ系群（ファミリー）の公知蛋 白質チロシンキナーゼ類に有意な相同性を示した。これらのＬｐＴＫ２、ＬｐＴ Ｋ４およびＬｐＴＫ１３遺伝子のヌクレオチド配列は、それぞれ１４９個の塩基 対（配列同定番号＋９）、１３７個の塩基対（配列同定番号：１３）および２１ １個の塩基対（配列同定番号：１５）を含んでいた。ＬｐＴＫ２５は３１２０個 の塩基対から成るヌクレオチド配列を有している（配列同定番号：２２）。７６ ０６個の塩基対を含んでいるＬｐＴＫ２　（配列同定番号：１９）号：２１）。

ヒト肝癌細胞内で発現するＨ　ｐ　Ｔ　Ｋ　５遺伝子は、３１２０個の塩基対か ら成るヌクレオチド配列を有している（配列同定番号＝２２）。ｂｐＴＫＩ、ｂ ｐＴＫ２、ｂｐＴＫ３、ｂｐＴＫ４、ｂｐＴＫ５およびｂｐＴＫ７を含むｂｐＴ Ｋ類のヌクレオチド配列は、ヒト脳組織内で発現し、そしてそれぞれ配列同定番 号：　２５−３０のアミノ酸配列を有する蛋白質をコード化する。

従って、本発明は、ヒト巨核球細胞系から単離したＤＮＡを包含しており、これ は、Ｃ−キットサブグループの蛋白質チロシンキナーゼ類の触媒ドメイン内の高 度に保存されているアミノ酸配列をコード化するＤＮＡにハイブリッド形成する ＤＮＡフラグメントにハイブリッド形成する。

本発明はまた、Ｃ−キットサブグループのｐＴＫ類の一員（即ちＦＬＴ／ＦＬＫ 　（ＳＡＬ−３１）　、ＦＧＦレセプタ（ＳＡＬ−Ｄ４）またはＮＧＦレセプタ （ＬｐＴＫ類））に有意な配列相同性を示す、本明細書に記述する如く同定した ｐＴＫ遺伝子がコード化する蛋白質、並びに■４ｐＴＫ５およびｂｐＴＫ類がコ ード化する蛋白質も包含している。本発明はまた、５ＡＬ−３１，５ＡＬ−Ｄ４ 、並びにＬｐＴＫ、ＨｐＴＫおよびｂｐＴＫ同族体または相当物（即ちチロシン キナーゼ活性を示す、５ＡＬ−Ｓｌ、５ＡＬ−Ｄ４、ＬｐＴＫ類、ＨｐＴＫおよ びｂｐＴＫ類のそれと本質的に同様なアミノ酸配列を有しているがそれとは同じ でなおよびｂｐＴＫ配列よりも短いペプチド類（ＳＡＬ−８ｔ、５ＡＬ−Ｄ４、 ＬｐＴＫ、ＨｐＴＫおよびｂｐＴＫフラグメント）　、５ＡＬ−３ｌ、５ＡＬ− ０４、ＬｐＴＫ類、Ｉ−Ｉ　ｐ　Ｔ　ＫおよびｂｐＴＫ類に特異的なモノクロー ナルおよびポリクローナル抗体、並びに５ＡＬ−８ｔ、５ＡＬ−Ｄ４、ＬｐＴＫ 類、ＨｐＴＫおよびｂｐＴＫ類の核酸配列そして５ＡＬ−３Ｌ、５ＡＬ−Ｄ４、 ＬｐＴＫ、ＨｐＴＫおよびｂｐＴＫ相当物の使用も包含している。

本発明は更に、Ｃ−キットサブグループ内に含まれているＦＬＴ／ＦＬＫ、ＦＧ ＦレセプタまたはＮＧＦレセプタ系群（ｆａａ＋１ｌｙ）の蛋白質チロシンキナ ーゼ類に有意な配列相同性を示す、本明細書に記述する蛋白質をコード化するＤ ＮＡまたはＲＮＡにハイブリッド形成する核酸配列も包含している。上記核酸配 列は、他のを推動物、特に哺乳動物および池の細胞型内に存在しているｐＴＫ遺 伝子を同定するためのプローブとして有効性を示す。これらはまた、インビトロ およびインビボ両方において、蛋白質チロシンキナーゼ活性を阻害するアンチセ ンスオリゴヌクレオチド類として用いられ得る。

本発明の５ＡＬ−８１，５ＡＬ−Ｄ４、ＬｐＴＫ、ＨｐＴＫおよびｂｐＴＫチロ シンキナーゼ類は、細胞の増殖、分化および他の代謝機能を調節する薬剤および 治療剤の開発に関連して標的蛋白質として用いられ得る。これらの５ＡＬ−５１ ，５ＡＬ−Ｄ４、ＬｐＴＫ、ＨｐＴＫまたはｂｐＴＫ蛋白質は、池のチロシンキ ナーゼ類に対する作動薬または拮抗薬として用いられ得る。これらの５ＡＬ−８ １、Ｓ　Ａ　Ｌ　−Ｄ　４、ｉ、ｐＴＫＳＨｐＴＫまたはｂｐＴＫチロシンキナ ーゼ類はまた、目積球およ化因子を検出するスクリーニングアッセイで用いられ 得る。標準的実験室技術を用いて、本発明のｐＴＫ類のりカントを同定すること ができる。

同定した後、細胞内に内因的に存在している上記リガンド、並びに細胞外液内に 外因的に存在している上記リガンドを検出するアッセイを設計することができる 。血液および尿の如き体液内に存在している上記リガンドを検出する診断補助と してまたアッセイを設計することができる。

図の簡単な説明 図１は、５ＡＬ−５Ｌのヌクレオチド配列（配列同定番号・５）およびそれの推 定アミノ酸配列（配列同定番号＝６）を表している。

図２は、ＳＡＬ−０４のヌクレオチド配列（配列同定番号、７）およびそれの推 定アミノ酸配列（配列同定番号：８）を表している。

図３Ａは、ＬｐＴＫ２に関するヌクレオチド配列（配列同定番号：９）およびそ れの推定アミノ酸配列（配列同定番号、１０）を表している。

図３Ｂは、ＬｐＴＫ３に関するヌクレオチド配列（配列同定番号：１１）および それの推定アミノ酸配列（配列同定番号：１２）を表している。

図３０は、ＬｐＴＫ４に関するヌクレオチド配列（配列同定番号：１３）および それの推定アミノ酸配列（配列同定番号：１４）を表している。

図３Ｄは、ＬｐＴＫ１３に関するヌクレオチド配列（配列同定番号：いる。

図４Ａ−４Ｊは、５ＡＬ−３１に関する全長ヌクレオチド配列（配列同定番号＝ １７）およびそれの推定アミノ酸配列（配列同定番号：１８）を表している。

図５Ａ−５Ｊは、ＬｐＴＫ２に関する全長ヌクレオチド配列（配列同定番号　１ ９）および推定アミノ酸配列（配列同定番号＝２０）を表している。

図６は、ＬｐＴＫ４に関する部分ヌクレオチド配列（配列同定番号：２１）を表 している。

図７Ａ−７Ｄは、ＬｐＴＫ２５に関する全長ヌクレオチド配列（配列同定番号： ２２）を表している。

図８Ａ−８Ｆは、ＩＩｐＴＫ５に関する全長ヌクレオチド配列（配列同定番号： ２３）および推定アミノ酸配列（配列同定番号：２４）を表している。

図９は、ｂｐＴＫｌのアミノ酸配列（配列同定番号＝２５）を表している。

図１０は、ｂｐＴＫ２のアミノ酸配列（配列同定番号：２６）を表している。

図１１は、ｂｐＴＫ３のアミノ酸配列（配列同定番号、２７）を表している。

図１２は、ｂｐＴＫ４のアミノ酸配列（配列同定番号：２８）を表している。

図１３は、ｂｐＴＫ５のアミノ酸配列（配列同定番号、２９）を表し新規な蛋白 質チロシンキナーゼ遺伝子を同定し、それらの核酸配列を決定し、そしてそのコ ード化した蛋白質のアミノ酸配列を推定した。本明細書に記述する如く単離した 遺伝子を、集合的に、蛋白質チロシンキナーゼ（ｐＴＫ）遺伝子と呼ぶ。本明細 書で考察する如く単離した上記遺伝子の核酸配列は、成長因子レセプタとして機 能する細胞外ドメインを含んでいる、以前に同定した蛋白質チロシンキナーゼ類 に有意な相同性を示す。これらの遺伝子は目積球およびリンパ球両方の細胞内に 存在していることが示された。

これらの新規ｐＴＫ類の単離および同定を容易にする目的で、実施例の中に記述 する如き２組のＤＮＡプローブを用いた。その１番目の組は、２種の変性オリゴ ヌクレオチド配列ｐＴＫ１　（配列同定番号＝１）およびｐＴＫ２　（配列同定 番号：２）から成っていた（Ｍａｔｔｈｅｗｓ。

Ｗ、、Ｃｅｌ　１　６５．：１１４３　（１９９１）；Ｗｉ　ｌｋｓ、Ａ、Ｆ、 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６：１６０３　（１９８ ９））。これらの配列をポリメラーゼ連鎖反応のプライマーとして用いてチロシ ンキナーゼのＤＮＡセグメントの増幅を行った（Ｍｕｌｌｉｓ、に他、Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、Ａｄｖａｎ、　Ｂｉｏｌ、　、５１ ：２６３　（１９８６）。

２番目の組は、Ｃ−キット系群（ファミリー）の蛋白質チロシンキナーゼ類が有 する触媒ドメインの高度に保存されている領域をコード化すから成っていた。こ れらの配列を第二ラウンドのＤＮＡ増幅におけるポリメラーゼ連鎖反応のプライ マーとして用いた。このような２段階の増幅操作を用いて、上記ｐＴＫプライマ ー類にハイブリッド形成するＤＮＡフラグメントを同定し、単離した後、配列決 定を行つた。

特に、Ｃ−キットサブグループの蛋白質チロシンキナーゼ類に有意な相同性を示 す１４種のｐＴＫ遺伝子を同定した。５ＡＬ−８１および５ＡＬ−Ｄ４と呼ぶ２ 種のｐＴＫ遺伝子（また、目積球由来ＦＧＦ様レセプタとも呼ぶ）を、ＣＭＫＩ Ｉ−５、ＤＡＭＩ、ＵＴ−７、およびエリトロポイエチン内で増殖するＵＴ−７ を含むいくつかの目積球細胞系内で同定したが、赤芽球細胞系１１ＥＬ、ＰＭＡ 刺激ＨＥＬ細胞またはに５６２内では同定されなかった。ＬｐＴＫ類と呼ぶ５種 のｐＴＫ遺伝子を、リンパ球細胞内で同定すると共に目積球内でも同定した。Ｈ ｐＴＫ５と呼ぶ１種のｐＴＫ遺伝子をヒト肝癌細胞内で同定し、そしてｂｐＴＫ 類と呼ぶ６種のｐＴＫ遺伝子をヒト脳組織内で同定した。

核酸配列同定番号５および１７がコード化する５ＡＬ−３Ｌ　（配列同定番号＝ ６および１８）は、ＦＬＴ／ＦＬＫ系群（ファミリー）のｐＴＫ類に有意な相同 性を示す。配列同定番号＝７がコード化する５ＡＬ−Ｄ４（配列同定番号：８） は、ＦＧＦレセプタ系群（ファミリー）のｐＴＫ類に関係しており、そして配列 同定番号：１１がコード化する１種のＬｐＴＫ　（ＬｐＴＫ３　（配列同定番号 ：１２））は、ＮＧＦレセプタ系群（ファミリー）のｐＴＫ類に関係してる。そ の残りのＬｐＴＫ類であるところの、配列同定番号＝９がコード化するＬｐＴＫ ２　（配列同定列同定番号二１６）、配列同定番号＝２２がコード化するＬｐＴ Ｋ２５もまた、公知蛋白質チロシンキナーゼ類に配列相同性を示す（データは示 していない）。

配列同定番号＝２３がコード化する）（ｐＴＫ５　（配列同定番号：２４）およ びｂｐＴＫ類１．２．３．４．５および７（配列同定番号＝２５−３０）もまた 、それぞれ公知蛋白質チロシンキナーゼ類に配列相同性を示す。

従って、上述したように、Ｃ−キットサブグループの蛋白質チロシンキナーゼ類 の蛋白質チロシンキナーゼの触媒ドメイン内に存在しているアミノ酸配列をコー ド化するＤＮＡにハイブリッド形成するＤＮＡを単離し、そして配列決定を行っ た。ｐＴＫ遺伝子と集合的に呼ぶこれらの単離したＤＮＡ配列（並びにそれらの 推定アミノ酸配列）は、レセプタチロシンキナーゼ系群（ファミリー）の公知− 員に有意な配列相同性をホすることが示された。

単離した後、ＰＣＲの如き公知標準技術を用いてこれらのＤＮＡフラグメントの 増幅を行うことができる。次に、これらの増幅させたフラグメントを適当なりロ ーニングベクターにクローン化して、それらのＤＮＡ配列を決定することができ る。

これらのクローニングベクターからＤＮＡ配列を切除し、３２ｐの如き放射能標 識ヌクレオチドで標識した後、これらを用いて適当なｃ　ＤＮＡライブラリーを スクリーニングすることによって、全長ｃＤＮＡクローンを得ることができる。

例えば組換え技術などを用いて作り出したｐ　Ｔ　Ｋ遺伝子、並びに化学的に合 成したｐＴＫ遺伝子も包含することを意図している。

これらのｐＴＫ遺伝子の推定アミノ酸配列には、Ｃ−キットサブグループのチロ シンキナーゼ類の蛋白質チロシンキナーゼ類の触媒ドメインに有意な相同性を示 すペプチド類をコード化するアミノ酸配列が含まれる。これらのｐＴＫ遺伝子が コード化するこれらの蛋白質には、サイレント変化をもたらす、即ち変化が表現 型的に検出されないところの、その配列内の残基を機能的に相当するアミノ酸残 基で置換した配列が含まれ得る。例えば、その配列内に存在している１個以上の アミノ酸残基を、機能相当物として働く同様な極性を示す別のアミノ酸で置換す る結果として、サイレント置換をもたらすことができる。

加うるに、そのペプチドに所望の機能的チロシンキナーゼ特性を有意に損わせる ことのない、その配列内に存在している１個以上のアミノ酸残基に関する欠失、 付加、転置、挿入または置換を行うことによって、その蛋白質構造の修飾を行う ことができる。

組換えＤＮＡ技術、例えば上記蛋白質をコード化するｃＤＮＡ含有ベクターから の切除によるか、或は所望蛋白質をコード化するＤＮＡを公知技術により機械的 および／または化学的に合成することによって、レセプタチロシンキナーゼ活性 を示す本発明の修飾ｐＴＫ類を作り出すことができる。

本発明のｐＴＫ類を作り出す代替アプローチは、ペプチド合成を用いて上記蛋白 質のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを作好適には、蛋白質を コード化するＤＮＡを、それを発現する適当なべフタ−／宿主系に挿入すること によって、本発明のｐＴＫ類を作り出す。

これらのＤＮＡ配列は、それらが天然に存在している給源から入手可能であるか 、或は化学合成することが可能であるか、或は標準的組換え技術を用いてそれら を作り出すことができる。

本発明はまた、レセプタチロシンキナーゼ活性を示す蛋白質の遺伝情報を指定す る本発明のｐＴＫ遺伝子を含んでいる発現ベクターにも関する。

本発明のｐＴＫ遺伝子は数多くの診断および治療目的で用いられ得る。

例えば、これらのｐＴＫ遺伝子の核酸配列をプローブとして用いて、真核細胞お よび原核細胞型を含む他の細胞型内に存在している他の蛋白質チロシンキナーゼ 類を同定することができる。

蛋白質チロシンキナーゼ類が示すキナーゼ活性を直接阻害する薬剤を設計するか 、或はチロシンキナーゼ類の触媒ドメインに結合してそれらの活性を阻害するペ プチド類を設計する目的で、これらの核酸配列を用いることができる。これらの 配列はまた、チロシンキナーゼ活性をまた阻害し得るか或は壊し得るアンチセン スヌクレオチド類を設計する目的で用いられ得る。このようなチロシンキナーゼ 活性の阻害は、細胞増殖を低下させることが有利である病理状態、例えば白血病 または他の悪性疾患において望ましいものである。

これらの核酸配列はまた、上述した如き薬剤、ペプチド類またはアンチロジンキ ナーゼ類に対して阻害効果を示すのではなくむしろ増強する。

このようにチロシンキナーゼ活性が増強されると、基質（外因性、並びに内因性 チロメン残基）のホスホリル化の増強がもたらされる。細胞増殖を上昇させるこ とが有利である状態、例えば貧血、出血疾患および外科操作中などでは、その効 果を上昇させる方が望ましい。

本発明のｐＴＫ遺伝子はまた、個々のリガンド（即ち線維芽細胞成長因子）に結 合し得るレセプタチロシンキナーゼ類の可溶フラグメントを得る目的で用いられ 得る。

組換えＤＮＡ技術を用いるか或は合成的に、可溶レセプタチロシンキナーゼフラ グメントをコード化するｐＴＫ遺伝子を作り出すことができる。両方の場合共、 その得られるＤＮＡは、疎水性トランスメンブラン領域の実質的部分が欠如して いてそのフラグメントの可溶化を可能にする可溶ｐＴＫフラグメントをコード化 する。

これらの可溶ｐＴＫ蛋白質フラグメントを外因的に導入することにより、内因性 膜結合ｐＴＫの競合相手（それらの個々のりガントに関する）として働かせるこ とによって、チロシンキナーゼ活性を阻害することができる。また、リガンドに 結合するがキナーゼ活性を活性化しないように修飾した可溶ｐＴＫ蛋白質フラグ メントを導入することができる。

これらの可溶ｐＴＫ蛋白質フラグメントはまた、成長因子および分化因子の如き リガンドを検出する結合アッセイで用いられ得る。これらのりガントを同定した 後、キナーゼ活性を阻害するか或は増強する目的でこれらを変化させるか或はそ れらの修飾を行うことができる。例えば、これらのりガントの修飾を行うか、或 は細胞に毒性を示す物質、例えばこのｐＴＫにｎした後そのキナーゼ活性を本質 的に増大させ得るか或は他の成長因子を活性化し得る、超活性化物質であっても よい。

本発明のｐＴＫ遺伝子はまた、キナーゼ活性を阻害もしくは増強する成長因子ま たは分化因子の如きリガンドをインビトロでスクリーニングするアッセイのため の診断道具を開発する目的で用いられるであろう。

これらのｐＴＫ遺伝子がコード化する蛋白質はまた、上記アッセイで用いられ得 るか、或は上記アッセイで用いるべきモノクローナルもしくはポリクローナル抗 体を生じさせるための免疫原として用いられ得る。

上記抗体はまた、もし蛋白質チロシンキナーゼ活性を修飾することができたなら ば個体が治療学的利点を得るであろう状態を治療する方法、例えば出血疾患にお いて血小板産生を増加させる方法で用いられ得る。

如何なる様式でも限定することを意図したものでない下記の実施例を用いて、本 発明をここに説明する。

実施例：ｐＴＫ遺伝子の同定および単離これらの新規ｐＴＫ遺伝子の単離および 同定を容易にする目的で、２組のＤＮＡプローブを用いた（表参照）。

その１番目の組は、２種の変性オリゴヌクレオチド配列ｐＴＫ１　（配列同定番 号、１）およびｐＴＫ２（配列同定番号：２）から成っていた。

標準的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用い、これらの配列をＰＣＲプライマ ーとして用いてチロシンキナーゼのＤＮＡセグメントの増幅を行った。

２番目の組は、Ｃ−キット系群（ファミリー）の蛋白質チロシンキナーゼ類の触 媒ドメインの高度に保存されている領域から選択した２種のＷ（配列前窓番号＝ ４）から成っていた。また、これらの配列を第二ラウンドのＤＮＡ増幅における ポリメラーゼ連鎖反応のプライマーとして用いた。公知実験室技術を用い、この ような２段階の増幅操作を用いて、これらのｐＴＫプライマー類にハイブリッド 形成するＤＮＡフラグメントを同定し、単離した後、配列決定を行ったＴＫＩ ＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＮＧＡＣＣＴ ＴＫ２ ＧＧ＾＾ＴＴＣＣ＾＾＾ＧＧＡＣＣＡＧＡＣＧＴＣ第二ラウンドの増幅 ＰＴＫ３　（キット系群（ファミリー）特異的）ＣＧＧＡＴＣＣＡＴＣＣＡＣＡ ＧＡＧＡＴＧＴＰＴＫＫｆ　（キット系群（ファミリー）特異的）ＧＧＡＡＴＴ ＣＣＴＴＣＡＧＧＡＧＣＣ八ＴＣＣＡＣＴＴ相当物 本分野の技術へは、本明細書に記述した本発明の特定具体例に対する数多くの相 当物を、常規のみの実験を用いて認識するか或は確かめることができるであろう 。このような相当物を下記の請求の範囲内に包含させることを意図している。

息Ｊ　ち−ｍ　υ ＬｐＴＩＣ２ ＬｐＴＫコ ＧＴＧＣＡＣＡＧＧＧ入ＴＣＴＣＧＣＧＧＣＴＣＧＧ入ＡＣｋＴＣＣＴＣＩ：Ｔ ＣＧＧＧＧ入入ＡＪＩＣＡＣＣＣＴＣＴＣＧｋｋＡＣＴＴＡＴＣＣＣＣＴＡ（Ａ ＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＣＣＣＴＧＡＣＧＧ入ＡｐＴＫ４ ＡＣＡＣ入入入ＴＣＡＣＴＧＣＣＧＣ ＬｐτＸ］コ ＴＸＧＶｐ、Ｅ　コｐ 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成６年７月２１日

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．ｃ−キツトサブグループの蛋白質チロシンキナーゼ類の蛋白質チロシンキナ ーゼの触媒ドメイン内に存在しているアミノ酸配列をコード化するＤＮＡにハイ ブリッド形成するＤＮＡフラグメントにハイブリツド形成するヒト巨核球由来単 離ＤＮＡ。
2. ２．ａ）ＳＡＬ−Ｓ１（配列同定番号：５および７）；ｂ）ＳＡＬ−Ｄ４（配列 同定番号：７）；ｃ）ＬｐＴＫ２（配列同定番号：９および１９）；ｄ）ＬｐＴ Ｋ３（配列同定番号：１１）；ｅ）ＬｐＴＫ４（配列同定番号：１３および２１ ）；ｆ）ＬｐＴＫ１３（配列同定番号：１５）；ｇ）ＬｐＴＫ２５（配列同定番 号：２２）；およびｈ）ＨｐＴＫ５（配列同定番号：２３）；から成るヌクレオ チド配列群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求の範囲１の単離ＤＮＡ 。
3. ３．ａ）ＳＡＬ−Ｓ１（配列同定番号：１６および１８）；ｂ）ＳＡＬ−Ｄ４（ 配列同定番号：８）；ｃ）ＬｐＴＫ２（配列同定番号：１０および２０）；ｄ） ＬｐＴＫ３（配列同定番号：１２）；ｅ）ＬｐＴＫ４（配列同定番号：１４）； ｆ）ＬｐＴＫ４（配列同定番号：１４）；ｇ）ＨｐＴＫ５（配列同定番号：２４ ）；ｈ）ｂｐＴＫ１（配列同定番号：２５）；ｉ）ｂｐＴＫ２（配列同定番号： ２６）；ｊ）ｂｐＴＫ３（配列同定番号：２７）；ｋ）ｂｐＴＫ４（配列同定番 号：２８）；ｌ）ｂｐＴＫ５（配列同定番号：２９）；およびｍ）ｂｐＴＫ７（ 配列同定番号：３０）；から成る群から逮択されるアミノ酸配列をコード化する 請求の範囲１の単離ＤＮＡ。
4. ４．ｃ−キットサブグループの蛋白質チロシンキナーゼ類の蛋白質チロシンキナ ーゼの触媒ドメイン内に存在しているアミノ酸配列をコード化する配列を有する ＤＮＡフラグメントを含んでいるヒト巨核球由来単離ＤＮＡ。
5. ５．ａ）ＳＡＬ−Ｓ１（配列同定番号：６）；ｂ）ＳＡＬ−Ｄ４（配列同定番号 ：８）；ｃ）ＬｐＴＫ２（配列同定番号：１０）；ｄ）ＬｐＴＫ３（配列同定番 号：１２）；ｅ）ＬｐＴＫ４（配列同定番号：１４）；およびｆ）ＬｐＴＫ１３ （配列同定番号：１６）；ｇ）ＨｐＴＫ５（配列同定番号：２４）；ｈ）ｂｐＴ Ｋ１（配列同定番号：２５）；ｉ）ｂｐＴＫ２（配列同定番号：２６）；ｊ）ｂ ｐＴＫ３（配列同定番号：２７）；ｋ）ｂｐＴＫ４配列同定番号：２８）；ｉ） ｂｐＴＫ４配列同定番号：２９）；およびｍ）ｂｐＴＫ７（配列同定番号：３０ ）；）から成る群から選択されるアミノ酸配列をコード化する請求の範囲４の単 離ＤＮＡ。
6. ６．ｃ−キツト系群（ファミリー）のチロシンキナーゼ類の触媒ドメインに配列 相同性を示すアミノ酸配列を含んでいるヒト巨核球由来同種蛋白質。
7. ７．該アミノ酸配列ガ、 ａ）ＳＡＬ−Ｓ１（配列同定番号：６）；ｂ）ＳＡＬ−Ｄ４（配列同定番号：８ ）；ｃ）ＬｐＴＫ２（配列同定番号：１０）；ｄ）ＬｐＴＫ３（配列同定番号： １２）；ｅ）ＬｐＴＫ４（配列同定番号：１４）；およびｆ）ＬｐＴＫ１３（配 列同定番号：１６）；ｇ）ＨｐＴＫ５（配列同定番号：２４）；ｈ）ｂｐＴＫ１ （配列同定番号：２５）；ｉ）ｂｐＴＫ２（配列同定番号：２６）；ｊ）ｂｐＴ Ｋ３（配列同定番号：２７）；ｋ）ｂｐＴＫ４（配列同定番号：２８）；ｌ）ｂ ｐＴＫ５（配列同定番号：２９）：およびｍ）ｂｐＴＫ７（配列同定番号：３０ ）；から成る群から選択される請求の範囲６の同種蛋白質。
8. ８．ＦＬＴ／ＦＬＫ系群（ファミリー）の蛋白質チロシンキナーゼ類に有意な配 列相同性を示すヒト巨核球由蛋白質。
9. ９．ヌクレオチド配列（配列同定番号：５）でコード化した請求の範囲８の蛋白 質。
10. １０．アミノ酸配列（配列同定番号：６）でコード化した請求の範囲８の蛋白質 。
11. １１．ヌクレオチド配列（配列同定番号：１７）でコード化した請求の範囲８の 蛋白質。
12. １２．アミノ酸配列（配列同定番号：１８）でニコード化した請求の範囲８の蛋 白質。
13. １３．ＦＧＦレセプタ系群（ファミリー）の蛋白質チロシンキナーゼ類に有意な 配列相同性を示すヒト巨核球由来蛋白質。
14. １４．ヌクレオチド配列（配列同定番号：７）でコード化した請求の範囲１０の 蛋由質。
15. １５．アミノ酸配列（配列同定番号：８）でコード化した請求の範囲１０の蛋白 質。
16. １６．ＮＧＦレセプタ系群（ファミリー）の蛋白質チロシンキナーゼ類に有意な 配列相同性を示すヒト巨核球由来蛋白質。
17. １７．ヌクレオチド配列（配列同定番号：１１）でコード化した請求の範囲１４ の蛋白質。
18. １８．アミノ酸配列（配列同定番号：１２）でコード化した請求の範囲１４の蛋 白質。
19. １９．ｃ−キットサブグループの蛋白質キナーゼ類の蛋白質チロシンキナーゼの 触媒ドメイン内に存在しているアミノ酸配列をコード化するＤＮＡにハイブリツ ド形成するＤＮＡフラグメントにハイブリツド形成するヒト巨核球由来ＤＮＡ配 列を含んでいるＤＮＡ発現ベター。
20. ２０．ａ）ＳＡＬ−Ｓ１（配列同定番号：５）；ｂ）ＳＡＬ−Ｄ４（配列同定番 号：７）；ｃ）ＬｐＴＫ２（配列同定番号：９）；ｄ）ＬｐＴＫ３（配列同定番 号：１１）；ｅ）ＬｐＴＫ４（配列同定番号：１３）；およびｆ）ＬｐＴＫ１３ （配列同定番号：１５）；ｇ）ＬｐＴＫ２５（配列同定番号：２２）；およびｈ ）ＨｐＴＫ５（配列同定番号：２３）；カ、ら成る群から選択されるＤＮＡ配列 を含んでい・る請求の範囲１７のＤＮＡ発現ベクター。
21. ２１．請求の範囲１７の発現ベクターで形質転換した細胞。