JP2002517977A

JP2002517977A - Ｔｎｆリガンドファミリーのｎｔｎ−２メンバー

Info

Publication number: JP2002517977A
Application number: JP50275099A
Authority: JP
Inventors: マシアコウスキー，ピオトゥル; バレンズエラ，デイビッド
Original assignee: リジェネロンファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1997-06-06
Filing date: 1998-06-03
Publication date: 2002-06-18
Also published as: CA2292899A1; EP0991759A1; WO1998055621A1; IL133316A0; AU7608898A; CA2292835A1

Abstract

(57)【要約】ヒトNTN-2ポリペプチドおよび関連の核酸が提供される。特異的ヒトNTN-2活性を有するヒトNTN-2ドメインを含むヒトNTN-2ポリペプチドが含まれる。ポリペプチドは、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞から組換え産生され得る。特異的結合剤および本発明の組成物を製造および使用する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】本明細書に引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参考として援用されるべきことを詳細におよび個々に示されるように、参考として本明細書に援用される。序論発明の分野本発明の分野は、細胞機能を調節するポリペプチド分子、このポリペプチドをコードする核酸配列、ならびにこの核酸配列およびこのポリペプチドを使用する方法である。背景腫瘍壊死因子α（TNF-α）は、活性化マクロファージによって主として産生されるサイトカインである。TNF-αは、Ｔ細胞およびＢ細胞増殖を刺激し、そして内皮細胞における接着分子の発現を誘導する。このサイトカインも、感染に対する宿主防御に重要な役割を果たす。 TNF-α活性は、２つの異なるレセプター、TNFR-p55およびTNFR-p75によって媒介される。これらの２つのレセプターはまた、主として活性化リンパ球により分泌される可溶性リンホトキシンα（LT-α）によって引き起こされる活性を媒介する。TNFR-p55の特異的刺激は、例えばインビトロ腫瘍細胞傷害性のようなTNF 活性、内皮細胞およびケラチノサイトにおける接着分子の発現、セラミドの付随増加でのスフィンゴミエリナーゼの活性化、NF-κBの活性化、ならびにマンガンスーパーオキシドジスムターゼmRNAを誘導する。TNFR-p75の特異的刺激は、マウスおよびヒトの胸腺細胞および細胞傷害性Ｔ細胞、線維芽細胞およびナチュラルキラー細胞の増殖性応答、ならびにPC60細胞におけるGM-CSF分泌を生じる。 TNFは、特にγインターフェロン（IFN-γ）と組み合わせて、サイトカインの何らかの他の組み合わせによって適合されない悪性細胞株を選択的に殺傷または阻害する能力を有する。しかし、TNFの毒性副作用が、ヒトにおける有効な用量レベルを得ることを抑制したので、TNF-α抗腫瘍治療でのガン患者の臨床試験は、期待はずれであった。これらの毒性副作用は、TNFR-p75レセプターへのTNF結合のせいであったが、悪性細胞における細胞傷害性活性は、TNFR-p55レセプターへのTNFの結合のせいであった。発明の要旨本発明は、腫瘍壊死因子（TNF）と相同である分子である。本発明は、この分子、ヒトNTN-2ポリペプチド、および関連核酸に関する方法および組成物を提供する。ヒトNTN-2特異的ドメインを含みそしてヒトNTN-2特異的活性を有するポリペプチドが含まれる。このポリペプチドは、本発明の核酸で形質転換した宿主細胞から組換え産生され得る。本発明は、特異的抗体のような結合剤、ならびに診断（例えば、ヒトNTN-2転写物についての遺伝子ハイブリダイゼーションスクリーニング）、治療（例えば、ヒトNTN-2遺伝子発現を調節するための遺伝子治療）、および生物薬学産業（例えば、先導薬理学的薬剤について化学ライブラリーをスクリーニングするための試薬）において本発明の組成物を製造および使用する方法を提供する。本発明のヒトNTN-2ポリペプチドに好ましい使用には、添加されたポリペプチドが培地の成分および／または細胞の生理機能の変化に影響を及ぼす細胞外表面と特異的に相互作用する条件下で、外因性ヒトNTN-2ポリペプチドと細胞または細胞のまわりの培地とを接触させることによって、細胞外表面を含む細胞の生理機能を改変する工程を包含する。生物学的に活性な薬剤をスクリーニングする方法も好ましく、この方法は、薬剤の存在がなければポリペプチドが参照親和性で結合標的を特異的に結合する条件下で、細胞外ヒトNTN-2ポリペプチド特異的結合標的および候補薬剤の存在下でヒトNTN-2ポリペプチドをインキュベートする工程；薬剤で偏った親和性を決定するために結合標的に対するポリペプチドの結合親和性を検出する工程であって、薬剤で偏った親和性と参照親和性との間の差が、薬剤が結合標的へのポリペプチドの結合を調節することを示す工程、を包含する。 TNFに対する相同性に基づいて、ヒトNTN-2が、疾患の発症に密接に関連した、免疫調節および炎症応答のメディエーターであることが期待される。リンパ様、造血、および他の系の細胞の発生、増殖、および死を調節するために有用であり得る。また、ヒトNTN-2は、敗血症性ショック、自己免疫疾患、および移植片-宿主疾患の抑制に役立ち得る。さらに、ヒトNTN-2ポリペプチドは、そのレセプターを同定するために使用され得る。図面の簡単な説明図１−プローブとしてヒトNTN-2配列の608ヌクレオチドフラグメントを使用する種々のヒト組織特異的RNAのノーザン分析。レーン１〜８は、順に以下のとおりである：心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、および膵臓。発明の詳細な説明本発明は、天然ヒトNTN-2ポリペプチド、ならびにヒトNTN-2アミノ酸配列、またはアッセイ認識可能なヒトNTN-2特異的活性を有するその機能的ヒトNTN-2ポリペプチドドメインを含む組換えポリペプチドを含むヒトNTN-2ポリペプチドを提供する。したがって、ポリペプチドは、開示された天然ヒトNTN-2ポリペプチドの欠失変異体であり得、そして例えば、非ヒトNTN-2ポリペプチドとの融合産物として提供され得る。本発明のヒトNTN-2ポリペプチドドメインは、ヒトNTN-2特異的活性または機能を有する。ヒトNTN-2についての多くの適用は、その特性から示唆される。ヒトNTN-2は、 TNFを使用して処置されるものと同様の状態の研究および処置に有用であり得る。さらに、ヒトNTN-2 cDNAは、例えば、細胞株におけるポリペプチドについてのアッセイにおける抗体の使用、あるいはオリゴヌクレオチドプライマーに対する配列類似性を有するものを増幅するためおよびどれくらい多くのヒトNTN-2が存在するかをしるためのPCRテストにおけるプライマーとしてのオリゴヌクレオチドの使用による、診断ツールとして有用であり得る。もちろん、ヒトNTN-2の単離も、その推定レセプター、他のヒトNTN-2結合ポリペプチドを単離するため、および／またはそのアンタゴニスト特性を研究するための手がかりを提供する。ヒトNTN-2特異的活性または機能は、便利なインビトロ、細胞ベースの、またはインビボアッセイ−例えば、インビトロ結合アッセイ、細胞培養アッセイ、動物（例えば、免疫応答、遺伝子治療、トランスジェニックなど）などによって決定され得る。結合アッセイは、結合標的とヒトNTN-2ポリペプチドとの特異的分子相互作用が評価される何らかのアッセイを包含する。結合標的は、天然の結合標的、または抗体のような特異的免疫ポリペプチドのような非天然結合標的、または以下に記載のアッセイで同定されるようなヒトNTN-2特異的薬剤であり得る。本発明のポリペプチドは、単離されたまたは純粋であり得−「単離された」ポリペプチドはその天然の状態で会合される物質のいくつかをもはや付随しない、そして好ましくは所定の試料中の総ポリペプチドの重量の少なくとも約0.5％、およびより好ましくは少なくとも約５％を構成するものであり；「純粋な」ポリペプチドは、所定の試料中の総ポリペプチドの重量の少なくとも約90％、および好ましくは少なくとも約99％を構成する。本発明のポリペプチドおよびポリペプチドドメインは、合成され、組換え技法によって産生され、または細胞から精製され得る。種々の分子および生化学的方法が、本発明の組成物の生化学的合成、分子発現、および精製に利用可能であり、例えば、Molecular Cloning，A Labor atory Manual (Sambrookら，Cold Spring Harbor Laboratory)、Current Protoc ols in Molecular Biology (Ausubelら編，Greene Publ．Assoc.，Wiley-Inters cience，NY)を参照のこと。本発明のポリペプチドは、免疫原として、スクリーニングアッセイにおける標的として、細胞増殖、分化、および／または機能などを調節するための生物活性試薬としての使用を含む、種々の使用を見いだす。例えば、本発明は、添加されたポリペプチドが培地の成分および／または細胞の生理機能の変化に影響を及ぼす細胞外表面と特異的に相互作用する条件下で、外因性ヒトNTN-2ポリペプチドと細胞または細胞のまわりの培地とを接触させることによって、細胞外表面を含む細胞の生理機能を調節するための方法を提供する。これらの方法によれば、細胞外表面は、形質膜関連レセプターを含み；外因性ヒトNTN-2は、細胞によって生成されないか、またはそうであれば非天然レベル、時期、または生理学的位置で発現されるポリペプチドをいい；そして適切な培地は、インビトロ培養培地および血液、滑液などのような生理学的液体を含む。ポリペプチドは、マイクロインジェクション、組換え酵素のプロモーター特異的発現、脂質ベシクルの標的された送達などのような何らかの便利な方法によって、細胞の特異的集団中で導入、発現、または抑制され得る。本発明は、天然および非天然ヒトNTN-2特異的結合剤、このような薬剤を同定および製造する方法、ならびに診断、治療、および薬品開発におけるその使用を提供する。ヒトNTN-2特異的結合剤は、体細胞性に組換えたタンパク質レセプター様特異的抗体またはＴ細胞抗原レセプターのようなヒトNTN-2特異的レセプターを含み（例えば、HarlowおよびLane（1988）Antibodies，A Laboratory Manua l，Cold Spring Harbor Laboratoryを参照のこと）、そしてまた、１、２、および３ハイブリッドスクリーニングのようなアッセイで同定した他の天然結合剤、ならびに以下に記載のような化学ライブラリーのスクリーニングで同定される非天然結合剤を含む。特定の目的の薬剤は、ヒトNTN-2機能を調節する。本発明は、ヒトNTN-2核酸を提供し、これは、翻訳可能な転写物、ハイブリダイゼーションプローブ、PCRプライマー、診断核酸などとしての使用、ならびにヒトNTN-2遺伝子および遺伝子転写物の存在を検出することならびに追加のヒトN TN-2ホモログおよび構造アナログをコードする核酸を検出または増幅することにおける使用を包含する、種々の適用を見いだす。本発明の核酸は、合成／非天然配列であり、および／または単離される、すなわち、その天然状態で会合される物質のいくつかをもはや付随せず、好ましくは所定の画分に存在する総核酸の重量の少なくとも約0.5％、より好ましくは少なくとも約５％を構成し、そして通常組換えは、非天然配列または天然染色体上で連結される以外のヌクレオチドに連結される天然配列を含むことを意味する。本明細書に開示されるヌクレオチド配列およびそのフラグメントを含む核酸は、天然の染色体上で連結されるもの以外の配列に直に隣接した、または天然の染色体上で連結されるもの以外の配列に直に隣接する10kbより少ない、好ましくは2kb より少ないもとのままの隣接領域に隣接した末端に、このような配列またはフラグメントを含む。核酸は、通常、RNAまたはDNAであるが、しばしば、他の塩基を含む核酸あるいは改変された安定性を提供するためのヌクレオチドアナログなどを使用するために有利である。開示されたヒトNTN-2ポリペプチドのアミノ酸配列は、選択された発現系（Hol lerら（1993）Gene 136: 323-328；Martinら（1995）Gene 154: 150-166）について最適化されたヒトNTN-2ポリペプチドをコードする核酸を逆翻訳するために使用され、または天然のヒトNTN-2をコードする核酸配列の単離における使用のための縮重オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを生成するために使用される（「GCG」ソフトウエア，Genetics Computer Group，Inc.，Madison，WI ）。ヒトNTN-2をコードする核酸は、発現ベクターの一部であり得、そして例えば、発現およびスクリーニングのため、トランスジェニック動物のため、ヒトNT N-2媒介シグナル伝達と関連する疾患についての候補薬物の有効性のような機能的研究のためなどに、組換え宿主細胞に組み込まれ得る。発現系は、選択的な翻訳後プロセシングによってヒトNTN-2ポリペプチド構造的および機能的改変体に影響を及ぼすために選択および／または適合される。本発明はまた、ヒトNTN-2 cDNA特異的配列を有しおよび配列番号１との特異的ハイブリダイゼーションをもたらすために十分な核酸ハイブリダイゼーションプローブおよび複製／増幅プライマーを提供する。特異的ハイブリダイゼーションを証明することは、一般的に、ストリンジェント条件を必要とし、例えば、５× SSPE（0.18M NaCl、0.01M NaPO₄、pH 7.7、0.001M EDTA）緩衝液中30％ホルムアミドを含む緩衝液中で42℃の温度にてハイブリダイズすること、および0.2×SSP Eで42℃にて洗浄する場合に結合したままであること；好ましくは５×SSPE緩衝液液中50％ホルムアミドを含む緩衝液中で42℃の温度にてハイブリダイズすることおよび42℃の0.2×SSPE緩衝で42℃にて洗浄する場合に結合したままであることである。ヒトNTN-2 cDNAホモログはまた、BLASTX（Altschulら（1990）Basic Local Alignment Search Tool，J．Mol．Biol．215: 403-410）のようなアラインメントアルゴリズムを使用して他のポリペプチドとは区別され得る。ヒトNTN-2ハイブリダイゼーションプローブは、臨床および実験室試料において野生型および変異体対立遺伝子を同定することにおける使用を見いだす。変異体対立遺伝子は、高処理能力比臨床診断のための対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）プローブを生成するために使用される。ヒトNTN-2核酸はまた、活性ヒトNTN-2の細胞発現または細胞内濃度もしくは利用可能性を調節するために使用される。ヒトNTN-2阻害核酸は、代表的には、開示された天然ヒトNTN-2コード配列の相補物を含むアンチセンス−一本鎖配列である。所定のヒトNTN-2ポリペプチドの発現のアンチセンス調節は、遺伝子調節配列に作動可能に連結したアンチセンス核酸を用い得る。細胞は、遺伝子の転写が、内因性ヒトNTN-2をコードするmRNAに結合し得るアンチセンス転写物を得るように配向したプロモーター配列とともにヒトNTN-2配列を含むベクターでトランスフェクトされる。アンチセンス核酸の転写は、構成的または誘導性であり得、そしてベクターは、安定な染色体外維持または組込みを提供し得る。あるいは、所定のヒトNTN-2ポリペプチドをコードするゲノムDNAまたはmRNAに結合する一本鎖アンチセンス核酸は、標的されたポリペプチドの発現における実質的な減少を生じる濃度で、宿主中でまたは宿主から一時的に単離される標的細胞に投与され得る，ヒトNTN-2発現における富化は、対応する遺伝子産物の機能的発現を増加させるヒトNTN-2核酸を標的された細胞タイプに導入することによってもたらされる。このような核酸は、ヒトNTN-2発現ベクター、内因性対立遺伝子の機能的発現をアップレギュレートするベクター、または変異体対立遺伝子の標的された修正についての置換ベクターであり得る。生存可能な細胞への核酸の導入のための技法は、当該技術分野で公知であり、そしてレトロウイルスベースのトランスフェクション、ウイルスコートタンパク質−リポソーム媒介トランスフェクションなどを含む。本発明は、ヒトNTN-2調節可能な細胞機能のレベルで活性な薬剤について、薬剤、化合物、先導化合物を同定する効果的方法を提供する。一般的に、これらのスクリーニング方法は、天然のヒトNTN-2結合標的とのヒトNTN-2相互作用を調節する化合物についてアッセイする工程を包含する。タンパク質−タンパク質結合アッセイ、イムノアッセイ、細胞ベースのアッセイなどを含む、結合剤についての種々のアッセイが提供される。好ましい方法は、先導化合物についての化学ライブラリーの自動化された費用効率の良い高処理能力比スクリーニングに従う。インビトロ結合アッセイは、ヒトNTN-2ポリペプチドを含む成分の混合物を用い、これは、別のペプチドまたはポリペプチド、例えば、検出または固定のためのタグなどとの融合産物の一部であり得る。アッセイ混合物は、天然のヒトNTN- 2結合標的を含む。ネイティブの結合標的は使用され得るが、一部がアッセイで便利に測定可能な本発明のヒトNTN-2に対する結合親和性および結合活性を提供する限り、その一部を使用することが、しばしば好ましい。アッセイ混合物はまた、候補薬理学的薬剤を含む。候補薬剤は、多数の化学クラスを含むが、代表的には、これらは、有機化合物、好ましくは小有機化合物であり、そして合成または天然化合物のライブラリーを含む種々の供給源から得られる。塩、緩衝液、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤などのような種々の他の試薬も含まれ得る。混合物成分は、必須の結合を提供する任意の順序で添加され得、そしてインキュベーションは、最適結合を容易にする任意の温度で行われ得る。混合物は、候補薬理学的薬剤の存在がなければ、ヒトNTN-2が、参照結合親和性を有する細胞結合標的、一部、またはアナログを特異的に結合する条件下でインキュベートされる。インキュベーション期間は、最適結合について選択されるが、迅速な高処理能力比スクリーニングを容易にするためにも最小にされる。インキュベーション後、ヒトNTN-2と１つ以上の結合標的との間の薬剤で偏った結合は、何らかの便利な方法によって検出される。無細胞結合タイプアッセイについては、分離工程が、結合していない成分と結合した成分を分離するためにしばしば使用される。分離は、沈殿、固定などによって、次いで、例えば、メンブラン濾過またはゲルクロマトグラフィーによる洗浄によって、行われ得る。無細胞結合アッセイについては、成分の１つは、通常、標識を含むかまたは標識に結合される。標識は、放射活性、発光、光学または電子密度などのような直接的検出、あるいはエピトープタグ、酵素などのような間接的検出を提供し得る。例えば、光学または電子密度、放射発光、非放射エネルギー転移によって、または抗体結合体で間接的に検出されるなどの、標識の性質およびアッセイ成分に依存して標識を検出するために、種々の方法が使用され得る。薬剤の存在下での結合親和性と比較して薬剤の不在下での標的に対するヒトNTN-2ポリペプチドの結合親和性の差は、薬剤が、対応する結合標的へのヒトNTN-2ポリペプチドの結合を調節することを示す。本明細書で使用される場合、差は、統計学的に有意であり、そして好ましくは、少なくとも50％、より好ましくは少なくとも90％差を示す。本発明は、培地と接触して細胞外表面を含む細胞の生理機能を改変する方法を提供し、この方法は、このポリペプチドが、この細胞の生理機能の変化に影響を及ぼすためのこの培地および細胞外表面の少なくとも１つの成分と特異的に相互作用する条件下で、外因性ヒトNTN-2ポリペプチドとこの培地とを接触させる工程を包含する。本発明は、生物学的に活性な薬剤についてスクリーニングする方法をさらに提供し、この方法は、a)この薬剤の存在がなければ、ポリペプチドが参照親和性で結合標的を特異的に結合する条件下で、細胞外ヒトNTN-2ポリペプチド特異的結合標的および候補薬剤の存在下でヒトNTN-2ポリペプチドをインキュベートする工程；b)薬剤で偏った親和性を決定するためにこの結合標的に対するこのポリペプチドの結合親和性を検出する工程であって、ここで薬剤で偏った親和性と参照親和性との間の差が、この薬剤がこの結合標的へのポリペプチドの結合を調節することを示す、工程を包含する。本発明の１つの実施態様は、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む単離されたヒトNTN-2ポリペプチド、またはヒトNTN-2特異的活性を有するそのフラグメントである。本発明の別の実施態様は、本明細書に記載のアミノ酸配列を含むヒトNTN-2ポリペプチドをコードする組換え核酸またはヒトNTN-2特異的活性を有するそのフラグメントである。さらに別の実施態様は、本明細書に記載のヌクレオチド配列を含む単離された核酸、または少なくとも18の連続する塩基を有しそして天然のヒトNTN-2 cDNAの存在下で本明細書に記載の配列を有する核酸と特異的にハイブリダイズするために十分なそのフラグメントである。本発明はまた、例えば、診断適用においてポリペプチドの検出に有用である本明細書に記載のヒトNTN-2ポリペプチドに対する抗体を提供する。このヒトNTN-2 ポリペプチドに対するモノクローナル抗体の調製については、培養物中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する何らかの技法が使用され得る。例えば、Ko hlerおよびMilstein (1975，Nature 256:495-497)によって最初に開発されたハイブリドーマ技法、ならびにトリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（ Kozborら，1983，Immunology Today 4:72）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBV-ハイブリドーマ技法（Coleら，1985,「Monoclonal Antibodi es and Cancer Therapy」，Alan R．Liss，Inc．77-96頁）などは、本発明の範囲内である。診断または治療使用のためのモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体またはキメラヒト−マウス（または他の種）モノクローナル抗体であり得る。ヒトモノクローナル抗体は、当該技術分野で公知の多くの技法のいずれかによって作成され得る（例えば、Tengら，1983，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．80:730 8-7312；Kozborら，1983，Immunology Today 4:72-79；Olssonら，1982，Meth． Enzymol．92:3-16）。ヒト定常領域とともにマウス抗原結合ドメインを含むキメラ抗体分子が調製され得る（Morrisonら，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A . 81:6851，Takedaら，Nature 314:452）。当該技術分野で公知の種々の手順は、本明細書に記載のヒトNTN-2ポリペプチドのエピトープに対するポリクローナル抗体の産生について使用され得る。抗体の産生について、種々の宿主動物（これにはウサギ、マウス、およびラットが含まれるがこれらに限定されない）は、ヒトNTN-2ポリペプチド、あるいはそのフラグメントまたは誘導体の注射によって免疫され得る。宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために種々のアジュバントが使用され得、これには、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのような無機物ゲル、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG（Bacille Calmette-Guerin）およびCorynebacterium parvumのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。選択されたヒトNTN-2ポリペプチドエピトープに対する抗体の分子クローンは、公知の技法によって調製され得る。組換えDNA方法論（例えば、Maniatisら，1 982，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laborato ry, Cold Spring Harbor，New Yorkを参照のこと）は、モノクローナル抗体分子、またはその抗原結合領域をコードする核酸配列を構築するために使用され得る。本発明は、抗体分子およびこのような抗体分子のフラグメントを提供する。分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、公知の技法によって生成され得る。例えば、このようなフラグメントは、抗体分子のペプシン切断によって産生され得るF(ab')₂フラグメント；F(ab')₂フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得るFab'フラグメント；ならびにパパインおよび還元剤で抗体分子を処理することによって生成され得るFabフラグメントを含むが、これらに限定されない。抗体分子は、公知の技法、例えば、免疫吸着または免疫アフィニティークロマトグラフィー、HPLC（高速液体クロマトグラフィー）のようなクロマトグラフ方法、またはそれらの組み合わせによって精製され得る。以下の実施例は、例示の目的で提供され、そして限定を提供するものではない。実施例１−部分ヒトNTN-2コード配列のクローニングおよび配列決定 TNFファミリーのすべての公知のヒトおよびマウスメンバーのアミノ酸配列を、mRNA配列のランダムフラグメントのNIH ESTデータベースを検索するためのtbl astn疑問として使用した（Altschul，Stephen F.，Warren Gish，Webb Miller， Eugene W．Myers，およびDavid J．Lipman (1990)．Basic local alignment sea rch tool．J．Mol．Biol．215:403-10）。各疑問は、ヒットのリスト、すなわち、疑問配列に対する実質的な配列類似性を有するEST配列を生成した。代表的には、リストの上部におけるヒットは、疑問タンパク質のmRNAコピー、次いでファミリーおよびランダム−チャンス類似性の他のメンバーに由来するESTに対応した。 parserプログラムを使用して、ファミリーのメンバーのすべてとの検索からヒットのすべてを組み合わせそして分類した。これは、公知のタンパク質に対応するヒットのすべての迅速な削減を可能にした。残りのヒットを、ファミリーに特徴的な配列モチーフの保存について分析した。追加のデータベース検索を行って、重複するESTを同定した。ヒトNTN-2の部分ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を、以下のとおりに決定した：疑問として配列番号１のヌクレオチド配列を使用して、追加のデータベース検索を行って、重複するESTを同定した。I.M.A.G.E.コンソーシアムからの２つの追加のクローンが、相同配列を含むことを識別した。これらのクローン、Geneba nk受託番号AA166695およびT87299を、Research Genetics，Inc．(Huntsville，A L)から得、そしてABI 373A DNA配列決定機およびTaq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)を使用して配列決定した。配列番号１との２つの追加のクローンのアラインメントは、680ヌクレオチドの合計長を示した。オリゴヌクレオチドを、部分ヒト配列に基づいて設計し、そして逆転写反応についておよびPCRについてのプライマーとして使用した。608ヌクレオチド長配列を得、そして以下に記載のような全長配列を単離するためのプローブとして使用した。実施例２−ヒトNTN-2をコードする全長cDNAクローンの単離および配列決定 λgt-10中のヒト胎盤cDNAライブラリーを、Clontech Laboratories，Inc．(Pa lo Alto，CA)から得た。プラークを、1.25×10⁶/20×20cmプレートの密度でプレーティングし、そしてレプリカフィルターを、標準的手順に従って採取した(Sam brookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版，8.46頁，Cold Spri ng Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)。フィルターを、配列番号３に示すhNTN-2配列のヌクレオチド216〜824に対応するプローブで、正常ストリンジェンシー（２×SSC、65℃）にてスクリーニングした。プローブを、フィルターへのプローブの非特異的結合を減少させるために0.5mg/mlサケ***DNA を含むハイブリダイゼーション溶液中で、65℃にてハイブリダイズさせた。フィルターを65℃にて２×SSCで洗浄し、そしてＸ線フィルムに一晩曝露した。強いハイブリダイゼーションシグナルを示す５つの陽性クローンを選び、そしてまたcDNAベクターからのオリゴを使用してPCR増幅した場合にフラグメントを産生した。hNTN-2 の配列決定５つのクローンのそれぞれからのコード領域を、ABI 373A DNA配列決定機およびTaq Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems，Inc. , Foster City，CA)を使用して配列決定した。クローンの１つから得た全長hNTN -2コード配列のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を、以下に記載する：実施例３−hNTN-2の組織特異的発現配列番号３に示されるhNTN-2配列のヌクレオチド216〜824に対応するフラグメントを放射標識し、そして種々のヒト組織特異的RNAのノーザン分析に利用した。いくつかのヒト組織からポリA+ RNAを含むノーザンブロットを、Clontech Lab oratories，Inc．(Palo Alto，CA)から得、そして0.5M NaPO4 (pH 7)、１％ウシ血清アルブミン (Fraction V，Sigma)、７％SDS、1mM EDTA、および100ng/ml超音波処理した変性サケ***DNAの存在下で放射標識したhNTN-2プローブに65℃にてハイブリダイズさせた。フィルターを、２×SSC、0.1％SDSで65℃にて洗浄し、そして−70℃にてスクリーンおよびＸ線フィルムを強めるもので16時間オートラジオグラフィーにかけた。 hNTN-2プローブは、ヒト心臓、胎盤、膵臓、および肺組織において2.7kb転写物に強くハイブリダイズし（図１）、そして脳および肝臓からのRNAに弱くハイブリダイズした。より弱いレベルの発現はまた、骨格筋および腎臓で見出され得た。心臓組織におけるhNTN-2の高い発現は、本発明が心臓疾患を処置するために使用され得ることを示唆し得る。肺および膵臓組織におけるhNTN-2の発現は、本発明が、肺および／または膵臓関連疾患を処置するために利用され得ることを示唆し得る。本発明は、理解の明快さの目的のために例示および実施例によっていくらか詳細に記載されているが、ある変化および改変が、添付の請求の範囲の意図または範囲から逸脱することなく行われ得ることは、本発明の教示に照らして当業者に容易に明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １１１Ｃ０７Ｋ 16/24 Ｃ０７Ｋ 14/52 19/00 16/24 Ｃ１２Ｎ 1/19 19/00 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/08 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/08 5/00 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者バレンズエラ，デイビッドアメリカ合衆国ニューヨーク 11010, フランクリンスクエア，グランジストリート 216

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトNTN-2をコードする単離された核酸分子。２．以下からなる群より選択される配列を有する、請求項１に記載の単離された核酸分子： (a)配列番号３に記載のようなヒトNTN-2のコード領域を含むヌクレオチド配列； (b)(a)のヌクレオチド配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズし、そしてヒトNTN-2の生物学的活性を有する分子をコードする、ヌクレオチド配列；または (c)遺伝コードの縮重がなければ、(a)または(b)のヌクレオチド配列にハイブリダイズし、そしてヒトNTN-2の生物学的活性を有する分子をコードする、ヌクレオチド配列。３．請求項１または２に記載の核酸分子を含むベクター。４．前記核酸分子が、宿主細胞においてその発現を指示し得る発現制御配列に作動可能に連結される、請求項３に記載のベクター。５．プラスミドである、請求項３または４に記載のベクター。６．請求項１または２に記載の核酸分子によってコードされる、単離されたヒトNTN-2ポリペプチド。７．配列番号４に記載のようなアミノ酸配列を有する、単雛されたヒトNTN-2 ポリペプチド。８．前記宿主細胞中に請求項３または４に記載のベクターを含む、ヒトNTN-2 の産生のための宿主−ベクター系。９．前記宿主細胞が、細菌、酵母、昆虫、または哺乳動物細胞である、請求項８に記載の宿主−ベクター系。１０．ケルベロスの産生を可能にする条件下で請求項８または９に記載の宿主 −ベクター系の細胞を増殖させる工程、およびこのように産生したヒトNTN-2を回収する工程を包含する、ヒトNTN-2を産生する方法。１１．請求項６または７に記載のヒトNTN-2を特異的に結合する抗体。１２．モノクローナル抗体である、請求項１１に記載の抗体。１３．請求項６または７に記載のヒトNTN-2、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。１４．請求項１１または１２に記載の抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。１５．ヒトまたは動物の体の処置の方法における、あるいは診断方法における使用のための、請求項６または７に記載のヒトNTN-2、請求項１１または１２に記載の抗体、あるいは請求項１３または１４に記載の組成物。１６．請求項１０に記載の方法によって産生されるポリペプチド。１７．免疫グロブリン定常領域に融合されたヒトNTN-2を含む、リガンド体。１８．前記免疫グロブリン定常領域が、ヒトIgG1のFc部分である、請求項１７に記載のリガンド体。１９．ヒトまたは動物の体の処置の方法における、あるいは診断方法における使用ための、請求項１７または１８に記載のリガンド体。２０．配列番号４に記載のようなアミノ酸配列を含むポリペプチド。