JP2004506021A - T細胞媒介性病態を改変するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、患者のT細胞媒介性病態を改変する方法を提供する。
【解決手段】この方法は、少なくとも1つおよび/または2つのキメラタンパク質を含有する組成物を投与する。キメラタンパク質はそれぞれ、T細胞媒介性病態の患者由来の特定のT細胞のTCRのVαまたはVβ領域のいずれかの少なくとも一部、および免疫グロブリン定常領域を含有する。Vαおよび/またはVβ領域をコードする遺伝子および免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子を単離し発現ベクターに挿入する。キメラタンパク質はその発現ベクターを昆虫細胞系統に導入することにより調製される。キメラタンパク質は抗体アフィニティーカラムを使用して精製され、次いで免疫学的担体キーホールリンペットヘモシニアン(KLH)と化学的に会合させる。会合体はT細胞媒介性病態の患者由来の特定のT細胞から特異的に調製されたキメラタンパク質を含有しているので、それを顆粒球−マクロファージ−CSFなどのサイトカインまたはケモカインと、またはそれ無しで投与すると、このようなT細胞媒介性病態を改変するための免疫応答を誘導させることができる。
【選択図】図1
【解決手段】この方法は、少なくとも1つおよび/または2つのキメラタンパク質を含有する組成物を投与する。キメラタンパク質はそれぞれ、T細胞媒介性病態の患者由来の特定のT細胞のTCRのVαまたはVβ領域のいずれかの少なくとも一部、および免疫グロブリン定常領域を含有する。Vαおよび/またはVβ領域をコードする遺伝子および免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子を単離し発現ベクターに挿入する。キメラタンパク質はその発現ベクターを昆虫細胞系統に導入することにより調製される。キメラタンパク質は抗体アフィニティーカラムを使用して精製され、次いで免疫学的担体キーホールリンペットヘモシニアン(KLH)と化学的に会合させる。会合体はT細胞媒介性病態の患者由来の特定のT細胞から特異的に調製されたキメラタンパク質を含有しているので、それを顆粒球−マクロファージ−CSFなどのサイトカインまたはケモカインと、またはそれ無しで投与すると、このようなT細胞媒介性病態を改変するための免疫応答を誘導させることができる。
【選択図】図1
Description
【0001】
関連出願
本出願は、「イディオタイプワクチンの調製方法」と題する米国仮出願番号60/224,723、「組換え免疫グロブリンを調製するための発現ベクター」と題する米国仮出願番号60/224,722、および「T細胞媒介性病態を改変するための方法および組成物」と題する米国仮出願番号60/266,133の優先権を主張する。
【0002】
【技術分野】
本発明は一般に、免疫学および免疫療法の分野に関する。詳細には、本発明はT細胞媒介性病態、例えばT細胞悪性腫瘍および/または自己免疫疾患を改変するための方法および組成物に関する。
【0003】
【発明の背景】
本発明は一般に、免疫学および免疫療法の分野に関する。詳細には、本発明はT細胞媒介性病態、例えばT細胞悪性腫瘍および/または自己免疫疾患を改変するための方法および組成物に関する。
免疫系は抗体媒介性および細胞媒介性の応答を生じさせる。それぞれのタイプの免疫応答は、B細胞(抗体性応答)およびT細胞(細胞性応答)のリンパ球の型によって調節されている。T細胞は、特定の外来タンパク質(抗原)と、その一部が主要組織適合複合体(MHC)と関連する場合に主として抗原提示細胞(APC)を介して結合し、抗原提示細胞では抗原が断片にまで消化されてそのMHCと結合するAPCの表面に提示される。
【0004】
T細胞リンパ腫は、免疫系を機能傷害におとしめるT細胞複製の不良を原因とするT細胞媒介性病態である。T細胞リンパ腫は、現在の治療法では有効に処置するのが困難であり、さらなる治療上のストラテジーが医師のさらなる手段として望まれる。
【0005】
他のT細胞媒介性病態には、宿主自身の免疫系が宿主自身の組織を攻撃する自己免疫疾患として分類される、増加途上の多くのヒト疾患が含まれる。T細胞は免疫系の最初の調節物質の1つであり、このような自己免疫病態に対して直接的または間接的に作用する。自己免疫疾患の例としては、慢性関節リウマチ(RA)、重症筋無力症(MG)、多発性硬化症(MS)、全身性エリテマトーデス(SLE)、自己免疫性甲状腺炎(橋本病)、グレーブス病(Graves’ disease)、炎症性大腸疾患、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎、および特定の糖尿病が挙げられる。これら自己免疫疾患の現在の処置は治療するのでなく、症状に対処するのみである。
【0006】
現在、これらのおよび他の自己免疫疾患には、T細胞レセプター(TCR)がMHC/自己抗原(または非自己抗原)複合体と結合することにより刺激されたTヘルパー細胞の作用が関与していることが知られている。自己免疫疾患の可能性ある処置として、MHC/抗原複合体とTCRとの相互作用を妨害することが提案されている。
【0007】
殆どのTリンパ球の表面に見出されるTCRは、αおよびβ鎖を最も普通に含むヘテロ二量体の一体化(インテグラル)膜タンパク質である。TCRの全体三次元構造は、αおよびβ鎖がそれぞれ抗原認識に関与するアミノ末端可変(V)領域および細胞内部への認識事象をシグナリングするのに重要なカルボキシ末端定常(C)領域を含む点において、B細胞上の細胞表面関連免疫グロブリン(Ig)と類似している。β鎖は、多様性(D)および結合(J)遺伝子セグメントによってコードされている付加的なアミノ酸をさらに含む。これらのV、D、JおよびC遺伝子セグメントは離れて位置し、染色体上その配座は分離している。Vβ、Dβ、JβおよびCβ遺伝子セグメントは再構成され、β鎖をコードする機能的な転写単位が創製される。機能的なα鎖転写単位は、Vα、JαおよびCαセグメントの再構成によって形成される。Vα、JαおよびCα遺伝子セグメントおよびVβ、Dβ、JβおよびCβ遺伝子セグメントの、リンパ球クローンにおけるこのユニークな再構成により、特定のリンパ球においてのみ見出されるユニークなタンパク質決定基、イディオタイプ(Id)が生じる。
【0008】
TCR分子を免疫グロブリン分子と区別する重要な相違が存在する。免疫グロブリンは一般に、B細胞抗原レセプターまたは分泌型分子としてのリガンドを液相において認識し、他方TCRは、他の細胞表面に存在するMHCクラスIおよびII分子と関連しているタンパク質抗原由来のペプチド断片としてのリガンドのみを認識する。さらに、免疫グロブリンとは異なり、TCR mRNAの選択的スプライシングは分泌型TCR鎖を生じるために起こらず、従ってTCR分子はT細胞の表面上の一体化膜タンパク質としてのみ存在する。最後に、T細胞が抗原認識の後に活性化されれば、TCR可変領域遺伝子セグメントの超変異は起こらず、これは、全体変異を受けてリガンドに対する親和性を増大させる、B細胞における免疫グロブリンのV遺伝子セグメントと対照的である。
【0009】
自己免疫疾患の膨大な研究により、現在、T細胞およびその発現TCR鎖は他のT細胞による免疫調節の標的となり得ることが多く報告されている(Vandenbark et al., ”Human TCR as antigen: Homologies and potentially cross−reactive HLA−DR−2 restricted epitopes with the AV and BV CDR2 loops,” Critical Reviews in Immunol., 20:57−83, 2000)。TCR鎖のペプチド断片は酵素学的にプロセッシングされた後、MHCクラスIおよびクラスII分子とともに活性化T細胞の表面に提示されると、現在考えられている。MHCクラスII分子は、活性化された後のT細胞上にのみ見出され、最近の証拠は、TCRペプチドの提示は、活性化の後にその発現が増大されるMHCクラスI分子を介して起こることを示している(Ware et al., Immunity 2:177−184, 1995; Jiang et al., Immunity 2:185−94, 1995)。このMHC/TCRペプチド複合体は、MHCクラスI拘束自己CD8+およびMHCクラスII拘束CD4+エフェクターT細胞の形態で自己調節免疫を誘導する。T細胞媒介性自己免疫疾患の準備段階において選択されたTCRペプチドワクチンの免疫調節性が報告されている(Gold et al., Critical Reviews Immunol., 17:507−10, 1997)。さらに、全TCR鎖はT細胞上にクローン的に分配されるので(B細胞のクローンにおける免疫グロブリンのように)、無傷の機能的TCRはT細胞リンパ腫にとっての可能性ある腫瘍特異的抗原としての候補である。無傷のTCRを抗原として使用する不利益のひとつは、αおよびβ鎖の定常領域に対する免疫応答が惹起されることに由来し得る合併症である。
【0010】
TCR鎖に特異的な免疫調節性細胞性応答は、TCR鎖の可変領域の決定基をコードするする生殖系列に対し、明らかに攻撃する。TCR鎖はIg分子のように変異を受けないので、包括的TCR鎖を治療目的で使うことが動物実験の証拠によって示唆された。細菌にて調製された分泌型TCRβ鎖(Kumar, J.Immunol. 159:5150−56, 1997)、TCRβ鎖を発現するワクシニアウイルス構築物(Chundru, J.Immunol. 156;4940−45, 1996)、または単一のTCRβ鎖をコードする「裸の」DNA構築物(Waisman, Nat.Med. 2:899−905, 1996)によるワクチン接種はすべて、TCRβ鎖を免疫するための調節T細胞応答を誘導させた。
【0011】
化学的性質が確定されたユニークなTCRモチーフを基本とするペプチドワクチンがT細胞媒介性病態を処置する治療物質として使用され試験された。研究者のなかには、TCR鎖のフレームワーク/CDR領域誘導化ペプチドは、特定の疾患において過剰発現するTCR鎖から誘導されるペプチドで処置すると、その動物において自己免疫疾患の発現を予防できることを示したものがいる。これは、T細胞が自身の内生TCR鎖をプロセッシングし、それを再度他のT細胞上に提示させてT細胞−T細胞相互作用を機能させ、病原細胞を調節できることを示している。しかし、TCRペプチド認識には、TCR鎖がMHC分子とともに標的T細胞表面上に提示されるペプチド断片にプロセッシングされる必要があり、そのため特定のTCR由来のどのペプチドが臨床において有効であるかを前もって予測することは極めて困難である。これは、TCRペプチドに対するMHCクラスII拘束応答を証明する近交系げっ歯類における生存試験によって証明されている (Gold et al., Critical Reviews Immunol., 17:507−10, 1997, supra)。従って、殆どのタンパク質同様、Vβ配列およびMHCの両者によってどのエピトープがT細胞の刺激因子であるかが決定され、相当するTCRペプチドがVβアミノ酸配列内のどこに存在するのかを予測する明確な規則はない。この試みは、ヒト人口に存在するMHC多型の膨大さによってより複雑となっている。
【0012】
TCRイディオタイプを調製しT細胞性免疫応答を調節するのは、TCRが一体化膜タンパク質であり普通は可溶性タンパク質として合成も分泌もされないため、困難である。従って、病原細胞、例えば腫瘍細胞からTCRの充分量を、治療目的のため慣用的に精製するのは実際的でない。
【0013】
大量の分泌型へテロ二量体TCRを調製する試みが昆虫細胞を用いてなされた。分泌型分子は全VαJαCα/VβDβJβCβ細胞外ドメインを含み、コンホメーション的に特異的な抗−TCR Vβ抗体による検出に基づいて、正しく折り畳まれていた。しかし、分泌型分子の産生レベルは低くなる場合がある。他の研究者は、同起源のパートナーMHC+ペプチドを認識する機能的TCRを産する可溶性へテロ二量体構造を作成する一定の目的で、種々の方法を用いて組換えTCR鎖を調製した。
【0014】
治療目的に幾つかの異なる方法によりTCRの可溶性一部を調製する努力は別の顕著な問題をはらんでいた。その問題および関連する努力は次の通りである:(1)封入体として精製した後再折り畳みできる大腸菌における単一鎖Fv構築物の産生(Kurucz et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 90:3830−34, 1994)、(2)細菌における組換えTCR分子の産生(Kumar et al., J.Immunol. 159;5150−56, 1997; Offner et al., J.Immunol. 161:2178−86, 1998; Novotny et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 88:8646−50, 1991)、(3)TCR可変領域およびすべてまたは殆どすべてのTCR定常領域と、哺乳動物細胞から分泌し得るIg定常領域との融合によって作成されるキメラ分子の産生(Gregoire et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 88:8077−81, 1991; Weber et al., Nature 356:793−96, 1992; Eilat, Proc.Nat.Acad.Sci. 89:6871−75, 1992)、(4)ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼCの作用により切断できるホスファチジルイノシトールグリカン結合を介して哺乳動物細胞の表面にTCRの細胞質外ドメインを発現させること(Lin et al., Science 249:677−79, 1990; Chung et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 91:12654−58, 1994; Okada et al. J.Immunol., 159:5516−27, 1997)、および(5)分泌型タンパク質として単一またはヘテロ二量体完全TCR鎖を昆虫細胞において発現させること(Kappler et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 91:8462−66, 1994)。これら細菌を利用する方法に付随する欠点は、確実なる可溶性と可能性あるエンドトキシン混入の問題であり、これらは細菌にて作成されるタンパク質の簡便な収獲と高い収量を不可能にする。哺乳動物細胞にて作成されるタンパク質では、ウイルス混入の問題がある。この問題は、リン脂質関連タンパク質を精製する際の困難性と相俟って複雑となり、上記方法の臨床使用の魅力を大幅に低下させる。
【0015】
所望の結合特異性をコードする遺伝子を同定するには有用であるが治療応用には一般に有益でない大腸菌において抗体を産生させると、さらなる困難性に遭遇する。典型的には、抗体の抗原結合断片であるFabまたはFvのみが細菌から分泌される(see, e.g., Kurucz et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 90:3830−34, 1994)。全鎖の4量体IgGを大腸菌から産生させる稀な場合、抗体は不適切にグリコシル化される。適当なグリコシル化がなければ、抗体は、抗体指向性細胞毒性(ADCC)の細胞融解活性や能動免疫療法を強力にする補体活性化を惹起させない。他方、哺乳動物発現系はグリコシル化された抗体を産生する。しかし、FDAの「考慮すべき点」のCBER部の最近の改変では、哺乳動物細胞の発現系において産生されるモノクローナル抗体に付随するウイルス混入への問題が明らかに警告されている。さらに、哺乳動物発現系にて産生された遺伝子操作抗体は極めて高価であると予想される (1回投与当たり$1500−$5000)。
【0016】
バキュロウイルス発現系は、大腸菌および哺乳動物細胞における抗体産生の優れた代替系である。バキュロウイルス系によれば、生物学的に活性なタンパク質を真核生物細胞において高収量(1−100 mg/L)で得ることが可能である(Haseman et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 87:3942−46, 1990)。バキュロウイルス/昆虫細胞系では、組換えタンパク質が原核生物にて過剰発現する際にしばしば遭遇する可溶性の問題を回避できる。さらに、昆虫細胞は、真核生物細胞に存在する、正しい折り畳みに関与する翻訳後修飾機構、ジスルフィド形成、グリコシル化、β−ヒドロキシル化、脂肪酸アシル化、プレニル化、リン酸化およびアミド化を含んでいる。ヒト結腸直腸癌腫細胞を認識する機能的なグリコシル化モノクローナル抗体のバキュロウイルス系における産生が最近証明された(Nesbit, J.Immunol.Methods, 151:201−208, 1992)。このバキュロウイルス産生抗体はADCCを媒介することが示された、これとは対照的に、細菌から産生される抗体はグリコシル化されず、よって検出可能なADCC活性は認められなかった。
【0017】
幾つかの場合において、生物学的活性タンパク質の発現におけるバキュロウイルス系の利用性が、過剰なタンパク質分解的変性無しに組換えタンパク質を効率的に可溶化できないことから障害されている。昆虫細胞における組換えタンパク質の発現の際に遭遇する可溶性およびタンパク質分解の問題を回避するため、バキュロウイルス移入ベクターが生物学的活性タンパク質の効率的分泌のために開発された。この宿主昆虫細胞から組みタンパク質を分泌させるベクターは、機能的分泌リーダー配列をポリヘドリンプロモーターの下流に挿入することにより構築される。cDNA配列のインフレーム挿入により、組換えタンパク質を分泌経路に置く異種シグナル配列を含むタンパク質が合成される。ヒトおよび昆虫リーダー配列はともに、昆虫細胞からの異種タンパク質の分泌を最大にするために試験された。ヒト胎盤アルカリホスファターゼシグナル配列(MLGPCMLLLLLLLGLRLQLSLG (配列番号:1);DNA配列:ATG GTG GGA CCC TGC ATG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTA GGC CTG AGG CTA CAG CTC TCC CTG GGC (配列番号:2))およびミツバチメリチンシグナル配列(MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(配列番号:3);DNA配列:ATG AAA TTC TTA GTC AAC GTT GCA CTA GTT TTT ATG GTC GTG TAC ATT TCT TAC ATC TAT GCG (配列番号:4))はともに、多くの細菌およびヒトタンパク質の分泌に有用であることが証明されている(Mroczkowski et al., J Biol. Chem. 269:13522−28, 1994およびTessier et al., Gene 98:177−83, 1991)。
【0018】
バキュロウイルス発現系を利用し、McKeever et al. (J.Exp.Med 184:1755−68, 1996)は、マウスIgG1重鎖のヒンジ、CH2およびCH3ドメインが連結したTCR鎖の細胞外ドメイン(Vα−CαおよびVβ−Cβ)からなるキメラタンパク質の産生を可能にした。膵β細胞抗原に特異的なT細胞クローン由来の、得られた可溶化TCR−IgG1キメラタンパク質を使用し、非肥満糖尿病(NOD)雌性マウスを免疫した。交配後、これらマウスの子孫を、母方から移入された抗−TCR抗体の糖尿病発現活性に対する効果について調べた。これらの試験により、可溶型で投与すると、TCRのαまたはβ鎖の可変領域は、誘導された系統のマウスにおいて免疫原性を示し得ることが証明された。これらの試験は、可溶性TCR−IgG1による免疫が天然のクローンタイプエピトープを認識する抗体の産生を刺激し得ることをさらに示している。McKeever et al.は、比較的単純な発現および精製ストラテジーを使用し、すべてのαおよびβ鎖を含有する可溶性TCR−IgG1タンパク質であって、そのTCR一部がTCRの機能的に活性な細胞表面型に見出されるものと交叉反応し免疫原性であるクローンタイプ決定を保持しているものを産生させることができると、明瞭に証明した。
【0019】
他の幾人かの研究者も、Ig鎖との融合分子としてTCR分子を種々の方法により発現させている。しかし、これらすべての研究はTCRの全構造を、即ち可変および定常領域の両者を、種々のIg骨格の一部と融合するのに使用し、すべてが初期の目的にかなうTCR可変領域の認識機能を再生していた。さらに、種々の形態のTCr鎖が、自己免疫疾患を予防/処置するための動物実験においてワクチンとして使用できることが証明されている。例えばOkada et al. (J.Immunol., 159:5516−27, 1997)には、哺乳動物細胞から作成した可溶性TCR鎖がマウスのT細胞腫瘍を処置するのに使用できることが示されている。しかし、上記のように、これらTCR分子の生産は困難であり、その産生レベルは低い。
さらに、TCRタンパク質を使用すると、獣医学の分野において治療的価値を有することが予測されている(see International Patent Application No. PCT/US99/17309, WO 00/06733, filed 29 July 1999)。
【0020】
【発明の概要】
本発明は、患者のT細胞媒介性病態を改変する方法を提供する。この方法は、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を有する少なくとも1つのキメラタンパク質を含有する組成物を投与する。他の好ましい態様では、ここでのキメラタンパク質は、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、リンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。さらに好ましい態様では、キメラタンパク質におけるTCR定常領域の一部は、約3−約30の連続アミノ酸残基である。リンカー領域はTCR定常領域の一部を含むことができる。さらに好ましい他の態様では、キメラタンパク質におけるTCR定常領域の一部は、定常領域の免疫グロブリン折り畳みにおける最初のシステイン残基を含み、そこまでのアミノ酸残基を含有する。この組成に使用されるVβまたはVα鎖はT細胞媒介性病態を有する患者のT細胞由来の特定のTCRと関連している。このような組成物を患者に投与した後、患者におけるT細胞媒介性病態は改変される。
【0021】
本発明はさらに、2つの異なるキメラタンパク質を含む組成物を投与することによる、患者のT細胞媒介性病態を改変する方法をも提供する。それぞれのキメラタンパク質は、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部と連結されている、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部を有している。他の好ましい態様では、ここでのキメラタンパク質は、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、リンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。さらに好ましい態様では、キメラタンパク質におけるTCR定常領域の一部は、約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26、または30の連続アミノ酸残基である。リンカー領域はTCR定常領域の一部を含むことができる。さらに好ましい他の態様では、キメラタンパク質におけるTCR定常領域の一部は、定常領域の免疫グロブリン折り畳みにおける最初のシステイン残基のアミノ末端側までのアミノ酸残基の幾つかまたはそのすべてを含有する。キメラタンパク質の一部であるVβおよび/またはVα鎖はT細胞媒介性病態を有する患者のT細胞由来の特定のTCRと関連している。
【0022】
患者由来のユニークなVαおよび/またはVβ鎖を含有する特異的TCRタンパク質は治療用組成物として開発できる。慢性関節リウマチ(RA)、重症筋無力症(MG)、多発性硬化症(MS)、全身性エリテマトーデス(SLE)、自己免疫性甲状腺炎(橋本病)、グレーブス病(Graves’ disease)、炎症性大腸疾患、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎および特定の糖尿病などの、自己免疫T細胞病態に関連するT細胞を、疑われる自己抗原を使用して選択的に刺激し、増殖させることができる。あるいは、自己免疫の攻撃を受けている組織から単離したT細胞を、T細胞成長因子、例えばL−2、IL−4などを使用して選択的に増殖できる。多発性硬化症に関連するT細胞は、Wilson et al. (J. Neuroimmunol. 76:15−28, 1997)による方法保父によって特徴付けされている(引用により、その図面、数値および表のすべてが本明細書に包含される)。他のT細胞媒介性病態に関連するT細胞は、Wilson et al.に記載されている方法を提供して特徴付けできる。少数の病原性T細胞を精製後、その細胞から発現されるT細胞レセプターの可変部分を本明細書に記載の方法によりPCRを用いてクローニングすることができる。クローニングすると、T細胞病態に特異的に関連するレセプターのVαおよび/またはVβ部分を使用し、本明細書に記載のバキュロウイルス系にて発現できるキメラタンパク質を作成できる。
【0023】
上記の組成物およびキメラタンパク質に使用される免疫グロブリン定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE重鎖、κおよびλ軽鎖のなかから選ばれるタンパク質の一部であることができる。ある態様では、キメラタンパク質は免疫グロブリン定常領域とともにTCRのVβまたはVα鎖のいずれかのみを含有する。キメラタンパク質の例としては、Vβ−IgGγ1、Vα−κ、またはVα−γ、またはVα−IgGγ1、Vβ−κ、またはVβ−λが挙げられる。別の態様の組成物は、免疫グロブリン定常領域とともにTCRのVβおよびVα鎖をそれぞれ含む2つのキメラタンパク質を含有する。この例としては、Vβ−IgGγ1およびVα−κ、またはVβ−IgGγ1およびVα−λ、またはVα−IgGγ1およびVβ−κ、またはVα−IgGγ1およびVβ−λが挙げられる。さらに特定の好ましい態様では、キメラタンパク質は、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、リンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。特定の好ましい態様では、キメラタンパク質におけるTCR定常領域の一部は、約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26または30の連続アミノ酸残基である。さらに好ましい他の態様では、キメラタンパク質におけるTCR定常領域の一部は、免疫グロブリン折り畳みにおける最初のシステイン残基のアミノ末端側までのアミノ酸残基の幾つかまたはそのすべてを含有する。この例としては、Vβ−Cβ−IgGγ1およびVα−Cα−κ、またはVβ−Cβ−IgGγ1およびVα−Cα−λ、またはVα−Cα−IgGγ1およびVβ−Cβ−κまたはVα−Cα−IgGγ1およびVβ−Cβ−λが挙げられる。
【0024】
本発明はまた、組換えDNA技法および発現系を用いてキメラタンパク質を調製する方法を提供する。この方法は次の工程を含む:(a)T細胞媒介性病態を有する患者のT細胞由来の特定のTCRのVβまたはVα鎖をコードする遺伝子を単離し、(b)TCRのVβまたはVα鎖をコードする遺伝子および免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子を、キメラタンパク質を発現できる発現ベクターに挿入し、(c)得られた発現ベクターを昆虫細胞系統に挿入して発現させ、キメラタンパク質を産生させ、そして(d)得られたキメラタンパク質を単離する。キメラタンパク質の調製方法はさらに、TCRのVβまたはVα鎖のいずれかをコードする遺伝子および第2の免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入し、第2のキメラタンパク質を発現させる工程をさらに含む。TCRのVβまたはVα鎖をコードする単離した遺伝子はさらに、TCR定常領域における約30個以下の一部をさらに含むことができる。
【0025】
本発明はさらに、患者のT細胞媒介性病態を改変するための組成物を提供する。この組成物は、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を有する少なくとも1つのキメラタンパク質を含有する。他の好ましい態様では、キメラタンパク質は、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、そのTCR鎖の定常領域における約30アミノ酸残基以下の一部、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。さらに好ましい態様では、キメラタンパク質におけるTCR定常領域の一部は、約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26、または30個の連続アミノ酸残基である。さらに好ましい他の態様では、キメラタンパク質におけるTCR定常領域の一部は、定常領域の免疫グロブリン折り畳みにおける最初のシステイン残基のアミノ末端側までのアミノ酸残基の幾つかまたはそのすべてを含有する。キメラタンパク質の一部であるVβまたはVα鎖はT細胞媒介性病態を有する患者のT細胞由来の特定のTCRと関連している。このような組成物はさらに、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、および第2の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を有する第2のキメラタンパク質を含有する。他の好ましい態様では、キメラタンパク質は、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、リンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。さらに好ましい態様では、リンカー領域は約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26または30の連続アミノ酸残基であるTCR定常領域の一部を含むことができる。さらに好ましい他の態様では、キメラタンパク質におけるTCR定常領域の一部は、定常領域の免疫グロブリン折り畳みにおける最初のシステイン残基のアミノ末端側までのアミノ酸残基の幾つかまたはそのすべてを含有する。第2のキメラタンパク質の一部であるVβまたはVα鎖はT細胞媒介性病態を有する患者のT細胞由来の特定のTCRと関連している。
【0026】
本発明の1つの態様では、組成物は、全Vβ領域および免疫グロブリンIgGγ1のヒト定常領域を含む第1のキメラタンパク質(TCR Vβ−IgGγ1)、および全Vαおよびヒトκまたはλ定常領域を含む第2のキメラタンパク質(TCR Vα−κまたはTCR Vα−λ)の2つのキメラタンパク質を含む。他の好ましい態様では、キメラタンパク質のいずれかまたは両者は、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、リンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。さらに好ましい態様では、キメラタンパク質のいずれかまたは両者におけるリンカー領域は、約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26または30の連続アミノ酸残基であるTCR定常領域の一部を含むことができる。
【0027】
本発明の1つの態様では、組成物は、第1のキメラタンパク質が全Vβ領域、TCRβ鎖定常領域(Cβ)の30アミノ酸残基以下の一部および免疫グロブリンIgGγ1のヒト定常領域(TCR Vβ−IgGγ1)を含む (TCR VβCβ (1−30)−IgGγ1)、2つのキメラタンパク質を含有する。他の好ましい態様では、Cβの使用する一部は、約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26または30の連続アミノ酸残基である。第2のキメラタンパク質は、全Vα、TCRα鎖定常領域(Cα)の30アミノ酸残基以下の一部よびヒトκ定常領域を含有する(TCR VαCα (1−30)−κ)。好ましい態様では、Cαの使用する一部は、約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26または30の連続アミノ酸残基である。
【0028】
本発明の別の態様では、組成物は、患者のT細胞由来の特定のTCRのVβまたはVα鎖のいずれか、および免疫グロブリン定常領域を含有する単一のキメラタンパク質を含有する。この例としては、キメラタンパク質Vβ−IgGγ1、Vα−κ、またはVα−λ、またはVα−IgGγ1、Vβ−κ、またはVβ−λが挙げられる。他の好ましい態様では、キメラタンパク質は、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、リンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。さらに好ましい態様では、キメラタンパク質におけるいずれかまたは両者のリンカー領域は、約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26、または30の連続アミノ酸残基であるTCR定常領域の一部を含有できる。
【0029】
本発明は1つの態様として、キメラタンパク質を発現するために使用される発現ベクターはバキュロウイルスベクターである。このベクターは、プロモーター、分泌シグナル配列およびキメラタンパク質をそれぞれ有する2つの発現カセットを含む。1つの発現カセットは、ミツバチメリチン分泌シグナル配列と連結しているバキュロウイルスAcNPVp10プロモーターを含む。他の発現カセットは、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌配列と連結しているポリヘドリンプロモーターを含む。このプロモーターおよびシグナル配列に加え、当業者に知られている他のプロモーターおよびシグナル配列をそれらに代替することができる。好ましい態様では、特定の患者由来の免疫グロブリン遺伝子に関連する内生分泌配列を使用する。TCRのVβまたはVα鎖、リンカー領域および免疫グロブリン定常領域の遺伝子を別個におよび/または一緒にバキュロウイルスベクターの上記発現カセットに挿入し、1つまたは2つのキメラタンパク質を発現させる。好ましい態様では、免疫グロブリン重鎖の定常領域、例えばIgG1をVβまたはVα鎖のいずれかとともにポリヘドリンプロモーターによって制御する。
【0030】
産生されたキメラタンパク質は抗−免疫グロブリンまたはIg結合タンパク質、例えば免疫グロブリン重鎖の定常領域に対するプロテインA、免疫グロブリンカッパ軽鎖の可変領域に対するプロテインL、および/または免疫グロブリン結合ドメインと結合する他のタンパク質などのアフィニティーカラムを用いて精製する。
【0031】
本発明はさらに、キメラタンパク質とキーホールリンペットヘモシニアン(KLH)などの担体タンパク質との共有結合も包含する。本発明の組成物はまた、顆粒球−マクロファージ−CSFなどのサイトカイン、または単球走化性タンパク質3(MCR3)などのケモカインとともに投与することができる。キメラタンパク質を含有する本発明の組成物は、T細胞媒介性病態を有する患者のT細胞由来の特定のTCRに特異的に関連しているため、この組成物を投与すれば、特定のVαまたはVβセグメントが関与しているイディオタイプ特異的疾患に対する免疫応答を誘導する。VαまたはVβセグメントなどのTCR V領域セグメントの拘束レパートリーを使用するT細胞が関与している自己免疫疾患に関連するT細胞に対する同様の応答がある。従って、本発明の組成物を投与すれば、患者のT細胞媒介性病態および/または自己免疫疾患が改変される。本発明組成物の投与経路には経口、吸入、注射、経皮的供給があるが、これらに限定されない。
【0032】
本明細書に引用するすべての米国特許および特許出願、外国特許および特許出願、科学雑誌、製本および刊行物は図面、数値および表を含みすべて、引用により本明細書に包含される。
【0033】
【好ましい態様の詳しい説明】
本発明では、免疫系のユニークな特異性をT細胞悪性腫瘍および病態の処置に適用する。本発明では、T細胞レセプターの可変領域をコードするはDNA配列を、ユニークなTCR V遺伝子ファミリーそれぞれの5’末端由来のプライマー、およびTCR定常領域プライマーを用いてクローニングした。典型的には、この方法では、PCRなどの幾つかの適当なクローニング手法の1つを利用する。α鎖およびβ鎖に対するTCR定常領域プライマーを使用して可変領域にクローニングし、VαまたはVβおよびIgGγ1定常領域からなるキメラタンパク質を調製した。さらに、当業者ならば、この系において同等に使用し同等の結果を得るための種々のプライマーを選択し、簡便なサブクローニングのための抗体可変領域の対を増幅できる。あるいは、キメラタンパク質を調製する工程として、5’RACEなどの手法を用い、TCR鎖の可変領域をクローニングできる。
【0034】
このキメラタンパク質はバキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞にて調製した。CαまたはCβの全ドメインをすべて含まないで調製されるキメラタンパク質は、α鎖およびβ鎖がすべて存在するキメラTCR/Ig分子から区別できる。例えば、これらのキメラタンパク質は、TCR可変領域に指向したコンホメーション特異的抗体、例えば抗−マウスVβ6(clone RR4−7)および抗−マウスVβ12(clone MR 11−1)(PharMingen, San Diego, Ca.)によって認識されない。これらのユニークなキメラタンパク質は、治療を複雑にしかねない正常な決定基が存在せず、自己免疫反応を刺激しないので、ワクチン療法の優れた抗原として期待される。さらに、可溶性TCRキメラタンパク質を調製するこれまでの試みは、適当なペプチド/MHC複合体に結合させるため、TCRの天然のコンホメーションに適合させたタンパク質を目的としていた。
【0035】
本発明は、T細胞媒介性病態および自己免疫疾患の有効な処置に対する大きな要求を満たすものである。本発明は、T細胞媒介性病態に関与するT細胞表面に存在するユニークな細胞表面抗原(イディオタイプ)をうまく利用するものである。そのためには、患者特異的にワクチンを調製する必要がある。このようなワクチンは特定患者に見出される病原性T細胞にユニークなマーカーに対して加工されることにより、優れて選択的である。
【0036】
本発明を特定の患者に対して加工するには、まず、ユニーク抗原を同定、単離し、次いでそのような抗原を調製する手段を探索する必要がある。抗原の調製は、当業者に利用可能な種々の多くの手法により行うことができる。例えば、最近開発された本発明の要求にかなう方法は、新規なバキュロウイルス/昆虫細胞発現系を利用し、これは最近、免疫療法のための機能的抗体を効率的に調製するために開発されたものである(see U.S. Provisional Application Serial No. 60/244,722, entitled ”Expression Vectors for Production of Recombinant Immunoglobulin”)。ヒトカッパ軽鎖またはIgG1重鎖を有するキメラタンパク質として簡便にサブクローニングし発現させるため、抗体可変領域の対を増幅するのに、2つの通常遺伝子特異的プライマーのみを必要とするようにバキュロウイルス発現ベクターを作製した。重鎖および軽鎖を分泌経路に置くための異種分泌シグナル配列を組込み、大量の活性免疫グロブリンを昆虫細胞から発現させた。このようなベクターは、ヒトカッパ定常領域とインフレームにありヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列を介して分泌されるカッパ軽鎖可変領域(VL)、およびミツバチメリチン分泌シグナル配列に先行されるヒトIgG1定常ドメインとインフレームにある重鎖可変領域(VH)を発現させるのに有用である。モノクローナル細胞系統由来のまたはファージディスプレイクローニングにより同定されるマウスまたはヒトモノクローナル抗体がこのベクターにおいて、2つの単純なサブクローニング工程を経て、全ヒトIgGl/κまたはIgGl/κとして簡便に発現できる。
【0037】
本発明では、融合Vα鎖、リンカーおよびIgG1重鎖として簡便にサブクローニングし発現させるため、TCR可変領域の対を増幅するのに、2つの通常遺伝子特異的プライマーのみを必要とするようにバキュロウイルス発現ベクターを作製した。VαおよびVβ鎖を分泌経路に置くための異種分泌シグナル配列を組込み、大量のキメラタンパク質を昆虫細胞から発現させる。このようなベクターは、Igカッパ定常領域とインフレームにありヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列を介して分泌されるTCRα鎖可変領域(Vα)、およびヒトIgG1定常領域とインフレームにありミツバチメリチン分泌シグナル配列を介して分泌されるTCRβ鎖可変領域(Vβ)(またはその逆)を発現させるのに有用である。
【0038】
バキュロウイルス系を使用する組換えタンパク質の発現により、細菌でのタンパク質作成に付随する多くの欠点を伴うことなく、さらに哺乳動物使用に伴う煩雑さを回避して、大規模な生物学的活性タンパク質が生産できる。例えば、市販されているバキュロウイルスシグナルプロモーターベクター(pVL1392)、または二次元プロモーターベクター(pAcUW51)(両者ともBD−Pharmingenから入手可能)を使用し、単量体β鎖またはヘテロ二量体αβ対として血清不含培地により分泌TCRラット鎖を調製した。これらの鎖の存在は、抗−Cβ定常領域捕獲抗体(R73, Pharmingen)および抗−Vβ検出抗体(R78; anti−rat Vβ8.2またはHIS 42; anti−rat Vβ16, Pharmingen)を用いるELISAにより、検出される。産生レベルは、およそ300ng/mlと測定された。TCR鎖を作成し、天然のコンホメーションにて分泌させ、αおよびβ鎖を安定なジスルフィド結合へテロ二量体として形成させた(Gold et al., 1997, supra)。
【0039】
特定のVセグメントの特異的エピトープを含む可溶性ヒトTCR断片は、昆虫宿主細胞において遺伝子操作により調製できる。患者由来の特定のVαおよび/またはVβ鎖を含むこのような可溶性組換えTCRタンパク質は治療用組成物に使用できる。患者に投与すれば、T細胞媒介性病態を改変するための細胞性免疫応答がインビボにおいて特異的に誘発されよう。
【0040】
この手法はさらに、B細胞リンパ腫から発現される患者特異的なVHおよびVL遺伝子の迅速な同定とクローニングに適用されており、次いでこれらを組換えIGl/κまたはλ分子として昆虫細胞において発現された(see U.S. Provisional Application Serial No. 60/224,723 entitled ”Method for Producing Idiotype−Vaccine”)。この方法により調製された分子は製剤化され、患者特異的にリンパ腫に対する抗−イディオタイプ細胞性免疫の誘発に使用された。
【0041】
「改変」または「改変する」なる用語は、本発明化合物におけるT細胞媒介性病態の調整能力を意味する。T細胞媒介性病態を改変する化合物は、化合物に対する抗体応答を惹起させてT細胞病態の細胞を破壊する;
T細胞病態の細胞のアポトーシスを誘発する;
T細胞病態の細胞に対する細胞性免疫を誘発してT細胞病態の細胞の発育や***をさらに阻害する;あるいは病原性T細胞の活性を阻害する、などの多くの可能性ある機序によりそのように機能する。改変を起こす正確な機序は決定する必要はないが、T細胞媒介性病態の改変は本発明の分子または組成物を投与することによる何らかの機序により起こるのは確かである。
【0042】
「T細胞媒介性病態」または「T細胞病態」なる用語は、T細胞の不適切な複製または活性により引き起こされる疾患および状態を意味する。好ましい態様では、本発明は、T細胞の不適切な複製によって引き起こされるT細胞リンパ腫であるT細胞媒介性病態の処置に使用される。T細胞リンパ腫は現在利用可能な治療法では有効に処置するのが困難である。T細胞の不適切な複製が関与する他のタイプのT細胞病態には慢性および急性のT細胞白血病および菌状息肉腫が挙げられる。他の好ましい態様では、慢性関節リウマチ(RA)、重症筋無力症(MG)、多発性硬化症(MS)、全身性エリテマトーデス(SLE)、自己免疫性甲状腺炎(橋本病)、グレーブス病(Graves’ disease)、炎症性大腸疾患、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎、および特定の糖尿病などの、宿主自身の免疫系が宿主自身の組織を攻撃する自己免疫疾患として分類される、増加途上の多くのヒト疾患が挙げられる。これら自己免疫疾患を処置する現在の処置方法は疾患を治癒するのでなく、症状を処置するのみである。
【0043】
「T細胞」なる用語は、生物の正常機能における細胞性免疫に関与する、生物の免疫系細胞(即ち、T細胞媒介性病態を経験していないもの)を意味する。
【0044】
「病態」なる用語は、多くの医学領域により異常と認識されている生物(例えばヒト)の状態を意味する。本発明により処置される病態はT細胞の機能または複製の異常を特徴とする。
【0045】
「患者」なる用語は、病態、より具体的にはT細胞病態の処置を必要とする生物を意味する。この用語は、臨床の場において治療物質による処置が必要であると示唆される特定の症状(群)を示す生体を意味する。処置は医学領域において一般に許容されている、または経験されるもののいずれであってもよい。好ましい態様では、患者は、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラットおよびマウスなどの哺乳動物である。さらに好ましい態様では、患者はヒトである。患者の診断は疾患の進行により自発的に、または治療方法や処置の経過とともに変化することがある。
【0046】
「生物」なる用語は単細胞または多細胞であり得る。この用語は、哺乳動物、最も好ましくはヒトを含む。好ましい生物はマウスであり、それは、マウスでの処置または診断の能力がヒトなどの他の生物における機能性を予測させることが多いからである。他の好ましい生物は霊長類であり、それは、霊長類での処置または診断の能力がヒトなどの他の生物における機能性を予測させることが多いからである。
【0047】
「キメラタンパク質」なる用語は、異なる少なくとも2つのタンパク質由来のセグメントを含む単一のポリペプチド鎖を含むタンパク質を意味する。キメラタンパク質のセグメントは異種タンパク質から誘導されなければならず、即ち、キメラポリペプチドのすべてのセグメントが同じタンパク質由来ではない。本発明のキメラタンパク質は、TCRのαまたはβ鎖の一部を含有するが、αまたはβ鎖いずれかの全定常領域を含まない。
【0048】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ペプチド」なる用語は本明細書では交換可能に使用している。
【0049】
「セグメント」または「一部」なる用語は、誘導元の全長ポリペプチドよりも長さが短いキメラタンパク質の供給源として使用されるタンパク質のアミノ酸配列から誘導されるポリペプチドを示す用語として使用している。好ましい態様では、セグメントは少なくとも約10、15、20、21、22、30、40、70、100、150、300、または450アミノ酸長である。このようなセグメントは天然ポリペプチドの1つまたはそれ以上の特性を保持できると考えられる。このような保持される特性の例としては、天然ポリペプチドまたはそのエピトープに特異的な抗体との結合性である。
【0050】
「天然に」または「天然」なる用語は、天然から単離されているタンパク質を意味する。従って、天然に存在するタンパク質とは、それが天然にて見出される形態のタンパク質を意味すると定義できる。天然タンパク質は天然に見出されまたは合成されていてもよいタンパク質と定義できる。また、この用語は、本発明のバキュロウイルス系または親試料の細胞培養によるなどの生物系により産生されるタンパク質にも適用できる。天然タンパク質は変性されていない単離されたタンパク質とも定義できる。「天然」なる用語はまた、ポリペプチドまたはタンパク質が単独でまたは他のポリペプチドとともに折り畳まれ、天然に見出される同様のタンパク質に類似する態様、あるいは翻訳後に修飾(翻訳後修飾)され、天然に見出される同様のタンパク質と類似する態様をも意味する。天然に存在するタンパク質が存在するのは、単一の患者由来の病原性T細胞においてのみであるが、いずれにせよ、これは天然に存在するタンパク質と考えられる。
【0051】
「Vα」および「Vβ」なる用語は、TCRのポリペプチド鎖の可変領域またはそのポリペプチド鎖をコードする核酸を意味する。当業者であれば、これらの用語の意味を理解するものである。可変領域の正確な配列は予測できず、問題の配列を単離することにより決定しなければならない。しかし、TCR遺伝子由来の可変領域の多重サブファミリーが同定され特徴付けされている(See reviews by Arden et al., Immunogenetics, 1995, 42:455−500, Arden et al., Immunogenetics, 1995, 42:501−530, およびClark et al., Immunogenetics, 1995, 42:531−540)。これらVαおよびVβ領域のいずれかを本発明にて使用できる。α鎖の正確な配列はTCRα鎖座のV領域、J領域およびTCRα鎖座の定常領域のクローン的再構成により決定される。β鎖の正確な配列はTCRβ鎖座のV領域、D領域、J領域および定常領域のクローン的再構成により決定される。「Vα」および「Vβ」なる用語はVαまたはVβ鎖の一部またはセグメントをも意味する。VαまたはVβ鎖のセグメントはV領域の少なくとも30アミノ酸を含む。VαまたはVβ鎖のセグメントはV領域のすべてまたは実質的にすべてを含むこともできる。「実質的にすべて」なる用語は可変領域全体の約90%または可変領域全体の約80%を意味することができる。「Vα」および「Vβ」なる用語はまた、上記のポリペプチド鎖の機能的誘導体をも意味する。「全Vα鎖(またはVα鎖全体)」とはα鎖の可変領域のすべてを意味する。「全Vβ鎖(またはVβ鎖全体)」とはβ鎖の可変領域のすべてを意味する。
【0052】
「リンカー領域」または「リンカー」なる用語は可変領域をコードする配列を免疫グロブリン定常領域分子の一部をコードする配列と連結するDNAセグメントを意味する。リンカー配列は通常のクローニングを可能にする合成配列であってよく、またはTCRのCαまたはCβの一部であってよい。いずれの場合でも、キメラタンパク質においてリンカー領域は可変領域の一部と免疫グロブリン定常領域の一部との間のインフレームを妨害しない。「リンカー領域」なる用語はリンカー領域DNA配列がコードするアミノ酸をも含む。「合成リンカー領域」または「合成リンカー」なる用語はT細胞レセプター遺伝子または免疫グロブリン遺伝子以外の供給源から得られるリンカー領域を意味する。好ましい態様では、合成リンカーは研究者によって開発され、インビトロにおいて合成される。合成リンカーはキメラタンパク質におけるT細胞レセプターと免疫グロブリン遺伝子部分との解読枠を破壊しない配列を含む。リンカー領域がTCRのCαまたはCβの一部を含む場合、定常領域の始めと免疫グロブリン折り畳みの最初のシステイン残基との間のアミノ酸の幾つかまたはそのすべてを含むことができる。
【0053】
「Cα」および「Cβ」なる用語は、TCRのポリペプチド鎖の定常領域、またはそのポリペプチド鎖をコードする核酸を意味する。当業者であれば、これらの用語の意味を理解するものである。本発明において定常領域に言及する場合における「セグメント」または「一部」なる用語は、TCRの定常領域のすべてを含むとは限らず、約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26、または30の連続アミノ酸残基を含むことができる。1から約30(両端を含む)の整数を含むあらゆる整数個のコドンがリンカー領域に存在できる。別の態様では、TCRの定常領域アミノ酸の約80%までが存在できる。このセグメントは、免疫グロブリン折り畳みの最初のシステインまでの最初の22個のCα鎖のすべてまたはその一部を含むことができる。記した免疫グロブリン折り畳みの最初のシステインを有するヒトTCRα鎖の代表的配列を図8に示す。このセグメントは、免疫グロブリン折り畳みの最初のシステインまでの最初の30個のCβ鎖のすべてまたはその一部を含むことができる。記した免疫グロブリン折り畳みの最初のシステインを有するヒトTCRβ鎖の代表的配列を図8に示す。「Cα」および「Cβ」なる用語は上記のポリペプチド鎖の機能的誘導体をも意味する。
【0054】
「TCR」または「T細胞レセプター」なる用語は、2つのポリペプチド鎖、およびα鎖およびβ鎖を含むT細胞表面に見出されるポリペプチドを意味する。「TCR」または「T細胞レセプター」なる用語はまた、このポリペプチド鎖をコードする核酸をも意味する。Bell et al. (Bell et al., 1995, T Cell Receptors, Oxford University Press, Oxford)に記載されているように、免疫系の正常な発達により、TCRはDNA再構成の作用に由来して膨大な配列の多様性を示す。特定のTCRの正確な配列は予測できず、問題のTCRをコードするする核酸またはその一部を配列決定することにより決定しなければならない。TCRの可能性ある配列は本発明に使用できる。
【0055】
「免疫グロブリン定常領域」なる用語は、免疫グロブリンの可変領域によりコードされていない免疫グロブリン分子部分のすべてまたはその一部を意味する。「免疫グロブリン定常領域」なる用語はまた、免疫グロブリン定常領域をコードするDNA配列をも意味することができる。免疫グロブリン定常領域にはCL、CH1、CH2、CH3セグメント、およびヒンジ領域が含まれる。免疫グロブリンタイプには、
IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE重鎖、およびκまたはλ軽鎖またはそのセグメントが含まれる。好ましい態様では、重鎖および軽鎖定常領域は9F12細胞から誘導される。免疫グロブリン定常領域セグメントは、それが例えばプロテインG、プロテインA、プロテインLまたは適当な抗体を介してキメラ分子を精製できる限り、あらゆるものを本発明に使用できる。上記の免疫グロブリン定常領域セグメントの機能的誘導体も使用できる。
【0056】
「免疫グロブリン折り畳み」または「免疫グロブリンドメイン」なる用語は、免疫グロブリンスーパーファミリーの構造要素を意味する。免疫グロブリンドメインは各々が、約110個のアミノ酸の保存された反復構造ドメインである。各ドメインでは、一般に4または3個のストランドの2つから整列されている7個の逆平行βストランド、および約60個のアミノ酸のループを形成する鎖内ジスルフィド結合がある。2つのシートは一般に互いに向かい合い、疎水性アミノ酸が内部に、親水性アミノ酸が外部に向かう。
【0057】
免疫グロブリンドメインは抗体、T細胞抗原レセプター、サイトカインレセプター(例えば5Igドメインを有する血小板誘導化成長因子レセプター)、細胞接着分子(例えばICAM−1/CD54)などの多くのタンパク質分子に見出される。2つの免疫グロブリンドメインがTCRの各鎖に見出され、1つは可変領域に、1つは定常領域内にである。2つの免疫グロブリンドメインが抗体軽鎖に見出され、4つがIgG重鎖に見出される。
【0058】
「カッパ定常領域」、「ラムダ定常領域」、「κ定常領域」および「λ定常領域」なる用語は、免疫系の発達過程で保存されてきたカッパ(κ)およびラムダ(λ)軽鎖の定常領域を意味する。これらの用語は、タンパク質のアミノ酸配列またはDNA配列のいずれかを意味できる。ある場合には、免疫グロブリン軽鎖は1つまたはそれ以上の他のタンパク質由来のアミノ酸を含むキメラタンパク質に含まれていても良い。
【0059】
「IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE」なる用語は、免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスを意味する。これらの用語は、タンパク質のDNA配列またはアミノ酸配列を意味できる。免疫グロブリン分子のクラスおよびサブクラスは重鎖によって決定される。例えば、IgGおよびIgDは免疫グロブリンの異なるクラスであり、IgG1およびIgG2は免疫グロブリン分子の異なるサブクラスである。「IgA」なる用語はIgA分子のあらゆるサブクラスを意味できる。好ましい態様では、これはIgA1分子を意味する。別の好ましい態様では、これはIgA2分子を意味する。ある態様では、使用される免疫グロブリン重鎖第2のタンパク質由来のアミノ酸を含むキメラタンパク質であってもよい。
【0060】
「IgGγ 1」なる用語は免疫グロブリンのIgG1クラスと関連する重鎖を意味する。IgG1は、ヒトIG免疫グロブリンの約66%を代表する(Roitt et al., Immunology, Mosby, St. Louis, 1993, pg.4.2)。
【0061】
「投与」なる用語は、化合物を生物の細胞または組織とまたはその内部に接触させる方法に関連する。T細胞媒介性病態は、生物の細胞または組織が生物の内部または生物の外部に存在すると予防または処置できる。生物の外部に存在する細胞は細胞培養皿にて維持または生育できる。生物の内部に保持される細胞では、経口、腸管外、経皮、注射および吸入など(これらに限定されない)の化合物を投与するための多くの手法が当業者に知られている。化合物投与の生物機能に対する効果を次いでモニターすればよい。生物は好ましくはマウス、ラット、ウサギ、モルモットまたはヤギであり、より好ましくはサルまたは霊長類、最も好ましくはヒトである。
【0062】
「組成物」なる用語は、目的のタンパク質を含む混合物を意味する。好ましい態様では、組成物は添加剤、安定化剤、賦形剤などの付加的な成分を含むことができる。
【0063】
T細胞クローンとの関連において可変領域に対して使用される「関連する」なる用語は、特定のT細胞クローンによって産生される免疫グロブリンに見出される可変領域を意味する。
【0064】
「T細胞クローン」なる用語は単一のT細胞のクローン的子孫を意味する。T細胞のクローン的子孫は産生されるTCRにおいて親細胞と同じイディオタイプを発現する。当業者であれば、T細胞のクローン的子孫はTCR遺伝子内に体細胞性変異を受けることがあるが、T細胞クローンの部分は依然保持していることを理解できる。
【0065】
「単離」なる用語は、天然に存在する核酸配列をその通常の細胞環境から取り出すことを意味する。従って、核酸配列は細胞不含溶液中に、または別の細胞環境に置かれているといえる。この用語は、配列がヌクレオチド鎖のみで存在することを意味せず、それに通常付随する非ヌクレオチド物質が実質的に含まれていない(少なくとも約90−95%純度)ことを意味しており、従ってこれは単離された染色体と区別される。さらに、核酸に関連して使用する「単離」なる用語は、目的の溶液に存在する全DNAまたはRNAの画分における特定のDNAまたはRNA配列が、その配列が取り出された細胞内よりも有意に高く増大(2−5倍)していることを意味する。これは、他の存在するDNAまたはRNAの量を優先的に減少させること、または特異的DNAまたはRNA配列の量を優先的に増大させること、またはそれらを組合わせることにより行うことができる。しかし、増大させることは、他のDNAまたはRNA配列が存在しないことを意味せず、目的の配列の量が相対的に有意に増大していることを意味する点に留意しなければならない。「有意」なる用語は、増大レベルが増大させる者にとって有用であることを示すために使用され、一般に他の核酸と比較して、少なくとも約2倍、より好ましくは少なくとも5−10倍またはそれ以上の増大を意味する。この用語はさらに、他の供給源由来のDNAまたはRNAが存在しないことを意味しない。他の供給源由来のDNAとは例えば、酵母または細菌ゲノム由来のDNA、またはpUC19などのクローニングベクターなどである。この用語は、1つのmRNAレベルが他の種のmRNAと比較して自然に増大し得るウイルス感染または腫瘍型増殖を区別する。即ち、この用語は、所望の核酸の比率を高める場合のみを網羅する意味である。
【0066】
単離されたDNA配列は天然環境におけるよりも比較的純度が高い(天然レベルと比較し、そのレベルは例えばmg/ml単位にて少なくとも2−5倍高い)。PCRによって得られる個々の配列は電気泳動的な均一にまで精製できる。PCR反応によって得られるDNA分子は全DNAまたは全RNAから得ることができる。これらのDNA配列は天然に存在していないが、好ましくは部分的に精製された天然に存在する物質(例えばメッセンジャーRNA(mRNA))を操作することにより得られる。例えば、mRNAからcDNAを構築するには、合成物質(cDNA)を作成し、cDNAライブラリーを含む細胞からのクローン選択により合成ライブラリーから個々の精製cDNAを単離すればよい。mRNAからのcDNA構築および別個のcDNAクローンの単離を含むこの方法は、天然メッセージの約106倍の純度を与える。従って、少なくとも1桁、好ましくは2または3桁、さらに好ましくは4または5桁の純度が明示的に理解される。
【0067】
「をコードする遺伝子」なる用語は、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸の配列を意味する。核酸配列はDNAまたはRNAのいずれの分子であってもよい。好ましい態様では、この分子はDNA分子である。他の好ましい態様では、分子はRNA分子である。RNA分子と存在する場合、翻訳を開始させるよう宿主細胞のリボゾームを駆動する配列(例えば開始コドンATG)および翻訳を終止させるようリボゾームを駆動する配列(例えば終止コドン)を含む。開始コドンと終止コドンとの間には解読枠(ORE)がある。当業者は、これらの意味に精通している。
【0068】
「昆虫細胞系統」なる用語は、バキュロウイルスによって感染される昆虫由来の細胞系統を意味する。当業者はこのような細胞系統およびその利用に必要な技術に精通している。代表的な昆虫細胞系統の例は、Spodoptera frugiperda (sf9) および Trichoplusia ni(Hi−5)細胞系統である。
【0069】
「Trichoplusia ni(Hi−5)およびSpodoptera frugiperda (sf9)細胞」なる用語は、バキュロウイルス発現ベクターとともに使用される昆虫細胞系統である。当業者はこのような細胞系統およびその入手方法に精通している。
【0070】
「アジュバント」なる用語は、選択した抗原または免疫原に対する動物における免疫応答を惹起させる場合に、選択した抗原または免疫原、例えば免疫応答を望むタンパク質またはポリペプチドとともに供給される、免疫応答を増大させるための物質である。当業者は選択および使用に適したアジュバントに精通している。ヒト使用が許可されているアジュバントにはアルミニウム塩およびMF59 (Singh and O’Hagan, Nature Biotech 17:1075−81, 1999)がある。他のアジュバントも開発されており(前掲)、それらも本発明に使用できる。
【0071】
「キーホールリンペットヘモシニアン」なる用語は、免疫反応において担体タンパク質として普通に使用されているカサガイ(Keyhole limpets)から単離されたタンパク質を意味する。当業者はキーホールリンペットヘモシニアンなる用語の意味に精通している。
【0072】
「サイトカイン」なる用語は、主としてリンパ球から分泌される、普通は可溶性の(糖)タンパク質、成長因子ファミリーを意味する。サイトカインは体液性および細胞性免疫応答、および貪食細胞の活性化の両者を刺激する。サイトカインは、免疫系の種々の細胞型(リンホカイン、インターロイキン、モノカイン、腫瘍壊死因子、インターフェロン)のみならず、血液学の分野で研究されている他の細胞(コロニー刺激因子を産生)、腫瘍学(トランスホーミング成長因子を産生)および細胞生物学の分野の細胞(ペプチド成長因子、熱ショックおよび他のストレスタンパク質を産生)から合成され、保存され輸送される。
【0073】
リンパ球から分泌されるサイトカインはリンホカインと呼ばれ、単球またはマクロファージから分泌されるものはモノカインと呼ばれる。多くのリンホカインは白血球から分泌されるのみならず、白血球の細胞応答に影響を与え得るため、インターロイキン(ILs)とも呼ばれる。具体的には、インターロイキンは造血器官の細胞を標的とする成長因子として機能する。
【0074】
「成長因子」なる用語は、細胞表面のレセプターと結合した後、細胞増殖および/または分化を活性化するタンパク質を意味する。多くの成長因子は用途が極めて広く、種々の細胞型の細胞分化を刺激するように機能できるが、他のものは特定の細胞型に特異的である。
【0075】
「ケモカイン」なる用語は、白血球の化学遊走物質および活性化物質として機能する炎症前の小さなサイトカインの一群であり、30個以上の化学遊走性サイトカインのスーパーファミリーである。ケモカインは、血液または骨髄由来の免疫系細胞を活性化し、それらを感染および障害組織へと移動させることを調和させる。ケモカインはまた、骨髄に見出される原始的幹細胞を成長および増殖する本質的な役割を果たし、それは成熟免疫細胞へと成長させる。ケモカインは広範な急性および炎症性疾患に関与し、7回膜貫通へリックスクラスのレセプターと結合することによりその作用を主として発揮する。
【0076】
ケモカインは分子量8 から 11 kDaであることが多く、1 から 100 ng/mlの濃度で活性であり、広範な細胞型から産生される。ケモカインの産生は、外因性の刺激物質および内生伝達物質、例えばIL−1、TNF−αおよびPDGFによって誘導される。ケモカインは特異的細胞表面レセプターに結合し、他のサイトカインの強力な誘導物質でなく、炎症および修復において比較的特殊な機能を果たすのみであるので、一次炎症前サイトカインよりも多面性が明らかに低い二次サイトカインと考えられる。
【0077】
「顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子」または「GM−CSF」なる用語は、小さな(20 kDaより小さい)分泌型タンパク質を意味する。これは特異的細胞表面レセプターに結合し、骨髄細胞の種特異的刺激物質として機能する。これは、樹状細胞、顆粒球、マクロファージ、好酸球および赤血球などの幾つかの造血細胞系譜の成長および分化を刺激する。具体的には、このサイトカインはT細胞増殖を増大させ (Santoli et al,J.Immunol,1988, 141(2):519−26)、顆粒球および単球における接着分子の発現を増大させ(Young et al., J.Immunol, 1990, 145(2):607−15; Grabstein et al., Science, 1986, 232(4749):506−08)、および抗原提示能を増大させ(Morrissey et al., J.Immunol,1987,139(4):1113−9; Heufler et al., J.Exp.Med., 1988, 167(2):700−05; Smith et al., J.Immunol, 1990, 144(5):1777−82)、細胞性免疫を形成する役割も果たす。
【0078】
「単球走化性タンパク質3」または「MCR3」なる用語は、単球から主として産生されるケモカインを意味する。MCR−3は広範なスペクトラムの化学遊走活性を有し、単球、樹状細胞、リンパ球、ナチュラルキラー細胞、好酸球、好塩基球、および好中球を引き付ける。このcDNAは1993年にMinty et al., Eur Cytokine Netw 4(2):99−110, 1993, and Opdenakker et al., Biochem Biophys Res Commun., 191(2):535−42, 1993によってクローニングされた。その性質は最近、Proost et al., J Leukoc Biol. 59(1):67−74, 1996によって綜説されている。
【0079】
「発現ベクター」なる用語は、選択した目的遺伝子、通常はタンパク質が適切に挿入された場合、発現するよう作製されている組換えDNA構築物を意味する。当業者はこの用語を理解する。発現ベクターは普通、目的遺伝子を挿入する部位の5’末端にプロモーター、およびその部位の3’末端にターミネーター領域を含む。目的遺伝子は制限酵素切断部位を選択して適当な部位に挿入することが多い。「発現ベクター」なる用語は、目的産物をコードする目的遺伝子がすでに挿入されている上記のDNA構築物をも意味する。
【0080】
「バキュロウイルス発現ベクター」なる用語は、選択した遺伝子がバキュロウイルス系に挿入された場合、発現するよう作製されているDNA構築物を意味する。本発明では、バキュロウイルス系で機能するよう作製された可能性あるバキュロウイルスまたは発現ベクターはあらゆるものを使用できる。同様に、「発現ベクター」なる用語は、バキュロウイルス発現ベクターの特定の態様を包含する用語であるが、「発現ベクター」は昆虫細胞系統だけではなく、それに加えて細胞および細胞系統において機能できる。
【0081】
「発現できる(発現させる)」なる用語は、発現ベクターを、目的遺伝子が発現される環境に置くことを意味する。これは通常、プロモーターおよび他の遺伝子発現に必須の領域が宿主細胞成分によって認識され目的遺伝子を発現させる適当な細胞型に発現ベクターを挿入する意味である。発現は普通、転写および翻訳の2つの工程からなる。発現はまた、細胞由来の成分を用いてインビトロにて行うこともできる。当業者はそのような手法、およびSambrook et al. (Sambrook, Fritsch, & Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)に記載されている技法に精通している。好ましい態様では、発現産物はタンパク質またはポリペプチドである。他の好ましい態様では、発現産物はVβ/IgGγ1、Vβ/Cκ、Vβ/Cλ、Vα/Cκ、Vα/Cλ、またはVα/IgGγ1である。
【0082】
「分泌シグナル配列」なる用語は、ペプチド配列を意味する。この配列が選択したポリペプチドのアミノ末端に結合したペプチドとしてインフレームにて翻訳されると、分泌シグナル配列は宿主細胞の機構と相互作用し選択ポリペプチドを分泌させる。分泌過程の部分では、この分泌シグナル配列は切断除去され、輸送後には目的のポリペプチドのみを残す。好ましい態様では、ミツバチメリチン分泌シグナル配列を使用する。別の好ましい態様では、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列を使用する。さらに好ましい態様では、特定の患者から誘導される免疫グロブリン遺伝子に付随する内生分泌配列を使用する。しかし、本発明はこれら分泌シグナル配列によって限定されず、当業者に周知の他の配列をこれらの代わりに、または付加的に使用できる。「分泌シグナル配列」なる用語はさらに、分泌ペプチドをコードする核酸配列をも意味する。
【0083】
「ELISA」なる用語は、タンパク質の存在または濃度をELISA平板のプラスチックウエルとの結合性によって測定し、次いで定量または検出するタンパク質に特異的な抗体により検出を行う、「酵素結合免疫吸着アッセイ」を意味する。
【0084】
「プロモーター制御」なる用語は、プロモーターが目的遺伝子の5’側に配置され、DNA配列をmRNA分子に転写させる、発現ベクターにおけるDNAの配列を意味する。mRNA分子は次いで、宿主細胞の機構により翻訳される。当業者のこの用語に非常に精通している。
【0085】
「プロテインA」、「プロテインG」、および「プロテインL」なる用語は、抗原結合部位と相互作用することなく、免疫グロブリン分子と特異的に結合できる特異的細菌タンパク質である。プロテインAは免疫グロブリン分子のFc領域と結合するStaphylococcus aureusから単離されるポリペプチドである。プロテインGは免疫グロブリンG(IgG)に対する親和性を有する細菌細胞壁タンパク質であり、ヒト連鎖球菌株G(G148)から単離された。プロテインLは嫌気性細菌Peptostreptococcus magnusのある種の株から発現される免疫グロブリン軽鎖結合タンパク質である。
【0086】
タンパク質またはポリペプチドに関して「単離」なる用語は、天然に存在するポリペプチドまたはタンパク質をその正常な細胞環境から取り出すこと、または発現系(本明細書に記載のバキュロウイルス系)において合成されたポリペプチドまたはタンパク質を他の発現系成分から取り出すこと、を意味する。従って、この配列は細胞不含溶液中に、または別の細胞環境に置かれているといえる。この用語は、配列がアミノ酸鎖のみで存在することを意味せず、それに天然にて付随する非アミノ酸基本物質が実質的に含まれていない(少なくとも約90−95%純度)ことを意味している。
【0087】
ポリペプチドに関連して「増大」なる用語は、特定のアミノ酸配列が正常または疾患細胞またはその配列が取り出された細胞内よりも、目的の溶液または細胞に存在する全アミノ酸配列が有意に高い(2−5倍)画分を意味する。これは、他の存在するアミノ酸配列の量を優先的に減少させること、または特異的アミノ酸配列の量を優先的に増大させること、またはそれらを組合わせることにより行うことができる。しかし、増大させることは、他のアミノ酸配列が存在しないことを意味せず、目的の配列の量が相対的に有意に増大していることを意味する点に留意しなければならない。ここでの「有意」なる用語は、増大レベルが増大させる者にとって有用であることを示すために使用され、一般に他のアミノ酸と比較して、少なくとも約2倍、より好ましくは少なくとも5−10倍またはそれ以上の増大を意味する。この用語はさらに、他の供給源由来のアミノ酸配列が存在しないことを意味しない。他の供給源のアミノ酸とは例えば、酵母または細菌ゲノムまたはpUC19などのクローニングベクターによってコードされるアミノ酸などである。好ましい態様では、アミノ酸配列は上記のキメラタンパク質である。この用語は、所望のアミノ酸配列の比率を高める場合のみを網羅する意味である。
【0088】
アミノ酸配列は精製形態であることがある種の目的にとって有益である。ポリペプチドに関連して「精製」なる用語は、絶対的純度(均一調製物のような)を要せず、配列が天然環境よりも純粋であることを示すものである。天然のレベルに比較し、このレベルは(例えばmg/ml単位にて)少なくとも2−5倍高い。精製は、少なくとも1桁、好ましくは2または3桁、さらに好ましくは4または5桁であることが明示的に理解される。好ましくは、物質は、機能的に有意なレベル、例えば90%、90−95 %純度で混入が無いものである。
【0089】
「作動可能に連結」なる用語は、プロモーターまたはエンハンサーなどの制御領域が目的の連結DNAに結合されてその転写、そしてその翻訳を起こす、DNAの配列操作を意味する。「作動可能に連結」なる用語はさらに、分泌シグナル配列などのプロセッシングシグナルをコードするDNA配列をポリペプチドをコードする遺伝子と連結させ、単一の解読枠を形成させることをも意味する。転写および翻訳の後、分泌シグナル配列は翻訳ポリペプチドを外部輸送させることができる。当業者はこの用語の意味に精通している。
【0090】
有用なキメラタンパク質の機能的誘導体
本発明はさらに、本発明のポリペプチドまたは核酸の機能的誘導体をも提供する。「機能的誘導体」とは、本発明のポリペプチドまたは核酸の「化学的誘導体」、「断片」または「変異体」を意味し、これらの用語は以下に詳述する。機能的誘導体はタンパク質の機能の少なくとも一部、例えばタンパク質に特異的な抗体との反応性、非触媒ドメインを介する酵素活性または結合活性を保持しており、これらは本発明の機能的誘導体の有用性を保証する。当業者には、遺伝子コードの縮重により、多くの異なる核酸配列が同じアミノ酸配列をコードできることが周知である。同様に、アミノ酸の保存的変化により、元の機能が保持されているタンパク質またはポリペプチドが得られることも周知である。両者ともに、すべての順列が本明細書に包含されるものである。
【0091】
本発明には、本明細書に記載の単離された核酸分子の機能的等価物が包含される。遺伝子コードの縮重により、特定のコドンは同一アミノ酸を特定し同じタンパク質を与える他のコドンに置換できる。メチオニンおよびトリプトファンを除き、既知のアミノ酸は1つ以上のコドンによってコードされ得るので、核酸配列は実質的に変動し得る。従って、本発明の遺伝子の一部またはすべては、天然に見出される配列と有意に異なる核酸配列として合成することができる。しかし、コードされるそのアミノ酸配列は保存されている。
【0092】
複合体の「化学的誘導体」は、通常はタンパク質の部分ではない付加的な化学部分を含む。タンパク質またはペプチドの共有結合修飾が本発明の範囲に含まれる。以下に説明するように、このような修飾は、選択した側鎖または末端残基と反応できる有機誘導化試薬とペプチドの標的アミノ酸残基を反応させることにより、分子に導入できる。
【0093】
最も普通には、システイン残基をクロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα−ハロアセテート(および対応するアミン)と反応させ、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイン残基はさらに、ブロモトリフルオロアセトン、クロロアセチルホスフェート、N−アルキルマレイミド、3−ニトロ−2−ピリジルジスルフィド、メチル 2−ピリジルジスルフィド、p−クロロメルクリベンゾエート、2−クロロメルクリ−4−ニトロフェノールまたはクロロ−7−ニトロベンゾ−2−オキサ−1,3−ジアゾールと反応させることにより誘導化される。
【0094】
ヒスチジル残基は、pH 5.5−7.0においてジエチルプロカルボネートと反応させることにより、その試薬は比較的ヒスチジン側鎖に特異的であるので、誘導化される。パラブロモフェナシルブロミドも有用である。この反応は好ましくは、pH 6.0において0.1M ナトリウム・カコヂレート中にて行う。
【0095】
リジンアミノ酸末端残基はクエン酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの試薬との誘導化により、リジン残基の効果またはその電荷が保存される。1級アミンを含有する残基を誘導化するための他の適当な試薬は、メチルピコリンイミデート、プリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロハイドライド(水素化クロロホウ素)、トリニトロベンゼンスルホン酸、O−メチルイソ尿素、2,4−ペンタンジオン、およびグリオキシレートによるトランスアミナーゼ触媒反応などである。
【0096】
アルギニル残基は1つまたは幾つかの通常の試薬、例えばフェニルグリオキサール、2,3−ブタンジオン、1,2−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンの中から選ばれるものとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導化には、グアニジン官能基の高いpKa故に、アルカリ条件において反応を行う必要がある。さらに、これらの試薬はリジンの基およびアルギニンα−アミノ基と反応できる。
【0097】
チロシル残基は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応による分光学的標識を導入する修飾のための周知の標的である。最も普通には、N−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを使用し、O−アセチルチロシル種および3−ニトロ誘導体をそれぞれ調製する。
【0098】
カルボキシ側鎖基(アスパラギン酸またはグルタミン酸)は、1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリニル(4−エチル)カルボジイミドまたは1−エチル−3−(4−アゾニア−4,4−ジメチルペンチル)カルボジイミドなどのカルボジイミド(R’−N−C−N−R’)との反応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【0099】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は脱アミド化されて対応するグルタミルおよびアスパルチル残基になることが多い。あるいは、これらの基は温和な酸性条件下、脱アミド化される。これら残基のいずれの形態も本発明の範囲に包含される。
【0100】
二機能性試薬での誘導化は、例えば水不溶性支持マトリックスまたは他の高分子担体との複合体において、タンパク質のペプチド成分を互いに、または他のタンパク質と架橋させ際に有用である。通常使用される架橋剤は、例えば、1,1−ビス(ジアゾアセチル)−2−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二機能性イミドエステル、例えば3,3’−ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)などのジスクシンイミジルエステル、およびビス−N−マレイミド−1,8−オクタンなどの二機能性マレイミドなどである。メチル−3−[p−アジドフェニル]ジチオールプロピオイミデートなどの誘導化剤は、光の存在下に架橋を形成できる光活性化中間体を与える。あるいは、シアノゲンブロミド活性化炭水化物および反応性基質などの反応性水不溶性材料はU.S. Patent Nos. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537;および4,330,440に記載され、これらはタンパク質固定化に使用される。
【0101】
他の修飾にはプロリンおよびリジンのヒドロキシ化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシ基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化 (Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79−86 (1983))、N−末端アミノのアシル化などがあり、ある場合には、C−末端カルボキシ基のアミド化もある。
【0102】
このような誘導化部分は安定性、溶解性、吸収性、生物学的半減期などを改善できる。これらの部分はまた、タンパク質複合体の望ましくない副作用を排除しまたは減じることができる。このような効果を媒介できる部分は例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)に記載されている。
【0103】
アミノ酸残基が欠失、挿入および/または置換されたタンパク質の機能的誘導体は、当業者に周知の標準的手法により調製できる。例えば、機能的誘導体の修飾された成分は、部位特異的突然変異手法(Adelman et al., 1983, DNA 2:183に例示)によって調製でき、ここでは配列をコードするDNAのヌクレオチドを修飾し、修飾コード配列を修飾し、次いで既述の手法により原核生物または真核生物宿主細胞において得られた組換えDNAを発現させる。あるいは、アミノ酸の欠失、挿入および/または置換を有するタンパク質は、当業者に周知の方法により直接化学合成によって常法により調製できる。タンパク質の機能的誘導体は通常、天然タンパク質と同じ質的生物活性を示す。
【0104】
「断片」なる用語は、タンパク質のアミノ酸配列から誘導されるポリペプチドであって、誘導される完全長のポリペプチドよりも長さが短いものを示す。例えば、このような断片は、完全長タンパク質をタンパク質分解的に切断することにより調製される。好ましくは、断片は、タンパク質をコードするDNA配列を適当に修飾し、天然配列のC末端、N末端および/または内部の1つまたはそれ以上の部位の1つまたはそれ以上のアミノ酸を欠失させることにより、組換え的に調製できる。このような断片は1つまたはそれ以上の特徴的部分、機能または天然タンパク質またはポリペプチドの特性を1つまたはそれ以上保持できる。このような保持される特性の例としては、触媒活性、基質特異性、無傷の細胞における他の分子との相互作用、調節機能、または天然複合体に特異的な抗体との結合性、またはそのエピトープなどがある。
【0105】
本発明に含まれる別の機能的誘導体は、天然ポリペプチドと比較して1つまたはそれ以上のアミノ酸が欠失している、あるいは付加的なアミノ酸または置換アミノ酸を有する「変異体」ポリペプチドである。変異体は天然に存在する複合体成分から、配列をコードするタンパク質DNAを修飾し、天然配列のC末端、N末端および/または内部の1つまたはそれ以上の部位の1つまたはそれ以上のアミノ酸のコドンを付加、除去および/または修飾することにより適切に誘導できる。付加的アミノ酸の付加、置換、および/またはを有するこのような変異体は上記した天然タンパク質の1つまたはそれ以上の特徴部分を保持していると考えられる。
【0106】
本発明の他の態様は、本発明のキメラタンパク質の用途に関する。好ましい用途は、医薬および獣医薬適用であり、ここでは有効量の本発明キメラタンパク質(好ましくは本発明の組成物の形態で)を患者に投与する。このように、キメラタンパク質は患者の細胞と接触し、その接触は所望の生物学的応答を引き起こす。本発明のキメラタンパク質を使用する方法は、生物において免疫応答を引き起こす方法、生物において抗体を産生させる方法(B細胞免疫応答)、生物によりT細胞免疫応答を誘導する方法、およびT細胞病態を処置する方法を含む。本発明はさらに、本発明のキメラタンパク質を投与することにより、T細胞媒介性病態を改変できる免疫応答を増大させるため、被験者を処置する方法をも含む。
【0107】
通常、このような方法は、生物に有効量の本発明キメラタンパク質を供給することにより行われる。「有効量」とは、所望の生物応答を惹起させる量を意味する。このような量を構成するものは、具体的キメラタンパク質、惹起させる所望の生物応答、キメラタンパク質の製剤、処置する生物の年齢、体重、性別および健康度、投与方法、処置または予防する疾患の状態など種々の因子によって変動する。本発明のキメラタンパク質および組成物を投与できる生物は哺乳動物であり、好ましくは哺乳動物はウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、および霊長類動物から選ばれる哺乳動物である。特に好ましい生物はヒトである。
【0108】
本明細書に記載の化合物はそのまま、または他の活性成分と混合して混合療法として、または適当な賦形剤または担体とともに、ヒト患者自身に投与できる。本発明適用のための化合物の製剤および投与方法は、”Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PA,に見出すことができる。
【0109】
投与経路
適当な投与経路は例えば、経口、直腸、経粘膜、腸管適用;腸管外供給、例えば筋肉内、皮下、静脈内、皮内注射;およびクモ膜下内、直接心室内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射などである。当業者は特定に投与経路に対して組成物を適合させる種々の方法を理解している。
【0110】
あるいは、化合物は全身投与でなく、固形癌に直接注入することにより局所的に投与することができ、その場合、デポット(貯蔵)としてまたは徐放製剤として局所投与することが多い。
【0111】
組成物/製剤
本発明の医薬組成物は、たとえば、慣例の混合、溶解、顆粒化、糖衣形成、すりつぶし、乳化、カプセル封入、封入または凍結乾燥工程などのそれ自体公知の方法で製造することができる。
したがって、本発明に用いるための医薬組成物は、医薬的に用いることができる調製品への活性化合物の加工を促進する賦形剤および補助剤を含む1種またはそれ以上の生理的に許容しる担体を用いる慣例の方法で製剤することができる。適当な製剤は、選ばれた投与経路に従属する。
【0112】
注射液のためには、本発明作用剤は、水性溶液、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液または生理的食塩緩衝液などの生体適合性緩衝液として製剤することができる。経粘膜投与のためには、製剤において、浸透されるべきバリヤーに適した浸透剤を用いる。このような浸透剤は一般に、当業界で公知である。
経口投与のためには、活性化合物と当業界で公知の医薬的に許容しうる担体を合わせることによって、本発明化合物を容易に製剤することができる。このような担体によって、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤されるべき本発明化合物は、処置されるべき患者による経口摂取が可能になる。適当な担体として、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどの糖類;トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび/またはポリビニルピロリドン(PVP)などのセルロース調製物といったような充填剤などの賦形剤が挙げられる。要すれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を加えてもよい。
【0113】
糖衣錠のコアは、適当なコーティングをして提供される。この目的のために、必要に応じてアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタン、ラッカー溶液および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含む濃縮糖類溶液を用いる。識別のため、または活性成分用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに染料または含量を加えてもよい。
【0114】
経口で用い得る医薬調製物として、ゼラチン製プッシュフィットカプセルならびにゼラチン、グリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤製軟密閉カプセルおよびが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤および/またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤ならびに必要に応じて安定剤と混合して有効成分を含むことができる。軟カプセルでは、脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの適当な液体に活性化合物を溶解または懸濁する。さらに、安定剤を加えてもよい。すべての経口投与用製剤は、このような投与に適した用量であるべきである。
【0115】
バッカル投与のためには、組成物を慣例の方法で製剤された錠剤またはロゼンジの剤形にする。
吸入による投与のためには、慣例的に、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体などの適当な噴霧剤を用いて、加圧パックまたは噴霧器からエアロゾルスプレーの剤形で本発明使用のための化合物をデリバリー(供給)する。加圧エアロゾルの場合、計量された量をデリバリーするバルブを提供することによって用量単位を決定する。吸入器(inhalerまたはinsufflator)で用いるためのたとえばゼラチン製のカプセル剤およびカートリッジを、本発明化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適当な粉末基剤の粉末混合物を含めて製剤することができる。
【0116】
ボーラス注射または継続的輸液などの注射による非経口投与用に本発明化合物を製剤することができる。注射用製剤は、たとえば、保存剤を添加したアンプルまたはマルチ投与容器などの単位投与剤形で提供される。該組成物は、懸濁液、溶液または油性または水性ビヒクルにおける乳液などの剤形をとることができ、懸濁剤、安定剤および/または分散剤などの製剤用剤を含んでもよい。
【0117】
非経口投与用医薬製剤は、水溶性形体の活性化合物の水溶液であってもよい。さらに、適当な油性注入用懸濁液として、活性化合物の懸濁液を製造してもよい。適当な親油性溶媒またはビヒクルとして、ゴマ油などの脂肪油、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルまたはリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘度を増す物質を含むことができる。必要に応じて、懸濁液は、適当な安定剤または高濃縮溶液が製造されるように化合物の溶解度を増加させる作用剤を含むこともできる。
あるいは、活性成分は適当なビヒクル、例えば滅菌発熱物質不含水により使用前に再構成される粉末形態であってもよい。
【0118】
これまでに記載した製剤に加えて、持効性製剤として、本発明化合物を製剤してもよい。このような長期作用製剤は、植込錠(たとえば、皮下または筋肉内)または筋肉内注射によって投与される。したがって、たとえば、適当なポリマーまたは疎水性材料(たとえば、許容しうる油中の乳剤)もしくはイオン交換樹脂とともに、またはたとえば可溶性の小さい塩などの可溶性の小さい誘導体として、本発明化合物を製剤してもよい。
【0119】
本発明の疎水性化合物のための医薬担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマーおよび水性相を含む共溶媒系である。共溶媒系は、VPD共溶媒系であってよい。VPDは、3% w/vのベンジルアルコール、8% w/vの非極性界面活性剤ポリソルベート80および65% w/vのポリエチレングリコール300の無水エタノール溶液である。VPD共溶媒系(VPD:D5W)は、5%デキストラン水溶液で1:1に希釈したVPDからなる。この共溶媒系は、疎水性化合物をよく溶解し、それ自体、全身投与において毒性が低い。共溶媒系の特性は、その溶解性および毒性特性を無効にすることなくかなり変えることができる。さらにそのうえ、共溶媒成分の個性は、変更することができる:たとえば、ポリソルベート80の代りに、他の低毒性非極性界面活性剤を用いてもよい;ポリエチレングリコールのフラクションサイズを変えてもよい;ポリビニルピロリドンなどの他の生体適合性ポリマーをポリエチレングリコールと交換してもよい;および他の糖質または多糖類をデキストロースの代りに使ってもよい。
【0120】
別法として、疎水性医薬化合物のための他のデリバリーシステムを用いてもよい。リポソームおよびエマルションが、疎水性薬物のためのデリバリービヒクルまたは担体の公知の例である。毒性はより大きいが、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒もまた、用いることができる。さらに、治療薬を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性系を用いて本発明化合物をデリバリーすることができる。種々の徐放性素材が確立されており、当業者には公知である。徐放性カプセル剤は、その化学的性質に応じて、2、3週間〜100日間化合物を放出する。治療薬の化学的性質および生物学的安定性に応じて、タンパク質安定化のさらなる方策を採ってもよい。
【0121】
医薬組成物はまた、適当な固相もしくはゲル相担体または賦形剤をふくむことができる。このような担体または賦形剤の例として、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖質、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
多くの本発明化合物が、医薬的に適合しうる対イオンとして提供される。医薬的に適合しうる塩は、多くの酸とともに形成され、該酸として、硫酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。塩は、水性または対応する遊離塩基体であるプロトン性溶媒により可溶性であることを企図されるものである。
【0122】
有効用量
本発明における使用に適した医薬組成物は、その企図する目的を達成するのに有効な量で有効成分が含まれる組成物である。さらに詳しくは、治療有効量とは、疾患の症状を予防、軽減または寛解するか、または治療されている患者の生存を延長するのに有効な化合物の量を意味する。治療有効量の決定は、特に本明細書に提供する詳細な記載を考慮して、当業者であれば成しうることである。
【0123】
本明細書に記載した本発明化合物の毒性および治療的有効性は、LD50(集団の50%が死に到る用量)およびED50(集団の50%において治療が有効である用量)の決定などの細胞培養または実験動物における標準の薬学的方法によって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比が、治療指数であり、LD50およびED50の比率として表わされる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲を設定するのに用いることができる。このような化合物の用量は、毒性が少ししかないか、または無毒性のED50を含む循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。該用量は、採用する投与剤形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変化する。正確な製剤、投与経路および用量は、患者のコンディションを考慮して、個々の医師によって選択される(たとえば、Fingl et al., 1975, in ”The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch. 1 p.1を参照)。
【0124】
投与量および間隔は、必要な効果を維持するのに十分である活性部分の血漿レベル、あるいは最小有効濃度(MEC)が提供されるように個々に調節する。MECは、各化合物によって変化する。MECを達成するのに必要な用量は、個々の特性および投与経路に応じて変化する。しかし、HPLCアッセイまたはバイオアッセイを用いて、血漿濃度を決定することができる。
【0125】
また、投薬間隔もMEC値を用いて決定され得る。化合物は、期間のうち10−90%、好ましくは30−90%、および最も好ましくは50−90%の間、MECを超える血漿レベルを維持するレジメを用いて投与されるべきである。
局所投与または選択的取り込みの場合、薬物の有効な局所濃度は血漿濃度とは関連しないかもしれない。
当然のことながら、投与される組成物の量は処置される被検体、被検体の体重、苦痛の重篤度、投与様式および指示する医師の判断に依存する。
【0126】
パッケージング
所望であれば、組成物は、活性成分を含有する単位投薬形態を1以上を含み得る容器またはディスペンサー装置中に提示され得る。例えば、容器はブリスターパックのような金属またはプラスチックのホイルを備え得る。容器またはディスペンサー装置は、投与に関する使用説明書を有しうる。また、容器またはディスペンサーは、医薬の製造、使用または販売を規定する政府機関により指示されている形態で、容器に付随した警告を備え得、この警告は、その機関によるヒトまたは動物投与用のポリヌクレオチドの形態の認可を反映している。例えば、このような警告は、処方薬剤または認可された製品添加物(approved product insert)に関して米国食品医薬品局により認可されているラベルであり得る。また、融和性の製薬キャリア中に処方されている本発明の化合物を含有する組成物も、製造し、適切な容器中に配置し、そして指定の状態の治療についてラベルすることができる。ラベル上に記載の適切な状態としては、腫瘍の治療、慢性関節リウマチの治療、糖尿病の治療などを挙げることができる。
【0127】
実施例
以下の記載において、免疫学、細胞生物学および分子生物学の分野の当業者にとって公知である種々の方法に対して参照がなされる。そのような公知の方法を記載する、参照の刊行物および他の材料は、そのすべてを本明細書中に参照して組み込む。
【0128】
実施例1.T細胞リンパ腫イディオタイプ(Id)同定およびクローニングに関する組織処理:
抹消リンパ節由来の腫瘍サンプルに、臨床的に指示されているように滅菌条件下で生検を実施し、患者イディオタイプ特異的組換えVαおよびVβ−Igキメラタンパク質を作製するために使用する。残りのリンパ節生検材料は今後の使用のために組織細胞バンクで液体窒素中で保存する。
【0129】
細胞単離:生検を実施したリンパ腫組織を、滅菌PBS中に沈めながら、使い捨ての0.38mmスチールメッシュスクリーンに押し付けて通すことにより、患者リンパ節生検の単一細胞懸濁物を得る。分散させた細胞をPBS中で2回洗浄し、ついで再懸濁してカウントする。10%の細胞画分を全RNA抽出のために処理し、残りの細胞は、30%ウシ胎仔血清および10% DMSOを含有するRPMI 1640組織培養培地中での再懸濁の後、液体窒素中に保管(archive)する。臨床サンプルの処理は全て、生物用安全キャビネットの中で行う。
【0130】
全RNA調製:ホモジナイズしたリンパ節細胞由来の全RNAは、RNeasy Kit (Qiagen)を用いて業者の指示のとおりに単離する。全RNAは分光光度計により定量する。
【0131】
Tリンパ腫細胞由来のTCRのVαおよびVβ鎖をコードする遺伝子のcDNA合成およびPCR増幅:Tリンパ腫細胞レセプターのVαおよびVβ鎖の両方を、以下の特性を用いる製品により、記載されるように厳密に、5’RACEシステム(Gibco BRL)を用いて同定する。第1鎖cDNA合成に関しては、鋳型としておよそ5.0μgの全RNAを用いて、Cα特異的プライマーCADS3またはCβ特異的プライマーCBDS3(表1を参照のこと)を使用して第1鎖DNAをプライムする。業者の推奨に従ってポリdCテイリング(tailing)を行った。ついで、業者から得た5’プライマー、ならびに第二のCα特異的CADS2またはCβ特異的CBDS2アンチセンスプライマー(これらは各々、cDNA合成のために用いた個々のプライマーの内部のものである)を用いてVαおよびVβ同定を行った(表1参照)。
【0132】
【表1】
(CB/IgG1:小文字の文字は、IgG1キメラタンパク質を形成するためのApa Iクローニング部位を製造するための変更を示す。C/GおよびG/Tと示した塩基は、2ヵ所の位置での使用に関しては、Cβ 1および2の間の差異に応じていずれかの塩基を示す。)
(CA/IgK:小文字の文字は、κ軽鎖とのキメラタンパク質を形成するためのDra IIIクローニング部位を製造するためのbpの変化を示す)
【0133】
PCR産物のクローニングおよび配列決定:VαおよびVβ鎖に関する腫瘍特異的配列を含有することが決定された反応物由来のPCR産物を、業者の推奨に従ってプラスミドpCR2.1−TOPOに直接クローニングし、Top10コンピテント大腸菌細胞(Invitrogen)に導入する。24個のミニプレプDNAプラスミドを、QIAPrep Spin Miniprep Kit (Qiagen)を用いてカーベニシリン耐性細菌コロニーから調製し、分光光度計により定量する。各プラスミド200ngを、Cy5/Cy5.5 Dye Primer Cycle Sequencing Kit (Visible Genetics)を用いて配列決定した。配列決定反応の完了後、OpenGene Automated DNA Sequencing Systemでサンプルを電気泳動し、GeneObjectsソフトウェアパッケージ (Visible Genetics)を用いてデータを処理した。SEQUENCHER Version 4.1.2 DNA分析ソフトウェア (GENE Codes Corp.)を用いて、配列アラインメントを含む更なる分析を行った。VαおよびVβについての腫瘍特異的配列が、サンプルのうちの75%に存在する場合(例えば、24個のうち18個以上が同一のグループを形成する場合)は考慮する。入手可能な場合には2個の独立生検サンプルを比較する。
【0134】
実施例2. イムノグロブリン重鎖および軽鎖の定常域を含有するバキュロウィルス発現ベクター pTRABacV α HC γ1 および pTRABacV β HC γ1 の構築
分泌シグナル配列のp2Bacへのクローニング:pTRABacHuLCκHCγ1およびpTRABacHuLCλHCγ1構築物のためのベースベクターはp2Bac (図2、配列番号:5、Invitrogen, Carlsbad, CA)であった。2個の分泌シグナル配列をこのベースベクター中にクローニングし、最初の中間生成物であるバキュロウィルス発現ベクターp2BacMを作製した。たいていの場合、バキュロウィルスAcNPVP10プロモーターの転写制御下に配置したミツバチメリチン分泌シグナル配列のアミノ末端ドメインをコードする相補的オリゴヌクレオチドを利用して、ベクターp2Bacをまず修飾した。メリチン配列クローニングのため、p2Bac(2μg)を、37℃で4時間、Not IおよびSpe Iで消化した。1%アガロースゲルでの電気泳動の後、Qiaex II樹脂 (Qiagen, Chatsworth, CA)を用いて線状ベクターを精製した。ついで、精製したDNAを水50μlを用いて溶離し、DNA濃度を測定した。プライマーMe1S/N(配列番号:16)およびMe1N/S(配列番号:17)、各1μgを、消化緩衝液M(10 μl)(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)中で混合し、5分間、70℃まで加熱し、ついで室温まで冷却して相補的プライマーとアニーリングさせた。アニーリングしたプライマーのうち10%を、Not IおよびSpe Iを用いて20μlの反応系中で、37℃で4時間、消化し、消化したプライマーを15%ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動の後、Qiaex H樹脂を用いて精製し、アニーリングしたプライマーに対するDNAの濃度を決定した。p2BacベクターおよびアニーリングしたメリチンフラグメントのDNAを、1:10のベクター対インサート比でライゲーションした。ライゲーション産物をコンピテントXL 1−Blue E.coli(Stratagene, San Diego, CA)を用いて形質転換し、37℃で一晩増殖させるためにLB−カーベニシリン寒天プレートにプレーティングした。標準的なプロトコルによりミニプレプコロニーを調製し、プラスミドを配列決定して構築物をチェックした。得られたベクターp2BacMはメリチン分泌シグナル配列を含有していた。
【0135】
同様に、p2BacMベクターを、AcNPVポリへドロンプロモーターの転写制御下にヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列のアミノ末端ドメインをコードするようにさらに修飾して、第二の中間生成物であるバキュロウィルス発現ベクターp2BacMAを作製した。アルカリホスファターゼ配列を導入するために用いた方法は、概して、以下のとおりであった。p2BacMプラスミド(2μg)をBam HIおよびEco RIを用いて消化し、線状ベクターをQiaex II樹脂を用いてアガロースゲルからゲル精製し、水50μl中に溶出した。ベクターのDNA濃度を測定した。プライマーAPB/E(配列番号:18)およびAPE/B(配列番号:19)の各1μgを消化緩衝液M10μl中に混合し、70℃で5分間加熱し、ついで室温まで冷却して相補的なプライマーをアニーリングさせた。アニーリングしたプライマーのうち10%を、Bam HIおよびEco RIを用いて20μlの反応系中で、37℃で4時間、消化した。ついで、消化したプライマーを15%ポリアクリルアミドゲルから、Qiaex II樹脂を用いて精製した。また、消化したプライマーのDNA濃度を決定した。ついで、線状p2BacMベクターおよびアルカリホスファターゼフラグメントを、1:10のベクター対インサート比でライゲーションし、ライゲーション産物をコンピテントXL1−Blue E.coliを用いて形質転換し、37℃で一晩増殖させるためにLB−カーベニシリン寒天プレートにプレーティングした。ミニプレプコロニーを調製し、プラスミドを配列決定して構築物をチェックした。得られた中間生成物ベクターp2BacMAは、ヒト胎盤アルカリホスファターゼに対する分泌シグナル配列を含有する。メチル感受性(methyl−sensitive)Stu I部位へのκ定常域の続いてのクローニングのために、p2BacMAプラスミドをさらに、dcmメチラーゼ活性を欠損したSCS−110 E. coli株(Stratagene)に形質転換した。
【0136】
IgG γ1 および軽鎖の定常領域の増幅およびクローニング:
ヒトモノクローナル抗体9F12のヒトカッパ(κ)定常およびヒトIgGγ1定常ドメインを、ヒト細胞系統9F12(ATCC#HB8177)から抽出したRNAからPCR増幅した。κ定常領域は、アルカリホスファターゼシグナル配列の後ろにクローニングした。IgGγ1定常領域はメリチン分泌シグナル配列の下流に挿入し、それによりベクター(pTRABacHuLCκHCγ1、図5a)を作製した。ヒトラムダ(λ)軽鎖定常領域を含むベクター(pTRABacHuLCλHCγ1、図5b)を、κ軽鎖定常領域をλ軽鎖定常領域と置換することにより調製した。軽鎖は、クローン性リンパ球白血病細胞RNA調製物からRT−PCRにより単離した。クローニング操作の詳細は次の通りである。
【0137】
9F12 κおよび IgG γ1 定常領域断片の増幅:
9F12細胞(ATCC#HB8177)由来の全RNAをRNeasy Kit(Qiagen)を用い、その製造元の教示に従って抽出した。1本鎖cDNAをSuperScript逆転写酵素(GIBCO BRL, Rockville, MD)をオリゴ(dT)プライマーとともに用いて合成した。合成した1本鎖cDNAの1/12を、9F12κおよびIgGγ1特異的オリゴヌクレオチド(それぞれ配列番号:22 plus 配列番号:23および配列番号:20 plus 配列番号:21)を用い、Expand High Fidelity Taq(ロッシュ)を含む100μl PCR反応中にて増幅した。増幅9F12免疫グロブリン由来の断片をQiaex II樹脂を含む1.5% SeaKemアガロースから精製し、水50μlで溶出させた。断片のDNA濃度を測定した。精製9F12免疫グロブリン断片を別々に、TA−II (Invitrogen) PCRクローニングベクターに連結した。連結産物をコンピテントXLI−Blue大腸菌に形質転換し、LB−カルベニシリン寒天平板上にて37℃にて一晩発育培養した。ミニプレップコロニーを調製し、プラスミドDNAを配列決定した。
【0138】
9F12 κ定常領域の発現ベクターへの挿入
κ定常ドメインに関し、κ定常ドメインを含有するプラスミドDNA5μgおよびSCS110 E.coli(大腸菌)から精製したベクターp2BacMA のDNA2μg をStu IおよびHind IIIで消化した。κ定常領域を含む320bp断片およびp2BacMAベクターを含む7.1kb断片をQuiex IIでゲル精製し、水50μlで溶出した。両断片のDNA濃度を測定した。次いで、精製した断片をRapid Ligationキット(ロッシュ)で連結した。連結産物をコンピテントXLI−Blue大腸菌に形質転換し、LB−カルベニシリン寒天平板上にて37℃にて一晩発育培養した。ミニプレップ細菌コロニーを調製し、組換えDNAを配列決定し、それによりκ定常領域の挿入を確認した。得られたプラスミドベクターはpTRABacLCκであった。
【0139】
IgG γ1 定常ドメインのベクターへの付加:
IgGγ1定常領域を含むプラスミドDNA5μg およびベクターpTRABacLCκのプラスミドDNA2μg をまずSpe IおよびXba Iで消化し、IgGγ1定常ドメインをベクターに付加した。IgGγ1定常領域の1kb断片およびpTRABacLCκベクターの7.4kb断片をQuiex IIを含むアガロースプラグからゲル精製し、水50μlで溶出した。両断片のDNA濃度を測定した。次いで、精製した断片をRapid Ligationキット(ロッシュ)で連結した。連結産物をコンピテントXLI−Blue大腸菌に形質転換し、LB−カルベニシリン寒天平板上にて37℃にて一晩発育培養した。ミニプレップコロニーを調製し、IgGγ1挿入の連結および方向性を制限部位の制限分析と配列決定により決定した。得られた組換えベクターはpTRABacHuLCκHCγ1であった。
【0140】
このプラスミドpTRABacHuLCκHCγ1におけるミツバチメリチン分泌配列とCγ1領域配列、およびアルカリホスファターゼ分泌配列とCκ領域配列との間にそれぞれ転写終止コドンを付加し、該プラスミドをさらに調整した。この修飾のため、pTRABacHuLCκHCγ1ベクターをSpe I + Apa I消化により線状化した。次いで、線状化したベクターをアニール化相補プライマーγ1−stuff 1(配列番号:53)およびγ1−stuff 1’(配列番号:54)に連結し、インフレイム終止コドンを導入した。この修飾により得られたベクターを次いで、Stu I (AGGCCT) + Dra III (CACnnnGTG)で線状化した後、アニール化相補プライマーκ−stuff 1(配列番号:55)およびκ−stuff 1’(配列番号:52)に連結し、インフレイム終止コドンを導入した。これらの修飾の正味の効果をそれぞれ図6Cおよび6D
に示す配列に表す。(付加した配列は二重線と太字により示している)
【0141】
γ定常領域のベクターへの付加:
γ軽鎖イディオタイプを示す慢性リンパ球白血病(CLL)の患者から精製した末梢血リンパ球(PBL)から全RNAを、RNeasyキット(Qiagen)を用いて抽出した。
【0142】
SuperScript Preamplification System(GIBCO BRL)を製造元の教示に従って使用し、約2.0μg の全RNAを第1ストランドcDNA合成の鋳型として用いた。オリゴ(dT)をプライミングに使用した。Vγシグナル配列の部分と同一の上流プライマー(TTGCTTACTG CACAGGATCC GTG; 配列番号:47)およびλ定常領域の最後の幾つかのコドンと相補的な下流プライマー(TGCCGTCGGC AGGAGGTATT TCATTATGAC TGTCTCCTTG CTATTATGAA CATTCTGTAG GGGCCA; 配列番号:48)および3’非翻訳領域の部分を用い、PCR反応により合成した1本鎖cDNAの1/12を増幅した。PCR産物をpCRIIベクター(Invitrogen)にクローニングし、配列決定を行い、同一性を確認した。正しいλ定常領域配列を含むプラスミドを第2のPCRの鋳型として選択した。この反応では、Jλの下流直後のλ定常領域の配列に相当する、操作したDra III制限部位を含有するセンスオリゴヌクレオチドCλ−5’(配列番号:49)、およびλ定常領域の直後の終止コドンをまたぐ、Hind IIIを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーCλ−3’(配列番号:50)を使用した。得られたPCR産物をpCR2.1−TOPOベクターにクローニングし、配列決定した。HindIII制限反応に際し、挿入物の方向性に応じて、λ定常領域配列を含む断片を幾つかのプラスミドから遊離させた。この制限断片をゲル単離し、pTRABacHuLCκHCγ1(図5A)にクローニングした後、Hind III消化により線状化し、それによりλおよびκ定常領域をともに含む中間プラスミドを作製した。このプラスミドをStu IおよびDra IIIで制限反応し、κ配列を除去した。得られた線状化プラスミドをアニール化相補プライマーγ−stuff 1(配列番号:51)およびγ−stuff 1’に連結し、最終プラスミドであるpTRABacHuLCλHCγ1(図5B)を作製した。
【0143】
pTRABacHuLCκHCγ 1および/またはpTRABacHuLCλHCγ 1の構築に用いたすべてのオリゴヌクレオチドプライマーのリストは以下の表2および3に認めることができる。
【0144】
唯一のクローニング配列Stu IおよびDra IIIを含有するVαまたはVβ鎖の遺伝子はκまたはλ定常領域およびアルカリホスファターゼシグナル配列間に、および唯一のクローニング配列Spe IおよびApa Iを含有するVβまたはVα鎖の遺伝子はIgGγ1定常領域およびミツバチメリチン分泌シグナル配列間にそれぞれ、pTRABacHuLCκHCγ 1またはpTRABacHuLCλHCγ 1のいずれかを使用して挿入することができた。次いで、得られた発現ベクターをSpodoptera frugiperda (Sf−9)昆虫細胞に形質導入し、組換え出芽バキュロウイルスを調製した。次いで、組換えバキュロウイルスをSf−9細胞にて連続的に増幅し、高力価の組換えバキュロウイルスストックを調製した。この高い力価の組換えバキュロウイルスストックをTrichoplusia ni (High−5)細胞に感染させ、以後のキメラTCR/Igタンパク質の産生に使用した。
【0145】
【表2】
【0146】
実施例3.患者から誘導したイディオタイプ V α および/または V β 鎖の遺伝子の発現ベクターへの挿入
上記のようにして、腫瘍由来のVαおよび/またはVβ鎖を単離した後、ミリチンリーダーペプチドの末端40ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマー(Vβ鎖クローニングのため)(配列番号:8−ACTAGTTTTT ATGGTCGTGT ACATTTCTTA CATCTATGCG)、アルカリホスファターゼリーダーペプチドの末端31ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマー(Vα鎖クローニングのため)(配列番号:9−AGGCCTGAGG CTACAGCTCT CCCTGGGC)、ならびに上記の分析から配列決定されたそれぞれVαまたはVβ遺伝子の最初の20ヌクレオチドを調製した。αまたはβ鎖定常領域由来のCA (CA/IgK;配列番号:15)の4−36塩基対およびCB (CB/IgG1;配列番号:14)の6−35塩基対に相補的な逆オリゴヌクレオチドプライマー。クローナルVαまたはVβ配列を有すると同定された組換えプラスミドを2回目のPCRの鋳型として使用する。サイクル条件は既述の通りである。
【0147】
発現ベクターへの V α 領域挿入:
配列を確認したプラスミド調製物から増幅したPCR誘導DNA断片を制限酵素Stu I およびDra IIIで消化し、アガロースゲルにて分離する。Vα遺伝子を含有すると推測される約360bp断片を溶出させ、適当なバキュロウイルス免疫グロブリン発現移入ベクターに挿入する。基本的には、PCR誘導Vα産物および対応するpTRABacHuLCκHCγ1またはpTRABacHuLCλHCγ 1カセットベクター2 μg をStu I およびDra IIIで消化した。患者誘導Vα鎖由来の360 bpDNA断片および線状pTRABacHuLCκHCγ1またはpTRABacHuLCλHCγ 1ベクターの8.4kb断片をQuiex IIを含むアガロースプラグから精製し、水50μlで溶出した。両断片のDNA濃度を測定し、次いで両断片をRapid Ligationキット(ロッシュ)を用いて連結した。連結産物をコンピテントXLI−Blue大腸菌に形質転換し、LB−カルベニシリン寒天平板上にて37℃にて一晩発育培養した。ミニプレップコロニーを調製し、組換えDNAプラスミドを制限分析と配列決定により確認した。得られたベクターをpTRABacVαHuLCκHCγ1またはpTRABacVαHuLCλHCγ 1と命名した。
【0148】
発現ベクターへの V β 領域挿入:
配列を確認したプラスミド調製物から増幅したPCR誘導DNA断片を制限酵素Spe IおよびApa 1で消化する。Vβ遺伝子を含有する約360bp断片を切りだし、ゲル精製し、関連Vα遺伝子を含有する適当なバキュロウイルス免疫グロブリン発現移入ベクターpTRABacVαHuLCκHCγ1またはpTRABacVαHuLCλHCγ1に、または関連Vα遺伝子を含有しないpTRABacHuLCκHCγ1に挿入する。基本的には、PCR誘導Vβ産物およびpTRABacVαHuLCκHCγ1、pTRABacVαHuLCλHCγ1、pTRABacHuLCκHCγ12 μg DNAをSpe IおよびApa 1で消化した。Vβ鎖の360 bp断片およびpTRABacVαHCγ1、pTRABacVαHuLCκHCγ1、またはpTRABacVαHuLCλHCγ1の8.8kb断片またはpTRABacHuLCκHCγ1の8.4 kb断片をQuiex IIを含むアガロースゲルプラグから精製し、水50μlで溶出した。両断片のDNA濃度を測定し、両断片をRapid Ligationキット(ロッシュ)を用いて連結した。連結産物をコンピテントXLI−Blue大腸菌に形質転換し、LB−カルベニシリン寒天平板上にて37℃にて一晩発育培養した。ミニプレップコロニーを調製し、組換えDNAプラスミドを配列決定した。得られたベクターをpTRABacVαHuLCκVβHCγ1、またはpTRABacVαHuLCλVβHCγ1、またはpTRABacHuLCκVβHCγ1と命名した。
【0149】
【表3】
【0150】
実施例4.V α および/または V β 鎖イディオタイプを含有するバキュロウイルス発現ベクターによる昆虫細胞系統のトランスフェクションおよび組換えキメラタンパク質の調製:
昆虫細胞発育:
2つの樹立された昆虫細胞系統(Sf9およびHigh−5)を改変バキュロウイルスベクターにトランスフェクトし、組換えキメラVH/免疫グロブリンおよび/またはVL/免疫グロブリンタンパク質を調製した。すべての昆虫細胞は、使い捨て滅菌通気式振盪フラスコ(Coming)中、140−150 rpmにて、50μg/Lゲンタマイシンを含むESF−921血清不含昆虫培地 (Expression Systems LLP)にて28℃において、液体容量が50%を越えることがないように発育させた。細胞を2−3日ごとに継代した。凍結細胞を産物の各ロットごとに稼動しているセルバンクから、または6週ごとに解凍することにより(凍結保護培地: 10% DMSO, 40% ESF−921 培地, 50% High−5 ならし培地)、バキュロウイルスによる感染に対して退縮性でない対数増殖期の細胞を連続して保存できるようにした。
【0151】
Sf9 細胞トランスフェクションおよび組換え検定:
Vαおよび/またはVβ領域の遺伝子および免疫グロブリン重鎖および/または軽鎖定常領域の遺伝子を含む改変バキュロウイルス発現ベクターを、BacVector−3000トランスフェクションキット(Invitrogen)を用いてSf9細胞に同時トランスフェクトした。アガロースオーバーレイから10個のプラークを個別に取り出した。単離したプラーク由来のウイルスを使用し、ESF−921培地5ml中、50%全面成長のSf−9細胞を播種したT−25フラスコに感染させた。T−25フラスコにて増幅したクローナルウイルス単離物を、2つのプライマー(配列番号:37−TTTACTGTTT TCGTAACAGT TTTG)および(配列番号:38−GGTCGTTAAC AATGGGGAAG CTG)を使用するPCRにより試験し、単離したプラークのクローン性を確かめ、野生型ウイルスの混入のないことを確かめた。概して言えば、組換え移入ベクタープラスミド200ngを、供給されているEufectin lipid試薬を用いたBac Vectorマニュアル(Novagen)に記載されているようにしてトリプレット−カットBac−Vector−3000により同時トランスフェクトした。このトランスフェクション混合物を連続して5倍に希釈した。この100μlを、2.5 x 106接着Sf9細胞を含む60mm組織培養皿にて培養した。1時間後、細胞に、ESF−921培養培地の1%アガロース溶液4mlを重層した。トランスフェクションの144時間目に、Neutral Red (Sigma, St. Louis, MO)を用いて生細胞を染色し、次いでアガロースオーバーレイ中にて発育しているトランスフェクト細胞から10個のクローンを個別に取り出した。ESF−921培地1 ml中、一晩のプラーク・プラグからウイルスを溶出させた。T−25フラスコに、ESF−921培地5ml中、50%全面成長のSf−9細胞を播種し、溶出クローナルウイルス0.5 mlを感染させた。感染の95時間後、T−25フラスコから培地0.5mlを取り出し、遠心により細胞を除去し、得られた上清を、ニトロセルロースへのブロッティングにより免疫グロブリン活性について検定した。野生型ウイルスが存在しないことも以下のPCRにより試験した。
【0152】
組換えバキュロウイルスを含む感染上清(10 μl)を、10 mM Tris pH 8.3、50 mM KCl、0.1 mg/ml ゼラチン、0.45% Nonidet P−40および0.45% Tween−20を含み、さらに6 μg プロテイナーゼ−Κを含む細胞溶解緩衝液90 μlに加えた。この混合物を60℃にて1時間加熱し、95℃で10分間インキュベートすることによりプロテイナーゼ−Κを変性させた。加熱した混合物25μlが冷却した後、新しいPCRチューブに移し、10 mM Tris pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1 mg/ml ゼラチン, 0.45% NP−40, 0.45% Tween−20, 400 μM 各dNTP, 5 mM MgCl2, 50 pM 各 PCR プライマー (最終)および2.5 U Taq ポリメラーゼ (ロッシュ(Roche))を含む別の混合物25μlを加えた。ウイルスDNAを、92℃の1分、次いで58℃の1分、および72℃の1分の40サイクルで増幅した。組換えバキュロウイルスプライマーPHフォワード(配列番号:37)およびPHリバース(配列番号:38)を使用し、T細胞レセプター遺伝子の部分を発現するポリヘドロン座を増幅した。アガロースゲルでの電気泳動によりPCR産物を分析した。組換えバキュロウイルスは1300 bp断片が増幅され、野生型バキュロウイルスは上記のプライマーセットを用いて約800 bp断片が増幅される。野生型ウイルスが混入した組換えウイルスはこれら両断片サイズが増幅される。
【0153】
Sf−9 細胞における高力価ウイルス保存液の調製:
T−25初代培養物から得た2mlを、ESF−921培地10ml中、50%全面成長のSf−9細胞を含有するT−75フラスコに移し、28℃にて120時間細胞を発育させた。二次T−75培養物5mlを、2x106 細胞/mlのSf−9細胞50mlを含有する150ml振盪フラスコに移し、細胞を28℃にて120時間発育させた。150ml振盪フラスコから25mlを取り出し、それを1L振盪フラスコ中の2x106 細胞/mlのSf−9細胞500mlに移し、28℃にて発育させた。培養物が20%に達したら、トリパンブルー染色により生細胞をスコアー化し(感染の約120−144時間後)、3000xGの遠心によりウイルス培養物を収獲し、50ml滅菌チューブに分配し、チューブの半分を4℃にて保存し、休止には−80℃にて保存した。これにより高力価のウイルス保存液500ml(>1x108 pfu/ml)が収獲され、これをキメラタンパク質生産のためのHigh−5昆虫細胞の感染に用いた。ウイルス力価(pfu/ml)はBaculovirus Rapid Titer Kit (Clontech, Palo Alto, CA)を用いて測定した。
【0154】
High−5 昆虫細胞における TCR/Ig キメラタンパク質の生産:
High−5昆虫細胞(BTI−TN−5B1−4)はSf−9細胞と比較して、より高いレベルの組換え免疫グロブリン(2−20 X)を分泌するので、それをTCR/Igキメラタンパク質生産のための細胞系統として選択した。初期の対数期にあるHigh−5細胞(1.0−2.0x106 cells/ml)を、ESF921培地(Expression Systems LLP)中5x105 細胞/mlの、通気閉口を有する1L使い捨て培養フラスコに播種した。フラスコを28℃にて140−150 rpmで振盪させ、フラスコ内の培地容量を経時的に500mlを越えないようにした。細胞密度が500 ml培地中、1.5−2.5 細胞/mlに達すると、感染多重度(MOI)約0.5:1 (pfu:細胞)で高力価組換えバキュロウイルス保存液でフラスコを感染させた。次いで、フラスコを28℃にて140−150 rpmで振盪させた。細胞生存率を毎日チェックし、感染の96時間内に生存率が<50%に落ちない段階で培養物を収獲した。
【0155】
実施例5.V α 免疫グロブリンおよび V β 免疫グロブリンを含むキメラタンパク質の精製:
約5,000 x gで60分間遠心し、次いで0.2μ PES滅菌フィルターユニットで濾過し、細胞および細胞残骸を除去した。プロテインA High−Trap カートリッジ (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ)によるアフィニティークロマトグラフィー、およびその後の50%飽和硫安中の沈降により、清澄な組織培養培地からキメラタンパク質を精製した。精製したキメラタンパク質をサイズ分離し、FPLC クロマトグラフィーにより緩衝液をPBSに交換した。タンパク質精製のために使用したすべての試薬はUSPバイオテクノロジー級(GenAr, Mallinckrot Baker, Parris, KY)であり、製造元によりエンドトキシンは試験されている。滅菌USP級水を使用し、すべての緩衝液および他の溶液を調製した。緩衝液および他の溶液は生物学的安全キャビネット内で調製し、0.2 μm PESフィルターユニットで滅菌濾過した。
【0156】
キメラタンパク質のプロテイン A セファロースアフィニティー精製:
発育している培養フラスコから組織培養培地を取り出し、5,000 x gで60分回転させて細胞および細胞残骸を沈殿させた。得られた上清を0.2 μ PESフィルターユニットで滅菌濾過した。VHおよび/またはVL−免疫グロブリンキメラタンパク質を含む濾過した培地にトリス緩衝液(1M, pH 7.4)を終濃度20mMまで加えた。蠕動ポンプ(Amersham Pharmacia)により、緩衝化組織培養上清をHighTrap組換えプロテインAセファロースアフィニティーカートリッジ5ml上に流速5ml/分で加え、清澄なフラスコ内の流路に集めた。カラムを5 ml/分にてPBS (pH7.4) 25 mlで洗浄した。流れの方向を逆にし、カラムをPBS 25 mlでさらに洗浄した。0.05Mクエン酸(pH 3.5)を1ml/分で逆にカラムに溶出し、画分1mlを集めた。この溶出した1ml画分に1M Tris (pH 9.0)約0.3 ml を加え、そのpHを素早く約8.0に調節した。この同じ方法により、プロテインG、プロテインL(これらに限定されない)または免疫グロブリン結合ドメインを結合できる他のタンパク質を含む他のタンパク質カラムを使用できる。
【0157】
キメラタンパク質の硫安沈降:
プロテインAセファロースから溶出されたVαおよび/またはVβ−Igを含有する画分を分光学的手法により同定した。ピーク画分をあつめ、容量を測定した。混合しながら同量の飽和硫安溶液を滴加した。得られた沈殿物を室温にて15分間放置し、5000xGの遠心にて沈降させた。沈降したVαおよび/またはVβ−Igキメラタンパク質を滅菌水中に再溶解した。High Trap Desalting カートリッジ(Amersham Pharmacia)を用いて、Vαおよび/またはVβ−Igキメラタンパク質をPBSに緩衝液交換し、次いで0.2 μlフィルターで最終的な滅菌濾過を行った。
【0158】
実施例6.キメラタンパク質のキーホールリンペットヘモシニアン( KLH )との会合(コンジュゲート):
精製後、Vαおよび/またはVβ−Igキメラタンパク質をグルタルアルデヒド架橋を介してGMP 級 KLH (VACMUNE, Biosyn Corporation)に次のようにして会合させた。滅菌15ml円錐チューブ中、精製した滅菌イディオタイプキメラタンパク質の少なくとも5mgを同重量のKLHと混合した。1%グルタルアルデヒド(25% 1級 水溶液, Sigma)1mlを終濃度0.1%まで滴加した。次いで、チューブを室温にて4時間ゆっくりと振動させた。滅菌PBS 2Lに対して滅菌DispoDialyzers (Spectrum Labs)にて会合体を透析し、その際、生物学的安全フードにて少なくとも24時間緩衝液を3回交換した。最終的Vαおよび/またはVβ−Igキメラタンパク質−KLH会合体を透析チャンバーから無菌的に取り出し、それを滅菌チューブに移し、混合し、次いでバイアルに分配した。最終産物の各バイアルにロット番号、患者情報、バイアル番号およびそれをバイアルに分配した日付を付した。最終ロットの10%を滅菌性について試験し、またバイアルを選択しエンドトキシンに関して試験した。
【0159】
実施例7.産物試験:
生産ロット上清を含むバキュロウイルスの DNA 配列:
昆虫細胞生産培養上清の試料1mlを収獲し、卓上遠心機にて5分間3000rpmにて回転させ、細胞残骸を除去した。バキュロウイルス粒子を含む、この清澄な上清の少なくとも0.1mlを、細胞溶解緩衝液(10 mM Tris, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1 mg/ml ゼラチン, 0.45% Nonidet P−40, および 0.45% Tween−20)と1:9の容量比で混合し、プロテイナーゼK(終濃度60μg/ml)で1時間60℃のタンパク質分解反応に付し、次いで95℃で15分間変性させた。この細胞溶解液25μlを、400μMの各dNTP、5 mM MgCl2、25 pmol オリゴヌクレオチド(配列番号:32および配列番号:35;または配列番号:36および配列番号:37)(表4参照)、および2.5 U Taqポリメラーゼ(ロッシュ)を含む蒸気の細胞溶解緩衝液25μlとさらに混合し、PCR反応を行った。サイクリング条件は、(I) 92℃での2分間の初期変性、(ii) その後の、92℃、58℃および72℃でのそれぞれ1分間の40サイクル、および(iii) 72℃での7分間の最終伸張。PCR産物は、アガロースゲル電気泳動により、予想サイズおよび量について評価した。次いで、2つまたはそれ以上の裸のプライマーを使用し、PCR産物の配列決定を直接行った。完全なVαおよび/またはVβヌクレオチド配列を、OpenGene Automated DNA Sequencing System (Visible Genetics)および上記の配列決定分析ソフトウエアを用いて決定し、その患者イディオタイプに対応するpTRABac(NHL−FV−8786−XXX)ベクターのV−遺伝子配列と比較した。
【0160】
抗ヒト IgG ELISA の免疫グロブリン検定を用いたキメラタンパク質の分析:
炭酸緩衝液中、ヤギ抗−ヒトIgG重鎖特異的抗体(Fischer, Pittsburgh, PA)の3 μg/ml希釈液100 μlでマイクロタイタープレートを被覆し、TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5) 100 μlで2回洗浄した。次いで、22℃にて1時間、ウエルをTBSB (TBS + 1% BSA) 200μlでブロックした。2倍連続希釈の希釈試料100μl をウエルに加え(2回操作)、22℃にて1時間インキュベートした。この分析を、精製ヒトIgG1/κまたはIgG1/γ標準品(Sigma, St. Louis, MO)を用いて繰り返した。ウエルをTBST (TBS + 0.1% Tween 20) 200μlで4回洗浄した。検出抗体、ヤギ−抗−ヒト H および L−HRP (Goat−anti−Human H and L−HRP、Chemicon, Temecula, CA)をTBSBで1:2000に希釈し、その100μlをウエルに加え、22℃にて1時間インキュベートした。ウエルをTBST200μlで6回洗浄した。基質(TMB 1 component, KPL Inc., Gaithersburg, MD)100μlをウエルに加え、30分間発色させ、試料をOD650クロマトグラムにより測定した。Hi Trap Desalting カラムから溶出された主要なタンパク質ピークはヒトIgG ELISA活性と対応しなければならない。
【0161】
実施例8.キメラタンパク質の濃度および純度:
生産上清におけるバキュロウイルスのVαおよび/またはVβ遺伝子のDNA配列は、生産ベクターのDNA配列と一致していなければならない。キメラタンパク質の濃度はOD280に基づいて0.5mg/mlを越えなければならず、ヒトIgG ELISA活性と対応しなければならない。
以下の表4は最終産物の同一性を確立するのに使用されるプライマー配列の概要である。
【0162】
【表4】
【0163】
実施例9. Vαおよび/またはVβ−Igキメラタンパク質および/またはそのサイトカインとの結合体(会合体)の同時投与
ハツカネズミT細胞リンパ腫系統であるRMAにより発現されるTCR Vβ12遺伝子(Van Hallら、Identification of a Novel Tumor−Specific CRL Epitope Presented by RMA, EL−4, and MBL−2 Lymphomas Reveals Their Common Origin. J. Immunol., 165:869−877; 2000に記載)を、メリチンリーダーペプチドの末端40ヌクレオチドおよびハツカネズミVβ12の最初の20ヌクレオチドを含有する5’ヌクレオチド(配列番号56:TTACTAGTTT TTATGGTCGT GTACATTTCT TACATCTATG CTGACGCTGG AGTTACCCAG A)、ならびにハツカネズミCbおよびヒトIgG1の5’末端に相補的な3’オリゴヌクレオチド(配列番号57:AGGAGACCTT GGGTGGAGTC GGGCCCTTCA GATCCTC)を用いて先に記載のようにクローニングした。得られたPCR産物(図X、最終ページを参照のこと)をpTRABacHuLCκHCγ 1のSpe I/Apa I部位にクローニングしてベクターpTRABacHuLCκVβ −RMAHCγ 1を得た。TCR Vβ −RMAHCγ 1キメラタンパク質を昆虫細胞中に生じさせ、先に記載のように精製した。このようなタンパク質の例(図9)について、C57/B16マウスに10,000 RMA T細胞リンパ腫細胞を植え付け、続いて36時間後に、RMA−特異的Vβ−Igキメラタンパク質(500 μg/mlの濃度)をサイトカインGM−CSF(100,000 IU/mlの濃度)とともに含む組成物を用いて処置した。このワクチンを、毎日、1x+GM−CSF x3で与えた。正確な処置プロトコルを14日間の間をおいて後、繰り返した。この方法で注射したマウスのうち60%が腫瘍移植の40日後に生存していたが、他方、腫瘍投与したコントロールマウスのうち90%より多くが死亡した。
【0164】
RMA Vb PCR産物の配列は以下の通りである(ミツバチメリチンシグナル配列を含む)。
【数1】
【0165】
本発明を完全に記載したので、当業者であれば、広範な範囲の等価なパラメーター、濃度および条件内で、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、そして過度の実験を伴うことなく、本発明が行われうることを理解する。
本発明は特定の実施態様に関連付けて説明したが、さらに変更し得ることが理解されるであろう。この適用は、本発明の原則、ならびに本発明が属する分野の既知または慣習的な実施内に入り、かつ添付の請求の範囲の範囲内に入る先に記載の本質的な特徴に当てはめることができるような本発明の開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変動、用途または適合を保護することを意図している。
【図面の簡単な説明】
【図1】T細胞媒介性病態を有する患者のT細胞由来の特定のTCRのVαまたはVβに対するキメラタンパク質を含有する組成物を調製するための概略である。
【図2】多重クローニング部位を有するバキュロウイルス発現ベクターp2Bacのプラスミド地図である。
【図3】バキュロウイルス発現ベクターp2BacのDNA配列(配列番号:5)である。5’から3’方向へ描いている。p2BacベクターはAcNPVポリヘドリン遺伝子プロモーター(GenBank 受入番号 X06637 (配列番号:44)のヌクレオチド1 から120)、およびAcMNPV p10プロモーター(GenBank 受入番号 A28889 (配列番号:45)のヌクレオチド8から237)を含んでいる。
【図4】プラスミドpTRABac/9F12のDNA配列である。このプラスミドは、安定なヒト細胞系統9F12(配列番号:41)から発現される重鎖および軽鎖(κ)の遺伝子を含有する。9F12細胞系統は破傷風トキソイド特異的なヒトIgG1/κ抗体を産生する。下線部分は成熟9F12 IgGγ1(TTTACCC....)およびカッパ(ATCGACA...)鎖をそれぞれコードする配列である。配列は5’から3’方向へ描いている。
【図5A】IgGγ1およびκ定常領域を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターpTRABacHuLCκHCγ1のプラスミド地図である。
【図5B】IgGγ1およびλ定常領域を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターpTRABacHuLCλHCγ1のプラスミド地図である。
【図6A】pTRABacHuLCκHCγ1(配列番号:6)のDNA配列である。5’から3’方向へ描いている。
【図6B】pTRABacHuLCλHCγ1(配列番号:7)のDNA配列である。5’から3’方向へ描いている。
【図6C】カッパスタッフプライマー(配列番号:42)を利用する修飾後におけるpTRABacHuLCκHCγ1のDNA配列である。5’から3’方向へ描いている。
【図6D】ラムダスタッフプライマー(配列番号:43)を利用する修飾後におけるpTRABacHuLCλHCγ1のDNA配列である。5’から3’方向へ描いている。
【図7】TCRアルファ鎖およびベータ鎖の代表的タンパク質配列である。両配列の定常領域に下線を施し、免疫グロブリン折り畳みの最初のシステイン残基に二重線を付している(配列番号:24および配列番号:25)。
【図8A】VαおよびVβの挿入部位を示す、IgGγ1およびκ定常領域を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターpTRABacHuLCκHCγ1のプラスミド地図である。
【図8B】VαおよびVβの挿入部位を示す、IgGγ1およびλ定常領域を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターpTRABacHuLCλHCγ1のプラスミド地図である。
【図9】TCR Vβ−Igキメラタンパク質製剤による腫瘍担持マウスの処置である。
関連出願
本出願は、「イディオタイプワクチンの調製方法」と題する米国仮出願番号60/224,723、「組換え免疫グロブリンを調製するための発現ベクター」と題する米国仮出願番号60/224,722、および「T細胞媒介性病態を改変するための方法および組成物」と題する米国仮出願番号60/266,133の優先権を主張する。
【0002】
【技術分野】
本発明は一般に、免疫学および免疫療法の分野に関する。詳細には、本発明はT細胞媒介性病態、例えばT細胞悪性腫瘍および/または自己免疫疾患を改変するための方法および組成物に関する。
【0003】
【発明の背景】
本発明は一般に、免疫学および免疫療法の分野に関する。詳細には、本発明はT細胞媒介性病態、例えばT細胞悪性腫瘍および/または自己免疫疾患を改変するための方法および組成物に関する。
免疫系は抗体媒介性および細胞媒介性の応答を生じさせる。それぞれのタイプの免疫応答は、B細胞(抗体性応答)およびT細胞(細胞性応答)のリンパ球の型によって調節されている。T細胞は、特定の外来タンパク質(抗原)と、その一部が主要組織適合複合体(MHC)と関連する場合に主として抗原提示細胞(APC)を介して結合し、抗原提示細胞では抗原が断片にまで消化されてそのMHCと結合するAPCの表面に提示される。
【0004】
T細胞リンパ腫は、免疫系を機能傷害におとしめるT細胞複製の不良を原因とするT細胞媒介性病態である。T細胞リンパ腫は、現在の治療法では有効に処置するのが困難であり、さらなる治療上のストラテジーが医師のさらなる手段として望まれる。
【0005】
他のT細胞媒介性病態には、宿主自身の免疫系が宿主自身の組織を攻撃する自己免疫疾患として分類される、増加途上の多くのヒト疾患が含まれる。T細胞は免疫系の最初の調節物質の1つであり、このような自己免疫病態に対して直接的または間接的に作用する。自己免疫疾患の例としては、慢性関節リウマチ(RA)、重症筋無力症(MG)、多発性硬化症(MS)、全身性エリテマトーデス(SLE)、自己免疫性甲状腺炎(橋本病)、グレーブス病(Graves’ disease)、炎症性大腸疾患、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎、および特定の糖尿病が挙げられる。これら自己免疫疾患の現在の処置は治療するのでなく、症状に対処するのみである。
【0006】
現在、これらのおよび他の自己免疫疾患には、T細胞レセプター(TCR)がMHC/自己抗原(または非自己抗原)複合体と結合することにより刺激されたTヘルパー細胞の作用が関与していることが知られている。自己免疫疾患の可能性ある処置として、MHC/抗原複合体とTCRとの相互作用を妨害することが提案されている。
【0007】
殆どのTリンパ球の表面に見出されるTCRは、αおよびβ鎖を最も普通に含むヘテロ二量体の一体化(インテグラル)膜タンパク質である。TCRの全体三次元構造は、αおよびβ鎖がそれぞれ抗原認識に関与するアミノ末端可変(V)領域および細胞内部への認識事象をシグナリングするのに重要なカルボキシ末端定常(C)領域を含む点において、B細胞上の細胞表面関連免疫グロブリン(Ig)と類似している。β鎖は、多様性(D)および結合(J)遺伝子セグメントによってコードされている付加的なアミノ酸をさらに含む。これらのV、D、JおよびC遺伝子セグメントは離れて位置し、染色体上その配座は分離している。Vβ、Dβ、JβおよびCβ遺伝子セグメントは再構成され、β鎖をコードする機能的な転写単位が創製される。機能的なα鎖転写単位は、Vα、JαおよびCαセグメントの再構成によって形成される。Vα、JαおよびCα遺伝子セグメントおよびVβ、Dβ、JβおよびCβ遺伝子セグメントの、リンパ球クローンにおけるこのユニークな再構成により、特定のリンパ球においてのみ見出されるユニークなタンパク質決定基、イディオタイプ(Id)が生じる。
【0008】
TCR分子を免疫グロブリン分子と区別する重要な相違が存在する。免疫グロブリンは一般に、B細胞抗原レセプターまたは分泌型分子としてのリガンドを液相において認識し、他方TCRは、他の細胞表面に存在するMHCクラスIおよびII分子と関連しているタンパク質抗原由来のペプチド断片としてのリガンドのみを認識する。さらに、免疫グロブリンとは異なり、TCR mRNAの選択的スプライシングは分泌型TCR鎖を生じるために起こらず、従ってTCR分子はT細胞の表面上の一体化膜タンパク質としてのみ存在する。最後に、T細胞が抗原認識の後に活性化されれば、TCR可変領域遺伝子セグメントの超変異は起こらず、これは、全体変異を受けてリガンドに対する親和性を増大させる、B細胞における免疫グロブリンのV遺伝子セグメントと対照的である。
【0009】
自己免疫疾患の膨大な研究により、現在、T細胞およびその発現TCR鎖は他のT細胞による免疫調節の標的となり得ることが多く報告されている(Vandenbark et al., ”Human TCR as antigen: Homologies and potentially cross−reactive HLA−DR−2 restricted epitopes with the AV and BV CDR2 loops,” Critical Reviews in Immunol., 20:57−83, 2000)。TCR鎖のペプチド断片は酵素学的にプロセッシングされた後、MHCクラスIおよびクラスII分子とともに活性化T細胞の表面に提示されると、現在考えられている。MHCクラスII分子は、活性化された後のT細胞上にのみ見出され、最近の証拠は、TCRペプチドの提示は、活性化の後にその発現が増大されるMHCクラスI分子を介して起こることを示している(Ware et al., Immunity 2:177−184, 1995; Jiang et al., Immunity 2:185−94, 1995)。このMHC/TCRペプチド複合体は、MHCクラスI拘束自己CD8+およびMHCクラスII拘束CD4+エフェクターT細胞の形態で自己調節免疫を誘導する。T細胞媒介性自己免疫疾患の準備段階において選択されたTCRペプチドワクチンの免疫調節性が報告されている(Gold et al., Critical Reviews Immunol., 17:507−10, 1997)。さらに、全TCR鎖はT細胞上にクローン的に分配されるので(B細胞のクローンにおける免疫グロブリンのように)、無傷の機能的TCRはT細胞リンパ腫にとっての可能性ある腫瘍特異的抗原としての候補である。無傷のTCRを抗原として使用する不利益のひとつは、αおよびβ鎖の定常領域に対する免疫応答が惹起されることに由来し得る合併症である。
【0010】
TCR鎖に特異的な免疫調節性細胞性応答は、TCR鎖の可変領域の決定基をコードするする生殖系列に対し、明らかに攻撃する。TCR鎖はIg分子のように変異を受けないので、包括的TCR鎖を治療目的で使うことが動物実験の証拠によって示唆された。細菌にて調製された分泌型TCRβ鎖(Kumar, J.Immunol. 159:5150−56, 1997)、TCRβ鎖を発現するワクシニアウイルス構築物(Chundru, J.Immunol. 156;4940−45, 1996)、または単一のTCRβ鎖をコードする「裸の」DNA構築物(Waisman, Nat.Med. 2:899−905, 1996)によるワクチン接種はすべて、TCRβ鎖を免疫するための調節T細胞応答を誘導させた。
【0011】
化学的性質が確定されたユニークなTCRモチーフを基本とするペプチドワクチンがT細胞媒介性病態を処置する治療物質として使用され試験された。研究者のなかには、TCR鎖のフレームワーク/CDR領域誘導化ペプチドは、特定の疾患において過剰発現するTCR鎖から誘導されるペプチドで処置すると、その動物において自己免疫疾患の発現を予防できることを示したものがいる。これは、T細胞が自身の内生TCR鎖をプロセッシングし、それを再度他のT細胞上に提示させてT細胞−T細胞相互作用を機能させ、病原細胞を調節できることを示している。しかし、TCRペプチド認識には、TCR鎖がMHC分子とともに標的T細胞表面上に提示されるペプチド断片にプロセッシングされる必要があり、そのため特定のTCR由来のどのペプチドが臨床において有効であるかを前もって予測することは極めて困難である。これは、TCRペプチドに対するMHCクラスII拘束応答を証明する近交系げっ歯類における生存試験によって証明されている (Gold et al., Critical Reviews Immunol., 17:507−10, 1997, supra)。従って、殆どのタンパク質同様、Vβ配列およびMHCの両者によってどのエピトープがT細胞の刺激因子であるかが決定され、相当するTCRペプチドがVβアミノ酸配列内のどこに存在するのかを予測する明確な規則はない。この試みは、ヒト人口に存在するMHC多型の膨大さによってより複雑となっている。
【0012】
TCRイディオタイプを調製しT細胞性免疫応答を調節するのは、TCRが一体化膜タンパク質であり普通は可溶性タンパク質として合成も分泌もされないため、困難である。従って、病原細胞、例えば腫瘍細胞からTCRの充分量を、治療目的のため慣用的に精製するのは実際的でない。
【0013】
大量の分泌型へテロ二量体TCRを調製する試みが昆虫細胞を用いてなされた。分泌型分子は全VαJαCα/VβDβJβCβ細胞外ドメインを含み、コンホメーション的に特異的な抗−TCR Vβ抗体による検出に基づいて、正しく折り畳まれていた。しかし、分泌型分子の産生レベルは低くなる場合がある。他の研究者は、同起源のパートナーMHC+ペプチドを認識する機能的TCRを産する可溶性へテロ二量体構造を作成する一定の目的で、種々の方法を用いて組換えTCR鎖を調製した。
【0014】
治療目的に幾つかの異なる方法によりTCRの可溶性一部を調製する努力は別の顕著な問題をはらんでいた。その問題および関連する努力は次の通りである:(1)封入体として精製した後再折り畳みできる大腸菌における単一鎖Fv構築物の産生(Kurucz et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 90:3830−34, 1994)、(2)細菌における組換えTCR分子の産生(Kumar et al., J.Immunol. 159;5150−56, 1997; Offner et al., J.Immunol. 161:2178−86, 1998; Novotny et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 88:8646−50, 1991)、(3)TCR可変領域およびすべてまたは殆どすべてのTCR定常領域と、哺乳動物細胞から分泌し得るIg定常領域との融合によって作成されるキメラ分子の産生(Gregoire et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 88:8077−81, 1991; Weber et al., Nature 356:793−96, 1992; Eilat, Proc.Nat.Acad.Sci. 89:6871−75, 1992)、(4)ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼCの作用により切断できるホスファチジルイノシトールグリカン結合を介して哺乳動物細胞の表面にTCRの細胞質外ドメインを発現させること(Lin et al., Science 249:677−79, 1990; Chung et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 91:12654−58, 1994; Okada et al. J.Immunol., 159:5516−27, 1997)、および(5)分泌型タンパク質として単一またはヘテロ二量体完全TCR鎖を昆虫細胞において発現させること(Kappler et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 91:8462−66, 1994)。これら細菌を利用する方法に付随する欠点は、確実なる可溶性と可能性あるエンドトキシン混入の問題であり、これらは細菌にて作成されるタンパク質の簡便な収獲と高い収量を不可能にする。哺乳動物細胞にて作成されるタンパク質では、ウイルス混入の問題がある。この問題は、リン脂質関連タンパク質を精製する際の困難性と相俟って複雑となり、上記方法の臨床使用の魅力を大幅に低下させる。
【0015】
所望の結合特異性をコードする遺伝子を同定するには有用であるが治療応用には一般に有益でない大腸菌において抗体を産生させると、さらなる困難性に遭遇する。典型的には、抗体の抗原結合断片であるFabまたはFvのみが細菌から分泌される(see, e.g., Kurucz et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 90:3830−34, 1994)。全鎖の4量体IgGを大腸菌から産生させる稀な場合、抗体は不適切にグリコシル化される。適当なグリコシル化がなければ、抗体は、抗体指向性細胞毒性(ADCC)の細胞融解活性や能動免疫療法を強力にする補体活性化を惹起させない。他方、哺乳動物発現系はグリコシル化された抗体を産生する。しかし、FDAの「考慮すべき点」のCBER部の最近の改変では、哺乳動物細胞の発現系において産生されるモノクローナル抗体に付随するウイルス混入への問題が明らかに警告されている。さらに、哺乳動物発現系にて産生された遺伝子操作抗体は極めて高価であると予想される (1回投与当たり$1500−$5000)。
【0016】
バキュロウイルス発現系は、大腸菌および哺乳動物細胞における抗体産生の優れた代替系である。バキュロウイルス系によれば、生物学的に活性なタンパク質を真核生物細胞において高収量(1−100 mg/L)で得ることが可能である(Haseman et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 87:3942−46, 1990)。バキュロウイルス/昆虫細胞系では、組換えタンパク質が原核生物にて過剰発現する際にしばしば遭遇する可溶性の問題を回避できる。さらに、昆虫細胞は、真核生物細胞に存在する、正しい折り畳みに関与する翻訳後修飾機構、ジスルフィド形成、グリコシル化、β−ヒドロキシル化、脂肪酸アシル化、プレニル化、リン酸化およびアミド化を含んでいる。ヒト結腸直腸癌腫細胞を認識する機能的なグリコシル化モノクローナル抗体のバキュロウイルス系における産生が最近証明された(Nesbit, J.Immunol.Methods, 151:201−208, 1992)。このバキュロウイルス産生抗体はADCCを媒介することが示された、これとは対照的に、細菌から産生される抗体はグリコシル化されず、よって検出可能なADCC活性は認められなかった。
【0017】
幾つかの場合において、生物学的活性タンパク質の発現におけるバキュロウイルス系の利用性が、過剰なタンパク質分解的変性無しに組換えタンパク質を効率的に可溶化できないことから障害されている。昆虫細胞における組換えタンパク質の発現の際に遭遇する可溶性およびタンパク質分解の問題を回避するため、バキュロウイルス移入ベクターが生物学的活性タンパク質の効率的分泌のために開発された。この宿主昆虫細胞から組みタンパク質を分泌させるベクターは、機能的分泌リーダー配列をポリヘドリンプロモーターの下流に挿入することにより構築される。cDNA配列のインフレーム挿入により、組換えタンパク質を分泌経路に置く異種シグナル配列を含むタンパク質が合成される。ヒトおよび昆虫リーダー配列はともに、昆虫細胞からの異種タンパク質の分泌を最大にするために試験された。ヒト胎盤アルカリホスファターゼシグナル配列(MLGPCMLLLLLLLGLRLQLSLG (配列番号:1);DNA配列:ATG GTG GGA CCC TGC ATG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTA GGC CTG AGG CTA CAG CTC TCC CTG GGC (配列番号:2))およびミツバチメリチンシグナル配列(MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(配列番号:3);DNA配列:ATG AAA TTC TTA GTC AAC GTT GCA CTA GTT TTT ATG GTC GTG TAC ATT TCT TAC ATC TAT GCG (配列番号:4))はともに、多くの細菌およびヒトタンパク質の分泌に有用であることが証明されている(Mroczkowski et al., J Biol. Chem. 269:13522−28, 1994およびTessier et al., Gene 98:177−83, 1991)。
【0018】
バキュロウイルス発現系を利用し、McKeever et al. (J.Exp.Med 184:1755−68, 1996)は、マウスIgG1重鎖のヒンジ、CH2およびCH3ドメインが連結したTCR鎖の細胞外ドメイン(Vα−CαおよびVβ−Cβ)からなるキメラタンパク質の産生を可能にした。膵β細胞抗原に特異的なT細胞クローン由来の、得られた可溶化TCR−IgG1キメラタンパク質を使用し、非肥満糖尿病(NOD)雌性マウスを免疫した。交配後、これらマウスの子孫を、母方から移入された抗−TCR抗体の糖尿病発現活性に対する効果について調べた。これらの試験により、可溶型で投与すると、TCRのαまたはβ鎖の可変領域は、誘導された系統のマウスにおいて免疫原性を示し得ることが証明された。これらの試験は、可溶性TCR−IgG1による免疫が天然のクローンタイプエピトープを認識する抗体の産生を刺激し得ることをさらに示している。McKeever et al.は、比較的単純な発現および精製ストラテジーを使用し、すべてのαおよびβ鎖を含有する可溶性TCR−IgG1タンパク質であって、そのTCR一部がTCRの機能的に活性な細胞表面型に見出されるものと交叉反応し免疫原性であるクローンタイプ決定を保持しているものを産生させることができると、明瞭に証明した。
【0019】
他の幾人かの研究者も、Ig鎖との融合分子としてTCR分子を種々の方法により発現させている。しかし、これらすべての研究はTCRの全構造を、即ち可変および定常領域の両者を、種々のIg骨格の一部と融合するのに使用し、すべてが初期の目的にかなうTCR可変領域の認識機能を再生していた。さらに、種々の形態のTCr鎖が、自己免疫疾患を予防/処置するための動物実験においてワクチンとして使用できることが証明されている。例えばOkada et al. (J.Immunol., 159:5516−27, 1997)には、哺乳動物細胞から作成した可溶性TCR鎖がマウスのT細胞腫瘍を処置するのに使用できることが示されている。しかし、上記のように、これらTCR分子の生産は困難であり、その産生レベルは低い。
さらに、TCRタンパク質を使用すると、獣医学の分野において治療的価値を有することが予測されている(see International Patent Application No. PCT/US99/17309, WO 00/06733, filed 29 July 1999)。
【0020】
【発明の概要】
本発明は、患者のT細胞媒介性病態を改変する方法を提供する。この方法は、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を有する少なくとも1つのキメラタンパク質を含有する組成物を投与する。他の好ましい態様では、ここでのキメラタンパク質は、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、リンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。さらに好ましい態様では、キメラタンパク質におけるTCR定常領域の一部は、約3−約30の連続アミノ酸残基である。リンカー領域はTCR定常領域の一部を含むことができる。さらに好ましい他の態様では、キメラタンパク質におけるTCR定常領域の一部は、定常領域の免疫グロブリン折り畳みにおける最初のシステイン残基を含み、そこまでのアミノ酸残基を含有する。この組成に使用されるVβまたはVα鎖はT細胞媒介性病態を有する患者のT細胞由来の特定のTCRと関連している。このような組成物を患者に投与した後、患者におけるT細胞媒介性病態は改変される。
【0021】
本発明はさらに、2つの異なるキメラタンパク質を含む組成物を投与することによる、患者のT細胞媒介性病態を改変する方法をも提供する。それぞれのキメラタンパク質は、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部と連結されている、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部を有している。他の好ましい態様では、ここでのキメラタンパク質は、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、リンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。さらに好ましい態様では、キメラタンパク質におけるTCR定常領域の一部は、約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26、または30の連続アミノ酸残基である。リンカー領域はTCR定常領域の一部を含むことができる。さらに好ましい他の態様では、キメラタンパク質におけるTCR定常領域の一部は、定常領域の免疫グロブリン折り畳みにおける最初のシステイン残基のアミノ末端側までのアミノ酸残基の幾つかまたはそのすべてを含有する。キメラタンパク質の一部であるVβおよび/またはVα鎖はT細胞媒介性病態を有する患者のT細胞由来の特定のTCRと関連している。
【0022】
患者由来のユニークなVαおよび/またはVβ鎖を含有する特異的TCRタンパク質は治療用組成物として開発できる。慢性関節リウマチ(RA)、重症筋無力症(MG)、多発性硬化症(MS)、全身性エリテマトーデス(SLE)、自己免疫性甲状腺炎(橋本病)、グレーブス病(Graves’ disease)、炎症性大腸疾患、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎および特定の糖尿病などの、自己免疫T細胞病態に関連するT細胞を、疑われる自己抗原を使用して選択的に刺激し、増殖させることができる。あるいは、自己免疫の攻撃を受けている組織から単離したT細胞を、T細胞成長因子、例えばL−2、IL−4などを使用して選択的に増殖できる。多発性硬化症に関連するT細胞は、Wilson et al. (J. Neuroimmunol. 76:15−28, 1997)による方法保父によって特徴付けされている(引用により、その図面、数値および表のすべてが本明細書に包含される)。他のT細胞媒介性病態に関連するT細胞は、Wilson et al.に記載されている方法を提供して特徴付けできる。少数の病原性T細胞を精製後、その細胞から発現されるT細胞レセプターの可変部分を本明細書に記載の方法によりPCRを用いてクローニングすることができる。クローニングすると、T細胞病態に特異的に関連するレセプターのVαおよび/またはVβ部分を使用し、本明細書に記載のバキュロウイルス系にて発現できるキメラタンパク質を作成できる。
【0023】
上記の組成物およびキメラタンパク質に使用される免疫グロブリン定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE重鎖、κおよびλ軽鎖のなかから選ばれるタンパク質の一部であることができる。ある態様では、キメラタンパク質は免疫グロブリン定常領域とともにTCRのVβまたはVα鎖のいずれかのみを含有する。キメラタンパク質の例としては、Vβ−IgGγ1、Vα−κ、またはVα−γ、またはVα−IgGγ1、Vβ−κ、またはVβ−λが挙げられる。別の態様の組成物は、免疫グロブリン定常領域とともにTCRのVβおよびVα鎖をそれぞれ含む2つのキメラタンパク質を含有する。この例としては、Vβ−IgGγ1およびVα−κ、またはVβ−IgGγ1およびVα−λ、またはVα−IgGγ1およびVβ−κ、またはVα−IgGγ1およびVβ−λが挙げられる。さらに特定の好ましい態様では、キメラタンパク質は、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、リンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。特定の好ましい態様では、キメラタンパク質におけるTCR定常領域の一部は、約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26または30の連続アミノ酸残基である。さらに好ましい他の態様では、キメラタンパク質におけるTCR定常領域の一部は、免疫グロブリン折り畳みにおける最初のシステイン残基のアミノ末端側までのアミノ酸残基の幾つかまたはそのすべてを含有する。この例としては、Vβ−Cβ−IgGγ1およびVα−Cα−κ、またはVβ−Cβ−IgGγ1およびVα−Cα−λ、またはVα−Cα−IgGγ1およびVβ−Cβ−κまたはVα−Cα−IgGγ1およびVβ−Cβ−λが挙げられる。
【0024】
本発明はまた、組換えDNA技法および発現系を用いてキメラタンパク質を調製する方法を提供する。この方法は次の工程を含む:(a)T細胞媒介性病態を有する患者のT細胞由来の特定のTCRのVβまたはVα鎖をコードする遺伝子を単離し、(b)TCRのVβまたはVα鎖をコードする遺伝子および免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子を、キメラタンパク質を発現できる発現ベクターに挿入し、(c)得られた発現ベクターを昆虫細胞系統に挿入して発現させ、キメラタンパク質を産生させ、そして(d)得られたキメラタンパク質を単離する。キメラタンパク質の調製方法はさらに、TCRのVβまたはVα鎖のいずれかをコードする遺伝子および第2の免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入し、第2のキメラタンパク質を発現させる工程をさらに含む。TCRのVβまたはVα鎖をコードする単離した遺伝子はさらに、TCR定常領域における約30個以下の一部をさらに含むことができる。
【0025】
本発明はさらに、患者のT細胞媒介性病態を改変するための組成物を提供する。この組成物は、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を有する少なくとも1つのキメラタンパク質を含有する。他の好ましい態様では、キメラタンパク質は、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、そのTCR鎖の定常領域における約30アミノ酸残基以下の一部、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。さらに好ましい態様では、キメラタンパク質におけるTCR定常領域の一部は、約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26、または30個の連続アミノ酸残基である。さらに好ましい他の態様では、キメラタンパク質におけるTCR定常領域の一部は、定常領域の免疫グロブリン折り畳みにおける最初のシステイン残基のアミノ末端側までのアミノ酸残基の幾つかまたはそのすべてを含有する。キメラタンパク質の一部であるVβまたはVα鎖はT細胞媒介性病態を有する患者のT細胞由来の特定のTCRと関連している。このような組成物はさらに、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、および第2の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を有する第2のキメラタンパク質を含有する。他の好ましい態様では、キメラタンパク質は、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、リンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。さらに好ましい態様では、リンカー領域は約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26または30の連続アミノ酸残基であるTCR定常領域の一部を含むことができる。さらに好ましい他の態様では、キメラタンパク質におけるTCR定常領域の一部は、定常領域の免疫グロブリン折り畳みにおける最初のシステイン残基のアミノ末端側までのアミノ酸残基の幾つかまたはそのすべてを含有する。第2のキメラタンパク質の一部であるVβまたはVα鎖はT細胞媒介性病態を有する患者のT細胞由来の特定のTCRと関連している。
【0026】
本発明の1つの態様では、組成物は、全Vβ領域および免疫グロブリンIgGγ1のヒト定常領域を含む第1のキメラタンパク質(TCR Vβ−IgGγ1)、および全Vαおよびヒトκまたはλ定常領域を含む第2のキメラタンパク質(TCR Vα−κまたはTCR Vα−λ)の2つのキメラタンパク質を含む。他の好ましい態様では、キメラタンパク質のいずれかまたは両者は、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、リンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。さらに好ましい態様では、キメラタンパク質のいずれかまたは両者におけるリンカー領域は、約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26または30の連続アミノ酸残基であるTCR定常領域の一部を含むことができる。
【0027】
本発明の1つの態様では、組成物は、第1のキメラタンパク質が全Vβ領域、TCRβ鎖定常領域(Cβ)の30アミノ酸残基以下の一部および免疫グロブリンIgGγ1のヒト定常領域(TCR Vβ−IgGγ1)を含む (TCR VβCβ (1−30)−IgGγ1)、2つのキメラタンパク質を含有する。他の好ましい態様では、Cβの使用する一部は、約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26または30の連続アミノ酸残基である。第2のキメラタンパク質は、全Vα、TCRα鎖定常領域(Cα)の30アミノ酸残基以下の一部よびヒトκ定常領域を含有する(TCR VαCα (1−30)−κ)。好ましい態様では、Cαの使用する一部は、約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26または30の連続アミノ酸残基である。
【0028】
本発明の別の態様では、組成物は、患者のT細胞由来の特定のTCRのVβまたはVα鎖のいずれか、および免疫グロブリン定常領域を含有する単一のキメラタンパク質を含有する。この例としては、キメラタンパク質Vβ−IgGγ1、Vα−κ、またはVα−λ、またはVα−IgGγ1、Vβ−κ、またはVβ−λが挙げられる。他の好ましい態様では、キメラタンパク質は、TCRのVβまたはVα鎖の少なくとも一部、リンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。さらに好ましい態様では、キメラタンパク質におけるいずれかまたは両者のリンカー領域は、約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26、または30の連続アミノ酸残基であるTCR定常領域の一部を含有できる。
【0029】
本発明は1つの態様として、キメラタンパク質を発現するために使用される発現ベクターはバキュロウイルスベクターである。このベクターは、プロモーター、分泌シグナル配列およびキメラタンパク質をそれぞれ有する2つの発現カセットを含む。1つの発現カセットは、ミツバチメリチン分泌シグナル配列と連結しているバキュロウイルスAcNPVp10プロモーターを含む。他の発現カセットは、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌配列と連結しているポリヘドリンプロモーターを含む。このプロモーターおよびシグナル配列に加え、当業者に知られている他のプロモーターおよびシグナル配列をそれらに代替することができる。好ましい態様では、特定の患者由来の免疫グロブリン遺伝子に関連する内生分泌配列を使用する。TCRのVβまたはVα鎖、リンカー領域および免疫グロブリン定常領域の遺伝子を別個におよび/または一緒にバキュロウイルスベクターの上記発現カセットに挿入し、1つまたは2つのキメラタンパク質を発現させる。好ましい態様では、免疫グロブリン重鎖の定常領域、例えばIgG1をVβまたはVα鎖のいずれかとともにポリヘドリンプロモーターによって制御する。
【0030】
産生されたキメラタンパク質は抗−免疫グロブリンまたはIg結合タンパク質、例えば免疫グロブリン重鎖の定常領域に対するプロテインA、免疫グロブリンカッパ軽鎖の可変領域に対するプロテインL、および/または免疫グロブリン結合ドメインと結合する他のタンパク質などのアフィニティーカラムを用いて精製する。
【0031】
本発明はさらに、キメラタンパク質とキーホールリンペットヘモシニアン(KLH)などの担体タンパク質との共有結合も包含する。本発明の組成物はまた、顆粒球−マクロファージ−CSFなどのサイトカイン、または単球走化性タンパク質3(MCR3)などのケモカインとともに投与することができる。キメラタンパク質を含有する本発明の組成物は、T細胞媒介性病態を有する患者のT細胞由来の特定のTCRに特異的に関連しているため、この組成物を投与すれば、特定のVαまたはVβセグメントが関与しているイディオタイプ特異的疾患に対する免疫応答を誘導する。VαまたはVβセグメントなどのTCR V領域セグメントの拘束レパートリーを使用するT細胞が関与している自己免疫疾患に関連するT細胞に対する同様の応答がある。従って、本発明の組成物を投与すれば、患者のT細胞媒介性病態および/または自己免疫疾患が改変される。本発明組成物の投与経路には経口、吸入、注射、経皮的供給があるが、これらに限定されない。
【0032】
本明細書に引用するすべての米国特許および特許出願、外国特許および特許出願、科学雑誌、製本および刊行物は図面、数値および表を含みすべて、引用により本明細書に包含される。
【0033】
【好ましい態様の詳しい説明】
本発明では、免疫系のユニークな特異性をT細胞悪性腫瘍および病態の処置に適用する。本発明では、T細胞レセプターの可変領域をコードするはDNA配列を、ユニークなTCR V遺伝子ファミリーそれぞれの5’末端由来のプライマー、およびTCR定常領域プライマーを用いてクローニングした。典型的には、この方法では、PCRなどの幾つかの適当なクローニング手法の1つを利用する。α鎖およびβ鎖に対するTCR定常領域プライマーを使用して可変領域にクローニングし、VαまたはVβおよびIgGγ1定常領域からなるキメラタンパク質を調製した。さらに、当業者ならば、この系において同等に使用し同等の結果を得るための種々のプライマーを選択し、簡便なサブクローニングのための抗体可変領域の対を増幅できる。あるいは、キメラタンパク質を調製する工程として、5’RACEなどの手法を用い、TCR鎖の可変領域をクローニングできる。
【0034】
このキメラタンパク質はバキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞にて調製した。CαまたはCβの全ドメインをすべて含まないで調製されるキメラタンパク質は、α鎖およびβ鎖がすべて存在するキメラTCR/Ig分子から区別できる。例えば、これらのキメラタンパク質は、TCR可変領域に指向したコンホメーション特異的抗体、例えば抗−マウスVβ6(clone RR4−7)および抗−マウスVβ12(clone MR 11−1)(PharMingen, San Diego, Ca.)によって認識されない。これらのユニークなキメラタンパク質は、治療を複雑にしかねない正常な決定基が存在せず、自己免疫反応を刺激しないので、ワクチン療法の優れた抗原として期待される。さらに、可溶性TCRキメラタンパク質を調製するこれまでの試みは、適当なペプチド/MHC複合体に結合させるため、TCRの天然のコンホメーションに適合させたタンパク質を目的としていた。
【0035】
本発明は、T細胞媒介性病態および自己免疫疾患の有効な処置に対する大きな要求を満たすものである。本発明は、T細胞媒介性病態に関与するT細胞表面に存在するユニークな細胞表面抗原(イディオタイプ)をうまく利用するものである。そのためには、患者特異的にワクチンを調製する必要がある。このようなワクチンは特定患者に見出される病原性T細胞にユニークなマーカーに対して加工されることにより、優れて選択的である。
【0036】
本発明を特定の患者に対して加工するには、まず、ユニーク抗原を同定、単離し、次いでそのような抗原を調製する手段を探索する必要がある。抗原の調製は、当業者に利用可能な種々の多くの手法により行うことができる。例えば、最近開発された本発明の要求にかなう方法は、新規なバキュロウイルス/昆虫細胞発現系を利用し、これは最近、免疫療法のための機能的抗体を効率的に調製するために開発されたものである(see U.S. Provisional Application Serial No. 60/244,722, entitled ”Expression Vectors for Production of Recombinant Immunoglobulin”)。ヒトカッパ軽鎖またはIgG1重鎖を有するキメラタンパク質として簡便にサブクローニングし発現させるため、抗体可変領域の対を増幅するのに、2つの通常遺伝子特異的プライマーのみを必要とするようにバキュロウイルス発現ベクターを作製した。重鎖および軽鎖を分泌経路に置くための異種分泌シグナル配列を組込み、大量の活性免疫グロブリンを昆虫細胞から発現させた。このようなベクターは、ヒトカッパ定常領域とインフレームにありヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列を介して分泌されるカッパ軽鎖可変領域(VL)、およびミツバチメリチン分泌シグナル配列に先行されるヒトIgG1定常ドメインとインフレームにある重鎖可変領域(VH)を発現させるのに有用である。モノクローナル細胞系統由来のまたはファージディスプレイクローニングにより同定されるマウスまたはヒトモノクローナル抗体がこのベクターにおいて、2つの単純なサブクローニング工程を経て、全ヒトIgGl/κまたはIgGl/κとして簡便に発現できる。
【0037】
本発明では、融合Vα鎖、リンカーおよびIgG1重鎖として簡便にサブクローニングし発現させるため、TCR可変領域の対を増幅するのに、2つの通常遺伝子特異的プライマーのみを必要とするようにバキュロウイルス発現ベクターを作製した。VαおよびVβ鎖を分泌経路に置くための異種分泌シグナル配列を組込み、大量のキメラタンパク質を昆虫細胞から発現させる。このようなベクターは、Igカッパ定常領域とインフレームにありヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列を介して分泌されるTCRα鎖可変領域(Vα)、およびヒトIgG1定常領域とインフレームにありミツバチメリチン分泌シグナル配列を介して分泌されるTCRβ鎖可変領域(Vβ)(またはその逆)を発現させるのに有用である。
【0038】
バキュロウイルス系を使用する組換えタンパク質の発現により、細菌でのタンパク質作成に付随する多くの欠点を伴うことなく、さらに哺乳動物使用に伴う煩雑さを回避して、大規模な生物学的活性タンパク質が生産できる。例えば、市販されているバキュロウイルスシグナルプロモーターベクター(pVL1392)、または二次元プロモーターベクター(pAcUW51)(両者ともBD−Pharmingenから入手可能)を使用し、単量体β鎖またはヘテロ二量体αβ対として血清不含培地により分泌TCRラット鎖を調製した。これらの鎖の存在は、抗−Cβ定常領域捕獲抗体(R73, Pharmingen)および抗−Vβ検出抗体(R78; anti−rat Vβ8.2またはHIS 42; anti−rat Vβ16, Pharmingen)を用いるELISAにより、検出される。産生レベルは、およそ300ng/mlと測定された。TCR鎖を作成し、天然のコンホメーションにて分泌させ、αおよびβ鎖を安定なジスルフィド結合へテロ二量体として形成させた(Gold et al., 1997, supra)。
【0039】
特定のVセグメントの特異的エピトープを含む可溶性ヒトTCR断片は、昆虫宿主細胞において遺伝子操作により調製できる。患者由来の特定のVαおよび/またはVβ鎖を含むこのような可溶性組換えTCRタンパク質は治療用組成物に使用できる。患者に投与すれば、T細胞媒介性病態を改変するための細胞性免疫応答がインビボにおいて特異的に誘発されよう。
【0040】
この手法はさらに、B細胞リンパ腫から発現される患者特異的なVHおよびVL遺伝子の迅速な同定とクローニングに適用されており、次いでこれらを組換えIGl/κまたはλ分子として昆虫細胞において発現された(see U.S. Provisional Application Serial No. 60/224,723 entitled ”Method for Producing Idiotype−Vaccine”)。この方法により調製された分子は製剤化され、患者特異的にリンパ腫に対する抗−イディオタイプ細胞性免疫の誘発に使用された。
【0041】
「改変」または「改変する」なる用語は、本発明化合物におけるT細胞媒介性病態の調整能力を意味する。T細胞媒介性病態を改変する化合物は、化合物に対する抗体応答を惹起させてT細胞病態の細胞を破壊する;
T細胞病態の細胞のアポトーシスを誘発する;
T細胞病態の細胞に対する細胞性免疫を誘発してT細胞病態の細胞の発育や***をさらに阻害する;あるいは病原性T細胞の活性を阻害する、などの多くの可能性ある機序によりそのように機能する。改変を起こす正確な機序は決定する必要はないが、T細胞媒介性病態の改変は本発明の分子または組成物を投与することによる何らかの機序により起こるのは確かである。
【0042】
「T細胞媒介性病態」または「T細胞病態」なる用語は、T細胞の不適切な複製または活性により引き起こされる疾患および状態を意味する。好ましい態様では、本発明は、T細胞の不適切な複製によって引き起こされるT細胞リンパ腫であるT細胞媒介性病態の処置に使用される。T細胞リンパ腫は現在利用可能な治療法では有効に処置するのが困難である。T細胞の不適切な複製が関与する他のタイプのT細胞病態には慢性および急性のT細胞白血病および菌状息肉腫が挙げられる。他の好ましい態様では、慢性関節リウマチ(RA)、重症筋無力症(MG)、多発性硬化症(MS)、全身性エリテマトーデス(SLE)、自己免疫性甲状腺炎(橋本病)、グレーブス病(Graves’ disease)、炎症性大腸疾患、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎、および特定の糖尿病などの、宿主自身の免疫系が宿主自身の組織を攻撃する自己免疫疾患として分類される、増加途上の多くのヒト疾患が挙げられる。これら自己免疫疾患を処置する現在の処置方法は疾患を治癒するのでなく、症状を処置するのみである。
【0043】
「T細胞」なる用語は、生物の正常機能における細胞性免疫に関与する、生物の免疫系細胞(即ち、T細胞媒介性病態を経験していないもの)を意味する。
【0044】
「病態」なる用語は、多くの医学領域により異常と認識されている生物(例えばヒト)の状態を意味する。本発明により処置される病態はT細胞の機能または複製の異常を特徴とする。
【0045】
「患者」なる用語は、病態、より具体的にはT細胞病態の処置を必要とする生物を意味する。この用語は、臨床の場において治療物質による処置が必要であると示唆される特定の症状(群)を示す生体を意味する。処置は医学領域において一般に許容されている、または経験されるもののいずれであってもよい。好ましい態様では、患者は、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラットおよびマウスなどの哺乳動物である。さらに好ましい態様では、患者はヒトである。患者の診断は疾患の進行により自発的に、または治療方法や処置の経過とともに変化することがある。
【0046】
「生物」なる用語は単細胞または多細胞であり得る。この用語は、哺乳動物、最も好ましくはヒトを含む。好ましい生物はマウスであり、それは、マウスでの処置または診断の能力がヒトなどの他の生物における機能性を予測させることが多いからである。他の好ましい生物は霊長類であり、それは、霊長類での処置または診断の能力がヒトなどの他の生物における機能性を予測させることが多いからである。
【0047】
「キメラタンパク質」なる用語は、異なる少なくとも2つのタンパク質由来のセグメントを含む単一のポリペプチド鎖を含むタンパク質を意味する。キメラタンパク質のセグメントは異種タンパク質から誘導されなければならず、即ち、キメラポリペプチドのすべてのセグメントが同じタンパク質由来ではない。本発明のキメラタンパク質は、TCRのαまたはβ鎖の一部を含有するが、αまたはβ鎖いずれかの全定常領域を含まない。
【0048】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ペプチド」なる用語は本明細書では交換可能に使用している。
【0049】
「セグメント」または「一部」なる用語は、誘導元の全長ポリペプチドよりも長さが短いキメラタンパク質の供給源として使用されるタンパク質のアミノ酸配列から誘導されるポリペプチドを示す用語として使用している。好ましい態様では、セグメントは少なくとも約10、15、20、21、22、30、40、70、100、150、300、または450アミノ酸長である。このようなセグメントは天然ポリペプチドの1つまたはそれ以上の特性を保持できると考えられる。このような保持される特性の例としては、天然ポリペプチドまたはそのエピトープに特異的な抗体との結合性である。
【0050】
「天然に」または「天然」なる用語は、天然から単離されているタンパク質を意味する。従って、天然に存在するタンパク質とは、それが天然にて見出される形態のタンパク質を意味すると定義できる。天然タンパク質は天然に見出されまたは合成されていてもよいタンパク質と定義できる。また、この用語は、本発明のバキュロウイルス系または親試料の細胞培養によるなどの生物系により産生されるタンパク質にも適用できる。天然タンパク質は変性されていない単離されたタンパク質とも定義できる。「天然」なる用語はまた、ポリペプチドまたはタンパク質が単独でまたは他のポリペプチドとともに折り畳まれ、天然に見出される同様のタンパク質に類似する態様、あるいは翻訳後に修飾(翻訳後修飾)され、天然に見出される同様のタンパク質と類似する態様をも意味する。天然に存在するタンパク質が存在するのは、単一の患者由来の病原性T細胞においてのみであるが、いずれにせよ、これは天然に存在するタンパク質と考えられる。
【0051】
「Vα」および「Vβ」なる用語は、TCRのポリペプチド鎖の可変領域またはそのポリペプチド鎖をコードする核酸を意味する。当業者であれば、これらの用語の意味を理解するものである。可変領域の正確な配列は予測できず、問題の配列を単離することにより決定しなければならない。しかし、TCR遺伝子由来の可変領域の多重サブファミリーが同定され特徴付けされている(See reviews by Arden et al., Immunogenetics, 1995, 42:455−500, Arden et al., Immunogenetics, 1995, 42:501−530, およびClark et al., Immunogenetics, 1995, 42:531−540)。これらVαおよびVβ領域のいずれかを本発明にて使用できる。α鎖の正確な配列はTCRα鎖座のV領域、J領域およびTCRα鎖座の定常領域のクローン的再構成により決定される。β鎖の正確な配列はTCRβ鎖座のV領域、D領域、J領域および定常領域のクローン的再構成により決定される。「Vα」および「Vβ」なる用語はVαまたはVβ鎖の一部またはセグメントをも意味する。VαまたはVβ鎖のセグメントはV領域の少なくとも30アミノ酸を含む。VαまたはVβ鎖のセグメントはV領域のすべてまたは実質的にすべてを含むこともできる。「実質的にすべて」なる用語は可変領域全体の約90%または可変領域全体の約80%を意味することができる。「Vα」および「Vβ」なる用語はまた、上記のポリペプチド鎖の機能的誘導体をも意味する。「全Vα鎖(またはVα鎖全体)」とはα鎖の可変領域のすべてを意味する。「全Vβ鎖(またはVβ鎖全体)」とはβ鎖の可変領域のすべてを意味する。
【0052】
「リンカー領域」または「リンカー」なる用語は可変領域をコードする配列を免疫グロブリン定常領域分子の一部をコードする配列と連結するDNAセグメントを意味する。リンカー配列は通常のクローニングを可能にする合成配列であってよく、またはTCRのCαまたはCβの一部であってよい。いずれの場合でも、キメラタンパク質においてリンカー領域は可変領域の一部と免疫グロブリン定常領域の一部との間のインフレームを妨害しない。「リンカー領域」なる用語はリンカー領域DNA配列がコードするアミノ酸をも含む。「合成リンカー領域」または「合成リンカー」なる用語はT細胞レセプター遺伝子または免疫グロブリン遺伝子以外の供給源から得られるリンカー領域を意味する。好ましい態様では、合成リンカーは研究者によって開発され、インビトロにおいて合成される。合成リンカーはキメラタンパク質におけるT細胞レセプターと免疫グロブリン遺伝子部分との解読枠を破壊しない配列を含む。リンカー領域がTCRのCαまたはCβの一部を含む場合、定常領域の始めと免疫グロブリン折り畳みの最初のシステイン残基との間のアミノ酸の幾つかまたはそのすべてを含むことができる。
【0053】
「Cα」および「Cβ」なる用語は、TCRのポリペプチド鎖の定常領域、またはそのポリペプチド鎖をコードする核酸を意味する。当業者であれば、これらの用語の意味を理解するものである。本発明において定常領域に言及する場合における「セグメント」または「一部」なる用語は、TCRの定常領域のすべてを含むとは限らず、約3、4、5、6、7、8、9、10、14、18、22、26、または30の連続アミノ酸残基を含むことができる。1から約30(両端を含む)の整数を含むあらゆる整数個のコドンがリンカー領域に存在できる。別の態様では、TCRの定常領域アミノ酸の約80%までが存在できる。このセグメントは、免疫グロブリン折り畳みの最初のシステインまでの最初の22個のCα鎖のすべてまたはその一部を含むことができる。記した免疫グロブリン折り畳みの最初のシステインを有するヒトTCRα鎖の代表的配列を図8に示す。このセグメントは、免疫グロブリン折り畳みの最初のシステインまでの最初の30個のCβ鎖のすべてまたはその一部を含むことができる。記した免疫グロブリン折り畳みの最初のシステインを有するヒトTCRβ鎖の代表的配列を図8に示す。「Cα」および「Cβ」なる用語は上記のポリペプチド鎖の機能的誘導体をも意味する。
【0054】
「TCR」または「T細胞レセプター」なる用語は、2つのポリペプチド鎖、およびα鎖およびβ鎖を含むT細胞表面に見出されるポリペプチドを意味する。「TCR」または「T細胞レセプター」なる用語はまた、このポリペプチド鎖をコードする核酸をも意味する。Bell et al. (Bell et al., 1995, T Cell Receptors, Oxford University Press, Oxford)に記載されているように、免疫系の正常な発達により、TCRはDNA再構成の作用に由来して膨大な配列の多様性を示す。特定のTCRの正確な配列は予測できず、問題のTCRをコードするする核酸またはその一部を配列決定することにより決定しなければならない。TCRの可能性ある配列は本発明に使用できる。
【0055】
「免疫グロブリン定常領域」なる用語は、免疫グロブリンの可変領域によりコードされていない免疫グロブリン分子部分のすべてまたはその一部を意味する。「免疫グロブリン定常領域」なる用語はまた、免疫グロブリン定常領域をコードするDNA配列をも意味することができる。免疫グロブリン定常領域にはCL、CH1、CH2、CH3セグメント、およびヒンジ領域が含まれる。免疫グロブリンタイプには、
IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE重鎖、およびκまたはλ軽鎖またはそのセグメントが含まれる。好ましい態様では、重鎖および軽鎖定常領域は9F12細胞から誘導される。免疫グロブリン定常領域セグメントは、それが例えばプロテインG、プロテインA、プロテインLまたは適当な抗体を介してキメラ分子を精製できる限り、あらゆるものを本発明に使用できる。上記の免疫グロブリン定常領域セグメントの機能的誘導体も使用できる。
【0056】
「免疫グロブリン折り畳み」または「免疫グロブリンドメイン」なる用語は、免疫グロブリンスーパーファミリーの構造要素を意味する。免疫グロブリンドメインは各々が、約110個のアミノ酸の保存された反復構造ドメインである。各ドメインでは、一般に4または3個のストランドの2つから整列されている7個の逆平行βストランド、および約60個のアミノ酸のループを形成する鎖内ジスルフィド結合がある。2つのシートは一般に互いに向かい合い、疎水性アミノ酸が内部に、親水性アミノ酸が外部に向かう。
【0057】
免疫グロブリンドメインは抗体、T細胞抗原レセプター、サイトカインレセプター(例えば5Igドメインを有する血小板誘導化成長因子レセプター)、細胞接着分子(例えばICAM−1/CD54)などの多くのタンパク質分子に見出される。2つの免疫グロブリンドメインがTCRの各鎖に見出され、1つは可変領域に、1つは定常領域内にである。2つの免疫グロブリンドメインが抗体軽鎖に見出され、4つがIgG重鎖に見出される。
【0058】
「カッパ定常領域」、「ラムダ定常領域」、「κ定常領域」および「λ定常領域」なる用語は、免疫系の発達過程で保存されてきたカッパ(κ)およびラムダ(λ)軽鎖の定常領域を意味する。これらの用語は、タンパク質のアミノ酸配列またはDNA配列のいずれかを意味できる。ある場合には、免疫グロブリン軽鎖は1つまたはそれ以上の他のタンパク質由来のアミノ酸を含むキメラタンパク質に含まれていても良い。
【0059】
「IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE」なる用語は、免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスを意味する。これらの用語は、タンパク質のDNA配列またはアミノ酸配列を意味できる。免疫グロブリン分子のクラスおよびサブクラスは重鎖によって決定される。例えば、IgGおよびIgDは免疫グロブリンの異なるクラスであり、IgG1およびIgG2は免疫グロブリン分子の異なるサブクラスである。「IgA」なる用語はIgA分子のあらゆるサブクラスを意味できる。好ましい態様では、これはIgA1分子を意味する。別の好ましい態様では、これはIgA2分子を意味する。ある態様では、使用される免疫グロブリン重鎖第2のタンパク質由来のアミノ酸を含むキメラタンパク質であってもよい。
【0060】
「IgGγ 1」なる用語は免疫グロブリンのIgG1クラスと関連する重鎖を意味する。IgG1は、ヒトIG免疫グロブリンの約66%を代表する(Roitt et al., Immunology, Mosby, St. Louis, 1993, pg.4.2)。
【0061】
「投与」なる用語は、化合物を生物の細胞または組織とまたはその内部に接触させる方法に関連する。T細胞媒介性病態は、生物の細胞または組織が生物の内部または生物の外部に存在すると予防または処置できる。生物の外部に存在する細胞は細胞培養皿にて維持または生育できる。生物の内部に保持される細胞では、経口、腸管外、経皮、注射および吸入など(これらに限定されない)の化合物を投与するための多くの手法が当業者に知られている。化合物投与の生物機能に対する効果を次いでモニターすればよい。生物は好ましくはマウス、ラット、ウサギ、モルモットまたはヤギであり、より好ましくはサルまたは霊長類、最も好ましくはヒトである。
【0062】
「組成物」なる用語は、目的のタンパク質を含む混合物を意味する。好ましい態様では、組成物は添加剤、安定化剤、賦形剤などの付加的な成分を含むことができる。
【0063】
T細胞クローンとの関連において可変領域に対して使用される「関連する」なる用語は、特定のT細胞クローンによって産生される免疫グロブリンに見出される可変領域を意味する。
【0064】
「T細胞クローン」なる用語は単一のT細胞のクローン的子孫を意味する。T細胞のクローン的子孫は産生されるTCRにおいて親細胞と同じイディオタイプを発現する。当業者であれば、T細胞のクローン的子孫はTCR遺伝子内に体細胞性変異を受けることがあるが、T細胞クローンの部分は依然保持していることを理解できる。
【0065】
「単離」なる用語は、天然に存在する核酸配列をその通常の細胞環境から取り出すことを意味する。従って、核酸配列は細胞不含溶液中に、または別の細胞環境に置かれているといえる。この用語は、配列がヌクレオチド鎖のみで存在することを意味せず、それに通常付随する非ヌクレオチド物質が実質的に含まれていない(少なくとも約90−95%純度)ことを意味しており、従ってこれは単離された染色体と区別される。さらに、核酸に関連して使用する「単離」なる用語は、目的の溶液に存在する全DNAまたはRNAの画分における特定のDNAまたはRNA配列が、その配列が取り出された細胞内よりも有意に高く増大(2−5倍)していることを意味する。これは、他の存在するDNAまたはRNAの量を優先的に減少させること、または特異的DNAまたはRNA配列の量を優先的に増大させること、またはそれらを組合わせることにより行うことができる。しかし、増大させることは、他のDNAまたはRNA配列が存在しないことを意味せず、目的の配列の量が相対的に有意に増大していることを意味する点に留意しなければならない。「有意」なる用語は、増大レベルが増大させる者にとって有用であることを示すために使用され、一般に他の核酸と比較して、少なくとも約2倍、より好ましくは少なくとも5−10倍またはそれ以上の増大を意味する。この用語はさらに、他の供給源由来のDNAまたはRNAが存在しないことを意味しない。他の供給源由来のDNAとは例えば、酵母または細菌ゲノム由来のDNA、またはpUC19などのクローニングベクターなどである。この用語は、1つのmRNAレベルが他の種のmRNAと比較して自然に増大し得るウイルス感染または腫瘍型増殖を区別する。即ち、この用語は、所望の核酸の比率を高める場合のみを網羅する意味である。
【0066】
単離されたDNA配列は天然環境におけるよりも比較的純度が高い(天然レベルと比較し、そのレベルは例えばmg/ml単位にて少なくとも2−5倍高い)。PCRによって得られる個々の配列は電気泳動的な均一にまで精製できる。PCR反応によって得られるDNA分子は全DNAまたは全RNAから得ることができる。これらのDNA配列は天然に存在していないが、好ましくは部分的に精製された天然に存在する物質(例えばメッセンジャーRNA(mRNA))を操作することにより得られる。例えば、mRNAからcDNAを構築するには、合成物質(cDNA)を作成し、cDNAライブラリーを含む細胞からのクローン選択により合成ライブラリーから個々の精製cDNAを単離すればよい。mRNAからのcDNA構築および別個のcDNAクローンの単離を含むこの方法は、天然メッセージの約106倍の純度を与える。従って、少なくとも1桁、好ましくは2または3桁、さらに好ましくは4または5桁の純度が明示的に理解される。
【0067】
「をコードする遺伝子」なる用語は、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸の配列を意味する。核酸配列はDNAまたはRNAのいずれの分子であってもよい。好ましい態様では、この分子はDNA分子である。他の好ましい態様では、分子はRNA分子である。RNA分子と存在する場合、翻訳を開始させるよう宿主細胞のリボゾームを駆動する配列(例えば開始コドンATG)および翻訳を終止させるようリボゾームを駆動する配列(例えば終止コドン)を含む。開始コドンと終止コドンとの間には解読枠(ORE)がある。当業者は、これらの意味に精通している。
【0068】
「昆虫細胞系統」なる用語は、バキュロウイルスによって感染される昆虫由来の細胞系統を意味する。当業者はこのような細胞系統およびその利用に必要な技術に精通している。代表的な昆虫細胞系統の例は、Spodoptera frugiperda (sf9) および Trichoplusia ni(Hi−5)細胞系統である。
【0069】
「Trichoplusia ni(Hi−5)およびSpodoptera frugiperda (sf9)細胞」なる用語は、バキュロウイルス発現ベクターとともに使用される昆虫細胞系統である。当業者はこのような細胞系統およびその入手方法に精通している。
【0070】
「アジュバント」なる用語は、選択した抗原または免疫原に対する動物における免疫応答を惹起させる場合に、選択した抗原または免疫原、例えば免疫応答を望むタンパク質またはポリペプチドとともに供給される、免疫応答を増大させるための物質である。当業者は選択および使用に適したアジュバントに精通している。ヒト使用が許可されているアジュバントにはアルミニウム塩およびMF59 (Singh and O’Hagan, Nature Biotech 17:1075−81, 1999)がある。他のアジュバントも開発されており(前掲)、それらも本発明に使用できる。
【0071】
「キーホールリンペットヘモシニアン」なる用語は、免疫反応において担体タンパク質として普通に使用されているカサガイ(Keyhole limpets)から単離されたタンパク質を意味する。当業者はキーホールリンペットヘモシニアンなる用語の意味に精通している。
【0072】
「サイトカイン」なる用語は、主としてリンパ球から分泌される、普通は可溶性の(糖)タンパク質、成長因子ファミリーを意味する。サイトカインは体液性および細胞性免疫応答、および貪食細胞の活性化の両者を刺激する。サイトカインは、免疫系の種々の細胞型(リンホカイン、インターロイキン、モノカイン、腫瘍壊死因子、インターフェロン)のみならず、血液学の分野で研究されている他の細胞(コロニー刺激因子を産生)、腫瘍学(トランスホーミング成長因子を産生)および細胞生物学の分野の細胞(ペプチド成長因子、熱ショックおよび他のストレスタンパク質を産生)から合成され、保存され輸送される。
【0073】
リンパ球から分泌されるサイトカインはリンホカインと呼ばれ、単球またはマクロファージから分泌されるものはモノカインと呼ばれる。多くのリンホカインは白血球から分泌されるのみならず、白血球の細胞応答に影響を与え得るため、インターロイキン(ILs)とも呼ばれる。具体的には、インターロイキンは造血器官の細胞を標的とする成長因子として機能する。
【0074】
「成長因子」なる用語は、細胞表面のレセプターと結合した後、細胞増殖および/または分化を活性化するタンパク質を意味する。多くの成長因子は用途が極めて広く、種々の細胞型の細胞分化を刺激するように機能できるが、他のものは特定の細胞型に特異的である。
【0075】
「ケモカイン」なる用語は、白血球の化学遊走物質および活性化物質として機能する炎症前の小さなサイトカインの一群であり、30個以上の化学遊走性サイトカインのスーパーファミリーである。ケモカインは、血液または骨髄由来の免疫系細胞を活性化し、それらを感染および障害組織へと移動させることを調和させる。ケモカインはまた、骨髄に見出される原始的幹細胞を成長および増殖する本質的な役割を果たし、それは成熟免疫細胞へと成長させる。ケモカインは広範な急性および炎症性疾患に関与し、7回膜貫通へリックスクラスのレセプターと結合することによりその作用を主として発揮する。
【0076】
ケモカインは分子量8 から 11 kDaであることが多く、1 から 100 ng/mlの濃度で活性であり、広範な細胞型から産生される。ケモカインの産生は、外因性の刺激物質および内生伝達物質、例えばIL−1、TNF−αおよびPDGFによって誘導される。ケモカインは特異的細胞表面レセプターに結合し、他のサイトカインの強力な誘導物質でなく、炎症および修復において比較的特殊な機能を果たすのみであるので、一次炎症前サイトカインよりも多面性が明らかに低い二次サイトカインと考えられる。
【0077】
「顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子」または「GM−CSF」なる用語は、小さな(20 kDaより小さい)分泌型タンパク質を意味する。これは特異的細胞表面レセプターに結合し、骨髄細胞の種特異的刺激物質として機能する。これは、樹状細胞、顆粒球、マクロファージ、好酸球および赤血球などの幾つかの造血細胞系譜の成長および分化を刺激する。具体的には、このサイトカインはT細胞増殖を増大させ (Santoli et al,J.Immunol,1988, 141(2):519−26)、顆粒球および単球における接着分子の発現を増大させ(Young et al., J.Immunol, 1990, 145(2):607−15; Grabstein et al., Science, 1986, 232(4749):506−08)、および抗原提示能を増大させ(Morrissey et al., J.Immunol,1987,139(4):1113−9; Heufler et al., J.Exp.Med., 1988, 167(2):700−05; Smith et al., J.Immunol, 1990, 144(5):1777−82)、細胞性免疫を形成する役割も果たす。
【0078】
「単球走化性タンパク質3」または「MCR3」なる用語は、単球から主として産生されるケモカインを意味する。MCR−3は広範なスペクトラムの化学遊走活性を有し、単球、樹状細胞、リンパ球、ナチュラルキラー細胞、好酸球、好塩基球、および好中球を引き付ける。このcDNAは1993年にMinty et al., Eur Cytokine Netw 4(2):99−110, 1993, and Opdenakker et al., Biochem Biophys Res Commun., 191(2):535−42, 1993によってクローニングされた。その性質は最近、Proost et al., J Leukoc Biol. 59(1):67−74, 1996によって綜説されている。
【0079】
「発現ベクター」なる用語は、選択した目的遺伝子、通常はタンパク質が適切に挿入された場合、発現するよう作製されている組換えDNA構築物を意味する。当業者はこの用語を理解する。発現ベクターは普通、目的遺伝子を挿入する部位の5’末端にプロモーター、およびその部位の3’末端にターミネーター領域を含む。目的遺伝子は制限酵素切断部位を選択して適当な部位に挿入することが多い。「発現ベクター」なる用語は、目的産物をコードする目的遺伝子がすでに挿入されている上記のDNA構築物をも意味する。
【0080】
「バキュロウイルス発現ベクター」なる用語は、選択した遺伝子がバキュロウイルス系に挿入された場合、発現するよう作製されているDNA構築物を意味する。本発明では、バキュロウイルス系で機能するよう作製された可能性あるバキュロウイルスまたは発現ベクターはあらゆるものを使用できる。同様に、「発現ベクター」なる用語は、バキュロウイルス発現ベクターの特定の態様を包含する用語であるが、「発現ベクター」は昆虫細胞系統だけではなく、それに加えて細胞および細胞系統において機能できる。
【0081】
「発現できる(発現させる)」なる用語は、発現ベクターを、目的遺伝子が発現される環境に置くことを意味する。これは通常、プロモーターおよび他の遺伝子発現に必須の領域が宿主細胞成分によって認識され目的遺伝子を発現させる適当な細胞型に発現ベクターを挿入する意味である。発現は普通、転写および翻訳の2つの工程からなる。発現はまた、細胞由来の成分を用いてインビトロにて行うこともできる。当業者はそのような手法、およびSambrook et al. (Sambrook, Fritsch, & Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)に記載されている技法に精通している。好ましい態様では、発現産物はタンパク質またはポリペプチドである。他の好ましい態様では、発現産物はVβ/IgGγ1、Vβ/Cκ、Vβ/Cλ、Vα/Cκ、Vα/Cλ、またはVα/IgGγ1である。
【0082】
「分泌シグナル配列」なる用語は、ペプチド配列を意味する。この配列が選択したポリペプチドのアミノ末端に結合したペプチドとしてインフレームにて翻訳されると、分泌シグナル配列は宿主細胞の機構と相互作用し選択ポリペプチドを分泌させる。分泌過程の部分では、この分泌シグナル配列は切断除去され、輸送後には目的のポリペプチドのみを残す。好ましい態様では、ミツバチメリチン分泌シグナル配列を使用する。別の好ましい態様では、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列を使用する。さらに好ましい態様では、特定の患者から誘導される免疫グロブリン遺伝子に付随する内生分泌配列を使用する。しかし、本発明はこれら分泌シグナル配列によって限定されず、当業者に周知の他の配列をこれらの代わりに、または付加的に使用できる。「分泌シグナル配列」なる用語はさらに、分泌ペプチドをコードする核酸配列をも意味する。
【0083】
「ELISA」なる用語は、タンパク質の存在または濃度をELISA平板のプラスチックウエルとの結合性によって測定し、次いで定量または検出するタンパク質に特異的な抗体により検出を行う、「酵素結合免疫吸着アッセイ」を意味する。
【0084】
「プロモーター制御」なる用語は、プロモーターが目的遺伝子の5’側に配置され、DNA配列をmRNA分子に転写させる、発現ベクターにおけるDNAの配列を意味する。mRNA分子は次いで、宿主細胞の機構により翻訳される。当業者のこの用語に非常に精通している。
【0085】
「プロテインA」、「プロテインG」、および「プロテインL」なる用語は、抗原結合部位と相互作用することなく、免疫グロブリン分子と特異的に結合できる特異的細菌タンパク質である。プロテインAは免疫グロブリン分子のFc領域と結合するStaphylococcus aureusから単離されるポリペプチドである。プロテインGは免疫グロブリンG(IgG)に対する親和性を有する細菌細胞壁タンパク質であり、ヒト連鎖球菌株G(G148)から単離された。プロテインLは嫌気性細菌Peptostreptococcus magnusのある種の株から発現される免疫グロブリン軽鎖結合タンパク質である。
【0086】
タンパク質またはポリペプチドに関して「単離」なる用語は、天然に存在するポリペプチドまたはタンパク質をその正常な細胞環境から取り出すこと、または発現系(本明細書に記載のバキュロウイルス系)において合成されたポリペプチドまたはタンパク質を他の発現系成分から取り出すこと、を意味する。従って、この配列は細胞不含溶液中に、または別の細胞環境に置かれているといえる。この用語は、配列がアミノ酸鎖のみで存在することを意味せず、それに天然にて付随する非アミノ酸基本物質が実質的に含まれていない(少なくとも約90−95%純度)ことを意味している。
【0087】
ポリペプチドに関連して「増大」なる用語は、特定のアミノ酸配列が正常または疾患細胞またはその配列が取り出された細胞内よりも、目的の溶液または細胞に存在する全アミノ酸配列が有意に高い(2−5倍)画分を意味する。これは、他の存在するアミノ酸配列の量を優先的に減少させること、または特異的アミノ酸配列の量を優先的に増大させること、またはそれらを組合わせることにより行うことができる。しかし、増大させることは、他のアミノ酸配列が存在しないことを意味せず、目的の配列の量が相対的に有意に増大していることを意味する点に留意しなければならない。ここでの「有意」なる用語は、増大レベルが増大させる者にとって有用であることを示すために使用され、一般に他のアミノ酸と比較して、少なくとも約2倍、より好ましくは少なくとも5−10倍またはそれ以上の増大を意味する。この用語はさらに、他の供給源由来のアミノ酸配列が存在しないことを意味しない。他の供給源のアミノ酸とは例えば、酵母または細菌ゲノムまたはpUC19などのクローニングベクターによってコードされるアミノ酸などである。好ましい態様では、アミノ酸配列は上記のキメラタンパク質である。この用語は、所望のアミノ酸配列の比率を高める場合のみを網羅する意味である。
【0088】
アミノ酸配列は精製形態であることがある種の目的にとって有益である。ポリペプチドに関連して「精製」なる用語は、絶対的純度(均一調製物のような)を要せず、配列が天然環境よりも純粋であることを示すものである。天然のレベルに比較し、このレベルは(例えばmg/ml単位にて)少なくとも2−5倍高い。精製は、少なくとも1桁、好ましくは2または3桁、さらに好ましくは4または5桁であることが明示的に理解される。好ましくは、物質は、機能的に有意なレベル、例えば90%、90−95 %純度で混入が無いものである。
【0089】
「作動可能に連結」なる用語は、プロモーターまたはエンハンサーなどの制御領域が目的の連結DNAに結合されてその転写、そしてその翻訳を起こす、DNAの配列操作を意味する。「作動可能に連結」なる用語はさらに、分泌シグナル配列などのプロセッシングシグナルをコードするDNA配列をポリペプチドをコードする遺伝子と連結させ、単一の解読枠を形成させることをも意味する。転写および翻訳の後、分泌シグナル配列は翻訳ポリペプチドを外部輸送させることができる。当業者はこの用語の意味に精通している。
【0090】
有用なキメラタンパク質の機能的誘導体
本発明はさらに、本発明のポリペプチドまたは核酸の機能的誘導体をも提供する。「機能的誘導体」とは、本発明のポリペプチドまたは核酸の「化学的誘導体」、「断片」または「変異体」を意味し、これらの用語は以下に詳述する。機能的誘導体はタンパク質の機能の少なくとも一部、例えばタンパク質に特異的な抗体との反応性、非触媒ドメインを介する酵素活性または結合活性を保持しており、これらは本発明の機能的誘導体の有用性を保証する。当業者には、遺伝子コードの縮重により、多くの異なる核酸配列が同じアミノ酸配列をコードできることが周知である。同様に、アミノ酸の保存的変化により、元の機能が保持されているタンパク質またはポリペプチドが得られることも周知である。両者ともに、すべての順列が本明細書に包含されるものである。
【0091】
本発明には、本明細書に記載の単離された核酸分子の機能的等価物が包含される。遺伝子コードの縮重により、特定のコドンは同一アミノ酸を特定し同じタンパク質を与える他のコドンに置換できる。メチオニンおよびトリプトファンを除き、既知のアミノ酸は1つ以上のコドンによってコードされ得るので、核酸配列は実質的に変動し得る。従って、本発明の遺伝子の一部またはすべては、天然に見出される配列と有意に異なる核酸配列として合成することができる。しかし、コードされるそのアミノ酸配列は保存されている。
【0092】
複合体の「化学的誘導体」は、通常はタンパク質の部分ではない付加的な化学部分を含む。タンパク質またはペプチドの共有結合修飾が本発明の範囲に含まれる。以下に説明するように、このような修飾は、選択した側鎖または末端残基と反応できる有機誘導化試薬とペプチドの標的アミノ酸残基を反応させることにより、分子に導入できる。
【0093】
最も普通には、システイン残基をクロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα−ハロアセテート(および対応するアミン)と反応させ、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイン残基はさらに、ブロモトリフルオロアセトン、クロロアセチルホスフェート、N−アルキルマレイミド、3−ニトロ−2−ピリジルジスルフィド、メチル 2−ピリジルジスルフィド、p−クロロメルクリベンゾエート、2−クロロメルクリ−4−ニトロフェノールまたはクロロ−7−ニトロベンゾ−2−オキサ−1,3−ジアゾールと反応させることにより誘導化される。
【0094】
ヒスチジル残基は、pH 5.5−7.0においてジエチルプロカルボネートと反応させることにより、その試薬は比較的ヒスチジン側鎖に特異的であるので、誘導化される。パラブロモフェナシルブロミドも有用である。この反応は好ましくは、pH 6.0において0.1M ナトリウム・カコヂレート中にて行う。
【0095】
リジンアミノ酸末端残基はクエン酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの試薬との誘導化により、リジン残基の効果またはその電荷が保存される。1級アミンを含有する残基を誘導化するための他の適当な試薬は、メチルピコリンイミデート、プリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロハイドライド(水素化クロロホウ素)、トリニトロベンゼンスルホン酸、O−メチルイソ尿素、2,4−ペンタンジオン、およびグリオキシレートによるトランスアミナーゼ触媒反応などである。
【0096】
アルギニル残基は1つまたは幾つかの通常の試薬、例えばフェニルグリオキサール、2,3−ブタンジオン、1,2−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンの中から選ばれるものとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導化には、グアニジン官能基の高いpKa故に、アルカリ条件において反応を行う必要がある。さらに、これらの試薬はリジンの基およびアルギニンα−アミノ基と反応できる。
【0097】
チロシル残基は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応による分光学的標識を導入する修飾のための周知の標的である。最も普通には、N−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを使用し、O−アセチルチロシル種および3−ニトロ誘導体をそれぞれ調製する。
【0098】
カルボキシ側鎖基(アスパラギン酸またはグルタミン酸)は、1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリニル(4−エチル)カルボジイミドまたは1−エチル−3−(4−アゾニア−4,4−ジメチルペンチル)カルボジイミドなどのカルボジイミド(R’−N−C−N−R’)との反応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【0099】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は脱アミド化されて対応するグルタミルおよびアスパルチル残基になることが多い。あるいは、これらの基は温和な酸性条件下、脱アミド化される。これら残基のいずれの形態も本発明の範囲に包含される。
【0100】
二機能性試薬での誘導化は、例えば水不溶性支持マトリックスまたは他の高分子担体との複合体において、タンパク質のペプチド成分を互いに、または他のタンパク質と架橋させ際に有用である。通常使用される架橋剤は、例えば、1,1−ビス(ジアゾアセチル)−2−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二機能性イミドエステル、例えば3,3’−ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)などのジスクシンイミジルエステル、およびビス−N−マレイミド−1,8−オクタンなどの二機能性マレイミドなどである。メチル−3−[p−アジドフェニル]ジチオールプロピオイミデートなどの誘導化剤は、光の存在下に架橋を形成できる光活性化中間体を与える。あるいは、シアノゲンブロミド活性化炭水化物および反応性基質などの反応性水不溶性材料はU.S. Patent Nos. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537;および4,330,440に記載され、これらはタンパク質固定化に使用される。
【0101】
他の修飾にはプロリンおよびリジンのヒドロキシ化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシ基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化 (Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79−86 (1983))、N−末端アミノのアシル化などがあり、ある場合には、C−末端カルボキシ基のアミド化もある。
【0102】
このような誘導化部分は安定性、溶解性、吸収性、生物学的半減期などを改善できる。これらの部分はまた、タンパク質複合体の望ましくない副作用を排除しまたは減じることができる。このような効果を媒介できる部分は例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)に記載されている。
【0103】
アミノ酸残基が欠失、挿入および/または置換されたタンパク質の機能的誘導体は、当業者に周知の標準的手法により調製できる。例えば、機能的誘導体の修飾された成分は、部位特異的突然変異手法(Adelman et al., 1983, DNA 2:183に例示)によって調製でき、ここでは配列をコードするDNAのヌクレオチドを修飾し、修飾コード配列を修飾し、次いで既述の手法により原核生物または真核生物宿主細胞において得られた組換えDNAを発現させる。あるいは、アミノ酸の欠失、挿入および/または置換を有するタンパク質は、当業者に周知の方法により直接化学合成によって常法により調製できる。タンパク質の機能的誘導体は通常、天然タンパク質と同じ質的生物活性を示す。
【0104】
「断片」なる用語は、タンパク質のアミノ酸配列から誘導されるポリペプチドであって、誘導される完全長のポリペプチドよりも長さが短いものを示す。例えば、このような断片は、完全長タンパク質をタンパク質分解的に切断することにより調製される。好ましくは、断片は、タンパク質をコードするDNA配列を適当に修飾し、天然配列のC末端、N末端および/または内部の1つまたはそれ以上の部位の1つまたはそれ以上のアミノ酸を欠失させることにより、組換え的に調製できる。このような断片は1つまたはそれ以上の特徴的部分、機能または天然タンパク質またはポリペプチドの特性を1つまたはそれ以上保持できる。このような保持される特性の例としては、触媒活性、基質特異性、無傷の細胞における他の分子との相互作用、調節機能、または天然複合体に特異的な抗体との結合性、またはそのエピトープなどがある。
【0105】
本発明に含まれる別の機能的誘導体は、天然ポリペプチドと比較して1つまたはそれ以上のアミノ酸が欠失している、あるいは付加的なアミノ酸または置換アミノ酸を有する「変異体」ポリペプチドである。変異体は天然に存在する複合体成分から、配列をコードするタンパク質DNAを修飾し、天然配列のC末端、N末端および/または内部の1つまたはそれ以上の部位の1つまたはそれ以上のアミノ酸のコドンを付加、除去および/または修飾することにより適切に誘導できる。付加的アミノ酸の付加、置換、および/またはを有するこのような変異体は上記した天然タンパク質の1つまたはそれ以上の特徴部分を保持していると考えられる。
【0106】
本発明の他の態様は、本発明のキメラタンパク質の用途に関する。好ましい用途は、医薬および獣医薬適用であり、ここでは有効量の本発明キメラタンパク質(好ましくは本発明の組成物の形態で)を患者に投与する。このように、キメラタンパク質は患者の細胞と接触し、その接触は所望の生物学的応答を引き起こす。本発明のキメラタンパク質を使用する方法は、生物において免疫応答を引き起こす方法、生物において抗体を産生させる方法(B細胞免疫応答)、生物によりT細胞免疫応答を誘導する方法、およびT細胞病態を処置する方法を含む。本発明はさらに、本発明のキメラタンパク質を投与することにより、T細胞媒介性病態を改変できる免疫応答を増大させるため、被験者を処置する方法をも含む。
【0107】
通常、このような方法は、生物に有効量の本発明キメラタンパク質を供給することにより行われる。「有効量」とは、所望の生物応答を惹起させる量を意味する。このような量を構成するものは、具体的キメラタンパク質、惹起させる所望の生物応答、キメラタンパク質の製剤、処置する生物の年齢、体重、性別および健康度、投与方法、処置または予防する疾患の状態など種々の因子によって変動する。本発明のキメラタンパク質および組成物を投与できる生物は哺乳動物であり、好ましくは哺乳動物はウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、および霊長類動物から選ばれる哺乳動物である。特に好ましい生物はヒトである。
【0108】
本明細書に記載の化合物はそのまま、または他の活性成分と混合して混合療法として、または適当な賦形剤または担体とともに、ヒト患者自身に投与できる。本発明適用のための化合物の製剤および投与方法は、”Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PA,に見出すことができる。
【0109】
投与経路
適当な投与経路は例えば、経口、直腸、経粘膜、腸管適用;腸管外供給、例えば筋肉内、皮下、静脈内、皮内注射;およびクモ膜下内、直接心室内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射などである。当業者は特定に投与経路に対して組成物を適合させる種々の方法を理解している。
【0110】
あるいは、化合物は全身投与でなく、固形癌に直接注入することにより局所的に投与することができ、その場合、デポット(貯蔵)としてまたは徐放製剤として局所投与することが多い。
【0111】
組成物/製剤
本発明の医薬組成物は、たとえば、慣例の混合、溶解、顆粒化、糖衣形成、すりつぶし、乳化、カプセル封入、封入または凍結乾燥工程などのそれ自体公知の方法で製造することができる。
したがって、本発明に用いるための医薬組成物は、医薬的に用いることができる調製品への活性化合物の加工を促進する賦形剤および補助剤を含む1種またはそれ以上の生理的に許容しる担体を用いる慣例の方法で製剤することができる。適当な製剤は、選ばれた投与経路に従属する。
【0112】
注射液のためには、本発明作用剤は、水性溶液、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液または生理的食塩緩衝液などの生体適合性緩衝液として製剤することができる。経粘膜投与のためには、製剤において、浸透されるべきバリヤーに適した浸透剤を用いる。このような浸透剤は一般に、当業界で公知である。
経口投与のためには、活性化合物と当業界で公知の医薬的に許容しうる担体を合わせることによって、本発明化合物を容易に製剤することができる。このような担体によって、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤されるべき本発明化合物は、処置されるべき患者による経口摂取が可能になる。適当な担体として、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどの糖類;トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび/またはポリビニルピロリドン(PVP)などのセルロース調製物といったような充填剤などの賦形剤が挙げられる。要すれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を加えてもよい。
【0113】
糖衣錠のコアは、適当なコーティングをして提供される。この目的のために、必要に応じてアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタン、ラッカー溶液および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含む濃縮糖類溶液を用いる。識別のため、または活性成分用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに染料または含量を加えてもよい。
【0114】
経口で用い得る医薬調製物として、ゼラチン製プッシュフィットカプセルならびにゼラチン、グリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤製軟密閉カプセルおよびが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤および/またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤ならびに必要に応じて安定剤と混合して有効成分を含むことができる。軟カプセルでは、脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの適当な液体に活性化合物を溶解または懸濁する。さらに、安定剤を加えてもよい。すべての経口投与用製剤は、このような投与に適した用量であるべきである。
【0115】
バッカル投与のためには、組成物を慣例の方法で製剤された錠剤またはロゼンジの剤形にする。
吸入による投与のためには、慣例的に、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体などの適当な噴霧剤を用いて、加圧パックまたは噴霧器からエアロゾルスプレーの剤形で本発明使用のための化合物をデリバリー(供給)する。加圧エアロゾルの場合、計量された量をデリバリーするバルブを提供することによって用量単位を決定する。吸入器(inhalerまたはinsufflator)で用いるためのたとえばゼラチン製のカプセル剤およびカートリッジを、本発明化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適当な粉末基剤の粉末混合物を含めて製剤することができる。
【0116】
ボーラス注射または継続的輸液などの注射による非経口投与用に本発明化合物を製剤することができる。注射用製剤は、たとえば、保存剤を添加したアンプルまたはマルチ投与容器などの単位投与剤形で提供される。該組成物は、懸濁液、溶液または油性または水性ビヒクルにおける乳液などの剤形をとることができ、懸濁剤、安定剤および/または分散剤などの製剤用剤を含んでもよい。
【0117】
非経口投与用医薬製剤は、水溶性形体の活性化合物の水溶液であってもよい。さらに、適当な油性注入用懸濁液として、活性化合物の懸濁液を製造してもよい。適当な親油性溶媒またはビヒクルとして、ゴマ油などの脂肪油、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルまたはリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘度を増す物質を含むことができる。必要に応じて、懸濁液は、適当な安定剤または高濃縮溶液が製造されるように化合物の溶解度を増加させる作用剤を含むこともできる。
あるいは、活性成分は適当なビヒクル、例えば滅菌発熱物質不含水により使用前に再構成される粉末形態であってもよい。
【0118】
これまでに記載した製剤に加えて、持効性製剤として、本発明化合物を製剤してもよい。このような長期作用製剤は、植込錠(たとえば、皮下または筋肉内)または筋肉内注射によって投与される。したがって、たとえば、適当なポリマーまたは疎水性材料(たとえば、許容しうる油中の乳剤)もしくはイオン交換樹脂とともに、またはたとえば可溶性の小さい塩などの可溶性の小さい誘導体として、本発明化合物を製剤してもよい。
【0119】
本発明の疎水性化合物のための医薬担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマーおよび水性相を含む共溶媒系である。共溶媒系は、VPD共溶媒系であってよい。VPDは、3% w/vのベンジルアルコール、8% w/vの非極性界面活性剤ポリソルベート80および65% w/vのポリエチレングリコール300の無水エタノール溶液である。VPD共溶媒系(VPD:D5W)は、5%デキストラン水溶液で1:1に希釈したVPDからなる。この共溶媒系は、疎水性化合物をよく溶解し、それ自体、全身投与において毒性が低い。共溶媒系の特性は、その溶解性および毒性特性を無効にすることなくかなり変えることができる。さらにそのうえ、共溶媒成分の個性は、変更することができる:たとえば、ポリソルベート80の代りに、他の低毒性非極性界面活性剤を用いてもよい;ポリエチレングリコールのフラクションサイズを変えてもよい;ポリビニルピロリドンなどの他の生体適合性ポリマーをポリエチレングリコールと交換してもよい;および他の糖質または多糖類をデキストロースの代りに使ってもよい。
【0120】
別法として、疎水性医薬化合物のための他のデリバリーシステムを用いてもよい。リポソームおよびエマルションが、疎水性薬物のためのデリバリービヒクルまたは担体の公知の例である。毒性はより大きいが、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒もまた、用いることができる。さらに、治療薬を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性系を用いて本発明化合物をデリバリーすることができる。種々の徐放性素材が確立されており、当業者には公知である。徐放性カプセル剤は、その化学的性質に応じて、2、3週間〜100日間化合物を放出する。治療薬の化学的性質および生物学的安定性に応じて、タンパク質安定化のさらなる方策を採ってもよい。
【0121】
医薬組成物はまた、適当な固相もしくはゲル相担体または賦形剤をふくむことができる。このような担体または賦形剤の例として、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖質、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
多くの本発明化合物が、医薬的に適合しうる対イオンとして提供される。医薬的に適合しうる塩は、多くの酸とともに形成され、該酸として、硫酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。塩は、水性または対応する遊離塩基体であるプロトン性溶媒により可溶性であることを企図されるものである。
【0122】
有効用量
本発明における使用に適した医薬組成物は、その企図する目的を達成するのに有効な量で有効成分が含まれる組成物である。さらに詳しくは、治療有効量とは、疾患の症状を予防、軽減または寛解するか、または治療されている患者の生存を延長するのに有効な化合物の量を意味する。治療有効量の決定は、特に本明細書に提供する詳細な記載を考慮して、当業者であれば成しうることである。
【0123】
本明細書に記載した本発明化合物の毒性および治療的有効性は、LD50(集団の50%が死に到る用量)およびED50(集団の50%において治療が有効である用量)の決定などの細胞培養または実験動物における標準の薬学的方法によって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比が、治療指数であり、LD50およびED50の比率として表わされる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲を設定するのに用いることができる。このような化合物の用量は、毒性が少ししかないか、または無毒性のED50を含む循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。該用量は、採用する投与剤形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変化する。正確な製剤、投与経路および用量は、患者のコンディションを考慮して、個々の医師によって選択される(たとえば、Fingl et al., 1975, in ”The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch. 1 p.1を参照)。
【0124】
投与量および間隔は、必要な効果を維持するのに十分である活性部分の血漿レベル、あるいは最小有効濃度(MEC)が提供されるように個々に調節する。MECは、各化合物によって変化する。MECを達成するのに必要な用量は、個々の特性および投与経路に応じて変化する。しかし、HPLCアッセイまたはバイオアッセイを用いて、血漿濃度を決定することができる。
【0125】
また、投薬間隔もMEC値を用いて決定され得る。化合物は、期間のうち10−90%、好ましくは30−90%、および最も好ましくは50−90%の間、MECを超える血漿レベルを維持するレジメを用いて投与されるべきである。
局所投与または選択的取り込みの場合、薬物の有効な局所濃度は血漿濃度とは関連しないかもしれない。
当然のことながら、投与される組成物の量は処置される被検体、被検体の体重、苦痛の重篤度、投与様式および指示する医師の判断に依存する。
【0126】
パッケージング
所望であれば、組成物は、活性成分を含有する単位投薬形態を1以上を含み得る容器またはディスペンサー装置中に提示され得る。例えば、容器はブリスターパックのような金属またはプラスチックのホイルを備え得る。容器またはディスペンサー装置は、投与に関する使用説明書を有しうる。また、容器またはディスペンサーは、医薬の製造、使用または販売を規定する政府機関により指示されている形態で、容器に付随した警告を備え得、この警告は、その機関によるヒトまたは動物投与用のポリヌクレオチドの形態の認可を反映している。例えば、このような警告は、処方薬剤または認可された製品添加物(approved product insert)に関して米国食品医薬品局により認可されているラベルであり得る。また、融和性の製薬キャリア中に処方されている本発明の化合物を含有する組成物も、製造し、適切な容器中に配置し、そして指定の状態の治療についてラベルすることができる。ラベル上に記載の適切な状態としては、腫瘍の治療、慢性関節リウマチの治療、糖尿病の治療などを挙げることができる。
【0127】
実施例
以下の記載において、免疫学、細胞生物学および分子生物学の分野の当業者にとって公知である種々の方法に対して参照がなされる。そのような公知の方法を記載する、参照の刊行物および他の材料は、そのすべてを本明細書中に参照して組み込む。
【0128】
実施例1.T細胞リンパ腫イディオタイプ(Id)同定およびクローニングに関する組織処理:
抹消リンパ節由来の腫瘍サンプルに、臨床的に指示されているように滅菌条件下で生検を実施し、患者イディオタイプ特異的組換えVαおよびVβ−Igキメラタンパク質を作製するために使用する。残りのリンパ節生検材料は今後の使用のために組織細胞バンクで液体窒素中で保存する。
【0129】
細胞単離:生検を実施したリンパ腫組織を、滅菌PBS中に沈めながら、使い捨ての0.38mmスチールメッシュスクリーンに押し付けて通すことにより、患者リンパ節生検の単一細胞懸濁物を得る。分散させた細胞をPBS中で2回洗浄し、ついで再懸濁してカウントする。10%の細胞画分を全RNA抽出のために処理し、残りの細胞は、30%ウシ胎仔血清および10% DMSOを含有するRPMI 1640組織培養培地中での再懸濁の後、液体窒素中に保管(archive)する。臨床サンプルの処理は全て、生物用安全キャビネットの中で行う。
【0130】
全RNA調製:ホモジナイズしたリンパ節細胞由来の全RNAは、RNeasy Kit (Qiagen)を用いて業者の指示のとおりに単離する。全RNAは分光光度計により定量する。
【0131】
Tリンパ腫細胞由来のTCRのVαおよびVβ鎖をコードする遺伝子のcDNA合成およびPCR増幅:Tリンパ腫細胞レセプターのVαおよびVβ鎖の両方を、以下の特性を用いる製品により、記載されるように厳密に、5’RACEシステム(Gibco BRL)を用いて同定する。第1鎖cDNA合成に関しては、鋳型としておよそ5.0μgの全RNAを用いて、Cα特異的プライマーCADS3またはCβ特異的プライマーCBDS3(表1を参照のこと)を使用して第1鎖DNAをプライムする。業者の推奨に従ってポリdCテイリング(tailing)を行った。ついで、業者から得た5’プライマー、ならびに第二のCα特異的CADS2またはCβ特異的CBDS2アンチセンスプライマー(これらは各々、cDNA合成のために用いた個々のプライマーの内部のものである)を用いてVαおよびVβ同定を行った(表1参照)。
【0132】
【表1】
(CB/IgG1:小文字の文字は、IgG1キメラタンパク質を形成するためのApa Iクローニング部位を製造するための変更を示す。C/GおよびG/Tと示した塩基は、2ヵ所の位置での使用に関しては、Cβ 1および2の間の差異に応じていずれかの塩基を示す。)
(CA/IgK:小文字の文字は、κ軽鎖とのキメラタンパク質を形成するためのDra IIIクローニング部位を製造するためのbpの変化を示す)
【0133】
PCR産物のクローニングおよび配列決定:VαおよびVβ鎖に関する腫瘍特異的配列を含有することが決定された反応物由来のPCR産物を、業者の推奨に従ってプラスミドpCR2.1−TOPOに直接クローニングし、Top10コンピテント大腸菌細胞(Invitrogen)に導入する。24個のミニプレプDNAプラスミドを、QIAPrep Spin Miniprep Kit (Qiagen)を用いてカーベニシリン耐性細菌コロニーから調製し、分光光度計により定量する。各プラスミド200ngを、Cy5/Cy5.5 Dye Primer Cycle Sequencing Kit (Visible Genetics)を用いて配列決定した。配列決定反応の完了後、OpenGene Automated DNA Sequencing Systemでサンプルを電気泳動し、GeneObjectsソフトウェアパッケージ (Visible Genetics)を用いてデータを処理した。SEQUENCHER Version 4.1.2 DNA分析ソフトウェア (GENE Codes Corp.)を用いて、配列アラインメントを含む更なる分析を行った。VαおよびVβについての腫瘍特異的配列が、サンプルのうちの75%に存在する場合(例えば、24個のうち18個以上が同一のグループを形成する場合)は考慮する。入手可能な場合には2個の独立生検サンプルを比較する。
【0134】
実施例2. イムノグロブリン重鎖および軽鎖の定常域を含有するバキュロウィルス発現ベクター pTRABacV α HC γ1 および pTRABacV β HC γ1 の構築
分泌シグナル配列のp2Bacへのクローニング:pTRABacHuLCκHCγ1およびpTRABacHuLCλHCγ1構築物のためのベースベクターはp2Bac (図2、配列番号:5、Invitrogen, Carlsbad, CA)であった。2個の分泌シグナル配列をこのベースベクター中にクローニングし、最初の中間生成物であるバキュロウィルス発現ベクターp2BacMを作製した。たいていの場合、バキュロウィルスAcNPVP10プロモーターの転写制御下に配置したミツバチメリチン分泌シグナル配列のアミノ末端ドメインをコードする相補的オリゴヌクレオチドを利用して、ベクターp2Bacをまず修飾した。メリチン配列クローニングのため、p2Bac(2μg)を、37℃で4時間、Not IおよびSpe Iで消化した。1%アガロースゲルでの電気泳動の後、Qiaex II樹脂 (Qiagen, Chatsworth, CA)を用いて線状ベクターを精製した。ついで、精製したDNAを水50μlを用いて溶離し、DNA濃度を測定した。プライマーMe1S/N(配列番号:16)およびMe1N/S(配列番号:17)、各1μgを、消化緩衝液M(10 μl)(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)中で混合し、5分間、70℃まで加熱し、ついで室温まで冷却して相補的プライマーとアニーリングさせた。アニーリングしたプライマーのうち10%を、Not IおよびSpe Iを用いて20μlの反応系中で、37℃で4時間、消化し、消化したプライマーを15%ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動の後、Qiaex H樹脂を用いて精製し、アニーリングしたプライマーに対するDNAの濃度を決定した。p2BacベクターおよびアニーリングしたメリチンフラグメントのDNAを、1:10のベクター対インサート比でライゲーションした。ライゲーション産物をコンピテントXL 1−Blue E.coli(Stratagene, San Diego, CA)を用いて形質転換し、37℃で一晩増殖させるためにLB−カーベニシリン寒天プレートにプレーティングした。標準的なプロトコルによりミニプレプコロニーを調製し、プラスミドを配列決定して構築物をチェックした。得られたベクターp2BacMはメリチン分泌シグナル配列を含有していた。
【0135】
同様に、p2BacMベクターを、AcNPVポリへドロンプロモーターの転写制御下にヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列のアミノ末端ドメインをコードするようにさらに修飾して、第二の中間生成物であるバキュロウィルス発現ベクターp2BacMAを作製した。アルカリホスファターゼ配列を導入するために用いた方法は、概して、以下のとおりであった。p2BacMプラスミド(2μg)をBam HIおよびEco RIを用いて消化し、線状ベクターをQiaex II樹脂を用いてアガロースゲルからゲル精製し、水50μl中に溶出した。ベクターのDNA濃度を測定した。プライマーAPB/E(配列番号:18)およびAPE/B(配列番号:19)の各1μgを消化緩衝液M10μl中に混合し、70℃で5分間加熱し、ついで室温まで冷却して相補的なプライマーをアニーリングさせた。アニーリングしたプライマーのうち10%を、Bam HIおよびEco RIを用いて20μlの反応系中で、37℃で4時間、消化した。ついで、消化したプライマーを15%ポリアクリルアミドゲルから、Qiaex II樹脂を用いて精製した。また、消化したプライマーのDNA濃度を決定した。ついで、線状p2BacMベクターおよびアルカリホスファターゼフラグメントを、1:10のベクター対インサート比でライゲーションし、ライゲーション産物をコンピテントXL1−Blue E.coliを用いて形質転換し、37℃で一晩増殖させるためにLB−カーベニシリン寒天プレートにプレーティングした。ミニプレプコロニーを調製し、プラスミドを配列決定して構築物をチェックした。得られた中間生成物ベクターp2BacMAは、ヒト胎盤アルカリホスファターゼに対する分泌シグナル配列を含有する。メチル感受性(methyl−sensitive)Stu I部位へのκ定常域の続いてのクローニングのために、p2BacMAプラスミドをさらに、dcmメチラーゼ活性を欠損したSCS−110 E. coli株(Stratagene)に形質転換した。
【0136】
IgG γ1 および軽鎖の定常領域の増幅およびクローニング:
ヒトモノクローナル抗体9F12のヒトカッパ(κ)定常およびヒトIgGγ1定常ドメインを、ヒト細胞系統9F12(ATCC#HB8177)から抽出したRNAからPCR増幅した。κ定常領域は、アルカリホスファターゼシグナル配列の後ろにクローニングした。IgGγ1定常領域はメリチン分泌シグナル配列の下流に挿入し、それによりベクター(pTRABacHuLCκHCγ1、図5a)を作製した。ヒトラムダ(λ)軽鎖定常領域を含むベクター(pTRABacHuLCλHCγ1、図5b)を、κ軽鎖定常領域をλ軽鎖定常領域と置換することにより調製した。軽鎖は、クローン性リンパ球白血病細胞RNA調製物からRT−PCRにより単離した。クローニング操作の詳細は次の通りである。
【0137】
9F12 κおよび IgG γ1 定常領域断片の増幅:
9F12細胞(ATCC#HB8177)由来の全RNAをRNeasy Kit(Qiagen)を用い、その製造元の教示に従って抽出した。1本鎖cDNAをSuperScript逆転写酵素(GIBCO BRL, Rockville, MD)をオリゴ(dT)プライマーとともに用いて合成した。合成した1本鎖cDNAの1/12を、9F12κおよびIgGγ1特異的オリゴヌクレオチド(それぞれ配列番号:22 plus 配列番号:23および配列番号:20 plus 配列番号:21)を用い、Expand High Fidelity Taq(ロッシュ)を含む100μl PCR反応中にて増幅した。増幅9F12免疫グロブリン由来の断片をQiaex II樹脂を含む1.5% SeaKemアガロースから精製し、水50μlで溶出させた。断片のDNA濃度を測定した。精製9F12免疫グロブリン断片を別々に、TA−II (Invitrogen) PCRクローニングベクターに連結した。連結産物をコンピテントXLI−Blue大腸菌に形質転換し、LB−カルベニシリン寒天平板上にて37℃にて一晩発育培養した。ミニプレップコロニーを調製し、プラスミドDNAを配列決定した。
【0138】
9F12 κ定常領域の発現ベクターへの挿入
κ定常ドメインに関し、κ定常ドメインを含有するプラスミドDNA5μgおよびSCS110 E.coli(大腸菌)から精製したベクターp2BacMA のDNA2μg をStu IおよびHind IIIで消化した。κ定常領域を含む320bp断片およびp2BacMAベクターを含む7.1kb断片をQuiex IIでゲル精製し、水50μlで溶出した。両断片のDNA濃度を測定した。次いで、精製した断片をRapid Ligationキット(ロッシュ)で連結した。連結産物をコンピテントXLI−Blue大腸菌に形質転換し、LB−カルベニシリン寒天平板上にて37℃にて一晩発育培養した。ミニプレップ細菌コロニーを調製し、組換えDNAを配列決定し、それによりκ定常領域の挿入を確認した。得られたプラスミドベクターはpTRABacLCκであった。
【0139】
IgG γ1 定常ドメインのベクターへの付加:
IgGγ1定常領域を含むプラスミドDNA5μg およびベクターpTRABacLCκのプラスミドDNA2μg をまずSpe IおよびXba Iで消化し、IgGγ1定常ドメインをベクターに付加した。IgGγ1定常領域の1kb断片およびpTRABacLCκベクターの7.4kb断片をQuiex IIを含むアガロースプラグからゲル精製し、水50μlで溶出した。両断片のDNA濃度を測定した。次いで、精製した断片をRapid Ligationキット(ロッシュ)で連結した。連結産物をコンピテントXLI−Blue大腸菌に形質転換し、LB−カルベニシリン寒天平板上にて37℃にて一晩発育培養した。ミニプレップコロニーを調製し、IgGγ1挿入の連結および方向性を制限部位の制限分析と配列決定により決定した。得られた組換えベクターはpTRABacHuLCκHCγ1であった。
【0140】
このプラスミドpTRABacHuLCκHCγ1におけるミツバチメリチン分泌配列とCγ1領域配列、およびアルカリホスファターゼ分泌配列とCκ領域配列との間にそれぞれ転写終止コドンを付加し、該プラスミドをさらに調整した。この修飾のため、pTRABacHuLCκHCγ1ベクターをSpe I + Apa I消化により線状化した。次いで、線状化したベクターをアニール化相補プライマーγ1−stuff 1(配列番号:53)およびγ1−stuff 1’(配列番号:54)に連結し、インフレイム終止コドンを導入した。この修飾により得られたベクターを次いで、Stu I (AGGCCT) + Dra III (CACnnnGTG)で線状化した後、アニール化相補プライマーκ−stuff 1(配列番号:55)およびκ−stuff 1’(配列番号:52)に連結し、インフレイム終止コドンを導入した。これらの修飾の正味の効果をそれぞれ図6Cおよび6D
に示す配列に表す。(付加した配列は二重線と太字により示している)
【0141】
γ定常領域のベクターへの付加:
γ軽鎖イディオタイプを示す慢性リンパ球白血病(CLL)の患者から精製した末梢血リンパ球(PBL)から全RNAを、RNeasyキット(Qiagen)を用いて抽出した。
【0142】
SuperScript Preamplification System(GIBCO BRL)を製造元の教示に従って使用し、約2.0μg の全RNAを第1ストランドcDNA合成の鋳型として用いた。オリゴ(dT)をプライミングに使用した。Vγシグナル配列の部分と同一の上流プライマー(TTGCTTACTG CACAGGATCC GTG; 配列番号:47)およびλ定常領域の最後の幾つかのコドンと相補的な下流プライマー(TGCCGTCGGC AGGAGGTATT TCATTATGAC TGTCTCCTTG CTATTATGAA CATTCTGTAG GGGCCA; 配列番号:48)および3’非翻訳領域の部分を用い、PCR反応により合成した1本鎖cDNAの1/12を増幅した。PCR産物をpCRIIベクター(Invitrogen)にクローニングし、配列決定を行い、同一性を確認した。正しいλ定常領域配列を含むプラスミドを第2のPCRの鋳型として選択した。この反応では、Jλの下流直後のλ定常領域の配列に相当する、操作したDra III制限部位を含有するセンスオリゴヌクレオチドCλ−5’(配列番号:49)、およびλ定常領域の直後の終止コドンをまたぐ、Hind IIIを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーCλ−3’(配列番号:50)を使用した。得られたPCR産物をpCR2.1−TOPOベクターにクローニングし、配列決定した。HindIII制限反応に際し、挿入物の方向性に応じて、λ定常領域配列を含む断片を幾つかのプラスミドから遊離させた。この制限断片をゲル単離し、pTRABacHuLCκHCγ1(図5A)にクローニングした後、Hind III消化により線状化し、それによりλおよびκ定常領域をともに含む中間プラスミドを作製した。このプラスミドをStu IおよびDra IIIで制限反応し、κ配列を除去した。得られた線状化プラスミドをアニール化相補プライマーγ−stuff 1(配列番号:51)およびγ−stuff 1’に連結し、最終プラスミドであるpTRABacHuLCλHCγ1(図5B)を作製した。
【0143】
pTRABacHuLCκHCγ 1および/またはpTRABacHuLCλHCγ 1の構築に用いたすべてのオリゴヌクレオチドプライマーのリストは以下の表2および3に認めることができる。
【0144】
唯一のクローニング配列Stu IおよびDra IIIを含有するVαまたはVβ鎖の遺伝子はκまたはλ定常領域およびアルカリホスファターゼシグナル配列間に、および唯一のクローニング配列Spe IおよびApa Iを含有するVβまたはVα鎖の遺伝子はIgGγ1定常領域およびミツバチメリチン分泌シグナル配列間にそれぞれ、pTRABacHuLCκHCγ 1またはpTRABacHuLCλHCγ 1のいずれかを使用して挿入することができた。次いで、得られた発現ベクターをSpodoptera frugiperda (Sf−9)昆虫細胞に形質導入し、組換え出芽バキュロウイルスを調製した。次いで、組換えバキュロウイルスをSf−9細胞にて連続的に増幅し、高力価の組換えバキュロウイルスストックを調製した。この高い力価の組換えバキュロウイルスストックをTrichoplusia ni (High−5)細胞に感染させ、以後のキメラTCR/Igタンパク質の産生に使用した。
【0145】
【表2】
【0146】
実施例3.患者から誘導したイディオタイプ V α および/または V β 鎖の遺伝子の発現ベクターへの挿入
上記のようにして、腫瘍由来のVαおよび/またはVβ鎖を単離した後、ミリチンリーダーペプチドの末端40ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマー(Vβ鎖クローニングのため)(配列番号:8−ACTAGTTTTT ATGGTCGTGT ACATTTCTTA CATCTATGCG)、アルカリホスファターゼリーダーペプチドの末端31ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマー(Vα鎖クローニングのため)(配列番号:9−AGGCCTGAGG CTACAGCTCT CCCTGGGC)、ならびに上記の分析から配列決定されたそれぞれVαまたはVβ遺伝子の最初の20ヌクレオチドを調製した。αまたはβ鎖定常領域由来のCA (CA/IgK;配列番号:15)の4−36塩基対およびCB (CB/IgG1;配列番号:14)の6−35塩基対に相補的な逆オリゴヌクレオチドプライマー。クローナルVαまたはVβ配列を有すると同定された組換えプラスミドを2回目のPCRの鋳型として使用する。サイクル条件は既述の通りである。
【0147】
発現ベクターへの V α 領域挿入:
配列を確認したプラスミド調製物から増幅したPCR誘導DNA断片を制限酵素Stu I およびDra IIIで消化し、アガロースゲルにて分離する。Vα遺伝子を含有すると推測される約360bp断片を溶出させ、適当なバキュロウイルス免疫グロブリン発現移入ベクターに挿入する。基本的には、PCR誘導Vα産物および対応するpTRABacHuLCκHCγ1またはpTRABacHuLCλHCγ 1カセットベクター2 μg をStu I およびDra IIIで消化した。患者誘導Vα鎖由来の360 bpDNA断片および線状pTRABacHuLCκHCγ1またはpTRABacHuLCλHCγ 1ベクターの8.4kb断片をQuiex IIを含むアガロースプラグから精製し、水50μlで溶出した。両断片のDNA濃度を測定し、次いで両断片をRapid Ligationキット(ロッシュ)を用いて連結した。連結産物をコンピテントXLI−Blue大腸菌に形質転換し、LB−カルベニシリン寒天平板上にて37℃にて一晩発育培養した。ミニプレップコロニーを調製し、組換えDNAプラスミドを制限分析と配列決定により確認した。得られたベクターをpTRABacVαHuLCκHCγ1またはpTRABacVαHuLCλHCγ 1と命名した。
【0148】
発現ベクターへの V β 領域挿入:
配列を確認したプラスミド調製物から増幅したPCR誘導DNA断片を制限酵素Spe IおよびApa 1で消化する。Vβ遺伝子を含有する約360bp断片を切りだし、ゲル精製し、関連Vα遺伝子を含有する適当なバキュロウイルス免疫グロブリン発現移入ベクターpTRABacVαHuLCκHCγ1またはpTRABacVαHuLCλHCγ1に、または関連Vα遺伝子を含有しないpTRABacHuLCκHCγ1に挿入する。基本的には、PCR誘導Vβ産物およびpTRABacVαHuLCκHCγ1、pTRABacVαHuLCλHCγ1、pTRABacHuLCκHCγ12 μg DNAをSpe IおよびApa 1で消化した。Vβ鎖の360 bp断片およびpTRABacVαHCγ1、pTRABacVαHuLCκHCγ1、またはpTRABacVαHuLCλHCγ1の8.8kb断片またはpTRABacHuLCκHCγ1の8.4 kb断片をQuiex IIを含むアガロースゲルプラグから精製し、水50μlで溶出した。両断片のDNA濃度を測定し、両断片をRapid Ligationキット(ロッシュ)を用いて連結した。連結産物をコンピテントXLI−Blue大腸菌に形質転換し、LB−カルベニシリン寒天平板上にて37℃にて一晩発育培養した。ミニプレップコロニーを調製し、組換えDNAプラスミドを配列決定した。得られたベクターをpTRABacVαHuLCκVβHCγ1、またはpTRABacVαHuLCλVβHCγ1、またはpTRABacHuLCκVβHCγ1と命名した。
【0149】
【表3】
【0150】
実施例4.V α および/または V β 鎖イディオタイプを含有するバキュロウイルス発現ベクターによる昆虫細胞系統のトランスフェクションおよび組換えキメラタンパク質の調製:
昆虫細胞発育:
2つの樹立された昆虫細胞系統(Sf9およびHigh−5)を改変バキュロウイルスベクターにトランスフェクトし、組換えキメラVH/免疫グロブリンおよび/またはVL/免疫グロブリンタンパク質を調製した。すべての昆虫細胞は、使い捨て滅菌通気式振盪フラスコ(Coming)中、140−150 rpmにて、50μg/Lゲンタマイシンを含むESF−921血清不含昆虫培地 (Expression Systems LLP)にて28℃において、液体容量が50%を越えることがないように発育させた。細胞を2−3日ごとに継代した。凍結細胞を産物の各ロットごとに稼動しているセルバンクから、または6週ごとに解凍することにより(凍結保護培地: 10% DMSO, 40% ESF−921 培地, 50% High−5 ならし培地)、バキュロウイルスによる感染に対して退縮性でない対数増殖期の細胞を連続して保存できるようにした。
【0151】
Sf9 細胞トランスフェクションおよび組換え検定:
Vαおよび/またはVβ領域の遺伝子および免疫グロブリン重鎖および/または軽鎖定常領域の遺伝子を含む改変バキュロウイルス発現ベクターを、BacVector−3000トランスフェクションキット(Invitrogen)を用いてSf9細胞に同時トランスフェクトした。アガロースオーバーレイから10個のプラークを個別に取り出した。単離したプラーク由来のウイルスを使用し、ESF−921培地5ml中、50%全面成長のSf−9細胞を播種したT−25フラスコに感染させた。T−25フラスコにて増幅したクローナルウイルス単離物を、2つのプライマー(配列番号:37−TTTACTGTTT TCGTAACAGT TTTG)および(配列番号:38−GGTCGTTAAC AATGGGGAAG CTG)を使用するPCRにより試験し、単離したプラークのクローン性を確かめ、野生型ウイルスの混入のないことを確かめた。概して言えば、組換え移入ベクタープラスミド200ngを、供給されているEufectin lipid試薬を用いたBac Vectorマニュアル(Novagen)に記載されているようにしてトリプレット−カットBac−Vector−3000により同時トランスフェクトした。このトランスフェクション混合物を連続して5倍に希釈した。この100μlを、2.5 x 106接着Sf9細胞を含む60mm組織培養皿にて培養した。1時間後、細胞に、ESF−921培養培地の1%アガロース溶液4mlを重層した。トランスフェクションの144時間目に、Neutral Red (Sigma, St. Louis, MO)を用いて生細胞を染色し、次いでアガロースオーバーレイ中にて発育しているトランスフェクト細胞から10個のクローンを個別に取り出した。ESF−921培地1 ml中、一晩のプラーク・プラグからウイルスを溶出させた。T−25フラスコに、ESF−921培地5ml中、50%全面成長のSf−9細胞を播種し、溶出クローナルウイルス0.5 mlを感染させた。感染の95時間後、T−25フラスコから培地0.5mlを取り出し、遠心により細胞を除去し、得られた上清を、ニトロセルロースへのブロッティングにより免疫グロブリン活性について検定した。野生型ウイルスが存在しないことも以下のPCRにより試験した。
【0152】
組換えバキュロウイルスを含む感染上清(10 μl)を、10 mM Tris pH 8.3、50 mM KCl、0.1 mg/ml ゼラチン、0.45% Nonidet P−40および0.45% Tween−20を含み、さらに6 μg プロテイナーゼ−Κを含む細胞溶解緩衝液90 μlに加えた。この混合物を60℃にて1時間加熱し、95℃で10分間インキュベートすることによりプロテイナーゼ−Κを変性させた。加熱した混合物25μlが冷却した後、新しいPCRチューブに移し、10 mM Tris pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1 mg/ml ゼラチン, 0.45% NP−40, 0.45% Tween−20, 400 μM 各dNTP, 5 mM MgCl2, 50 pM 各 PCR プライマー (最終)および2.5 U Taq ポリメラーゼ (ロッシュ(Roche))を含む別の混合物25μlを加えた。ウイルスDNAを、92℃の1分、次いで58℃の1分、および72℃の1分の40サイクルで増幅した。組換えバキュロウイルスプライマーPHフォワード(配列番号:37)およびPHリバース(配列番号:38)を使用し、T細胞レセプター遺伝子の部分を発現するポリヘドロン座を増幅した。アガロースゲルでの電気泳動によりPCR産物を分析した。組換えバキュロウイルスは1300 bp断片が増幅され、野生型バキュロウイルスは上記のプライマーセットを用いて約800 bp断片が増幅される。野生型ウイルスが混入した組換えウイルスはこれら両断片サイズが増幅される。
【0153】
Sf−9 細胞における高力価ウイルス保存液の調製:
T−25初代培養物から得た2mlを、ESF−921培地10ml中、50%全面成長のSf−9細胞を含有するT−75フラスコに移し、28℃にて120時間細胞を発育させた。二次T−75培養物5mlを、2x106 細胞/mlのSf−9細胞50mlを含有する150ml振盪フラスコに移し、細胞を28℃にて120時間発育させた。150ml振盪フラスコから25mlを取り出し、それを1L振盪フラスコ中の2x106 細胞/mlのSf−9細胞500mlに移し、28℃にて発育させた。培養物が20%に達したら、トリパンブルー染色により生細胞をスコアー化し(感染の約120−144時間後)、3000xGの遠心によりウイルス培養物を収獲し、50ml滅菌チューブに分配し、チューブの半分を4℃にて保存し、休止には−80℃にて保存した。これにより高力価のウイルス保存液500ml(>1x108 pfu/ml)が収獲され、これをキメラタンパク質生産のためのHigh−5昆虫細胞の感染に用いた。ウイルス力価(pfu/ml)はBaculovirus Rapid Titer Kit (Clontech, Palo Alto, CA)を用いて測定した。
【0154】
High−5 昆虫細胞における TCR/Ig キメラタンパク質の生産:
High−5昆虫細胞(BTI−TN−5B1−4)はSf−9細胞と比較して、より高いレベルの組換え免疫グロブリン(2−20 X)を分泌するので、それをTCR/Igキメラタンパク質生産のための細胞系統として選択した。初期の対数期にあるHigh−5細胞(1.0−2.0x106 cells/ml)を、ESF921培地(Expression Systems LLP)中5x105 細胞/mlの、通気閉口を有する1L使い捨て培養フラスコに播種した。フラスコを28℃にて140−150 rpmで振盪させ、フラスコ内の培地容量を経時的に500mlを越えないようにした。細胞密度が500 ml培地中、1.5−2.5 細胞/mlに達すると、感染多重度(MOI)約0.5:1 (pfu:細胞)で高力価組換えバキュロウイルス保存液でフラスコを感染させた。次いで、フラスコを28℃にて140−150 rpmで振盪させた。細胞生存率を毎日チェックし、感染の96時間内に生存率が<50%に落ちない段階で培養物を収獲した。
【0155】
実施例5.V α 免疫グロブリンおよび V β 免疫グロブリンを含むキメラタンパク質の精製:
約5,000 x gで60分間遠心し、次いで0.2μ PES滅菌フィルターユニットで濾過し、細胞および細胞残骸を除去した。プロテインA High−Trap カートリッジ (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ)によるアフィニティークロマトグラフィー、およびその後の50%飽和硫安中の沈降により、清澄な組織培養培地からキメラタンパク質を精製した。精製したキメラタンパク質をサイズ分離し、FPLC クロマトグラフィーにより緩衝液をPBSに交換した。タンパク質精製のために使用したすべての試薬はUSPバイオテクノロジー級(GenAr, Mallinckrot Baker, Parris, KY)であり、製造元によりエンドトキシンは試験されている。滅菌USP級水を使用し、すべての緩衝液および他の溶液を調製した。緩衝液および他の溶液は生物学的安全キャビネット内で調製し、0.2 μm PESフィルターユニットで滅菌濾過した。
【0156】
キメラタンパク質のプロテイン A セファロースアフィニティー精製:
発育している培養フラスコから組織培養培地を取り出し、5,000 x gで60分回転させて細胞および細胞残骸を沈殿させた。得られた上清を0.2 μ PESフィルターユニットで滅菌濾過した。VHおよび/またはVL−免疫グロブリンキメラタンパク質を含む濾過した培地にトリス緩衝液(1M, pH 7.4)を終濃度20mMまで加えた。蠕動ポンプ(Amersham Pharmacia)により、緩衝化組織培養上清をHighTrap組換えプロテインAセファロースアフィニティーカートリッジ5ml上に流速5ml/分で加え、清澄なフラスコ内の流路に集めた。カラムを5 ml/分にてPBS (pH7.4) 25 mlで洗浄した。流れの方向を逆にし、カラムをPBS 25 mlでさらに洗浄した。0.05Mクエン酸(pH 3.5)を1ml/分で逆にカラムに溶出し、画分1mlを集めた。この溶出した1ml画分に1M Tris (pH 9.0)約0.3 ml を加え、そのpHを素早く約8.0に調節した。この同じ方法により、プロテインG、プロテインL(これらに限定されない)または免疫グロブリン結合ドメインを結合できる他のタンパク質を含む他のタンパク質カラムを使用できる。
【0157】
キメラタンパク質の硫安沈降:
プロテインAセファロースから溶出されたVαおよび/またはVβ−Igを含有する画分を分光学的手法により同定した。ピーク画分をあつめ、容量を測定した。混合しながら同量の飽和硫安溶液を滴加した。得られた沈殿物を室温にて15分間放置し、5000xGの遠心にて沈降させた。沈降したVαおよび/またはVβ−Igキメラタンパク質を滅菌水中に再溶解した。High Trap Desalting カートリッジ(Amersham Pharmacia)を用いて、Vαおよび/またはVβ−Igキメラタンパク質をPBSに緩衝液交換し、次いで0.2 μlフィルターで最終的な滅菌濾過を行った。
【0158】
実施例6.キメラタンパク質のキーホールリンペットヘモシニアン( KLH )との会合(コンジュゲート):
精製後、Vαおよび/またはVβ−Igキメラタンパク質をグルタルアルデヒド架橋を介してGMP 級 KLH (VACMUNE, Biosyn Corporation)に次のようにして会合させた。滅菌15ml円錐チューブ中、精製した滅菌イディオタイプキメラタンパク質の少なくとも5mgを同重量のKLHと混合した。1%グルタルアルデヒド(25% 1級 水溶液, Sigma)1mlを終濃度0.1%まで滴加した。次いで、チューブを室温にて4時間ゆっくりと振動させた。滅菌PBS 2Lに対して滅菌DispoDialyzers (Spectrum Labs)にて会合体を透析し、その際、生物学的安全フードにて少なくとも24時間緩衝液を3回交換した。最終的Vαおよび/またはVβ−Igキメラタンパク質−KLH会合体を透析チャンバーから無菌的に取り出し、それを滅菌チューブに移し、混合し、次いでバイアルに分配した。最終産物の各バイアルにロット番号、患者情報、バイアル番号およびそれをバイアルに分配した日付を付した。最終ロットの10%を滅菌性について試験し、またバイアルを選択しエンドトキシンに関して試験した。
【0159】
実施例7.産物試験:
生産ロット上清を含むバキュロウイルスの DNA 配列:
昆虫細胞生産培養上清の試料1mlを収獲し、卓上遠心機にて5分間3000rpmにて回転させ、細胞残骸を除去した。バキュロウイルス粒子を含む、この清澄な上清の少なくとも0.1mlを、細胞溶解緩衝液(10 mM Tris, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1 mg/ml ゼラチン, 0.45% Nonidet P−40, および 0.45% Tween−20)と1:9の容量比で混合し、プロテイナーゼK(終濃度60μg/ml)で1時間60℃のタンパク質分解反応に付し、次いで95℃で15分間変性させた。この細胞溶解液25μlを、400μMの各dNTP、5 mM MgCl2、25 pmol オリゴヌクレオチド(配列番号:32および配列番号:35;または配列番号:36および配列番号:37)(表4参照)、および2.5 U Taqポリメラーゼ(ロッシュ)を含む蒸気の細胞溶解緩衝液25μlとさらに混合し、PCR反応を行った。サイクリング条件は、(I) 92℃での2分間の初期変性、(ii) その後の、92℃、58℃および72℃でのそれぞれ1分間の40サイクル、および(iii) 72℃での7分間の最終伸張。PCR産物は、アガロースゲル電気泳動により、予想サイズおよび量について評価した。次いで、2つまたはそれ以上の裸のプライマーを使用し、PCR産物の配列決定を直接行った。完全なVαおよび/またはVβヌクレオチド配列を、OpenGene Automated DNA Sequencing System (Visible Genetics)および上記の配列決定分析ソフトウエアを用いて決定し、その患者イディオタイプに対応するpTRABac(NHL−FV−8786−XXX)ベクターのV−遺伝子配列と比較した。
【0160】
抗ヒト IgG ELISA の免疫グロブリン検定を用いたキメラタンパク質の分析:
炭酸緩衝液中、ヤギ抗−ヒトIgG重鎖特異的抗体(Fischer, Pittsburgh, PA)の3 μg/ml希釈液100 μlでマイクロタイタープレートを被覆し、TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5) 100 μlで2回洗浄した。次いで、22℃にて1時間、ウエルをTBSB (TBS + 1% BSA) 200μlでブロックした。2倍連続希釈の希釈試料100μl をウエルに加え(2回操作)、22℃にて1時間インキュベートした。この分析を、精製ヒトIgG1/κまたはIgG1/γ標準品(Sigma, St. Louis, MO)を用いて繰り返した。ウエルをTBST (TBS + 0.1% Tween 20) 200μlで4回洗浄した。検出抗体、ヤギ−抗−ヒト H および L−HRP (Goat−anti−Human H and L−HRP、Chemicon, Temecula, CA)をTBSBで1:2000に希釈し、その100μlをウエルに加え、22℃にて1時間インキュベートした。ウエルをTBST200μlで6回洗浄した。基質(TMB 1 component, KPL Inc., Gaithersburg, MD)100μlをウエルに加え、30分間発色させ、試料をOD650クロマトグラムにより測定した。Hi Trap Desalting カラムから溶出された主要なタンパク質ピークはヒトIgG ELISA活性と対応しなければならない。
【0161】
実施例8.キメラタンパク質の濃度および純度:
生産上清におけるバキュロウイルスのVαおよび/またはVβ遺伝子のDNA配列は、生産ベクターのDNA配列と一致していなければならない。キメラタンパク質の濃度はOD280に基づいて0.5mg/mlを越えなければならず、ヒトIgG ELISA活性と対応しなければならない。
以下の表4は最終産物の同一性を確立するのに使用されるプライマー配列の概要である。
【0162】
【表4】
【0163】
実施例9. Vαおよび/またはVβ−Igキメラタンパク質および/またはそのサイトカインとの結合体(会合体)の同時投与
ハツカネズミT細胞リンパ腫系統であるRMAにより発現されるTCR Vβ12遺伝子(Van Hallら、Identification of a Novel Tumor−Specific CRL Epitope Presented by RMA, EL−4, and MBL−2 Lymphomas Reveals Their Common Origin. J. Immunol., 165:869−877; 2000に記載)を、メリチンリーダーペプチドの末端40ヌクレオチドおよびハツカネズミVβ12の最初の20ヌクレオチドを含有する5’ヌクレオチド(配列番号56:TTACTAGTTT TTATGGTCGT GTACATTTCT TACATCTATG CTGACGCTGG AGTTACCCAG A)、ならびにハツカネズミCbおよびヒトIgG1の5’末端に相補的な3’オリゴヌクレオチド(配列番号57:AGGAGACCTT GGGTGGAGTC GGGCCCTTCA GATCCTC)を用いて先に記載のようにクローニングした。得られたPCR産物(図X、最終ページを参照のこと)をpTRABacHuLCκHCγ 1のSpe I/Apa I部位にクローニングしてベクターpTRABacHuLCκVβ −RMAHCγ 1を得た。TCR Vβ −RMAHCγ 1キメラタンパク質を昆虫細胞中に生じさせ、先に記載のように精製した。このようなタンパク質の例(図9)について、C57/B16マウスに10,000 RMA T細胞リンパ腫細胞を植え付け、続いて36時間後に、RMA−特異的Vβ−Igキメラタンパク質(500 μg/mlの濃度)をサイトカインGM−CSF(100,000 IU/mlの濃度)とともに含む組成物を用いて処置した。このワクチンを、毎日、1x+GM−CSF x3で与えた。正確な処置プロトコルを14日間の間をおいて後、繰り返した。この方法で注射したマウスのうち60%が腫瘍移植の40日後に生存していたが、他方、腫瘍投与したコントロールマウスのうち90%より多くが死亡した。
【0164】
RMA Vb PCR産物の配列は以下の通りである(ミツバチメリチンシグナル配列を含む)。
【数1】
【0165】
本発明を完全に記載したので、当業者であれば、広範な範囲の等価なパラメーター、濃度および条件内で、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、そして過度の実験を伴うことなく、本発明が行われうることを理解する。
本発明は特定の実施態様に関連付けて説明したが、さらに変更し得ることが理解されるであろう。この適用は、本発明の原則、ならびに本発明が属する分野の既知または慣習的な実施内に入り、かつ添付の請求の範囲の範囲内に入る先に記載の本質的な特徴に当てはめることができるような本発明の開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変動、用途または適合を保護することを意図している。
【図面の簡単な説明】
【図1】T細胞媒介性病態を有する患者のT細胞由来の特定のTCRのVαまたはVβに対するキメラタンパク質を含有する組成物を調製するための概略である。
【図2】多重クローニング部位を有するバキュロウイルス発現ベクターp2Bacのプラスミド地図である。
【図3】バキュロウイルス発現ベクターp2BacのDNA配列(配列番号:5)である。5’から3’方向へ描いている。p2BacベクターはAcNPVポリヘドリン遺伝子プロモーター(GenBank 受入番号 X06637 (配列番号:44)のヌクレオチド1 から120)、およびAcMNPV p10プロモーター(GenBank 受入番号 A28889 (配列番号:45)のヌクレオチド8から237)を含んでいる。
【図4】プラスミドpTRABac/9F12のDNA配列である。このプラスミドは、安定なヒト細胞系統9F12(配列番号:41)から発現される重鎖および軽鎖(κ)の遺伝子を含有する。9F12細胞系統は破傷風トキソイド特異的なヒトIgG1/κ抗体を産生する。下線部分は成熟9F12 IgGγ1(TTTACCC....)およびカッパ(ATCGACA...)鎖をそれぞれコードする配列である。配列は5’から3’方向へ描いている。
【図5A】IgGγ1およびκ定常領域を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターpTRABacHuLCκHCγ1のプラスミド地図である。
【図5B】IgGγ1およびλ定常領域を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターpTRABacHuLCλHCγ1のプラスミド地図である。
【図6A】pTRABacHuLCκHCγ1(配列番号:6)のDNA配列である。5’から3’方向へ描いている。
【図6B】pTRABacHuLCλHCγ1(配列番号:7)のDNA配列である。5’から3’方向へ描いている。
【図6C】カッパスタッフプライマー(配列番号:42)を利用する修飾後におけるpTRABacHuLCκHCγ1のDNA配列である。5’から3’方向へ描いている。
【図6D】ラムダスタッフプライマー(配列番号:43)を利用する修飾後におけるpTRABacHuLCλHCγ1のDNA配列である。5’から3’方向へ描いている。
【図7】TCRアルファ鎖およびベータ鎖の代表的タンパク質配列である。両配列の定常領域に下線を施し、免疫グロブリン折り畳みの最初のシステイン残基に二重線を付している(配列番号:24および配列番号:25)。
【図8A】VαおよびVβの挿入部位を示す、IgGγ1およびκ定常領域を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターpTRABacHuLCκHCγ1のプラスミド地図である。
【図8B】VαおよびVβの挿入部位を示す、IgGγ1およびλ定常領域を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターpTRABacHuLCλHCγ1のプラスミド地図である。
【図9】TCR Vβ−Igキメラタンパク質製剤による腫瘍担持マウスの処置である。
Claims (56)
- 患者のT細胞媒介性病態を改変する方法であって、
T細胞媒介性病態を有する患者のT細胞由来の特定のTCRに関連するTCRのVβまたはVα領域の少なくとも一部、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含むキメラタンパク質を含有する組成物を投与し、
それにより患者におけるT細胞媒介性病態を改変させる、ことを特徴とする方法。 - 該組成物がさらに、TCRのVαまたはVβ領域の少なくとも一部、および第2の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む第2のキメラタンパク質を含有する、請求項1記載の方法。
- 免疫グロブリン定常領域がヒトIgGγ1定常領域を含む、請求項1記載の方法。
- キメラタンパク質のVαまたはVβ領域がVβである、請求項1記載の方法。
- キメラタンパク質のVαまたはVβ領域がVαである、請求項1記載の方法。
- キメラタンパク質がさらに、VαまたはVβ領域と免疫グロブリン定常領域の一部との間に、TCRのCβまたはCα領域の一部であってCβまたはCα領域の全ての領域でないリンカー領域、または合成リンカー領域を含む、請求項1記載の方法。
- 第2のキメラタンパク質がさらに、VαまたはVβ領域と免疫グロブリン定常領域の一部との間に、TCRのCβまたはCα領域の一部であってCβまたはCα領域の全ての領域でない第2のリンカー領域、または合成リンカー領域を含む、請求項2記載の方法。
- 第1のキメラタンパク質のTCRのVαまたはVβ領域がVβであり、第2のキメラタンパク質のTCRのVαまたはVβ領域がVαである、請求項1または2記載の方法。
- 第2の免疫グロブリン定常領域がヒトκまたはλ定常領域を含む、請求項2記載の方法。
- TCRのVβ領域が全Vβ領域である、請求項1または2記載の方法。
- Vβ領域が全Vβ領域を含み、Cβの一部がTCR β鎖定常領域(Cβ)由来の最初の9個のアミノ酸を含む、請求項1または2記載の方法。
- TCRのVα領域が全Vα領域である、請求項1または2記載の方法。
- Vα領域が全Vα領域を含み、リンカー領域が、TCR α鎖定常領域(Cα)由来の最初の9個のアミノ酸を含む、請求項6または7記載の方法。
- 第1または第2の免疫グロブリン定常領域が、ヒトIgGγ1定常領域、ヒトIgGγ2定常領域、ヒトIgGγ3定常領域、ヒトIgGγ4定常領域、ヒトIgA1定常領域、ヒトIgA2定常領域、ヒトIgM定常領域、ヒトIgD定常領域、ヒトIgE定常領域、ヒトκ鎖定常領域、およびヒトγ鎖定常領域のなかから選ばれる、請求項1または2記載の方法。
- 該キメラタンパク質が、
T細胞媒介性病態を有する患者のT細胞由来の特定のTCRのVβまたはVα領域をコードする遺伝子を単離し、
TCRのVβまたはVα領域をコードする該遺伝子、リンカー領域および免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子を、該第1のキメラタンパク質を発現できる発現ベクターに挿入し、
得られた発現ベクターを昆虫細胞系統に挿入し、キメラタンパク質を産生させ、そして
得られたキメラタンパク質を単離する、ことにより調製される、請求項1記載の方法。 - TCRのVβまたはVα領域のいずれかをコードする遺伝子、リンカー領域および第2の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部をコードする遺伝子を、該発現ベクターに挿入し、第2のキメラタンパク質を発現させる工程をさらに含む、請求項15記載の方法。
- 第1または第2のキメラタンパク質のリンカー領域が、TCRのCβまたはCα領域の一部であってCβまたはCα領域の全ての領域でない、または合成リンカー領域である請求項15または16記載の方法。
- キメラタンパク質を担体タンパク質に会合させる工程をさらに含む、請求項15または16記載の方法。
- 担体タンパク質がキーホールリンペットヘモシニアン(KLH)である、請求項18記載の方法。
- 組成物をさらに、サイトカインまたはケモカインと同時投与する、請求項1記載の方法。
- サイトカインが顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF)である、請求項20記載の方法。
- ケモカインが単球走化性タンパク質3(MCR3)である、請求項20記載の方法。
- 発現ベクターがバキュロウイルス発現ベクターである、請求項15記載の方法。
- バキュロウイルス発現ベクターがミツバチメリチン分泌シグナル配列およびヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列を含む、請求項23記載の方法。
- バキュロウイルス発現ベクターが、ミツバチメリチンを制御するバキュロウイルスAcNPV p10プロモーター、およびヒト胎盤アルカリホスファターゼを制御するAcNPVポリヘドリンプロモーターをさらに含む、請求項24記載の方法。
- TCRのVβ領域をコードする遺伝子および第1の免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子がバキュロウイルス発現ベクターにおいて該p10プロモーターにより制御され、そしてTCRのVα領域をコードする遺伝子および第2の免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子がバキュロウイルス発現ベクターにおいてポリヘドリンプロモーターにより制御されている、請求項25記載の方法。
- TCRのVβまたはVα領域をコードする遺伝子および免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子がバキュロウイルス発現ベクターにおいて、該p10プロモーターまたはポリヘドリンプロモーターのいずれかにより制御されている、請求項25記載の方法。
- 第1の免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子がヒトIgGγ1遺伝子を含有する、請求項15記載の方法。
- 第2の免疫グロブリン定常領域がヒトκまたはλ定常領域遺伝子を含む、請求項16記載の方法。
- 免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子が、ヒトIgGγ1定常領域、ヒトIgGγ2定常領域、ヒトIgGγ3定常領域、ヒトIgGγ4定常領域、ヒトIgA1定常領域、ヒトIgA2定常領域、ヒトIgM定常領域、ヒトIgD定常領域、ヒトIgE定常領域、ヒトκ鎖定常領域、およびヒトγ鎖定常領域のなかから選ばれる、請求項15または16記載の方法。
- 第1のキメラタンパク質がTCR Vβ−Cβ−IgGγ1、TCR Vα−Cα−κまたはTCR Vα−λである、請求項15記載の方法。
- 第1および第2のキメラタンパク質がTCR Vβ−Cβ−IgGγ1およびTCR Vα−Cα−κまたはTCR Vβ−Cβ−IgGγ1およびTCR Vα−Cα−λである、請求項16記載の方法。
- 昆虫細胞系統がTrichoplusia ni (Hi−5)またはSpodoptera frugiperda (sf9)細胞系統である、請求項13記載の方法。
- キメラタンパク質の発現をELISAにより分析する、請求項15または16記載の方法。
- キメラタンパク質を、プロテインA、プロテインG、プロテインLおよび、免疫グロブリン結合ドメインと結合できる他のタンパク質のなかから選ばれるタンパク質を用いて単離する、請求項15または16記載の方法。
- 免疫グロブリン結合ドメインと結合できる他のタンパク質が抗−免疫グロブリン抗体である、請求項35記載の方法。
- T細胞媒介性病態がT細胞リンパ腫である、請求項1記載の方法。
- T細胞媒介性病態が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、糖尿病、炎症性大腸疾患、重症筋無力症、慢性関節リウマチおよび甲状腺炎のなかから選ばれる自己免疫疾患である、請求項1記載の方法。
- 患者のT細胞媒介性病態を改変するための組成物であって、T細胞媒介性病態を有する患者のT細胞クローン由来の特定のTCRに関連するVβまたはVα領域の少なくとも一部、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含むキメラタンパク質を含有する組成物。
- キメラタンパク質がさらに、VαまたはVβ領域と免疫グロブリン定常領域の一部との間に、TCRのCβまたはCα領域の一部であってCβまたはCα領域の全ての領域でないリンカー領域、または合成リンカー領域を含む、請求項39記載の組成物。
- T細胞媒介性病態を有する患者のT細胞クローン由来の特定のTCRに関連するTCRのVβまたはVα領域の少なくとも一部、および第2の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む第2のキメラタンパク質、をさらに含有する、請求項39記載の組成物。
- キメラタンパク質がさらに、VαまたはVβ領域と免疫グロブリン定常領域の一部との間に、TCRのCβまたはCα領域の一部であってCβまたはCα領域の全ての領域でないリンカー領域、または合成リンカー領域を含む、請求項40記載の組成物。
- キメラタンパク質が請求項13または14の方法により調製される、請求項39または40記載の組成物。
- 免疫グロブリン定常領域が、ヒトIgGγ1定常領域、ヒトIgGγ2定常領域、ヒトIgGγ3定常領域、ヒトIgGγ4定常領域、ヒトIgA1定常領域、ヒトIgA2定常領域、ヒトIgM定常領域、ヒトIgD定常領域、ヒトIgE定常領域、ヒトκ鎖定常領域、およびヒトγ鎖定常領域のなかから選ばれる、請求項39または40記載の組成物。
- 免疫グロブリン定常領域が、TCRのVβ領域と作動可能に連結されたIgGγ1定常領域を含む、請求項39記載の組成物。
- 免疫グロブリン定常領域が、TCRのVα領域と作動可能に連結されたκまたはλ定常領域を含む、請求項39記載の組成物。
- 2つのキメラタンパク質がVβ−IgGγ1およびVα−κまたはVβ−IgGγ1およびVα−λである、請求項40記載の組成物。
- 担体タンパク質をさらに含有する、請求項39または40記載の組成物。
- 担体タンパク質がキーホールリンペットヘモシニアン(KLH)である、請求項48記載の組成物。
- サイトカインまたはケモカインとともに同時に投与される、請求項39または40記載の組成物。
- サイトカインが顆粒球−マクロファージ−CSFである、請求項50記載の組成物。
- ケモカインが単球走化性タンパク質3(MCR3)である、請求項50記載の組成物。
- 免疫療法剤をさらに含む、請求項39または40記載の組成物。
- T細胞媒介性病態がT細胞リンパ腫である、請求項39記載の組成物。
- T細胞媒介性病態が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、糖尿病、炎症性大腸疾患、重症筋無力症、慢性関節リウマチおよび甲状腺炎のなかから選ばれる自己免疫疾患である、請求項39記載の組成物。
- 注射、吸入、経口または経皮的に投与される、請求項39記載の組成物。
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