JPH03287070A - フィブリノペプタイドＢβ↓１‐↓４↓２の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はＦＰＢβ、−４２を特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体を利用した試料中のＦＰＢβ、−４２の測定
方法に関するものである。

（従来の技術） 血栓症や血栓症を伴い易い病態の患者では、血液はいわ
ゆる凝固亢進状態にあることが指摘されており、血液凝
固亢進状態は何等かの原因による血管向凝固系の活性化
によると考えられている。

血液凝固はカスケード反応により進行するが、その中に
フィブリノゲンーフィプリン系があり、フィブリノゲン
の分解に関与するトロンビン等の酵素活性の上昇は、す
なわち血管向凝固系の活性化を意味する。

フィブリノゲンは分子量約３４００００の糖タンパク質
で、Ａα、Ｂβおよびγ鎖の各ポリペブタイド鎖が一対
ずつ計６本の２量体の形をとり、Ｓ−８結合で連結され
ている。血液凝固系が活性化されると、フィブリノゲン
はトロンビンによりフィブリンに転換されるが、この過
程は一連の血液凝固過程のうち最終段階に位置する中心
的反応である。まずトロンビンがフィブリノゲンに作用
するとＡα鎖Ｎ末端近傍のＡｒｇｌＢとｃ＋ｙｉ７の間
が切断され、Ａｌａｌ−ＡｒｇｌＢというフィブリノペ
プタイドＡ　（ＦＰＡ）が生じる。ＦＰＡを遊離したも
のはｄｅｓフィブリンモノマーとなり、フィブリンの結
合を担う部分が露出される。さらに、トロンビンが作用
することによりフィブリンに転換されるが、Ｂβ鎖Ｎ末
端近傍の＾ｒｇ１４とＧｌｙ１５の間が切断され１４個
のアミノ酸からなるフィブリノペプタイドＢ　（ＦＰＢ
）が遊離し、これによりフィブリンの結合に関与する部
分が露出する。フィブリンはモノマーからポリマーへと
重合し、さらに活性化Ｘ■因子による架橋形成を経て安
定化フィブリンとなる。

一方、線溶系の活性化により生したプラスミンは、Ｂβ
ＭＮ末端側のＡｒｇ４２−ＡＩａ４３の結合を切断する
ため、フィブリノゲンあるいはｄｅｓＡフィブリンモノ
マーにプラスミンが作用すると、Ｂβ鎖からはフィブリ
ノペプタイドＢ１−４２を生し、ＦＰＢを放出したのち
のフィブリンにプラスミンが作用すると、フィブリノペ
プタイドＢβ１．．４２が遊離することになる。Ｆ　Ｐ
　Ｂ　Ｂ　、４２とＦＰＢβ１５−４２は、いずれもプ
ラスミンにより遊離したベプタイドであるため、ＦＰＢ
β、−４２は一次線溶を、ＦＰＢβ１．−４２は二次線
溶を反映していることになる。

現時点では、ＦＰＢβ１−４２は放射免疫測定法（ＲＩ
　Ａ）あるいは酵素免疫測定法（ＥＩＡ）により測定さ
れているが、両者とも競争法と呼ばれるタイプの測定法
である。しかし、ＲＩＡはそれに使用される試薬の取扱
いこ多大な注意を要するだけでなく、特別な施設も必要
とされる。また、競争法でのＥＩＡは感度が比較的低い
という欠点を有している。

（発明が解決しようとする課題） 上述したように従来の方法は諸問題を有しており、本発
明の目的はその様な問題点を解決し、簡便な測定法を提
出することにある。すなわち、難しいとされてきたアミ
ノ酸４２残基のペプチドであるＦＰＢβ１−４２に対す
るサンドウィッチ系を確立し、・検出感度に支障をきた
すことなく上記問題を解決することである。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは従来技術の問題点を解決すべく、操作が簡
便で測定精度の高いＦＰＢβ、−４２の測定方法につい
て鋭意検討したところ、これらの問題点を解決できるこ
とを見出だし、本発明を完成させた。すなわち、本発明
は試料中のフィブリノペプタイドＢβ１−４２を測定す
る方法において、（ａ）　　・フィブリノペプタイドＢ
β１−４２を特異的に認識する、固相に固定化されたモ
ノクローナル抗体 ・試料 及び ・固定化モノクローナル抗体とは異なる部位でフィブリ
ノペブタイドＢβ１−４２を特異的に認識する、標識さ
れたまたは標識されていないモノクローナル抗体 とを接触させ、 （ｂ）　（ａ）で標識されていないモノクローナル抗体
を使用した場合には、そのモノクローナル抗体又はａで
生しる免疫反応生成物を特異的に認識する標識された抗
体を接触させ、 （ｃ）遊離の標識された抗体を除去し、（（１）標識を
直接的または間接的に検出して、免疫反応生成物を定量
する 工程からなることを特徴とする試料中のフィブリノベプ
タイドＢβ１−４２の測定法を提供するものであり、以
下その詳細について説明する。

本発明は、抗原であるＦＰＢβ、−４２の上において、
認識部位の異なる２種類のモノクローナル抗体を用いて
サンドウィッチ法による免疫測定法により、ＦＰＢβ１
−４２を定量することを特徴とするＦＰＢβ、−４２の
測定法である。具体的には、例えばモノクローナル抗体
はＦＰＢβ１−４２のアミノ末端側を認識するものとカ
ルボキシル末端側を認識するものとを作製して免疫測定
法に供すればよい。

本発明方法において、用いられるモノクローナル抗体は
、それ自体公知である方法（Ｇ、ケーラー＆Ｃ，ミルシ
ュタイン、ネーチャー、第２５６巻２４９５頁、１９７
５年）に準じて製造することができる。以下、本発明に
使用するモノクローナル抗体の製造法について詳細に説
明する。

（Ａ）抗原感作動物細胞の調製 ＦＰＢβ、−４２を動物に免疫する。免疫動物はマウス
、ウサギ、ヤギ等、一般に免疫用動物として用いられて
いるものが用いられ、好ましくはＢａｌ　ｂ　／　ｃマ
ウスのように後述の骨髄腫細胞がセル・ラインとして確
立している種類のものが使用されるが、特に限定されな
い。免疫方法についても何ら限定されるものはない。

（Ｂ）腫瘍細胞の調製 上記Ａ項で用いた免疫用動物に対応する腫瘍細胞を必要
量培養する。腫瘍細胞は例えば５Ｐ２１０　／　Ａ　ｇ
　１４のような８−アザグアニンを含む培養液にて成育
し、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む
培養液にて成育できないなどの性質を有するもの、すな
わち培養液成分によって選択可能なセル・ラインとして
確立されたものを用いる。

（ｃ）細胞融合 細胞融合は公知である方法（Ｇ、ケーラー＆Ｃ。

ミルシュタイン、ネーチャー、第２５６巻。

４９５頁、１９７５年）に準じて行なうことができる。

ただし、電気的に融合する方法も用いられ、特に限定さ
れない。

（Ｄ）抗ＦＰＢβ、−４２抗体の精製 上記方法により得られたハイブリドーマの産生ずるモノ
クローナル抗体を、通常タンパク質の精製に用いられる
方法により精製する。

（Ｅ）抗ＦＰＢβ１−４２抗体の固定化本発明方法に用
いられる抗体を固相に固定化する方法は、公知の方法を
採用でき、固相としては例えば、ポリスチレン、ポリエ
チレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、セファロ
ース粒子、ラテックス、アガロース、セルロース、ポリ
メタアクリレートなどが使用される。

（Ｆ）標識抗体の調製 抗ＦＰＢβ１−４２抗体を標識する場合、その標識化の
方法とその検出方法もなんら限定されるものでなく、公
知の方法により標識化および検出することができる。標
識として間接的に検出されるもの、例えば酵素を用いる
場合、標識物質としては例えば、ペルオキシダーゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ウ
レアーゼ、カタラーゼ、β−グルクロニダーゼなどの酵
素が使われる。標怠として直接的に検出されるもの、例
えば放射性物質としては、３Ｈ，’２５Ｉ、　または１
３１■等が、蛍光物質を使用する方法としては、例えば
、フルオレスカミン、フルオレラセンチオシアネート、
テトラローダミンイソチオシアネート等が常法によりモ
ノクローナル抗体に結合される。しかしながら、標識物
質は上記物質に何ら限定されるべきものではない。

また標識されていない抗ＦＰＢβ、−４２抗体を用いた
場合には、その抗体又はその免疫反応生成物を特異的に
認識する標識された抗体を用いる。その際の標識も前述
と同様のものが用いられる。

以上のような固定化抗ＦＰＢβ１−４２抗体及び標識化
抗体を用いて、試料中のＦＰＢβ１−４２をサンドイッ
チ測定法で測定することができる。このとき、固定化抗
体、標識化抗体、及び試料を接触させる順序には特に限
定はない。そして生成した免疫反応生成物を遊離の標識
化抗体と分離し、標識を直接的又は間接的に検出すれば
よい。

（発明の効果） （１）試料中のＦＰＢβ、−４２濃度は、０．１〜２０
０ｎｇ／ｍｌの範囲内で測定することができ、（２）従
来法に比べて、極めて簡便な操作で短時間に、かつ感度
よく多数の検体の測定が可能である。

（実施例） 以下に本発明の詳細な実施例を説明する。しかし本発明
は、これら実施例のみに限定されるものではない。

実施例１ 酵素標識法によるＦＰＢβ１−４２の測定（１）抗原感
作動物細胞の調製 Ｂａ１ｂ／ｃｖウス（♀）をＦＰＢβ、−４２で免疫し
た。免疫は、マウスの腹腔にフロイントの完全アジュバ
ントとＦＰＢβ１−４２１００μｇ／匹とを乳化させた
試料１００μｍを投与した。２週間後に追加免疫として
ＦＰＢβ、−４２１００μｇ／匹をフロイントの不完全
アジュバントと乳化させたもの１００μｍをマウス腹腔
に投与した。１週間後最終免疫としてＦＰＢβ１−４２
１００μｇ／匹をリン酸緩衝化生理食塩水（０，８５％
ＮａＣ１含有０．０１％リン酸緩衝液、ｐＨ７，２：以
下ＰＢＳ）に溶解したちの１００μｍを腹腔内に投与し
た。３日後この処置マウスの膵臓を無菌的に取出した。

１５％子牛脂児血清（以下１５％ＦＣＳと省略する）を
含むＤＭＥＭＩ○ｍ１を注射器で吸い取り２７ゲージの
注射針をつけた。膵臓を氷冷しておいたデイツシュに入
れ、注射針で数か新式をあけた。注射針を差し込み還流
し膵臓細胞をデイツシュに流出させた。流出液をナイロ
ンメツシュで濾過し遠心チューブに入れ、１１０００ｒ
ｐで１０分間遠心分離して上澄をすてた。細胞ベレット
中の赤血球を０．１５Ｍ塩化アンモニウム溶液（１ｍＭ
エチレンジアミン４酢酸−２ナトリウム塩（以下ＥＤＴ
Ａと省略する）を含む０．０１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ７，
２）で溶血させ遠心分離し、さらに細胞ベレットをＤＭ
ＥＭで２回同様に遠心洗浄して牌細胞とした。

（ｎ）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としてはＢａ　１　ｂ　／　Ｃマウス由来の
８−アザグアニン耐性株として、ＳＰ２１０−Ａｇ１４
（以下Ｓ　Ｐ　２１０と省略する）を使用した。

細胞融合を行う１週間前まで２０μｇ　／　ｍ　］の］
］］８−アザグアニン１５％Ｆを含むＤＭＥＭで培養し
、その後細胞融合臼まで１５％ＦＣ８を含むＤＭＥＭを
使用した。細胞融合直前に、５Ｐ２１０は無菌的にＤＭ
ＥＭで１１００Ｏｒｐで１０分間遠心洗浄を２回繰り返
し調製した。

（ｍ）細胞融合 上記（１）項で調製した膵臓細胞と上記（ＩＩ）項で調
製した骨髄腫細胞を５＝１の割合で混合遠心（１０００
ｒｐｍ、１０分）し細胞ベレットを集めた。遠心チュー
ブを軽くたたいて細胞ベレットを壁面にうずく広げた。

その中に３７℃に暖めておいた５０％ＰＥＧ（ＭＥＲＫ
社製ポリエチレングリコール４０００）を含むＤＭＥＭ
溶液０．５ｒｎｌを遠心チューブを回しながら少しずつ
滴下した。１分間ゆっくりと遠心チューブを回転させ混
合した後、３０秒に１ｍｌの割合で遠心チューブを回転
しながら３７℃に加温しておいたＤＭＥＭを１０回加え
た。つぎにＦｅ２を２ｍｌゆっくりと入れ、１１０００
ｒｐ、１０分間遠心した。細胞ベレットを１５％ＦＣ５
とＩ　Ｘ　１０−４Ｍヒボキサンチン、４　Ｘ　１０−
７Ｍアミノプテリン、１．６Ｘ１０−５Ｍチミジンを含
むＤＭＥＭ　（以下ＨＡＴ培地と省略する）で２回遠心
洗浄（１０００ｒｐｍ、１０分間）した。この培養液を
９６ウエルプレート（Ｆａ　１　ｃｏｎ＃３０４２）に
５Ｘ１０５細胞個／ウェルになるように２００μｍずつ
分注した。３日目ごとにＨＡＴ培地を１００１１１／ウ
エル交換した。３週間後からは、１Ｘ１０−’Ｍヒポキ
サンチン、１°６　Ｘ　１０−’Ｍチミジンと１５％Ｆ
Ｃ５を含むＤＭＥＭ（以下ＨＴ培地と省略する）を培地
交換に用いた。

（ＩＶ）ハイブリドーマの選択 ９６ウエルプレートに細胞コロニーが認められる１００
日目後から固相酵素免疫測定法を行い、培養上清に抗Ｆ
ＰＢβ、−４２抗体が存在するかどうか調べた。

９６ウエルイムノプレート平底（インターメッド社製）
に、ＦＰＢβ１−４２２　ｕ　ｇ　／　ｍ　１を５０μ
ｍ／ウェル分注し、３７℃で１．５時間静置した。ウェ
ルに残っている溶液を除去し、ＰＢＳに０．０４％ツイ
ーン（Ｔｗｅｅｎ）　−２０を含んだ溶液（以下ＰＢＳ
−Ｔ）で３回洗浄した後、０．１％ＢＳＡを溶解したＰ
ＢＳ−Ｔ溶液３００μｌを各ウェルに加えて、３７℃で
１．５時間ブロッキング処理した。つぎに各ウェルに上
記培養上清を１００μｍずつ分注し３７℃で１．５時間
静置した。これらのウェルをＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄
した後、ペルオキシダーゼ標識ラビット抗マウスＩｇＧ
抗体（ジャクソン社製＞４０００倍希釈を５０μｌ／ウ
エルずつ分注し、３７℃で１．５時間静置した。ＰＢＳ
−Ｔ溶液で３回洗浄したのち、基質溶液（１，２％　２
，２−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン硫酸）
−ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び０．０１％過酸化
水素（Ｈ２Ｏ２）を含有する０、１Ｍクエン酸緩衝液（
ｐＨ５，１，））を各ウェルに１００μｍ添加した。３
０分間室温で放置し、２００ｍＭシュウ酸溶液を１００
μｍ加えて酵素反応を停止させた。４１５ｎｍでの吸光
度を測定し、酵素活性が認められたウェルに抗ＦＰＢβ
、−４°抗体を産生ずるハイブリドーマが存在すること
がわかる。以上のようにして、抗体価の強い抗体産生ノ
＼イブリドーマを取得した。

（Ｖ）コンデショニングメデウムの調製２６ゲージの注
射針をつけた注射器に１０ｍ１の冷蔵しておいた０、３
４Ｍサッカロース溶液を吸い取った。Ｂａ１ｂ／ｃマウ
ス（♂）をを椎脱臼させ、無菌的に腹腔内に上記溶液を
注入した。

注入後５分以内に左側腹部に１８ゲージの注射針をつけ
氷冷しておいた注射器にて腹腔内溶液を回収した。氷冷
しておいた遠心チューブに上記回収液を流し込み、１１
０００ｒｐで５分間遠心分離した。遠心後上清を廃棄し
、細胞ベレットに１５％ＦＣ８−ＤＭＥＭを加え攪拌し
ブツシュに入れた。３７℃、５％炭酸ガス濃度、９５％
湿度で一晩培養した。培養上清を集め、０．２２μｍの
メンブレンフィルターで濾過し、これをコンデショニン
グメデウムとした。

（ＶＩ）クローニング 抗体産生を認めるハイブリドーマについて限界希釈法を
用いて単一クローンにした。上記（Ｖ）項で作製したフ
ンデショニングメデウムを１ｍｌ含むＨＡＴ培地２０ｍ
１を用意した。クローニングしたいハイブリドーマ細胞
を各ウェルに１個になるように上記培養液中に調整し、
２００μｍ／ウェルすつ９６ウエルプレート（Ｆａｌｃ
ｏｎ＃３０４２　）に分注した。培養１０日目前後から
細胞コロニーか認められるウェルについて、上記ＣＩＶ
）項に記載した固相酵素免疫測定法に準じて抗ＦＰＢβ
１−４２抗体産生ノ＼イブリドーマを選択し、さらに再
度クローニングを繰り返し単一ノ＼イブリドーマを樹立
した。最終的に７クローンのｌ＼イブリドーマを確立し
た。

（■）抗ＦＰＢβｌ−４２抗体の精製 Ｂ　ａ　１　ｂ　／　ｃマウス（♂）６〜１０週令の腹
腔にブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン）を０．５ｍｌ／匹投与した。２週間後上記
（Ｖｌ）項で得られた抗ＦＰＢβ１−４２抗体産生ハイ
ブリドーマ株をマウス腹腔内に各クロンについて２Ｘ１
０６細胞個／匹移植した。

１０日目前後に生成した腹水を、１８ゲージの注射針を
腹腔に差し込み、１／２０量の０，２Ｍ・ＥＤＴＡをい
れた遠心チューブに滴下させた。遠心チューブを４００
Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、上清を集めた。採取した上
清を５０％硫酸アンモニウム沈殿分画法にしたがって粗
精製し、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ溶液
に透析後、イオン交換クロマトグラフィー　ゲル濾過を
おこない精製した。メルカプトエタノール還元下での５
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（１２％Ｔ）で１本
の重鎮と１本の軽鎖の２本のバンドになったことで抗体
の純度を確認した。

以上の方法により、ＦＰＢβ１−４２を特異的に認識す
る複数種のモノクローナル抗体を得た。それぞれの抗体
の結合定数は、１０７〜ＩＯＩＩＭ−１の範囲内であっ
た。

（■）抗ＦＰＢβ１−４２抗体の固定化未処理マイクロ
タイタープレート（９６ウエル・ヌンクプレート、イン
ターメッド社製）の各ウェルに０，１Ｍ炭酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ９，６）に溶解した３μｇ／ｍｌのマウス
由来の抗ＦＰＢβ、−４２抗体（名称Ａ）の溶液２００
μｍを加えて、４℃−夜インキユベートした。次に、各
ウェルの溶液を除去し、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、
０．１％ＢＳＡを溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液３００μｍを
各ウェルに加えて、４℃でブロッキング処理しそのまま
保存した。

（■）西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰ）標識
抗体の調製 ０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，１）に溶解
したＨＲＰ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）に１％１−フルオロ−
２，４−ジニトロベンゼンのエタノール溶液０．１ｍｌ
を加え、室温にて１時間反応させた。その溶液に０．０
６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１．０ｒｎ３を添加し３０分
反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリウムを０．１６
Ｍのエチレングリコール１．Ｏｍｌを加えて除去した後
、０°０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）で透
析した。次に、マウス由来抗ＦＰＢβ、−４２モノクロ
一ナル抗体（名称Ｂ０モノクローナル抗体Ａとは異なる
抗原部位を認識するもの）５ｍｇを加えて５〜６時間反
応させた。水素化ホウ素ナトリウム５ｍｇを添加して４
℃中で一夜放置した。

この後、未反応の水素化ホウ素ナトリウムを除去するた
め、０．８５％塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７，１）に対して４℃で一夜攪拌
しながら透析した。上記反応物をＴＳＫ−ゲルＧ−３０
００ＳＷ（東ソー株式会社製、商品名）を用いて高速液
体クロマトグラフィーにて精製し、ＨＲＰＩｌ識抗体と
した。

（Ｘ）試料中のＦＰＢβ１−４２の定量本実施例中の（
■）で記述した方法で作製したマイクロタイタープレー
トを室温にもどし、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後、ＦＰ
Ｂβ、−４２を含む標準試料を各ウェルにそれぞれ２０
μｍ加えた。つぎに本実施例（ＩＸ）で得たＨＲＰ標識
抗体をＰＢＳ−Ｔ溶液で希釈し、各ウェルに２００μｍ
ずつ添加した。そのまま室温で３時間インキュベートし
た後、溶液を除去しＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。そ
れに、１．２％　２，２−アジノジ−（３−エチルベン
ズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及
び０．０１％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有する０、１
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，１）から成る基質溶液を各
ウェルに２００μｍ添加し、室温で３０分間酵素反応さ
せた後、２００ｍＭシュウ酸溶液を１００μｍ加えて酵
素反応を停止させた。上記マイクロタイタープレートを
各ウェルについて、波長４１５ｎｍ、対照波長４９２ｎ
ｍの吸光強度を自動マイクロタイタープレートリーダー
（東ソー株式会社製、ＭＰＲ−Ａ４、商品名）で測定し
た結果を表１に示す。表１から明らかなように、試料中
のＦＰＢβ１−４２は０．１〜２００ｎｇ／ｍ＋の範囲
で定量できることが確認された。

表１ 特許出痴人 東ソー株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 試料中のフィブリノペプタイドＢβ＿１＿−＿４＿２を
   測定する方法において、 （ａ）・フィブリノペプタイドＢβ＿１＿−＿４＿２を
   特異的に認識する、固相に固定化されたモノクロー ナル抗体 ・試料 及び ・固定化モノクローナル抗体とは異なる部位でフィブリ
   ノペプタイドＢβ＿１＿−＿４＿２を特異的に認識する
   、標識されたまたは標識されて いないモノクローナル抗体 とを接触させ、 （ｂ）（ａ）で標識されていないモノクローナル抗体を
   使用した場合には、そのモノクローナル抗体又はａで生
   じる免疫反応生成物を特異的に認識する標識された抗体
   を接触させ、 （ｃ）遊離の標識された抗体を除去し、 （ｄ）標識を直接的または間接的に検出して、免疫反応
   生成物を定量する 工程からなることを特徴とする試料中のフィブリノペプ
   タイドＢβ＿１＿−＿４＿２の測定法。