JPH03285693A - ヒト肝実質細胞増殖因子の生産方法および該因子を産生する形質転換体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は少なくとも蛋白質発現に必要なプロモーター配
列、シグナルペプチド様配列、ヒト肝実質細胞増殖因子
をコードするＤＮＡ配列及びターミネータ−配列を有す
る発現ベクターにより形質転換された形質転換体、さら
にその形質転換体を培養することによりかかるヒト肝実
質細胞増殖因子を産生する方法に関する。

（従来の技術） 肝臓は、生体中唯−再生可能な臓器である。この肝再生
現象は肝移植実験や体液交流実験などから何らかの液性
因子によることが示唆されてきた。近年、本発明者らは
肝実質細胞を生体内より取り出し生体外においてその増
殖を促進させるヒト由来の蛋白性因子すなわち、ヒト肝
実質細胞増殖因子（以下ｒ　ｈＨＧＦ　Ｊと略ず。）を
劇症肝炎患者血漿より見いだしくバイオメディカルリサ
ーチ（Ｂｉｏｍｅｄ、　Ｒｅｓ、）　６巻２３１頁（１
９８５）及びエクスペリメンタルセルリサーチ（Ｅｘｐ
、　Ｃｅ１１．　Ｒｅｓ、）　１６６巻１３９頁（１９
８６）　）、世界で初めて単一の蛋白質として精製する
ことに成功した（特開昭６３−２２５２６号公報及びジ
ャーナルオブクリニカルインベステイゲーション（Ｊ、
　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、）　８１巻４１４頁（１
９８８）　）。さらにｈＨＧＦ蛋白質をコードする遺伝
子を単離するに至った（特許出願済（特願平１−２０９
４４９号）及びバイオケミカルバイオフイジカルリサー
チコミニコーケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｕｎ、）　１６３巻９６７
頁（１９８９））。

このｈＨＧＦ蛋白質はシグナル様ペプチド配列から数え
、４９４個のアミノ酸からなるＨ鎖ペプチドと２３４個
のアミノ酸からなるＬ鎖ペプチドより構成される蛋白質
で少なくとも４箇所に糖鎖結合部位を持つことを特徴と
する。これら２つのペプチド鎖はジスルフィド結合（Ｓ
　−Ｓ結合）により結合しており、肝実質細胞の増殖を
生体外に於いて促進する活性が認められている（バイオ
ケミカルバイオフイジカルリサーチコミニュケーション
（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｕｎ、）　１６３巻９６７頁（１９８
９）　）。各ペプチド鎖１７− １８− の遺伝子はＨ鎖及びＬ鎖ペプチドの順に連なった形でコ
ードされている。そのため−本のＲＮＡ上に転写され、
同時に一つの蛋白質として翻訳される。その後Ｎ末端側
に存在するシグナル様配列の切断除去が起こりさらにそ
れ以降の一本の蛋白銀が二本に切断される。これによっ
て生じた二本のペプチド鎖はＳ−８結合を介して機能的
な蛋白質を形成すると考えられる。

（発明が解決しようとする問題点） このｈＨＧＦ蛋白質の生化学的ならびに生理的機能を明
らかにすることは肝再生機構の解明のみならず、生体外
における安定な肝実質細胞の供給ならびに肝疾患に対す
る治療薬の開発に重要な役割を担ってくる。しかしなが
らｈＨＧＦ蛋白質の生体における詳細な機能、あるいは
肝障害時における肝再生に対するｈＨＧＦ蛋白質の効果
等を調べるためには多量のｈＨＧＦ蛋白質を必要とする
。

ところが現在に至るまでｈＨＧＦ蛋白質を取得する方法
としては、劇症肝炎患者血漿を材料として、その中に微
量に存在するｈＨＧＦ蛋白質の精製を行わざるをえなか
った。この方法は人的、時間的、価格的に必ずしも容易
な方法ではなく、またウィルスなどを始めとした感染源
の存在する患者血漿中から微量なｈＨＧＦ蛋白質のみを
安定にとりだすことは困難を極める。これらの理由から
劇症肝炎患者血漿を材料としたｈＩ−ＩＧＦ蛋白質の安
定かつ大量の精製は行われていなかった。

（問題点を解決するための手段） そこで本発明者らは、ｈＨＧＦ蛋白質を絹換えＤＮＡ技
術により安定かつ大量に取得するため種々の検討をした
結果、この目的に有用なｈＨＧＦ蛋白質をコードする遺
伝子を含む発現ベクターを新たに構築しｈＨＧＦ蛋白質
の発現を可能にした。

即ち、本発明の要旨は、第２図で表わされるｈＨＧＦ遺
伝子を有する発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得
られる形質転換体を培養してｈＨＧＦを生産することを
特徴とするｈＨＧＦの生産方法および該因子を産生ずる
形質転換体に存する。

以下に、本発明を説明する。

ｈＨＧＦ蛋白質の工業生産のためには、その蛋白質発現
が安定した宿主−ベクター系を選択すること、さらに発
現したｈＨＧＦ蛋白質が生物学的活性すなわち肝実質細
胞の増殖活性を有している必要がある。特に天然のｈＨ
ＧＦ蛋白質が糖蛋白質であること、またｈＨＧＦ蛋白質
が多くのシスティン残基を含み、そのシスティン残基間
のチオール結合の位置および蛋白質の高次構造が活性維
持に重要であることを考慮する必要がある。

このような場合、宿主としては酵母や大腸菌例えば、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株や
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＹＡ−２１株等の微
生物も使用することが出来るが、動物細胞例えばＣＨＯ
細胞、ＣＯ８細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７，ｌ
１１１１胞、マウスＦＭ３Ａ細胞等を用いて上記遺伝子
を発現させることが望ましい。

またこれらの細胞を宿主とする場合は、第１図に示すＤ
ＮＡ配列中に含まれるシグナル様配列すなわち１から８
７番目、１から９３番目を含む未成熟のり、ＨＧ、Ｆ遺
伝子を細胞内に導入することにより、成熟型り、Ｔ（Ｇ
Ｆ蛋白質が細胞外に分泌生産されることが期待されると
いう利点が挙げられる。

本発明において用いられる発現ベクターは、そのプロモ
ーター下流にｈＨＧＦ蛋白質の一部または全部のアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ断片を有する。

プロモーターとしては、種々のプロモーターが報告され
ているが、本発明においては、ＳＶ４０プロモーターま
たはメタロチオネイン遺伝子のプロモーターが好ましい
。このプロモーターの下流に前述のシグナル様配列を含
む未成熟のｈＨＧＦ遺伝子のＤＮＡ断片を転写方向に従
って挿入する。この場合、ｈＨＧＦ遺伝子のＤＮＡ断片
を２−３個結合したものを挿入してもよいし、また、ｈ
ＨＧＦ遺伝子のＤＮＡ断片の５′上流側にプロモーター
を結合したＤＮＡ断片を単位とし、転写方向を揃えて２
−３個結合したものを挿入してもよい。

上記り、ＨＧＦ遺伝子には、その下流にポリアデニル化
部位が存在することが必要である。例えば、８Ｖ４０Ｄ
ＮＡ、　ｓ−グロビン遺伝子またはメタロチオネイン遺
伝子由来のポリアデニル化部位がｈＨＧＦ遺伝子の下流
に１つ存在することが必要である。ま１− ＝２２ た、ｈＨＧＦ遺伝子にプロモーターを結合したＤＮＡ断
片を２−３個タンデムに挿入する方法を用いた場合には
、各ｂ−ＨＧＦ遺伝子の３′側にそれぞれポリアデニル
化部位を存在させることが可能である。

上記の発現ベクターを用いて動物細胞例えばＣＨＯ細胞
を形質転換する際には、選択マーカーを用いることが望
ましい。選択マーカー遺伝子を該発現ベクターのポリア
デニル化部位下流に順方向あるいは逆方向に挿入してお
くと、形質転換体を得る際に、選択マーカー遺伝子を含
む別のプラスミドを二重形質転換する必要がない。この
ような選択マーカーとしては、メトトレキセート剛性を
与えるＤＨＦＲ遺伝子（ジャーナルオブモレキュラバイ
オロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）　１５９巻６
０１頁（１９８２）　）、抗生物質Ｇ　−４１８耐性を
与えるＮｅｏ遺伝子（ジャーナルオブモレキュラアプラ
イドジェネティクス（Ｊ。

Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、）　１巻３２７頁
（１９８２）　）、ミコフェノール酸耐性を与える大腸
菌由来のＥｃｏｇｐｔ遺伝子（プロシーディングアンド
ナショナルアカデミーオブサイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）　７
８巻２０７２頁（１９８１）　）、抗生物質ハイグロマ
イシン耐性を与えるｈｐｈ遺伝子（モレキュラセルバイ
オロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、）　５巻
４１０頁（１９８５）　）等が挙げられる。これらの各
耐性遺伝子の５′上流側にはプロモーター、例えば前述
のＳＶ４０由未のプロモーターが挿入されており、また
、各剛性遺伝子の３′下流側には、前述のポリアデニル
化部位が含まれる。

発現ベクターに上記のような選択マーカー遺伝子が挿入
されていない場合には、形質転換体の選択のマーカーを
有するベクター例えばｐｓＶ２ｎｅ。

（ジャーナルオブモレキュラアプライドジエネティクス
（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、）　１巻
３２７頁（１９８２）　）、ｐＭＢＧ（ネイチャー　（
Ｎａｔｕｒｅ）　２９４巻２２８頁（１９８１））、ｐ
ｓＶ２ｇｐｔ　（プロシーディングアンドナショナルア
カデミーオブサイエンス（Ｐｒｅｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ。

Ａ、）　７８巻２０７２頁（１９８１）　）、ｐＡｄ−
Ｄ２６−１（ジャーナルオブモレキュラバイオロジー（
Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）　１５９巻６０１頁（１
９８２）　）　（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１５９
．６０１　（１９８２）　）などをｈＨＧＦ遺伝子の発
現ベクターと共に二重形質転換し、選択マーカー遺伝子
の表現形質により形質転換体を容易に選択できる。

以上のような方法で、選択されるｈＨＧＦ蛋白質遺伝子
を含有する細胞について選択マーカーを変更して二重形
質転換を繰り返すことは、約２０倍程度発現量を上昇さ
せ得るので好ましい。

発現ベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法
（ビルオオジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　５２巻４５６頁
（１９７３））、エレクトロポレーション法（ジャーナ
ルオブメンブレンバイオロジー（Ｊ、　Ｍｅｍｂｒ、　
Ｂｉｏｌ、）　１０巻２７９頁（１９７２）　）等が挙
げられるが、リン酸カルシウム法が一般的である。

形質転換された動物細胞の培養は、常法により浮遊培養
または付着培養で行うことができる。培地としては、Ｍ
ＥＭ、　ＲＰＭＩｉ６４０などを用い、５−１０％血清
存在下もしくは適当量のインシュリン、デキサメザゾン
、トランスフェリンの存在下、もしくは無血清下にて培
養する。

ｈＨＧＦ蛋白質を産生じている動物細胞はその培養上溝
中に産生されたｈＨＧＦ蛋白質を分泌することから、こ
の組換え体の培養上清を用いｈＨＧＦ蛋白質の分離精製
を行うことが可能である。具体的には生産されたｈＨＧ
Ｆ蛋白質を含む培養上清を各種クロマトグラフィー、例
えば、Ｓ−セファロース、ヘパリンセファロース、ハイ
ドロキシアパタイトもしくは硫酸化セルロファイン等を
組み合わせたクロマトグラフィーにて精製することによ
り、ｈＨＧＦ蛋白質を単離精製することができる。

（実施例） 以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが
、その要旨を越えない限り、以下の実施例に限定される
ものではない。

実施例１ ［１１ｈＨＧＦ蛋白質発現プラスミドの調製第３図にｈ
ＨＧＦ蛋白質発現プラスミドの調製方法を示す。ｈＨＧ
ＦｃＤＮＡ　（バイオケミカル・アン１乙バイオフイジ
カル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂ、　Ｂ、　Ｒ
，Ｃ第１６３巻（２）　９６７頁−９７３頁（１９８９
）　）を含む力、ｍ　ＨＴ−に１曳Ｉ断片ずなわちｈＨ
ＧＦ蛋白翻訳開始点ＡＴＧより２７塩基上流のＢａｍＨ
Ｉ切断点から終止コドンＴＡＧより８塩基」−流の均里
Ｉ切断点まで＝２５ ＝２６ の領域をカバーする約２．３ｋｂのＢａｍ　ＨＩ　−掬
狙Ｉ断片を含むプラスミドｐＵｃＨＧＦＩＤＮＡを常法
（「モレキュラー・クローニング］、コールド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボラトリ−１９３頁（１９８２）　
）により調製した。

次に該プラスミドＤＮＡ１０．ｇを常法に従い制限酵素
均ｍ■で切断し、得られたＤＮＡ断片を常法に従いフェ
ノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈澱によ
り該ＤＮＡ断片を精製し１０，６の水に溶解した。

さらにこのＤＮＡ断片の絢ｍＩ切断点に第３図に示す両
末端が制限酵素にｍ１切断点をもちかつ内部に終止コド
ンＴＧＡ及び制限酵素ＢａｍＨＩ切断点を含む３２塩基
の合成リンカ−をＭａｎｉａｔｉｓらの方法（［モレキ
ュラー・クローニング］、コールド・スプリング・バー
バー・ラボラトリ−１３９６頁−３９７頁（１９８２）
　）に従い導入した。

これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた
形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法（［モレキュラ
ー・クローニング」、コールド・スプリング・ハーバ−
・ラボラトリ−１９３頁（１９８２））ニより調製した
。

次に該プラスミドＤＮＡ　１０　ｐｇを常法に従い制限
酵素ＢａｍＨＩで切断し、この制限酵素反応液を１．０
％アガロースゲルによって電気泳動をすることにより目
的の開始コドンＡＴＧと終止コドンＴＧＡを含むｈＨＧ
ＦＤＮＡ断片をベクター等の目的以外のＤＮＡ断片と分
離した。Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（［モレキュラー・
クローニング］、コールｌ乙スプリング・ハーバ−・ラ
ボラトリ−１１６４頁（１９８２）　）に従いアガロー
スゲル断片から目的とするｈＨＧＦ遺伝子をコードする
約２．３ｋｂの顯皿ＨＩ　−Ｂａｍ　ＨＩＤＮＡ断片を
調製した。得られたＤＮＡ断片の末端矛常法に従いＴ４
ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端にした後フェノール・
クロロホルム抽出を行い、エタノール沈澱により該ＤＮ
Ａ断片を精製し１０　ＩＪｅの水に溶解した。

一方、発現ベクターｐＫＣＲ（プロシーディング・アン
ド・ナチュラル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　７８巻１
５２７頁（１９８１）　）　０．０５１．１ｇは予め常
法に従い平滑末端を生じる制限酵素ＳｍａＩで切断し、
フェノール、クロロホルム抽出を行いエタノール沈澱に
より精製した。これを４００回の５０ｍＭ）リス−塩酸
（ｐＨ８）、１ｍＭ塩化マグネシウム溶液に溶解したの
ちバクチリアルアルカリホスファターゼ（東洋紡、ＢＡ
Ｐ−１０１）　１ユニットを添加し、６５６Ｃ下３０分
の反応を施し脱燐酸化処理を行った。次にこの反応液か
らフェノール・クロロホルム抽出とエタノール沈澱によ
り該ＤＮＡ断片を精製し１０ばの水に溶解した。

上記の様に調製したｐＫＣＲベクターのＤＮＡ断片０．
０１　、ｇと前述の平滑末端化されたｈＨＧＦｃＤＮＡ
の阿ＨＩ断片０．１μｇを含む反応液（６６Ｉ１１１Ｍ
　）リス塩酸ｐＨ７，６，６，６ｍ、Ｍ塩化マグネシウ
ム１０ｍＭジチオスレイトール、６６μＭＡＴＰ）　２
０　、ｅ中にて１４°Ｃで１２時間Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（東洋紡ＬＧＡ−１０１）による結合反応を行った。こ
のＴ４ＤＮＡリガーゼ反応液１０　、ｅを用いて大腸菌
ＨＢ　１０１株（全酒造）を説明書に従い形質転換し、
アンピシリンを５０１１ｇ　／ｒｎ、ｅの濃度で含む培
地」ユで培養することにより数十個のアンピシリン耐性
株を得た。

これらの組換え体をＭａｎｉａｔｉｓらの方法（［モレ
キュラ・クローニング」、コール１乙スプリング・ハー
バ−・ラボラトリ、８６頁〜９６頁（１９８２）　）に
従い解析することにより、発現ベクターｐＫＣＲのプロ
モーターとポリアゾニレ−ジョン部位の中間に存在する
制限酵素ＳｍａＩ切断部位にｈＨＧＦ遺伝子が順方向に
二連結したプラスミド、ｐＫＣＲＨＧＦ　−２プラスミ
ドを得ることが出来た。

その構造を第４図に示す。

［ＩＩ］　　ｈＨＧＦ蛋白質を継代的に発現する細胞株
の取得 実施例１　［Ｉ］により作製された発現ベクターｐＫＣ
Ｒ（プロシーデング・アン１乙ナチユラル・アカデミ−
・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、）　７８巻（２）　１５２７頁（１９８１
））の制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位にｈＨＧＦｃＤＡＮ
が二個挿入されたプラスミドｐＫＣＲＨＧＦ　−２をＭ
ａｎｉａｔｉｓらの方法（［モレキュラー・クローニン
グ１、コール１乙スプリング・ハーバ−・ラポラＩ・ツ
ー１８６頁〜９６頁（１９８２）　）に従い組換え２９
− ３０− 体の大腸菌から回収、精製しＨＧＦ発現プラスミドＤＮ
Ａを大量に得た。

一方形質転換細胞選択用のマーカーをコードするプラス
ミドｐｓＶ２ｎｅｏ　（ジャーナル・オブ・アプライ１
乙ジエネテイクス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉ
ｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）１巻３２７頁（１９８２）　
）を有する組換え体の大腸菌およびｐＡｄ−Ｄ２６−１
（ジャーナル・オブ・モレキュラ・バイオロジー（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇ
ｙ）第１５９巻６０１頁（１９８２）　）を有する絹換
え体の大腸菌から前述のＭａｎｉａｔｉｓらの方法に従
い該プラスミドＤＮＡを回収、精製した。

得られた三種のプラスミドＤＮＡを用いてＡｕ５ｕｂｅ
ｌらの方法（カレント・プロトコール・イン。

モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ）、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・アン
ド・ウィリーインターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗ
ｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）　９−１−１章
〜９・１・４章（１９８７）　）を基にＣＨＯ細胞に二
重形質転換してＣＨＯ細胞を形質転換した。

即ち、まず直径９ｃｍのシャーレの中でＦｅ２　（牛胎
児血清）が１０％人ったＥＲＤＦ培地（極東製薬社製）
中でＣＨＯ細胞をセミコンフルエントな状態になるまで
培養した。次にシャーレから培地を除きそこにＤＮＡ溶
液を滴加するが、該ＤＮＡ溶液は予め次に示す手順に従
って調製した。

まず直径９ｃｍのシャーレ−枚につき３００μぞの２ｘ
　ＨＥＢＳ溶液（２Ｘ　ＨＥＢＳ溶液；１．６％塩化ナ
トリウム、０．０７４％塩化カリウム、０．０５％５％
燐酸水素二ナトリウム１塩、０．２％デキストロース、
１％ＨＥＰＥＳ（ｐ：Ｅ（７，０５））と１０　、ｇの
プラスミドＤＮＡおよびＩＶＩｇのｐｓＶ２ｎｅｏプラ
スミドＤＮＡ、１．ｇのｐＡｄ　−Ｄ２６−１プラスミ
ドＤＮＡを加え、滅菌された水で５７０　ＩＩｅに合わ
せた溶液をエッペンドルフ遠心管中に準備する。次に該
ＤＮＡ溶液に３０１Ｊｅの２．５Ｍの塩化カルシウム溶
液を滴加しながらポルテックスミキサーを用い数秒間激
しく混和する。これを室温で３０分間放置するが、その
間およそ１０分おきにポルテックスミキサーで混和する
。

この様にしてできたＤＮＡ溶液を前述の細胞にかけて室
温で３０分間静置した。その後ＦＣ８が１０％入ったＥ
ＲＤＦ培地９　ｍｅをシャーレに入れて、５％ＣＯ２存
在下、３７°Ｃで４〜５時間培養した。次にシャーレか
ら培地を除き５　ｍ６のＩ　Ｘ　ＴＢＳ　＋十溶液（Ｉ
ＸＴＢＳ＋十溶液；　２５　ｍＭ　）リス−塩酸（ｐＨ
７，５）、１４０ｍＭ塩化すトリウム、５ｍＭ塩化カリ
ウム、０．６ｍＭ燐酸水素二ナトリウム、０．０８　ｍ
Ｍ塩化カルシウム、０．０８ｍＭ塩化マグネシウム）で
細胞を洗浄し、Ｉ　Ｘ　ＴＢＳ＋十溶液全溶液した後、
グリセロールを２０％含むＩＸＴＢＳ＋十溶液５ｍぞを
、細胞にかけて、室温で１〜２分間静置し、上清を除去
した。その後５　ｍｅのＩ　Ｘ　ＴＢＳ＋十溶液全溶液
を再び洗浄し、Ｆｅ２が１０％人ったＥＲＤＦ培地１０
ｍ６をシャーレに入れて５％ＣＯ２存在下、３７°Ｃで
培養した。培養後、４８時間が経過した時点で培地を除
き、５　ｍｅのＩ　Ｘ　ＴＢＳ＋十溶液全溶液を洗浄し
た後、細胞にトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（シグマ社）　
２　ｍｌをかけ、室温で３０秒静置した。その後、トリ
プシン−ＥＤＴＡ溶液を除き、それから５分後にＦｅ２
が１０％人ったＥＲＤＦ培地１０ｍ６をシャーレに入れ
て細胞を剥がし、９ｃｍシャーレ−枚分の細胞を９ｃｍ
シャーレ１０枚に分けて薬剤Ｇ４１８　（Ｇ４１８硫酸
塩（ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ）　；ＧＩＢＣＯ社）を２００
　ｐｇ　／　ｍｅの濃度になるように加えて培養を続け
た。その後１０日が経過した時点で生き残ったＧ４１８
に耐性の細胞を単Ｆｊｌｔ　Ｌ、一つの培養用の穴がお
よそ３．１　ｃｍ２の２４穴の培養皿を用い、それぞれ
Ｆｅ２が１０％入ったＥＲＤＦ培地１培地１マｅ中そ７
日間培養し直した。

以上の細胞の培地をＦｅ２を含まないＥＲＤＦ培地に代
えて培養を続け７２時間が経過した細胞の培地を個別に
２ｍ／集め、それをセントリコン濃縮器（ミリボア社）
で５０　、ｅに遠心濃縮してそのうちの約１５μｅをサ
ンプルとして、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行った。

これを常法に従いウェスタンプロット法で解析しｈＨＧ
Ｆ蛋白質の発現を確認した。

また、Ｇｏｈｄａらの方法（エクスペリメンタル・セル
・リサーチ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒ
ｅ５ｃｅｒｃｈ）　１６６巻１３９頁〜１５０頁（１９
８６）　）によりｈＨＧＦ活性を測定し生物学的活性の
存在を確認した。

３− ４− さらに得られた細胞株は個別に単離され酵素イムノアッ
セイ法を行いｈＨＧＦ蛋白質の定量を行った。

その結果、発現量の確認された細胞株Ｂ−１，Ｂ−２７
、Ｂ−１０２を得た。

実施例２ ［Ｉ　］　　ｈＨＧＦ遺伝子を有する発現ベクターを用
いて繰り返し形質転換して得られる、ｈＨＧＦ蛋白質を
継代的に発現する細胞株の取得 実施例１−［Ｉ］により取得した、ｈＨＧＦ遺伝子発現
ベクターｐＫＣＲＨＧＦ　−２及びミコフェノール酸耐
性の形質転換細胞選択用のマーカーをコードするプラス
ミドｐＭＢＧ　（Ｎａｔｕｒｅ　２９４．２２８　（１
９８１）　）を有する絹換え体の大腸菌から、前述のＭ
ａｎｉａｔｉｓらの方法に従い該プラスミドＤＮＡを回
収、精製した。

得られた二種のプラスミドＤＮＡを用いてＡｕ５ｕｂｅ
ｌらの方法（カレント・プロトコール、イン・モレキュ
ラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、グ
リーン・パブリッシング・アソシエイッ・アンｌ乙つイ
リーインターザイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ
−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）　９・１・１章〜９・１
・４章（１９８７））を基に、実施例１−［ＩＩ］によ
って得られたｈＨＧＦ蛋白質を継代的に発現する細胞株
のうり、ｈＩ−ＩＧＦの発現量の多いもの３株（Ｂ−１
、Ｂ−２７、Ｂ−１０２）を単ｊｉｌｔ、　Ｌ、それら
を個別に二重形質転換して該細胞を形質転換した。

すなわち、まず直径９ｃｍシャーレの中でＦｅ２が１０
％入ったＥＲＤＦ培地中で、前述のｈＨＧＦ蛋白質を継
代的に発現する細胞株を個別にセミコンフルエントな状
態になるまで培養した。次にシャーレから培地を除きそ
こにＤＮＡ溶液を滴加するが、該ＤＮＡ溶液は、１０μ
ｇ　（７）　ｐＫＣＲＨＧＦ　−２プラスミドＤＮＡ及
び１．ｇのｐＭＢＧプラスミドＤＮＡを用いる以外は、
実施例１−［ＩＩ］と同様の手順で調製した。

この様にしてできたＤＮＡ溶液を前述の細胞にかけて室
温で３０分間静置した。その後ＦＣ８が１０％入ったＥ
ＲＤＦ培地９　ｍｅをシャーレに入れて、５％ＣＯ２存
在下、３７°Ｃで４〜５時間培養した。次にシャーレか
ら培地を除き５　ｍ４？のＩＸＴＢＳ＋十溶液（前述）
で細胞を洗浄し、Ｉ　Ｘ　ＴＢＳ＋十溶液全溶液した後
、グリセロールを２０％含むＩ　Ｘ　ＴＢＳ＋十溶液５
ｍｅを細胞にかけて、室温で１〜２分間静置し、」−清
を除去した。その後５　ｍｌのＩ　Ｘ　ＴＢＳ＋十溶液
全溶液を再び洗浄し、Ｆｅ２が１０％入ったＥＲＤＦ培
地１０ｍ４？をシャーレに入れて５％ＣＯ２存在下、３
７°Ｃで培養し、４８時間が経過した時点で培地を除き
、５ｍｌのＩＸＴＢＳ＋十溶液で細胞を洗浄した後、細
胞にトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（シグマ社）　２　ｍｅ
をかけ、室温で３０秒静置した。その後、トリプシン−
ＥＤＴＡ溶液を除き、それから５分後にＦｅ２が１０％
入った。−ＭＥＭ（−）培地１０ｍ、／をシャーレに入
れて細胞を剥がし、９ｃｍシャーレ−枚の細胞を９ｃｍ
シャーレ１０枚に分けて薬剤ミコフェノール酸（シグマ
社製）をｌｐｇ／ｍ６及びキザンチン（シグマ社製）を
２５０μｇａｍｅの濃度になるように加えて培養を続け
た。その後１０日が経過した時点で生き残ったミコフェ
ノール酸に耐性の細胞を単離し、一つの培養用の穴がお
よそ３．１　ａｍ２の２４穴の培養皿を用い、それぞれ
Ｆｅ２が１０％入ったＥＲＤＦ培地ｌ　ｍｅ中でおよそ
７日間培養し直した。

以上の細胞の培地をＦｅ２を含まないＥＲＤＦ培地に代
えて培養を続け７２時間が経過した細胞の培地を個別に
２　ｒｍ？集め、それらをセントリコン濃縮器（ミリボ
ア社）で５０　、ｌに遠心濃縮してそのうち約１５μｅ
をサンプルとして５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行った。

これを常法に従いウェスタンプロット法で解析しｈＨＧ
Ｆ蛋白質の発現を確認した。

また、Ｇｏｈｄａらの方法（エクスペリメンタル・セル
・リザーチ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒ
ｅ５ｅｒｃ１１）　１６６巻１３９頁〜１５０頁（１９
８６）　）によりｈＨＧＦ活性を測定し生物学的活性の
存在を確認した。

その結果を第５図に示す。

さらに、得られた細胞株のうちいくつかを個別に単離し
酵素イムノアッセイ法でｈＨＧＦ蛋白質の発現量を確認
した結果、二重形質転換前の細胞株Ｂ−１０２の発現量
のおよそ２０倍の発現量を示す細胞株ＢＤ　−２４を得
た。

（発明の効果） 本発明に係わるｈＨＧＦ遺伝子を挿入された発現３７ ８ ４゜ ベクターを宿主細胞に導入することにより、今まで困難
であった生物学的活性を有するｈＨＧＦ蛋白質を大量、
安定かつ容易に生産することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒト肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子の
塩基配列を表わす。 第２図はヒト肝実質細胞増殖因子をコードする遺。 伝子から推定されるアミノ酸配列を示す。 第３図は、ヒト肝実質細胞増殖因子を発現するベクター
を構築する工程を表わす。 第４図は、本発明のヒト肝実質細胞増殖因子をコードす
るＤＮＡを有する発現ベクターの構造を表わす。 第５図は、本発明のヒＩ・肝実質細胞増殖因子をコード
するＤＮＡを有する発現ベクターを有するＣＨＯ細胞が
産生ずるヒト肝実質細胞増殖因子をを含む培養」二清の
生物学的活性を示したものである。 ９ ト −６ く↓ ヒ （ン （ン ヒ く （］ （ワ ヒ （〕 （９ （〕 Ｃ＋）　　　　　　し　　　　　（９く支＜ｏ　　　　
＜　　　。 （ノ ヒ （ノ ト ≧ 」 」 ヒ ■ く の θつ ｑ。 く フ　　　コ　　　−〇 −ＯＷ （り（り＞Ｃし く （９ くミ ヒ ト ■ Σ ト ト く く く ト ド く 」 ヒ 」 ■ ト 」 工

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記アミノ酸配列で表わされるヒト肝実質細胞増
   殖因子をコードする遺伝子を有する発現ベクターで宿主
   細胞を形質転換し、得られる形質転換体を培養してヒト
   肝実質細胞増殖因子を生産することを特徴とするヒト肝
   実質細胞増殖因子の生産方法。 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】
2. （２）下記塩基配列で表わされる、ヒト肝実質細胞増殖
   因子をコードする遺伝子を有する発現ベクターで宿主細
   胞を形質転換し、得られる形質転換体を培養してヒト肝
   実質細胞増殖因子を生産することを特徴とするヒト肝実
   質細胞増殖因子の生産方法。 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】
3. （３）下記アミノ酸配列で表わされるヒト肝実質細胞増
   殖因子をコードする遺伝子を有する発現ベクターで宿主
   細胞を形質転換して得られる形質転換体に対し、さらに
   該ヒト肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子を有する
   発現ベクターを用いて繰り返し形質転換し、得られる形
   質転換体を培養してヒト肝実質細胞増殖因子を生産する
   ことを特徴とするヒト肝実質細胞増殖因子の生産方法。 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】
4. （４）下記アミノ酸配列で表わされるヒト肝実質細胞増
   殖因子をコードする遺伝子を有する発現ベクターで形質
   転換して得られるヒト肝実質細胞増殖因子を産生する動
   物細胞。 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】