JPH03285693A - ヒト肝実質細胞増殖因子の生産方法および該因子を産生する形質転換体 - Google Patents
ヒト肝実質細胞増殖因子の生産方法および該因子を産生する形質転換体Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は少なくとも蛋白質発現に必要なプロモーター配
列、シグナルペプチド様配列、ヒト肝実質細胞増殖因子
をコードするDNA配列及びターミネータ−配列を有す
る発現ベクターにより形質転換された形質転換体、さら
にその形質転換体を培養することによりかかるヒト肝実
質細胞増殖因子を産生する方法に関する。
列、シグナルペプチド様配列、ヒト肝実質細胞増殖因子
をコードするDNA配列及びターミネータ−配列を有す
る発現ベクターにより形質転換された形質転換体、さら
にその形質転換体を培養することによりかかるヒト肝実
質細胞増殖因子を産生する方法に関する。
(従来の技術)
肝臓は、生体中唯−再生可能な臓器である。この肝再生
現象は肝移植実験や体液交流実験などから何らかの液性
因子によることが示唆されてきた。近年、本発明者らは
肝実質細胞を生体内より取り出し生体外においてその増
殖を促進させるヒト由来の蛋白性因子すなわち、ヒト肝
実質細胞増殖因子(以下r hHGF Jと略ず。)を
劇症肝炎患者血漿より見いだしくバイオメディカルリサ
ーチ(Biomed、 Res、) 6巻231頁(1
985)及びエクスペリメンタルセルリサーチ(Exp
、 Ce11. Res、) 166巻139頁(19
86) )、世界で初めて単一の蛋白質として精製する
ことに成功した(特開昭63−22526号公報及びジ
ャーナルオブクリニカルインベステイゲーション(J、
Cl1n、 Invest、) 81巻414頁(1
988) )。さらにhHGF蛋白質をコードする遺伝
子を単離するに至った(特許出願済(特願平1−209
449号)及びバイオケミカルバイオフイジカルリサー
チコミニコーケーション(Biochem、 Biop
hys、 Res、 Comun、) 163巻967
頁(1989))。
現象は肝移植実験や体液交流実験などから何らかの液性
因子によることが示唆されてきた。近年、本発明者らは
肝実質細胞を生体内より取り出し生体外においてその増
殖を促進させるヒト由来の蛋白性因子すなわち、ヒト肝
実質細胞増殖因子(以下r hHGF Jと略ず。)を
劇症肝炎患者血漿より見いだしくバイオメディカルリサ
ーチ(Biomed、 Res、) 6巻231頁(1
985)及びエクスペリメンタルセルリサーチ(Exp
、 Ce11. Res、) 166巻139頁(19
86) )、世界で初めて単一の蛋白質として精製する
ことに成功した(特開昭63−22526号公報及びジ
ャーナルオブクリニカルインベステイゲーション(J、
Cl1n、 Invest、) 81巻414頁(1
988) )。さらにhHGF蛋白質をコードする遺伝
子を単離するに至った(特許出願済(特願平1−209
449号)及びバイオケミカルバイオフイジカルリサー
チコミニコーケーション(Biochem、 Biop
hys、 Res、 Comun、) 163巻967
頁(1989))。
このhHGF蛋白質はシグナル様ペプチド配列から数え
、494個のアミノ酸からなるH鎖ペプチドと234個
のアミノ酸からなるL鎖ペプチドより構成される蛋白質
で少なくとも4箇所に糖鎖結合部位を持つことを特徴と
する。これら2つのペプチド鎖はジスルフィド結合(S
−S結合)により結合しており、肝実質細胞の増殖を
生体外に於いて促進する活性が認められている(バイオ
ケミカルバイオフイジカルリサーチコミニュケーション
(Biochem、 Biophys。
、494個のアミノ酸からなるH鎖ペプチドと234個
のアミノ酸からなるL鎖ペプチドより構成される蛋白質
で少なくとも4箇所に糖鎖結合部位を持つことを特徴と
する。これら2つのペプチド鎖はジスルフィド結合(S
−S結合)により結合しており、肝実質細胞の増殖を
生体外に於いて促進する活性が認められている(バイオ
ケミカルバイオフイジカルリサーチコミニュケーション
(Biochem、 Biophys。
Res、 Comun、) 163巻967頁(198
9) )。各ペプチド鎖17− 18− の遺伝子はH鎖及びL鎖ペプチドの順に連なった形でコ
ードされている。そのため−本のRNA上に転写され、
同時に一つの蛋白質として翻訳される。その後N末端側
に存在するシグナル様配列の切断除去が起こりさらにそ
れ以降の一本の蛋白銀が二本に切断される。これによっ
て生じた二本のペプチド鎖はS−8結合を介して機能的
な蛋白質を形成すると考えられる。
9) )。各ペプチド鎖17− 18− の遺伝子はH鎖及びL鎖ペプチドの順に連なった形でコ
ードされている。そのため−本のRNA上に転写され、
同時に一つの蛋白質として翻訳される。その後N末端側
に存在するシグナル様配列の切断除去が起こりさらにそ
れ以降の一本の蛋白銀が二本に切断される。これによっ
て生じた二本のペプチド鎖はS−8結合を介して機能的
な蛋白質を形成すると考えられる。
(発明が解決しようとする問題点)
このhHGF蛋白質の生化学的ならびに生理的機能を明
らかにすることは肝再生機構の解明のみならず、生体外
における安定な肝実質細胞の供給ならびに肝疾患に対す
る治療薬の開発に重要な役割を担ってくる。しかしなが
らhHGF蛋白質の生体における詳細な機能、あるいは
肝障害時における肝再生に対するhHGF蛋白質の効果
等を調べるためには多量のhHGF蛋白質を必要とする
。
らかにすることは肝再生機構の解明のみならず、生体外
における安定な肝実質細胞の供給ならびに肝疾患に対す
る治療薬の開発に重要な役割を担ってくる。しかしなが
らhHGF蛋白質の生体における詳細な機能、あるいは
肝障害時における肝再生に対するhHGF蛋白質の効果
等を調べるためには多量のhHGF蛋白質を必要とする
。
ところが現在に至るまでhHGF蛋白質を取得する方法
としては、劇症肝炎患者血漿を材料として、その中に微
量に存在するhHGF蛋白質の精製を行わざるをえなか
った。この方法は人的、時間的、価格的に必ずしも容易
な方法ではなく、またウィルスなどを始めとした感染源
の存在する患者血漿中から微量なhHGF蛋白質のみを
安定にとりだすことは困難を極める。これらの理由から
劇症肝炎患者血漿を材料としたhI−IGF蛋白質の安
定かつ大量の精製は行われていなかった。
としては、劇症肝炎患者血漿を材料として、その中に微
量に存在するhHGF蛋白質の精製を行わざるをえなか
った。この方法は人的、時間的、価格的に必ずしも容易
な方法ではなく、またウィルスなどを始めとした感染源
の存在する患者血漿中から微量なhHGF蛋白質のみを
安定にとりだすことは困難を極める。これらの理由から
劇症肝炎患者血漿を材料としたhI−IGF蛋白質の安
定かつ大量の精製は行われていなかった。
(問題点を解決するための手段)
そこで本発明者らは、hHGF蛋白質を絹換えDNA技
術により安定かつ大量に取得するため種々の検討をした
結果、この目的に有用なhHGF蛋白質をコードする遺
伝子を含む発現ベクターを新たに構築しhHGF蛋白質
の発現を可能にした。
術により安定かつ大量に取得するため種々の検討をした
結果、この目的に有用なhHGF蛋白質をコードする遺
伝子を含む発現ベクターを新たに構築しhHGF蛋白質
の発現を可能にした。
即ち、本発明の要旨は、第2図で表わされるhHGF遺
伝子を有する発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得
られる形質転換体を培養してhHGFを生産することを
特徴とするhHGFの生産方法および該因子を産生ずる
形質転換体に存する。
伝子を有する発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得
られる形質転換体を培養してhHGFを生産することを
特徴とするhHGFの生産方法および該因子を産生ずる
形質転換体に存する。
以下に、本発明を説明する。
hHGF蛋白質の工業生産のためには、その蛋白質発現
が安定した宿主−ベクター系を選択すること、さらに発
現したhHGF蛋白質が生物学的活性すなわち肝実質細
胞の増殖活性を有している必要がある。特に天然のhH
GF蛋白質が糖蛋白質であること、またhHGF蛋白質
が多くのシスティン残基を含み、そのシスティン残基間
のチオール結合の位置および蛋白質の高次構造が活性維
持に重要であることを考慮する必要がある。
が安定した宿主−ベクター系を選択すること、さらに発
現したhHGF蛋白質が生物学的活性すなわち肝実質細
胞の増殖活性を有している必要がある。特に天然のhH
GF蛋白質が糖蛋白質であること、またhHGF蛋白質
が多くのシスティン残基を含み、そのシスティン残基間
のチオール結合の位置および蛋白質の高次構造が活性維
持に重要であることを考慮する必要がある。
このような場合、宿主としては酵母や大腸菌例えば、S
accharom ces cerevisiae株や
Escherichiacoli YA−21株等の微
生物も使用することが出来るが、動物細胞例えばCHO
細胞、CO8細胞、マウスL細胞、マウスC127,l
1111胞、マウスFM3A細胞等を用いて上記遺伝子
を発現させることが望ましい。
accharom ces cerevisiae株や
Escherichiacoli YA−21株等の微
生物も使用することが出来るが、動物細胞例えばCHO
細胞、CO8細胞、マウスL細胞、マウスC127,l
1111胞、マウスFM3A細胞等を用いて上記遺伝子
を発現させることが望ましい。
またこれらの細胞を宿主とする場合は、第1図に示すD
NA配列中に含まれるシグナル様配列すなわち1から8
7番目、1から93番目を含む未成熟のり、HG、F遺
伝子を細胞内に導入することにより、成熟型り、T(G
F蛋白質が細胞外に分泌生産されることが期待されると
いう利点が挙げられる。
NA配列中に含まれるシグナル様配列すなわち1から8
7番目、1から93番目を含む未成熟のり、HG、F遺
伝子を細胞内に導入することにより、成熟型り、T(G
F蛋白質が細胞外に分泌生産されることが期待されると
いう利点が挙げられる。
本発明において用いられる発現ベクターは、そのプロモ
ーター下流にhHGF蛋白質の一部または全部のアミノ
酸配列をコードするDNA断片を有する。
ーター下流にhHGF蛋白質の一部または全部のアミノ
酸配列をコードするDNA断片を有する。
プロモーターとしては、種々のプロモーターが報告され
ているが、本発明においては、SV40プロモーターま
たはメタロチオネイン遺伝子のプロモーターが好ましい
。このプロモーターの下流に前述のシグナル様配列を含
む未成熟のhHGF遺伝子のDNA断片を転写方向に従
って挿入する。この場合、hHGF遺伝子のDNA断片
を2−3個結合したものを挿入してもよいし、また、h
HGF遺伝子のDNA断片の5′上流側にプロモーター
を結合したDNA断片を単位とし、転写方向を揃えて2
−3個結合したものを挿入してもよい。
ているが、本発明においては、SV40プロモーターま
たはメタロチオネイン遺伝子のプロモーターが好ましい
。このプロモーターの下流に前述のシグナル様配列を含
む未成熟のhHGF遺伝子のDNA断片を転写方向に従
って挿入する。この場合、hHGF遺伝子のDNA断片
を2−3個結合したものを挿入してもよいし、また、h
HGF遺伝子のDNA断片の5′上流側にプロモーター
を結合したDNA断片を単位とし、転写方向を揃えて2
−3個結合したものを挿入してもよい。
上記り、HGF遺伝子には、その下流にポリアデニル化
部位が存在することが必要である。例えば、8V40D
NA、 s−グロビン遺伝子またはメタロチオネイン遺
伝子由来のポリアデニル化部位がhHGF遺伝子の下流
に1つ存在することが必要である。ま1− =22 た、hHGF遺伝子にプロモーターを結合したDNA断
片を2−3個タンデムに挿入する方法を用いた場合には
、各b−HGF遺伝子の3′側にそれぞれポリアデニル
化部位を存在させることが可能である。
部位が存在することが必要である。例えば、8V40D
NA、 s−グロビン遺伝子またはメタロチオネイン遺
伝子由来のポリアデニル化部位がhHGF遺伝子の下流
に1つ存在することが必要である。ま1− =22 た、hHGF遺伝子にプロモーターを結合したDNA断
片を2−3個タンデムに挿入する方法を用いた場合には
、各b−HGF遺伝子の3′側にそれぞれポリアデニル
化部位を存在させることが可能である。
上記の発現ベクターを用いて動物細胞例えばCHO細胞
を形質転換する際には、選択マーカーを用いることが望
ましい。選択マーカー遺伝子を該発現ベクターのポリア
デニル化部位下流に順方向あるいは逆方向に挿入してお
くと、形質転換体を得る際に、選択マーカー遺伝子を含
む別のプラスミドを二重形質転換する必要がない。この
ような選択マーカーとしては、メトトレキセート剛性を
与えるDHFR遺伝子(ジャーナルオブモレキュラバイ
オロジー(J、 Mo1. Biol、) 159巻6
01頁(1982) )、抗生物質G −418耐性を
与えるNeo遺伝子(ジャーナルオブモレキュラアプラ
イドジェネティクス(J。
を形質転換する際には、選択マーカーを用いることが望
ましい。選択マーカー遺伝子を該発現ベクターのポリア
デニル化部位下流に順方向あるいは逆方向に挿入してお
くと、形質転換体を得る際に、選択マーカー遺伝子を含
む別のプラスミドを二重形質転換する必要がない。この
ような選択マーカーとしては、メトトレキセート剛性を
与えるDHFR遺伝子(ジャーナルオブモレキュラバイ
オロジー(J、 Mo1. Biol、) 159巻6
01頁(1982) )、抗生物質G −418耐性を
与えるNeo遺伝子(ジャーナルオブモレキュラアプラ
イドジェネティクス(J。
Mo1. Appl、 Genet、) 1巻327頁
(1982) )、ミコフェノール酸耐性を与える大腸
菌由来のEcogpt遺伝子(プロシーディングアンド
ナショナルアカデミーオブサイエンス(Proc、 N
atl、 Acad、 Sci、 U、S、A、) 7
8巻2072頁(1981) )、抗生物質ハイグロマ
イシン耐性を与えるhph遺伝子(モレキュラセルバイ
オロジー(Mo1. Ce11. Biol、) 5巻
410頁(1985) )等が挙げられる。これらの各
耐性遺伝子の5′上流側にはプロモーター、例えば前述
のSV40由未のプロモーターが挿入されており、また
、各剛性遺伝子の3′下流側には、前述のポリアデニル
化部位が含まれる。
(1982) )、ミコフェノール酸耐性を与える大腸
菌由来のEcogpt遺伝子(プロシーディングアンド
ナショナルアカデミーオブサイエンス(Proc、 N
atl、 Acad、 Sci、 U、S、A、) 7
8巻2072頁(1981) )、抗生物質ハイグロマ
イシン耐性を与えるhph遺伝子(モレキュラセルバイ
オロジー(Mo1. Ce11. Biol、) 5巻
410頁(1985) )等が挙げられる。これらの各
耐性遺伝子の5′上流側にはプロモーター、例えば前述
のSV40由未のプロモーターが挿入されており、また
、各剛性遺伝子の3′下流側には、前述のポリアデニル
化部位が含まれる。
発現ベクターに上記のような選択マーカー遺伝子が挿入
されていない場合には、形質転換体の選択のマーカーを
有するベクター例えばpsV2ne。
されていない場合には、形質転換体の選択のマーカーを
有するベクター例えばpsV2ne。
(ジャーナルオブモレキュラアプライドジエネティクス
(J、 Mo1. Appl、 Genet、) 1巻
327頁(1982) )、pMBG(ネイチャー (
Nature) 294巻228頁(1981))、p
sV2gpt (プロシーディングアンドナショナルア
カデミーオブサイエンス(Prec、 Natl、 A
cad、 Sci、 U、 S。
(J、 Mo1. Appl、 Genet、) 1巻
327頁(1982) )、pMBG(ネイチャー (
Nature) 294巻228頁(1981))、p
sV2gpt (プロシーディングアンドナショナルア
カデミーオブサイエンス(Prec、 Natl、 A
cad、 Sci、 U、 S。
A、) 78巻2072頁(1981) )、pAd−
D26−1(ジャーナルオブモレキュラバイオロジー(
J、 Mo1. Biol、) 159巻601頁(1
982) ) (J、 Mo1. Biol、 159
.601 (1982) )などをhHGF遺伝子の発
現ベクターと共に二重形質転換し、選択マーカー遺伝子
の表現形質により形質転換体を容易に選択できる。
D26−1(ジャーナルオブモレキュラバイオロジー(
J、 Mo1. Biol、) 159巻601頁(1
982) ) (J、 Mo1. Biol、 159
.601 (1982) )などをhHGF遺伝子の発
現ベクターと共に二重形質転換し、選択マーカー遺伝子
の表現形質により形質転換体を容易に選択できる。
以上のような方法で、選択されるhHGF蛋白質遺伝子
を含有する細胞について選択マーカーを変更して二重形
質転換を繰り返すことは、約20倍程度発現量を上昇さ
せ得るので好ましい。
を含有する細胞について選択マーカーを変更して二重形
質転換を繰り返すことは、約20倍程度発現量を上昇さ
せ得るので好ましい。
発現ベクターの動物細胞への導入はリン酸カルシウム法
(ビルオオジー(Virology) 52巻456頁
(1973))、エレクトロポレーション法(ジャーナ
ルオブメンブレンバイオロジー(J、 Membr、
Biol、) 10巻279頁(1972) )等が挙
げられるが、リン酸カルシウム法が一般的である。
(ビルオオジー(Virology) 52巻456頁
(1973))、エレクトロポレーション法(ジャーナ
ルオブメンブレンバイオロジー(J、 Membr、
Biol、) 10巻279頁(1972) )等が挙
げられるが、リン酸カルシウム法が一般的である。
形質転換された動物細胞の培養は、常法により浮遊培養
または付着培養で行うことができる。培地としては、M
EM、 RPMIi640などを用い、5−10%血清
存在下もしくは適当量のインシュリン、デキサメザゾン
、トランスフェリンの存在下、もしくは無血清下にて培
養する。
または付着培養で行うことができる。培地としては、M
EM、 RPMIi640などを用い、5−10%血清
存在下もしくは適当量のインシュリン、デキサメザゾン
、トランスフェリンの存在下、もしくは無血清下にて培
養する。
hHGF蛋白質を産生じている動物細胞はその培養上溝
中に産生されたhHGF蛋白質を分泌することから、こ
の組換え体の培養上清を用いhHGF蛋白質の分離精製
を行うことが可能である。具体的には生産されたhHG
F蛋白質を含む培養上清を各種クロマトグラフィー、例
えば、S−セファロース、ヘパリンセファロース、ハイ
ドロキシアパタイトもしくは硫酸化セルロファイン等を
組み合わせたクロマトグラフィーにて精製することによ
り、hHGF蛋白質を単離精製することができる。
中に産生されたhHGF蛋白質を分泌することから、こ
の組換え体の培養上清を用いhHGF蛋白質の分離精製
を行うことが可能である。具体的には生産されたhHG
F蛋白質を含む培養上清を各種クロマトグラフィー、例
えば、S−セファロース、ヘパリンセファロース、ハイ
ドロキシアパタイトもしくは硫酸化セルロファイン等を
組み合わせたクロマトグラフィーにて精製することによ
り、hHGF蛋白質を単離精製することができる。
(実施例)
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが
、その要旨を越えない限り、以下の実施例に限定される
ものではない。
、その要旨を越えない限り、以下の実施例に限定される
ものではない。
実施例1
[11hHGF蛋白質発現プラスミドの調製第3図にh
HGF蛋白質発現プラスミドの調製方法を示す。hHG
FcDNA (バイオケミカル・アン1乙バイオフイジ
カル・リサーチ・コミュニケーション(B、 B、 R
,C第163巻(2) 967頁−973頁(1989
) )を含む力、m HT−に1曳I断片ずなわちhH
GF蛋白翻訳開始点ATGより27塩基上流のBamH
I切断点から終止コドンTAGより8塩基」−流の均里
I切断点まで=25 =26 の領域をカバーする約2.3kbのBam HI −掬
狙I断片を含むプラスミドpUcHGFIDNAを常法
(「モレキュラー・クローニング]、コールド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボラトリ−193頁(1982)
)により調製した。
HGF蛋白質発現プラスミドの調製方法を示す。hHG
FcDNA (バイオケミカル・アン1乙バイオフイジ
カル・リサーチ・コミュニケーション(B、 B、 R
,C第163巻(2) 967頁−973頁(1989
) )を含む力、m HT−に1曳I断片ずなわちhH
GF蛋白翻訳開始点ATGより27塩基上流のBamH
I切断点から終止コドンTAGより8塩基」−流の均里
I切断点まで=25 =26 の領域をカバーする約2.3kbのBam HI −掬
狙I断片を含むプラスミドpUcHGFIDNAを常法
(「モレキュラー・クローニング]、コールド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボラトリ−193頁(1982)
)により調製した。
次に該プラスミドDNA10.gを常法に従い制限酵素
均m■で切断し、得られたDNA断片を常法に従いフェ
ノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈澱によ
り該DNA断片を精製し10,6の水に溶解した。
均m■で切断し、得られたDNA断片を常法に従いフェ
ノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈澱によ
り該DNA断片を精製し10,6の水に溶解した。
さらにこのDNA断片の絢mI切断点に第3図に示す両
末端が制限酵素にm1切断点をもちかつ内部に終止コド
ンTGA及び制限酵素BamHI切断点を含む32塩基
の合成リンカ−をManiatisらの方法([モレキ
ュラー・クローニング]、コールド・スプリング・バー
バー・ラボラトリ−1396頁−397頁(1982)
)に従い導入した。
末端が制限酵素にm1切断点をもちかつ内部に終止コド
ンTGA及び制限酵素BamHI切断点を含む32塩基
の合成リンカ−をManiatisらの方法([モレキ
ュラー・クローニング]、コールド・スプリング・バー
バー・ラボラトリ−1396頁−397頁(1982)
)に従い導入した。
これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた
形質転換体よりプラスミドDNAを常法([モレキュラ
ー・クローニング」、コールド・スプリング・ハーバ−
・ラボラトリ−193頁(1982))ニより調製した
。
形質転換体よりプラスミドDNAを常法([モレキュラ
ー・クローニング」、コールド・スプリング・ハーバ−
・ラボラトリ−193頁(1982))ニより調製した
。
次に該プラスミドDNA 10 pgを常法に従い制限
酵素BamHIで切断し、この制限酵素反応液を1.0
%アガロースゲルによって電気泳動をすることにより目
的の開始コドンATGと終止コドンTGAを含むhHG
FDNA断片をベクター等の目的以外のDNA断片と分
離した。Maniatisらの方法([モレキュラー・
クローニング]、コールl乙スプリング・ハーバ−・ラ
ボラトリ−1164頁(1982) )に従いアガロー
スゲル断片から目的とするhHGF遺伝子をコードする
約2.3kbの顯皿HI −Bam HIDNA断片を
調製した。得られたDNA断片の末端矛常法に従いT4
DNAポリメラーゼにて平滑末端にした後フェノール・
クロロホルム抽出を行い、エタノール沈澱により該DN
A断片を精製し10 IJeの水に溶解した。
酵素BamHIで切断し、この制限酵素反応液を1.0
%アガロースゲルによって電気泳動をすることにより目
的の開始コドンATGと終止コドンTGAを含むhHG
FDNA断片をベクター等の目的以外のDNA断片と分
離した。Maniatisらの方法([モレキュラー・
クローニング]、コールl乙スプリング・ハーバ−・ラ
ボラトリ−1164頁(1982) )に従いアガロー
スゲル断片から目的とするhHGF遺伝子をコードする
約2.3kbの顯皿HI −Bam HIDNA断片を
調製した。得られたDNA断片の末端矛常法に従いT4
DNAポリメラーゼにて平滑末端にした後フェノール・
クロロホルム抽出を行い、エタノール沈澱により該DN
A断片を精製し10 IJeの水に溶解した。
一方、発現ベクターpKCR(プロシーディング・アン
ド・ナチュラル・アカデミ−・オブ・サイエンス(Pr
oc、 Nat、 Acad、 Sci、) 78巻1
527頁(1981) ) 0.051.1gは予め常
法に従い平滑末端を生じる制限酵素SmaIで切断し、
フェノール、クロロホルム抽出を行いエタノール沈澱に
より精製した。これを400回の50mM)リス−塩酸
(pH8)、1mM塩化マグネシウム溶液に溶解したの
ちバクチリアルアルカリホスファターゼ(東洋紡、BA
P−101) 1ユニットを添加し、656C下30分
の反応を施し脱燐酸化処理を行った。次にこの反応液か
らフェノール・クロロホルム抽出とエタノール沈澱によ
り該DNA断片を精製し10ばの水に溶解した。
ド・ナチュラル・アカデミ−・オブ・サイエンス(Pr
oc、 Nat、 Acad、 Sci、) 78巻1
527頁(1981) ) 0.051.1gは予め常
法に従い平滑末端を生じる制限酵素SmaIで切断し、
フェノール、クロロホルム抽出を行いエタノール沈澱に
より精製した。これを400回の50mM)リス−塩酸
(pH8)、1mM塩化マグネシウム溶液に溶解したの
ちバクチリアルアルカリホスファターゼ(東洋紡、BA
P−101) 1ユニットを添加し、656C下30分
の反応を施し脱燐酸化処理を行った。次にこの反応液か
らフェノール・クロロホルム抽出とエタノール沈澱によ
り該DNA断片を精製し10ばの水に溶解した。
上記の様に調製したpKCRベクターのDNA断片0.
01 、gと前述の平滑末端化されたhHGFcDNA
の阿HI断片0.1μgを含む反応液(66I111M
)リス塩酸pH7,6,6,6m、M塩化マグネシウ
ム10mMジチオスレイトール、66μMATP) 2
0 、e中にて14°Cで12時間T4DNAリガーゼ
(東洋紡LGA−101)による結合反応を行った。こ
のT4DNAリガーゼ反応液10 、eを用いて大腸菌
HB 101株(全酒造)を説明書に従い形質転換し、
アンピシリンを5011g /rn、eの濃度で含む培
地」ユで培養することにより数十個のアンピシリン耐性
株を得た。
01 、gと前述の平滑末端化されたhHGFcDNA
の阿HI断片0.1μgを含む反応液(66I111M
)リス塩酸pH7,6,6,6m、M塩化マグネシウ
ム10mMジチオスレイトール、66μMATP) 2
0 、e中にて14°Cで12時間T4DNAリガーゼ
(東洋紡LGA−101)による結合反応を行った。こ
のT4DNAリガーゼ反応液10 、eを用いて大腸菌
HB 101株(全酒造)を説明書に従い形質転換し、
アンピシリンを5011g /rn、eの濃度で含む培
地」ユで培養することにより数十個のアンピシリン耐性
株を得た。
これらの組換え体をManiatisらの方法([モレ
キュラ・クローニング」、コール1乙スプリング・ハー
バ−・ラボラトリ、86頁〜96頁(1982) )に
従い解析することにより、発現ベクターpKCRのプロ
モーターとポリアゾニレ−ジョン部位の中間に存在する
制限酵素SmaI切断部位にhHGF遺伝子が順方向に
二連結したプラスミド、pKCRHGF −2プラスミ
ドを得ることが出来た。
キュラ・クローニング」、コール1乙スプリング・ハー
バ−・ラボラトリ、86頁〜96頁(1982) )に
従い解析することにより、発現ベクターpKCRのプロ
モーターとポリアゾニレ−ジョン部位の中間に存在する
制限酵素SmaI切断部位にhHGF遺伝子が順方向に
二連結したプラスミド、pKCRHGF −2プラスミ
ドを得ることが出来た。
その構造を第4図に示す。
[II] hHGF蛋白質を継代的に発現する細胞株
の取得 実施例1 [I]により作製された発現ベクターpKC
R(プロシーデング・アン1乙ナチユラル・アカデミ−
・オブ・サイエンス(Proc、 Nat、 Acad
、 Sci、) 78巻(2) 1527頁(1981
))の制限酵素BamHI切断部位にhHGFcDAN
が二個挿入されたプラスミドpKCRHGF −2をM
aniatisらの方法([モレキュラー・クローニン
グ1、コール1乙スプリング・ハーバ−・ラポラI・ツ
ー186頁〜96頁(1982) )に従い組換え29
− 30− 体の大腸菌から回収、精製しHGF発現プラスミドDN
Aを大量に得た。
の取得 実施例1 [I]により作製された発現ベクターpKC
R(プロシーデング・アン1乙ナチユラル・アカデミ−
・オブ・サイエンス(Proc、 Nat、 Acad
、 Sci、) 78巻(2) 1527頁(1981
))の制限酵素BamHI切断部位にhHGFcDAN
が二個挿入されたプラスミドpKCRHGF −2をM
aniatisらの方法([モレキュラー・クローニン
グ1、コール1乙スプリング・ハーバ−・ラポラI・ツ
ー186頁〜96頁(1982) )に従い組換え29
− 30− 体の大腸菌から回収、精製しHGF発現プラスミドDN
Aを大量に得た。
一方形質転換細胞選択用のマーカーをコードするプラス
ミドpsV2neo (ジャーナル・オブ・アプライ1
乙ジエネテイクス(Journal of Appli
ed Genetics)1巻327頁(1982)
)を有する組換え体の大腸菌およびpAd−D26−1
(ジャーナル・オブ・モレキュラ・バイオロジー(Jo
urnal of molecular biolog
y)第159巻601頁(1982) )を有する絹換
え体の大腸菌から前述のManiatisらの方法に従
い該プラスミドDNAを回収、精製した。
ミドpsV2neo (ジャーナル・オブ・アプライ1
乙ジエネテイクス(Journal of Appli
ed Genetics)1巻327頁(1982)
)を有する組換え体の大腸菌およびpAd−D26−1
(ジャーナル・オブ・モレキュラ・バイオロジー(Jo
urnal of molecular biolog
y)第159巻601頁(1982) )を有する絹換
え体の大腸菌から前述のManiatisらの方法に従
い該プラスミドDNAを回収、精製した。
得られた三種のプラスミドDNAを用いてAu5ube
lらの方法(カレント・プロトコール・イン。
lらの方法(カレント・プロトコール・イン。
モレキュラー・バイオロジー(Current Pro
tocols inMolecular Biolog
y)、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・アン
ド・ウィリーインターサイエンス(Greene Pu
blishing As5ociates and W
iley−Interscience) 9−1−1章
〜9・1・4章(1987) )を基にCHO細胞に二
重形質転換してCHO細胞を形質転換した。
tocols inMolecular Biolog
y)、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・アン
ド・ウィリーインターサイエンス(Greene Pu
blishing As5ociates and W
iley−Interscience) 9−1−1章
〜9・1・4章(1987) )を基にCHO細胞に二
重形質転換してCHO細胞を形質転換した。
即ち、まず直径9cmのシャーレの中でFe2 (牛胎
児血清)が10%人ったERDF培地(極東製薬社製)
中でCHO細胞をセミコンフルエントな状態になるまで
培養した。次にシャーレから培地を除きそこにDNA溶
液を滴加するが、該DNA溶液は予め次に示す手順に従
って調製した。
児血清)が10%人ったERDF培地(極東製薬社製)
中でCHO細胞をセミコンフルエントな状態になるまで
培養した。次にシャーレから培地を除きそこにDNA溶
液を滴加するが、該DNA溶液は予め次に示す手順に従
って調製した。
まず直径9cmのシャーレ−枚につき300μぞの2x
HEBS溶液(2X HEBS溶液;1.6%塩化ナ
トリウム、0.074%塩化カリウム、0.05%5%
燐酸水素二ナトリウム1塩、0.2%デキストロース、
1%HEPES(p:E(7,05))と10 、gの
プラスミドDNAおよびIVIgのpsV2neoプラ
スミドDNA、1.gのpAd −D26−1プラスミ
ドDNAを加え、滅菌された水で570 IIeに合わ
せた溶液をエッペンドルフ遠心管中に準備する。次に該
DNA溶液に301Jeの2.5Mの塩化カルシウム溶
液を滴加しながらポルテックスミキサーを用い数秒間激
しく混和する。これを室温で30分間放置するが、その
間およそ10分おきにポルテックスミキサーで混和する
。
HEBS溶液(2X HEBS溶液;1.6%塩化ナ
トリウム、0.074%塩化カリウム、0.05%5%
燐酸水素二ナトリウム1塩、0.2%デキストロース、
1%HEPES(p:E(7,05))と10 、gの
プラスミドDNAおよびIVIgのpsV2neoプラ
スミドDNA、1.gのpAd −D26−1プラスミ
ドDNAを加え、滅菌された水で570 IIeに合わ
せた溶液をエッペンドルフ遠心管中に準備する。次に該
DNA溶液に301Jeの2.5Mの塩化カルシウム溶
液を滴加しながらポルテックスミキサーを用い数秒間激
しく混和する。これを室温で30分間放置するが、その
間およそ10分おきにポルテックスミキサーで混和する
。
この様にしてできたDNA溶液を前述の細胞にかけて室
温で30分間静置した。その後FC8が10%入ったE
RDF培地9 meをシャーレに入れて、5%CO2存
在下、37°Cで4〜5時間培養した。次にシャーレか
ら培地を除き5 m6のI X TBS +十溶液(I
XTBS+十溶液; 25 mM )リス−塩酸(pH
7,5)、140mM塩化すトリウム、5mM塩化カリ
ウム、0.6mM燐酸水素二ナトリウム、0.08 m
M塩化カルシウム、0.08mM塩化マグネシウム)で
細胞を洗浄し、I X TBS+十溶液全溶液した後、
グリセロールを20%含むIXTBS+十溶液5mぞを
、細胞にかけて、室温で1〜2分間静置し、上清を除去
した。その後5 meのI X TBS+十溶液全溶液
を再び洗浄し、Fe2が10%人ったERDF培地10
m6をシャーレに入れて5%CO2存在下、37°Cで
培養した。培養後、48時間が経過した時点で培地を除
き、5 meのI X TBS+十溶液全溶液を洗浄し
た後、細胞にトリプシン−EDTA溶液(シグマ社)
2 mlをかけ、室温で30秒静置した。その後、トリ
プシン−EDTA溶液を除き、それから5分後にFe2
が10%人ったERDF培地10m6をシャーレに入れ
て細胞を剥がし、9cmシャーレ−枚分の細胞を9cm
シャーレ10枚に分けて薬剤G418 (G418硫酸
塩(GENETICIN) ;GIBCO社)を200
pg / meの濃度になるように加えて培養を続け
た。その後10日が経過した時点で生き残ったG418
に耐性の細胞を単Fjlt L、一つの培養用の穴がお
よそ3.1 cm2の24穴の培養皿を用い、それぞれ
Fe2が10%入ったERDF培地1培地1マe中そ7
日間培養し直した。
温で30分間静置した。その後FC8が10%入ったE
RDF培地9 meをシャーレに入れて、5%CO2存
在下、37°Cで4〜5時間培養した。次にシャーレか
ら培地を除き5 m6のI X TBS +十溶液(I
XTBS+十溶液; 25 mM )リス−塩酸(pH
7,5)、140mM塩化すトリウム、5mM塩化カリ
ウム、0.6mM燐酸水素二ナトリウム、0.08 m
M塩化カルシウム、0.08mM塩化マグネシウム)で
細胞を洗浄し、I X TBS+十溶液全溶液した後、
グリセロールを20%含むIXTBS+十溶液5mぞを
、細胞にかけて、室温で1〜2分間静置し、上清を除去
した。その後5 meのI X TBS+十溶液全溶液
を再び洗浄し、Fe2が10%人ったERDF培地10
m6をシャーレに入れて5%CO2存在下、37°Cで
培養した。培養後、48時間が経過した時点で培地を除
き、5 meのI X TBS+十溶液全溶液を洗浄し
た後、細胞にトリプシン−EDTA溶液(シグマ社)
2 mlをかけ、室温で30秒静置した。その後、トリ
プシン−EDTA溶液を除き、それから5分後にFe2
が10%人ったERDF培地10m6をシャーレに入れ
て細胞を剥がし、9cmシャーレ−枚分の細胞を9cm
シャーレ10枚に分けて薬剤G418 (G418硫酸
塩(GENETICIN) ;GIBCO社)を200
pg / meの濃度になるように加えて培養を続け
た。その後10日が経過した時点で生き残ったG418
に耐性の細胞を単Fjlt L、一つの培養用の穴がお
よそ3.1 cm2の24穴の培養皿を用い、それぞれ
Fe2が10%入ったERDF培地1培地1マe中そ7
日間培養し直した。
以上の細胞の培地をFe2を含まないERDF培地に代
えて培養を続け72時間が経過した細胞の培地を個別に
2m/集め、それをセントリコン濃縮器(ミリボア社)
で50 、eに遠心濃縮してそのうちの約15μeをサ
ンプルとして、5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行った。
えて培養を続け72時間が経過した細胞の培地を個別に
2m/集め、それをセントリコン濃縮器(ミリボア社)
で50 、eに遠心濃縮してそのうちの約15μeをサ
ンプルとして、5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行った。
これを常法に従いウェスタンプロット法で解析しhHG
F蛋白質の発現を確認した。
F蛋白質の発現を確認した。
また、Gohdaらの方法(エクスペリメンタル・セル
・リサーチ(Experimental Ce1l R
e5cerch) 166巻139頁〜150頁(19
86) )によりhHGF活性を測定し生物学的活性の
存在を確認した。
・リサーチ(Experimental Ce1l R
e5cerch) 166巻139頁〜150頁(19
86) )によりhHGF活性を測定し生物学的活性の
存在を確認した。
3−
4−
さらに得られた細胞株は個別に単離され酵素イムノアッ
セイ法を行いhHGF蛋白質の定量を行った。
セイ法を行いhHGF蛋白質の定量を行った。
その結果、発現量の確認された細胞株B−1,B−27
、B−102を得た。
、B−102を得た。
実施例2
[I ] hHGF遺伝子を有する発現ベクターを用
いて繰り返し形質転換して得られる、hHGF蛋白質を
継代的に発現する細胞株の取得 実施例1−[I]により取得した、hHGF遺伝子発現
ベクターpKCRHGF −2及びミコフェノール酸耐
性の形質転換細胞選択用のマーカーをコードするプラス
ミドpMBG (Nature 294.228 (1
981) )を有する絹換え体の大腸菌から、前述のM
aniatisらの方法に従い該プラスミドDNAを回
収、精製した。
いて繰り返し形質転換して得られる、hHGF蛋白質を
継代的に発現する細胞株の取得 実施例1−[I]により取得した、hHGF遺伝子発現
ベクターpKCRHGF −2及びミコフェノール酸耐
性の形質転換細胞選択用のマーカーをコードするプラス
ミドpMBG (Nature 294.228 (1
981) )を有する絹換え体の大腸菌から、前述のM
aniatisらの方法に従い該プラスミドDNAを回
収、精製した。
得られた二種のプラスミドDNAを用いてAu5ube
lらの方法(カレント・プロトコール、イン・モレキュ
ラー・バイオロジー(Current Protoco
ls inMolecular Biology)、グ
リーン・パブリッシング・アソシエイッ・アンl乙つイ
リーインターザイエンス(Greene Publis
hing As5ociates and Wiley
−Interscience) 9・1・1章〜9・1
・4章(1987))を基に、実施例1−[II]によ
って得られたhHGF蛋白質を継代的に発現する細胞株
のうり、hI−IGFの発現量の多いもの3株(B−1
、B−27、B−102)を単jilt、 L、それら
を個別に二重形質転換して該細胞を形質転換した。
lらの方法(カレント・プロトコール、イン・モレキュ
ラー・バイオロジー(Current Protoco
ls inMolecular Biology)、グ
リーン・パブリッシング・アソシエイッ・アンl乙つイ
リーインターザイエンス(Greene Publis
hing As5ociates and Wiley
−Interscience) 9・1・1章〜9・1
・4章(1987))を基に、実施例1−[II]によ
って得られたhHGF蛋白質を継代的に発現する細胞株
のうり、hI−IGFの発現量の多いもの3株(B−1
、B−27、B−102)を単jilt、 L、それら
を個別に二重形質転換して該細胞を形質転換した。
すなわち、まず直径9cmシャーレの中でFe2が10
%入ったERDF培地中で、前述のhHGF蛋白質を継
代的に発現する細胞株を個別にセミコンフルエントな状
態になるまで培養した。次にシャーレから培地を除きそ
こにDNA溶液を滴加するが、該DNA溶液は、10μ
g (7) pKCRHGF −2プラスミドDNA及
び1.gのpMBGプラスミドDNAを用いる以外は、
実施例1−[II]と同様の手順で調製した。
%入ったERDF培地中で、前述のhHGF蛋白質を継
代的に発現する細胞株を個別にセミコンフルエントな状
態になるまで培養した。次にシャーレから培地を除きそ
こにDNA溶液を滴加するが、該DNA溶液は、10μ
g (7) pKCRHGF −2プラスミドDNA及
び1.gのpMBGプラスミドDNAを用いる以外は、
実施例1−[II]と同様の手順で調製した。
この様にしてできたDNA溶液を前述の細胞にかけて室
温で30分間静置した。その後FC8が10%入ったE
RDF培地9 meをシャーレに入れて、5%CO2存
在下、37°Cで4〜5時間培養した。次にシャーレか
ら培地を除き5 m4?のIXTBS+十溶液(前述)
で細胞を洗浄し、I X TBS+十溶液全溶液した後
、グリセロールを20%含むI X TBS+十溶液5
meを細胞にかけて、室温で1〜2分間静置し、」−清
を除去した。その後5 mlのI X TBS+十溶液
全溶液を再び洗浄し、Fe2が10%入ったERDF培
地10m4?をシャーレに入れて5%CO2存在下、3
7°Cで培養し、48時間が経過した時点で培地を除き
、5mlのIXTBS+十溶液で細胞を洗浄した後、細
胞にトリプシン−EDTA溶液(シグマ社) 2 me
をかけ、室温で30秒静置した。その後、トリプシン−
EDTA溶液を除き、それから5分後にFe2が10%
入った。−MEM(−)培地10m、/をシャーレに入
れて細胞を剥がし、9cmシャーレ−枚の細胞を9cm
シャーレ10枚に分けて薬剤ミコフェノール酸(シグマ
社製)をlpg/m6及びキザンチン(シグマ社製)を
250μgameの濃度になるように加えて培養を続け
た。その後10日が経過した時点で生き残ったミコフェ
ノール酸に耐性の細胞を単離し、一つの培養用の穴がお
よそ3.1 am2の24穴の培養皿を用い、それぞれ
Fe2が10%入ったERDF培地l me中でおよそ
7日間培養し直した。
温で30分間静置した。その後FC8が10%入ったE
RDF培地9 meをシャーレに入れて、5%CO2存
在下、37°Cで4〜5時間培養した。次にシャーレか
ら培地を除き5 m4?のIXTBS+十溶液(前述)
で細胞を洗浄し、I X TBS+十溶液全溶液した後
、グリセロールを20%含むI X TBS+十溶液5
meを細胞にかけて、室温で1〜2分間静置し、」−清
を除去した。その後5 mlのI X TBS+十溶液
全溶液を再び洗浄し、Fe2が10%入ったERDF培
地10m4?をシャーレに入れて5%CO2存在下、3
7°Cで培養し、48時間が経過した時点で培地を除き
、5mlのIXTBS+十溶液で細胞を洗浄した後、細
胞にトリプシン−EDTA溶液(シグマ社) 2 me
をかけ、室温で30秒静置した。その後、トリプシン−
EDTA溶液を除き、それから5分後にFe2が10%
入った。−MEM(−)培地10m、/をシャーレに入
れて細胞を剥がし、9cmシャーレ−枚の細胞を9cm
シャーレ10枚に分けて薬剤ミコフェノール酸(シグマ
社製)をlpg/m6及びキザンチン(シグマ社製)を
250μgameの濃度になるように加えて培養を続け
た。その後10日が経過した時点で生き残ったミコフェ
ノール酸に耐性の細胞を単離し、一つの培養用の穴がお
よそ3.1 am2の24穴の培養皿を用い、それぞれ
Fe2が10%入ったERDF培地l me中でおよそ
7日間培養し直した。
以上の細胞の培地をFe2を含まないERDF培地に代
えて培養を続け72時間が経過した細胞の培地を個別に
2 rm?集め、それらをセントリコン濃縮器(ミリボ
ア社)で50 、lに遠心濃縮してそのうち約15μe
をサンプルとして5DS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行った。
えて培養を続け72時間が経過した細胞の培地を個別に
2 rm?集め、それらをセントリコン濃縮器(ミリボ
ア社)で50 、lに遠心濃縮してそのうち約15μe
をサンプルとして5DS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行った。
これを常法に従いウェスタンプロット法で解析しhHG
F蛋白質の発現を確認した。
F蛋白質の発現を確認した。
また、Gohdaらの方法(エクスペリメンタル・セル
・リザーチ(Experimental Ce1l R
e5erc11) 166巻139頁〜150頁(19
86) )によりhHGF活性を測定し生物学的活性の
存在を確認した。
・リザーチ(Experimental Ce1l R
e5erc11) 166巻139頁〜150頁(19
86) )によりhHGF活性を測定し生物学的活性の
存在を確認した。
その結果を第5図に示す。
さらに、得られた細胞株のうちいくつかを個別に単離し
酵素イムノアッセイ法でhHGF蛋白質の発現量を確認
した結果、二重形質転換前の細胞株B−102の発現量
のおよそ20倍の発現量を示す細胞株BD −24を得
た。
酵素イムノアッセイ法でhHGF蛋白質の発現量を確認
した結果、二重形質転換前の細胞株B−102の発現量
のおよそ20倍の発現量を示す細胞株BD −24を得
た。
(発明の効果)
本発明に係わるhHGF遺伝子を挿入された発現37
8
4゜
ベクターを宿主細胞に導入することにより、今まで困難
であった生物学的活性を有するhHGF蛋白質を大量、
安定かつ容易に生産することが可能となる。
であった生物学的活性を有するhHGF蛋白質を大量、
安定かつ容易に生産することが可能となる。
第1図はヒト肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子の
塩基配列を表わす。 第2図はヒト肝実質細胞増殖因子をコードする遺。 伝子から推定されるアミノ酸配列を示す。 第3図は、ヒト肝実質細胞増殖因子を発現するベクター
を構築する工程を表わす。 第4図は、本発明のヒト肝実質細胞増殖因子をコードす
るDNAを有する発現ベクターの構造を表わす。 第5図は、本発明のヒI・肝実質細胞増殖因子をコード
するDNAを有する発現ベクターを有するCHO細胞が
産生ずるヒト肝実質細胞増殖因子をを含む培養」二清の
生物学的活性を示したものである。 9 ト −6 く↓ ヒ (ン (ン ヒ く (] (ワ ヒ (〕 (9 (〕 C+) し (9く支<o
< 。 (ノ ヒ (ノ ト ≧ 」 」 ヒ ■ く の θつ q。 く フ コ −〇 −OW (り(り>Cし く (9 くミ ヒ ト ■ Σ ト ト く く く ト ド く 」 ヒ 」 ■ ト 」 工
塩基配列を表わす。 第2図はヒト肝実質細胞増殖因子をコードする遺。 伝子から推定されるアミノ酸配列を示す。 第3図は、ヒト肝実質細胞増殖因子を発現するベクター
を構築する工程を表わす。 第4図は、本発明のヒト肝実質細胞増殖因子をコードす
るDNAを有する発現ベクターの構造を表わす。 第5図は、本発明のヒI・肝実質細胞増殖因子をコード
するDNAを有する発現ベクターを有するCHO細胞が
産生ずるヒト肝実質細胞増殖因子をを含む培養」二清の
生物学的活性を示したものである。 9 ト −6 く↓ ヒ (ン (ン ヒ く (] (ワ ヒ (〕 (9 (〕 C+) し (9く支<o
< 。 (ノ ヒ (ノ ト ≧ 」 」 ヒ ■ く の θつ q。 く フ コ −〇 −OW (り(り>Cし く (9 くミ ヒ ト ■ Σ ト ト く く く ト ド く 」 ヒ 」 ■ ト 」 工
Claims (4)
- (1)下記アミノ酸配列で表わされるヒト肝実質細胞増
殖因子をコードする遺伝子を有する発現ベクターで宿主
細胞を形質転換し、得られる形質転換体を培養してヒト
肝実質細胞増殖因子を生産することを特徴とするヒト肝
実質細胞増殖因子の生産方法。 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 - (2)下記塩基配列で表わされる、ヒト肝実質細胞増殖
因子をコードする遺伝子を有する発現ベクターで宿主細
胞を形質転換し、得られる形質転換体を培養してヒト肝
実質細胞増殖因子を生産することを特徴とするヒト肝実
質細胞増殖因子の生産方法。 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 - (3)下記アミノ酸配列で表わされるヒト肝実質細胞増
殖因子をコードする遺伝子を有する発現ベクターで宿主
細胞を形質転換して得られる形質転換体に対し、さらに
該ヒト肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子を有する
発現ベクターを用いて繰り返し形質転換し、得られる形
質転換体を培養してヒト肝実質細胞増殖因子を生産する
ことを特徴とするヒト肝実質細胞増殖因子の生産方法。 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 - (4)下記アミノ酸配列で表わされるヒト肝実質細胞増
殖因子をコードする遺伝子を有する発現ベクターで形質
転換して得られるヒト肝実質細胞増殖因子を産生する動
物細胞。 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】
Priority Applications (9)
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JP2088592A JP3036782B2 (ja) | 1990-04-03 | 1990-04-03 | ヒト肝実質細胞増殖因子の生産方法および該因子を産生する形質転換体 |
CA002022752A CA2022752C (en) | 1989-08-11 | 1990-08-07 | Hepatic parenchymal cell growth factor, gene encoding the same, process for producing the factor, and transformants producing the factor |
EP90115397A EP0412557B1 (en) | 1989-08-11 | 1990-08-10 | Hepatic parenchymal cell growth factor, gene encoding the same, process for producing the factor, and transformants producing the factor |
HU904957A HUT58798A (en) | 1989-08-11 | 1990-08-10 | Process for producing growth factor of parenchimic hepatic celles, the gen for coding this and transformants for producing this factor |
AT90115397T ATE152124T1 (de) | 1989-08-11 | 1990-08-10 | Wachstumsfaktor aus parenchymalen lebenszellen, dafür kodierendes gen, verfahren zur herstellung dieses faktors und transformanten |
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DE69030539T DE69030539T2 (de) | 1989-08-11 | 1990-08-10 | Wachstumsfaktor aus parenchymalen Lebenszellen, dafür kodierendes Gen, Verfahren zur Herstellung dieses Faktors und Transformanten |
KR1019900012415A KR960006122B1 (ko) | 1989-08-11 | 1990-08-11 | 간의 실질 세포 성장 인자, 이를 코딩하는 유전자, 이 인자를 생산하는 방법, 및 이 인자를 생산하는 형질전환체 |
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JP2088592A Expired - Lifetime JP3036782B2 (ja) | 1989-08-11 | 1990-04-03 | ヒト肝実質細胞増殖因子の生産方法および該因子を産生する形質転換体 |
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05301824A (ja) * | 1991-06-03 | 1993-11-16 | Mitsubishi Kasei Corp | 肝実質細胞増殖剤 |
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-
1990
- 1990-04-03 JP JP2088592A patent/JP3036782B2/ja not_active Expired - Lifetime
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05301824A (ja) * | 1991-06-03 | 1993-11-16 | Mitsubishi Kasei Corp | 肝実質細胞増殖剤 |
WO1994004175A1 (en) * | 1992-08-24 | 1994-03-03 | Toshikazu Nakamura | Hgf production promoter |
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---|---|
JP3036782B2 (ja) | 2000-04-24 |
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