FI103987B - Interleukiini-7 - Google Patents

Interleukiini-7 Download PDF

Info

Publication number
FI103987B
FI103987B FI902077A FI902077A FI103987B FI 103987 B FI103987 B FI 103987B FI 902077 A FI902077 A FI 902077A FI 902077 A FI902077 A FI 902077A FI 103987 B FI103987 B FI 103987B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
cells
protein
dna sequence
sequence
residues
Prior art date
Application number
FI902077A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI103987B1 (fi
FI902077A0 (fi
Inventor
Raymond G Goodwin
Anthony E Namen
Stephen D Lupton
Diane Y Mochizuki
Original Assignee
Sanofi Synthelabo
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Synthelabo filed Critical Sanofi Synthelabo
Publication of FI902077A0 publication Critical patent/FI902077A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI103987B1 publication Critical patent/FI103987B1/fi
Publication of FI103987B publication Critical patent/FI103987B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5418—IL-7
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

103987
Interleukiini-7
Tekninen ala Tämä keksintö koskee yleensä immunologian ja mole-5 kyylibiologian aloja ja erityisesti erästä polypeptidikas-vutekijää, joka säännöstelee lymfosyytti- ja muiden hema-topoieettisten esisolujen lisääntymistä ja erilaistumista.
Keksinnön taustaa B- ja T-lymfosyytit ovat immuunivasteiden ensisi-10 jäiset vaikuttajasolut. Kummankin soluluokan ajatellaan polveutuvan alunperin nisäkkään luuytimessä olevista hema-topoieettisista kantasoluista esi- tai edeltäjäsolujen kautta, jotka edustavat erotettavissa olevia asteita kummankin luokan erilaistumisessa.
15 B-lymfosyytit eli B-solut ovat kiertävien vasta- ainetta erittävien plasmasolujen edeltäjiä. Kypsät B-solut, joille on tunnusomaista sellaisten pintaan sitoutuneen immunoglobuliinin ilmentäminen, joka kykenee sitomaan spesifisiä antigeenejä, polveutuvat hematopoieettisista 20 kantasoluista sellaisen välivaihesoluluokan kautta, joka tunnetaan esi-B-soluina. Kypsiä T-soluja kehittyy pääasiallisesti kateenkorvassa, ilmeisesti vielä identifioi-mattomasta edeltäjäsolusta, joka siirtyy luuytimestä ka-teenkorvaan T-lymfosyytin kehityksen varhaisessa vaihees-25 sa.
Vaikka on edistytty huomattavasti sellaisten liu- • t koisten hormonin kaltaisten faktorien identifioimisessa, t · * • · · jotka säännöstelevät muiden hematopoieettista alkuperää olevien solujen, kuten esimerkiksi granulosyyttien ja mak- ... 30 rofagien, erilaistumista, tiedetään hyvin vähän säännöste- • · · *- levistä faktoreista, jotka liittyvät B- ja T-solujen lym- • · * \ fogeneesiin. Monipuolisesti kehityskelpoista lymfoidikan- tasolua ei ole identifioitu eikä myöskään ole määritelty kaikkia faktoreita tai olosuhteita, jotka vaaditaan B- ja 35 T-solulinjojen tehtäväänsä sitoutumiseen ja laajentumi- 2 103987 seen. B- ja T-solujen kasvun ja erilaistumisen myöhemmät vaiheet, jotka seuraavat pintaimmunoglobuliinin ilmaantumista ja B-solun esiintuloa luuytimestä tai T-solun esiintuloa kateenkorvasta, ovat olleet parhaiten tutkitut. Tämä 5 työ on paljastanut muutamia faktoreita, jotka vaikuttavat kypsiin periferisiin B- ja T-soluihin, mukaan lukien IL- I, IL-2, IL-4, IL-5, interferoni gamma, BSF-2, neuroleu-kiini ja transformoiva kasvutekijä beeta.
Käytettävissä on hajanaisia niitä B-soluja koskevia 10 todisteita, joita pidetään kypsien funktionaalisten peri-feristen B-solujen välittöminä edeltäjinä. Nämä esi-B-solut on määritelty soluiksi, jotka siältävät solulimassa olevan μ-ketjun, mutta eivät solulimassa olevaa kevyttä ketjua eivätkä pintaimmunoglobuliinia.
15 Paige, Nature 302:711 (1983) ja Paige et ai., Eur.
J. Immunol. 14:979 (1984) ovat kuvanneet tekniikkoja sellaisten B-solujen edeltäjien viljelemiseksi, jotka on saatu 14 päivän ikäisistä hiiren sikiökautisen maksan soluista. Näiden esi-B-solujen havaittiin erikoistuvan vas- 20 ta-ainetta erittäviksi B-soluiksi in vitro, kun viljelmien apuna käytettiin sikiökautisten maksasolujen kerrosta, luuytimen adherenttien solujen kerrosta tai sopivaan kun-" toon saatettuja kasvuliuoksia, jotka sisälsivät kolonioita
I
i ’· stimuloivia faktoreita.
25 Giri et ai., J. Immunol. 132:223 (1984), ovat vil- jelleet hiiren luuytimestä peräisin olevaa esi-B-solulin-jaa 70Z/3 sellaisten osittain puhdistettujen IL-l-valmis- • · · .*)*. teiden läsnäollessa, jotka on saatu lipopolysakkaridilla (LPS) indusoitujen P388Dl-solujen supernatanteista. IL-1- ...^ 30 valmisteen kanssa kosketuksiin joutumisen jälkeen esi-B- • · · I.. solujen havaittiin ilmentävän pintaimmunoglobuliinia.
• · · *. Jyonouchi et ai., J. Immunol. 135:1891 (1985) ovat selos- vV taneet, että NZB-hiirten seerumista peräisin oleva humo- raalinen tekijä tai tekijät kykenivät lisäämään B-linjan 35 edeltäjäsolujen kypsymistä. Landreth et ai., J. Immunol.
3 103987 134:2305 (1985) ovat osoittaneet, että syklistä neutroso-luniukkuutta sairastavan potilaan virtsassa läsnäoleva tekijä (tai tekijät) stimuloi esi-B-solujen syntyä ihmisen ja hiiren luuydinviljelmissä.
5 Näitä tuloksia on kuitenkin ollut vaikea tulkita johtuen kysymyksessä olevien solupopulaatioiden epähomogeenisestä luonteesta. Tunnettujen lymfokiinien pleio-trooppiset vaikutukset samoin kuin niiden voimakkaat luontaiset biologiset aktiivisuudet tekevät monimutkaiseksi 10 sellaisten määritysten analyysin, joihin liittyy heterogeenisten soluviljelmien reagointi seerumia sisältävistä soluviljelmistä reagointi seerumia sisältävistä soluviljelmistä saatuihin sopivaan kuntoon saatettuihin viljely-aineisiin.
15 Yksi lymfosyyttien kehityksen tutkimisen pääeste on ollut vaikeus saada rikastettuja elinkykyisten lymfoidi-edeltäjäsolujen populaatioita. Pitkäaikainen luuydinvil-jelmäjärjestelmä, jonka ovat kehittäneet Whitlock ja Witte, J. Immunol. Meth. 67:353 (1984), on tarjonnut esi-20 B-solujen lähteen tutkimusta varten. Whitlock-Witte-vil-jelmässä adherenttia tukikerrosta, joka käsittää perus-kudoksesta peräisin olevia fibroblasteja, makrofaageja ja ·' " endoteelisoluja, käytetään syöttökerroksena ylläpitämään : '·· ei-adherenttien esi-B- ja varhaisempien lymfoidiedeltäjä- !mi! 25 solujen muodostaman ylemmän faasin kasvua.
:\j Whitlock et ai., Cell 48:1009 (1987), ja Hunt et ai., Cell 48:997 (1987) ovat selostaneet sellaisten solu- • » · .Γ. linjojen kloonauksen, jotka olivat peräisin hiiren luu- ydinperuskudoksesta ja jotka kykenivät ylläpitämään esi- #...t 30 B-solujen ja kypsien B-solujen muiden edeltäjien kasvua • · · - - Whitlock-Witte-viljelmissä. Yhden sellaisen solulinjan, • · · • Il jolle on annettu nimitys ALC, supernatanteista testattiin aktiivisuus IL-1-, IL-2-, IL-3- ja IL-4-määritykeissä.
: ' Aktiivisuuden puuttuminen näissä määrityksissä viittasi 35 siihen, että nämä tekijät eivät olleet ALC-supernatanteis- 4 103987 sa todetun lisääntymistä aiheuttavan aktiivisuuden lähde. Sekä Whitlock et ai. että Hunt et ai. katsoivat havaitsemansa esi-B-soluja indusoivan aktiivisuuden johtuvan uudesdta tekijästä, joka oli läsnä peruskudoksen solujen 5 supernatanteissa.
Tätä keksintöä kehitettäessä käytettiin Whitlock-Witte-viljelysysteemin muunnosta sellaisten epäkypsien B-solujen lähteenä, joihin perustui nopea kvantitatiivinen analyysi sellaisten kasvutekijöiden toteamiseksi, jotka 10 kykenivät stimuloimaan esi-B-solujen lisääntymistä. Olete tulle tekijälle, joka havaittiin hiiren peruskudossolujen viljelmissä, annettiin alustavasti nimitys "lymfopoietii-ni-1" ("LP-1") ja myöhemmin sille annettiin nimitys "inte-rleukiini-7" ("IL-7"). Hiiren IL-7 -cDNAin, jota käytet-15 tiin ihmisen cDNAin varmistamiseen, kloonaamiseen käytet tiin uutta kloonaustekniikkaa. Sellaisen solulinjan saamiseksi, joka ilmensi liukenevaa hiiren IL-7:ä todettavissa olevina määrinä perustettiin uusi solulinja transformoimalla peruskudossoluja, jotka olivat peräisin Whitlock-20 Witte-viljelmästä. Tästä solullnjasta, joka erittää esi-B-solujen kasvuaktiivisuutta seerumittomissa vil-jelyaineissa, saatiin spesifinen IL-7-lähetti-RNA il- • « ·’ " mentämiskloonausta varten ja proteiini puhdistettavaksi ja : " sekvenssoitavaksi. Hiiren cDNA-kloonin eristäminen mahdol-
• I I
25 listi ihmisen IL-7:n koodaavien ihmisen genomi- ja cDNA- • · *.’·· kloonien identifioinnin ristihybridisaation avulla.
Esikokeet, joissa on annettu puhdistettua rekom-:*·*; binantti-IL-7:ä hiirille, ovat osoittaneet, että sen li- säksi, että IL-7 stimuloi T- ja B-solujen hematopoieettis-30 ten edeltäjien kehitystä ja lisääntymistä, se myös kykenee • · f tI..# indusoimaan megakryosyyttien ja granulosyyttien/makrofaa- i · i gien edeltäjien lisääntymistä luuytimessä. Ottaen huomioon v potentiaaliset immunologiset terapeuttiset käytöt T-solu- '·' jen ja vasta-ainetta erittävien B-solujen samoin kuin mul- 35 den hematopoieettisten solutyyppien edeltävjien lisäänty- 5 103987 misen stimuloimisessa, on olemassa huomattavaa kiinnostusta teknologian kehittämiseen biologisesti aktiivisten IL- 7-molekyylien tuottamiseksi. Rekombinantti-ilmentämissys-teemejä käyttämällä voidaan saada riittäviä määriä puhdas-5 ta proteiinia sallimaan sellaisten molekyylien biologisen aktiivisuuden yksityiskohtaisen tutkimisen ja tyydyttämään terapeuttisten IL-7-valmisteiden odotettua kliinistä kysyntää .
Yhteenveto keksinnöstä 10 Tässä keksinnössä tarjotaan nisäkkäiden interleu- kiini-7 (IL-7)-proteiineja, joita on aikaisemmin nimitetty lymfopoietiini-l_ksi ("LP-1"). Näitä molekyylejä voidaan valmistaa puhdistamalla soluviljelmien supernatanteista tai ilmentämällä DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat nisäk-15 kään IL-7:n. Edullisesti sellaiset sekvenssit käsittävät oleellisesti yhden ainoan avoimen lukuraamin nukleotidi-sekvenssin, jota voidaan ilmentää rekombinanttitranskrip-tioyksikössä nisäkkään, mikrobin tai viruksen transkriptio- tai translaatiosäätelyelementtien säätelyn alaisena. 20 Tässä keksinnössä tarjotaan myös rekombinantti-ilmentämis-vektoreita, jotka sisältävät kyseisiä DNA-sekvenssejä, eukaryootti- ja prokaryootti-ilmentämissysteemejä, joihin ·' " sisältyy kyseisiä rekombinantti-ilmentämisvektoreita, me-
I I
: " netelmiä proteiinien valmistamiseksi puhdistamalla nisä- 25 kässolujen viljelyaineista tai rekombinantti-ilmentämisen • » !/·· avulla sopivassa eukaryootti- tai prokaryoottisysteemissä, erilaisia terapeuttisia valmisteita ja menetelmiä, jotka ;’·*· käsittävät tai sisältävät keksinnön mukaisten proteiinien käytön, ja vasta-aineita, jotka ovat keksinnön mukaisten .···, 30 proteiinien kanssa immunoreaktiivisia.
• · ·
Kuvien lyhyt kuvaus • · »
Kuviossa 1 on annettu ihmisen ja hiiren IL-7-prote-
• F
V, iineja koodaavien cDNA-kloonien restriktiokartat, laatikot osoittavat avoimien lukuraamien asemat; viivoinvarjostus ; 35 osoittaa signaalipeptidi- tai johto (leader)-sekvenssin, 6 103987 valittujen restriktioendonukleaasien tunnistuskohtien likimääräiset asemat on merkitty.
Kuvio 2 esittää hiiren IL-7:n (mIL-7) koodaavan cDNA-kloonin nukleotidisekvenssin, joka identifioitiin 5 suoran ilmentämiskloonauksen avulla käyttäen nisäkkään ilmentämisvektoria. Täyspitkän alkuperäisen proteiinin aloituskodoni, kypsän sekvenssin N-terminaalisen aminohapon määräävä kodoni ja terminaatiokodoni on alleviivattu.
Kuvio 3 osoittaa kuvion 2 hiiren cDNA-kloonin koo-10 daavan alueen nukleotidisekvenssin ja siitä johdetun aminohapposekvenssin. Kypsän proteiinin sekvenssin koodaa nukleotidisekvenssi, joka alkaa nukleotidistä 1 ja päättyy nukleotidiin 387. Oletetun signaalipeptidin, joka on koodattu alkuperäisen translaatiotuotteen johtosekvenssinä, 15 koodaavat nukleotidit -75 - -1. Kypsän mIL-7:n N-terminaalinen glutamiinihappojäännös on alleviivattu.
Kuvio 4 esittää ihmisen IL-7:n (hIL-7) koodaavan cDNA-kloonin nukleotidisekvenssin, joka eristettiin ris-tihybridisaatiotutkimusten avulla käyttäen mIL-7-cDNA:sta 20 saatua koetinta. Täyspitkän alkuperäisen proteiinin aloituskodoni, kypsän sekvenssin N-terminaalisen aminohapon määräävä kodoni ja lopetuskodoni on alleviivattu.
! " Kuvio 5 osoittaa kuvion 4 hIL-7-cDNA-kloonin koo- : daavan alueen nukleotidisekvenssin ja siitä johdetun ami- «Il 25 nohapposekvenssin. Ihmisen kypsän proteiinin koodaa sek-γ.: venssi, joka alkaa nukleotidista 1 ja päättyy nukleotidiin 456. Oletetun hydrofobisen signaalipeptidin, joka on koo- ··· dattu alkuperäisen translaatiotuotteen johtosekvenssinä, koodaavat nukleotidit -75 - -1. Kypsän proteiinin N-ter-30 minaalinen asparagiinihappojäännös on alleviivattu. Plas- • · · "... midi, joka sisältää hIL-7:n koodaavan sekvenssin E.Coli- kannassa JM107, on talletettu kokoelmaan the American Type
• I
V, Cultgure Collection 21. lokakuuta 1987 ja sille on annettu tulonumero ATCC 67546.
Il·’ • I » t
« f I
< 103987
Kuvio 6 osoittaa esi-B-solujen (esitys A) ja tymo-syyttien (esitys B) vastauksen IL-7:ään. Esityksessä A kuvatussa kokeessa esi-B-soluja, jotka olivat peräisin Whitlock-Witte-luuydinviljelmistä (katso alla), viljeltiin 5 tiheydellä 2,5 x 105 solua ml:aa kohden IL-7:n läsnäollessa kolmen päivän ajan 37 °C:ssa. Käytettiin kahta IL-7:n lähdettä: Il-7-geenin sisältävällä ilmentämisvektorilla transfektoiduilta COS-7-soluilta saadun supernatantin lai-mennossarjaa (avoimet neliöt) ja puhdistettua rekom-10 binantti-IL-7-proteiinia, alkaen konsentraatiosta 100 ng/ml (tummat neliöt). Esityksessä B kuvatussa kokeessa tymosyyttejä viljeltiin tiheydellä 1 x 107 solua ml:aa kohden samoissa olosuhteissa, paitsi että puhdistetun rekom-binantti-IL-7-proteiinin laimennokset aloitettiin konsen-15 traatiosta 1 pg/ml. Kaikissa kokeissa kukin graafisesti esitetty arvo edustaa kolmen rinnakkaisen näytteen keskiarvoa.
Kuvio 7 on kaaviokuva nisäkkään runsaan ilmennyksen plasmidista pPC201, joka on kuvattu yksityiskohtaisemmin 20 esimerkissä 7.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 1. Määritelmiä " "Interleukiini-7" ja "IL-7" viittaavat nisäkkään : " endogeeniseen sekretoriseen proteiiniin, joka kykenee in- « I f 25 dusoimaan luuytimestä peräisin olevien lymfosyyttien esi- i « !,'·· solujen ja edeltäjien, mukaan lukien esi-B-soluina tun- : : netut erikoistuneet edeltäjät, lisääntymisen. Tämän mole- kyylin vaihtoehtoisia nimityksiä ovat "esi-B-solujen kasvutekijä" ja "lymfopoietiini-1". Hiiren kypsän proteiinin, 30 joka vastaa kuviossa 3 esitettyä sekvenssiä, ennustettu i·· molekyylipaino on 14 897 daltonia, jättäen lukuunottamatta * · · kaikki glykosylointi. Ihmisen kypsän proteiinin, joka vas-V taa kuviossa 5 esitettyä sekvenssiä, ennustettu molekyyli-
I I
paino on 17 387 daltonia, jättäen lukuunottamatta glykosy-: 35 lointi. Tässä patenttijulkaisussa käytettynä ilmaus "kyp- i I < 8 103987 sä" tarkoittaa aina proteiinia ilmennettynä muodossa, josta puuttuu johto (leader) -sekvenssi, jollainen voi olla läsnä alkuperäisen geenin täysipitkissä transkripteissä.
"Olennaisesti homologinen" tai "olennaisesti ident-5 tinen", jotka voivat viitata sekä nukleiinihappo- että aminohapposekvensseihin, tarkoittaa, että nimenomainen kysymyksessä oleva sekvenssi, esimerkiksi mutanttisek-venssi, eroaa vertailusekvenssistä yhden tai useamman substituution, deleetion tai lisäyksen johdosta, joiden net-10 tovaikutus ei johda epäedulliseen funktionaaliseen erilaisuuteen vertailusekvenssin ja kysymyksessä olevan sekvenssin kesken. Tämän keksinnön tarkoituksia varten aminohapposekvenssejä, joissa on yli 90-prosenttia yhdenmukaisuutta, joilla on ekvivalenttinen biologinen asktii-15 visuus ja toisiaan vastaavat ilmentymisominaisuudet, pidetään olennaisesti identtisinä tai homologisina ja ne sisältyvät niiden proteiinien piiriin, jotka määritellään termillä "interleukiini-7". Aminohapposekvenssejä, joissa on yli 40 prosenttia yhdenmukaisuutta, pidetään olen-20 naisesti samanlaisina. Nukleiinihapposekvenssejä määritel täessä kaikkia kysymyksessä olevia nukleiinihapposekvenssejä, jotka kykenevät koodaamaan olennaisesti homolo- a · j, gisia tai samanlaisia aminohapposekvenssejä, pidetään a i : " olennaisesti homologisina tai samanlaisina vertailunuk-
f I I • I
25 leiinihapposekvenssin kanssa. Määritettäessä homologiaa * · ·.’·· tai samanlaisuutta tulisi jättää huomioon ottamatta ver- • · · tailusekvenssin typistäminen tai sisäiset deleetiot. Sek- venssejä, joilla on pienemmät homologia-asteet ja joilla on verrattavissa oleva bioaktiivisuus, pidetään vastik- .·;·. 30 keina. Tämän keksinnön tarkoituksia varten IL-7-proteiinin * * * "alayksikön" katsotaan käsittävän vähintään 20 aminohapon • · · aminohapposekvenssin.
• · V.' "Rekombinantti" tarkoittaa tässä käytettynä, että • · · :.tl: proteiini on saatu rekombinantti (esim. mikrobi tai nisäk- t :\\ 35 kään) -ilmentämissysteemeistä, joihin voi sisältyä minkä • t • « 9 103987 tahansa lajin solujen transformointi alan asiantuntijoiden tuntemien tekniikkojen avulla. "Mikrobi-" viittaa rekom-binanttiproteiineihin, jotka on valmistettu bakteeri tai sieni (esim. hiiva) -ilmentämissysteemeissä. Tuotteena 5 "rekombinanttimikrobi-" määrittelee proteiinin, joka on olennaisesti vapaa muista alkuperäisistä endogeenisistä aineista ja jossa ei ole mukana siihen liittyvää alkuperäistä glykosylointia. Useimmissa bakteeriviljelmissä, esim. E.colissa, ilmentynyt proteiini on vapaa glykanista; 10 hiivassa ilmentyneessä proteiinissa on erilainen'glykosy- loitumismalli kuin nisäkässoluissa ilmennetyssä.
"Eristetty DNA-sekvenssi" viittaa DNA-polymeeriin, joka on erillisen fragmentin muodossa tai suuremman DNA-rakenteen osana ja joka on saatu DNA:sta, joka on eristet-15 ty ainakin kerran olennaisesti puhtaassa muodossa, toisin sanoen vailla epäpuhtauksina olevia endogeenisiä aineita ja sellaisena määränä tai konsentraationa, joka mahdollistaa sekvenssin ja sen osanukleotidisekvenssien identifioinnin, manipuloinnin ja talteenoton yleisten bioke-20 miallisten menetelmien avulla, esimerkiksi käyttäen kloo- nausvektoria. Sellaiset eristetyt sekvenssit tarjotaan edullisesti sellaisen avoimen lukuraamin muodossa, jota * « i eivät keskeytä sisäiset vaille translaatiota jäävät sek- • · • " venssit eli intronit, joita on tyypillisesti läsnä eukary- '···' 25 oottigeeneissä. Vaille translaatiota jääviä DNA-sek- • % venssejä voi olla läsnä avoimesta lukuraamista myötävir- · « taan, jossa ne eivät häiritse koodavien alueiden käsitte- : lyä tai ilmentämistä. "Nukleotidisekvenssi" viittaa deok- siribonukleotidien heteropolymeeriin. Tämän keksinnön tar- 30 joamia proteiineja koodaavat DNA-sekvenssit kootaan yleen- ' .·:*. sä cDNA-kappaleista ja lyhyistä "linker"-oligonukleoti- * deistä tai sarjasta oligonukleotideja sellaisen synteet- • · r «'·' tisen geenin aikaansaamiseksi, jota voidaan ilmentää re- • i i kombinanttitranskriptioyksikössä. IL-7-DNA: itä voidaan jV. 35 myös eristää minkä tahansa nisäkässolun genomi-DNA:sta.
• < •III I « 10 103987 "Rekombinantti-ilmentämisvektori" viittaa plas-midiin, joka sisältää transkriptioyksikön, joka sisältää seuraavat osat: 1) geneettisen elementin tai elementtejä, joilla on sääte-5 lytehtävä geenin ilmentämisessä, esimerkiksi promoottoreita tai vahvistajia (enhancer); 2) rakenne- eli koodaavan sekvenssin, jolle tapahtuu transkriptio mRNArksi ja translaatio proteiiniksi, ja 3) sopivan transkription aloitus- ja lopetussekvenssin. 10 Rakenne-elementit, jotka on aiottu käytettäviksi hiivail- mentämissysteemeissä, sisältävät edullisesti johto (leader) -sekvenssin, jonka ansiosta isäntäsolu kykenee erittämään translaation jälkeen proteiinin solun ulkopuolelle. Vaihtoehtoisesti, kun rekombinanttiproteiini iltnes-15 tyy ilman johto- eli kuljetussekvenssiä, se voi sisältää N-terminaalisen metioniinijäännöksen. Tämä jäännös voidaan valinnaisesti myöhemmin lohkaista ilmentyneestä rekombi-nanttiproteiinista, jolloin saadaan lopullinen tuote. Vek-toreihin, jotka ovat mahdollisesti käyttökelpoisia biolo-20 gisesti aktiivisten IL-7-proteiinien ilmentämisessä, sisältyy myös viruksia, esim. faagi, tai DNA-kappaleita, jotka voivat integroitua isännän genomiin rekombinaation
• t I
avulla.
• I
• " "Rekombinanttimikrobi-ilmentämissysteemi" tarkoit- 25 taa sellaisten sopivien isäntämikro-organismien, esimer-
• I
kiksi sellaisten bakteerien kuin E.coll tai sellaisen hii-
«M
van kuin S.cerevisiae, jotka ovat stabiilisti integroineet rekombinanttitranskriptioyksikön kromosomaaliseen DNA:hän tai sisältävät rekombinanttitranskriptioyksikön niissä ;*j\ 30 pysyvästi olevan plasmidin osana, olennaisesti homogeenis- ta monoviljelmää. Yleensä systeemin muodostavat solut ovat yhdsen ainoan kantatransformantin jälkeläisiä. Tässä mää-'·' ritellyn mukaiset rekombinantti-ilmentämissysteemit ilmen- tävät heterologista proteiinia ilmennettävään DNA-sek- « •'Λ i 103987 il venssiin tai synteettiseen geeniin liitettyjen säätelyele-menttien indusoinnin jälkeen.
2. IL-7-määrityksen ja faktorin solulähteiden kehittäminen 5 Käytettiin B-solun edeltäjien in vitro-viljelysys- teemiä hiiren luuydinperuskudoksen solujen soluviljelmässä erittämän sellaisen tekijän identifioimiseksi, joka säätelee esi-B-solujen kasvua. Havaittu esi-B-solujen kasvun täydellinen riippuvuus niiden peruskudossyöttökerroksista 10 Whitlock-Witte-viljelmissä viittasi siihen, että perusku-doksen solut tuottavat esi-B-solujen kasvua stimuloivaa aktiivisuutta. Tämän kasvuaktiivisuuden karakterisoimisek-sl kehitettiin kvantitatiivinen määritys ja etsittiin esi-B-solujen kasvua edistävän aktiivisuuden solulähde.
15 Ensimmäisissä yrityksissä kehittää bioanalyysi käy tettiin pitkäaikaisista peruskudosluuydin (syöttö) -kerroksista saatuja soluttomia supernatantteja kasvua edistävän aktiivisuuden lähteenä. Yleensä määrityksen tulokset olivat epämääräisiä, koska todettu stimulaatiokerroin oli 20 ainoastaan kaksin- - nelinkertainen taustaan verrattuna. Tämä vastaa tuloksia, joita ovat selostanewet Whitlock et ai., Cell 48:1009 (1987), ja Hunt et ai., Cell 48:997 !. (1987). Tämän esteen kiertämiseksi ja kasvutekijän sopivan solulähteen perustamiseksi, aikaansaatiin kuolemattomaksi 25 tehty solulinja transfektoimalla pitkäaikaisista luuydin- * · · '· ” viljelmistä saatuja peruskudossoluja pSV3neo-plasmidilla, « · · joka sisälsi SV40-T-antigeenitransformointisekvenssit.
• · · ·* Yhden tulokseksi saadun kloonisolulinjan, jolle annettiin nimitys IxN/A6, todettiin konstitutiivisesti tuottavan 30 tekijää, joka kykeni ylläpitämään edeltäjä-B-solujen kas-' vua. Myöhemmin todettiin, että verrattavissa olevia tasoja esi-B-solujen kasvua edistävää aktiivisuutta voitiin tuot-taa, kun soluja kasvatettiin seerumittomissa olosuhteissa • · « määrän 1 pg/ml LPS läsnäollessa.
• « • « t
« I
12 103987 Määrityksen herkkyyden optimoimiseksi hankittiin erittäin rikastettu edeltäjä-B-solujen populaatio pitkäaikaisista luuydinviljelmistä. Käytettiin lisäksi solujen rikastusvaihetta, jossa johdettiin G-10-Sephadexin kaut-5 ta, jottga saataisiin homogeenisempi populaatio, joka kykenisi synnyttämään sopivia biologisen määrityksen tuloksia. Tämän määrityssysteemin spesifisyys testattiin muiden määriteltyjen fafktorien avulla. Mikään testatuista faktoreista, mukaan lukien IL-Ια, IL-1B, IL-2, IL-3, IL-4, 10 IL-5, GM-CSF, G-CSF, CSF-1, BSF-2, alfa-, beeta- ja gamma- interferoni, neuroleukiini ja transformoiva kasvutekijä beeta, ei kyennyt aiheuttamaan tymidiinin liittymisen sti-muloitumista taustan tasoja enemmän käytettäessä sarjaa faktorien konsentraatioita. Lisäksi puhdistettu mIL-7 ei 15 aiheuttanut mitään vastausta IL-l:n, IL-2:n, IL-3:n, GM-CSF:n (FDCP2-1D), IL-4:n, IL-5:n, G-CSF:n, CSF-l:n ja interferonin standardibiomäärityksissä. IxN/A6-solulinjalta saadut soluttomat supernatantit stimuloivat kuitenkin hiiren makrofaagityyppiä olevien kolonioiden muodostumista 20 pehmytagarissa. IxN/A6:n avulla sopivaan kuntoon saatetun viljelyaineen faktiointi DEAE-Sephacel-kromatografian avulla erotti kolonioita stimuloivan aktiivisuuden esi-B-
i · I
!. solujen kasvua edistävästä aktiivisuudesta. Alla on kuvat- — · t tu edullinen IL-7-aktiivisuuden määrityksen ohje.
« I
';·[ 25 3. IL-7:n biologisen aktiivisuuden määritys • · · *· " Esi-B-soluedeltäjäpopulaation perustamiseksi aloi- • · # ·...· tettiin ja ylläpidettiin luuydinviljelmiä kuten ovat ku- ·’ vanneet Whitlock et ai., J. Immunol. Meth. 67:353 (1983), RPMI 1640:ssä, johon oli lisätty valittuna yhdistelmänä 30 5 % sikiökutisen naudan seerumia (FBS) (Irvine Scientific,
Santa Clara, CA, USA), 50 μΜ 2-merkaptoetanolia, 50 U/ml penisilliiniä, 50 pg/ml streptomysiiniä ja 2 mM L-gluta- • f r miinia.
’' Ei-adherentteihin hematopoieettisiin soluihin, joi- ·'<' 35 ta saadaan tämän tyyppisestä viljelyssysteemistä, on osoi- 13 103987 tettu sisältyvän B-kantasoluja, esi-B-soluja ja joitakin varhaisia B-soluja. Katso Whitlock et ai.. Cell 32:903 (1983). On merkillepantavaa, että Dorshkind et älä, J. Immunol. 137:3457 (1986), ovat osoittaneet sellaisista 5 luuydinviljelmistä peräisin olevien solujen kykenevän muodostamaan uudelleen sekä B-solujen että T-solujen osaston yhdistetysti immunopuutoksisilla hiirillä, mikä osoittaa, että näissä viljelmissä voi myös olla läsnä lymfoidikanta-soluelementti. Toistaiseksi ei reagoivien solujen täydel-10 listä luetteloa ole määritetty, mutta selvästikin tähän populaatioon kuuluu B-linjan edeltäjäsoluja. Näillä soluilla on imusolun ulkomuoto, johon kuuluu suuri tuma ja kapea solulimakehä, mikä vastaa esi-B-solun fenotyyppiä.
Määritystä varten ei-adherentteja esi-B-soluja 15 poistetaan Whitlock-Witte-viljelmien adherenteista perus- kudoskerroksista varovaisesti pipetin avulla, pelletoidaan sentrifugoimalla ja uudelleensuspendoidadan 1-2 ml:aan Iscoves-muunnettua Dulbeccos-elatusainetta (IMDM), joka sisältää 5 % FBS, 50 U/ml penisilliiniä, 50 pg/ml strep-20 tomysiiniä ja 2 mM L-glutamiinia (määrityksen väliaine).
Solut lisätään sitten pieneen Sephadex G-10 (toiminimen Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Uppsdala, SE, tava-!. ramerkki geelisuodatusmateriaalia varten) -pylvääseen käyttäen tiheyttä alle 10e solua ml kohden geeliä, mahdol-25 listen paikaltaan siirtyneiden, epäpuhtautena olevien ad- • · · *· “ herenttien eli peruskudossolujen poistamiseksi ja sitten ·»» ·...· inkuboidaan huoneen lämpötilassa 10 minuutin ajan, kuten • · · : ovat kuvanneet Ly et ai., J. Immunol. Meth. 5:239 (1974).
Esi-B-solut eluoidaan sitten G10-pylväästä määrityksen 30 väliaineella, pestään ja uudelleensuspendoidaan tiheydeksi :'j‘. 2,5 x 105 solua/ml määrityksen väliaineeseen. Analysoita- * vista näytteistä tehdään laimennossarja 96 syvennyksen • t f mikrotiitterilevyn yksittäisiin syvennyksiin käyttäen lo-'·.· pullista tilavuutta 50 ml. 50 μΐ solususpensioita (12 500 35 solua/syvennys) lisätään kuhunkin syvennykseen ja levyjä 14 103987 inkuboidaan 48 tunnin ajan kostutetussa C02-kasvatuskaapis-sa, joka sisältää 7,5 5 C02, loput N2. Viljelmille annetaan inkubaation neljän viimeisen tunnin aikana pulsseja käyttäen 2 pCi/syvennys tritiumilla merkittyä tymidiiniä (3H-5 TdR; NEN, 60-80 Ci/millimooli) 25 mikrolitran tilavuudessa. Viljelmät kootaan automaattisen kokoajan avulla lasi-kuitusuodattimille ja liittynyt radioaktiivisuus määritetään nestetuikelaskemisen avulla. Yksi IL-7:n yksikkö määritellään faktorin määräksi, joka vaaditaan aiheuttamaan 10 puolimaksimaalinen 3H-TdR:n liittyminen yllä kuvatun IL- 7-määrityksen olosuhteissa.
Tyypillisten esi-B-solujen lisääntymisen määritysten, joissa on käytetty raakoja ja puhdistettuja rekom-binantti-IL-7-valmisteita, tulokset on esitetty kuviossa 15 6, esitys A.
4. Puhdistetun alkuperäisen proteiinin eristäminen Puhdistusmenetelmien kehittäminen hiiren IL-7 varten paljasti, että tekijän biologinen aktiivisuus on stabiili laajassa valikoimassa olosuhteita, joihin sisältyi 20 äärimmäisiä pH-arvoja (2,1-9,0) ja liuoksia, jotka sisälsivät orgaanisia liuottimia asetonitriili ja n-propanoli. .·, Aktiivisuuden erottaminen SDS-PAGEn (natriumdodesyyli-
· I
sulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi) avulla osoitti, että IL-7-aktiivisuus liittyi proteiiniin, jonka • % ;·\ 25 Mr oli 25 000, ja oli stabiili SDS:n läsnäollessa ja • · · *· 70 eC:n lämpötiloissa. Kuitenkin proteiinin pelkistäminen • · « • · antamalla sen olla kosketuksissa 1 % 2-merkaptoetanolin • · · · kanssa tuhosi täysin sen biologisen aktiivisuuden, mikä osoittaa solunsisäisten disulfidisidosten läsnäolon. Pre-30 paratiivinen SDS-PAGE erotti yhden ainoan proteiinin, jon-:*·*: ka Mr oli 25 000 ja joka sattui yhteen biologisen aktiivi- suuden kanssa. Lisäksi radioaktiivisuudella merkitty « · IL-7 sitoutui spesifisesti soluihin, jotka reagoivat tähän tekijään, mikä viittaa siihen, että IL-7 muiden polypepti-35 dihormonien tavoin sitoutuu spesifisiin reseptoreihin so-
• I
15 103987 lujen pinnalla. Puhdistusmenetelmästä oli seurauksena 10-miljoonakertainen puhdistuminen ja 35 % lopullinen saanto. Edman-pilkkomisen avulla saatu N-terminaalinen sekvenssi oli X-X-His-Ile-Lys-Asp-Lys-Glu-X-Lys-Ala-Tyr-Glu-X-Val-5 Met, joka oli ainutlaatuinen verrattaessa julkaistujen proteiinisekvenssien tietokantaan.
Puhdistetun IL-7:n arvioitu spesifinen aktiivisuus oli noin 4 x 106 yksikköä/pg proteiinia ja se oli aktiivinen konsentraationa 10"1 pM, joka perustui proteiinikon-10 sentraation silmämääräisiin arvioihin, jotka oli tehty hopealla värjätyn SDS-PAGEn värin voimakkuuden perusteella.
Tätä ensimmäistä spesifisen aktiivisuuden arviota esi-B-solujen lisääntymisen määrityksessä on korjattu 15 alaspäin proteiinikonsentraatioiden tarkempien määritysten valossa. Puhdistetun rekombinantti-IL-7:n spesifinen aktiivisuus esi-B-solujen lisääntymisen määrityksessä näyttää olevan väliltä 1-2 x 105 yksikköä/pg.
5. cDNAriden eristäminen 20 Hiiren koodaavan sekvenssin varmistamiseksi mlL- 7:n koodaava DNA-sekvenssi eristettiin cDNA-kirjastosta, joka oli valmistettu transformoidulta hiiren peruskudosso-lulinjalta lxN/A6 eristetyn polyadenyloidun RNA:n kään-
I I
: ' teiskopioinnin avulla. Kirjastoa seulottiin ilmentämällä r i ( 25 suoraan yhteen saatettuja cDNA-kappaleita apinan COS-7-soluissa käyttäen nisäkkään ilmentämisvektoria (pDC201), joka käyttää SV40:ltä ja adenovirus 2:lta peräisin olevia säätelysekvenssejä. Suunnilleen 720 000 cDNArta seulottiin suunnilleen 1000 cDNA:n yhteen saatettuina ryhminä, kunnes .·:*. 30 yhden transfektanttiryhmän supernatantin analyysi osoitti tymidiinin liittymisen kymmenkertaista lisääntymistä taus- • · « [· taan verrattuna. Tästä positiivisesta ryhmästä saatua jää- tynyttä bakteerimäärää käytettiin sitten suunnilleen 200 koloniaa sisältävien maljojen saamiseksi. Kullakin näistä ;v 35 maljoista olevista kolonioista saatu plasmidi-DNA yhdis- 16 103987 tettiin transformoitiin COS-7-soluihin ja positiivinen joukko identifioitiin. Tästä joukosta peräisin olevia yksittäisiä kolonioita seulottiin, kunnes identifioitiin yksi ainoa klooni, joka määräsi sellaisen 25 kilodaltonin 5 proteiinin synteesiä, jolla oli todettavissa oleva IL-7-aktiivisuus. Tämä klooni eristettiin ja sen insertti sek-venssoitiin hiiren cDNA:n koodaavan sekvenssin määrittämiseksi, joka sekvenssi on esitetty kuviossa 2. Tämä cDNA sisältää pitkähkön 548 emäsparin vaille translaatiota jää-10 vän alueen translaation aloituskohdan vieressä. Kypsän proteiinin alkamiskohta pääteltiin vertaamalla N-ter-minaaliseen aminohapposekvenssiin, joka oli saatu A6-solu-jen supernatanteista peräisin olevista erittäin hyvin puh-distetuisfä-7-valmisteista. Koodaava alue sisältää kuusi 15 kysteiinijäännöstä ja kaksi potentiaalista N-glykosyloin- tikohtaa.
Hiiren sekvenssin avulla rakennettiin koettimia ja niitä käytettiin sellaisten ihmisen genomi-DNA-kirjastojen ja ihmisen cDNA-kirjastojen seulomiseen, jotka oli saatu 20 ihmisen maksan adenokarsinoomasolulinjan SK-HEP-1 (ATCC HTB-52) viljelmistä. cDNA-klooneja, jotka hybridisoituivat ihmisen genomisekvensseistä johdettuihin oligonukleotidi- • I i λ koettimiin ja koettimiin, jotka käsittivät valittuja hii- « i *,,, ren geenin 3'- ja 5'- vaille translaatiota jääviä sek- < r 25 venssejä, eristettiin sitten ja sekvenssoitiin. Täten • · · *· *· eristetty kokonainen cDNA-sekvenssi on esitetty kuviossa 4 · $ · ·...’ ja saatu koodaava sekvenssi on esitetty kuviossa 5.
M» ·.· ; Ihmisen IL-7:n koodaa monen eksonin geeni. Eris tettäessä kuviossa 4 kuvattu cDNA-klooni havaittiin useita 30 vaihtoehtoisia mRNA-rakennelmia, joiden voidaan katsoa johtuvan erilaisista mRNA:n katkomis- ja uudelleenyhdis- .·. tely (splicing) -tapahtumista transkription jälkeen. Näi- • » « den vaihtoehtoisten rakenteiden, joilla on suuria homolo-*··' gian alueita tässä erityisesti patenttivaatimuksissa esi-
I I
• · · • « • · « · ia 17 103987 tettyjen cDNA:iden kanssa, katsotaan kuuluvan tämän keksinnön piiriin.
6. Synteettisiä DNA-rakennelmia Tämän keksinnön nukleiinihappototeutuksina tar-5 jotaan DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat nisäkkäiden IL-7:iä, IL-7:n analogeja ja alayksikköjä. Esimerkkejä nisäkkäiden IL-7:istä ovat kädellisen IL-7, ihmisen IL-7, hiiren, koiran, kissan, hevosen, naudan, sian, lampaan, hirven ja vuohen IL-7. IL-7-DNA:t tarjotaan edullisesti muo-10 dossa, jota on mahdollista ilmentää rekombinanttitrans-kriptioyksikössä nisäkkään, mikrobin tai viruksen transkriptio- tai translaatiosäätelyelementtien säätelyn alaisena. Esimerkiksi mikro-organismissa ilmennettävä sekvenssi ei sisällä introneja. Edullisesti DNA-sekvenssit 15 käsittävät vähintään yhden, mutta valinnaisesti useamman kuin yhden sekvenssikomponentin, joka on saatu cDNA-sekvenssistä tai sen kopiosta. Sellaisiin sekvensseihin voi olla liittyneinä tai niitä voivat reunustaa DNA-sekvenssit, jotka on valmistettu kokoamalla synteettisiä oli-20 gonukleotideja. Esimerkkisekvenssejä ovat sellaiset, jotka ovat olennaisesti homologisia kuviossa 3 ja kuviossa 5 .·. esitettyjen nukleotidisekvenssien kanssa. Valinnaisesti !. voivat koodaavat sekvenssit sisältää kodoneja, jotka koo- daavat yhden tai useampia lisäaminohappoja, jotka sijait-25 sevat N-päässä, esimerkiksi N-termi naali sen ATG-kodonin, • · » *· '* joka määrää lukuraamiin nukleotidisekvenssin kanssa liit- tyneen metioniinin. Koodin degeneraation vuoksi voi esiin- ·«· \* · tyä huomattavaa vaihtelua nukleotidisekvensseissä, jotka koodaavat saman aminohapposekvenssin; yksi esikuvallinen :*·*: 30 DNA-toteutus on se, joka vastaa kuvion 3 nukleotidien :*·*· 1-387 sekvenssiä. Synteettiset DNA-sekvenssit, jotka koo- daavat IL-7-proteiineja ja jotka käsittävät nukleotidisek- * « · venssejä, joita on muutettu sisältämään restriktiokohtia i '···' tai edullista kodonikäytäntöä bakteerissa ilmentämistä 35 varten, sisältyvät keksinnön piiriin.
• · • · 18 103987 Tässä keksinnössä tarjotaan myös ilmentämisvekto-reita hyödyllisten määrien puhdistettua IL-7:ä tuottamiseksi, jotka vektorit voivat sisältää nisäkkäiden IL-7:iä tai IL-7:n analogeja tai alayksikköjä koodaavia 5 synteettisiä tai cDNA:sta saatuja DNA-kappaleita toimivasti liitettynä säätelyelementteihin, jotka ovat peräisin nisäkkään, bakteerin, hiivan, bakteriofaagin tai viruksen geeneistä. Hyödyllisiä säätelyelementtejä on kuvattu yksityiskohtaisemmin alla. Sopiviin solulinjoihin transfor-10 moinnin tai transfektoinnin jälkeen sellaiset vektorit voidaan indusoida ilmentämään rekombinanttiproteiinia.
7. Rekombinantti-ilmentämisjärjestelmiä
Nisäkkäiden IL-7:iä voidaan ilmentää nisäkkäiden tai hyönteisten soluissa, hiivassa, bakteereissa tai muis-15 sa soluissa sopivien promoottorien säätelyn alaisena. Solut tornia translaatiojärjestelmiä voitaisiin myös käyttää nisäkkään IL-7:n tuottamiseen käyttäen tämän keksinnön mukaisista DNA-rakennelmista saatuja RNA:ita. Sopivia kloonaus- ja ilmentämisvektoreita käytettäviksi baktee-20 ri-, sieni-, hiiva- ja nisäkässoluisännissä ovat kuvanneet Pouwels et ai., Clonig Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York, 1985), jonka asiaan kuuluva sisältö
< I I
liitetään tähän viitteenä.
Rekombinanttiproteiinin ilmentämiseen voidaan käyt- • < 25 tää monenlaisia nisäkässoluviljelmäjärjestelmiä. Esimerk- f ( f ’•4|* kejä nisäkkään ilmentämisjärjestelmistä ovat apinan munu- *...* aisen fibroblastien C0S-7-linjat, joita on kuvannut Gluz- • · « V ' man, Cell 23:175 (1981), ja muut solulinjat, jotka kykene vät ilmentämään niiden kanssa yhteen sopivaa vektoria, :T: 30 esimerkiksi C127-, 3T3-, CHO-, HeLa- ja BHK-solulinjat.
Nisäkkäiden ilmentämisvektorit voivat sisältää sellaisia kopioitumattomia elementtejä kuin replikaation aloituskoh- « * * dan, sopivan promoottorin ja vahvistajan (enhancer), ja muita 5’- ja 3'- reunustavia kopioitumattomia sekvenssejä 35 ja 5'- ja 3'- vaille translaatiota jääviä sekvenssejä, • · 19 103987 kuten esimerkiksi tarpeellisia ribosomin sitoutumiskohtia, polyadenylaatiokohdan, muokkaus (splice) -donori- ja -ak-septorikohtia ja terminaatiosekvenssejä. SV40-virus-genomista saatuja DNA-sekvenssejä, esimerkiksi SV40-aloi-5 tuskohtaa, varhaista promoottoria, vahvistajaa, muokkaus (splice) ja polyadenylaatiokohtia voidaan käyttää tarjoamaan muut geneettiset elementit, jotka vaaditaan hete-rologisen DNA-sekvenssin ilmentämistä varten. Lisäyksi-tyiskohtia nisäkkäiden runsaan ilmentämisen vektorien käy-10 töstä on esitetty alla esimerkeissä 3 ja 8. Esimerkkivek-toreita voidaan rakentaa kuten ovat esittäneet Okayama ja Berg, Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983), Cosman et ai., Nature 312:768 (1984), Cosman et ai., Mol. Immunol. 23:935 (1986) tai Clark et ai., US-patentti 4 675 285.
15 Hiivajärjestelmiä, edullisesti käyttäen Sacc- haromyces-lajeja, kuten esimerkiksi lajia S.cerevisiae, voidaan myös käyttää tämän keksinnön mukaisen rekom-binanttiproteiinin ilmentämiseen, samoin kuin muiden sukujen hiivoja, esimerkiksi sukujen Plchia tai Kluyveromyces. 20 Yleensä hyödylliset hiivan vektorit sisältävät rep- likaation aloituskohtia ja selektoitavia merkkigeenejä, jotka sallivat sekä hiivan että E.colin transformoinnin, esimerkiksi E.colin ampisilliiniresistenssigeenin ja S.ce-
• I I
revlslaen TRP1-geenin, ja promoottorin, joka on peräisin !", 25 runsaasti ilmennetystä hiivan geenistä, myötävirtaan si-
• · I
jaitsevan rakennegeenin transkription indusoimiseksi.
*···* Sellaisia promoottoreita voidaan saada hiivan transkrip- • * · ; tioyksiköistä, jotka koodaavat runsaasti ilmennettyjä gee nejä, kuten esimerkiksi 3-fosfoglyseraattikinaasin (PGK), sj*: 30 a-tekijän, happaman fosfataasin tai lämpöshokkiproteiineja ym. Heterologinen rakennesekvenssi kootaan sopivaan raa- .’. miin translaation aloitus- ja lopetussekvenssin ja edul- • · « lisesti sellaisen johtosekvenssin kanssa, joka kykenee • · '·;·* ohjaamaan translaation jälkeen proteiinin erittymisen so- » > · \ 35 lun ulkopuoliseen väliaineeseen. Valinnaisesti heterologi- • · 20 103987 nen sekvenssi voi koodata fuusioproteiinin, johon sisältyy ! N-terminaalinen identifiointipeptidi (esim. Asp-Tyr-Lys- (Asp)4-Lys) tai muu sekvenssi, joka antaa toivottuja ominaisuuksia, esim. ilmentyneen rekombinanttituotteen stabi-5 loitumista tai yksinkertaistuneen puhdistuksen.
Hyösyllisiä hiivan vektoreita voidaan koota käyttäen pBR322:sta peräisin olevia DNA-sekvenssejä E.colissa valintaa ja replikaatiota varten (Ampr-geeni ja replikaa-tion aloituskohta) ja hiivan DNA-sekvenssejä mukaan lukien 10 glukoosilla repressoituva alkoholidehydrogenaasi 2 (ADH2)-promoottori. ADH2-promoottorin ovat kuvanneet Russell et ai., J. Biol. Chem. 258:2674 (1982) ja Beier et ai., Nature 300:724 (1982). Sellaiset vektorit voivat myös sisältää hiivan TRP1-geenin selektoitavana merkkigeeninä ja 15 hiivan 2 μ - replikaation alkoituskohdan. Hiivan johto (leader) -sekvenssi, esimerkiksi a-tekijäjohtosekvenssi, joka ohjaa heterologisten proteiinien erittymisen hiiva-isännästä, voidaan sijoittaa promoottorin ja ilmennettävän rakennegeenin väliin. Katso Kurjan et ai., US-patentti 4 20 546 082; Kurjan et ai., Cell. 30:933 (1982); ja Bitter et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:5330 (1984). Johtosek-venssiä voidaan muuntaa sisältämään lähellä sen 3'-päätä ;·, yksi tai useampia hyödyllisiä restriktiokohtia, jotta hei- I ' «Il potettaisiin johtosekvenssin fuusiointia vieraisiin gee-25 neihin.
• · ·
Alan asiantuntijat tuntevat sopivia hiivan trans- • · *·*·* formointi-menettelyjä; esimerkkitekniikan ovat kuvanneet ·«· *.· * Hinnen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929 (1978), jossa valitaan Trp+-transformantteja selektiivisessä vil-: 30 jelyaineessa, jonka muodostaa 0,67 % hiivan typpiperustaa, :*·*: 0,5 % casaminohappoja, 2 % glukoosia, 10 Mg/ml adeniinia ja 20 Mg/ml urasilia.
Isäntäkantoja, jotka on transformoitu ADH2-promoot- i i *··* torin sisältävillä vektoreilla, voidaan kasvattaa ilmentä- ! ·’: 35 mistä varten rikkaassa elatusaineessa, jonka muodostaa 1 % —: · ___: * a v · 21 103987 hiivauutetta, 2 % peptonia ja 1 % glukoosia ja jossa on täydennyksenä 80 yg/ml adeniinia ja 80 pg/ml urasilia. ADH2-promoottorin derepressio tapahtuu elatusaineen glukoosin loppuessa. Raa'at hiivan supernatantit kootaan suo-5 dattamalla ja pidetään 4 °C:ssa ennen lisäpuhdistusta. Hiivailmentämisjärjestelmän käyttö rekombinanttinisäkäs-lL-7:n tuottamiseksi on kuvattu alla esimerkissä 4.
Hyösyllisiä ilmentämisvektoreita bakteerikäyttöä varten kokoonpannaan liittämällä nisäkkään IL-7:n koodaava 10 rakenne-DNA-sekvenssi yhdessä sopdivien translaation aloitus- ja lopetussignaalien kanssa toimivaan lukuraamiin funktionaalisen promoottorin kanssa. Vektori sisältää yhden tai useampia fenotyypin perusteella selektoitavia merkkigeenejä ja replikaation aloituskohdan takaamaan mo-15 nistumisen isännässä. Sopivia prokaryootti-isäntiä transformaatiota varten ovat E.coli, Bacillus subtilis. Salmonella typhimurlum ja sukujen Pseudomonas, Streptomyces ja Staphylococcus useat eri lajit, vaikka voidaan myös käyttää muita valinnan mukaan.
20 Ilmentämisvektoreita rakennetaan sopivasti leik kaamalla cDNA-klooneja kohdista, jotka ovat lähellä kypsän proteiinin N-terminaalisen jäännöksen koodaavaa kodonia.
:·. Esimerkiksi hiiren cDNA voidaan leikata Ndel:llä tai
• « I
’·· Clal:llä tai ihmisen cDNA Clal:llä, jolloin aikaansaadaan 25 palanen, joka sisältää olennaisesti koko koodaavan alueen.
• 1 1
Voidaan sitten käyttää synteettisiä oligonukleotideja koo- • · ’·1·’ daavan alueen mahdollisten poistettujen osien "lisäämisek- : si takaisin" ja tarjoamaan liittämissekvenssi koodaavan kappaleen yhdistämiseksi ligaation avulla sopivaan luku- ··· · 30 raamiin ilmentämisvektoriin, ja valinnaisesti kodoni, joka määrää aloitusmetioniinin.
•
Edustavana mutta ei rajoittavana esimerkkinä mai- • · « M nittakoon, että hyödylliset ilmentämisvektorit bakteereis- * · ·" sa käyttöä varten voivat sisältää selektoitavan merkkigee- « · · • V 35 nin ja bakteeri-replikaation aloituskohdan, joka on peräi- · 22 103987 sln kaupallisesti saatavissa olevista plasmideista, jotka sisältävät tunnetun kloonausvektorin pBR322 (ATCC 37017) geneettisiä elementtejä. Sellaisia kaupallisia vektoreita ovat esimerkiksi pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, 5 Uppsala, _Sweden) ja pGEMl (Promega Biotec, Madison, wi, USA). Nämä pBR322-"runko"-osat yhdistetään sopivan promoottorin ja ilmennettävän rakennesekvenssin kanssa. Eräässä erityisen hyödyllisessä bakteeri-ilmentämisjärjestelmässä käytetään faagi-gamma-PL-promoottoria ja cI857ts-10 lämpöherkkää repressoria. Kokoelmasta the American Type Culture Collection saatavissa olevia plasmidivektoreita, jotka sisältävät gamma-PL-promoottorin johdannaisia, ovat plasmidi pHUB2, joka sijaitsee E♦coli-kannassa JMB9 (ATCC 37092), ja pPLc28, joka sijaitsee E.coli RRlrssä (ATCC 15 53082). Muita hyödyllisiä promoottoreita E.colissa ilmen tämistä varten ovat T7-RNA-polymeraasipromoottori, jonka ovat kuvanneet Studier et ai., J. Mol. Biol. 189:113 (1986), IacZ-promoottori, jonka on kuvannut Lauer, J. Mol. Appi. Genet. 1:139-147 (1981) ja joka on saatavissa ATCC 20 37121:nä, ja tac-promoottori, jonka on kuvannut Maniatis,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, s. 412) ja joka on saatavissa ATCC
« 37138:na «
Sen jälkeen kun sopiva isäntäkanta on transformoitu ; , 25 ja isäntäkanta on kasvatettu sopivaan solutiheyteen, väli- I ( i 'I"· tun promoottorin repressio kumotaan käyttäen asianmukaista • · *···* keinoa (esim. lämpötilan muutos tai kemiallinen induktio) M· V ' ja soluja viljellään vielä yhden ajanjakson verran. Solut kootaan tyypillisesti sentrifugoimalla, rikotaan fysikaa-Jti : 30 listen tai kemiallisten keinojen avulla ja tulokseksi saa- tu raaka uute säilytetään lisäpuhdistusta varten. Soluja 9 kasvatetaan esimerkiksi 10 litran fermentorissa käyttäen • ♦ * • · * maksimaalisen ilmastuksen ja voimakkaan sekoituksen olo- « « suhteita. On edullista käyttää vaahdonestoainetta i ' 35 (Antifoam A). Viljelmiä kasvatetaan 30 °C:ssa superinduk- ««lii • 4 23 103987 tioelatusaineessa, jonka ovat esitelleet Mott et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:88 (1985), ja joka valinnaisesti sisältää antibiootteja, repressio kumotaan solu-tiheydellä, joka vastaa absorbanssia A600 = 0,4-0,5, nos-5 tamalla lämpötila 42 °C:seen ja viljelmät kootaan 2-20, edullisesti 3-65 tuntia lämpötilan kohottamisen jälkeen. Solumassa konsentroidadan aluksi suodattamalla tai muulla tavoin, sitten sentrifugoidaan nopeudella 10 000 x g 10 minuutin ajan 4 °C:ssa, mitä seuraa solupelletin nopea 10 jäädyttäminen.
Bakteeri-ilmentämisjärjestelmän käyttö rekom-binanttinisäkäs-IL-7:n tuottamiseksi on kuvattu alla esimerkissä 5.
8. Puhdistusmenetelmiä 15 Puhdistettuja nisäkkään IL-7:iä tai biologisesti samanarvoisia homologeja valmistetaan edullisesti viljelemällä sopivia isäntä/vektoriyhdistelmiä tämän keksinnön mukaisten synteettisten geenien rekombinanttitranslaatio-tuotteiden ilmentämiseksi, jotka tuotteet puhdistetaan 20 sitten viljelyaineesta.
Vaihtoehtoiseen menetelmään puhdistetun IL-7:n . \ tuottamiseksi sisältyy puhdistaminen soluviljelmien super- « :, natanteista. Tässä lähestymistavassa käytetään solulinjaa, joka valmistaa hyödyllisiä määriä kyseistä proteiinia.
I 25 Sellaisilta solulinjoilta saadut supernatantit voidaan i i i valinnaisesti konsentroida käyttäen kaupallisesti saata- • · *···1 vissa olevaa proteiinikonsentrointisuodatinta, esimerkiksi • · v V 1 Amicon (toiminimen W.R. Grace & Co., Danvers, MA, USA, tavaramerkki) tai Pellicon (toiminimen Millipore Corp.,
• M
ί,ί ϊ 30 Bedford, MA, USA, tavaramerkki) tai Pellicon (toiminimen :Ί'ί Millipore Corp. Bedford, MA, USA, tavaramerkki) -ultrasuo- #/.t datusyksikköä. Konsentrointivaiheen jälkeen konsentraatti • · r voidaan lisätä sopivaan anioninvaihtohartsiin, esimerkiksi j « matriisiin tai substraattiin jossa on riippuvia dietyyli- 35 aminoetyyli (DEAE)-ryhmiä. Matriisit voivat olla akryyli- r « · r i <
• I
24 103987 amidia, agaroosia, dekstraania, selluloosaa tai muita tyyppejä, joita tavallisesti käytetään proteiinien puhdistamisessa. Eräs edullinen matriisi on DEAE-Sephacel (Pharmacia). Kun käytetään DEAE-ryhmiä sisältäviä materi-5 aaleja, IL-7 sisältävät uutteet lisätään heikosti emäksisessä pH:ssa (esim. pH 8) ja natriumkloridikonsentraatios-sa (tai muun sopivan suolan) joka on noin 100 mM. Ionin-vaihtaja sitoo monet epäpuhtautena olevat proteiinit, kun taas IL-7 saadaan talteen sitoutumattomissa fraktioissa.
10 Anioninvaihtokromatografian jälkeen voidaan käyttää kationinvaihtovaihetta. Tässä vaiheessa IL-7 sisältävät fraktiot lisätään kationinvaihtajaan heikosti happamissa olosuhteissa käyttäen pientä suolakonsentraatiota (esim. pH 5, 100 mM NaCl). Ioninvaihtaja sitoo IL-7:n ja se voi-15 daan eluoida paremmin puhdistetussa muodossa suuremmissa suolakonsentraatioissa ja heikosti emäksisessä pH:ssa. Sopivia kationinvaihtajia ovat erilaiset liukenemattomat matriisit, jotka sisältävät sulfopropyyli- tai karboksime-tyyliryhmiä. Edullisina pidetään sulfopropyyliryhmiä. 20 Hyödyllinen materiaali IL-7:n puhdistamista varten on SP-Trisacryl (Pharmacia-LKB). Kationinvaihtokromatografian jälkeen on osoittautunut hyödylliseksi affiniteettivaihe
I
: " käyttäen matriisia, jossa on sininen väriaine-ligandi.
: " Sopiviin väriaineligandeihin kuuluu Blue B, joka voidaan
' I I
25 saada liittoyhdisteenä agaroosin kanssa (Blue B-agaroosi). Voidaan myös käyttää muita väriaineligandivastikkeita. Lopuksi voidaan käyttää yhtä tai useampaa käänteisfaasi- ·«« korkeapainenestekromatografia (RP-HPLC)-vaihetta käyttäen hydrofobisia RP-HPLC-materiaaleja, esim. silikageeliä, 30 jossa on riippuvia metyyli- tai muita alifaattisia ryhmiä, • · · IL-7-valmisteen puhdistamiseksi lisää. Joitakin tai kaik- • · t ’. kia edellä olevia puhdistusvaiheita, erilaisina yhdistel- • · :,V minä, voidaan myös käyttää homogeenisen rekombinanttipro- • « J : teiinin aikaansaamiseksi.
· I •
• I
• I
I
____ · « 1 « 25 103987
Bakteeriviljelmässä tuotettu rekombinanttiproteii-ni eristetään tavallisesti suorittamalla aluksi uutto so-lupelleteistä, mitä seuraa yksi tai useampia konsentroin-nin, liuoksesta irti suolaamisen, vesipitoisen ioninvaih-5 tokromatografian tai kokoon perustuvan ekskluusiokromato-grafian vaiheita. Proteiini voidaan renaturoida bakteerien suorittaman ilmentämisen jälkeen saattamalla kosketuksiin katalyyttisen pelkistimen kanssa proteiinikonsentraation ollessa 10-50 pg/ml 1-6 M guanidiini-HCl:n läsnäollessa 10 yhteenkasautumisen estämiseksi. Lopuksi voidaan käyttää korkeapaionenestekromatografiaa (HPLC) viimeisinä puhdis-tusvaiheina. Mikrobisolut, joita on käytetty rekombinant-tinisäkäs-IL-7:n ilmentämisessä, voidaan rikkoa käyttäen mitä tahansa sopivaa menetelmää, mukaanlukien vuorottainen 15 jäädytys ja sulatus, sonikointi, mekaaninen hajottaminen tai soluja liuottavien aineiden käyttö.
Hiivojen, jotka ilmentävät nisäkkään IL-7 erittyvänä proteiinina, fermentaatiokasvatus yksinkertaistaa suuresti puhdistusta. Suurimittaisesta fermentaatiokas-20 vatuksesta tuloksena oleva erittynyt rekombinanttiproteii-ni voidaan puhdistaa vastaavilla menetelmillä kuin ne, joita ovat esitelleet Urdal et ai., J. Chromatog. 296:171 • i (1984). Tässä kirjallisuusviitteessä kuvataan kaksi peräk-
« I
: käistä käänteisfaasi-HPLC-vaihetta rekombinantti-ihmis-
» I I
25 GM-CSF:n puhdistamiseksi preparatiivisen HPLC-pylvään « · ·.’·· avulla. Tässä käytettynä "puhdistettu" viittaa nisäkkään IL-7-valmisteeseen, jonka spesifinen aktiivisuus on vähintään noin 104 yksikköä mikrogrammaa (pg) proteiinia kohden sellaisessa esi-B-solujen lisääntymisen 30 määrityksessä kuin on kuvattu muualla tässä i t r patenttijulkaisussa. Puhdistettujen IL-7-valmisteiden t * * spesifinen aktiivisuus on edullisesti vähintään noin 105 • t \V yksikköä/pg.
• * t 9. Biologisesti aktiivisia proteiinianalogeja i i
• I I
I « 26 103987 Tässä keksinnössä tarjotaan sen erilaisina proteii-nitoteutuksina oleellisesti homogeenisia rekombinanttini-säkäs-IL-7-polypeptidejä, jotka ovat vapaita epäpuhtauksina olevista endogeenisistä materiaaleista ja valinnaisesti 5 ilman niin liittyvää alkuperäisen mallista glykosyloitumista. Alkuperäiset hiiren ja ihmisen IL-7-molekyylit otetaan talteen soluviljelmästä glykoproteiineina, joiden näennäinen molekyylipaino on SDS-PAGEn mukaan noin 25 ki-lodaltonia (kD). Nisäkäsilmentämisjärjestelmissä, esim. 10 C0S-7-soluissa, ilmennetyt IL-7:t voivat olla molekyyli-painoltaan ja glykosyloitumistavaltaan samanlaisia tai hiukan erilaisia kuin luonnolliset molekyylit, ilmentämis-järjestelmästä riippuen. Ilmentämällä IL-7-DNA:ita sellaisissa bakteereissa kuin esimerkiksi E.coli saadaan gly-15 kosyloitumattomia molekyylejä, joiden näennäismolekyyli-paino on noin 16 kD SDS-PAGEn avulla pelkistämättömissä olosuhteissa määritettynä.
Tämän keksinnön piiriin kuuluvia rekombinantti-IL- 7-proteiineja ovat myös N-terminaalisen metionyylin omaa-20 vat hiiren ja ihmisen IL-7:t. Muita mahdollisia toteutus-muotoja ovat nisäkkään IL-7:t, jotka on ilmennetty fuusio-proteiineina johto (leader) -polypeptidin kanssa, joka «' ' sisdältää sekvenssin Asp-Tyr-Lys-(Asp)4-Lys, tai muiden
< I
i sopivien peptidi- tai proteiinisekvenssien kanssa, joita i · 25 käytetään avustamaan mikro-organismeissa ilmentämisessä : tai mikrobien ilmentämien proteiinien puhdistamisessa.
;'**,· Tämän keksinnön mukaisten proteiinien biologisesti • · · samanarvoisia ja biologisesti aktiivisia homologeja tai « analogeja ovat erilaiset muteiinit, esimerkiksi IL-7:ien # 30 typistetyt versiot, joista on poistettu pääte- tai sisäi- • · t *.. siä jäännöksiä tai sekvenssejä, joita ei tarvita biologis- • · · *. ta aktiivisuutta varten, ja myös sellaiset alloproteiinit « « V,·' jollaisia ovat esitelleet Koide et ai., Proc. Natl. Acad.
Sei. USA 85:6237 (1988). Tässä käytettynä ilmaukset "bio-35 logisesti samanarvoinen" ja "biologisesti aktiivinen" tar- 4 103987 n koittavat, että määrätyllä proteiinilla on sama biologinen aktiivisuus kuin alkuperäisellä IL-7-molekyylillä. Muita tässä mahdollisia muteiineja ovat sellaiset, joissa yksi tai useampia kysteiinijäännöksiä on poistettu tai korvat-5 tu muilla aminohapoilla, esimerkiksi neutraaleilla aminohapoilla, jotta aikaansaataisiin edullisempia renaturoin-ti- tai stabiiliusominaisuuksia. Muita mutageneesimahdol-lisuuksia ovat vierekkäisten kaksiemäksisten aminohappo-jäännösten muuntaminen, jotta lisättäisiin ilmentymistä 10 sellaisissa hiivajärjestelmissä, joissa on läsnä KEX2-pro-teaasiaktiivisuus, tai proteiinisekvenssin muuntaminen yhden tai useamman N-sidosglykosylointikohdan poistamiseksi. On myös havaittu, että ihmisen IL-7-molekyylin jäännösten 121-139, joilla ei ole vastineita hiiren IL-7-15 molekyylissä, poistaminen ei poista biologista aktiivisuutta hiiren tai ihmisen esi-B-solu-määritysjärjestelmissä.
Tässä käytettynä "mutanttiaminohapposekvenssi" viittaa polypeptidiin, jonka koodaa nukleotidisekvenssi, 20 joka on tarkoituksella tehty alkuperäisestä sekvenssistä poikkeavaksi. "Mutanttiproteiini" tai muteiini" tarkoittaa proteiinia, joka käsittää mutanttiaminohapposekvenssin.
• I
' ' "Alkuperäinen sekvenssi" viittaa aminohappo- tai nukleii- ( r : nihapposekvenssiin, joka on identtinen geenin tai proteii- 25 nin villin tyypin tai luontaisen muodon kanssa. Ilmaukset !/.ϊ "KEX2-proteaasin tunnistamiskohta" ja "N-glykosylointikoh- ta" on määritelty jäljempänä. Ilmaus "inaktivoida" käytet- :Ί*; tynä tämän keksinnön määrättyjä puolia määriteltäessä tar- koittaa valitun KEX2-proteaasin tunnistamiskohdan muut-30 tamista, jotta hidastettaisiin tai estettäisiin lajin • · · 1..^ Saccharomyces cerevisiae KEX2-proteaasin suorittamaa kat- • · « *. komista, tai N-glykosylointikohdan muuttamista, jotta es- • f V, tettäisiin oligosakkaridiryhmien kovalenttinen sitoutumi- •'f< : nen määrättyihin aminohappo jäännöksiin.
* I
28 103987
Voidaan käyttää kohdennetun mutageneesin menetelmiä KEX2-proteaasin käsittelykohtien inaktivoimiseksi poistamalla, lisäämällä tai korvaamalla jäännöksiä Arg-Arg-, Arg-Lys- ja Lys-Arg-parien muuttamiseksi niin että elimi-5 noidaan näiden vierekkäisten emäksisten jäännösten esiintyminen. Lys-Lys-parit ovat huomattavasti vähemmän alttiita KEX2:n suorittamalle katkaisemiselle, ja Arg-Lys- tai Lys-Arg-parin muuttaminen Lys-Lys-pariksi edustaa konservatiivista ja edullista lähestymistapaa KEX2-kohtien inak-10 tivoimiseksi. Tuloksena olevat muteiinit ovat vähemmän alttiita KEX2-proteaasin suorittamalla katkaisulla muissa kohdissa kuin hiivan A-tekijäjohtosekvenssin kohdalla, jossa katkaisu eritettäessä on tarkoitettua.
Monet erittyvät proteiinit saavat kovalenttisesti 15 kiinnittyneitä hiilihydraattiyksikköjä translaation jälkeen, usein sellaisten oligosakkaridiyksikköjen muodossa, jotka ovat liittyneet asparagiinisivuketjuihin N-glykosi-disidoksilla. Määrättyyn erittyvään proteiiniin kiinnitettävien oligosakkaridiyksikköjen sekä rakenne että lukumää-20 rä voi olla hyvin vaihteleva, mistä on seurauksena laaja valikoima yhdelle ainoalle glykoproteiinille kuuluvia näennäismolekyylimassoja. mIL-7 ja hIL-7 ovat tämän tyyp-j pisiä erittyviä glykoproteiineja. Yritykset ilmentää gly- i « : koproteiineja rekombinanttijärjestelmissä voi tehdä moni- 25 mutkaiseksi heterogeenisyys, joka johtuu tästä vaihtele- • » !.1·· vasta hiilihydraattikomponentista. Esimerkiksi sellaisten rekombinanttiglykoproteiinien kuin ihmisen tai hiiren gra- :1:1.· nulosyytti-makrofaagikolonioita stimuloivan tekijän (GM- CSF) puhdistetut seokset voivat käsittää 0-50 % hiilihyd- .·;·, 30 raattia painon mukaan. Miyajima et ai., EMBO Journal • · · ·· 5:1193 (1986) ovat selostaneet sellaisen rekombinantti- • · · v ' • · · hiiren GM-CSF:n ilmentämisen, jossa N-glykosylointikohtia • 1 :.v oli muunnettu glykosyloinnin estämiseksi ja hiivassa ilmennetyn tuotteen heterogeenisyyden vähentämiseksi.
I i
I
« « I I
29 103987
Vaihtelevien määrien liittynyttä hiilihyraattia läsnäolo erittyneissä rekombinanttiglykoproteiineissa monimutkaistaa puhdistusmenetelmiä, vähentäen siten saantoa. Lisäksi mikäli glykoproteiinia käytetään terapeuttisena 5 aineena, on olemassa mahdollisuus, että saajat kehittävät allergisia reaktioita hiivan hiilihydraattiryhmien johdosta, mikä vaatii hoidon keskeyttämistä. Näistä syistä immu-nosäännöstelyglykoproteiinien biologisesti aktiiviset, homogeeniset analogit, joissa on vähentyneesti hiilihyd-10 raattia, voivat olla toivottavia terapeuttista käyttöä varten.
Nisäkkäisen IL-7:ien funktionaalisia mutanttianalo-geja, joissa on inaktivoituja N-glykosylointikohtia, voidaan tuottaa oligonukleotidisynteesin ja ligaation avulla 15 tai käyttäen kohdennetun mutageneesin tekniikkoja kuten jäljempänä on kuvattu. Näitä analogiproteiineja voidaan tuottaa homogeenisessa, vähentyneesti hiilihydraattia omaavassa muodossa hyvänä saantona käyttäen hiivailmentä-misjärjestelmiä. N-glykosylointikohdille on eukaryoot-20 tiproteiineissa tunnusomaista aminohappotripletti
Asn-A1-Z, jossa A1 on mikä tahansa aminohappo, paitsi ei Pro, ja Z on Ser tai Thr. Tässä sekvenssissä asparagiini ; tarjoaa sivuketjuaminoryhmän hiilihydraatin kovalenttista : kiinnittymistä varten. Sellainen kohta voidaan eliminoida V 25 korvaamalla Asn tai jäännös Z toisella aminohapolla, pois- * · %1·· tamalla Asn tai Z, tai sijoittamalla ei-Z-aminohappo A1:n ja Z:n väliin tai muu aminohappo kuin Asn Asn:n ja A1:n väliin. Korvaamiset tehdään edullisesti konservatiivises- « ti; toisin sanoen edullisimpia korvaavia aminohappoja ovat .·1·. 30 sellaiset, joiden fysikaaliskemialliset ominaisuudet muis- • · · tuttavat korvattavan jäännöksen ominaisuuksia. Samoin kun • ♦ · omaksutaan deleetion tai lisäämisen strategia, tulisi ot- • · taa huomioon deleetion tai lisäyksen mahdollinen vaikutus i · biologiseen aktiivisuuteen.
I < 1 4 4 f
« I
• I
30 103987
Yllä kuvattujen erityisten muteiinien lisäksi voidaan valmistaa helposti lukuisia DNA-rakennelmia, jotka sisältävät kokonaan kuvioissa 1-5 esitetyt nukleotidisek-venssit tai osan niistä yhdessä sellaisten oligonukleoti-5 dikasettien kanssa, jotka sisältävät lisää hyödyllisiä restriktiokohtia. Mutaatioita voidaan järjestää erityisiin kohtiin syntetisoimalla oligonukleotideja, jotka sisältävät mutanttisekvenssin ja sen sivuilla sellaiset restrik-tiokohdat, jotk mahdollistavat yhdistämisen ligaation 10 avulla alkuperäisen sekvenssin kappaleisiin. Ligaation jälkeen tulokseksi saatu uudelleen rakennettu sekvenssi koodaa muteiinin, jossa on haluttu aminohappolisäys -substituutio tai -deleetio.
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää oligonukleotidilla 15 kohdennetun mutageneesin menetelmiä sellaisen muutetun geenin aikaansaamiseksi, jossa määrättyjä kodoneja on muutettu vaaditun substituution, deleetion tai lisäyksen mukaan. Walder et ai., Gene 42:133 (1986); Bauer et ai., Gene 37:73 (1985); Craik, Biotechniques, tammikuu 1985, 20 12-19; Smith et ai., Genetic Engineering: Principles and
Methods (Plenum Press 1981); ja US-patentti 4 518 584 esittelevät sopivia tekniikkoja ja liitetään tähän viit- t teenä.
» r ·' Yhdessä tämän keksinnön toteutusmuodossa IL-7:n 25 aminohapposekvenssi on liitetty hiivan a-tekijäjohtosek- venssiin N-terminaalisen fuusiokonstruktion kautta, joka ··· s#>4! sisältää peptidin Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys : (DYKDDDDK) koodaavan nukleotidisekvenssin. Viimeksi mai- nittu sekvenssi on erittäin antigeeninen ja tarjoaa epi-30 toopin, johon sitoutuu reversiibelisti spesifinen mono- .·;·. klonaalinen vasta-aine, mikä mahdollistaa ilmentyneen re- * · · *· kombinanttiproteiinin nopean määrityksen ja helpon puhdis- V·' tuksen. Tämän sekvenssin myös lohkaisee spesifisesti nau- # · t dan limakalvon enterokinaasi Asp-Lys-paria välittömästi 35 seuraavan jäännöksen vierestä. Fuusioproteiinit, joiden 31 103987 päässä on tämä peptidi, voivat myös olla solun sisällä tapahtuvaa pilkkomista vastustavia E.collssa. Vaihtoehtoinen konstruktio on Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Glu-Ile-Gly-Arg-Pro, joka tarjoaa taktori X:n tunnistamiskoh-5 dan välittömästi myötävirtaan enterokinaasin kohdasta.
10. IL-7:n antaminen
Valmisteiden ja käyttömenetelmien osalta tämä keksintö tarjoaa terapeuttisia valmisteita, jotka sisältävät tehokkaan määrän mitä tahansa keksinnön mukaisista nisäk-10 kään IL-7-proteiineista ja sopivaa laimennus- tai kantaja-ainetta, ja menetelmiä B- ja/tai T-lymfosyyttien kehityksen tai lisääntymisen stimuloimiseksi tai immuuni-, lym-fopoieettisen tai hematopoieettisen vastauksen moduloimi-seksi tai suurentamiseksi nisäkkäillä, mukaan lukien ih-15 miset, jotka menetelmät käsittävät tehokkaan määrän mitä tahansa edellä olevista valmisteista antamisen. Käyttö yhdessä tai seoksessa muiden lymfokiinien, esim. IL-la:n, IL-18:n, IL-2:n, IL-3:n, IL-4:n IL-5:n, IL-6:n, CSF-l:n, GM-CSF:n tai G-CSF:n, IFN-a:n, IFN-B:n tai IFN-gamma:n 20 kanssa on myös mahdollista.
Terapeuttisessa käytössä puhdistettua IL-7:ä annetaan nisäkkäälle hoidoksi hoidonaiheeseen sopivalla ta-valla. Siten esimerkiksi nisäkkään IL-7-valmiste, joka • < • ' annetaan esi-B- tai esi-T-solujen lisääntymisen kiihotus- • 25 aineena tai immuuni- tai hematopoieettisten vaikut- ·.**: tajasolujen kehityksen, lisääntymisen tai toiminnan modu- laattorina, voidaan antaa kertaruiskeen, jatkuvan in-fuusion, siirteistä tapahtuvan hitaan vapautuksen tai muun sopivan tekniikan avulla. Tyypillisesti IL-7-hoitoaine 30 annetaan sellaisen valmisteen muodossa, joka sisältää puh-distettua proteiinia yhdessä fysiologisesti hyväksyttävien kantaja-, täyte- tai laimennusaineiden kanssa. Neutraali '1.1 puskuroitu suolaliuos tai suolaliuos, johon on sekoitettu « « « samalta lajilta peräisin olevaa albumiinia, ovat esimerkk- « ;v. 35 ejä sopivista laimennusaineista. Edullisesti tuote for- « · « 32 103987 muloidaan lyofilisaatiksi käyttäen sopivien täyteaineiden liuoksia (esim. sakkaroosi) laimennusaineina. Sopivat annostukset voidaan määrittää kokeiden avulla; yleensä annostusten 10 ng - 100 pg/kg/päivä, edullisesti 100 ng - 1 5 pg/kg/päivä annettuna 1-20 päivän ajan voidaan odottaa aiheuttavan biologisen vaikutuksen. Esimerkiksi kertaruis-keita, joissa on 1 pg/kg, voidaan antaa 4 päivän välein hematopoieettisten solujen kehityksen kiihotusaineena.
Seuraavat esimerkit valaisevat tämän keksinnön eri-10 tyisiä puolia, mukaan lukien alkuperäisen hiiren IL-7:n puhdistaminen, hiiren ja ihmisen IL-7-proteiineja koodaa-vien geenien kloonaaminen ja ilmentäminen, rekombinantti-hiiri- ja -ihmis-IL-7-proteiinien puhdistaminen homogeenisiksi, biologisia määrityksiä, joihin liittyy puhdistet-15 tujen IL-7-proteiinien käyttö, ja puhdistettujen IL-7-pro-teiinien antaminen nisäkkäille mallihoito-ohjelmassa. Esimerkeissä on kaikki menetelmät, joihin liittyy DNA-entsyy-mien, esimerkiksi restriktioendonukleaasien ja DNA-polyme-raasien, käyttö, suoritettu valmistajan antamien ohjeiden 20 mukaan. Kaikki koettimet oli merkitty 32P:lla. Muut yleiset nukleiinihappojen käsittelyteknologiat ovat olen-, naisesti samanlaisia kuin ne, joita on esitelty teoksissa
< I
Maniatis, supra, ja Ausubel et ai., toimittajat. Current
• I
' " Protocols in Molecular Biology (Wiley-Interscience, Media,
I ' I
25 PA, USA).
·.*·· Esimerkki 1 ···
JiitJ Hiiren IL-7:ä tuottavan solulinjan (IxN/A6 ) aikaan- saaminen transfektion avulla; hiiren IL-7:n puhdis-taminen solujen supernatanteista 30 Adherentteja luuytimen peruskudossoluja transfek- * ·* * .···, toitiin plasmidilla pSV3neo, joka sisälsi SV40-T-antigee- • · 9 nitransformointisekvenssit, käyttäen sellaista kalsiumfos- · · faattimenetelmää, jonka ovat kuvanneet Southern et ai., J.
m
Mol. Appi. Genet. 1:327 (1982) ja Graham et ai., Virology 35 52:456 (1973); Wiglerin et ai. muuntamana, Cell 14:725
• I
r «««Il « i 33 103987 (1978). Transfektoidut adherentit solut poistettiin tryp-siini:EDTAn avulla ja kloonattiin rajoittavan laimennuksen avulla. Tuloksena olevilta klooneilta saaduisdta superna-tanteista testattiin IL-7-aktiivisuus ja parasta tuottajaa 5 (IxN/A6) laajennettiin jatkotutkimusta varten. Tätä solu-linjaa tarkkailtiin kuukausittain mykoplasman esiintymisen suhteen käyttäen kaupallisesti saatavissa olevia mykoplas-manosoitustarvikkeita.
IxN/A6-soluilta peräisin olevia sopivaan kuntoon 10 saatettuja viljelyaineita aikaansaatiin 1750 cm2:n kudos-viljelyrullapulloissa (Falcon #3029) seuraavalla tavalla. Kun solut saavuttivat konfluenssin, viljelyaine korvattiin 1 litralla/rullapullo seerumitonta RPMI:tä, johon oli lisätty glukoosia 2,3 g/litra ja natriumbikarbonaattia 1,54 15 g/litra jajoka sisälsi kiihotusaineena S.typhlmurium-LPS:a 1 pg/ml. Pulloja kaasutettiin 10 % C02:lla ilmassa ja in-kuboitiin kuuden päivän ajan. Supernatantti koottiin ja konsentroitiin sitten 20-kertaisesti Amicon DClO-onttokui-tulaitteessa (rajamolekyylipaino 10 000). Raa'at kon- 20 sentraatit steriloitiin suodattamalla ennen analyysiä ja puhdistusta.
Yksi litra raakaa konsentroitua sopivaan kuntoon i : saatettua viljelyainetta säädettiin pH-arvoon 8 IN NaOH:- f * : 11a ja laimennettiin steriilillä tislatulla vedellä säh- 25 könjohtokyvyn 1 m Siemen/cm omaavaksi (sähkönjohtokyky 1 m * i ’/·! Siemen/cm vastaa 100 mM natriumkloridikonsentraatiota Ra- diometer CDM83-sähkönjohtokykymittari1la). Konsentraatti lisättiin sitten DEAE-Sephacel (Pharmacia) -pylvääseen » (5,0 x 15 cm), joka oli etukäteen tasapainotettu 20 mM .···. 30 Tris-HCl:lla (pH 8), joka sisälsi 100 mM NaCl. Effluenttia
i * I
tarkkailtiin A280:n avulla ja proteiinia sisältävä läpi vir-
I f I
rannut fraktio koottiin lisäpuhdistusta varten.
\V DEAE-Sephacel-pylväästä saatu sitoutumaton fraktio « i · säädettiin pH-arvoon 5 IM sitruunahapolla (vapaa happo). ;v, 35 Tämä lisättiin sitten suoraan SP-Trisacryl (Pharmacia-LKB)
• I
• « « · 34 103987 -pylvääseen (3,2 x 12,5 cm), joka oli etukäteen tasapainotettu 10 mM sitraatilla (pH 5,0), joka sisälsi 100 mM NaCl. Pylvästä pestiin viidellä kolonnin tilavuudella ta-sapainotuspuskuriliuosta, mitä seurasi pesu viidellä ko-5 lonnin tilavuudella 20 mM Tris-HCl (pH 8). Kun pylvään effluentin pH saavutti pH-arvon 8 ja A280 oli palannut perusviiva-arvoihin, pylvästä eluoitiin yhden litran lineaarisella gradientilla 0,0M:sta 0,5M natriumkloridiin 20 mM Tris-HCl:sa (pH 8). Eluointi suoritettiin käyttäen vir-10 tausnopeutta 50 ml/tunti ja koottiin 10 ml:n fraktioita ja ne tutkittiin IL-7:n läsnäolon suhteen.
Kahdesta erillisestä SP-Trisacrylin eluutiosta saadut yhdistetyt IL-7:ä sisältävät fraktiot yhdistettiin ja lisättiin suoraan Blue B-agaroosi (Amicon Corp., Danvers, 15 MA, USA) -pylvääseen (2,5 x 40 cm), joka oli etukäteen tasapainotettu 20 mM Tris-HCl:11a (pH 8), joka sisälsi 125 mM NaCl. Näyte lisättiin käyttäen virtausnopeutta 15 ml/-tunti. Sen jälkeen kun oli pesty tasapainotuspuskuriliuoksella, kunnes AZ80 oli palannut perusviiva-arvoihin, pylväs-20 tä eluoitiin yhden litran lineaarisella gradientilla 0,125 M:sta 2M NaCl: iin 20 mM Tris-HCl :ssa (pH 8). Koottiin , 10 ml:n fraktioita käyttäen virtausnopeutta 25 ml/tunti ja ' niistä tutkittiin IL-7-aktiivisuus.
I (
< I
: Korkeapainenestekromatografia (HPLC) suoritettiin i 25 käyttäen Waters Associates (Milford, MA) -nestekromatogra- < ( /*: fia, joka oli varustettu kahdella mallia 510 olevalla sys-
Ml teemikontrollerilla ja mallia 441 olevalla absorbansside-tektorilla, joka tarkkaili aallonpituudella 214 nm, olennaisesti kuten ovat kuvanneet Urdal et ai., J. Chrom. 30 296:171 (1984). Suuret näytetilavuudet pumpattiin pylväi- siin pienpumpun avulla.
• · · '· Blue B-agargroosikromatografiavaiheesta saadut IL- '.V 7-asktiivisuutta sisältävät fraktiot lisättiin, käyttäen i i r virtausnopeutta 5 ml/min, kokoa 8 mm x 10 cm olevaan radi- i 35 aali-PAK-koteloon (Waters Associates), joka sisälsi 15-20 I ( f t * Il « < 35 103987 μ: n Vydac C-4-käänteisfaasipiidioksidia (Separations Group, Hesperia, CA, USA). Veden, joka sisälsi 0,1 % tri-fluorietikkahappoa (TFA, liuotin A), annettiin virrata nopeasti kolonnien lävitse, kunnes absorbanssi aallon-5 pituudella 214 nm oli perusviivan tasoilla. Tällöin järjestettiin lineaarinen gradientti, joka johti 0 %:sta 100 %:iin liuotinta B (asetonitriili, joka sisälsi 0,1 % TFA:a) nopeudella 1 % liuotinta B/min ja käyttäen virtausnopeutta 1 ml/min.
10 Yhden ainoan HPLC-vaiheen jälkeiset aktiiviset fraktiot yhdistettiin, laimennettiin kahdella tilavuudella liuosta, jossa oli 0,9 M etikkahappoa ja 0,2 M pyridiiniä (pH 4,0, puskuriliuos A2), ja lisättiin samaan pylvääseen senjälkeen kun oli uudelleentasapainotettu pyridiiniase-15 taattiliuotinseoksella. Pylvääseen käytettiin sitten liuottimen B2 (0,9 M etikkahappoa, 0,2 M pyridiiniä ja 60 % n-proapnolia) gradienttia, joka johti 0 %:sta 20 %:iin liuotinta B2 10 minuutissa ja 20 % B2:sta 84 % B2:een 100 minuutissa, käyttäen virtausnopeutta 1 ml/min.
20 Tästä toisesta HPLC-vaiheesta saadut aktiivisuutta sisältävät fraktiot yhdistettiin, laimennettiin kahdella tilavuudella liuotinta A2 ja lisättiin kokoa 3,9 mm x 30 cm * 1 !. olevaan radiaali-PAK-pylvääseen, joka oli pakattu 10 μ:η * I :
Vydac C-18-käänteisfaasipiidioksidilla, joka oli etukäteen 25 tasapainotettu 20 % liuottimena B2. Liuottimen B2 gradi- ’· “ enttia 20 %:sta 84 %:iin käytettiin proteiinin eluointiin • · · pylväästä. Kolmannesta HPLC-vaiheesta saadut aktiivisuutta • t · ’ sisältävät fraktiot laimennettiin tilavuudella liuotinta A, (0,1 % TFA) ja lisättiin C-18-pylvääseen, joka oli etu- 30 käteen tasapainotettu 20 % liuottimena B! (asetonitriili, 0,1 % TFA9, ja liuottimen Bx gradienttia, joka oli järjes- ,·, tetty 20 %:sta 100 %:iin B2:tä käyttäen muuttumisnopeutta • · · 1 % minuutissa ja virtausnopeutta 1 ml/min, käytettiin IL-7:n eluointiin.
•« <
• I
• I
36 103987 SDS-PAGE suoritettiin käyttäen muunnelmaa menetelmästä, jonka on kuvannut Laemmli, Nature 227:680 (1970). Materiaali, joka oli puhdistettu neljän RP-HPLC-vaiheen avulla, haihdutettiin kuiviin tyhjössä lyofilisointilait-5 teessä ja liuotettiin uudelleen pieneen tilavuuteen SDS-näytepuskuriliuosta, jossa ei ollut 2-merkaptoetanolia. Näyteelle suoritettiin elektroforeesi 12 % po ly akryyli ami-digeelissä. Tulokseksi saadun geelin asianmukainen kulku-kaista leikattiin 1-2 mm:n lohkoiksi ja kukin lohko hie-10 nonnettiin ja eluoitiin diffuusion avulla yön aikana 0,2 % SDS:iin; sitten määritettiin kussakin fraktiossa oleva biologinen aktiivisuus. Aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja näyte analysoitiin suorittamalla elektroforeesi Phastgel PAGE-järjestelmässä (Pharmacia) käyttäen 10-15 % 15 gradienttigeeliä. Proteiinit tehtiin silminnähtäviksi käyttäen hopeavärjäysmenetelmää.
Taulukossa 1 alla on esitetty yhteenveto IL-7:n puhdistamiseen käytettyjen menetelmien tuloksista. pH-ar-vossa 8 ja 100 mM NaClrssa IL-7-aktiivisuus, joka oli 20 IxN/A6-soluilta saadussa konsentroidussa viljelyaineessa, ei sitoutunut DEAE-Sephacel-pylvääseen, vaikka raa'assa sopivaan kuntoon saatetussa viljelyaineessa läsnäolevasta proteiinin kokonaismäärästä 90 prosenttia, mukaan lukien • proteiini, joka oli vastuussa makrofaagikolonioita stimu- « « « ; 25 loivasta aktiivisuudesta, sitoutui pylvääseen. Myöhemmät · · l./ kromatografiavaiheet, mukaan lukien SP-Trisacryl, Blue B- *** agaroosi ja neljä erillistä käänteisfaasi-HPLC-menettelyä, • · · johtivat IL-7-aktiivisuuden 200 000-kertaiseen puhdistumiseen.
• · · • · · • · · * • · · • · « • t * · · * * * • · • « I • « « « « I I f
-I »MU
• <
El n 37 103987
Taulukko 1
Hiiren interleukiini-7:n (IL-7) puhdistaminen Vaihe S.a.(yks./pg) Puhdistuminen Saanto (-kertainen) (%) 5 ___ 1. Konsentraatti 0,38 1 2. DEAE-Sephacel 4,63 12,2 100 (ei sit.) 3. SP-Trisacryl 153 403 113 10 4. Blue B-aga- roosi 423 1113 80 5. RP-HPLC 8xl04 2xl05 50 6. SDS-PAGE 4xl06 10x10® 35 15 800 litran raakaa sopivaan kuntoon saatettua vil- jelyainetta käsittely tällä tavalla johti neljään HPLC-pylvään fraktioon, jotka sisälsivät kokonaismäärän 5 x 106 yksikköä IL-7-aktiivisuutta. Tämän materiaalin analyysi SDS-PAGEn ja hopeavärjäyksen tai 125I:lla merkitsemisen 20 avulla paljasti, että muutamia porteiineja oli vielä läsnä tässä puhdistamisen vaiheessa. Tässä materiaalissa läsnä olevalla huomattavimmalla proteiinilla oli massa 18 000; :\ oli kuitenkin todettavissa heikkoja vyöhykkeitä tämän vyö- ]<· hykkeen ylä- ja alapuolella.
« I
25 Suoritettiin kaksi koetta sen tässä seoksessa ole- • · t • · · *,,* van proteiinin identifioimiseksi, joka oli vastuussa IL- • · ’·♦·* 7-aktiivisuudesta. Ensimmäisessä IL-7; lie suoritettiin
• »I
’.* * SDS-PAGE pelkistämättömissä olosuhteissa. Elektroforeesin loppuun suorittamisen jälkeen geeli leikattiin 1 mm: n »·· ϊ 30 kaistaleiksi ja kussakin kaistaleessa oleva proteiini :T: eluoitiin väliaineeseen ja analysoitiin biologisen .*. aktiivisuuden suhteen. Tulokset osoittivat, että IL-7- • · ·
• · I
biologinen aktiivisuus liittyi proteiiniin, jonka Mr oli 25 • · 000, ja oli erillään geelin siitä alueesta, joka vastasi i ·': 35 Mr:n 18 000 omaavan proteiini vyöhykkeen sisältävää.
• ( 38 103987
Aktiivisuutta ei saatu eristettyä, kun elektroforeesi suoritettiin pelkistävissä olosuhteissa.
Toisessa kokeessa 125I:lla merkitty IL-7 absorboitiin soluihin, jotka reagoivat tähän tekijään (lxN/2b).
5 IxN/2b on kloonisolulinja, joka on saatu pitkäaikaisesta luuydinviljelmästä peräisin olevista adherenteista esi-B-soluista. Näitä soluja voidaan kasvattaa ilman eksogeeni-siä syöttösoluja ja ne ovat tiukasti riippuvaisia puhdistetusta IL-7:stä jatkuvan kasvun ja elinvoimaisuuden suh-10 teen. Solut pestiin ja uutettiin sitten PBS:lla, joka sisälsi 1 % Triton X-100 (polyoksieteenieetteri-pinta-ak-tiivinen aine, Rohm & Huss Co., Philadelphia, PA, USA). Näyte tästä materiaalista analysoitiin sitten SDS-PAGEn jälkeiseen autoradiografian avulla. Tulokset osoittivat, 15 että ainoastaan proteiini, jonka Mr oli 25 000, näytti sitoutuvan IL-7:lie herkkiin soluihin. Ylimäärä merkitsemätöntä IL-7 inhiboi tämän proteiinin sitoutumista, ja kontrollisolut, jotka eivät reagoi IL-7:ään, eivät sitoneet Mr:n 25 000 omaavaa proteiinia. Kummankin kokeen tu-20 lokset viittasivat siihen, että proteiini, jonka Mr oli 25 000, oli vastuussa IL-7-aktiivisuudesta.
lL-7-aktiivi suuden kestävyys SDS-PAGE-menetel-I'. mässä sai ajattelemaan, että tätä menetelmää voitaisiin käyttää viimeisenä vaiheena tämän proteiinin puhdistukses- « 25 sa. Tulokset osoittivat, että kuten oli todettu esikokees- I..* sa, IL-7-aktiivisuus eluoitui asemassa, joka sattui yhteen *** Mr:n 25 000 omaavan proteiinin kanssa. Tämän bioaktiivisen • · · *·* * fraktion PAGE-analyysi paljasti yhden ainoan proteiinin, joka todettiin hopeavärjäyksen avulla. Proteiinin sekvens- ··« \* * 30 sointi Edman-pilkkomisen avulla käyttäen Applied Biosys- • · · · terns (Foster City, CA, USA) - automaattista sekvenssoijaa osoitti seuraavan N-terminaalisen aminohapposekvenssin: • · · X-X-His-Ile-Lys-Asp-Lys-Glu-X-Lys-Ala-Tyr-Glu-X-Val-Met.
Lopullisen spesifisen aktiivisuuden arvioitiin : 35 alustavasti olevan 4 x 106 yksikköä/pg proteiinia, joka 39 103987 merkitsi 10-miljoonakertaista puhdistumista lähtömateriaaliin verrattuna. Aikaisemmin mainituista syistä tätä arviota on korjattu alaspäin arvoon noin 2 x 105 yksikköä/yg, joka vastaa COS-7-soluissa tuotetun homogeenisen rekombi-5 nanttihiiri-IL-7:n spesifistä aktiivisuutta.
Esimerkki 2
Hiiren IL-7:n koodaavan cDNA:n eristäminen ilmentämällä suoraan aktiivista proteiinia COS-7-so-luissa 10 cDNA-kirjasto kokoonpantiin sellaisen polyadeny- loidun mRNA:n käänteiskopioinnin avulla, joka oli eristetty IL-7:n indusoivissa olosuhteissa kasvatetuista IxN/a6-soluista eristetystä kokonais-RNA:sta. Soluja kasvatettiin RPMI 1640-elatusaineessa, joka sisälsi lisäksi 5 % sikiö-15 kautisen naudan seerumia, 48 tunnin ajan antaen läsnäolla 10 ng/ml forbolimyristyyliasetaattia (PMA) ja 1 uy/ml S.typhlmurlum-LPS IL-7-spesifisen lähetti-RNA:n maksimaalisen tuotannon aikaanaamiseksi. Solut koottiin käyttäen trypsiini-EDTAa ja sytoplasman RNA eristettiin käyttäen 20 NP40-lyysimenetelmää, joka oli olennaisesti samanlainen kuin Pennican et ai. esittämä, Nature 301:214 (1983).
: Poly-A*-RNA eristettiin oligo-dT-selluloosakromatografian : avulla ja kaksisäikeinen cDNA valmistettiin käyttäen kään- : teiskopioijaentsyymiä. Tasapäinen cDNA yhdistettiin ligaa- ;' <, 25 tion avulla Smalrllä leikattuun defosforyloituun pPC201- • · .*··. vektori-DNA :han.
• · ,·;·# Eukaryootin runsaan ilmennyksen vektori pDC201 • « · (katso esimerkki 7 ja kuvio 7) koottiin SV40, adenovirus 2 ja pBR322-DNA:sta ja se sisälsi järjestyksessä: • · » *·* ’30 1) SV40-palasen, joka sisälsi replikaation aloituskohdan, • · · V · aikaisen ja myöhäisen promoottorin ja vahvistajan (enhancer); • · ,··, 2) adenovirus 2-palasen, joka sisälsi tärkeimmän myöhäisen • promoottorin, kolmiosaisen myöhäisen johto (leader)-kap- • <
• I
40 103987 paleen ensimmäisen eksonin ja osan ensimmäisestä intro-; nista; 3) synteettisen sekvenssin, joka sisälsi HindiII-kohdan, muokkaus (splice)-akseptorikohdan, adsenovirus-2:n kol- 5 miosaisen johtokappaleen toisen ja kolmannen eksonin ja multippelin kloonauskohdan, joka sisälsi Smal-kohdan; 4) lisää SV40-sekvenssejä, jotka sisälsivät varhaisen ja myöhäisen polyadenylointikohdan; 5) adenovirus 2-sekvenssejä, jotka sisälsivät virukseen 10 liittyviä RNA-geenejä; ja 6) pBR322-elementtejä E.colissa replikoitumista varten.
Tulokseksi saatua pDC201:ssä olevaa IxN/A6-cDNA kirjastoa käytettiin E.coli-kannan DH5a transformointiin ja rekombinantteja sijoitettiin maljaviljelmiksi siten 15 että aikaansaataisiin suunnilleen 1000 koloniota maljaa kohden ja riittävästi maljoja tarjoamaan suunnilleen kokonaismäärän 50 000 koloniota seulontaa kohden. Koloniot kaavittiin kultakin maljalta, ne yhdistettiin ja plasmidi-DNA eristettiin kustakin yhdistetystä joukosta. Yhdistetty 20 DNA käytettiin sitten apinan C0S-7-solujen subkonfluentin kerroksen transfektointiin käyttäen DEAE-dekstraania, mitä seurasi klorokiinikäsittely, kuten ovat kuvanneet Luthman et ai., Nucleic Acids Res. 11:1295 (1983) ja McCutchan et ai., J. Natl. Cancer Inst. 41:351 (1968). Soluja kasvatet-25 tiin sitten viljelmässä kolmen päivän ajan, jotta sallit- t It I./ täisiin lisättyjen sekvenssien lyhytaikainen ilmeneminen.
Kolmen päivän kuluttua soluviljelmien supernatanteista « « *·* ‘ tutkittiin IL-7-aktiivisuus käyttäen muualta patenttijul kaisussa kuvattua esi-B-solujen lisääntymisen määritystä.
• · · V * 30 Sen jälkeen kun oli seulottu tällä tavalla noin 720 000 • · « V : tästä kirjastosta saatua rekombinanttia, yhden transfek- tanttijoukon havaittiin valmistavan IL-7-aktiivisuutta « lisääntymiskokeessa määränä, joka oli kymmenkertainen ' taustaan verrattuna suurempi.
I t t i 41 103987
Positiivisesta joukosta peräisin olevaa jäädytettyä bakteerimäärää käytettiin sitten suunnilleen 200 kolo-nion maljojen aikaansaamiseen. Näitä maljoja käsiteltiin kuten aikaisemmin plasmidi-DNA:n saamiseksi yhdistetyistä 5 bakteerikolonioista ja DNA transfektoitiin C0S-7-soluihin kuten yllä on kuvattu. Positiivisen joukon identifioinnin jälkeen eristettiin plasmidi-DNA yksittäisistä kolonioista ja seulottiin jälleen C0S-7-solujen transfektoinnin avulla. Tällä tavalla eristettiin yksi ainoa klooni, joka ky-10 keni aiheuttamaan IL-7:n ilmentymisen C0S-7-soluissa. In-sertti subkloonattiin ja sekvenssoitiin tavanomaisten tekniikkojen avulla. Sekvenssi on esitetty kuviossa 2.
Esimerkki 3
Ihmisen IL-7:n koodaavan cDNA:n eristäminen ja 15 aktiivisen proteiinin ilmentäminen C0S-7-soluissa
Ensimmäiset yritykset osoittaa ihmisen IL-7-mRNA Norhern blot-määrityksissä käyttäen lovi (nick) -translaatiolla käsiteltyä hiiren IL-7-cDNA:ta epäonnistuivat. Oli kuitenkin mahdollista saada hiiren koetin hybridisoi-20 tumaan ihmisen genomi-DNA:n Southern blot-näytteisiin.
Niinpä ihmisen IL-7-cDNA:n etsintä aloitettiin seulomalla ; 1 ensin kaupallisesti saatavissa olevaa ihmisen genomikir- : jastoa. Noin 400 000 ihmisen genomin kloonia seulottiin lovitranslaatiolla käsitellyn hiiren IL-7-cDNA:n avulla 25 käyttäen tekniikkoja, joita ovat kuvanneet Benton ja .···) Davis, Science 195:180 (1977). Tästä seulonnasta saatiin • · lii erillinen hybridisoituva klooni, joka puhdistettiin ja • a · • jolle suoritettiin restriktiokartoitus. Tämän kloonatun genomi-DNA:n Southern blot-analyysit osoittivat, että hyb- *.* * 30 ridisoituminen hiiren koettimeen rajoittui 1,2 kiloemäksen • « · V · EcoRI-palaseen. Tämä palanen subkloonattiin ja sekvenssoi- .·.*. tiin, jolloin paljastui, että se vastasi geenin 5'-koodaa- • < .«·, matonta aluetta ulottuen koodaavan alueen ensimmäiseen 10 '1' emäkseen, jonka jälkeen ihmisen genomi-DNA-sekvenssi poik-
I I I
35 kesi hiiren IL-7-cDNA-sekvenssistä intronin läsnäolon joh- 42 103987 dosta. Tämän genomisekvenssin määrittäminen mahdollisti sellaisten oligonukleotidien synteesin, joiden sekvenssit olivat komplementaarisia ihmisen IL-7-RNA-transkriptille. Syntetisoitiin kaksi sellaista oligonukleotidia, joissa 5 oli 29 ja 31 emästä, ne merkittiin 32P:lla käyttäen T4-po-lynukleotidikinaasia ja käytettiin koettimena muutamista ihmisen solulinjoista peräisin olevan RNAtn Northern blot-näytteille. Näiden koetinten todettiin hybridioituvan spesifisesti kahteen sellaisen mRNA:n kokoluokkaan, joka oli 10 peräisin ihmisen maksan adenokarsinoomasolulinjasta SK-HEP-1 (ATCC HTB 52).
Kokoonpantiin cDNA-kirjasto käänteiskopioimalla polyadenyloitua mRNArta, joka oli eristetty SK-HEP-l:stä eristetystä kokonais-RNA:sta. Soluja viljeltiin RPMI 1640-15 elatusaineessa, jossa oli lisäksi 10 % sikiökautisen naudan seerumia, 16 tunnin ajan antaen läsnäolla 1 pg/ml LPS:a HIL-7-mRNA:n synteesin herättämiseksi. Polyadenyloi-tu mRNA eristettiin kromatografian avulla käyttäen oligo-dT-selluloosaa ja käänteiskopioitiin käyttäen yleisiä tek-20 nilkkoja ensimmäisen cDNA-säikeen aikaansaamiseksi. Tämä cDNA tehtiin kaksisäikeiseksi käyttäen DNA-polymeraasi I:tä, tehtiin tasapäiseksi T4-DNA-polymeraasin avulla, metyloitiin EcoRI-metylaasin avulla cDNA:n sisällä olevien EcoRI-katkaisukohtien suojaamiseksi ja yhdistettiin ligaa-25 tion avulla EcoRI-"linker"-kappaleisiin. Tulokseksi saatu- ,'··[ ja rakennelmia pilkottiin EcoRIrllä, jotta poistettaisiin • « "I muut "linker"-kopiot kuin yksi cDNA:n kummastakin päästä, • · · • · · * ja yhdistettiin ligaation avulla bakteriofaagi gamma-gtl0:n EcoRI:llä leikattuihin ja defosforyloituihin ulok- *.* * 30 keisiin (Huynh et ai., DNA Cloning: A Practical Approach, ·.* · Glover, toim., IRL Press, ss. 49-78). Ligaation avulla saatu DNA pakattiin faagihiukkasiin käyttäen kaupallisesti • f .·< saatavissa olevia tarvikkeita rekombinanttien kirjaston « aikaansaamiseksi (Stratagene Cloning Systems, San Diego, 35 CA, USA). Rekombinantteja sijoitettiin maljaviljelmiin 9 43 103987 E.coli-kannalle C600(hfl*) ja seulottiin yleisten plak-kihybridisaatiotekniikkojen avulla kohtalaisen niukoissa olosuhteissa (50 °C, 0,9M NaCl) käyttäen samoja kinaasilla käsiteltyjä oligonukleotideja, jotka hybridisoituivat 5 mRNA:han. Seulottaessa noin 150 000 plakkia eristettiin kirjastosta yksi klooni, joka hybridisoitui koettimiin, kun suodattimia pestriin lxSSC:llä 55 eC:ssa. Tälle kloonille (hIL-7-cDNA #1) suoritettiin plakkipuhdistus ja in-sertti-DNA puhdistettiin ja subkloonattiin standardi-10 kloonausvektori pBR322:n EcoRItllä leikattuun johdannaiseen (pGEMBL18), joka sisältää "polylinker"-alueen, jossa on ainoa EcoRI-kohta, BamHI-kohta ja useita muita ainoita restriktiokohtia. Esimerkin tämän tyyppisestä vektorista ovat kuvanneet Bente et ai., Nucleic Acids 15 Research 11:1645 (1983).
Tämä cDNA sekvenssoitiin sitten ja sen osoitettiin olevan pituudeltaan 1465 emäsparia ja siinä olevan avoimen lukuraamin, joka kykeni koodaamaan 133 aminohapon proteiinin. Sekä tämän ihmisen cDNA:n DNA- että aminohapposek-20 venssi osoittivat noin 78 % homologiaa hiiren IL-7-cDNA:n kanssa. Kun tämä ihmisen cDNA subkloonattiin pDC201:n : ' Smal-kohtaan, jotta mahdollistettaisiin sen ilmentyminen : C0S-7-soluissa, ei IL-7-aktiivisuutta kuitenkaan todettu viljelmien supernatanteissa transfektion jälkeen.
: 25 Jotta saataisiin lisää ihmisen IL-7-cDNA:itä, noin .···. miljoona gamma-gtlO-bakteriofaagia, jotka sisälsivät SK- • · l\'.' HEP-l:n poly-A*-RNA:sta saatuja cDNA:itä, seulottiin käyt- • « ·
’ täen lovitranslaatiolla käsiteltyä ihmisen IL-7-cDNA
#l:tä. Tämä johti vielä 5 cDNA:n eristämiseen, jotka ·.* · 30 cDNA:t liitettiin sitten pDC201:n Smal-kohtaan. Nämä kons- M» : truktiot transfektoitiin sitten C0S-7-soluihin ja viljel- ;*·*; mien supernatanteista tutkittiin IL-7-aktiivisuus. Yksi V < cDNA, jolle on annettu nimitys hIL-7 #3, osoitti todet- « i < tavissa olevaa lL-7-aktiivisuutta. Tämä cDNA subkloonat-: 35 tiin pGEMBL18:aan ja sekvenssoitiin. cDNA-sekvenssi on • I · I .
44 103987 esitetty kuviossa 4; hIL-7:n koodaava sekvenssi ja siitä johdettu aminohapposekvenssi on esitetty kuviossa 5. Esimerkki 4
Hiiren IL-7:n ilmentäminen hiivajärjestelmässä 5 Hiivailmentämisvektorin aikaansaamiseksi mIL-7:ä varten hiivan plasmidia pBCIO, joka on pYaHuGM:n (ATCC 53157) johdannainen ja vastine, muutettiin seuraavasti. pBCIO on hiiva/bakteerisukkulavektori, joka sisältää: 1) pBR322:sta peräisin olevan replikaation aloituskohdan 10 ja Ampr-geenin, jotka mahdollistavat selektion ja replikaation E.colissa; 2) TRPl-geenin ja 2p-replikaation aloituskohdan S.cerevisiaessa selektiota ja replikaatiota varten; 3) hiivan alkoholidehydrogenaasi 2 (ADH2)-promoottorin, 15 jota seuraa hiivan pre-pro-a-tekijäjohtosekvenssi vieraan proteiinin ilmentämisen ja erittymisen hiivasta mahdollistamiseksi; ja 4) multippelin kloonauskohdan, johon sisältyy Spel-kohta. pBCIO:tä pilkottiin täydellisesti Asp718:lla ja Spelrllä, 20 vektorifragmentti eristettiin ja yhdistettiin ligaation avulla seuraavaan oligonukleotidi A:hän, joka tarjoaa N- terminaalisen epitoopin tai identifiointijohtopalasen Asp- Γ. Tyr-Lys-(Asp4)-Lys ("flag") fuusioituna a-faktorijohtosek- .···, venssin viereen ja lukuraamiin sen kanssa, mitä seuraa * » 25 taktori X-proteaasin tunnistuskohta ja "polylinker"-sek- • · · I..’ venssi, joka käsittää Stul-, Ncol-, BamHl-, Smal- ja Spel- katkaisukohdat: • » ·
Asd7181 α-faktorin käsittely 5'~GTA CCT TTC GAT AAA AGA GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG GAA ...
3’-GA AAC CIA ITT TCT CTG ATG TTC CTG CTG CTA CTG TTC CTT ...
’·' ' Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu ...
5.5 ' "flag"-epitooppi
.V. istui INcoI -iSmal 4-SpeI
*.·.· ATC GAA GGT AGG CCT CCA TGG ATC CCC CGG GAC A-J1 ----TAG CTT CCA TCC GGA GGT ACC TAG GGG GCC CTG TGA TO-5' *”’ ....lie Glu Gly Arg Pro tBamHl B‘· 35 Faktori X-kohta "polylinker" 45 103987
Tulokseksi saatua rakennelmaa, jolle on annettu nimitys pIXY166, pilkottiin sitten Stul:llä ja Spel:llä ja vektori yhdistettiin ligaation avulla noin 950 emäsparin Ndel-Nbal-palaseen, joka sisälsi suurimman osan mIL-7-cDNA:n 5 koodaavasta alueesta, ja seuraavaan "linker"-oligonuk-leotidiin, joka lisää takaisin mIL-7:n kypsän sekvenssin N-terminaaliset 11 aminohappoa sisäiseen Ndel-kohtaan saakka: 5r-GAG TGC CAC ATT AAA GAC AAA GAA GGT AAA GCA-3' 10 3'-CTC ACG GTG TAA TTT CTG TTT CTT CCA TTT CGT AT-5'
Glu cys Hie Ile Lys Asp Lys Glu Gly Lys Ala Tämä iImentämisvektori, jolle on annettu nimitys pIXY171, puhdistettiin sillä transformoitiin diploidi S♦cerevisiae-15 hiivakanta (XV2181) käyttäen sellaisia standarditekniik-koja kuiun joita on esitelty EPÄ 0165654:ssä, valiten tryptofaaniprototrofeja. Tulokseksi saatuja transformant-teja viljeltiin flag-mIL-7-fuusioproteiinin ilmentämiseksi. Viljelmiä, joistas oli tarkoitus tutkia biologinen 20 aktiivisuus, kasvatettiin 20-30 ml:ssa YPD-elatusainetta (1 % hiivauutetta, 2 % peptonia, 1 % glukoosia) 37 eC:ssa ;’.tt solutiheyteen 1-5 x 108 solua/ml. Solut poistettiin sitten sentrifugoimalla ja viljelyaine suodatettiin 0,45 u:n sei-.···. luloosa-asetaattisuodattimen lävitse. Transformoidun hii-
• I
25 vakannan tuottamat suprenatantit tutkittiin sitten suorit- • «· J./ tamalla reaktio hiiren monoklonaalisen vasta-aineen kans- • sa, mitä seurasi piparjuuriperoksidaasiin kytketty vuohen * · » *·1 1 antihiirivasta-aine "flag"-peptidin läsnäolon osoit tamiseksi, ja ne tutkittiin myös esi-B-solujen lisääntymi- • · · V ' 30 sen määrityksen avulla IL-7-aktiivisuuden suhteen, mikä :T: varmisti biologisesti aktiivisen proteiinin erittymisen.
·1. Esimerkki 5 f · · Il . .
(Il
Ihmisen IL-7:n ilmentäminen hiivassa · « " hIL-7:n ilmentämistä varten kokoonpantiin • · · • 1,1' 35 pIXY120:sta saatu hiivailmentämisvektori seuraavasti.
46 103987 PIXY120 on identtinen pYaHuGM:n (ATCC 53157) kanssa, paitsi että se ei sisällä cDNA-inerttiä ja siinä on "polylin-ker"/multippeli kloonauskohta, jossa on Ncol-kohta. Tämä vektori sisältää DNA-sekvenssejä seuraavista lähteistä: 5 1) suuren Sphl (nukleotidi 562) - EcoRI (nukleotidi 4361)- palasen, joka on irrotettu plasmidista pBR322 (ATCC 37017) ja sisältää replikaation aloituskohdan ja ampisilliinire-sistenssimerkkigeenin E.colissa selektointia varten; 2) S.cerevisiae-DNA:ta mukaan lukien TRP-l-merkkigeeni, 10 2p-replikaation aloituskohta, ADH2-promoottori; ja 3) DNA:n, joka koodaa 85 aminohapon signaalipeptidin ja joka on peräisin erittyvän peptidin α-faktori koodaavasta geenistä (katso Kurjan et ai., US-patentti 4 546 082). Asp718-restriktiokohta tuotettiin α-faktori signaalipep- 15 tidissä olevaan asemaan 237 heterologisten geenien fuusion helpottamiseksi. Tämä aikaansaatiin muuttamalla nukleotidin 241 kohdalla oleva tymidiinijäännös sytosiinijäännökseksi käyttäen oligonukleoditilla kohdennettua in vitro-mutageneesiä kuten on kuvannut Craik, Biotechniques, tam-20 mikuu 1985, 12-19. Synteettinen oligonukleotidi, joka sisälsi multippelin kloonauskohdan ja jolla oli seuraava sekvenssi, sijoitettiin aminohapon 79 kohdalla olevasta
• I I
; t Asp718-kohdasta, joka on lähellä α-faktori signaalipep- • i i \.. tidin 3'-päätä, 2y-sekvenssissä olevaan Spel-kohtaan: 25 «Il • I I • · • · ·
Asp718 S tul Ncol BamHI
gtäcctttggataaaagägactacaaggacgacgatgacaagaggcctccatggat ...
' GAAACCTAl^TrCTCTGATGTrCCTGCTGCTACTGTTCTCCGGAGGTACCTA...
" poly 1 inker "- 30 • M • · · • · · ·.·.· Smai Spel
...CCCCCGGGACA
·...' ...GGGGGCCCTGTGATC
i ί ''i 35 -"polylinker -+ i a · i i i
I
47 103987 pBCl20 eroa pYaHuGMrstä myös siten, että siinä on läsnä 514 emäsparin DNA-palanen, joka on peräisin yksisäikeises-tä faagista fl ja sisältää replikaation aloituskohdan ja geenien välisen alueen ja joka on liitety pBR322-sekvens-5 sissä olevaan Nrul-kohtaan. fi-replikaation aloituskohdan läsnäolo mahdollistaa vektorin yksisäikeisten DNA-kopioi-den aikaansaamisen, kun se on transformoitu sopiviin E.coll-kantoihln ja superinfektoitu bakteriofaagilla fl, mikä helpottaa vektorin DNA:n sekvenssointia ja mahdollis-10 taa in_vitro-mutageneesin. cDNA:n liittämiseksi pIXY120:tä pilkotaan Asp718:lla, joka katkaisee läheltä a-faktorijoh-topeptidin 3'-päätä (nukleotidi 237), ja esimerkiksi NcoI:llä, joka katkaisee "polylinker"-alueella. Suuri vek-toripalanen puhdistetaansitten ja yhdistetään ligaation 15 avulla DNA-palaseen, joka koodaa ilmennettävän proteiinin.
Erittämisvektorin aikaansaamiseksi ihmisen IL-7:n ilmentämistä varten cDNA-palanen, joka koodaa hIL-7:n Clal-kohdasta (katso kuvio 1) Ncol-kohtaan, joka sijaitsee avoimeen lukuraamiin nähden 3', irroitetaan cDNA:sta, joka 20 sisältää täydellisen hIL-7-sekvenssin. pIXY120:tä pilkotaan Asp718:lla läheltä a-faktorijohtopeptidin 3'-päätä ja Ncolrllä. Vektoripalanen yhdistetään ligaation avulla hlL-" 7-cDNA:n Clal-NcoI-palaseen ja seuraavaan oligonukleoti- • « ' diin, joka muodostaa uudelleen α-faktorijohtopeptidin vii- * « i 25 meiset viisi aminohappoa ja kypsän hIL-7:n ensimmäiset 20 aminohappoa.
* · · • · • · α-faktorin käsittely
EcoRV
GTA CCT TTG GAT AAA AGA GAT TGT GAT ATC GAA GGT AAA GAT GGC ...
... 30 GA AAC CTA TTT TCT CIA ACA CIA TAG CTT CCA TTT CIA CCG ...
· Pro Leu Asp Lys Arg Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly ...
|<-hIL-7--♦ • · · a
... AAA CAA TAT GAG AGT GTT CTA ATG GTC AGC AT :. V ... TTT CTT ATA CTC TCA CAA GAT TAC CAG TCG TAG C
Lys Gin Tyr Glu Ser Vai Leu Met Vai Ser Ile « « 35 • 1 i 48 103987
Oligonukleotidi sisältää myös T- >C-muutoksen nukleotidin 12 kohdalla EcoRV-restriktiokohdan tuottamiseksi muuttamatta koodattua aminohapposekvenssiä. Tulokseksi saadulle hIL-7:n ilmentämisvektorille on annettu nimitys pIXYl20.
5 Solun sisäisen ilmentämisen vektorin aikaansaami seksi hIL-7:n S.cerevisiaessa tuottamista varten, pIXYl20:tä pilkotaan XhoI:llä (Joka katkaisee a-faktori-johtosekvenssiin nähden 5') ja NcoI:llä johtopeptidin koo-daavan DNA-sekvenssin poistamiseksi. Vektoripalanen eris-10 tetään ja yhdistetään ligaation avulla EcoRV-NcoI-pala-seen, joka koodaa hIL-7:n nukleotidistä 12 alkaen ja joka on saatu pIXY192:sta (kuten yllä on kuvattu) ja seuraavaan oligonukleotidiin:
15 T CGA GAC AAA ATG GAT TGT GA
CTG TIT TAC CTA ACA CT Met Asp Cys Asp Tämä oligonukleotidi liittää kypsän hIL-7:n hiivan ADH2-promoottoriin ja tarjoaa aloitusmetioniinin kodonin ja 20 kypsän hIL-7:n ensimmäiset kolme aminohappoa EcoRV-kohtaan asti. Tulokseksi saadulle vektorille on annettu nimitys pIXYl93.
; Edellä olevat ilmentämisvektorit puhdistetaan sit- • ten ja käytetään diploidin S. cerevisiae-hiivakannan 25 (XV2181) transformointiin käyttäen yleisiä tekniikkoja, kuten esimerkiksi EPÄ 1654 654:ssä esiteltyjä, valiten • « .*·*. tryptofaaniprototrofeja. Tulokseksi saatuja transfor- mänttejä viljellään hIL-7-proteiinin ilmentämiseksi joko • · · solun sisälle taierittyvänä proteiinina. Viljelmiä, joista 30 on tarkoitus tutkia biologinen aktiivisuus, kasvatetaan • · · 20-50 ml:ssa YPD-elatusainetta ( % hiivauutetta, 2 % pep- • i « ’·’ * töniä, 1 % glukoosia) 37 eC:ssa solutiheyteen 1-5 x 108 solua/ml. Solujen erottamiseksi viljelyaineesta solut • · poistetaan sentrifugoimalla ja viljelyaine suodatetaan • · · 35 0,45 μ:η selluloosa-asetaattisuodattimen lävitse ennen
• « I
• f · ....: • * tm 49 103987 analysointia. pIXY192:11a transformoidun hiivakannan tuottamat supernatantit tai raa'at uutteet, jotka on valmistettu rikotuista pIXY193:lla transformoiduista hiivasoluista, tutkitaan esi-B-solsujen lisääntymisen määritystä 5 käyttäen IL-7-aktiivisuuden suhteen biologisesti aktiivisen proteiinin ilmentymisen varmistamiseksi.
Esimerkki 6
Hiiren IL-7:n ilmentäminen E.colissa
Kypsää mIL-7:ä ilmennettiin solun sisälle E.colls-10 sa sijoittamalla koodaava alue myötävirtaan bakteriofaagi gamman vasemmanpuoleisesta promoottorista PL. Plasmidin tuottama mRNA sisältää consensus-ribosomin-sitoutumiskoh-dan ja ATG:n (aloitusmetioniinin kodoni). Ilmentämisplas-midi kokoonpantiin seuraavasti. Ensin plasmidia pLNbIL2 15 (ATCC 53202; katso EPÄ 215 576) pilkottiin Xbalillä ja
Stul:llä ja tulokseksi saatu 5,2 kiloemäksen vektorin-palanen otettiin talteen. Toiseksi syntetisoitiin synteettinen oligonukleotidi faagi lambdan typistetyn N-geenin transkriptioyksikön yhdistämiseksi consensus-ribosomin- . 20 sitoutumiskohtaan (cRBS) ja mIL-7:n koodaavaan alueeseen Ndel-kohdaan saakka (katso kuvio 1). Tällä oligonukleoti-dilla oli seuraava sekvenssi:
!. (Xbal) Bglu cRBS
CTÄGATCTCT AAGGAGGTAAAAAAAT ATG GAA TGT CAT ATT AAA GAT AAA GAA GGT ...
, 9c; TAGAGA ITCCTCCATrTlTTTA TAC CTT ACA GTA TAA TTT CTA TTT CTT CCA ...
0 Met Glu Cys His Ile Lys Asp Lys Glu Gly ...
(Nflel)
···. ... AAA GCA
'···’ ... TTT CGTAT
:T: ... Lys Ala _...# 30 Kolmanneksi restriktiopalanen, joka sisälsi suurimman osan • ♦ c l.. mIL-7:n koodaavasta alueesta, otettiin talteen kloonilta, • · · ·, joka oli eristetty kuten on kuvattu esimerkissä 2, pilkko- maila Ndel:llä ja PvuII:11a. Edellä olevat kolme frag- :menttia yhdistettiin ligaation avulla saaden ilmentämis- • « · .Λ 35 plasmidi, jolle on annettu nimitys pLNPBGF. Tällä plasmi-
• I
50 103987 dilla transformoitiin E.coli-kanta K802:pRK248cIts (ATCC 33526; atcc 33766), jota viljeltiin sitten superinduktio-elatusaineessa (katso Mott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:88 (1985)). Rekombinanttitranskriptioyksikön ilmen-5 täminen indusoitiin muuttamalla viljelmän lämpötila
30 °C:sta 42 °C:seen, kun viljelmät saavuttivat A600-arvon noin 0,5, ja niitä pidettiin sitten tuossa lämpötilassa suunnilleen kahden tunnin ajan. Tämän ajan kuluttua solut koottiin ja tulokseksi saatu solupelletti liuotettiin uut-10 topuskuriliuokseen, jonka muodosti (1 ml:n viljelmää vastaavaa pellettiä varten) 0,5 ml liuosta, jossa oli 7M gua-nidiini-HCl, 10 mM sitraattia pH 7,0, 5 mM EDTAa, 0,1 % beetamerkaptoetanolia ja 0,1 % Triton X100. Tulokseksi saatu täysin denaturoitunut solu-uute laimennettiin sitten 15 nopeasti (1 osa 100 kohden) kudosviljelyaineella (RPMI
1640), joka sisälsi 1 % naudan seerumin albumiinia. Tämä menetelmä johti 20-50 000 yksikön aktiivisuutta ilmentymiseen ml:aa kohden solu-uutetta.
mIL-7:n ilmentymistaso parannettiin noin 100-ker-20 täiseksi siirtämällä pLNPBGF:stä peräisin oleva proteiinin koodaava restriktiopalanen plasmidiin, joka sisälsi lyhennetyn 5'-koodaamasttoman alueen. Tämä ilmentämisplasmidi (jolle on annettu nimitys pPLlppPBGF) rakennettiin plasmi-dista pPL3 seuraavasti. pPL3 on sellaisen kaupallisesti 25 saatavissas olevan plasmidin pGEMl (Promega Biotec, Madi- * * » / son, Wl, USA) johdannainen, joka sisältää olennaisesti * · ’·.·* samanlaisen lämpöherkän gamma-PL-promoottorin kuin se, jon- • · « *.· ’ ka ovat kuvanneet yksityiskohtaisesti Gourse et ai., Proc.
Natl. Acad. Sci.USA 82:1069 (1985). Samankaltaisia gamma- : 30 PL-promoottorisekvenssejä on läsnä plasmideissa pHUB2, joka sijaitsee E.coli-kannassa JMB9 (ATCC 37092), ja pPLc28, • " .\ joka sijaitsee E.coli RRl:ssä (ATCC 53082). pPL3 piklot- tiin Hindlll:11a, tulokseksi saatu lineaariseen muotoon ; saatettu plasmidi tehtiin tasapäiseksi T4-polymeraasin i ' 35 avulla ja sitä pilkottiin sitten Asp718:lla. Sitten vai- 51 103987 niistettiin synteettinen oligonukleotidi, jolla oli seuraa-va sekvenssi: (Asp71fl) (Xbal) GIACCGCTACATGGAGATTAACTCAAT 5 GCGATTTTACXrTCEAAITGTGTIAGATC.
pLNPBGF:stä peräisin oleva restriktiopalanen, joka sisälsi koko koodaavan alueen, aikaansaatiin pilkkomalla Xbalillä ja SspI:llä. Edellä olevat elementit yhdistettiin ligaa-10 tion avulla käyttäen yleisiä tekniikkoja ja tulokseksi saadulla plasmidilla pPLlppPBGF transformoitiin K802:pRK248clts. Kun tämä kanta indusoitiin kuten yllä on kuvattu, aikaansaatiin noin 2,5-3,2 miljoonaa yksikköä esi-B-solujen kasvua edistävää aktiivisuutta ml:aa kohden 15 viljelyainetta solu-uutteisiin, jotka oli valmistettu yllä kuvatulla tavalla. Lisäksi SDS-PAGE osoitti tiheään värjäytyneen proteiinivyöhykkeen asemassa, joka vastasi kypsän mIL-7:n molekyylipainoa.
Esimerkki 7 20 Rekombinantti-ihmis-IL-7:n ilmentäminen käyttäen erittäin tehokkaita nisäkäsilmentämlsjärjestelmiä Nisäkkään ilmentämisplasmidi pDC201, joka on esi- • tetty kuviossa 7, on suunniteltu ilmentämään sen mul-tippeliin kloonauskohtaan (MCS) liitettyjä cDNA-sek- :25 venssejä, kun se on transfektoitu nisäkässoluihin. Viita-
• · I
ten nyt kuvioon 7, pDC20l sisältää seuraavat komponentit: .···. SV40 (viivoilla varjostettu laatikko) sisältää SV40-sek- • · venssit koordinaateista 5171-270, mukaan lukien replikaa- • · · tion aloituskohta, vahvistaja (enhancer) -sekvenssi ja 30 varhainen ja myöhäinen promoottori. Palanen on sen suun- • · · ’·1 1 täisenä, että varhaisesta promoottorista tapahtuvan trans- • · · *.1 1 kription suunta on nuolen esittämä. Ad-MLP (avoin laatik- ko) sisältää adenovirus-2-sekvenssit koordinaateista 5779- i « i '
« I
.··, 6231, mukaan lukien tärkein myöhäinen promoottori, kol- 35 miosaisen johtopeptidisekvenssin ensimmäinen eksoni ja osa
I
52 103987 ensimmäisen ja toisen eksonin välistä intronia. TPL (pil-: kutettu laatikko) sisältää synteettisen DNA-sekvenssin, joka käsittää adenovirus-2:n sekvenssit 7056-7172, 9634-9693 (jotka sisältävät kolmiosaisen johtopeptidisekvenssin 5 toisen eksonin muokkaus (splice) -akseptorikohdan, kolmiosaisen johtopeptidisekvenssin toisen eksonin ja osan i kolmatta eksonia) ja multippelin kloonauskohdan (MCS), j joka sisältää kohdat Kpnl:tä, Smal:tä ja BglII:ta varten.
pA (viivoin varjostettu laatikko) sisältää SV40-sekvenssit 10 kohdista 4127-4100 ja 2770-2533, jotka sisältävät polyade-nylointi - ja lopetussignaalit varhaista transkriptiota varten. VA (tumma laatikko) sisältää adenovirus-2:n sek venssit kohdista 10226-11555, jotka sisältävät virukseen liittyvät RNA-geenit (VAI ja VAII) ja Nhel-kohdan, joka 15 sijaitsee suunnilleen 570 emäsparia myötävirtaan MCS:sta. Yhtenäiset viivat ovat peräisin pBR322:sta ja edustavat (alkaen pA.sekvenssien jälkeen ja edeten myötäpäivään) koordinaatteja 29-23, 651-185 (johon kohtaan VA-sekvenssit on liitetty), 29-1, 4363-2486 ja 1094-375. pDC201 on 20 pMLSVtn johdannainen, jonka ovat aikaisemmin kuvanneet
Cosman et ai., Nature 312:768 (1984).
C0S-7-soluja kasvatetaan ja ne transfektoidaan , kuten ovat kuvanneet Cosman et ai., supra, plasmidi- ' DNA: 11a, joka on saatu sellaisen E.coli DH5an (rec A") ’' 25 1,5 ml:n viljelmästä, joka on transformoitu Smal:llä lei- *.**: katulla liitetyn hIL-7-cDNA:n sisältävällä pDC201:llä ··· (katso yllä oleva esimerkki 3). Edullisessa suoritussa : muodossa käytetään hIL-7-cDNA:ta liitettynä ihmisen IL-2- reseptorin (p55, Tac-antigeeni) signaalisekvenssiin rekom-j*·*; 30 binantti -hIL-7:n erittymisen transfektioiduista C0S-7- soluista lisäämiseksi.
• · Tässä suoritusmuodossa ppDC201-plasmidia,jossa on hIL-7-cDNA-insertti, leikataan Clal:llä ja Nhel:llä ja • · * tulokseksi saatu Clal-Nhel-palanen (joka sisältää ihmisen sv. 35 IL-7:n koodaavan sekvenssin C-terminaalisen osan) yhdis- M : \ • « · t « S"^a m 53 103987 tetään ligaation avulla seuraavan oligonukleotidiin, joka palauttaa ihmisen kypsän IL-7:n ensimmäiset 19 aminohappoa koodaavan sekvenssin sisäiseen Clal-kohtaan asti ja sen mukaan lukien: 5
EcoRV
AT TGT GAT ATC GAA GGT AAA GAT GGC AAA CAA TAT GAG...
TA ACA CTA TAG CTT CCA TTT CTA CCG ITT GTT ATA CTC...
Asp Cys Asp lie Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gin Tyt Glu...
Clal
... ACT GTT CTA ATG GTC AGC AT iU ...TCA CAA GAT TAC CAG TCG TAGC
...Ser Vai Leu Met Vai Ser.
Ihmisen IL-2-reseptori-cDNA:n PvuII-Xbal-palanen irrotetaan sitten pMLSV-Nl/N4-S:stä (ATCC 39890; katso EPÄ 15 162 699 ja Cosman et ai, supara). Tämä plasmidi sisältää
PvuII-kohdan välittömästi vstavirtaan Pstl-kohdasta, joka on esitelty mainituissa julkaisuissa. PvuII-Xbal-palanen eristetään ja tehdään tasapaiseksi T4-DNA-polymeraasin avulla ja yhdistetään ligaation avulla BamHI-”linker"-sek-20 vensseihin. Tämä palanen kloonataan sitten BglII:lla leikattuun välituotevektoriin. MamHI:llä katkomisen jälkeen tulokseksi saatu fragmentti eristetään ja kloonataan BglII:lla leikattuun pDC201:een, jolloin saadaan pDC201/IL-2R. IL-2-reseptorijohtopeptidisekvenssin liittä-25 miseksi kysään hIL-7:ään pDC201/IL-2R leikataan Sstltllä, !/.; tehdään tasapäiseksi ja leikataan sitten Nhel:llä ja tu- :***; lokseksi saatu vektorifragmentti yhdistetään ligaation
• M
:’!1< avulla hIL-7-fragmenttiin, joka on kokoonpantu käyttäen edellä olevaa oligonukleotidia. COS-7-soluihin transfek-30 toituna tulokseksi saatuvektori aiheuttaa hIL-7:n runsaan • · i !.. ohimenevän ilmentymisen.
• » ·
Vaihtoehtoinen nisäkässoluilmentämisjärjestelmä • · V.’ ihmisen IL-7:ä varten kokoonpannaan liittämällä edellä : oleva IL-2R/IL-7-rakennelma selektoitavan merkkigeenin ;v, 35 sisältävään nisäkkään stabiiliin ilmentämisvektoriin, joka • i 1 · 54 103987 viedään sitten vauvahamsterin munuaisen (BHK) soluihin. Ilmentämisvektori kokoonpannaan seuraavasti. Smal-Hincll-cDNA-palanen irrotetaan edellä olevasta, yllä kuvatulla tavalla kootusta pDC201/hIL-2R/hIL-7-plasmidista ja kloo-5 nataan nisäkkään ilmentämisvektorin, joka sisältää SV40-replikaation aloituskohdan ja viruksen vahvistaja (enhancer) sekvenssin liitettynä hiiren metallotioneiini-promoottoriin (MT-1), korjattuun (Klenow-polymeraasi) BamHI-kohtaan. Katso Palmiter et ai., US-patentti 10 4 579 821. Tämä hybridipromoottori osoittaa runsasta sta biilia, konstitutiivista ilmentämistä monissa erilaisissa nisäkässolutyypeissä. pNPVl sisältää myös normaalin dihyd-rofolaattireduktaasin (DHFR) DNA-sekvenssin, joka mahdollistaa tämän plasmidin sisältävien nisäkässolujen meto-15 treksaattiselektion. DHFR-sekvenssin monistumistapahtumia sellaisissa soluissa voidaan valita käyttämällä suurennettuja metotreksaattikonsentraatioita. Tällä tavalla yleensä myös monistetaan viereiset DNA-sekvenssit ja aikaansaadaan siten lisääntynyt ilmentyminen.
20 Selektio ja ilmentäminen suoritetaan käyttäen ad- herentteja BHKtk-ts 13 -soluja (ATCC CRL 1632), joita ovat kuvanneet Waechter et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA !. 79:1106 (1982) ja Talavera et ai., J. Cell. Physiol.
92:425 (1977). Nämä solut kykenevät sekä runsas mannoosi 25 että moniaineinen oligosakkaridi-proteiinin modifiointiin t » » *· *: (katso Hsieh et ai., J. Biol. Chem. 258:2548 (1983)). Sen • · · • i *...* jälkeen kun ilmentämisplasmidi on saatettu lineaariseen • · t \· ; muotoon Sallin avulla, DNA viedään BHK-soluihin sähköhuo- koistamisen (electroporation) avulla käyttäen 300 volttia ;Ti 30 ja 960 mikrofaradia. Sopivia sähkönhuokoistamistekniikkoja :*·*· on esitelty teoksessa Ausubel et ai., toimittajat, supra, kohdassa 9.3.1. 48 tunnin kuluttua viljelyaineeseen jär-jestetään 1 mikromolaarinen metotreksaattikonsentraatio ja resistenttejä kolonioita valitaan kahden viikon kuluttua.
: 35 Edustavia klooneja bioanalysoidaan hIL-7:n erittämisen • ( 55 103987 viljelmän supernatanttifraktioon suhteen. Runsaimmin ilmentäville klooneille suoritetaan sitten lisävalintamenet-telyjä käyttäen 10, 20 ja 50 mikromolaarista metotreksaat-tia. Resistenttejä kolonioita analysoidaan lisäksi run-5 säästi ilmentävien kloonien identifioimiseksi. BHK-linjat, jotka on valittu tätä ohjelmaa käyttäen, ovat adherentteja soluja ja voidaan laatia suurennetun mittakaavan tuotantosuunnitelmia, joihin sisältyy joko suspensiokasvatus käyttäen helmiä tai kasvatusbioreaktoreissa käyttäen ont-10 tokuituteknologiaa. BHK-solut voidaan helposti sopeuttaa kasvatukseen suspensiosoluina.
Esimerkki 8 lL-7:n käyttö epäkypsien T-solujen jatymosyyttien lisääntymisen stimulointiin 15 Tarkoituksena on osoittaa, että IL-7 stimuloi T- solujen erilaisten linjojen ja asteiden lisääntymistä, sikiökautisilta ja täysikasvuisilta hiiriltä peräisin olevia tymosyyttejä viljeltiin rekombinanttihiiri-IL-7:n raakojen ja puhdistettujen valmisteiden läsnäollessa.
20 Kateenkorva, joka on vastuussa soluimmuunivasteen kehittymisestä ja/tai erilaistumisesta, muodostuu heterogeenisestä T-solujen populaatiosta. Suuri enemmistö, noin 80-85 % soluista, ovat fenotyypiltään ainutlaatuisia (CD+/CD8+) ja funktionaalisesti kelpaamattomia. Kateenkor-25 vassa on myös läsnä sekä funktionaalisesti että fenotyy-piltään kypsempiä soluja. Nämä solut eli yhden positiivi- ’···* sen solut (CD4+/CD8‘ tai CD4‘/CD8+) käsittävät suunnilleen • « · * 5-10 % tymosyyteistä ja kykenevät reagoimaan erilaisiin immunologisiin ärsykkeisiin. Kateenkorvassa on myös läsnä ϊ 30 CD4VCD8'-solujen populaatio, jonka solun ajatellaan olevan :'Γί varhaisin solu T-solujen ontogeniassa. CD4"/CD8'-alajoukos- sa on soluja, jotka kykenevät uudelleen kansoittamaan im- i muunivasteen suhteen heikentyneiden saajien kateenkorvan ; ja synnyttämään muut tymosyyttipolulaatiot.
< I I f · 56 103987
Nyt tiedetään, että varhaiset tymosyytit, esimerkiksi L3T4'/Lyt2' tai CD4'/CD8'-solut, voivat uudelleenkan-soittaa säteilytettyjen saajien kateenkorvan ja erilaistua eri tymosyyttialajoukoiksi (toisin sanoen CD4+/CD8', 5 CD4‘/CD8+ ja CD4+/CD8+) . IL-7:n vaikutusten tymosyyttien lisääntymiseen määrittämiseksi erilaisia tymosyyt-tipreparaatteja inkuboitiin puhdistetun mIL-7:n ja [H3] -tymidiinin läsnäollessa ja liittyneen radioaktiivisuuden suhteelliset tasot mitattiin tuikelaskennan avulla. Seulo raavassa koesarjassa viljelmien supernatantteja, jotka sisälsivät hiiren IL-7 -cDNA:n sisältävällä ilmentämisvek-torilla transformoidulta COS-7-solulinjalta peräisin olevaa IL-7:ä, valmistettiin kuten on kuvattu esimerkissä 3. Näitä superntantteja käytettiin suoraan tai ne puhdistet-15 tiin yhdeksi ainoaksi 25 kilodaltonin proteiinilajiksi kuten on esitetty yksityiskohtaisesti esimerkissä 1. Puhdistamisen jälkeen rekombinantti-mIL-7:n spesifinen aktiivisuus oli suunnilleen 8 x 105 yksikköä^g proteiinia.
Tymosyyttien lisääntymisen määrityksissä täysikas-20 vuisia C3H/HeJ- tai C57BL/6J-tymosyyttejä viljeltiin tiheydellä 10* solua/syvennys Costar-96 syvennyksen tasapoh-jäisillä mikrotiitterilevyillä (Cambridge, MA, USA) RPMI-1640-elatusaineessa, johon oli lisätty 10 % sikiökautisen « · t *_ naudan seerumia, 5 x 105M 2-merkaptoetanolia, 50 μg/ml glu- < « 25 tamiinia, 0,2 ml:n lopullisessa tilavuudessa, rekombinant- <11 tihiiri-IL-2: ta lisättiin viljelmiin konsentraatioksi 50 • · *···’ ng/ml, kun taas mIL-7:ä lisättiin raa'an C0S-7-supernatan- * tin 1:50-laimennoksena, joka sisälsi suunnilleen 1,25 ng/ml mIL-7:ä. 3H-tymidiiniä lisättiin viljelmäsyvennyksiin : 30 72 tunnin viljelyn kuudeksi viimeiseksi tunniksi. Tulokset :T: on ilmaistu pulsseina minuutissa (cpm) alla taulukossa 2, neljän rinnakkaismäärityksen aritmeettisena keskiarvona.
• I r
Arvioitiin IL-7:n mitogeenisiä kykyujä varhaisim-pien T-solujen tai thy+ CD4'/CD8‘-tymosyyttien suhteen, sekä ί 35 yksin että Con A.-n läsnäollessa. Käytettiin kahta CD4'/CD8' < « · < r
< I
57 103987 -tymosyyttien lähdettä. CD4*/CD8"-tymosyyttejä hankittiin täysikasvuisista kateenkorvista negatiivisen selektion avulla käyttäen vasta-ainetta ja komplementin välityksellä tapahtuvaa sytolyysiä. C57BL/6J- täysikasvuisia tymosyyt-5 tejä inkuboitiin 4>:ssa 45 minuutin ajan yhtä suurten tilavuuksien kanssa asnti-L3T4- ja anti-Lyt2- monoklonaalis-ta vasta-ainetta (mAb). Tämän inkubaation jälkeen solut sentrifugoitiin, supernatantti imettiin pois ja solut uudelleensuspendoitiin Mar 18,5-solulinjan (anti- rotan 10 kappaketju -mAb) (American Type Tissue Center, Rockville, MD, USA) viljelmän supernatanttiin (1 ml/107 solua) 30 minuutin ajaksi 4C:ssa. Sentrifugoinnin jälkeen solut uudelleensuspendoitiin kaniinin komplementin 1:10-laimennokseen ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 37 °C:ssa. Solut pestiin 15 sitten kerran ja elinkykyiset solut eristettiin sentrifu-goimalla epäjatkuvan tiheysgradientin kautta. Tulokseksi saatuja soluja oli suunnilleen 0,1 % lähtölukumäärästä. Ne olivat yli 98 % elinkykyisiä ja CD4- ja CD8- ilmennyksen analyysi immunofluoresoivan värjäyksen ja virtaussytomet-20 rian avulla osoitti niiden olevan alle 4 % CD4* tai CD8*.
CD4'/CD8'-tymosyyttejä hankittiin myös päivän 13 sikiökautisina tymosyytteinä, jotka käsittävät pääasiallisesti (>99 %) CD4"/CD8* Thyl*-soluja. Päivän 13 sikiökauti-sia tymosyyttejä (jolloin päivä 0 on emätintulpan ensim- i 25 mäinen päivä) viljeltiin tiheydellä 5 x 104 solua/syvennys pyöreäpohj ai silla levyillä Rauletin et ai. menetelmän mu- *···' kaan, Nature 314:101 (1985). Kun näitä soluja viljeltiin * · · ’·* * rekombinantti-IL-7: n kanssa, havaittiin lisääntymisreaktio kuten on esitetty taulukossa 2. CD4"/CD8*-tymosyytit voivat ϊ 30 lisääntyä IL-7:n vaikutuksesta ilman että läsnä on mitään muuta komitogeenia.
Kasvilektiinin konkanavaliini A (Con A, 2,5 pg/ml)
I ( I
lisääminen viljelmiin lisäsi selvästi CD4‘/CD8'-tymosyyt-
• I
tien reaktiota IL-2:een ja lL-7:ään. Täysikasvuiset CD4‘ V 35 /CD8"-solut reagoivat melkoisen voimakkaasti pelkkään Con I « ' I f „ 10398?
DO
A:han, kun taas IL-2:n lisääminen viljelmiin aikaansai lisääntymisen kolminkertaisen vahvistumisen. IL-7:n lisääminen enemmän kuin kaksinkertaisesti näiden solujen li-sääntymisreaktion. Sikiökautiset tymosyytit eivät mitat-5 tavassa määrin reagoineet pelkkään Con A:hän, mutta IL-ä 2:n tai IL-7:n läsnä ollessa havaittiin merkittävää li sääntymistä. Nämä tulokset osoittavat, että T-solsujen erilaistuminen vähiten kypsän kateenkorvansisäisen vaiheen soluja voidaan stimuloida lisääntymään IL-7:n avulla, mikä 10 osoittaa tämän sytokiinin roolin T-solujen erilaistumisessa ja kypsymisessä.
Taulukko 2 IL-7:n aiheuttama täysikasvuisten ja sikiökautis-15 ten tymosyyttien lisääntyminen
Viljelmän lisäykset
Tymosyytit Con A Ei mitään IL-2 IL-7 Täysikasvuisia - 0,7 19,1 11,7 20 CD4'/CD8‘ + 43,3 130,3 98,4 Päivän 13 sikiö- - 0,6 11,5 6,7 kautisia + 1,0 23,3 12,9 ] Tutkittiin myös IL-7:n suhteellista tehokkuutta T- f ! 25 solujen mitogeenina, sekä yksin että komltogeeniärsykkeen PHA läsnäollessa ja sitä verrattiin kahteen muuhun T-solu- • · *···* jen kasvutekijään, interleukiini-2:een (IL-2) ja inter- *·* ‘ leukiini-4:ään (IL-4). Sekä IL-2 että IL-7 stimuloivat suoraan tymosyyttien lisääntymistä; IL-2 oli kuitenkin «4« V ; 30 noin kymmenen kertaa aktiivisempi painon perusteella kuin :: : IL-7. Niinkin suurina konsentraatioina kuin 1 pg/ml IL-4 t·]·. oli heikko mitogeeni tymosyyttiviljelmille. Kuitenkin kun ,\ lektiiniä fytohemaglutiniini (PHA) lisättiin viljelmiin lopulliseksi konsentraatioksi 1 % (tilavuus/tilavuus), m 59 103987 todettiin IL-2:sta, IL-4:stä ja IL-7:stä riippuvaisen lisääntymisen huomattava suureneminen.
IL-7 toimii IL-2:sta, IL-4:stä tai PHA:sta riippumattomana tymosyyttien lisääntymisen stimuloinnissa.
5 Esimerkiksi IL-2-konsentraatioissa, jotka olivat kyllästä viä tymosyyttien lisääntymistä varten (1-1000 ng/ml:a kohden), IL-7 (konsentraationa noin 1-2 ng/ml:a kohden) merkittävästi suurensi lisääntymisreaktiota, aikaansaadaan tritiumilla merkityn tymidiinin liittymisen noin 50 % li-10 sääntymisen. Samalla tavoin todettiin myös IL-4:stä riippuvaisen lisääntymisen suureneminen lL-7:n läsnäollessa. Lisäksi IL-7:n aiheuttamaa tymosyyttien lisääntymistä ei estänyt anti-IL-2-reseptori-monoklonaalinen vasta-aine konsentraaioina, jotka kykenivät estämään IL-2:n aikaan-15 saaman tymosyyttien lisääntymisen. Anti-mIL-4-mono- klonaalinen vasta-aine ei myöskään estänyt IL-7:n kykyä aiheuttaa tymosyyttien lisääntyminen.
Edellä olevat kokeet osoittavat, että IL-7 kykenee stimuloimaan epäkypsien T-solujen lisääntymistä ja on myös 20 tehokas kypsien T-solujen kostimuloija mitogeenin läsnäollessa.
. Esimerkki 9 < ; IL-7:n antaminen normaaleille hiirille . . Suoritettiin sarja kokeita tarkoituksena selvittää , 25 mIL-7:n normaaleille C57BL/6J-hiirille (Jackson Laborato- « I i ’·./ ry, Bar Harbor, ME, USA) vatsaontelon sisään antamisen « · ’···1 vaikutukset. Hiiren IL-7:ä, joka oli valmistettu C0S-7- ·♦· *·1 ’ solujen suorittaman ilmentämisen avulla kuten on kuvattu esimerkissä 3, annettiin päivinä 0-4. Solumäärä (cel- « · · ; 30 lularity), funktio- ja solunpointa-antigeenifenotyyppi :T: pernassa, vatsakalvon ontelossa, periferisessä veressä, kateenkorvassa ja luuytimessä tutkittiin päivinä 5 ja 8, I- annoksilla 40 ng, 200 ng ja 1 pg eläintä kohden, käyttäen viittä hiirtä annostusryhmää kohden.
I t 1 I I
II’ 60 103987
Luuytimen granulosyytti/makrofaagikolonian muodostavien yksikköjen (CFU-GM) määrä oli kohonnut päivänä 8 kaikkia IL-7-annoksia saavilla hiirillä ja 40 ng:n ryhmällä esiintyi suurin lisääntyminen verrattuna kontrollihii-5 riin, hotka saivat ainoastaan täyteainetta. Samoin olivat IL-7:lle herkät ytimen solut lisääntyneet samoissa hiirissä, ja suurin vaikutus esiintyi 40 ng:n ryhmällä. Luuytimen megakaryosyyttien CFU:iden (CFU-MK) määrä oli lisääntynyt kaikilla annosryhmillä ja oli maksimaalinen (3 x 10 suurempi kuin kontrolleilla) päivänä 8 hiirillä, jotka seaivat 200 ng. Pernassa CFU-GM-määrä oli suurentunut ainoastaan hiirillä, jotka saivat suurinta IL-7:n annosta.
Periferisen veren solumäärä oli suurentunut 1,5-2,5X:ksi päivänä 5 kaikissa annosryhmissä ja oli pysynyt 15 noin 2,5X:na suuren annoksen ryhmässä päivänä 8. Samankaltainen kinetiikka todettiin vatsakalvon ontelon solumää-rällä, mutta täällä suurenemiset ulottuivat 3,5X:ksi saakka. Luuysin oli lisääntynyt noin l,5X:ksi päivänä 5, mutta ei eronnut kontrolleista päivänä 8. Pernassa todettiin 20 1,5-1,8X suurenemisia solumäärässä päivinä 5 ja 8 suuren annoksen ryhmässä. Kateenkorvan solumäärä ei ollut muuttunut päivänä 5, mutta oli suurentunut 2X:ksi päivänä 8 suuren annoksen ryhmässä.
Esimerkki 10 25 IL-7:n kanssa immunoreaktiivisten vasta-aineiden • ·« *,.* valmistus • *
Puhdistetun alkuperäisen tai rekombinantti-IL-7:n, • « · ** * esimerkiksi ihmisen IL-7:n, valmisteita käytetään poly- klonaalisten antiseerumien tai edullisesti monoklonaalis- • tf V ‘ 30 ten vasta-aineiden tuottamiseen IL-7:ä vastaan käyttäen !t!*; tavanomaisia tekniikkoja, esimerkiksi niitä, jotka on esi- telty US-patenttissa 4 411 993. Sellaisten vasta-aineiden < voidaan odottaa olevan hyödyllisiä IL-7:n oisoittamisessa f tai IL-7:n biologisen aktiivisuuden neutraloimisessa mää- i
t I
61 103987 ritykeissä tai kokeissa, joihin liittyy monia lym-fokiinejä.
Hiirten immunoimiseksi olennaisen puhdas IL-7-val-miste emulgoidaan täydelliseen Freundin adjuvanttiin ja 5 ruiskutetaan määrinä, jotka ovat väliltä 10-100 pg, sub-kutaanisesti Balb/c-hiiriin. Kymmenestä kahteentoista päivään myöhemmin immunoiduille eläimille annetaan tehosteeksi lisää IL-7:ä, joka on emulgoitu epätäydelliseen Freundin adjuvanttiin, ja sen jälkeen annetaan tehosteita mää-10 räajoin viikoittain tai joka toinen viikko toteutettavan immunointiaikataulun mukaan. Seeruminäytteitä otetaan ai-ka-ajoin retro-orbitaalisen verenoton tai hännän kärjen poisleikkaamisen avulla testattaviksi "dot-blot"-määrityksen (vasta-ainevoileipä) tai ELISA:n (entsyymiin liitetty 15 immunosorbentti-analyysi) avulla. Muut analyysimenetelmät ovat myös sopivia. Sopivan vasta-ainetiitterin toteamisen jälkeen positiivisille eläimille annetaan ruiskeena laskimoon suolaliuoksessa olevaa antigeeniä. Kolme tai neljä päivää myöhemmin eläimet tapetaan, splenosyyttejä kootaan 20 ja fuusioidaan hiiren myeloomasolulinjaan NS1. Tällä menetelmällä aikaansaatuja hybridomasolulinjoja sijoitetaan levyviljelmiksi monen syvennyksen mikrotiitterilevyille : HAT-selektiiviseen elatusaineeseen (hypoksantiini, amino- pteriini ja tymidiini) jotta estettäisiin fuusioitumat- i 25 tornien solujen, myeloomahybridien ja pernasoluhybridien * v v I,,’ lisääntyminen.
• • · ’*· Täten aikaansaatuja hybridomaklooneja voidaan seu- • « » *·* loa ELISA:n avulla IL-7:n kanssa reaktiivisuuden suhteen käyttäen esimerkiksi sovellutuksia tekniikoista, joita on V' 30 esitetty julkaisussa Engvall et ai., Immunocemistry 8:871 V : (1971) ja US-patentissa 4 703 004. Positiivisia klooneja ruiskutetaan sitten samasyntyisten Balb/c-hiirten vat- I » l> sakalvon onteloon sellaisten vesivatsojen tuottamiseksi, < jotka sisältävät suuria konsentraatioita (>1 mg/ml) anti- i 35 IL-7-monoklonaalista vasta-ainetta. Tulokseksi saatu mono- « « ( « 62 103987 klonaalinen vasta-aine voidaan puhdistaa ammoniumsulfaat-tisaostuksen avulla, jota seuraa geeliekskluusiokromato-grafia, joka perustuu vsta-aineen sitoutumiseen Staphylococcus aureus-bakteerin proteiini A:hän.
<
I I ( I
I i I
• V
· · • « « · « « · ·
IM
• · · · · • · · * • f · * · t • · · • · · • · · * · • f r
• I
« I < f • ( • « I « « < _____ « ( · | « · I I f
• I

Claims (10)

103987
1. Eristetty DNA-sekvenssi, joka koodaa nisäkkään interleukiini-7:ää (IL-7), tunnettu siitä, että 5 DNA-sekvenssi on a) DNA-sekvenssi, joka käsittää kuviossa 3 tai 5 esitetyn nukleotidisekvenssin, b) DNA-sekvenssi, joka on degeneroitunut kohdan a) DNA-sekvenssin geneettisen koodin suhteen, tai 10 c) DNA-sekvenssi, joka hybridisoituu hybridisaatio- olosuhteissa, jotka ovat 50 °C ja 0,9 M NaCl, mitä seuraa pesu lXSSC-puskurissa 55 °C:ssa, kohdan a) mukaiseen DNA-sekvenssiin ja joka koodaa IL-7:ää, jolla on biologista aktiivisuutta pre-B-solujen proliferaatiomäärityksessä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty DNA- sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa ihmisen IL-7-proteiinia, jolla on biologista aktiivisuutta pre-B-solujen proliferaatiomäärityksessä ja että siinä on N-ter-minaalinen aminohapposekvenssi Asp-Cys-Asp-Ile-Glu-Gly-
20 Lys-Asp-Gly-Lys-Gln-Tyr-Glu-Ser-Val-Leu-Met-Val-Ser-Ile-.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa IL-7- « | ·' proteiinia, joka käsittää aminohapposekvenssin, joka on • I ί yli 90-%:isesti identtinen aminohapposekvenssin kanssa, I I I ·,,,! 25 joka muodostuu kuvion 3 tähteistä -25 - 129, kuvion 3 täh- teistä 1 - 129, kuvion 5 tähteistä -25 - 152 tai kuvion 5 • · tähteistä 1 - 152. • M
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa IL-7- f...t 30 proteiinia, joka käsittää aminohapposekvenssin, joka muo- • · · dostuu kuvion 3 tähteistä -25 - 129, kuvion 3 tähteistä 1 • · · *·) * - 129, kuvion 5 tähteistä -25 - 152 tai kuvion 5 tähteistä . :V: 1 - 152. • <
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen eristetty DNA- • · · 35 sekvenssi, tunnettu siitä, että se käsittää ku- • « · • « • · « » 103987 vion 5 nukleotidien 1 - 456 DNA-sekvenssin.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty DNA- sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa ihmisen IL-7-proteiinia, joka käsittää aminohapposekvenssin, josta 5 puuttuu yksi tai useampia aminohappoja, jotka vastaavat kuviossa 5 esitettyjä tähteitä 121 - 139, mutta joka on muuten identtinen kuviossa 5 tähteinä 1 - 152 esitetyn aminohapposekvenssin kanssa.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty DNA- 10 sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa ihmisen IL-7-proteiinia, joka käsittää aminohapposekvenssin, jossa on modifikaatio, joka on a) N-glykosylaationkohdan (-kohtien) inaktivaatio tai 15 b) KEX2-proteaasin prosessointikohdan (-kohtien) inaktivaatio, jolloin aminohapposekvenssi mainittuja modifikaatioita lukuun ottamatta on identtinen kuvion 5 tähteiden 1 - 152 esittämän sekvenssin kanssa.
8. Rekombinantti-ilmentämisvektori, tunnettu siitä, että sisältää jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukaisen DNA-sekvenssin.
• " 9.Patenttivaatimuksen 8 mukainen rekombinantti- ; ilmentämisvektori, tunnettu siitä, että DNA-sek- I I I 25 venssi koodaa ihmisen IL-7-proteiinia, joka käsittää ku-vion 5 tähteiden 1 - 152 esittämän aminohapposekvenssin.
10. Menetelmä nisäkkään IL-7:n valmistamiseksi, » · tunnettu siitä, että viljellään sopivaa isäntäso-lua, joka sisältää patenttivaatimuksen 8 mukaisen vek- ... 30 torin, nisäkkään IL-7:n ilmentämistä edistävissä olosuh- • * » * » » I.. teissä. • * · • « < 1 103987
FI902077A 1987-10-26 1990-04-25 Interleukiini-7 FI103987B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11356687A 1987-10-26 1987-10-26
US11356687 1987-10-26
US8803747 1988-10-19
PCT/US1988/003747 WO1989003884A1 (en) 1987-10-26 1988-10-19 Interleukin-7

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI902077A0 FI902077A0 (fi) 1990-04-25
FI103987B1 FI103987B1 (fi) 1999-10-29
FI103987B true FI103987B (fi) 1999-10-29

Family

ID=22350177

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI902077A FI103987B (fi) 1987-10-26 1990-04-25 Interleukiini-7

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP0314415B1 (fi)
JP (1) JP2749838B2 (fi)
AT (1) ATE109829T1 (fi)
AU (1) AU616456B2 (fi)
CA (1) CA1340491C (fi)
DE (1) DE3851035T2 (fi)
DK (1) DK175865B1 (fi)
FI (1) FI103987B (fi)
IE (1) IE64159B1 (fi)
IL (1) IL88151A (fi)
NO (1) NO302824B1 (fi)
NZ (1) NZ226679A (fi)
WO (1) WO1989003884A1 (fi)
ZA (1) ZA887773B (fi)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE56471T1 (de) 1980-04-03 1990-09-15 Biogen Inc Dns-sequenzen, rekombinante dns-molekuele und verfahren zur herstellung von dem menschlichen fibroblast-interferon.
US5032396A (en) * 1989-02-17 1991-07-16 Immunex Corporation IL-7 to stimulate platelet production
ZA943348B (en) * 1993-05-21 1995-11-16 Hirano Toshio A gene encoding a polypeptide having pre-B cell growth-supporting ability
TW442493B (en) * 1993-10-15 2001-06-23 Toshio Hirano A membrane protein polypeptide having pre-B cell growth-supporting ability and a gene thereof
US5795569A (en) * 1994-03-31 1998-08-18 Amgen Inc. Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
DK0690127T3 (da) * 1994-03-31 1999-05-03 Amgen Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til stimulering af megakaryocytvækst og -differentiering
EP2314696A1 (en) * 1998-09-21 2011-04-27 Schering Corporation Therapeutic uses of human Interleukin-B50 antagonist.
US20030099947A1 (en) 1998-09-21 2003-05-29 Bazan J. Fernando Mammalian cytokines; related reagents and methods
MXPA01008142A (es) 1999-02-10 2003-07-21 Welfide Corp Compuestos de amida, y uso medicinal de los mismos.
DE10137792A1 (de) * 2001-08-06 2003-02-27 Erdmann Volker Verfahren zur Genexpression
EP1391513A1 (en) * 2002-08-08 2004-02-25 Cytheris IL-7 drug substance, IL-7 comprising composition, preparation and uses thereof
BRPI0519000A2 (pt) * 2004-12-09 2008-12-23 Merck Patent Gmbh variantes de il-7 com imunogenicidade reduzida
EP1746161A1 (en) 2005-07-20 2007-01-24 Cytheris Glycosylated IL-7, preparation and uses
UA120027C2 (uk) 2006-12-14 2019-09-25 Шерінг-Плау Лтд. Ізольоване антитіло проти собачого тимусного стромального лімфопоетину (tslp)
KR20140063657A (ko) 2011-08-03 2014-05-27 사이세리스 Ｈｃｖ 면역요법
US8962913B2 (en) * 2012-06-18 2015-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized IL-7 rodents
KR101873201B1 (ko) 2015-06-11 2018-07-02 주식회사 제넥신 변형된 인터루킨-7 단백질 및 이의 용도
KR102386735B1 (ko) 2015-11-06 2022-04-14 주식회사 제넥신 변형된 인터루킨-7 융합 단백질의 제형
KR20170066265A (ko) 2015-12-04 2017-06-14 주식회사 제넥신 면역글로불린 Fc가 융합된 인터루킨-7 융합 단백질을 포함하는 사람 파필로마바이러스 유래 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR102604595B1 (ko) 2015-12-04 2023-11-21 주식회사 제넥신 면역글로불린 Fc가 융합된 인터루킨-7 융합 단백질을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US20230071889A1 (en) 2018-12-21 2023-03-09 Ose Immunotherapeutics Bifunctional anti-pd-1/il-7 molecule

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4411993A (en) 1981-04-29 1983-10-25 Steven Gillis Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity
US4579821A (en) 1981-11-23 1986-04-01 University Patents, Inc. Control of DNA sequence transcription
US4546082A (en) 1982-06-17 1985-10-08 Regents Of The Univ. Of California E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins
US4720482A (en) * 1982-10-20 1988-01-19 Dana Farber Cancer Institute Pharmaceutical compositions containing one or more lymphocyte growth factors
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4730036A (en) * 1984-01-03 1988-03-08 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Purifications of B-cell inducing factor (BIF) and B-cell growth factor (BGF)
US4703004A (en) 1984-01-24 1987-10-27 Immunex Corporation Synthesis of protein with an identification peptide
US4675285A (en) 1984-09-19 1987-06-23 Genetics Institute, Inc. Method for identification and isolation of DNA encoding a desired protein
JPS6490199A (en) * 1987-09-30 1989-04-06 Hiromi Fujiwara T cell growth factor derived from thymic interstitial cell and production thereof

Also Published As

Publication number Publication date
FI103987B1 (fi) 1999-10-29
CA1340491C (en) 1999-04-13
AU616456B2 (en) 1991-10-31
NO892630D0 (no) 1989-06-23
AU2827289A (en) 1989-05-23
IL88151A (en) 1993-01-31
ATE109829T1 (de) 1994-08-15
DK302089D0 (da) 1989-06-19
DK302089A (da) 1989-06-19
WO1989003884A1 (en) 1989-05-05
EP0314415A2 (en) 1989-05-03
NO302824B1 (no) 1998-04-27
NO892630L (no) 1989-06-23
JP2749838B2 (ja) 1998-05-13
EP0314415A3 (en) 1990-05-30
FI902077A0 (fi) 1990-04-25
ZA887773B (en) 1989-07-26
NZ226679A (en) 1991-06-25
DE3851035D1 (de) 1994-09-15
EP0314415B1 (en) 1994-08-10
IE883221L (en) 1989-04-26
DE3851035T2 (de) 1994-12-01
JPH05268971A (ja) 1993-10-19
DK175865B1 (da) 2005-04-18
IE64159B1 (en) 1995-07-12
IL88151A0 (en) 1989-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4965195A (en) Interleukin-7
FI103987B (fi) Interleukiini-7
US6156301A (en) Use of interleukin-7 to stimulate proliferation of hematopoietic cell precursors
FI106044B (fi) Menetelmä nisäkkään interleukiini-4-reseptorin (IL-4R) ja sen vasta-aineen tuottamiseksi ja IL-4R:ä koodaava DNA, vektori ja isäntäsolu
AU601727B2 (en) Human g-csf protein expression
US5108910A (en) DNA sequences encoding fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
US5073627A (en) Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
JP3115318B2 (ja) Ｇｍ―ｃｓｆ及びｉｌ―３を含む融合タンパク質
FI116943B (fi) Menetelmä kasvainkuoliotekijän reseptoria sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja niitä koodaava DNA ja vektori
IE883523L (en) Interleukin-1 Receptors
EP0342206A1 (en) Human interleukin-3 proteins
US5328988A (en) Interleukin-7
AU620537B2 (en) Human interleukin-4 muteins
JPH09512165A (ja) インターロイキン１５
AU602097B2 (en) Bovine granulocyte-macrophage colony stimulating factor
AU625534B2 (en) Interleukin-1 receptors
JP3689111B2 (ja) インターロイキン１５

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: SANOFI

FG Patent granted

Owner name: SANOFI-SYNTHELABO

MA Patent expired