JPH03164183A - 脳由来の膜蛋白質発現系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 細胞の増殖及び分化は多数の刺激性、抑制性及び相乗性
のホルモン及び因子によって開始され、促進され、維持
されそして調節されることは明らかである。細胞ホメオ
スタシス機構の変化及び／又は破壊は増殖に関連した疾
患（腫瘍形或を含む）の基本的原因であると思われる。

増殖調節因子（刺激剤及び阻害剤）は種々の疾患（例え
ば、癌）の診断、予後及び治療に潜在的用途があるので
それらの単離、特徴づけ及び作用機構にかなりの興味が
持たれており、更にまた特に有糸***が癌に影響を及ぼ
すかもしれない場合のその有糸***の基本的機構を理解
することにかなりの興味が持たれている。

増殖及び分化に加えて、多くの肉体的応答が蛋白質によ
って調節され、その場合に蛋白質はりガンド又はレセブ
ターとして役立つことができる。

脳の機能及び外部及び内部の刺激に対する応答のその調
節についての更なる研究は、痛み、気分、等のような刺
激に対する応答の調節に伴う無数の化合物が単離される
結果をもたらした．不安解消剤、鎮痙剤、筋弛緩剤及び
鎮静剤として普通に用いられているペンゾジアゼピン（
ＢＺＤ）は、Ｔ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）で仲介された
抑制性神経伝達の増強作用に基づく薬理学的効果を発揮
すると考えられる。ＢＺＤによるＧＡＢＡ一作働性伝達
の調節における第一段階は中枢神経系中の特異的な高い
親和性を有しかつ飽和できる結合部位に対する結合であ
ると思われ、この場合にその結合部位は“超分子複合体
”（ｓｕｐｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｏｍｐｌｅｘ）
の成分であると考えられる。この系を理解すること、及
びその系を調節又は制御することができることの必要性
は、天然リガンド及びそれが機能する態様を知ることに
依存している。

これらの因子の検出、単離及び精製は、その混合物の複
雑性、その混合物中の種々の戒分の諸活性の分岐性、広
範囲の種類の試薬による諸戒分の不活性化への感受性、
化合物の活性が多数のサブユニットの存在に依存するよ
うな化合物をもつ可能性、及び種々の精製段階を追跡す
るためのパイオアッセイを提供することにおいてしばし
ば起こる困難によってしばしば複雑にされる。それにも
かかわらず、精製及び分離に実質的な進歩があり、その
進歩は関心のある生底物の検出及び単離の助けとなって
いる。

〔従来の技術〕

Ｂｅａ　１等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉ
ｏ　ｈ　ｓ．（１９７９）　３　：９３　−　９６は、
増殖及びＤＮＡ合戒を正常細胞中でよりも形質転換細胞
中で一層抑制するペプチドがヒトの尿中に存在すること
を報告している。Ｈｏｌｌｅｙ等、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ
ｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．（１９８０）７７　：　５
９８９−５９９２は、上皮細胞或長阻害物質の精製を記
載している。

Ｌｅｔａｎｓｋｙ，　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｒｅ　．（１９
８２）　２　：　３９　　４５は、ウシの胎盤から精製
されたべブチドが腫瘍の増殖及びＤＮＡ中へのチミジン
の取り込みを正常細胞中でよりも新生物中で一層強く抑
制することを報告している。Ｃｈｅｎ，　Ｔｒｅｎｄｓ
　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｃｉ．（１９８２）　７　：３
６４　−　３６５は、癌抑制特性をもったペプチドを腹
水流体から単離することを報告している。Ｒｅｄｄｉｎ
ｇ及びＳｃｈａｌｌｙ　，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　
Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．（１９Ｂ２）７９：７０１４−７
０１８は、種々の正常細胞系及び腫瘍細胞系に対して抗
＝***促進活性を示す精製されたペプチドをブタの視床
下部から単離することを報告している。これらの殆どの
因子は十分には特徴づけされておらず、またそれらの基
本的構造は知られていない。

ジアゼバム結合性阻害剤は、Ｇｕｉｄｏｔｔｉ等、Ｐｒ
ｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ（
１９８３）６０　：　　３８３−３８５、Ｃｏｓ　ｔａ
等、Ｎｅｕｒｏ　ｈａｒｎ＋ａｃｏｌ．　（１９８４）
２３：　９８９−９９１、Ｆｅｒｒｅｒｏ等、Ｎｅｕｒ
ｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．　（１９８４）２３　：　１３
５９　−１３６２、及びＡｌｈｏ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ　
（１９８５）　２２９　：　１７９１８２によって報告
されそして説明されている。

〔発明の概要〕

新規な方法及び組戒物が提供され、これらの組戒物は、
ゲル浸透カラムで酸性水性アセトニトリルを用い次いで
逆相ＨＰＬＣで直線グラジエントの酸性（０．１％トリ
フルオロ酢酸）水性アセトニトリルを用いて脳組織から
単離することができ、その上にそのような組或物の戒分
及びそのような戒分と実質的に相同の領域をもつポリベ
ブチドが提供される．その組戒物及び戒分は、ジアゼパ
ムに対するアゴニストとして及び表面膜蛋白質として、
新生物細胞の増殖を遅延させる用途があるであろう。ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が提供さ
れ、それは原核生物又は真核生物中でのポリペプチドの
生産を可能にする。主題のポリペブチドに特異的に結合
する抗体が提供される。

〔具体的な説明〕

天然の生理学的に活性なポリペブチド化合物類の組合わ
せ、個々のポリペプチド化合物類、それの生理学的に活
性なフラグメント頻を含む新規な組底物、及び種々のポ
リペプチドをコードしている核酸配列が提供される。そ
のポリペブチドは脊椎動物、特に噛乳動物の脳細胞中に
天然に見いだされるポリベブチドに相同であるか又は実
質的に相同である（少なくとも６０％相当）配列をもつ
。

その諸組或物は種々の生理学的活性をもち、そして脳細
胞中に特異的に位置しているか又は脳以外の広範囲の種
々の組織中に一般的に見いだされる。

このポリベブチドは、ホモジナイズされた脳組織又はそ
の精製された画分を用いてクロマトグラフィーカラムか
ら酸性水性アセトニトリル溶離剤で溶出することによっ
て単離可能であることを特徴とする。一つの因子は逆相
ＨＰＬＣ及びゆるやかな直線グラジエントの酸性水性ア
セトニトリルを用いてクロマトグラフィーによって実質
的に純粋に単離することができる。その他の戒分につい
ては所望の活性は水性酸性ｎ−プロパノールを直線グラ
ジエントとして用いて更に精製することができる．その
クロマトダラムは、約０．　１〜０．５ｄ／分の流速で
合理的な分離を得るために４時間以上の時間にわたって
展開することができる。逆相ＨＰＬＣを用いての分離で
は脳組織からの部分的にＩｌＩ製されたサンプルをもた
らすのが普通である。部分的な精製は、ゲル浸透クロマ
トグラフィーを用い溶離剤として酸性水性アセトニトリ
ルを用い、特に均一に溶出することによって好都合に達
戒することができる。好都合には、媒体は０．１％トリ
フルオロ酢酸水溶液中の４０％アセトニトリルであるこ
とができる。

二或分は実質的に異なった生理学的活性及び組戒をもつ
。内因性ペンゾジアゼピンオイド又はエンドゼビン（Ｅ
ＢＺＤ）と呼ばれる一つの因子は、ベイリウム（ｖａｌ
ｉｕｍ）アゴニストとしてジアゼパムレセプターに結合
する活性を示し、そして細胞質蛋白質であることは明ら
かである。ＥＢＺＤは、低い投与量では、噛乳動物に興
奮及び増強された意識を引き起こし、一方高い投与量で
は、鎮静を引き起こす。拍動心臓細胞集合体については
、低い投与量では心臓拍動度数は低下し、一方高い投与
量では心臓拍動度数は増大する。それらの化合物はジア
ゼパム結合性阻害剤について公表された（前記のＧｕｉ
ｄｏｔｔｉ等の文献）配列との幾らかの相同性を示す。

このペブチドは、脳シナブトソームへのペンゾジアゼピ
ンの結合を抑制することにおいて、約１〜１０団、普通
には３〜６−のＫｆをもつことを更に特徴とする（後記
の実験の項を参照のこと）。天然のポリペプチドはゲル
浸透クロマトグラフィーによって測定して約７〜１５ｋ
Ｄａ　１、普通には８〜１２ｋＤａｌ、又はＳＯＳ−Ｐ
ＡＧＥで６〜１０ｋＤａｌの範囲の分子量をもつ（後記
の実験の項を参照のこと）．このペブチドは親水性であ
る。１０００ユニッｌ−／［を越える比活性を得ること
ができる（後記の実験の項を参照のこと）。

ＥＢＺＤのフラグメントも生物活性である；特に、ＥＢ
ＺＤのアミノ酸３３〜５２を含むフラグメント（異なっ
た種にわたる共通配列）はジアゼバム結合性阻害剤とし
ての活性をもつ。

第二の戒分は脳因子（ＢＰ）と呼ばれ、そして前記した
ようにして脳組織から単離することができる。この因子
はＩ！ＢＺＤよりも実質的に少ない量で存在し、そして
ゲル浸透精製においてＥＢＺＤよりも遅い。その化合物
は、総て後記の実験の項に記載されているように、肺癌
細胞の戒長を抑制するために、並びに軟寒天コロニー形
戊及びコロニー形戒率を抑制するために有効であること
が見いだされている。

ＢＦは一般的にはゲル浸透クロマトグラフィーから求め
て約５〜２０ｋＤａｌ，　９通には約８〜１８ｋＤａｌ
の分子量をもつ。この蛋白質は逆相ＨＰＬＣ及び直線グ
ラジエントの０．　１％ＴＦＡ水性ｎ−プロパノールを
用い、約２０〜２６％ｎ−プロバノールで溶出して精製
することができる。その精製された蛋白質は少なくとも
約１５　Ｘ　１０３ユニット／肩の比活性をもっことが
できる（後記の実験の項を参照のこと）．第三戒分は、
アミノ酸配列ＫＷＤＡＷＮ　（ｈＥＢＺＤのアミノ酸５
４〜５９）をコードするオリゴヌクレオチドのプールで
あるプローブを用いて得ることができる。

その蛋白質はＥＢＺＤよりも実質的に大きく、リーダー
配列及びストップトランスファー配列をもち、それで表
面膜蛋白質として作用することができ、この場合にその
ペプチドの主要部分は細胞の外にある。この蛋白質は実
質的に脳組織中に位置している。

これらの蛋白質はいずれかの好都合な入手源、特に脊椎
動物、一層特定的には啼乳動物〔ウシ、ヒツジ、ウサギ
、ネズミ、霊長類（特にヒト）、等を含む〕から得るこ
とができる。それらの化合物は天然のままで用いること
ができ、又は種々の方法で、例えば、グリコシル化を欠
失させ、末端アシル化（特にアセチル化又はホルミル化
）を欠失させ、レセブター（例えば、抗体）への競合的
結合能力のような生理学的活性をもつフラグメントを使
用し、欠失、挿入を行い、他のペプチドに融合させ、他
のべブチド、例えば、抗体形戒のための免疫原、又はハ
ブテンに共有結合させ、又は１個以上の、普通には数で
約１０％以下の、一層普通には数で約５％以下の、挿入
、欠失、トランジション又はトランスバージヲンによっ
て変更されるアミノ酸をもつことによって変異させて、
変更することができる。

各々のポリペプチドを更に詳細に考慮する．■肌並１二
二土工 ＥＢＺＤボリペブチドは約２０キロドルトン（ｋｃａｌ
）未満、普通には約１５ｋＤａ１未満であることを特徴
とし、そして普通には少なくとも約１ｋＤａｌ、一ｉ普
通には少なくとも約２　ｋＤａｌである。

そのポリベブチド組或物は、逆相ＨＰＬＣで周囲条件下
で０．　１％水性トリフルオロ酢酸中の０〜６０％アセ
トニトリルの直線グラジエントを用いて、２８〜５０％
アセトニトリル、特に２９〜４０％アセトニトリル、一
層特定的には約２９〜３６％アセトニトリル、一層特異
的には３０〜３４％アセトニトリルの範囲内でμ−ボン
ダパック（Ｂｏｎｄａｐａｋ）　−　Ｃ　ｒ　ｓカラム
から溶出することを更に特徴とする． ポリペプチドは少なくとも約１５個のアミノ酸、一層普
通には少なくとも約２０個のアミノ酸、そして約１２５
個よりも少ないアミノ酸、普通には約１００個よりも少
ないアミノ酸をもつ。天然の化合物は、後記の実験の項
で説明するようにＰＡＧＥ又はゲル浸透クロマトグラフ
ィーにおいて約７〜１５ｋＤａｌの範囲内の分子量をも
つ。

ポリペブチド組底物は下記のアごノ酸配列の少なくとも
１つ、好ましくは下記のアξノ酸配列の少なくとも２つ
、一層好ましくは下記のアミノ酸配列の少なくとも３つ
をもつことを更に特徴とし、その場合にこの配列は３個
までのアミノ酸の挿入又は欠失又はその組み合わせによ
って保存されていてもよい。

ａ．　　Ｙ　ａａ”　ａａ”　Ａｒ　Ｋ　Ｑ　Ａ　Ｔ　
ａａ’ｂ．ＫＷＤＡＷ ｃ．　　Ａ　Ｍ　ａａ’　Ａ　Ｙ　　（Ｘ）ｘ　Ｖ　Ｅ
　Ｅｄ．　Ｔ　Ｋ　Ｐ　ａａ’　ａａ’　Ｅ　Ｅ　Ｍ　
Ｌ　Ｆ　Ｉ　Ｙ　ａａ’　Ｈ　Ｙ　Ｋｅ．ＱＡＴＶＧＤ
ＩＮＴＥＲＰＧＭＬＤｆ．ＱＡＴＶＧＤＩＮＴＥＲＰＧ
ＭＬ（）ＰＴＧＫｇ．ＫＧＴｓＫＥＯＡ 上記の配列において、 ａａ”は芳香族ア壽ノ酸、特にフエニルアラニン及びヒ
スチジンであり； ａａ’はいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アξノ酸であ
って、それは酸性、塩基性、又は中性でもよく、好まし
くは約３〜５個の炭素原子をもつ酸性又は中性アξノ酸
であり； ａａ’はいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アミノ酸であ
ることができ、それは塩基性、酸性又は中性、一層特定
的には約５〜６個の炭素原子をもつ塩基性又は中性アミ
ノ酸であり； ａａ’は脂肪族中性アミノ酸であり、それは極性又は非
極性でもよく、特にヒドロキシル置換基及び約３〜４個
の炭素原子をもつものであり；ａａ′″は脂肪族中性ア
ミノ酸であり、それは極性又は非極性でもよく、特にヒ
ドロキシル置換基及び約２〜４個の炭素原子をもつもの
であり：ａａ’は脂肪族アミノ酸であり、それは中性極
性又は酸性でもよく、特に酸性アミノ酸又はそのアミド
であって且つ４〜５個の炭素原子をもつものであり； Ａｒは芳香族アξノ酸であって、チロシン、フェニルア
ラニン、ヒスチジン及びトリプトファン、特にＹを包含
し； ａａｑは脂肪族アξノ酸、特に４〜６個の炭素原子をも
つ塩基性又は中性極性のアξノ酸であり、特に４〜５個
の炭素原子をもつ中性極性である時には７５ド基をもち
、即ちＮ及びＱ、好ましくはＫであり； Ｘは１〜３個のアξノ酸であり、それはいずれのアξノ
酸でもよく、特に脂肪族アミノ酸、一層特定的には第一
中性アミノ酸、第二酸性アミノ酸又はそのアミド、及び
第三塩基性アミノ酸をもっものであり；そして Ｘは０又はｌである。

主題の発明の目的のため、種々のアミノ酸は多数のサブ
クラスに分けられる。下記の表はそのサブクラスを示し
ている： 脂肪族 中性 非極性　　　　ＧＡＰＶＬＩ 極性　　　　　ＳＴＣＭＮＱ 酸性　　　　　　ＤＢ 塩基性　　　　　ＫＲ 芳香族　　　　　　ＦＨＹＷ 前記した生理学的特性をもち且つ下記のアミノ酸配列の
少なくとも１個を含むポリベブチドは特に興味のあるも
のである： ａ．　ＴＫＰａａ’　ＤｌｌｉＥＭＬＦＩＹａａ”　Ｈ
ＹＫＱＡＴａａ’　Ｇｂ．　　ＫＷＤＡＷａａ’　　ａ
ａ’　　　Ｌａａ翼　ａａ’　　ａａｋ　ａａ’　　Ｋ
Ｅａａ”　　ＡＭａａ’ＡＹ　（χ）．　ＶＥＥ　ａａ
’　ＫＫｃ．　ＫＱＡＴＶＧＤＩＮＴＥＲＰＧＭＬＤＦ
Ｔ上記の配列において、 ａａ’　，　ａａ＠，　ａａｑ，及びＡｒは前記で定義
した通りであり； ａａ’は脂肪族アミノ酸であり、それは特に約４〜６個
の炭素原子をもつ中性又は酸性、一層特定的には５〜６
個の炭素原子をもつ中性アミノ酸であることができ； ａａ’は脂肪族中性アミノ酸、特に、約３〜５個の、一
層普通には３〜４個の炭素原子をもち且つ特にヒドロキ
シル又はカルボキシアミド極性置換基をもつ極性アミノ
酸であり； ａａｈは脂肪族アミノ酸であり、それはヒドロキシル置
換基及び約３〜５個の炭素原子をもつ中性又は酸性、特
に極性又は酸性アξノ酸であることができ； ａａｉは脂肪族７５ノ酸、特に、約２〜６個の炭素原子
をもつ中性又は塩基性アミノ酸、一層特定的には非極性
中性アミノ酸であり； ａａｊは中性又は酸性のいずれかであり、中性である時
には好ましくは非極性であり、そして特に約２〜５個の
、一層普通には２〜４個の炭素原子をもつ脂肪族アミノ
酸であり； ａａ’は脂肪族中性アミノ酸、特に、約３〜５個、一層
普通には４〜５個の炭素原子をもち、カルコゲン（酸素
又は硫黄）官能基、特にヒドロキシル基又はメチルチオ
基をもつ極性アミノ酸であり；ａａＬ　は脂肪族中性ア
ミノ酸、特にヒドロキシル官能基及び約３〜４個の炭素
原子をもつ極性アミノ酸であり； ａａ”は４〜５個の炭素原子をもつ脂肪族酸性アミノ酸
であり； ａａ’は約３〜６個の炭素原子、特に４〜６個の炭素原
子をもつ脂肪族中性又は塩基性アごノ酸であり、この場
合に脂肪族中性アミノ酸は好ましくは非極性であり； ａａ’は脂肪族中性非極性又は極性アミノ酸、特に、３
〜６個の炭素原子をもつ非極性アミノ酸、好ましくはＡ
であり； ａａ”は３〜４個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性又
は極性アミノ酸であり、極性である時には、特にヒドロ
キシル基をもち、好ましくはＡであり：Ｘ′はＸと同じ
であり、普通には１〜３個のアミノ酸であり、それは脂
肪族アミノ酸であり、それは一般的には４〜６個の炭素
原子をもつ中性、酸性又は塩基性であることができ、特
にＮ−Ｃ方向の順序で中性非極性、酸性又はそのアミド
、及び塩基性アミノ酸であり； ＸはＯ又は１であり；そして ａａ’は脂肪族中性アミノ酸であり、それは特に約４〜
６個の、普通には５〜６個の炭素原子をもつ極性又は非
極性アミノ酸であることができ、極性アξノ酸である時
には、特にメチルチオ基をもつ。

Ｘの他に更に、本発明のポリベブチド群の種々のメンバ
ー間に共通構造を維持するために１〜３個、好ましくは
１〜２個の挿入又は欠失があってもよいことが理解され
るであろう。又、アミノ酸は天然Ｌ−アミノ酸であるが
、ある場合には、Ｄーアミノ酸が使用されてもよい。

特に興味のある化合物は下記の式、又は下記の配列の範
囲内に入る少なくとも１０個、普通には少なくとも１５
個、好ましくは少なくとも２５個のアミノ酸からなるそ
のフラグメント、特に前に特定した配列の１つ含むフラ
グメントをもつ：ψ−Ｚ’　−ａａ’−ａａ”−ａａ”
−ａａ’−ａａ’−ａａ’−ａａ’−ａａ’Ｋ−ａａｌ
０−ａａ”−ａａ”−ａａ”−ａａ”−Ｐ−ａａ”−ａ
ａ’Ｅ−ａａ”−Ｍ−Ｌ−ａａ”″−ａａ”−Ｙ−ａａ
”−ａａ”ａａ”−Ｋ−Ｑ−Ａ−Ｔ−ａａ”−Ｇ−ａａ
３４−ａａ”−ａａ”ａａ”−ａａ”−ａａ”−Ｐ−Ｇ
−ａａ”−ａａ”−Ｄ−ａａ”ａａ４ｈ−Ｇ−ａａ’″
−ａａ”−Ｋ−Ｈ−Ｄ−Ａ−１１−ａａ”ａａｓｂ−Ｌ
−ａａ”−ａａ”−ａａ”−ａａ”−Ｋ−Ｅ−ａａ”Ａ
−Ｍ−ａａ”−ａａ”−Ｙ−　（Ｘ）　ｘ　−Ｖ−Ｅ−
Ｅａａ”−Ｋ−Ｋ−ａａ”−ａａ”−ａａ”−ａａ”−
　Ｚ’上記の配列において、 ψはＨ原子又はアセチル基であり； ｚＮは結合又は１〜１０個のアミノ酸、好ましくは１〜
９個のアξノ酸であり、そのアミノ酸は脂肪族又は芳香
族であることができ、この場合にその配列は配列 それによりそのような配列の範囲内の諸アミノ酸のいず
れの配列も、例えばＥ−Ａ−Ａ又はＨ−Ｅ−Ｔ−Ｒ等も
ａａ’　に結合することができ、またこの場合に、２個
のアミノ酸が同じ部位に記載されている場合にいずれか
のアミノ酸を選ぶことができ、好ましくは同じライン上
のアミノ酸が一緒に採用され；ａａ’・８・■は２〜６
個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性アミノ酸、特にグ
リシン、アラニン、プロリン、パリン、ロイシン及びイ
ソロイシンであり； ａａ５＋　ｌ　ｈ＋　２５ｒ　３５ｔコマｒ　ＳＳｒ　
６０＋　６１＋　ｂａｒクコ・７９　は脂肪族中性非極
性又は極性アミノ酸であり、この場合に特にａａＳｔＩ
６′１″３５゛″２？＋　？ｊ＋”がいずれかのもので
あり、そして残りが好ましくは極性アミノ酸、特にセリ
ン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギ
ン及びグルタミンであり； ａａ　Ｉ　＋　６＋　？゜Ｉ　Ｔｏ　１　９−　３！１
　３４１　３１１１　Ｓ＆＋　５９゜４４＋　Ｔｏは脂
肪族中性アミノ酸（極性及び非極性アξノ酸を包．含す
る）又は脂肪族酸性アミノ酸、即ちアスパラギン酸及び
グルタミン酸であり；特にａａ１？＋　３２＋　２４゜
５９．　７８は中性アミノ酸である時に非極性であり、
残りは中性アミノ酸である時に極性であり、そしてまた
ａａｌ＋　１＋＋　？＋　１　？−　１　９＋　３４＋
　２８ｒ　Ｓｉｎ　６４　は好ましくは酸性アミノ酸で
あり； ａａＺ＋　ＩＯ＋　１　１＋　２２＊　ＺＳ′Ｚｋ−　
２”ｌ＊　４１＋　４’４＋　４５ｒ　４９−　？’Ｆ
　ハ脂肪族中性アミノ酸又は芳香族アミノ酸、特にフエ
ニルアラニン、ヒスチジン、チロシン、及びトリブトフ
ァンであり、好ましくは、ａａ！ｌ　Ｉｏ′２ｋ＋　！
？−　４５＋　’Ｔ’ｒは好ましくは芳香族アミノ酸で
あり、一方残りのアミノ酸は好ましくは脂肪族アくノ酸
であり；ａａ３＋　９＋　ｌｆｔ．目，２ｋ．３９＊　
４ｂｔ　４１＋　５１＋　６？＋　”１ｈは脂肪族中性
又は塩基性アミノ酸、即ちリジン及びアルギニンであり
、この場合にａ１゜％Ｔ１＋　６？゛？ｌｋは塩基性以
外の時に好ましくは非極性であり、そして残りは塩基性
以外の時に好ましくは極性であり、但しａ　ａ　Ｊ　＆
は極性でも非極性でもよく、モしてａ１・Ｉ！＋１４＋
３９・４６＊　Ｓｌ１？・７６は好ましくは塩基性アミ
ノ酸であり；ａａ２ｚは塩基性又は芳香族、特にフエニ
ルアラニンであり； Ｘ及びＸは前記で定義した通りであり、そしてｚ０はＯ
｝Ｉ，Ｎ｝Ｉ！、又は１〜６個の、普通には１〜４個の
アミノ酸の、特に２〜６個の、普通には４〜６個のアミ
ノ酸の、特に極性又は非極性ア旦ノ酸の配列、特に配列
Ｍ−Ｐ−Ｍ〜丁の範囲内の配列である。

１個以上の共通アミノ酸を変えることができ（普通には
３個以上の変更を伴わない）、そしてその共通配列での
アミノ酸の挿入又は欠失は、Ｘとして示した以外の３個
まで、好ましくは２個以下のアミノ酸までであることが
必要であることが理解される。

興味のあるポリペプチドは下記の配列中に含まれた少な
くとも１５個、好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸
を配列中にもつ： Ｅ 上記の配列において、いずれかの部位にあるいずれかの
アミノ酸はその部位の他のいずれかのアミノ酸で置換さ
れてもよく、好ましくは上方のアミノ酸は一緒に採用さ
れ、一方下方のアミノ酸は一緒に採用され、一層好まし
くは同じライン上のアミノ酸は一緒に採用され、そして
星印（＊）は結合（その部位にアミノ酸がないこと）を
意図しており、モして２は０又は１である。その配列は
合計で１０個までの、普通には合計で８個までのアくノ
酸によって延長されてもよく、その場合にはＮ−末端は
追加の配列Ｖ−１｛−Ｅ−Ｔ−Ｒ又はそれのいずれかの
部分をもつことができ、モしてＣ一末端は配列Ｍ−Ｐ一
Ｍ−Ｔ又はそれのいずれかの部分をもつことができる． 特に興味のあるポリペプチドとしては、少なくとも約１
５個、好ましくは少なくとも約２０個、一層好ましくは
少なくとも約３０個のアミノ酸をもち、下記の配列の１
つに含まれるポリペプチドがあり、その場合にそのよう
な配列は少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１２
個、そして一層好ましくは少なくとも１５個の、星印（
＊）で示したア逅ノ酸を含む（ｂ＝ウシ、ｈ＝ヒト）。

Ｅ一阿−Ｋ−Ｋ４−Ｌ Ｅ Ｔ−Ｍ−Ｐ−Ｍ Ｔ （ｂＥＢＺＤ） Ｋ−Ｋ−Ｋ Ｙ−Ｇ−１ （ｈＥＢＺＤ） 本発明の特に好ましい組戒物については、上記の諸配列
が、約５個よりも多いアξノ酸が挿入され、欠失されも
しくは置換されて、又はそれらの組み合せによって、変
更されていることがなく、好ましくは変更は約３個以下
のアξノ酸によってである。

ＥＢＺｏｍ或物は少なくとも約２０％の純度、一層普通
には少なくとも約３０％の純度、好ましくは少なくとも
約８０％の純度、一層好ましくは少なくとも約９５％の
純度、望ましくは１００％の純度である。

それが由来する組織からの戒分を実質的に含まず、由来
組織からの成分が１重量％未満、好ましくは約Ｏ．１重
量％未満、一層好ましくは約ｏ．ｏｏｉ重量％未満であ
るＥＢＺＤ組成物は特に興味がある。本発明のＥＢＺＴ
Ｉ組戒物は、後記の実験の項で記載するアッセイ条件下
で粗シナブトソーブ膜への３Ｈ−ジアゼパムの結合を４
０％競争に必要な量によって測定して、少なくともｌ５
ユニット／■の比活性をもつ。

比活性は普通には少なくとも５００ユニット／■、好ま
しくは少なくとも約１０００ユニット／■であり、そし
て１２５０ユニット／■以上であってもよい。一般的に
は、松果体、脈絡叢、脳橋、及び視神経中の湿った組織
１ｇ当り少なくとも約１０■当量あり、そして普通には
脈絡叢中の湿った組織１ｇ当り少なくとも約２０ｇ当量
ある。前記したように、本発明の化合物は心臓細胞集合
体の収縮において心臓収縮度数に影響を及ぼすことがで
き、少ない投与量では心臓収縮度数を低下させ、この少
ない投与量は一般的には約１５０ｑ／Ｉｌｄ！未満であ
る（実験の項を参照のこと）。ＥＢＺＤのその他の特徴
は、生理学的活性がＥＢＺＤについて立証される種々の
試験から明らかである。

凰四ヱ 脳因子は少なくとも２ｋＤａｌ、一層普通には少なくと
も５ｋＤａｌそして約２５ｋＤａ１以下、一層普通には
約２２ｋＤａｌ以下であることを特徴とする。脳因子は
、細胞増殖調節アッセイによって立証されるように、少
なくとも約Ｉ　ＸＩＯ’　、一層普通には少なくとも約
５Ｘ１０３、好ましくは少なくとも約１０６、好ましく
は少なくとも約１．５Ｘ１０’の比活性をもつ。

脳因子は普通には少なくとも約１０％の純度、一層普通
には少なくとも約５０％の純度、好ましくは少なくとも
約８０％の純度、一層好ましくは少なくとも約９５％の
純度、望ましくは１００％の純度である。

特に、脳因子が、それを単離する由来組織からの戒分、
例えば細胞破片、その他の蛋白質、サツカライド、脂質
、それらの組み合せ、等を実質的に含まないことが望ま
しい。

脳因子の配列は、Ｎ一末端近くに又はＮ一末端に実質的
に下記のアミノ酸配列をもつ配列を含む：Ｎ−Ｋ−Ｅ−
Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｖ−Ｑ−Ｋ−Ｌ−Ｆ−Ｖ−Ｄ−Ｋ−　１−
Ｘ−Ｅ−Ｙ上記の配列においてＸは任意のアミノ酸を示
す。

脳因子はヒトＴ細胞の応答を抑制し、そして自己免疫又
は器官移植組織をもつ宿主の治療のための免疫調節剤と
しての用途があり、単独で、又はその他の免疫抑制剤、
例えばシクロスポリンＡ又はコルチコステロイドとの併
用で用いられる。

普通には、脳因子の配列は上記の配列に対して数で少な
くとも６５％、好ましくは少なくとも約７５％相同であ
る（個数での％は、欠失、挿入、及び変異を相加的差と
して計算することを意図している）。

本発明の脳因子は細胞増殖の抑制及び軟寒天コロニー形
戒の抑制においても活性を有する。従って、本発明の化
合物はインビトロ及びインビボにおいて新生物細胞の増
殖を抑制するための用途を有し、一方、正常細胞にほと
んど影響を及ぼさず、通常は新生物細胞と正常細胞との
間を少なくとも１桁の、好ましくは少なくとも２桁のオ
ーダーで識別することができる。

股蛋亘責 膜蛋白質はほとんどの場合について下記の配列をもつ： ＡＡＡ ＡＬＩＡ しし＾ ｌＪＡＡ ししＡ しＬｉ’ｌ’　　６八■ ＡＧＣ ＣＡＴ ＡＡＧ “ｌＺｌ Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓ．ｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　
Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　　２８０ＧＡＴ　Ｇ
ＡＡ　　ＡＡＣ　ＴＴＧ　　ＧＡＧ　　ＣＡＡ　　ＡＣ
Ｔ　ＧＧＡ　　ＡＡＡ　　ＡＣＴ　　９０７Ｍｅｔ　Ｇ
ｌｎ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌ
ｅｕ　Ｈｉｓ　ＬｙｓＡＴＧ　　ＣＡＧ　　ＡＡＣ　　
ＧＴＣ　　ＣＴＣ　　ＣＡＧ　　ＡＧＡ　　ＣＴＣ　　
ＣＡＣ　　ＡＡＡＴｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐ
ｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　　５
００ＡＣＴ　ＴＣＡ　　ＣＣＧ　　ＡＧＡ　　ＣＣＡ　
　ＴＣＴ　　ＴＧＧ　　ＴＧＧ　　ＣＣＣ　ＴＴＣ　　
１５６７圭表ＩＩ列襲吸： ウシの脳に由来するｃＤＮＡクロ 一ンのヌクレオチド配列及び推定されたアミノ酸配列（
＊）。

アミノ酸残基は提案された開始メチ オニンとの関係で番号づけされている。

ＥＢＺＤと相 同な領域は太線によって上に線引きされており、そして
疎水性及び非荷電のアξノ酸の延長領域は細線で線引き
されている。潜在的なグリコシル化部位は囲まれている
。

それ故にベプチドは数で上記配列の少なくとも約６０％
、一層普通には少なくとも約７５％、そして好ましくは
少なくとも約９５％をもつ。ＥＢＺＤとの相同性をもつ
、太線の引かれた配列は特に興味がある。その蛋白質は
少なくとも約１０％の純度、好ましくは少なくとも約５
０％の純度、一層好ましくは少なくとも約８０％の純度
、そして特に好ましくは少なくとも約９５％の純度、望
ましくは純粋であることを更に特徴とする。その化合物
は望ましくはそれの由来する組織からの戒分を含まない
。

膜蛋白質は主として脳組織中に見いだされることを更に
特徴とする。

興味のある追加の蛋白質は上記蛋白質のフラグメントと
して含まれ、それはヌクレオチド１７０の又はヌクレオ
チド２７０又は２７３のメチオニンで始まるポリペプチ
ドを含む。

本発明のポリベブチドは抗体の生産のための抗原として
用いることができ、そしてこの抗体は今度は抗イディオ
タイプ抗体の生産のための抗原として用いることができ
る。慣用の方法に従ってポリクロナール抗体又はモノク
ロナール抗体のいずれかを調製することができる。本発
明のポリペプチド又はそれのフラグメント、一Ｓ的には
少なくとも約１５個のアミノ酸をもつフラグメントはそ
れ自体で使用することができるが、しかし好ましくは、
免疫系を活性化するアジュバント又は抗原に結合させら
れる。種々の抗原、例えば、血清アルブミン、キーホー
ルリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシ
アニン、グロプリン、等を用いることができる。ポリペ
ブチドに結合させるのに広範囲の種々の技術、例えばグ
ルタルアルデヒド、マレイミド安息香酸、ジアゾ安息香
酸等を利用することができる。アジュバントとしてはフ
ロインド（Ｆｒｅｕｎｄ）アジュバント、水酸化アルミ
ニウム、等がある。

抗原を慣用の量で適切な宿主中に注入し、この場合に２
〜４週間の間隔で１回以上の追加免疫注射を行なう。モ
ノクロナール抗体を用いる場合には、通常は原免疫及び
追加免疫との注射をマウスに行い、その牌臓を単離し、
その牌臓細胞を慣用の技術に従って適切な融合パートナ
ーと融合させる。

例えば、Ｇａｌｆｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）　
２６６：５５０；Ｋｅｎｎｅｔｔ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ　
Ｔｏ　ｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　　ａｎｄ
　Ｉｍｍｕ−二困［（１９８７）８１　：　７７　；米
国特許第４，３８１．２９２号及び第４．３６３．７９
９号を参照のこと。しかしながら、特定の目的に対して
は、その他の噛乳動物、例えば霊長類（例えばヒト）を
、ヒ｝Ｐｃ鎖をもつ抗体の生産のために、用いることが
できる。

ＥＢＺＤポリベブチド及びＥＢＺロボリベプチドに特異
的に結合する抗体は、個々に又は一緒にして、インビボ
及びインビトロの両方に用途がある。主題の化合物はジ
アゼバムレセプターへの結合のためのアゴニストとして
用いることができる。本発明の化合物は、ジアゼパムレ
セブターの数及び分布を求めるのに用いることができる
。加えて、本発明の化合物は噛乳動物宿主の心臓拍動を
調節するのに、噛乳動物宿主を鎮静させるのに、又は噛
乳動物宿主に興奮を引き起させるのに用いられる。

脳因子ポリペブチド及び脳因子ポリベプチドに特異的に
結合する抗体は、個々に又は一緒になって、インビボ及
びインビトロの両方で用途がある。

このポリベプチドは腫瘍抑制特性をもっているので、こ
のポリペプチドは、腫瘍細胞の過度の増殖を抑制するた
めに、正常細胞及び腫瘍発生細胞の両方を含む細胞混合
物と共に用いることができる。

それ故に本発明の化合物は下記の場合のような状態で用
いることができる：正常細胞を突然変異させる場合、こ
の場合には突然変異の発生の結果として正常細胞及び腫
瘍発生細胞で生じる差異を区別することが望まれる；骨
髄が噛乳動物宿主からとり出されている場合に腫瘍発生
細胞の増殖を抑制する場合；細胞集団中の該ポリベプチ
ドについての結合部位を検知する場合、等。この脳因子
ポリペプチドはＴ細胞を他の細胞から区別するか又はと
り出すために用いることができる。

脳因子ポリペブチドは、腫瘍中に注入するか、リポソー
ム中に封入する（この場合にリポソームは腫瘍細胞に対
する特異的な又は優先的な抗体に結合していてもよい）
か、等によって、腫瘍細胞の増殖を抑制するために生体
内で用いることができる。他の方法としては、本発明の
ポリペプチドは免疫調節剤として用いることができる。

このポリペプチドは、ポリベプチドについての診断にお
いて、それ自体で又は抗体との組み合せで用いることが
できる。診断アッセイでの使用のためにそのいずれか又
は両方がラベルされ又はラベルされないであろう。多数
の診断アッセイが文献に記載されており、該ポリペプチ
ド、又は抗体への種々のラベル、例えば酵素、放射性核
種、フルオレッサー、基質、補酵素、粒子（例えば磁性
粒子）等の直接又は間接のいずれかでの結合を含む。こ
れらのアッセイの例示としては、例えば米国特許第３，
８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第４，１
７４，３８４号、第４，２７７，４３７号及び第４．３
７４，９２５号を参照のこと。

種々のアッセイ法がホモゲニアスイムノアッセイ及びヘ
テロゲニアスイムノアッセイに分けられ、この場合その
区別はポリペブチドとその抗体との間の複合体をその特
定の結合対の複合体にならなかったものから分離しなけ
ればならないかどうかに依存する。種々のアッセイ法は
ＥＩＡ　，　ＥＬＩＳＡ、Ｒｌ八、ホモゲニアスＥＩＡ
　，　　ドットーフ゛ロ・冫ト、ウエスターンズ（Ｗｅ
ｓｔｅｒｎｓ）等と称される。

本発明のポリペプチドに対する抗体は抗イディオタイプ
を生産するために抗原としてそれ自体で用いることがで
き、この抗イディオタイプは競合抗原として役立つこと
ができ、該ポリベプチドのエビトーブ部位と競合するエ
ピトーブ部位をもつ．それ故に、これらの抗イディオタ
イプはジアゼバムアゴニストとして、腫瘍抑制剤として
、主題のポリペプチドの代用品として、又は主題のポリ
ベプチドに対するアンタゴニストとして役立つことがで
きる。

上記のポリペプチドは、天然源に由来する天然ポリペプ
チド群、並びに結合特異性のような生理学的特性、例え
ばジアゼバムレセプター及び腫瘍細胞阻害、を共有する
非天然ポリベプチドの群を形成する。天然化合物は天然
源、主として脳組織から得ることができる。しかしなが
ら、本発明の天然組戒物は多数の種々の組織、例えば肺
臓及び精巣中に見いだすことができる。

本発明の化合物を単離するために、脳組織から血絣を排
除し、ホモジナイズし、酸性（ｐＨ＜　４　）条件下で
有機溶剤で抽出し、そして透析して実質的に約４ｋＤａ
ｌ未満である低分子量物質を除去する。

その生戒物を次いでゲル浸透カラム及び約３５〜４５％
アセトニトリルを含有する０．　１％トリフルオロ酢酸
水溶液溶離剤を用いて処理して、その生戒物の活性の抑
制剤として作用するらしい化合物を排除する。その渚画
分をパイオアッセイによって観察する。その生戒したＥ
ＢＺＤ画分を、逆相高圧液体クロマトグラフィーカラム
、例えば、μ−ボンダパックーＣ．カラムを用い、水性
０．　１％トリフルオロ酢酸中の約Ｏ〜６０％アセトニ
トリルの線状グラジエントを用い、そして長いカラム及
び遅い溶出速度、例えば４時間以上、好ましくは５時間
以上を用いて更に精製した。本発明のＥＢＺＤ化合物は
約３０〜５０％アクリロニトリル、一層特定的には３０
〜４０％アクリロニトリルの画分中に見いだされる．Ｂ
Ｆ化合物含有画分を、逆相ＨＰＬＣを用い、０．　１％
水性アセトニトリルの直線グラジェントを用い、３２〜
３６％アセトニトリルで溶離し、このプロセスを１回以
上繰り返して、更に精製する。この濃縮された両分を次
いで、逆相ＨＰＬＣを用い、０．１％水性ｎ−プロパノ
ールの直線グラジェントを用い、約２２〜２４％ｎ−プ
ロバノールで溶離し、このプロセスを１回以上繰り返し
て、更に精製する。

他の方法として、本発明のポリペプチドは、特にポリベ
プチドが３０個未満のアミノ酸、一層特定的には２５個
未満のアミノ酸の場合に、公知の技術に従って合戒する
ことができる。例えば、Ｂａｒａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆ
ｉｅｌｄ，　Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｐｅ　ｔｉｄｅ
　Ｓ　ｎｔｈｅｓｆｓ＋“Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．
　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ　，Ｓｐｅｃｉａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　Ｐａｒｔ＾，Ｖｏ
ｌ．　２，　Ｇｒｏｓｓ及びＭｅｒｅｎｈｏｆｅｒＷ、
Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（米国’）　１９８０、
１〜２８４頁を参照のこと．比較的大きなポリペプチド
、特に約２０個以上のアミノ酸をもつもの、一層特定的
には約３０個のア壽ノ酸をもつものについては、そのポ
リペプチドをコードする配列を得るためにハイブリッド
ＤＮＡ技術を用いることができ、それは次いで公知の方
法に従って所望のポリペプチドの発現に用いることがで
きる。ポリペプチドをコードするためにゲノムＤＮＡ，
　ｃＤＮＡ、合戒ＤＮＡ又はそれらの組み合せを用いる
ことができ、いずれかのイントロンの存在はそのイント
ロンのための機能的スブライシング系をもつ宿主細胞を
用いることによって解決される。ほとんどの場合におい
て、オープンリーディングフレームが用いられ（イント
ロンなし）、この場合にそのリーディングフレームをコ
ードする配列は発現宿主中で機能する転写及び翻訳調節
シグナルに連結される。

特に興味のあるｃＤＮＡとしてはＥＢＺＤについて得ら
れるｃＤＮＡがある。このｃＤＮＡは開始のメチオニン
から約１２０ｂｐまでの上流及び翻訳終結シグナルから
下流のポリ（Ａ）＋テールを含む約２２５ｂｐを含む。

下記はヒト及びウシｃＤＮＡ配列を示している。

５’−ＧＡＧＣＡＣＣＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＣＴＡＡ
ＧＧＴＴＧＣＧＣＴＴＮａｅｌ ↓ Ｔ Ｃ −Ｇ− ＴＣ− −Ｇ Ｔ−Ｇ Ａ−Ｇ ＣＧ 旧ｎｄ　ｍ 上 ＡＴＡＡＣＴＡＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＡ
ＧＡＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＴＡＴＧＡＣＴＡＡＣＡＧＡ
ＴＴＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＧＴＴＡＣＴ＾＾ＴＣ
ＣＴＴＧＣＴＧＡＧＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴＣＡＧＴＡＧ
ＡＴＧＡＡＴＴＡＡＡＡＧＴＡＴＣＴＴＴＧＴＴＡＣＴ
ＴＴ／ＡＣＴＴＣＧ／ＡＴ（ｐｏｌｙ　Ａ）−３’　　
６０７５１１ ５９０ 上記はウシとヒトのヌクレオチド及びＥＢＺＤの推定さ
れたアミノ酸配列を比較して示している。ヒトの配列に
おいて異る残部はウシの配列の上及び下に示されており
、それは３つのオーバラップするｃＤＮＡクローンから
求められた。ヌクレオチド残部はウシのクローンの複合
配列に関して番号付けされており、アミノ酸残基は開始
のメチオニンに関して番号付けされている。ウシの配列
のリーディングフレームは星印（＊）に挟まれている。

３つの別個のクローンのポリ（Ａ）十付加部位における
差異は逆スラッシュによって示されている。

ウシのｃＤＮＡブローブを調製するのに用いられたＮａ
ｅ　Ｉ及び旧ｎｄｌＩ［の制限部位が示されている。

実験の項で示す配列、又はそのフラグメント、少なくと
も約４５個の塩基（１５個以上のコドン）をもつフラグ
メントが、本発明のポリベプチドの発現に用いることが
できる。インビトロ突然変異誘発、突然変異誘発、アダ
プター等を用いることによって、その配列を天然配列か
ら変化させて、サイレント突然変異を有するか又は非野
生型ア果ノ酸をコードするコドンを有する配列を作るこ
とができる。従って、天然ポリペプチド、及び相応の生
理学的特性を有するがしかし１個以上のアミノ酸の異な
っているポリペプチドの両方を作ることができる。

使用されるコード配列は、他の配列に連結するための平
滑末端または付着端を有していることができる。発現の
ために、多数の発現ベクターが商業的に人手し得るかま
たは文献に記載されている．従って、適当な宿主におけ
る発現のために、発現ベクター内に対象の配列を導入す
ることができる．宿主は、原核生物または真核生物、す
なわち、細菌、藻類、菌類、例えば、酵母、噛乳動物の
細胞、例えば、マウス細胞、ハムスター細胞、モンキー
細胞等であることができる。発現ベクターは、コード配
列の挿入のために完全に組立てられていようが、本発明
のポリペプチドのコード配列と組合わせて組立てられて
いようが、多くの場合、以下のように特徴付けられる。

常にというわけではないが一般には、宿主中で維持され
るべき少数または多数のコピー数のエピソーム要素を提
供する、野生型複製系以外の複製系が人手可能である。

宿主ゲノム中にコード配列を組込むことが望ましい場合
には、複製系は必要ないであろう。コード配列は、５′
末端および３′末端において、しばしば野生型の制御領
域以外の、転写および翻訳開始シグナルおよび終結制御
シグナルのそれぞれによって挟まれている。従って、プ
ロモーター領域は５′末端において用いられ、キャップ
配列、制御された発現のためのオペレーター、および工
冫ハンサー配列等を含み、構戒的発現のためにプロモー
ター制御を含んでいないことができる。３′末端におい
ては、ターミネーター、終止コドン、および最適にはポ
リアデニル化配列等が存在する。

転写および翻訳制御配列およびコード配列の発現造成物
は、しばしば、ベクターが導入されている形質転換され
た宿主に関する選択および発現ベクターを保有する細胞
に対する競争的好都合の提供の双方を可能にするｌ種も
しくはそれ以上のマーカーに連結される。マーカーは、
栄養要求宿主に対する原栄養性の付与による補完、殺生
物剤（ｂｉｏｃｉｄｅ）耐性、例えば、種々の抗生物質
および重金属等に対する耐性、および免疫等含んでいる
ことができる。種々の配列は、宿主中で機能的であるよ
うに選択される。

多くの発現ベクターについて、多数の制限部位を与える
ポリリンカーが、配列と転写および翻訳開始制御配列と
終止制御配列の間に存在している。

従って、コード配列の適当な設計によって、またはアダ
プターを用いることによって、コード配列をポリリンカ
ー領域内に挿入することができる。

ある場合には、コード配列を５′−コード配列に連結し
て、融合生戒物を得ることが望ましい場合があり、この
場合、この５′一配列がリーダー配列、とりわけ分泌リ
ーダー配列およびプロセッシングシグナルをコードする
．種々の分泌リーダーは例えば、次の文献に記載されて
いる：米国特許第４，４１１．９９４号、ＥＰＡ８Ｂ，
６３２および１１６，２０１。

コード配列は正しいリーディングフレームで分泌リーダ
ーおよびプロセッシングシグナルに連結されることによ
って、その融合コード配列を発現ベクター中に挿入して
発現造戒物を提供することができる。

ポリペプチドが細胞内に保有されている場合は、細胞の
増殖後、細胞を集菌しこれを溶解してポリペプチドを単
離することができる。ポリペプチドが分泌される場合に
は、栄養培地を連続的に交換してポリペプチドを単離す
ることができる。ポリペプチドの単離および精製のため
に種々の技法が存在しており、例えば、アフィンティー
クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動、グラジエン
ト遠心分離および溶剤抽出等がある。

用途に応じて、本発明の化合物は種々の方法で配合する
ことができる。生体内投与のため、本発明の化合物を生
理学的に許容される担体、例えば、滅菌水、食塩水、リ
ン酸緩衝溶液およびエタノール等中に導入することがで
きる。その濃度は、特定の適用、およびその適用が局所
的であるか全身的であるか、等に応じて広く異る。投与
は、非経口的、静脈内的、腹腔内的、動脈内的および皮
下的等であることができる。

天然に存在するＥＢＺＤの濃度は一般に５〜５００躍／
戚である。投与方法に応じて、用量は約０．　５〜５０
０ｇ／ｋｇまで、より通常には約５〜５０Ｊ１ｇ／ｋｇ
まで変化することができ、用量が２５ｎ／ｋｇを越える
場合には精神安定作用が生ずる。特定の用量は、所望の
反応、投与方法および用量の反復性等によって変化する
， 以下に説明のため実施例を与えるが、これらの実施例は
限定を目的とするものではない。

Ｂｉｏ−Ｓｉｌ　ＴＳＫ−２５０ゲルロ：ｉ！ＪＨＰＬ
Ｃカラムを、バイオーラッドラポラトリーズ（リッチモ
ンド、カルフォルニア）より購入した。ｇ　−　Ｂｏｎ
ｄａｐａｋ　−　Ｃ　ｒ　ａカラムをウォーターズアソ
シエート（ミルフォールド、マサチューセッツ）より入
手した。トリブシン（ＴＰＣＫ処理）、キモトリプシン
およびスタフィロコッカル・アウレウス（Ｓｔａ　ｈ　
ｌｏｃｏｃｏｌ　ａｕｒｅｕｓ）ｖ８プロテアーゼは、
ワーリントン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）から得る。エ
ンドプロティナーゼＬｙｓ　−　Ｃをベーリンガーマン
ハイムから得た。３Ｈ−ラベル化ジアゼバム、ＲＯ１５
−１７８８、フルニトラゼパムおよびβーカルボリンを
ＮＥＷ　，ボストン、マサチューセッツから得た。キャ
リャフリーｌ．ｓ｝−ヨウ素はアマーシャム（アーリン
トンハイト、イリノイ）製のものであった。

新鮮な又は凍結したウシの脳（４８０ｇ湿重量）を融解
し次いで細断した．細断した組織を、２３７’Ｍのエタ
ノール（９８％）　、１８．５ｒｎ１のＩＨｃ　ｆｆｉ
、および２．　５　７ｄのアブ口ティニン〔ウシの肺源
の２３　ＴＴＵ／ｄ（シグマケミカル社）〕から戒る２
４００ｄの抽出緩衝液中に懸濁させた。混合物をワーリ
ングコマーシャル混合機中でホモジナイズした。ホモジ
ネートを４゜Ｃで一夜で撹拌し、ベックマン型１９ロー
ター中８００Ｏｒ．ｐｍで３０分間遠心分離し、次いで
上澄みを注意深く除去した。最終量は約２０７０ｍＡ！
であった。クロロホルム（２０７０ａｉ！）および２０
７ｄの酸性の水（２０３ｄの水と４ｍの濃ＩＩＣ／！）
を上澄みに添加し、混合物を約１時間激しく撹拌し、次
いで室温に放置し二相に分離した。水性の上相を注意深
く除去し次いでスペクトラポール透析膜チューブ（３．
５００Ｍ−カットオフ、アメリカンサイエンティフィッ
クプロダクト）中、４　”Ｃで０．１Ｍ酢酸２０ｆを２
回取り換えて透析した．透析した上澄みを凍結乾燥した
．凍結乾燥材料（７８５Ｍ）を粗分画と称した。

ル冫゛クロマトグーフィー Ｂｉｏ−Ｓｉｌ　ＴＳκ−２５０カラム（６０Ｘ　２．
　Ｉ　ＣＩ）を高速液体クロマトグラフィー（Ｉ｛ＰＬ
Ｃ）システム（ウォーターズアソシエーツ）に取付けた
．粗分画を０．１％三フフ化酢酸を用い４０％アセトニ
トリル水溶液中に８■／ＩＩｉの濃度で溶解した．カラ
ムを０．　１％三フフ化酢酸（ＴＦＡ）　と共に４０％
アセトニトリルを用いて平衡化した．２ＩＩＩ１のアリ
コート（１６■のタンパク賞）を注入し次いで０．　１
％濃度のＴＦＡを有する４０％アセトニトリル水溶液を
移動相として均一に溶出を行った。流速を２戚／分に設
定しそしてチャートスピードを０．２５ｃｍ／分に設定
した。

クロマトグラフィー処理を室温で行った。５ｄの分画を
採取した．各分画のアリコートを凍結乾燥し次いでペン
ゾジアゼピン（ＢＺＤ）結合競合活性（ＢＺＤ−ＢＣＡ
）および成長抑制活性について３回分析した。

ＢＺＤ−ＢＣＡの位置を知った後（分画２４）、先に述
べた如＜、４９回のクロマトグラフィー操作を行った。

全ての操作の活性分画を集め次いで凍結乾燥した．約６
５■の活性な乾燥粉末を得た。これをＴＳＫ−２５０分
画と称した．この分画は約９３６ユニットのＢＺＤ−Ｂ
ＣＡ活性を含有していた。

ＴＳＫ−２５０　　　の′　１　　　クロマトグーフィ
ーＴＳＫ−２５０分画を０．　１％ＴＦＡに溶解し（２
■／ＩＩ１）、更にＢ　−　Ｂｏｎｄａｐａｋ　−Ｃｌ
　ｓカラム（７８ｍｓ＋（内径）×３０ｃｍ）を用い室
温で逆相ＨＰＬＣにより分別した。試料を均一に適用し
、カラムを洗浄し次いで０．１％ＴＦＡで平衡化した．
流速を２ａ１／分に設定し、そしてチャート速度を０．
２５Ｃ１ｍ／分に設定した．第一の溶剤Ｏ．ｌ％ＴＦＡ
と第二の溶剤Ｏ．ｌ％ＴＦＡ中のアセトニトリルと間で
の線状グラジエント法を用いた。グラジエントの条件は
２０分内でＯ〜２８％、次いで１４０分内で２８〜４２
％、１０分内で４２〜５２％更に６分内で５２〜１００
％であった。全ての溶剤は、ＨＰＬＣ等級のものであっ
た。４ＩＩｒ１の分画を採取した。

各分画のアリコートを凍結乾燥し、次いでＢＺＤ−ＢＣ
＾に対し３回分析した。大部分の活性部分が、３１〜３
２％アセトニトリル濃度間で溶出した．分百３６と分画
３７をプールし、次いで１２ｄの０．　１％ＴＦ＾で希
釈した．混合物を、ｇ　−Ｂｏｎｄａｐａｋ−Ｃｐｓカ
ラム（３．９ｍｍ（内径）　Ｘ３０ｃｍ）に均一に適用
した。流速はＩｄｌ分であり、チャート速度は０．２５
ｃｍｌ分であった。第一の溶剤０．１％ＴＦＡと第二の
溶剤０．１％ＴＦＡを有するアセトニトリルとの間で直
線グラジエント法を用いた。グラジエント条件は次の通
りであった。１０分内で０〜３０％、次いで６０分内で
３０〜４０％であった。分画を採取した。殆ど全ての活
性（約８５０ユニット）部分は３１％までのアセトニト
リル濃度で分画６内に溶離した．この分画をＨＰＬＣ　
　Ｃｐｓ分画と称し、これは約６８０ｎのタンパクを有
していた． また、ヒトの脳組織を用いて上述の手順に実質的に従っ
てヒ｝　ＥＢＺＤを精製した．２シナプトソームのｉ＋ 粗シナブス膜分画を、体重２００ｇまでのスブラーグー
ドーレイ系ラットの脳又は新鮮なウシの脳皮質のいずれ
かからＺｕｃｋｉｎ等（Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔｌ．　Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ（１９７４）７１　：　４８０
２−４８０６）の記載の如く調製した。シナプス膜を、
５０ｍＭのトリスーＨＣｌ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し
、緩衝液中にくりかえし懸濁させ次いで遠心分離により
ペレット化した。洗浄したシナプトソーム膜を５０ＩＩ
ＭトリスーＨＣｌ（ｐＨ７．４）に懸濁させ次いで−２
０℃で保存した。

ＥＢＺＤ−　　”　　　　　についてのアッセイ種々の
両分又は精製されたタンパク質による、洗浄されたシナ
ブトソームへの３Ｈ　−　ＢＺＤの結合の阻害を、結合
競争活性の指標として使用した。シナプトソーム膜への
３｝１　−　ＢＺＤの結合を、２５団のβ−カルボリン
の不在下又は存在下のいずれかて使い捨ての１２　Ｘ　
７５ａｏａのボリプロビレン管中において２通り実施し
た。その結合混合物は、所望の種々の濃度の試験化合物
、２０−のＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ＝７．　４　）　
、シナブス膜懸濁液（７０〜１００汀のタンパク質）、
１〜５ＩＩＭの’Ｈ　−　ＢＺＤ及び合計体積０．　ｌ
　ｄ中０．５％の最終濃度のジメチルスルホキシドを含
んだ。４゜Ｃで３０分間のインキュベーションの後、０
．　１　ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｉ　（ｐＨ＝　７．　４　
）中１０％の冷ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６００
０）　０．　７　ｄを各々の管に添加した。その懸濁液
をすぐ４℃でＧＦ／Ｂフィルターにより真空濾過した．
そのフィルターを、１■／ｌＩｉのＢＳＡを含む５０−
の冷Ｔｒｉｓ−Ｈ（／！　（ｐｔｌ＝７．　４　）　１
０ｍにより洗浄した．そのフィルターを、計数バイアル
に移し、そしてアクアシン（Ａｑｕａｓ−ｓｉｎｅ）　
（ＮＥＮ）　１０ｍを、各バイアルに添加し、そしてＢ
ｅｃｋｍａｎβ一カウンターを用いて放射能を測定した
．２５−のβ一カルボリンの存在において結合した放射
能（合計結合の２〜８％）は、非特異的であると思われ
、そしてデーターはそれに応じて修正された．タンパク
質濃度を、標準としてＢＳＡを用いて、Ｌｏｗｒｙ．な
ど．，Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．（１９５１）ユ超
：２６５〜２７５の方法によって測定した。

ポ１アクｌルアミド゛ル　　’　　　ＰＡＧＥ！）０．
　１　Ｍのリン酸ナトリウム（ＰＨ＝７．　２　）　、
０．　１％のＳＯＳ及び６Ｍの尿素を含む１５．６％の
ポリアクリルアξドビスーアクリルアミド（３０：０．
８）の１５ｃｍの分離ゲル（０．７５ｍａ＋の厚さ）を
使用した。そのゲルは、ゲル２０ｍ１当りＴＥＭＨＤ（
ＢｉｏＲａｄ）　１０Ｉｌ１を含み、そして、２０％の
過硫酸アンモニウムの１．０４７艷のゲルを用いること
によって重合されたものである．分離ゲルの条件と同一
の緩衝液条件を用いる３．５％のアクリルアミド溶液の
上層ゲルを、下層ゲルの上に注いだ．上層ゲルの約３１
ｗ１を残して、コム（Ｃｏａ＋ｂ）を、その上のゲル中
に挿入した．０．ＯＩＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７
．２）、７Ｍの尿素、１％のＳＤＳ及び１％の２−メル
カプトエタノール中サンプル４０ｕ１を、２分間煮沸し
、そしてすぐに適用した．そのランニング緩衝液は、０
．　１％のＳＯＳを含む０．１Ｍのリン酸ナトリウム（
ｐＨ＝　７．　２　）であった．トラッキング染料がゲ
ルの底に達するまで、そのゲルを、室温で５■／ｃＩＩ
ｌで泳動させた。そのゲルを、５０％メタノール及び９
％酢酸中に固定し、固定溶液中において０．１％クーマ
シープルーＣＣｏｏｔｍａｓｉｅ　ｂｌｕｅ）により染
色し、そして５０％メタノール及び９％酢酸により脱染
色した。脱染色の後、そのゲルを乾燥せしめた。

１５％の分離ゲル及び５％のスクッキングゲルを使用す
る、Ｌａｅａ＋ｍｌｉ．Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）　２
２７　：　６８０　〜６８５のＰＡＧＥ法もまた、使用
された。ゲル上のタンパク賞を、Ｍｅｒｒｉｌ，など．
．　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８１）　２１１　：　１４３
７〜１４３９の銀染色法又はクーマシーブルー染色法の
いずれかによって検出した。

ンパク　のヨウソ Ｂａｒｒｉｄｇｅ，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ
．　（１９７８）５０　：　５４〜６５によって記載さ
れているクロラミン−Ｔ法を用いてＩ門■により、又は
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．　（１９７３）ユ３３　：　５２
９〜５３９に記載されている”Ｊ−Ｂｏｌｔｏｎ及びＨ
ｕｎｔｅｒ試薬を用いて、タンパク質をラベルした．Ｅ
ＢＺＤに・　る ウシの脳からの精製されたＥＢＺＤに対する抗血清をラ
ットにおいて調製した。生後６週間のＳｐｒａｇｕｅ−
　Ｄａｗ　ｌｅｙラットを、完全フロイントアジュバン
ト中に乳化された、合計２０■の精製タンパク質により
感作した。続く追加免疫接種を、不完全フロイントアジ
ュバント中タンパク質１０Ｊ！ｇを用いて２週間隔で与
えた．各接種の後１週間で試験採血を行い、そして下記
に概説されているラジオイムノアッセイ法を用いて抗体
についてスクリーンした。

そのアッセイのために適切な抗血清は、一般的に、２〜
３回のみの追加免疫接種の後、得られた。

ウサギ（およそ３ｋｇの重さのニュージーランドホワイ
トウサギ）における精製されたウシの脳のＥＢＺＤに対
する抗血清をまた、ラットのために記載された同じ方法
によって調製した。但し、４０Ｉ！ｇ及び２０Ｉ！ｇの
タンパク質を、それぞれ、１次接種及び追加免疫注射の
ために使用した。

ラジオイムノア　セイ 精製されたウシの脳因子を、およそ３　ＸＩＯ”ｃｐｍ
／Ｋの比活性にクロラミンＴにより放射性ヨウ化し、モ
して４　”ＣでＴＮＥＮ緩衝液（２０−のＴｒｉｓ　−
　ＨＣ　ｌ、ｐＨ＝　７．　４　；　５ｍＭのＥＤＴＡ
　；　　１５０ｍＭのＮａＣｌ　；０．０５％のＮＰ−
４０　；　０．１％のＢＳＡ）中に保存した。

ラジオイムノアッセイのためには、次の試薬が次々とポ
リプロピレン管（３ＭＮの容量）に添加された：精製さ
れた脳因子の標準又はサンプル１０ｄ、ラット抗血清（
ＴＮＥＮ緩衝液中においてｌ：３０に希釈された）１０
Ｉｊ１及び１２５１によりラベルされたウシの脳因子（
〜５　ＸＩＯ’ｃｐｍ）　３０ｐｌ．室温で４５分間の
インキュベーションの後、熱失活されホルマリンにより
固定されたＳ．アウレアス（Ｓ，　ａｕｒｅｕｓ）の１
０％懸濁液５０ｄを添加し、そしてその混合物をさらに
３０分間放置した。次に、免疫吸着剤をｎ−ブチルフタ
レート油のクッションを通して遠心分離し（１５，ＯＯ
ＯＸ　ｇ、１分）、そしてＳ．７ウレアスヘレフト中の
放射能活性の量を、ｒ一分光測定によって測定した。抗
血清の不在において結合した放射能は非特異的であると
思われ、そしてデーターはそれに応じて修正された。

ＲＩＡ反応性物質についての検定されるべき組織は次の
ようにして加工された。新鮮な又は冷凍された組織（お
よそ１ｇの正味重量）を、１０ｄの冷ホモジナイゼーシ
ョン緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ＝７．
４　；　５ｍＭのＥＤＴＡ　；　１５０ｍＭのＮａＣｌ
　；　０．　２％のＮＰ４０　；　０．２　ｍＭのフエ
ニルメチルスルホニルフルオリド；一当り　１００カリ
クレイン阻害剤ユニットのＴｒａｓｙｌｏｌ）に添加し
、そしてＰｏｌｙｔｒｏｎ組織ホモジナイザーにより３
回、１５秒間の破壊により均質化した．その抽出物を取
り出し、そして１００，０００×ｇで３０分間の遠心分
離により残骸を除去した。

次に、この上清液を、５分間９５゜Ｃへ加熱し、そして
低速度で遠心分離し、沈殿した蛋白質を除去した．一連
のｌ：３の希釈の抽出物を、ＴＮＥＮ緩衝液により調製
し、そしてラジオイムノアフセイに使用した．標準曲線
は各セットのアッセイを含み、そして免疫反応性物質の
量を、直接的な比較により算定した。

ウシ及びヒトのＥＢＺＤを、エンドプロティナーゼＬｙ
ｓ−Ｃを含む０．　１　ＭのＴｒｉｓ−アセテー｝　（
ｐｌｌ＝８．　０　）　４０眉において２４゜Ｃで１６
時間消化した。ＥＢＺＤ　：酵素の比は、重ｔ基準で１
０：１であった。ペプチドフラグメントを、水中０．０
５％ＴＦＡから０．０４５％ＴＦＡを含む６０％アセト
ニトリルまでの直線２時間グラジエントを用いてμ一Ｂ
ｏｎｄａｐａｋ−（．ｓカラム（Ｗａｔｅｒｓ）でのｒ
ｐＨＰＬＣによって分離した。ペプチドをモニターし、
そして２１４ｎＦＩでのそれらの吸収によって同定し、
集め、凍結乾燥し、そしてアッセイのために使用した。

Ｂｉｏ−Ｓｉｔ　ＴＳＫ−２５０のカラムからウシの脳
のＥＢＺＤの溶出プロフィールを決定した。ＢＺＤ結合
の競争活性は、リボヌクレアーゼ（Ｍｒ〜１１，５００
）よりもわずかに小さな中間サイズを有する単一のピー
クとしてカラムから現われた。分取用逆相カラムＴＳＫ
−２５０からの活性フラクション２４のクロマトグラフ
ィーの結果、その活性は３１〜３２％のア七トニトリル
の間で溶出した。分析用逆相カラムに基づく、プールさ
れたフラクション３６及び３７の再クロマトグラフィー
は、対称的なピークとして活性蛋白質の溶出をもたらし
た。その精製は第１表に要約される。

ａ：上記のアフセイ条件下で粗シナプトソーム膜への３
Ｈ−ジアゼパムの結合に対する４０％競争のために必要
とする材料。

ｂ：プールされた材料の直接計量による。

ｃ　：　２８０ｍμでの吸光度から計算された。

ｄ：低い比活性のため、この段階で直接的にアッセイす
ることは不可能であった。この数は、フラクシッン２４
及び２５中のＴＳＫ−２５０クロマトグラフィー処理の
後に回収された合計ユニットを示す． ８４．２％の収率を伴う９６９倍の精製を、３段階方法
で達成した。阻害度は、蛋白質の濃度が上昇するにつれ
て、上昇した．しかしながら、最大の阻害度は、８囲の
濃度の純粋な蛋白質でさえわずかに５２％に過ぎないこ
とが見出された．Ｋｉ値は、３Ｈ−ジアゼバム又は’Ｈ
　−　ＲＯ１５−１７８８のいずれがリガンドとして使
用されても、約５洲であることが見出された。

精製された蛋白質の均質性は、６Ｍの尿素の存在におい
てＰＡＧＥによって示された．ペブチドの分子量は、１
０．５Ｋドルトンであると算定された。

Ｌａｅ＋＋ｓ＋ｌｉのＳＯＳ−ＰＡＧＥ法による精製さ
れた蛋白質（ウシ又はヒト）の分析もまた、見掛のＭｒ
〜７Ｋドルトンを有する単一のバンドを与えた．精製さ
れたタンパク質は、溶離用溶媒として０．１％のＴＦＡ
と共に、水中４０％アセトニトリルを用いるＢｉｏ−Ｓ
ｉｌ　ＴＳＫ−２５０カラム（６０ｃｍ　Ｘ　７．　５
　ｔｔｍの内部直径）から単一の対称ピークとして出現
した．その見掛分子量は、このゲル浸透クロマトグラフ
ィー法によって約１１．５Ｋドルトンであることが計算
された。この精製されたヒトの脳のＥＢＺＤは、類似す
る物理化学的特性及び生物学的特性を示した．シナプト
ソーム膜への、′ｔＳＩ−ラベルされた（クロラミンー
Ｔ法又はＢｏｌ　ｔｏｎ及びＨｕｎ　ｔｅｒ法のいずれ
かによる）精製タンパク賞の特異的結合は観察されなか
った． 堕旦坐允奄 ＲＩＡ系を展開して組織抽出物、体液および組織培養細
胞中のＥＢＺＤを定量した．種々のペプチドによる、ウ
シＥＢＺＤに対するラット抗血清に結合したウシ脳から
の１２５Ｉ−ラベル化ＥＢＺＤの除去を測定した。ウシ
およびヒトのＥＢＺＤは、ウシＥＢＺＤ蛋白質に対して
調製されたラット抗血清に結合するＩｔｓ（一ラベル化
ウシＥＢＺＤとの競争において同様な能力を示した．こ
のことは、両方の蛋白質中に全く同様な免疫原決定基が
存在していることを示している．エンドプロティナーゼ
Ｌｙｓ−Ｃ消化によって得られモして逆相ＨＰＬＣによ
って精製されたウシｆ！ＢＺＤのベプチドフラグメント
はいずれもなんらの免疫反応性も示さなかった．従って
、ＥＢＺＤの免疫原決定基はエンドブロティナーゼＬｙ
ｓ−Ｃによって生じた単一ペブチドフラグメントのいず
れにも保有されていない。ラビットの種々の組織中のＥ
ＢＺＤの分布を下記第２表に示す。

脳 腎臓 唾液腺 肝臓 胃 結腸 肺臓 肺 心臓 胸腺 膵臓 大腿筋 甲状腺（Ｔｈｙｒｏｉｄ） ３．８０ ３．４２ ｌ．７６ １．５２ １．２７ １．０５ ０．９７ ０．８４ ０．７３ ０．６７ ０．５０ ０．３７ ０．０６ Ｎ．Ｄ．＝検出できず。

ＲＩＡ法の詳細は前述してある。

血清または血漿以外の試験組織はすべて、ＲＩＡによっ
て検出されるＥＢＺＤを含有していた。ウシの脳、牌臓
および胸腺は組織１ｇ（湿重）当り約１１．５　，　７
．　６および６．８■当量を含有していたが、ヒトの脳
は組織１ｇ（湿重）当り１５．７１！ｇ当量を含有して
いることが見い出された。ラビット脳中のＥＢＺＤの濃
度は、ウシまたはヒトの脳中に存在する濃度よりはるか
に低いものであることが見い出された。ＥＢＺＤばモン
キーの脳中にも見い出された。

ウシのタンパク賞に対する抗血清はラットおよびマウス
の脳中に免疫学的交差反応物質をほとんど検出しなかっ
た。ＥＢＺＤがヒトの脳脊髄液および腹水液中に存在し
ていることも見い出された。ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ　７
）肝癌細胞（ＨＥＰ　２）　、神経芽腫細胞（ＭＴＢ　
１４）、神経膠神経芽腫細胞（ＣＣＬ　１２７）および
膠芽腫細胞（ＨＴＢ　１０）について計算したところ、
それぞれ：ａ縮細胞（〜１０９細胞）１一当り９．ｌ，
８．９　，　８．６　．０．３２および０．２６■当量
のＩＥＢＺＤを含有していた，ＥＢＺＤ１ｉｔｇは約６
Ｘ１０”分子を含んでいる。従って、ＭＣＦ　７．　Ｈ
ＥＰ　２およびＨＴＢ　１４細胞は細胞１個当り〜５Ｘ
１０’分子のＥＢＺＤを含有している．従って、ＥＢＺ
Ｄは噛乳動物の組織中に広く分布しており、そしてＤＢ
Ｉ　とは異り脳に特有のベプチドではない。広い組織分
布は、ＥＢＺＤの機能が組織に特異的なものというより
むしろ一般的なものであろうということを示唆している
。

大脳 小脳 延髄 下垂体 嗅球 松果体 脈絡叢 橋 ヴエガ（Ｖｅｇａ）神経 視神経 ３．４ ７．５ ５．３ １．３ ２．６ ｌ７．４ ２６．７ １４．３ １．７ １６．２ ＥＢＺＤｌＩｌ度は前述の如くにＲＩＡによって測定し
た。

第３表は、ＲＩＡによって測定されたラビット脳の種々
の領域におけるＥＢＺＤの分布を要約している。

脳の領域は・すべてＥＢＺＤ様物質を保有しているが、
ＥＢＺＤ濃度の実質的な局所的変化があることが示され
た．試験したラビット脳の全領域の中で、最高濃度は脈
絡叢において見い出され、そして最低濃度は下垂体にお
いて見い出された。

ＥＢＺＤの　　（ａｎａｌｅ　ｆｉｃ）　１体ｆｉ２．
３〜２．　６　ｋｇの雄性ニュージーランドラビットを
この実験の全体を通じて用いた。ヤコブ（Ｊａｃｏｂ）
等、ニューロファーマコル．　（Ｎｅ肛坐軸Ｌｓａｃｏ
ｌ．）　　（１９７２年）１１：１〜１６頁に記載され
たの直接穿刺法に若干の変更を施すことによってｉｃｖ
注射を行なった．動物は、頭蓋に小さな穴（直径０．　
８閣）を開ける（ベントバルビタール麻酔下）ことによ
って実験の２日前に準備した．この穴は正中線に対して
１．　Ｏ　ｍ側方およびプレグマに対して１．０閣口吻
側に位置している。実験の日、注射の直前に、皮膚の傷
上に局所麻酔薬を噴霧する。

＃２６の針を頭蓋の表面から１２ｍｍの深さまで鉛直に
挿入する．正確な位置決めは大脳脊髄液の出現によって
指示される。針を引き抜き、針に薬剤溶液を充填して、
この針を同じ深さまで再度挿入する。

注射は、常に、注射器微量ビュレットを用いて１０ｄの
容量で３０〜６０秒間にわたって実施する。対照の動物
には同容量の滅菌食塩水を与える。薬剤はすべて滅菌し
た等張の食塩水中に溶解し、そしてその遊離塩基として
表現される。

動物は一般に実験の２〜３時間前一対の縦仕切り棒（Ｓ
ｔａｎｃｈｉｏｎ）内に位置させる。結腸温度は、リー
ズーノースラップ・スピードマックス・レコーダー（Ｌ
ｅｅｄｓ−Ｎｏｒｔｈｒｕｐ　ＳｐｅｅｄｏｌｌＩａｘ
　ｒｅｃｏｒｄｅｒ）上に記録されるように特別に電線
が引かれているＹＳ■スキャンニング・テレサーモメー
ター（ＹＳＩＳｃａｎｎｉｎｇ　Ｔｅｌｅｔｈｅｒｍｏ
ｍｅｔｅｒ）に接続されている直腸サーミスタプロープ
によって測定される。実験は２２．０±ｉ．　ｏ　”ｃ
の常温室内で実施する。

興奮活性は立直り反射の回復時間の短縮によって示され
る。２５■／ｋｇのベントバルビタールヲ静脈内に投与
されたラビットは麻酔にかかり、その麻酔時間の間は自
らを正常な直立位置まで動いて戻すことなく仰向けにな
っていることができる。

ラビットが仰向けの姿勢をこれ以上続けていることがで
きなくなった時を立直り反射の回復時間と考えた。

瞳孔の拡大、運動活性の増大および呼吸速度の増大等を
含む種々のパラメータの肉眼的観察によって挙動を評価
した。さらに、ある種の常同的（ｓ　ｔｅｒｅｏｔｙｐ
ｉｃ）応答、例えば、強迫的にかじったり引掻いたりす
ることを注意深く観察した。

ｂ　ＥＢＺＤ ■星 注射の１０分後、動物は連続的な咀噌反応を開始する．
呼吸は９０分から２０４分まで増加した。

運動活性の増大．ｍ能冗進（ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔｉｖ
ｉｔｙ）なし。痛覚脱失なし。

■虹屋 注射の１０分後、呼吸は９８分から６５分まで減少。強
迫的咀噌および軽度の興奮。興奮は短時間続いた。機能
元進なし。痛覚脱失なし。

辿虹屋 注射の４分後、動物は目を閉じる。呼吸減少（１０８分
から５０分まで）．注射の１０分後、立直り反射欠如。

動物は深い麻酔状態にはなかった。

ｂＥＢＺＤ投与の２８分後、立直り反射は回復した。痛
覚欠如なし。

８日齢のヒナ鳥（ｃｈｉｃｋｅｎ）の胚から心室を単個
細胞に分離し３日間回転培養に付した。この方法により
、直径約１５０ミクロンの小さな規則的球形の細胞が生
ずる。集塊内の細胞は互いに他と電気的に結合しており
、規則的な一定のリズムで同時に収縮する〔ミルダル（
Ｍｙｒｄａｌ）およびデハーン（ＤｅＨａａｎ）、ジエ
イ．セル．フィズ．（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈ　ｓ．）（１
９８３年）量互３１９〜３２５頁〕．電気生理学的特性
を基準にすれば、この調製物は戒体の噛乳動物のプルキ
ンエ線維、主たる心臓の伝導系に似ている〔ミルダルお
よびデハーン、ディ・イニシエイション・オヴ・ザ・ハ
ートビート（Ｔｈｅ　Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ編、１９７
５年、オツクスフォート・ユニバーシティ・プレス社（
Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ）　
、ロンドン、ｐ．７）。これらの集塊は２４゜Ｃで平衡
化しｂＥＢＺＤを用いて２４時間処理した。２つの個別
の実験において、１００ｘ／ＩＩＩ１の量で処理した集
塊の収縮速度は対照と有意に相違した。これを以下に示
す。

実験１： （測定された収縮速度（秒）／５回の収縮間間隔）Ｎ　
　平　均　　標準偏差　ＳＥ　ＭＥＡＮ未処理　　１４
　　　１１．４８　　　　１．４４　　　　０．３８処
理　１４　　７．９４　　２．０４　　０．５５実験２
： Ｎ　　平　均　　標準偏差　ＳＥＭＥＡＮ未処理　　１
３　　　２４．５９　　　　３，１８　　　　０．８８
処理　１２　　１９．３３　　２．３７　　０．６８各
実験において、スチューｙントＴテストによれば、処理
された母集口は有意に未処理の母集団と異なっている。

これら２つの母集団が同じものであるという確率は０．
０００１より小さい（ｐ−０．００００）．欠芳決定 ウシおよびヒトのＥＢＺＤのアミノ酸配列を、（ａ）エ
ンドブロティナーゼリシンＣ、（ｂ）キモトリブシン、
（Ｃ）スタフィロコッカル・アウレウス（Ｓｔａ　ｈ　
ｌｏｃｏｃｃａｌ　ａｕｒｅｕｓ）　Ｖ８および（ｄ）
臭化シアンを用いたｂＥＢＺＤおよびｈＥＢＺＤの消化
により得られたべブチドのマイクロシークエンス分析に
よって決定した。ペブチドフラグメントは揮発性溶剤を
用いてｒｐＨＰＬＣによって精製した。アξノ末端をブ
ロックしたペプチドを１２Ｎ　ＨＣＩＩ中で周囲温度に
おいて１６時間インキユベーションした。次いで、試料
を凍結乾燥によって乾燥させた。ペプチドを、４７０Ａ
型気相プロテインシークエンサー（ＰｒｏｔｅｉｎＳｅ
ｑｕｅｎｃｅｒ）　（アプライド・バイオシステムズ社
（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）
）による自動反復エドマン分解に付した。ｒｐＨＰＬｃ
によってフェニルチオヒダントインアミノ酸を分析した
。

これとは別に、蛋白質（ウシおよびヒトＥＢＺＤ　）ま
たはペプチドを、６ＮＢ（／！を用いて１０５゜Ｃで１
６〜２０時間減圧において加水分解した。得られたアミ
ノ酸をフエニルチオカルバモイル誘導体に転化しピコ（
Ｐｉｃｏ）ＴＡＧシステム〔ウォーターズ・アソシエー
ツ（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ））によって
分析した．フェニルチオカルバモイルアミノ酸を２５４
ｎＭの吸光度によって検出した． ■並立也ヱ盪遣 ｂＥＢＺＤおよびｈＥＢｚｏノ７　ａ　／酸配置を、６
ＮＨＣｊ！で加水分解した後、アξノ酸自動分析装置を
用いて決定した。これらの蛋白質には、システィンを除
くすべての共通のアミノ酸が存在していた。これらのデ
ータから計算された最小分子量は約９．９００であり、
ＳＯＳ−ＰＡＧＥによって確認された値と一致する。

Ｎ一末端アごノ酸は、数サイクルのエドマン分解を実施
した場合でさえ検出されなかった。このことは、ｂＥＢ
ＺＤおよびｈＥＢＺＤの末端アごノ基がブロックされて
いることを示唆している。配列は実験の部に記載のよう
に決定した。ｂＥＢＺＤおよびｈＥＢＺＤの配列を、公
表されているＤＢＩの配列と比較しながら以下に示す。

ｂＥＢＺＤ配列と異な．るｈＥＢＺＤアミノ酸配列中の
残基には下線を引いた． ｈＥＢＺＤのアミノ酸配列とｂＢＢＺＤのアミノ酸配列
との比較は、ヒトおよびウシのＥＢＺＤが数個の保存的
置換基によってのみ互いに他と相違しているのかもしれ
ないということを示している。６個のアミノ酸置換基の
中の５個がＤＮＡレベルにおけるたったｌ個の塩基変化
と一致する．これらの結果は、ヒトおよびウシのＥＢＺ
Ｄが異なる種の間で構造的に高度に保存されていること
を立証している。

ウシの組織から単離したポリ（Ａ”　）ＲＮＡをｃＤＮ
Ａ合戒用の鋳型として使用した．第ＩＭのｃＤＮＡ合或
はオリゴ（ｄＴ）とトリ骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）
逆転写酵素とを使用して実施した．第２鎖は大腸菌ＲＮ
ａｓｅ　Ｈ　，　　ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＤＮＡ
リガーゼ（ＮＡＤ”　）を使用して合戒した。Ｓ１ヌク
レアーゼ消化および続いて大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■
の大断片によるフィルイン反応によって２本鎖ｃＤＮ＾
を平滑末端化した．ターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフェラーゼを使用して、デオキシグアニン残基
約１５個をｃＤＮ＾の３′末端に酵素的に加えた．次に
、二〇〇の尾部をもっｃＤＮＡをＡ−５０カラム上でサ
イズ分別して、５００塩基対未満のｃＤＮＡと導入され
なかったデオキシグアニン残基とを除去した。次に、プ
ールしたｃＤＮＡの濃縮を、ＥｃｏＲＩで消化したλｇ
ｔ．１０　　０ＮＡの存在下におけるエタノール沈殿に
よって実施した。

ＥｃｏＲ　Ｉで切断したλｇｔ．１０に対するＧの尾部
をもつｃＤＮ八の連結反応は、３′末端にデオキシシト
シン１２個を含みそして５′末端にＥｃｏＲＩ開裂ＤＮ
Ａの１本鎖突出部に相補的な配列（ＡＡＴＴ）を含む１
本鎖オリゴヌクレオチドリンカーを使用して新規の方法
によって実施した。連結したＤＮＡの旦對工劇パッケー
ジングの後で、組換えファージを大腸菌株Ｃ６００　ｒ
ｋ−　ｔａｋ”　ＨｆＥ中へ導入した．これは、組換え
（野生型でない）フェージに感染すると細胞溶菌される
。その方法により、放射性標識合或オリゴヌクレオチド
〔１７ヌクレオチド長：その配列はウシＥＢＺＤ中に見
出される６個の連続するアξノ酸（ＫＷＤＡＷＮ）によ
って推定した〕を使用し、プラークからのＤＮＡを二重
にスクリーニングした。コドンが不明なので、オリゴヌ
クレオチドの３２種の縮重ブールとしてＭＳ１を合威し
た。ＭＳＩによるスクリーニングにより陽性のプラーク
を得これをプラ一ク精製し、そして１．８ｋｂの挿入部
を含有することが示された。この挿入部をプラスミドｐ
ＦＭＢＬ中にサブクローン化した。これをｐＭＰｌと称
する。挿入部を制限地図化した後、続いて適当な数片を
Ｍ１３株中に更にサブクローン化し、そしてＳａｎｇｅ
ｒ−　Ｃｏｕ　Ｉｓｅｒのジデオキシ法によって配列を
決めた。

ｐＭＰ　ｌ中に含まれるｃＤＮＡは、ＭＳＩの種とほと
んど同じ挿入部の５′末端から約３００塩基対のＤＮＡ
配列を含んでいた。更に、ｐＭＰ１のヌクレオチド配列
により、配列が決定されているウシＥＢＺＤに関して決
定したアミノ酸配列と類似の（但し、同一ではない）ア
ミノ酸配列が予想された。これらの２種の蛋白質が密接
に関連していることはアミノ酸配列の顕著な保存性によ
って示唆されている。配列が決まっているＥＢＺＤから
アミノ酸３個を除去することにより、残りのアミノ酸を
ｐＭＰｌの配列と関連させることができ、この結果アミ
ノ酸４３％が保存される。更に、多数の変化が保存的置
換を含んでいる（前記の記載を参照されたい）。

ｐＭＰ１０発見は、ウシＥＢＺＤが同様の生物学的活性
の蛋白質をコードしているであろう関連遺伝子の群の一
員であることを示している．最後に注意すべき点は、配
列の決定されたウシの脳の因子よりも大きい蛋白質をｐ
ＭＰ１がコードしている点である。

なぜなら、リーディングフレームが、その蛋白質の公知
の末端アごノ酸の上流および下流の両方に延びているか
らである。

Ｕ狸遺伝ヱ坐発里 ウシの牌臓を使用している前記の方法を繰返した。得ら
れたｃＤＮＡは０．６ｋｂｐの挿入部であり、これをｐ
ＥＭＢＬ中にクローン化してｐＥＢＺＤを得た。配列決
定を行なったところ、ｐＭＰ１と相同のコード配列が得
られた。ウシのエンドゼビン（ｂＥＢＺＤ）をコードす
るＤＮＡ断片を、』■■消化およびＮａｅ　Ｉ消化を組
合せることにより、ｃＤＮＡプラスミド（ＥＢＺＤ）か
ら切り出した。その断片をゲル電気泳動によって精製し
、発現ベクター（ｐＳＭ　Ｌ　．　２）中にＳｔｕ　Ｉ
部位に挿入した。ρＳＭＩ，２発現ベクターの形成は、
ｐＢＲ３２２の複製開始点およびβ−ラクタマーゼ遺伝
子（Ｂｏｌｉｖａｒ等、Ｇｅｎｅ（１９７７）　２　：
　９５）　、ｐＴＲ２１３のｌａｃプロモーターおよび
リポソーマル結合部位（Ｒｏｂｅｒｔｓ等、Ｐｒｏｃ．
　Ｎａｔｌ．＾ｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ（１９７９
）出：　７６０−７６４　）をｐＬＧ３００のｉ　−Ｚ
融合遺伝子（Ｇｕａｒｅｎ　ｔｅ等、Ｃｅｌｌ（１９８
０）２０：　５４３−５５３　〕にスプライシングする
ことによって行なった。得られたプラスミドはクローニ
ング部位例えばＳｔｕ　１部位に挿入された外来遺伝子
を融合蛋白質として発現することができる。この構造に
おいて、ＥＢＺＤに関する全コード配列は、ｃｒｏ蛋白
質の最初の２個のアミノ酸をコードするＤＮＡに位相を
合わせて融合された。ブラスミドｐｓ８１０Ｂは挿入部
を正しい配向で含んでおり、プラスミドｐｓＢ１０３は
挿入部を誤った配向で含んでおり、そしてプラス壽ドρ
ＳＢｌ２５は挿入部を含んでいない。各種のプラスミド
を含む大腸菌ＨＢＩＯＩクローンを対数期まで増殖させ
、そして振とうしなから３７゜Ｃで２時間、最終濃度１
一までＩＰＴＧを加えることによって誘導した。この細
胞を遠心によって収集し、リゾチーム洗浄剤処理によっ
て溶菌した。基本的に、溶菌物は上滑（細胞賞ゾル）と
ペレット（細胞賞内封入体）とに分けて、免疫化学的技
術によって分析することができる。

発現したＥＢＺＤ融合蛋白質のレベルを、競争的ラジオ
イムノアッセイによって測定した。その結果が示すとこ
ろによれば、正しい配向で挿入部をもつＥＢＺＤ発現ベ
クター（ｐｓ８１０８）を含む大腸菌クローンだけが高
いレベルのＥＢＺＤポリペブチドを産生ずる。大部分の
ｃｒｏ−ＥＢＺＤは上清分画（細胞質ゾル）中に見出さ
れた。ペレット分画（細胞質封入体）中には、検出可能
な量だけが見出された。一方、ｐｓＢ１０３またはｐｓ
Ｂ１２５クローンのいずれの溶菌物においてもｃｒｏ−
ＥＢＺＤは検出されなかった。ＩＰＴＧによる誘導後に
、細胞培養物１ｌ当り０．　５■のｃｒｏ−ＥＢＺＤが
産生されたものと推定される。

Ｂｉｏ−Ｓｉｌ　ＴＳＫ−２５０分取用カラム（６０ｘ
　２．　１　ｃｍ）を高圧液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）システム（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅ
ｓ）に取付けた．トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）　０．　
１％を含む水中の４０％アセトニトリル中に粗製分画を
８■／成の濃度で溶解した．カラムを０．　１％ＴＦＡ
を含む４０％アセトニトリルで平衡化した。アリコー｝
２ｄ（タンパク質１６■）を注入し、最終濃度０．１％
のＴＦＡを含む水中の４０％アセトニトリル移動相によ
って均一に展開を実施した。ＢＰの位置（分画２３）が
分かった後で、前記の操作を二〜三百回行なった。分画
を監視する方法は後述する細胞増殖調節アッセイであっ
た。前記の浸透クロマトグラフィーから脳因子（ＣＩＡ
）の見掛けの分子量を計算したところ、約１８ｋＤａｌ
であった。

ＴＳＫ−２５０　　　の　　１　　　クロマトグラフィ
ー１５試行からのＴＳＫ−２５０画分２３をプールした
（容量７５ｄ）。プールされた材料を水中０．１％ＴＦ
Ａにより２倍に希釈した。この混合物を、水中０．１％
ＴＦＡによりあらかじめ平衡化されたμ−ボンダパック
−Ｃｌｌｌカラム（７８Ｍ内径Ｘ　３００ｍｍ）に室温
にて均一に注入した。一次溶剤０．　１％ＴＦＡと二次
溶剤０．　１％ＴＦＡを伴うアセトニトリルとの間で直
線グラジエントを用いた。グラジエント条件は２０分間
に０〜２８％、１４０分間に２８〜４２％、１０分間に
４２〜５２％、そして次に６分間に５２〜１００％であ
った。

すべての溶剤はＨＰＬＣグレードであった。４ＷＩ１の
両分を集めた。各両分のアリコートを５０■のＢＳＡと
共に乾燥し、そしてＣＩＡについてアッセイした．ＣＩ
Ａの２個のピークを貯蔵した．第１の活性（α）は３２
〜３３．５％の間のアセトニトリル濃度において溶出し
、他方第２のピーク（β）は３４．５〜３６％の間のア
セトニトリル濃度で溶出した。α活性のこれ以上の精製
は次のようにして行った。

１０試行からの活性画分３０及び３１をプールし、そし
て０．　１％ＴＦＡにより２倍に希釈した。希釈された
サンプルをμ−ボンダパックカラム（７８　Ｘ　３００
閣）に均一に適用し、モしてカラムを０．　１％ＴＦＡ
で洗浄しそして平衡化した．流速はＩＭ１／分であり、
そしてチャートスピードは０．１Ｃ１１／分であった．
やはり、第ｌ溶剤０．１％ＴＦＡと第２溶剤０．１％Ｔ
ＦＡの濃度を有するアセトニトリルとの間で直線グラジ
エントを用いた。グラジエント条件は、４０分間にＯ〜
３０％、２４０分間に３０〜３８％、そして２０分間に
３８〜１００％であった。最初の１２画分は６一であり
、そして次に４ＩｎＩＷｉ分を集めた。アリコートを（
，ＩＡについてアッセイした。活性は３２〜３３．５％
の間のアセトニトリル濃度において溶出した。

画分３０〜３２をプールした。１２ｍの０．１％ＴＦＡ
をプールされた両分に加えた。混合物（２４ｄを、０．
　１％ＴＦ＾で平衡化された分析用μ−ボンダパックＣ
Ｉｌｌカラム（　３．　９　Ｘ　３００ｍｍ）上に均一
に適用した。流速及びチャートスピードはそれぞれ０．
　４　ｄ／分及び０．ＩＣＩ１／分であった．やはり、
第１溶剤０．１％ＴＦＡと第２溶剤０．　１％ＴＦＡの
濃度を有するアセトニトリルの間で直線グラジェントを
用いた．グラジエント条件は、２５分間に０〜３０％、
２００分間に３０〜３８％、そして２５分間に３８〜１
００％であった。２１ＩＩ１の百分を集めた。画分のア
リコートをＣＩＡについてアッセイした．活性は分析用
Ｃ．カラムから、約３４％のアセトニトリル濃度におい
て溶出した． 画分２９−３１をプールし、そして０．１％ＴＦＡで２
倍に希釈し、モしてμ−ボンダパックＣＩｌｌカラム（
３．９Ｘ　３００ａ＊）に適用した。第１溶剤０．１％
ＴＰＡと第２溶剤０．　１％↑ＦＡの濃度を有するｎ−
プロパノールとの間の直線グラジエントを用いた。グラ
ジエント条件は、４０分間に０〜１８％、２２５分間に
ｌ８〜２７％、そして２０分間に２７〜３５％であった
。流速は０．４ｍ／分であり、そしてチャートスピード
は０．１ＣＩ１／分に設定された。画分を集め、そして
アリコートをＣＩＡについてアッセイした。活性は約２
３％のｎ−プロバノール濃度において溶出した．画分２
８及び２９をプールし、そして０．１％ＴＦＡにより５
倍希釈し、そして０．　１％ＴＦＡの濃度を有するｎ−
プロパノールを第２溶剤として用いてμ−ボンダパック
（＋ｓカラム（３１９Ｘ　３００Ｍ）上で再クロマトグ
ラフ処理した。クロマトグラフ条件及びグラジエント条
件はすぐ上に記載したのと同じであった。最初の８個の
画分は６ｄであり、そして１．　６　ｄの画分を集めた
。各両分のアリコートをＣＩＡについてアッセイした。

ほとんどの活性が画分１５〜１７に現われた。画分１５
〜１７は約１５ｇの蛋白質及び約２３０　Ｘ　１０’ユ
ニットのＣＩＡを含有していた．この画分をＨＰＬＣ　
　Ｃ＋ａ’画分とした。最終精製画分は、ＣＣＬ６４を
試験細胞として用いた蛋白質ｎ当り１５．３３Ｘ１０’
ユニットの比活性を有していた。

次の第４表は結果を要約する。

粗製物　　３．６８０　　　１．５５１　　　　０．４
２１ＴＳＫ−２５０　　　　　６３０　　　２．７６０
　　　　　　４．３８ＨＰＬＣ−ＣＩ８Ｓ　　Ｏ．０１
５　　　　　２３０　　　　１５，３３３．００１００ １８１ １４．８ （＊）　ＣＣＬ６４細胞のＤＮＡへの１２５）一デオキ
シウリジンの取り込みを５０％阻害するために必要な材
料アッセイはＮｕｎｃ９６ウエルブレー｝　（Ｋａｍｓ
ｔｒｕｐｖｅｊ９０．　ＤＫ−４＋ＯＯＯ＋　Ｒｏｓｋ
ｘｌｄｅ　％デンマーク）中で行った．ヒト肺癌細胞（
Ａ５４９）又はミンクの肺細胞（ＣＣＬ６４）を試験細
胞として使用した。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び
ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（０．５７
ｍｇ／ｒＩＩｉずつ）及びグルタミンを伴うドルベコ改
変イーグル培地（ＤＭＩＩ！Ｍ）　５０　ｄ中３．５×
１０３細胞を、端のウエル以外のすべてのウエルに導入
した。端のウエルには５０ＩＪ１のＰＢＳを導入し、そ
してプレートを３７゜Ｃにてインキエベートした。

試験サンプルを、１０％ＦＣＳ　，　Ｐ／Ｓ及びグルタ
ミンを含むＤＭＥＭ中に懸濁して３連試験を行った。４
日後、５０メの試験サンプルを各試験ウエルに加え、他
方対照ウエルには５０ｄの培地のみを加えた。プレート
を３７℃にて３日間インキユベートした。４日目に、１
！ｓ■−ヨード−２′−デオキシウリジンの溶液（　（
４Ｃｉ／Ｉｇ　　０．５ｍＣｉ　／ｄ　（０．１，ｍア
イソトープ／ｄ、１０％ＦＣＳ　，　Ｐ／Ｓ、グルタξ
ンを含有するＤＭＥＭ中）１００ｍを各ウエルに加え、
そしてプレートを３７℃にてインキユベートした．５日
目に、培地をウエルから吸引し、２００　ｄのＰＢＳで
１回洗浄した．次に、２００ｄのメタノールを各ウエル
に加え、プレートを１０分間インキエベートし、そして
メタノールを吸引により除去した．水酸化？トリウム（
２００Ｉｌｌ、ＬＭ）を各ウエルに加え、プレートを３
０分間３７゜Ｃにてインキユベートし、そして次に水酸
化ナトリウムをタイターテック（Ｔｔｔｅｒ−ｔｅａ）
プラグ（フロー・ラプス）により取り出した。

プラグを１２Ｘ７５ＩＩｎのプラスチックチューブに移
し、そして放射能を定量測定するためにγ一カウンター
で計数した。

ソフトアガー・コロニー阻　アッセイ ■０％ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中０．５％寒天（ア
ガーノーブル；ディフコラボラトリーズ、デトロイト、
ミシガン）の２．０ｄの基層を６０ｍのコスター組織培
養皿に加えた。同じ培地一ウシ血清混合物、１．　Ｏ　
ＸＩＯ’八５４９　Ａｇ３　（ソフトアガー増殖クロー
ン３）細胞及び２連の種々の濃度の試験されるべきサン
プルを含有する０．　３％寒天を加えた．プレートを空
気中５％ＣＯ■の加湿雰囲気中で３７゜Ｃにてインキエ
ベートし、そして７日後に適切な補充物を含有する０．
３％寒天２．ＯＪｄの添加により再供給した．コロニー
を固定せず染色しないで測定し、そして低倍率の無作為
の視野５個当り６細胞？り多いコロニーの数を７日及び
ｌ４日後に計数した。

コロニーノ　ニアッセイ このアッセイは６ウエルーファルコンプレート（　９．
　６　ｃｆｆｌの面積／ウエル）中で行った。Ａ５４９
細胞（２００）を各ウエル中、１０％ＦＣＳＳＰ／Ｓ及
びグルタミンを含む１−のＤＭＥＭ中にプレートした。

プレートした直後に、１．　０　ｄの培地中種々の濃度
の試験材料を２連で加えた。対照ウエルには試験材料を
なんら含まない１．　０　ｄの培地のみを加えた。プレ
ート空気中５％ＣＯ■の加湿雰囲気中３７゜Ｃにて１０
日間インキエベートし、５０％メタノール中０．　２％
メチレンブルー１．　０　ｄを各ウエルに添加し、そし
て２０分間放置し、染料を除去し、そして各ウエルを０
．１ｄの水で２回洗浄し、そして空気乾燥した。

コロニーのサイズ及び数を定量測定した。

↓凰笠匁止叉 ＤＮＡ合或の５０％阻害が、それぞれ９８Ｉ！ｇ／ｒＩ
Ｉｉ、２１ｎ／　ｒｄ及び９５ｎｇ／ｍの粗画分、ＴＳ
Ｋ−２５０画分及び最終純蛋白質において観察された。

従って、＾５４９ヒト肺癌細胞における５０％ＤＮＡ合
成阻害が純蛋白質の約９ｎＭ濃度において見られた． ｂＢＦはまた、寒天（Ａｇ）上でのヒト肺癌細胞Ａ５４
９の足場独立性増殖を阻害した。ソフトアガー中でのコ
ロニー形成の５０％減少が約７６ｎｇ／ｍのｂＢＦにお
いて見られた。Ａ５４９細胞のコロニー形或率はこの蛋
白質により顕著に阻害された。１３ｎｇ／Ｉｄ（１．２
４ｎＭ）の蛋白質濃度において、コロニー形威率は対照
のそれに比べて５０％に過ぎなかった。約８０ｎｇ／ｄ
のｂＢＦの存在下ではＡ５４９細胞のコロニは見られな
かった。

Ａ５４９細胞を種々の濃度のｂＢＦの存在下又は非存在
下で増殖せしめ、そして細胞の増殖を直接細胞計数にモ
ニターした場合、ｂＢＦは量依存的に細胞増殖を阻害す
ることが見出された。すなわち、ＤＮＡへのＩＺｓＩ−
デオキシウリジンの取り込みは細胞増殖の良好な基準で
ある。

ｂＢＦはＡ　５．４　９細胞、ヒト黒色腫細胞（Ａ３７
５　Ａｇ）及びヒト乳癌細胞（ＭＣＦ　−　７　）の種
々のクローンの増殖を阻害した。ヒト***線維芽細胞（
ＷＩ−２６）の増殖がｂＢＦにより刺激された。脳因子
はまた、ネズξ線維芽細胞セルライン３Ｔ３−Ａ３１に
対して増殖刺激的である。

ヒトＴ一細胞機能（Ｚａｒｌｉｎｇ等、Ｔｒａｎｓｐｌ
ａｎｔａｔｉｏｎ（１９７６）２１　：　　４６８−４
７６　）に対する脳因子の効果を研究するために、同種
異系的（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃａｌｌｙ）に誘導された
増殖性及び細胞変性ヒトリンパ球を生じさせそして測定
するためのミクロ法を用いた。

末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を正常個体のヘパリン処理血
液から、フィコールーハイパク遠心により単離した。次
にＰＢＬをリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄し
、そして１０％の熱不活性化されたプールされた正常ヒ
ト血清（ＨＳ）が補充されたＲ　ＰＭＩ　１６４０の培
地（ギプコ、グランドアイル、ＮＹ）中に１×１０６Ｐ
ＢＬ／ｄの濃度で懸濁した。次に、Ｏ．　ｌ　ｄのこれ
らのＰＢＬ　（応答細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｃｅ
ｌｌ）と称する）を９６−ウエルプレートの２連の丸底
ウエルのそれぞれに加え、そして次に０．０５ｄの培地
のみ又は２ＸｌＯ’個のＸ一線照射された（２５００Ｒ
ａｄ）同種異系細胞〔“刺激細胞”（ｓｔｉｎ＋ｕｌａ
ｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ）と称する）を含有する０．０５ｄ
の培地、及び０．０５ｄの培地のみ又は種々の濃度の脳
因子（０．９〜７５ユニット脳因子／ウエルをもたらす
）を含有する培地を加えた。細胞を５％ＣＯ２インキュ
ベーター中で３７゜Ｃにてインキエベートし、そして２
日目及び５日目に０．０５１１の培地を各ウエルから取
り出し、そして次にもとの濃度の脳因子を含有する培地
０．０５ｄを添加した。

増殖応答を決定するため、６日目に各群からウエルの内
容物をプールし、そして０．１Ｊｌｌ！を９６−ウエル
プレートの４連のウエルのそれぞれに加え、次に０．０
２５ｄの容量中ｌμＣｉの３Ｈ−チξジン（ＩＨＴｄＲ
　，ニューイングランドニュークレア、ボストン、ＭＡ
）を加えた。６時間後、ウエルの内容物を多ウエル収得
器を用いてガラスフィルターストリップ上に収得し、こ
れらのストリップをシンチレーシゴン液体を含有するバ
イアルに移し、そして３Ｈ−ＴｄＲ取り込みをβ一カウ
ンター中での計数により決定した。

細胞変性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成に対する効果を決
定するため、６日目にウエノレからプーノレされた残り
のリンパ球を９６−ウエルプレートの３連の球底ウエル
に加え（０．１５−／ウエル）、そして０．　１５ｄの
４倍逐次希釈物も３連のウエルのそれぞれに加えた。Ｓ
　Ｉ（：　ｒラベル化標的細胞（ｔａｒｇｅｔ　ｃｅｌ
ｌ）を調製するため、同種異系刺激細胞の提供者から生
じたリンボブラストイドセルライン（ＬＣＬ）細胞１．
５Ｘ１０”を５００ｐｃｉ”Ｃｒ（Ｎａ２Ｃｒ０４，　
ニューイングランドニュークレア、ボストン、ＭＡ）に
より３７゜Ｃにて１時間ラベルし、次に標的細胞を■５
％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する培地で
３回洗浄し、そしてこの培地に６Ｘ１０’細胞／成で再
懸濁した。次に、０．０５ＩＩ１の標的細胞を、エフエ
クター細胞を収容する各ウエルに、及び培地のみ〔自然
（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）”Ｃｒ放出を決定するため
〕又は洗剤のみ（ＳＩＣｒ放出を決定するため）を収容
するウエルに加え、そしてプレートを３７゜Ｃにて６時
間インキユベートした。次に、上清の一定のアリコート
を各ウエルから取り出し、モしてＴカウンター中で計数
するためにチューブに移した．特異的ＳＩＣ，放出％を
次のようにして決定した．次の第５表が結果を示す． 第５表、 ヒトＴ−リンパ球のアロ抗原 ２０７ １０３．６９０ ７０．１４０ ６４．５０７ ７８，２８７ Ｂ７　，　０９５ ９９，５５２ 末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は正常個体■のヘパリン処理
血液から得られ、そして個体ＣからのＸ一線照射された
（２５００Ｒａｄ）同種異系ＰＢＬ　（Ｃｘ）により刺
激され、そして６日後、３Ｈ−チミジン（”Ｈ　ＴｄＲ
）の取り込みを上に詳述したようにして決定した．ＣＰ
Ｍ　＝カウント／分。

悩因子の同様な効果が試験した他のすべての提供者のＰ
ＢＬのＴ一細胞増殖応答に対して観察された。脳因子に
よる一層顕著な程度の阻害がヒト細胞変性Ｔ−リンパ球
の生戒に対して観察された。

同じ量の５１（ｒ放出を生じさせる未処理のエフエクタ
ー細胞の数として、７５ユニットの脳因子と共にインキ
エベートされた約ｌ６倍多くのエフエクター細胞が４２
％のＳＩＣ，放出を生じさせるために必要である。

上記の結果から、この発明の化合物はインビト口及びイ
ンビボの両方における広範囲の用途で使用され得ること
が明らかである。この発明のポリペプチド及び抗体は、
生理的流体、例えば血液、血清、血漿、尿、又は脳脊髄
液中のこのような蛋白質の存在を細胞内的に又は細胞外
的に決定するため、組織中の細胞によって形威されるポ
リペプチドの量の決定のため、診断的に使用することが
できる。さらに、この発明の化合物はポリペプチドのり
セプターの決定のために使用することができる。さらに
、この発明の化合物は、正常細胞の存在下及び非存在下
で腫瘍細胞の増殖速度を調節するため、免疫調節剤とし
て、又はジアゼバムリセプターもしくはＧＡＢＡ一作働
性リセブターと関連する生理学的機能を調節するために
使用することができる．従って、脳組織由来の脳因子化
合物及びその断片は、外科的処置又は術後処置等のため
に、例えば骨髄、腫瘍、例えば黒色腫、肉腫、又は癌に
おける正常細胞と腫瘍細胞との混合物から腫瘍細胞を除
去するために他の添加物と組合わせて使用することがで
きる．脳因子化合物はまた、Ｔ一細胞の増殖の調節のた
めにも使用することができる，　ＥＢＺＤ化合物はＥＢ
ＺＤリセプタ一の活性を調節するためにも使用すること
ができる．前記の発明を、理解を明瞭にするために説明
及び例により幾分詳細に説明したが、幾らかの変化及び
変更を、添付された特許請求の範囲内で実施することが
できることは自明である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、膜蛋白質と実質的に同一のアミノ酸組成をもつポリ
   ペプチド又はメチオニン３７、６８又は６９で始まるそ
   のフラグメントを含む組成物、をコードしており、そし
   て適切な方向で、少なくとも１つの、野生型プロモータ
   ー以外のプロモーター、野生型ターミネーター以外のタ
   ーミネーター、又は野生型複製系以外の複製系に結合さ
   れているＤＮＡ配列を含むＤＮＡ表現構造体。 ２、該複製系、プロモーター及びターミネーターが原核
   生物宿主中で官能性である、特許請求の範囲第１項記載
   のＤＮＡ発現造成物。