JPH03155787A - Ebzd蛋白質発現系 - Google Patents
Ebzd蛋白質発現系Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
細胞の増殖及び分化は多数の刺激性、抑制性及び相乗性
のホルモン及び因子によって開始され、促進され、維持
されそして調節されることは明らかである。細胞ホメオ
スタシス機構の変化及び/又は破壊は増殖に関連した疾
患(腫瘍形成を含む)の基本的原因であると思われる。
のホルモン及び因子によって開始され、促進され、維持
されそして調節されることは明らかである。細胞ホメオ
スタシス機構の変化及び/又は破壊は増殖に関連した疾
患(腫瘍形成を含む)の基本的原因であると思われる。
増殖調節因子(刺激剤及び阻害剤)は種々の疾患(例え
ば、癌)の診断、予後及び治療に潜在的用途があるので
それらの単離、特徴づけ及び作用機構にかなりの興DK し KYG [ 味が持たれており、更にまた特に有糸***が癌に影響を
及ぼすかもしれない場合のその有糸***の基本的機構を
理解することにかなりの興味が持たれている。
ば、癌)の診断、予後及び治療に潜在的用途があるので
それらの単離、特徴づけ及び作用機構にかなりの興DK し KYG [ 味が持たれており、更にまた特に有糸***が癌に影響を
及ぼすかもしれない場合のその有糸***の基本的機構を
理解することにかなりの興味が持たれている。
増殖及び分化に加えて、多くの肉体的応答が蛋白質によ
って調節され、その場合に蛋白質はリガンド又はレセプ
ターとして役立つことができる。
って調節され、その場合に蛋白質はリガンド又はレセプ
ターとして役立つことができる。
脳の機能及び外部及び内部の刺激に対する応答のその調
節についての更なる研究は、痛み、気分、等のような刺
激に対する応答の調節に伴う無数の化合物が単離される
結果をもたらした。
節についての更なる研究は、痛み、気分、等のような刺
激に対する応答の調節に伴う無数の化合物が単離される
結果をもたらした。
不安解消剤、鎮痙剤、筋弛緩剤及び鎮静剤として普通に
用いられているベンゾジアゼピン(BZD)は、r−ア
ミノ酪酸(GABA)で仲介された抑制性神経伝達の増
強作用に基づく薬理学的効果を発揮すると考えられる。
用いられているベンゾジアゼピン(BZD)は、r−ア
ミノ酪酸(GABA)で仲介された抑制性神経伝達の増
強作用に基づく薬理学的効果を発揮すると考えられる。
BZDによるGABA−作動性伝達の調節における第一
段階は中枢神経系中の特異的な高い親和性を有しかつ飽
和できる結合部位に対する結合であると思われ、この場
合にその結合部位は11超分子複合体” (super
molecular complex)の成分であると
考えられる。この系を理解すること、及びその系を調節
又は制御することができることの必要性は、天然リガン
ド及びそれが機能する態様を知ることに依存している。
段階は中枢神経系中の特異的な高い親和性を有しかつ飽
和できる結合部位に対する結合であると思われ、この場
合にその結合部位は11超分子複合体” (super
molecular complex)の成分であると
考えられる。この系を理解すること、及びその系を調節
又は制御することができることの必要性は、天然リガン
ド及びそれが機能する態様を知ることに依存している。
これらの因子の検出、単離及び精製は、その混合物の複
雑性、その混合物中の種々の成分の諸活性の分岐性、広
範囲の種類の試薬による諸成分の不活性化への感受性、
化合物の活性が多数のサブユニットの存在に依存するよ
うな化合物をもつ可能性、及び種々の精製段階を追跡す
るためのバイオアッセイを提供することにおいてしばし
ば起こる困難によってしばしば複雑にされる。それにも
かかわらず、精製及び分離に実質的な進歩があり、その
進歩は関心のある生成物の検出及び単離の助けとなって
いる。
雑性、その混合物中の種々の成分の諸活性の分岐性、広
範囲の種類の試薬による諸成分の不活性化への感受性、
化合物の活性が多数のサブユニットの存在に依存するよ
うな化合物をもつ可能性、及び種々の精製段階を追跡す
るためのバイオアッセイを提供することにおいてしばし
ば起こる困難によってしばしば複雑にされる。それにも
かかわらず、精製及び分離に実質的な進歩があり、その
進歩は関心のある生成物の検出及び単離の助けとなって
いる。
〔従来の技術]
Bea 1等、Cancer Biochem、 Bi
o h s、(1979) 3 :93−96は、増殖
及びDNA合成を正常細胞中でよりも形質転換細胞中で
一層抑制するペプチドがヒトの尿中に存在することを報
告している。Hol ley等、Proc、 Nat
l、 Acad、 Sci、(1980)ヱヱ :
5989−5992は、上皮細胞成長■害物質の精
製を記載している。
o h s、(1979) 3 :93−96は、増殖
及びDNA合成を正常細胞中でよりも形質転換細胞中で
一層抑制するペプチドがヒトの尿中に存在することを報
告している。Hol ley等、Proc、 Nat
l、 Acad、 Sci、(1980)ヱヱ :
5989−5992は、上皮細胞成長■害物質の精
製を記載している。
Letansky、、Biosci、 Re 、(19
82) 2 : 39−45は、ウシの胎盤から精製さ
れたペプチドが腫瘍の増殖及びDNA中へのチミジンの
取り込みを正常細胞中でよりも新生物中で一層強く抑制
することを報告している。Chen、 Trends
Biochem、 Sci、(1982) 7 :36
4−365は、癌抑制特性をもったペプチドを腹水流体
から単離することを報告している。 Redding及
び5chally 、 Proc、 Natl、 Ac
ad、 Sci、(1982)79ニア014−701
8は、種々の正常細胞系及び腫瘍細胞系に対して抗−分
裂促進活性を示す精製されたペプチドをブタの視床下部
から単離することを報告している。これらの殆どの因子
は十分には特徴づけされておらず、またそれらの基本的
構造は知られていない。
82) 2 : 39−45は、ウシの胎盤から精製さ
れたペプチドが腫瘍の増殖及びDNA中へのチミジンの
取り込みを正常細胞中でよりも新生物中で一層強く抑制
することを報告している。Chen、 Trends
Biochem、 Sci、(1982) 7 :36
4−365は、癌抑制特性をもったペプチドを腹水流体
から単離することを報告している。 Redding及
び5chally 、 Proc、 Natl、 Ac
ad、 Sci、(1982)79ニア014−701
8は、種々の正常細胞系及び腫瘍細胞系に対して抗−分
裂促進活性を示す精製されたペプチドをブタの視床下部
から単離することを報告している。これらの殆どの因子
は十分には特徴づけされておらず、またそれらの基本的
構造は知られていない。
ジアゼパム結合性阻害剤は、Guidotti等、Pr
oc、 Na11. Acad、 Sci、 USA(
1983)60: 383 385、Cos ta等
、Neuro harmacol、 (1984)23
: 989 991、Ferrero等、Neurop
harmacol、 (1984)23 : 1359
1362、及びAlho等、5cience (198
5) 229 : 179−182によって報告されそ
して説明されている。
oc、 Na11. Acad、 Sci、 USA(
1983)60: 383 385、Cos ta等
、Neuro harmacol、 (1984)23
: 989 991、Ferrero等、Neurop
harmacol、 (1984)23 : 1359
1362、及びAlho等、5cience (198
5) 229 : 179−182によって報告されそ
して説明されている。
〔発明の概要]
新規な方法及び組成物が提供され、これらの組成物は、
ゲル浸透カラムで酸性水性アセトニトリルを用い次いで
逆相HPLCで直線グラジェントの酸性(0,1%トリ
フルオロ酢酸)水性アセトニトリルを用いて脳組織から
単離することができ、その上にそのような組成物の成分
及びそのような成分と実質的に相同の領域をもつポリペ
プチドが提供される。その組成物及び成分は、ジアゼパ
ムに対するアゴニストとして及び表面膜蛋白質として、
新生物細胞の増殖を遅延させる用途があるであろう。ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が提供さ
れ、それは原核生物又は真核生物中でのポリペプチドの
生産を可能にする。主題のポリペプチドに特異的に結合
する抗体が提供される。
ゲル浸透カラムで酸性水性アセトニトリルを用い次いで
逆相HPLCで直線グラジェントの酸性(0,1%トリ
フルオロ酢酸)水性アセトニトリルを用いて脳組織から
単離することができ、その上にそのような組成物の成分
及びそのような成分と実質的に相同の領域をもつポリペ
プチドが提供される。その組成物及び成分は、ジアゼパ
ムに対するアゴニストとして及び表面膜蛋白質として、
新生物細胞の増殖を遅延させる用途があるであろう。ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が提供さ
れ、それは原核生物又は真核生物中でのポリペプチドの
生産を可能にする。主題のポリペプチドに特異的に結合
する抗体が提供される。
天然の生理学的に活性なポリペプチド化合物類の組合わ
せ、個々のポリペプチド化合物類、それの生理学的に活
性なフラグメント類を含む新規な組成物、及び種々のポ
リペプチドをコードしている核酸配列が提供される。そ
のポリペプチドはを推動物、特に哺乳動物の脳細胞中に
天然に見いだされるポリペプチドに相同であるか又は実
質的に相同である(少なくとも60%相当)配列をもつ
。
せ、個々のポリペプチド化合物類、それの生理学的に活
性なフラグメント類を含む新規な組成物、及び種々のポ
リペプチドをコードしている核酸配列が提供される。そ
のポリペプチドはを推動物、特に哺乳動物の脳細胞中に
天然に見いだされるポリペプチドに相同であるか又は実
質的に相同である(少なくとも60%相当)配列をもつ
。
その諸組成物は種々の生理学的活性をもち、そして脳細
胞中に特異的に位置しているか又は脳以外の広範囲の種
々の組織中に一般的に見いだされる。
胞中に特異的に位置しているか又は脳以外の広範囲の種
々の組織中に一般的に見いだされる。
このポリペプチドは、ホモジナイズされた脳組織又はそ
の精製された両分を用いてクロマトグラフィーカラムか
ら酸性水性アセトニトリル溶離剤で溶出することによっ
て単離可能であることを特徴とする。一つの因子は逆相
HPLC及びゆるやかな直線グラジェントの酸性水性ア
セトニトリルを用いてクロマトグラフィーによって実質
的に純粋に単離することができる。その他の成分につい
ては所望の活性は水性酸性n−プロパツールを直線グラ
ジェントとして用いて更に精製することができる。
の精製された両分を用いてクロマトグラフィーカラムか
ら酸性水性アセトニトリル溶離剤で溶出することによっ
て単離可能であることを特徴とする。一つの因子は逆相
HPLC及びゆるやかな直線グラジェントの酸性水性ア
セトニトリルを用いてクロマトグラフィーによって実質
的に純粋に単離することができる。その他の成分につい
ては所望の活性は水性酸性n−プロパツールを直線グラ
ジェントとして用いて更に精製することができる。
そのクロマトグラムは、約0.1〜0.5d/分の流速
で合理的な分離を得るために4時間以上の時間にわたっ
て展開することができる。逆相HPLCを用いての分離
では脳組織からの部分的に精製されたサンプルをもたら
すのが普通である。部分的な精製は、ゲル浸透クロマト
グラフィーを用い溶離剤として酸性水性アセトニトリル
を用い、特に均一に溶出することによって好都合に達成
することができる。好都合には、媒体は0.1%トリフ
ルオロ酢酸水溶液中の40%アセトニトリルであること
ができる。
で合理的な分離を得るために4時間以上の時間にわたっ
て展開することができる。逆相HPLCを用いての分離
では脳組織からの部分的に精製されたサンプルをもたら
すのが普通である。部分的な精製は、ゲル浸透クロマト
グラフィーを用い溶離剤として酸性水性アセトニトリル
を用い、特に均一に溶出することによって好都合に達成
することができる。好都合には、媒体は0.1%トリフ
ルオロ酢酸水溶液中の40%アセトニトリルであること
ができる。
二成分は実質的に異なった生理学的活性及び組成をもつ
。内因性ペンゾジアゼピンオイド又はエンドゼビン(E
BZD)と呼ばれる一つの因子は、ベイリウム(val
ium)アゴニストとしてジアゼパムレセプターに結合
する活性を示し、そして細胞質蛋白質であるこ々は明ら
かである。EBZDは、低い投与量では、哺乳動物に興
奮及び増強された意識を引き起こし、一方高い投与量で
は、鎮静を引き起こす。拍動心臓細胞集合体については
、低い投与量では心臓拍動度数は低下し、一方高い投与
量では心臓拍動度数は増大する。それらの化合物はジア
ゼパム結合性阻害剤について公表された(前記のGui
dotti等の文献)配列との幾らかの相同性を示す。
。内因性ペンゾジアゼピンオイド又はエンドゼビン(E
BZD)と呼ばれる一つの因子は、ベイリウム(val
ium)アゴニストとしてジアゼパムレセプターに結合
する活性を示し、そして細胞質蛋白質であるこ々は明ら
かである。EBZDは、低い投与量では、哺乳動物に興
奮及び増強された意識を引き起こし、一方高い投与量で
は、鎮静を引き起こす。拍動心臓細胞集合体については
、低い投与量では心臓拍動度数は低下し、一方高い投与
量では心臓拍動度数は増大する。それらの化合物はジア
ゼパム結合性阻害剤について公表された(前記のGui
dotti等の文献)配列との幾らかの相同性を示す。
このペプチドは、脳シナプトソームへのベンゾジアゼピ
ンの結合を抑制することにおいて、約1〜10犀、普通
には3〜6禮のKiをもつことを更に特徴とする(後記
の実験の項を参照のこと)。天然のポリペプチドはゲル
浸透クロマトグラフィーによって測定して約7〜15k
Dal、普通には8〜12kDal、又は5OS−PA
GEで6〜10kDalの範囲の分子量をもつ(後記の
実験の項を参照のこと)。このペプチドは親水性である
。1000ユニツト/■を越える比活性を得ることがで
きる(後記の実験の項を参照のこと)。
ンの結合を抑制することにおいて、約1〜10犀、普通
には3〜6禮のKiをもつことを更に特徴とする(後記
の実験の項を参照のこと)。天然のポリペプチドはゲル
浸透クロマトグラフィーによって測定して約7〜15k
Dal、普通には8〜12kDal、又は5OS−PA
GEで6〜10kDalの範囲の分子量をもつ(後記の
実験の項を参照のこと)。このペプチドは親水性である
。1000ユニツト/■を越える比活性を得ることがで
きる(後記の実験の項を参照のこと)。
EBZDのフラグメントも生物活性である;特に、EB
ZDのアミノ酸33〜52を含むフラグメント(異なっ
た種にわたる共通配列)はジアゼパム結合性阻害剤とし
ての活性をもつ。
ZDのアミノ酸33〜52を含むフラグメント(異なっ
た種にわたる共通配列)はジアゼパム結合性阻害剤とし
ての活性をもつ。
第二の成分は脳因子(BF)と呼ばれ、そして前記した
ようにして脳組織から単離することができる。この因子
はEBZDよりも実質的に少ない量で存在し、そしてゲ
ル浸透精製においてEBZDよりも遅い。その化合物は
、総て後記の実験の項に記載されているように、肺癌細
胞の成長を抑制するために、並びに軟寒天コロニー形成
及びコロニー形成率を抑制するために有効であることが
見いだされている。
ようにして脳組織から単離することができる。この因子
はEBZDよりも実質的に少ない量で存在し、そしてゲ
ル浸透精製においてEBZDよりも遅い。その化合物は
、総て後記の実験の項に記載されているように、肺癌細
胞の成長を抑制するために、並びに軟寒天コロニー形成
及びコロニー形成率を抑制するために有効であることが
見いだされている。
BPは一般的にはゲル浸透クロマトグラフィーから求め
て約5〜20kDal、普通には約8〜18kDalの
分子量をもつ。この蛋白質は逆相HPLC及び直線グラ
ジェントの0.1%TF^水性n−プロパツールを用い
、約20〜26%n−プロパツールで溶出して精製する
ことができる。その精製された蛋白質は少なくとも約1
5X10’ユニツト/躍の比活性をもつことができる(
後記の実験の項を参照のこと)。
て約5〜20kDal、普通には約8〜18kDalの
分子量をもつ。この蛋白質は逆相HPLC及び直線グラ
ジェントの0.1%TF^水性n−プロパツールを用い
、約20〜26%n−プロパツールで溶出して精製する
ことができる。その精製された蛋白質は少なくとも約1
5X10’ユニツト/躍の比活性をもつことができる(
後記の実験の項を参照のこと)。
第三成分は、アミノ酸配列KWDAWN (hEBZD
のアミノ酸54〜59)をコードするオリゴヌクレオチ
ドのプールであるプローブを用いて得ることができる。
のアミノ酸54〜59)をコードするオリゴヌクレオチ
ドのプールであるプローブを用いて得ることができる。
その蛋白質はEBZDよりも実質的に太き(、リーダー
配列及びストップトランスファー配列をもち、それで表
面膜蛋白質として作用することができ、この場合にその
ペプチドの主要部分は細胞の外にある。この蛋白質は実
質的に脳組織中に位置している。
配列及びストップトランスファー配列をもち、それで表
面膜蛋白質として作用することができ、この場合にその
ペプチドの主要部分は細胞の外にある。この蛋白質は実
質的に脳組織中に位置している。
これらの蛋白質はいずれかの好都合な入手源、特にを推
動物、−層特定的には哺乳動物〔ウシ、ヒツジ、ウサギ
、ネズミ、霊長類(特にヒト)、等を含む]から得るこ
とができる。それらの化合物は天然のままで用いること
ができ、又は種々の方法で、例えば、グリコジル化を欠
失させ、末端アシル化(特にアセチル化又はホルミル化
)を欠失させ、レセプター(例えば、抗体)への競合的
結合能力のような生理学的活性をもつフラグメントを使
用し、欠失、挿入を行い、他のペプチドに融合させ、他
のペプチド、例えば、抗体形成のための免疫原、又はハ
ブテンに共有結合させ、又は1個以上の、普通には数で
約10%以下の、−層普通には数で約5%以下の、挿入
、欠失、トランジション又はトランスバージョンによっ
て変更されるアミノ酸をもつことによって変異させて、
変更することができる。
動物、−層特定的には哺乳動物〔ウシ、ヒツジ、ウサギ
、ネズミ、霊長類(特にヒト)、等を含む]から得るこ
とができる。それらの化合物は天然のままで用いること
ができ、又は種々の方法で、例えば、グリコジル化を欠
失させ、末端アシル化(特にアセチル化又はホルミル化
)を欠失させ、レセプター(例えば、抗体)への競合的
結合能力のような生理学的活性をもつフラグメントを使
用し、欠失、挿入を行い、他のペプチドに融合させ、他
のペプチド、例えば、抗体形成のための免疫原、又はハ
ブテンに共有結合させ、又は1個以上の、普通には数で
約10%以下の、−層普通には数で約5%以下の、挿入
、欠失、トランジション又はトランスバージョンによっ
て変更されるアミノ酸をもつことによって変異させて、
変更することができる。
各々のポリペプチドを更に詳細に考慮する。
EBZDポリペプチド
EBZDポリペプチドは約20キロドルトン(kDal
)未満、普通には約15kDa1未満であることを特徴
とし、そして普通には少なくとも約1kDal、−層普
通には少なくとも約2kDalである。
)未満、普通には約15kDa1未満であることを特徴
とし、そして普通には少なくとも約1kDal、−層普
通には少なくとも約2kDalである。
そのポリペプチド組成物は、逆相HPLCで周囲条件下
で0.1%水性トリフルオロ酢酸中の0〜60%アセト
ニトリルの直線グラジェントを用いて、28〜50%ア
セトニトリル、特に29〜40%アセトニトリル、−層
特定的には約29〜36%アセトニトリル、−層特異的
に゛は30〜34%アセトニトリルの範囲内でμmボン
ダパック(Bondapak) C+aカラムから溶
出することを更に特徴とする。
で0.1%水性トリフルオロ酢酸中の0〜60%アセト
ニトリルの直線グラジェントを用いて、28〜50%ア
セトニトリル、特に29〜40%アセトニトリル、−層
特定的には約29〜36%アセトニトリル、−層特異的
に゛は30〜34%アセトニトリルの範囲内でμmボン
ダパック(Bondapak) C+aカラムから溶
出することを更に特徴とする。
ポリペプチドは少な(とも約15個のアミノ酸、−層普
通には少なくとも約20個のアミノ酸、そして約125
個よりも少ないアミノ酸、普通には約100個よりも少
ないアミノ酸をもつ。天然の化合物は、後記の実験の項
で説明するようにPAGIE又はゲル浸透クロマトグラ
フィーにおいて約7〜15kDa lの範囲内の分子量
をもつ。
通には少なくとも約20個のアミノ酸、そして約125
個よりも少ないアミノ酸、普通には約100個よりも少
ないアミノ酸をもつ。天然の化合物は、後記の実験の項
で説明するようにPAGIE又はゲル浸透クロマトグラ
フィーにおいて約7〜15kDa lの範囲内の分子量
をもつ。
ポリペプチド組成物は下記のアミノ酸配列の少なくとも
1つ、好ましくは下記のアミノ酸配列の少なくとも2つ
、−層好ましくは下記のアミノ酸配列の少なくとも3つ
をもつことを更に特徴とし、その場合にこの配列は3個
までのアミノ酸の挿入又は欠失又はその組み合わせによ
って保存されていてもよい。
1つ、好ましくは下記のアミノ酸配列の少なくとも2つ
、−層好ましくは下記のアミノ酸配列の少なくとも3つ
をもつことを更に特徴とし、その場合にこの配列は3個
までのアミノ酸の挿入又は欠失又はその組み合わせによ
って保存されていてもよい。
a、 Y aa” aa”^r K Q A T aa
’b、に讐DAW c、 A M aa’ A Y (X)X V E E
d、 T K P aa’ aa’ E E M L
F I Y aa” HY Ke、QATVGDINT
ERPGMLDf、QATVGDINTERPGMLD
FTGKg、KGTSKEDA 上記の配列において、 aa”は芳香族アミノ酸、特にフェニルアラニン及びヒ
スチジンであり; aabはいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アミノ酸であ
って、それは酸性、塩基性、又は中性でもよく、好まし
くは約3〜5個の炭素原子をもつ酸性又は中性アミノ酸
であり; aacはいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アミノ酸であ
ることができ、それは塩基性、酸性又は中性、−層特定
的には約5〜6個の炭素原子をもつ塩基性又は中性アミ
ノ酸であり; aa’は脂肪族中性アミノ酸であり、それは極性又は非
極性でもよく、特にヒドロキシル置換基及び約3〜4個
の炭素原子をもつものであり;aa”は脂肪族中性アミ
ノ酸であり、それは極性又は非極性でもよく、特にヒド
ロキシル置換基及び約2〜4個の炭素原子をもつもので
あり;aa’は脂肪族アミノ酸であり、それは中性極性
又は酸性でもよく、特に酸性アミノ酸又はそのアミドで
あって且つ4〜5個の炭素原子をもつものであり; Arは芳香族アミノ酸であって、チロシン、フェニルア
ラニン、ヒスチジン及びトリプトファン、特にYを包含
し; aaqは脂肪族アミノ酸、特に4〜6個の炭素原子をも
つ塩基性又は中性極性のアミノ酸であり、特に4〜5個
の炭素原子をもつ中性極性である時にはアミド基をもち
、即ちN及びQ、好ましくはKであり; Xは1〜3個のアミノ酸であり、それはいずれのアミノ
酸でもよく、特に脂肪族アミノ酸、−層特定的には第一
中性アミノ酸、第二酸性アミノ酸又はそのアミド、及び
第三塩基性アミノ酸をもつものであり;そして XはO又はlである。
’b、に讐DAW c、 A M aa’ A Y (X)X V E E
d、 T K P aa’ aa’ E E M L
F I Y aa” HY Ke、QATVGDINT
ERPGMLDf、QATVGDINTERPGMLD
FTGKg、KGTSKEDA 上記の配列において、 aa”は芳香族アミノ酸、特にフェニルアラニン及びヒ
スチジンであり; aabはいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アミノ酸であ
って、それは酸性、塩基性、又は中性でもよく、好まし
くは約3〜5個の炭素原子をもつ酸性又は中性アミノ酸
であり; aacはいずれかのアミノ酸、特に脂肪族アミノ酸であ
ることができ、それは塩基性、酸性又は中性、−層特定
的には約5〜6個の炭素原子をもつ塩基性又は中性アミ
ノ酸であり; aa’は脂肪族中性アミノ酸であり、それは極性又は非
極性でもよく、特にヒドロキシル置換基及び約3〜4個
の炭素原子をもつものであり;aa”は脂肪族中性アミ
ノ酸であり、それは極性又は非極性でもよく、特にヒド
ロキシル置換基及び約2〜4個の炭素原子をもつもので
あり;aa’は脂肪族アミノ酸であり、それは中性極性
又は酸性でもよく、特に酸性アミノ酸又はそのアミドで
あって且つ4〜5個の炭素原子をもつものであり; Arは芳香族アミノ酸であって、チロシン、フェニルア
ラニン、ヒスチジン及びトリプトファン、特にYを包含
し; aaqは脂肪族アミノ酸、特に4〜6個の炭素原子をも
つ塩基性又は中性極性のアミノ酸であり、特に4〜5個
の炭素原子をもつ中性極性である時にはアミド基をもち
、即ちN及びQ、好ましくはKであり; Xは1〜3個のアミノ酸であり、それはいずれのアミノ
酸でもよく、特に脂肪族アミノ酸、−層特定的には第一
中性アミノ酸、第二酸性アミノ酸又はそのアミド、及び
第三塩基性アミノ酸をもつものであり;そして XはO又はlである。
主題の発明の目的のため、種々のアミノ酸は多数のサブ
クラスに分けられる。下記の表はそのサブクラスを示し
ている: 脂肪族 中性 非極性 GAPVLI 極性 STCMNQ 酸性 DE 塩基性 KR 芳香族 FHYW 前記した生理学的特性をもち且つ下記のアミノ酸配列の
少なくとも1個を含むポリペプチドは特に興味のあるも
のである: a、 TKPaa’ DEIEMLFIYaa@HYK
QATaa’ Gb、 KWDAWaa’ aa’
Laa” aa″aa’ aa’ KEaa″AMaa
11+’lY (X)x VEE aa’ KKc、
KQATVGDINTERPGMLDFT上記の配列に
おいて、 aa’ 、 aa@、 889%及びArは前記で定義
した通りであり; aa’は脂肪族アミノ酸であり、それは特に約4〜6個
の炭素原子をもつ中性又は酸性、−層特定的には5〜6
個の炭素原子をもつ中性アミノ酸であることができ; aa’は脂肪族中性アミノ酸、特に、約3〜5個の、−
層普通には3〜4個の炭素原子をもち且つ特にヒドロキ
シル又はカルボキシアミド極性置換基をもつ極性アミノ
酸であり; aa’は脂肪族アミノ酸であり、それはヒドロキシル置
換基及び約3〜5個の炭素原子をもつ中性又は酸性、特
に極性又は酸性アミノ酸であることができ; aa’は脂肪族アミノ酸、特に、約2〜6個の炭素原子
をもつ中性又は塩基性アミノ酸、−層特定的には非極性
中性アミノ酸であり; aajは中性又は酸性のいずれかであり、中性である時
には好ましくは非極性であり、そして特に約2〜5個の
、−層普通には2〜4個の炭素原子をもつ脂肪族アミノ
酸であり; aa’は脂肪族中性アミノ酸、特に、約3〜5個、−層
普通には4〜5個の炭素原子をもち、カルコゲン(酸素
又は硫黄)官能基、特にヒドロキシル基又はメチルチオ
基をもつ極性アミノ酸であり;aa’ は脂肪族中性ア
ミノ酸、特にヒドロキシル官能基及び約3〜4個の炭素
原子をもつ極性アミノ酸であり; aa″″は4〜5個の炭素原子をもつ脂肪族酸性アミノ
酸であり; aa”は約3〜6個の炭素原子、特に4〜6個の炭素原
子をもつ脂肪族中性又は塩基性アミノ酸であり、この場
合に脂肪族中性アミノ酸は好ましくは非極性であり; aa’は脂肪族中性非極性又は極性アミノ酸、特に、3
〜6個の炭素原子をもつ非極性アミノ酸、好ましくはA
であり; aa”は3〜4個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性又
は極性アミノ酸であり、極性である時には、特にヒドロ
キシル基をもち、好ましくはAであり;X′はXと同じ
であり、普通には1〜3個のアミノ酸であり、それは脂
肪族アミノ酸であり、それは−船釣には4〜6個の炭素
原子をもつ中性、酸性又は塩基性であることができ、特
にN−C方向の順序で中性非極性、酸性又はそのアミド
、及び塩基性アミノ酸であり; Xは0又はlであり;そして aa’は脂肪族中性アミノ酸であり、それは特に約4〜
6個の、普通には5〜6個の炭素原子をもつ極性又は非
極性アミノ酸であることができ、極性アミノ酸である時
には、特にメチルチオ基をもつ。
クラスに分けられる。下記の表はそのサブクラスを示し
ている: 脂肪族 中性 非極性 GAPVLI 極性 STCMNQ 酸性 DE 塩基性 KR 芳香族 FHYW 前記した生理学的特性をもち且つ下記のアミノ酸配列の
少なくとも1個を含むポリペプチドは特に興味のあるも
のである: a、 TKPaa’ DEIEMLFIYaa@HYK
QATaa’ Gb、 KWDAWaa’ aa’
Laa” aa″aa’ aa’ KEaa″AMaa
11+’lY (X)x VEE aa’ KKc、
KQATVGDINTERPGMLDFT上記の配列に
おいて、 aa’ 、 aa@、 889%及びArは前記で定義
した通りであり; aa’は脂肪族アミノ酸であり、それは特に約4〜6個
の炭素原子をもつ中性又は酸性、−層特定的には5〜6
個の炭素原子をもつ中性アミノ酸であることができ; aa’は脂肪族中性アミノ酸、特に、約3〜5個の、−
層普通には3〜4個の炭素原子をもち且つ特にヒドロキ
シル又はカルボキシアミド極性置換基をもつ極性アミノ
酸であり; aa’は脂肪族アミノ酸であり、それはヒドロキシル置
換基及び約3〜5個の炭素原子をもつ中性又は酸性、特
に極性又は酸性アミノ酸であることができ; aa’は脂肪族アミノ酸、特に、約2〜6個の炭素原子
をもつ中性又は塩基性アミノ酸、−層特定的には非極性
中性アミノ酸であり; aajは中性又は酸性のいずれかであり、中性である時
には好ましくは非極性であり、そして特に約2〜5個の
、−層普通には2〜4個の炭素原子をもつ脂肪族アミノ
酸であり; aa’は脂肪族中性アミノ酸、特に、約3〜5個、−層
普通には4〜5個の炭素原子をもち、カルコゲン(酸素
又は硫黄)官能基、特にヒドロキシル基又はメチルチオ
基をもつ極性アミノ酸であり;aa’ は脂肪族中性ア
ミノ酸、特にヒドロキシル官能基及び約3〜4個の炭素
原子をもつ極性アミノ酸であり; aa″″は4〜5個の炭素原子をもつ脂肪族酸性アミノ
酸であり; aa”は約3〜6個の炭素原子、特に4〜6個の炭素原
子をもつ脂肪族中性又は塩基性アミノ酸であり、この場
合に脂肪族中性アミノ酸は好ましくは非極性であり; aa’は脂肪族中性非極性又は極性アミノ酸、特に、3
〜6個の炭素原子をもつ非極性アミノ酸、好ましくはA
であり; aa”は3〜4個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性又
は極性アミノ酸であり、極性である時には、特にヒドロ
キシル基をもち、好ましくはAであり;X′はXと同じ
であり、普通には1〜3個のアミノ酸であり、それは脂
肪族アミノ酸であり、それは−船釣には4〜6個の炭素
原子をもつ中性、酸性又は塩基性であることができ、特
にN−C方向の順序で中性非極性、酸性又はそのアミド
、及び塩基性アミノ酸であり; Xは0又はlであり;そして aa’は脂肪族中性アミノ酸であり、それは特に約4〜
6個の、普通には5〜6個の炭素原子をもつ極性又は非
極性アミノ酸であることができ、極性アミノ酸である時
には、特にメチルチオ基をもつ。
Xの他に更に、本発明のポリペプチド群の種々のメンバ
ー間に共通構造を維持するために1〜3個、好ましくは
1〜2個の挿入又は欠失があってもよいことが理解され
るであろう。又、アミノ酸は天然L−アミノ酸であるが
、ある場合には、D−アミノ酸が使用されてもよい。
ー間に共通構造を維持するために1〜3個、好ましくは
1〜2個の挿入又は欠失があってもよいことが理解され
るであろう。又、アミノ酸は天然L−アミノ酸であるが
、ある場合には、D−アミノ酸が使用されてもよい。
特に興味のある化合物は下記の式、又は下記の配列の範
囲内に入る少なくとも10個、普通には少なくとも15
個、好ましくは少なくとも25個のアミノ酸からなるそ
のフラグメント、特に前に特定した配列の1つ含むフラ
グメントをもつ:ψ−ZN−aa’−aa”−aa’−
aa’−aaS−aa’−aa’−aa’に−aa”−
aa”−aa”−aa”−aa14−P−aa”−aa
”E−aa”−M−L−aa”−aa”−Y−aa!5
−aa”aa”−に−Q−^−T−aa”−G−aa”
−aa”−aa36aa”−aa”−aa”−P−G−
aa”−aa4″−D−aa”aa”−G−aa”−a
a49−に−W−D−へ−W−aa”aa”−L−aa
”−aa”−aabo−aa6I−に−E−aa64A
−M−aa”−aa”−Y−(X)x −V4−Eaa
”−に−に−aa7h−aa”−aa”−aa”−Zc
上記の配列において、 ψはH原子又はアセチル基であり; ZNは結合又は1〜10個のアミノ酸、好ましくは1〜
9個のアミノ酸であり、そのアミノ酸は脂肪族又は芳香
族であることができ、この場合にその配列は配列 それによりそのような配列の範囲内の諸アミノ酸のいず
れの配列も、例えばE−A−A又はH−E−T−R等も
aa’ に結合することができ、またこの場合に、2個
のアミノ酸が同じ部位に記載されている場合にいずれか
のアミノ酸を選ぶことができ、好ましくは同じライン上
のアミノ酸が一緒に採用され;aa’・8・11は2〜
6個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性アミノ酸、特に
グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン及び
イソロイシンであり; aaS= 16+ !Sr 35+ 3?+ SS+
1+O+ 61+ blh フコ″フ9 は脂肪族中性
非極性又は極性アミノ酸であり、この場合に特にaa5
′Ib・z5・35°ff?・73・79がいずれかの
ものであり、そして残りが好ましくは極性アミノ酸、特
にセリン、スレオニン、システィン、メチオニン、アス
パラギン及びグルタミンであり: aal+6′?゛I ?+ 19+ 32+ 34+
38+ 56+ 5’l+ 64+ ?[lは脂肪族中
性アミノ酸(極性及び非極性アミノ酸を包含する)又は
脂肪族酸性アミノ酸、即ちアスパラギン酸及びグルタミ
ン酸であり;特にa a + + 7 + 32°34
+ 59−78は中性アミノ酸である時に非極性であり
、残りは中性アミノ酸である時に極性であり、そしてま
たaa’°6°?゛l ?19+ 34+ 311+
56+ 64 は好ましくは酸性アミノ酸であり; a a 2 + I O+ l :I+ 23+
25+ Zb+ 21+ ’42+ 43+ 4
S+ 49・ 77は脂肪族中性アミノ酸又は芳香族ア
ミノ酸、特にフェニルアラニン、ヒスチジン、チロシン
、及びトリプトファンであり、好ましくは、aa”・I
ll・26+ 21・45・77は好ましくは芳香族ア
ミノ酸であり、一方残りのアミノ酸は好ましくは脂肪族
アミノ酸であり;aa319+ l Z+ 14+ 3
6+ 39+ 4b+ 4th S日°67°76は脂
肪族中性又は塩基性アミノ酸、即ちリジン及びアルギニ
ンであり、この場合にaa’・58°67°76は塩基
性以外の時に好ましくは非極性であり、そして残りは塩
基性以外の時に好ましくは極性であり、但しa a a
&は極性でも非極性でもよく、そしてaa’・12・
目・39・4き・58”67・ハは好ましくは塩基性ア
ミノ酸であり;a a 2 tは塩基性又は芳香族、特
にフェニルアラニンであり; X及びXは前記で定義した通りであり、そしてzcはO
H、NHg 、又は1〜6個の、普通には1〜4個のア
ミノ酸の、特に2〜6個の、普通には4〜6個のアミノ
酸の、特に極性又は非極性アミノ酸の配列、特に配列M
−P−M−Tの範囲内の配列である。
囲内に入る少なくとも10個、普通には少なくとも15
個、好ましくは少なくとも25個のアミノ酸からなるそ
のフラグメント、特に前に特定した配列の1つ含むフラ
グメントをもつ:ψ−ZN−aa’−aa”−aa’−
aa’−aaS−aa’−aa’−aa’に−aa”−
aa”−aa”−aa”−aa14−P−aa”−aa
”E−aa”−M−L−aa”−aa”−Y−aa!5
−aa”aa”−に−Q−^−T−aa”−G−aa”
−aa”−aa36aa”−aa”−aa”−P−G−
aa”−aa4″−D−aa”aa”−G−aa”−a
a49−に−W−D−へ−W−aa”aa”−L−aa
”−aa”−aabo−aa6I−に−E−aa64A
−M−aa”−aa”−Y−(X)x −V4−Eaa
”−に−に−aa7h−aa”−aa”−aa”−Zc
上記の配列において、 ψはH原子又はアセチル基であり; ZNは結合又は1〜10個のアミノ酸、好ましくは1〜
9個のアミノ酸であり、そのアミノ酸は脂肪族又は芳香
族であることができ、この場合にその配列は配列 それによりそのような配列の範囲内の諸アミノ酸のいず
れの配列も、例えばE−A−A又はH−E−T−R等も
aa’ に結合することができ、またこの場合に、2個
のアミノ酸が同じ部位に記載されている場合にいずれか
のアミノ酸を選ぶことができ、好ましくは同じライン上
のアミノ酸が一緒に採用され;aa’・8・11は2〜
6個の炭素原子をもつ脂肪族中性非極性アミノ酸、特に
グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン及び
イソロイシンであり; aaS= 16+ !Sr 35+ 3?+ SS+
1+O+ 61+ blh フコ″フ9 は脂肪族中性
非極性又は極性アミノ酸であり、この場合に特にaa5
′Ib・z5・35°ff?・73・79がいずれかの
ものであり、そして残りが好ましくは極性アミノ酸、特
にセリン、スレオニン、システィン、メチオニン、アス
パラギン及びグルタミンであり: aal+6′?゛I ?+ 19+ 32+ 34+
38+ 56+ 5’l+ 64+ ?[lは脂肪族中
性アミノ酸(極性及び非極性アミノ酸を包含する)又は
脂肪族酸性アミノ酸、即ちアスパラギン酸及びグルタミ
ン酸であり;特にa a + + 7 + 32°34
+ 59−78は中性アミノ酸である時に非極性であり
、残りは中性アミノ酸である時に極性であり、そしてま
たaa’°6°?゛l ?19+ 34+ 311+
56+ 64 は好ましくは酸性アミノ酸であり; a a 2 + I O+ l :I+ 23+
25+ Zb+ 21+ ’42+ 43+ 4
S+ 49・ 77は脂肪族中性アミノ酸又は芳香族ア
ミノ酸、特にフェニルアラニン、ヒスチジン、チロシン
、及びトリプトファンであり、好ましくは、aa”・I
ll・26+ 21・45・77は好ましくは芳香族ア
ミノ酸であり、一方残りのアミノ酸は好ましくは脂肪族
アミノ酸であり;aa319+ l Z+ 14+ 3
6+ 39+ 4b+ 4th S日°67°76は脂
肪族中性又は塩基性アミノ酸、即ちリジン及びアルギニ
ンであり、この場合にaa’・58°67°76は塩基
性以外の時に好ましくは非極性であり、そして残りは塩
基性以外の時に好ましくは極性であり、但しa a a
&は極性でも非極性でもよく、そしてaa’・12・
目・39・4き・58”67・ハは好ましくは塩基性ア
ミノ酸であり;a a 2 tは塩基性又は芳香族、特
にフェニルアラニンであり; X及びXは前記で定義した通りであり、そしてzcはO
H、NHg 、又は1〜6個の、普通には1〜4個のア
ミノ酸の、特に2〜6個の、普通には4〜6個のアミノ
酸の、特に極性又は非極性アミノ酸の配列、特に配列M
−P−M−Tの範囲内の配列である。
1個以上の共通アミノ酸を変えることができ(9通には
3個以上の変更を伴わない)、そしてその共通配列での
アミノ酸の挿入又は欠失は、Xとして示した以外の3個
まで、好ましくは2個以下のアミノ酸までであることが
必要であることが理解される。
3個以上の変更を伴わない)、そしてその共通配列での
アミノ酸の挿入又は欠失は、Xとして示した以外の3個
まで、好ましくは2個以下のアミノ酸までであることが
必要であることが理解される。
興味のあるポリペプチドは下記の配列中に含まれた少な
くとも15個、好ましくは少なくとも30個のアミノ酸
を配列中にもつ: E R 上記の配列において、いずれかの部位にあるいずれかの
アミノ酸はその部位の他のいずれかのアミノ酸で置換さ
れてもよく、好ましくは上方のアミノ酸は一緒に採用さ
れ、一方下方のアミノ酸は一緒に採用され、−層好まし
くは同じライン上のアミノ酸は一緒に採用され、そして
星印(*)は結合(その部位にアミノ酸がないこと)を
意図しており、そして2は0又はlである。その配列は
合計で10個までの、普通には合計で8個までのアミノ
酸によって延長されてもよく、その場合にはN−末端は
追加の配列V−トE−T−R又はそれのいずれかの部分
をもつことができ、そしてC−末端は配列M−P−M−
T又はそれのいずれかの部分をもつことができる。
くとも15個、好ましくは少なくとも30個のアミノ酸
を配列中にもつ: E R 上記の配列において、いずれかの部位にあるいずれかの
アミノ酸はその部位の他のいずれかのアミノ酸で置換さ
れてもよく、好ましくは上方のアミノ酸は一緒に採用さ
れ、一方下方のアミノ酸は一緒に採用され、−層好まし
くは同じライン上のアミノ酸は一緒に採用され、そして
星印(*)は結合(その部位にアミノ酸がないこと)を
意図しており、そして2は0又はlである。その配列は
合計で10個までの、普通には合計で8個までのアミノ
酸によって延長されてもよく、その場合にはN−末端は
追加の配列V−トE−T−R又はそれのいずれかの部分
をもつことができ、そしてC−末端は配列M−P−M−
T又はそれのいずれかの部分をもつことができる。
特に興味のあるポリペプチドとしては、少なくとも約1
5個、好ましくは少なくとも約20個、−層好ましくは
少なくとも約30個のアミノ酸をもち、下記の配列の1
つに含まれるポリペプチドがあり、その場合にそのよう
な配列は少なくとも10個、好ましくは少なくとも12
個、そして−層好ましくは少なくとも15個の、星印(
*)で示したアミノ酸を含む(b=ウシ、h=ヒト)。
5個、好ましくは少なくとも約20個、−層好ましくは
少なくとも約30個のアミノ酸をもち、下記の配列の1
つに含まれるポリペプチドがあり、その場合にそのよう
な配列は少なくとも10個、好ましくは少なくとも12
個、そして−層好ましくは少なくとも15個の、星印(
*)で示したアミノ酸を含む(b=ウシ、h=ヒト)。
本本本 本 本* *本 *傘*傘D−A−W
−S−S−L−G−D−M−T−に−E−E−A−M−
I−A−Y−V−E−本 本 本 E−M−に−に−1−L−E−T−M−P−1−T寧* に−に−に−Y−G−1 * * に−に−に−Y−G−1 本発明の特に好ましい組成物については、上記の諸配列
が、約5個よりも多いアミノ酸が挿入され、欠失されも
しくは置換されて、又はそれらの組み合せによって、変
更されていることがなく、好ましくは変更は約3個以下
のアミノ酸によってである。
−S−S−L−G−D−M−T−に−E−E−A−M−
I−A−Y−V−E−本 本 本 E−M−に−に−1−L−E−T−M−P−1−T寧* に−に−に−Y−G−1 * * に−に−に−Y−G−1 本発明の特に好ましい組成物については、上記の諸配列
が、約5個よりも多いアミノ酸が挿入され、欠失されも
しくは置換されて、又はそれらの組み合せによって、変
更されていることがなく、好ましくは変更は約3個以下
のアミノ酸によってである。
EBZD&l成物は少なくとも約20%の純度、−層普
通には少なくとも約30%の純度、好ましくは少なくと
も約80%の純度、−層好ましくは少なくとも約95%
の純度、望ましくは100%の純度である。
通には少なくとも約30%の純度、好ましくは少なくと
も約80%の純度、−層好ましくは少なくとも約95%
の純度、望ましくは100%の純度である。
それが由来する組織からの成分を実質的に含まず、由来
組織からの成分が1重量%未満、好ましくは約°0.1
重量%未満、−層好ましくは約o、ooi重量%未満で
あるEBZD組成物は特に興味がある。本発明のEBZ
D組成物は、後記の実験の項で記載するアッセイ条件下
で粗シナブトソープ膜への3H−ジアゼパムの結合を4
0%競争に必要な量によって測定して、少なくとも15
ユニツト/■の比活性をもつ。
組織からの成分が1重量%未満、好ましくは約°0.1
重量%未満、−層好ましくは約o、ooi重量%未満で
あるEBZD組成物は特に興味がある。本発明のEBZ
D組成物は、後記の実験の項で記載するアッセイ条件下
で粗シナブトソープ膜への3H−ジアゼパムの結合を4
0%競争に必要な量によって測定して、少なくとも15
ユニツト/■の比活性をもつ。
比活性は普通には少な(とも500ユニツト/■、好ま
しくは少なくとも約1000ユニツト/■であり、そし
て1250ユニット/■以上であってもよい。−船釣に
は、松果体、脈絡叢、脳橋、及び視神経中の湿った組織
1g当り少なくとも約lOI!g当量あり、そして普通
には脈絡最中の湿った&l[1g当り少なくとも約2O
n当量ある。前記したように、本発明の化合物は心臓細
胞集合体の収縮において心臓収縮度数に影響を及ぼすこ
とができ、少ない投与量では心臓収縮度数を低下させ、
この少ない投与量は一般的には約150pg/11未満
である(実験の項を参照のこと)。EBZDのその他の
特徴は、生理学的活性がEBZDについて立証される種
々の試験から明らかである。
しくは少なくとも約1000ユニツト/■であり、そし
て1250ユニット/■以上であってもよい。−船釣に
は、松果体、脈絡叢、脳橋、及び視神経中の湿った組織
1g当り少なくとも約lOI!g当量あり、そして普通
には脈絡最中の湿った&l[1g当り少なくとも約2O
n当量ある。前記したように、本発明の化合物は心臓細
胞集合体の収縮において心臓収縮度数に影響を及ぼすこ
とができ、少ない投与量では心臓収縮度数を低下させ、
この少ない投与量は一般的には約150pg/11未満
である(実験の項を参照のこと)。EBZDのその他の
特徴は、生理学的活性がEBZDについて立証される種
々の試験から明らかである。
■四予
脳因子は少なくとも2kDal、−if通には少なくと
も5kDa!そして約25kDa 1以下、−層普通に
は約22kDa I以下であることを特徴とする。脳因
子は、細胞増殖調節アッセイによって立証されるように
、少なくとも約1×103、−層普通には少なくとも約
5X10’、好ましくは少な(とも約106、好ましく
は少なくとも約1.5X40’の比活性をもつ。
も5kDa!そして約25kDa 1以下、−層普通に
は約22kDa I以下であることを特徴とする。脳因
子は、細胞増殖調節アッセイによって立証されるように
、少なくとも約1×103、−層普通には少なくとも約
5X10’、好ましくは少な(とも約106、好ましく
は少なくとも約1.5X40’の比活性をもつ。
脳因子は普通には少なくとも約10%の純度、−層普通
には少なくとも約50%の純度、好ましくは少な(とも
約80%の純度、−層好ましくは少なくとも約95%の
純度、望ましくは100%の純度である。
には少なくとも約50%の純度、好ましくは少な(とも
約80%の純度、−層好ましくは少なくとも約95%の
純度、望ましくは100%の純度である。
特に、脳因子が、それを単離する由来組織からの成分、
例えば細胞破片、その他の蛋白質、サツカライド、脂質
、それらの組み合せ、等を実質的に含まないことが望ま
しい。
例えば細胞破片、その他の蛋白質、サツカライド、脂質
、それらの組み合せ、等を実質的に含まないことが望ま
しい。
脳因子の配列は、N−末端近(に又はN−末端に実質的
に下記のアミノ酸配列をもつ配列を含む:N−に−E−
L−D−P−V−(1−に−L−F−V−D−に−1−
χ−E−Y上記の配列においてXは任意のアミノ酸を示
す。
に下記のアミノ酸配列をもつ配列を含む:N−に−E−
L−D−P−V−(1−に−L−F−V−D−に−1−
χ−E−Y上記の配列においてXは任意のアミノ酸を示
す。
脳因子はヒトT細胞の応答を抑制し、そして自己免疫又
は器官移植組織をもつ宿主の治療のための免疫調節剤と
しての用途があり、単独で、又はその他の免疫抑制剤、
例えばシクロスポリンA又はコルチコステロイドとの併
用で用いられる。
は器官移植組織をもつ宿主の治療のための免疫調節剤と
しての用途があり、単独で、又はその他の免疫抑制剤、
例えばシクロスポリンA又はコルチコステロイドとの併
用で用いられる。
普通には、脳因子の配列は上記の配列に対して数で少な
くとも65%、好ましくは少なくとも約75%相同であ
る(個数での%は、欠失、挿入、及び変異を相加的差と
して計算することを意図している)。
くとも65%、好ましくは少なくとも約75%相同であ
る(個数での%は、欠失、挿入、及び変異を相加的差と
して計算することを意図している)。
本発明の脳因子は細胞増殖の抑制及び軟寒天ココニー形
成の抑制においても活性を有する。従って、本発明の化
合物はインビトロ及びインビボにおいて新生物細胞の増
殖を抑制するための用途を有し、一方、正常細胞にほと
んど影響を及ぼさず、通常は新生物細胞と正常細胞との
間を少なくとも1桁の、好ましくは少なくとも2桁のオ
ーダーで識別することができる。
成の抑制においても活性を有する。従って、本発明の化
合物はインビトロ及びインビボにおいて新生物細胞の増
殖を抑制するための用途を有し、一方、正常細胞にほと
んど影響を及ぼさず、通常は新生物細胞と正常細胞との
間を少なくとも1桁の、好ましくは少なくとも2桁のオ
ーダーで識別することができる。
胆1亘i
膜蛋白質はほとんどの場合について下記の配列をもつ:
Phe Gly Asn Val Asp Pro A
rg Leu Arg Ser −ITTCGGG
AAT GTT GAT CCG CGG
CTG CGCTCC6’+Ser Trp
Cys Cys (:ys Gys 1.;
ys Leu lle Pro ztAG
CTGG TGCTGCTGCTGCTGCCTG A
TT CCA 12−AUI lし^ ししら ljA しし八 lシ■ 1’[i(i UG CC TC Fl:i’/ 、L起U:ウシの脳に由来するcDNAクローンのヌク
レオチド配列及び推定されたアミノ酸配列(*)。アミ
ノ酸残基は提案された開始メチオニンとの関係で番号づ
けされている。EBZDと相同な領域は太線によって上
に線引きされており、そして疎水性及び非荷電のアミノ
酸の延長領域は細線で線引きされている。潜在的なグリ
コジル化部位は囲まれている。
rg Leu Arg Ser −ITTCGGG
AAT GTT GAT CCG CGG
CTG CGCTCC6’+Ser Trp
Cys Cys (:ys Gys 1.;
ys Leu lle Pro ztAG
CTGG TGCTGCTGCTGCTGCCTG A
TT CCA 12−AUI lし^ ししら ljA しし八 lシ■ 1’[i(i UG CC TC Fl:i’/ 、L起U:ウシの脳に由来するcDNAクローンのヌク
レオチド配列及び推定されたアミノ酸配列(*)。アミ
ノ酸残基は提案された開始メチオニンとの関係で番号づ
けされている。EBZDと相同な領域は太線によって上
に線引きされており、そして疎水性及び非荷電のアミノ
酸の延長領域は細線で線引きされている。潜在的なグリ
コジル化部位は囲まれている。
それ故にペプチドは数で上記配列の少なくとも約60%
、−層普通には少なくとも約75%、そして好ましくは
少なくとも約95%をもつ。EBZDとの相同性をもつ
、太線の引かれた配列は特に興味がある。その蛋白質は
少なくとも約10%の純度、好ましくは少なくとも約5
0%の純度、−層好ましくは少な(とも約80%の純度
、そして特に好ましくは少な(とも約95%の純度、望
ましくは純粋であることを更に特徴とする。その化合物
は望ましくはそれの由来する組織からの成分を含まない
。
、−層普通には少なくとも約75%、そして好ましくは
少なくとも約95%をもつ。EBZDとの相同性をもつ
、太線の引かれた配列は特に興味がある。その蛋白質は
少なくとも約10%の純度、好ましくは少なくとも約5
0%の純度、−層好ましくは少な(とも約80%の純度
、そして特に好ましくは少な(とも約95%の純度、望
ましくは純粋であることを更に特徴とする。その化合物
は望ましくはそれの由来する組織からの成分を含まない
。
膜蛋白質は主として脳組織中に見いだされることを更に
特徴とする。
特徴とする。
興味のある追加の蛋白質は上記蛋白質のフラグメントと
して含まれ、それはヌクレオチド170の又はヌクレオ
チド270又は273のメチオニンで始まるポリペプチ
ドを含む。
して含まれ、それはヌクレオチド170の又はヌクレオ
チド270又は273のメチオニンで始まるポリペプチ
ドを含む。
本発明のポリペプチドは抗体の生産のための抗原として
用いることができ、そしてこの抗体は今度は抗イデイオ
タイプ抗体の生産のための抗原として用いることができ
る。慣用の方法に従ってポリクロナール抗体又はモノク
ロナール抗体のいずれかを調製することができる。本発
明のポリペプチド又はそれのフラグメント、−船釣には
少なくとも約15個のアミノ酸をもつフラグメントはそ
れ自体で使用することができるが、しかし好ましくは、
免疫系を活性化するアジュバント又は抗原に結合させら
れる。種々の抗原、例えば、血清アルブミン、キーホー
ルリンベット(keyhole limpet)ヘモシ
アニン、グロブリン、等を用いることができる。ポリペ
プチドに結合させるのに広範囲の種々の技術、例えばグ
ルタルアルデヒド、マレイミド安息香酸、ジアゾ安息香
酸等を利用することができる。アジュバントとしてはフ
ロイント(Freund)アジュバント、水酸化アルミ
ニウム、等がある。
用いることができ、そしてこの抗体は今度は抗イデイオ
タイプ抗体の生産のための抗原として用いることができ
る。慣用の方法に従ってポリクロナール抗体又はモノク
ロナール抗体のいずれかを調製することができる。本発
明のポリペプチド又はそれのフラグメント、−船釣には
少なくとも約15個のアミノ酸をもつフラグメントはそ
れ自体で使用することができるが、しかし好ましくは、
免疫系を活性化するアジュバント又は抗原に結合させら
れる。種々の抗原、例えば、血清アルブミン、キーホー
ルリンベット(keyhole limpet)ヘモシ
アニン、グロブリン、等を用いることができる。ポリペ
プチドに結合させるのに広範囲の種々の技術、例えばグ
ルタルアルデヒド、マレイミド安息香酸、ジアゾ安息香
酸等を利用することができる。アジュバントとしてはフ
ロイント(Freund)アジュバント、水酸化アルミ
ニウム、等がある。
抗原を慣用の量で適切な宿主中に注入し、この場合に2
〜4週間の間隔で1回以上の追加免疫注射を行なう。モ
ノクロナール抗体を用いる場合には、通常は原免疫及び
追加免疫との注射をマウスに行い、その肺臓を単離し、
その肺臓細胞を慣用の技術に従って適切な融合パートナ
−と融合させる。
〜4週間の間隔で1回以上の追加免疫注射を行なう。モ
ノクロナール抗体を用いる場合には、通常は原免疫及び
追加免疫との注射をマウスに行い、その肺臓を単離し、
その肺臓細胞を慣用の技術に従って適切な融合パートナ
−と融合させる。
例えば、Ga1fer等、Nature(1977)
266:550;にennett等、Current
To tcs in Microbiolo and
Immu赳旦■(19B?)氾377;米国特許第4
,381,292号及び第4.363,799号を参照
のこと。しかしながら、特定の目的に対しては、その他
の哺乳動物、例えば霊長類(例えばヒト)を、ヒトFc
tJ[をもつ抗体の生産のために、用いることができる
。
266:550;にennett等、Current
To tcs in Microbiolo and
Immu赳旦■(19B?)氾377;米国特許第4
,381,292号及び第4.363,799号を参照
のこと。しかしながら、特定の目的に対しては、その他
の哺乳動物、例えば霊長類(例えばヒト)を、ヒトFc
tJ[をもつ抗体の生産のために、用いることができる
。
EBZDポリペプチド及びEBZDポリペプチドに特異
的に結合する抗体は、個々に又は−緒にして、インビボ
及びインビトロの両方に用途がある。主題の化合物はジ
アゼパムレセプターへの結合のためのアゴニストとして
用いることができる。本発明の化合物は、ジアゼパムレ
セプターの数及び分布を求めるのに用いることができる
。加えて、本発明の化合物は哺乳動物宿主の心臓拍動を
調節するのに、哺乳動物宿主を鎮静させるのに、又は哺
乳動物宿主に興奮を引き起させるのに用いられる。
的に結合する抗体は、個々に又は−緒にして、インビボ
及びインビトロの両方に用途がある。主題の化合物はジ
アゼパムレセプターへの結合のためのアゴニストとして
用いることができる。本発明の化合物は、ジアゼパムレ
セプターの数及び分布を求めるのに用いることができる
。加えて、本発明の化合物は哺乳動物宿主の心臓拍動を
調節するのに、哺乳動物宿主を鎮静させるのに、又は哺
乳動物宿主に興奮を引き起させるのに用いられる。
脳因子ポリペプチド及び脳因子ポリペプチドに特異的に
結合する抗体は、個々に又は−緒になって、インビボ及
びインビトロの両方で用途がある。
結合する抗体は、個々に又は−緒になって、インビボ及
びインビトロの両方で用途がある。
このポリペプチドは腫瘍抑制特性をもっているので、こ
のポリペプチドは、Ill瘍細胞の過度の増殖を抑制す
るために、正常細胞及び腫瘍発生細胞の両方を含む細胞
混合物と共に用いることができる。
のポリペプチドは、Ill瘍細胞の過度の増殖を抑制す
るために、正常細胞及び腫瘍発生細胞の両方を含む細胞
混合物と共に用いることができる。
それ故に本発明の化合物は下記の場合のような状態で用
いることができる:正常細胞を突然変異させる場合、こ
の場合には突然変異の発生の結果として正常細胞及び腫
瘍発生細胞で生じる差異を区別することが望まれる;骨
髄が哺乳動物宿主からとり出されている場合に腫瘍発生
細胞の増殖を抑制する場合;細胞集団中の該ポリペプチ
ドについての結合部位を検知する場合、等。この脳因子
ポリペプチドはT細胞を他の細胞から区別するか又はと
り出すために用いることができる。
いることができる:正常細胞を突然変異させる場合、こ
の場合には突然変異の発生の結果として正常細胞及び腫
瘍発生細胞で生じる差異を区別することが望まれる;骨
髄が哺乳動物宿主からとり出されている場合に腫瘍発生
細胞の増殖を抑制する場合;細胞集団中の該ポリペプチ
ドについての結合部位を検知する場合、等。この脳因子
ポリペプチドはT細胞を他の細胞から区別するか又はと
り出すために用いることができる。
脳因子ポリペプチドは、腫瘍中に注入するか、リポソー
ム中に封入する(この場合にリポソームは腫瘍細胞に対
する特異的な又は優先的な抗体に結合していてもよい)
か、等によって、腫瘍細胞の増殖を抑制するために生体
内で用いることができる。他の方法としては、本発明の
ポリペプチドは免疫調節剤として用いることができる。
ム中に封入する(この場合にリポソームは腫瘍細胞に対
する特異的な又は優先的な抗体に結合していてもよい)
か、等によって、腫瘍細胞の増殖を抑制するために生体
内で用いることができる。他の方法としては、本発明の
ポリペプチドは免疫調節剤として用いることができる。
このポリペプチドは、ポリペプチドについての診断にお
いて、それ自体で又は抗体との組み合せで用いることが
できる。診断アッセイでの使用のためにそのいずれか又
は両方がラベルされ又はラベルされないであろう。多数
の診断アッセイが文献に記載されており、該ポリペプチ
ド、又は抗体への種々のラベル、例えば酵素、放射性核
種、フルオレッサー、基質、補酵素、粒子(例えば磁性
粒子)等の直接又は間接のいずれかでの結合を含む。こ
れらのアッセイの例示としては、例えば米国特許第3,
817,837号、第3.850.752号、第4.1
74,384号、第4,277.437号及び第4,3
74.925号を参照のこと。
いて、それ自体で又は抗体との組み合せで用いることが
できる。診断アッセイでの使用のためにそのいずれか又
は両方がラベルされ又はラベルされないであろう。多数
の診断アッセイが文献に記載されており、該ポリペプチ
ド、又は抗体への種々のラベル、例えば酵素、放射性核
種、フルオレッサー、基質、補酵素、粒子(例えば磁性
粒子)等の直接又は間接のいずれかでの結合を含む。こ
れらのアッセイの例示としては、例えば米国特許第3,
817,837号、第3.850.752号、第4.1
74,384号、第4,277.437号及び第4,3
74.925号を参照のこと。
種々のアッセイ法がホモゲニアスイムノアッセイ及びヘ
テロゲニアスイムノアッセイに分けられ、この場合その
区別はポリペプチドとその抗体との間の複合体をその特
定の結合対の複合体にならなかったものから分離しなけ
ればならないかどうかに依存する。種々のアッセイ法は
EIA 、 ELISA 。
テロゲニアスイムノアッセイに分けられ、この場合その
区別はポリペプチドとその抗体との間の複合体をその特
定の結合対の複合体にならなかったものから分離しなけ
ればならないかどうかに依存する。種々のアッセイ法は
EIA 、 ELISA 。
RIA 、ホモゲニアスEIA 、 ドツト−プロッ
ト、ウエスターンズ(Westerns)等と称される
。
ト、ウエスターンズ(Westerns)等と称される
。
本発明のポリペプチドに対する抗体は抗イデイオタイプ
を生産するために抗原としてそれ自体で用いることがで
き、この抗イデイオタイプは競合抗原として役立つこと
ができ、該ポリペプチドのエピトープ部位と競合するエ
ピトープ部位をもつ。
を生産するために抗原としてそれ自体で用いることがで
き、この抗イデイオタイプは競合抗原として役立つこと
ができ、該ポリペプチドのエピトープ部位と競合するエ
ピトープ部位をもつ。
それ故に、これらの抗イデイオタイプはジアゼパムアゴ
ニストとして、腫瘍抑制剤として、主題のポリペプチド
の代用品として、又は主題のポリペプチドに対するアン
タゴニストとして役立つことができる。
ニストとして、腫瘍抑制剤として、主題のポリペプチド
の代用品として、又は主題のポリペプチドに対するアン
タゴニストとして役立つことができる。
上記のポリペプチドは、天然源に由来する天然ポリペプ
チド群、並びに結合特異性のような生理学的特性、例え
ばジアゼパムレセプター及び腫瘍細胞阻害、を共有する
非天然ポリペプチドの群を形成する。天然化合物は天然
源、主として脳組織から得ることができる。しかしなが
ら、本発明の天然組成物は多数の種々の組織、例えば肺
臓及び精巣中に見いだすことができる。
チド群、並びに結合特異性のような生理学的特性、例え
ばジアゼパムレセプター及び腫瘍細胞阻害、を共有する
非天然ポリペプチドの群を形成する。天然化合物は天然
源、主として脳組織から得ることができる。しかしなが
ら、本発明の天然組成物は多数の種々の組織、例えば肺
臓及び精巣中に見いだすことができる。
本発明の化合物を単離するために、脳組織から血餅を排
除し、ホモジナイズし、酸性(pH< 4 )条件下で
有機溶剤で抽出し、そして透析して実質的に約4kDa
1未満である低分子量物質を除去する。
除し、ホモジナイズし、酸性(pH< 4 )条件下で
有機溶剤で抽出し、そして透析して実質的に約4kDa
1未満である低分子量物質を除去する。
その生成物を次いでゲル浸透カラム及び約35〜45%
アセトニトリルを含有する0、1%トリフルオロ酢酸水
溶液溶離剤を用いて処理して、その生成物の活性の抑制
剤として作用するらしい化合物を排除する。その諸両分
をバイオアッセイによって観察する。その生成したEB
ZD画分を、逆相高圧液体クロマトグラフィーカラム、
例えば、μmボンダパック−C1llカラムを用い、水
性0.1%トリフルオロ酢酸中の約0〜60%アセトニ
トリルの線状グラジェントを用い、そして長いカラム及
び遅い溶出速度、例えば4時間以上、好ましくは5時間
以上を用いて更に精製した。本発明のEBZD化合物は
約30〜50%アクリロニトリル、−層特定的には30
〜40%アクリロニトリルの両分中に見いだされる。
アセトニトリルを含有する0、1%トリフルオロ酢酸水
溶液溶離剤を用いて処理して、その生成物の活性の抑制
剤として作用するらしい化合物を排除する。その諸両分
をバイオアッセイによって観察する。その生成したEB
ZD画分を、逆相高圧液体クロマトグラフィーカラム、
例えば、μmボンダパック−C1llカラムを用い、水
性0.1%トリフルオロ酢酸中の約0〜60%アセトニ
トリルの線状グラジェントを用い、そして長いカラム及
び遅い溶出速度、例えば4時間以上、好ましくは5時間
以上を用いて更に精製した。本発明のEBZD化合物は
約30〜50%アクリロニトリル、−層特定的には30
〜40%アクリロニトリルの両分中に見いだされる。
BF化合物含有画分を、逆相HPLCを用い、0.1%
水性アセトニトリルの直線グラジェントを用い、32〜
36%アセトニトリルで溶離し、このプロセスを1回以
上繰り返して、更に精製する。この濃縮された両分を次
いで、逆相HPLCを用い、0.1%水性n〜プロパツ
ールの直線グラジェントを用い、約22〜24%n−プ
ロパツールで溶離し、このプロセスを1回以上繰り返し
て、更に精製する。
水性アセトニトリルの直線グラジェントを用い、32〜
36%アセトニトリルで溶離し、このプロセスを1回以
上繰り返して、更に精製する。この濃縮された両分を次
いで、逆相HPLCを用い、0.1%水性n〜プロパツ
ールの直線グラジェントを用い、約22〜24%n−プ
ロパツールで溶離し、このプロセスを1回以上繰り返し
て、更に精製する。
他の方法として、本発明のポリペプチドは、特にポリペ
プチドが30個未満のアミノ酸、−層特定的には25個
未満のアミノ酸の場合に、公知の技術に従って合成する
ことができる。例えば、Barany及びMerrif
ield、 5olid−Phase Pe tide
S nthesis。
プチドが30個未満のアミノ酸、−層特定的には25個
未満のアミノ酸の場合に、公知の技術に従って合成する
ことができる。例えば、Barany及びMerrif
ield、 5olid−Phase Pe tide
S nthesis。
“The Peptides、 Analysis 5
ynthesis Biology 。
ynthesis Biology 。
5pecial Methods in Pep
tide 5ynthesis、 Part A
。
tide 5ynthesis、 Part A
。
Vol、 2+ Gross及びMerenhofer
lii、 Academic Press(米国) 1
980. 1〜284頁を参照のこと。
lii、 Academic Press(米国) 1
980. 1〜284頁を参照のこと。
比較的大きなポリペプチド、特に約20個以上のアミノ
酸をもつもの、−層特定的には約30個のアミノ酸をも
つものについては、そのポリペプチドをコードする配列
を得るためにハイブリッドDNA技術を用いることがで
き、それは次いで公知の方法に従って所望のポリペプチ
ドの発現に用いることができる。ポリペプチドをコード
するためにゲノムDNA、 cDNA、合成りNA又は
それらの組み合せを用いることができ、いずれかのイン
トロンの存在はそのイントロンのための機能的スプライ
シング系をもつ宿主細胞を用いることによって解決され
る。はとんどの場合において、オープンリーディングフ
レームが用いられ(イントロンなし)、この場合にその
リーディングフレームをコードする配列は発現宿主中で
機能する転写及び翻訳調節シグナルに連結される。
酸をもつもの、−層特定的には約30個のアミノ酸をも
つものについては、そのポリペプチドをコードする配列
を得るためにハイブリッドDNA技術を用いることがで
き、それは次いで公知の方法に従って所望のポリペプチ
ドの発現に用いることができる。ポリペプチドをコード
するためにゲノムDNA、 cDNA、合成りNA又は
それらの組み合せを用いることができ、いずれかのイン
トロンの存在はそのイントロンのための機能的スプライ
シング系をもつ宿主細胞を用いることによって解決され
る。はとんどの場合において、オープンリーディングフ
レームが用いられ(イントロンなし)、この場合にその
リーディングフレームをコードする配列は発現宿主中で
機能する転写及び翻訳調節シグナルに連結される。
特に興味のあるcDNAとしてはEBZDについて得ら
れるcDNAがある。このcDNAは開始のメチオニン
がら約120bpまでの上流及び翻訳終結シグナルから
下流のポリ(A)+テールを含む約225bpを含む。
れるcDNAがある。このcDNAは開始のメチオニン
がら約120bpまでの上流及び翻訳終結シグナルから
下流のポリ(A)+テールを含む約225bpを含む。
下記はヒト及びウシcDNA配列を示している。
5’ −GAGCACCGGTGGAにAにGCCTA
AGGTTGCGCTTCG − ael ↓ )find m 7 TTTGGCTGCCA−GCCATTCATTTCA
CCTAAACTGATTTA 434−−−−−
T−A−TGT−−−−−GTG−−−AT−−−−−
−−−−−GACATGCCTTGTTTTT−CT^
^TACTGGGGATGAAGTTCATA^−一−
−−〜−−〜−−TT−−−−−−−C−T−−−−−
GT−GAA 3AT八八CTAGCTAAGCCA
GAAGCTCAAGACAGCCCAGGATA
511TGACTAACAGATTAGGAGCTG
AAACGGTTACT八八TCCTTGCTGAGT
AATTTTTATCAGTAGATGAATTAAA
AGTATCTT 590TGTTACTTT/A
CTTCG/AT(poly ^)−3’ 607上
記はウシとヒトのヌクレオチド及びEBZDの推定され
たアミノ酸配列を比較して示している。ヒトの配列にお
いて異る残部はウシの配列の上及び下に示されており、
それは3つのオーパラ・ンブするcDN^クローンから
求められた。ヌクレオチド残部はウシのクローンの複合
配列に関して番号付けされており、アミノ酸残基は開始
のメチオニンに関して番号付けされている。ウシの配列
のリーディングフレームは星印(*)に挟まれている。
AGGTTGCGCTTCG − ael ↓ )find m 7 TTTGGCTGCCA−GCCATTCATTTCA
CCTAAACTGATTTA 434−−−−−
T−A−TGT−−−−−GTG−−−AT−−−−−
−−−−−GACATGCCTTGTTTTT−CT^
^TACTGGGGATGAAGTTCATA^−一−
−−〜−−〜−−TT−−−−−−−C−T−−−−−
GT−GAA 3AT八八CTAGCTAAGCCA
GAAGCTCAAGACAGCCCAGGATA
511TGACTAACAGATTAGGAGCTG
AAACGGTTACT八八TCCTTGCTGAGT
AATTTTTATCAGTAGATGAATTAAA
AGTATCTT 590TGTTACTTT/A
CTTCG/AT(poly ^)−3’ 607上
記はウシとヒトのヌクレオチド及びEBZDの推定され
たアミノ酸配列を比較して示している。ヒトの配列にお
いて異る残部はウシの配列の上及び下に示されており、
それは3つのオーパラ・ンブするcDN^クローンから
求められた。ヌクレオチド残部はウシのクローンの複合
配列に関して番号付けされており、アミノ酸残基は開始
のメチオニンに関して番号付けされている。ウシの配列
のリーディングフレームは星印(*)に挟まれている。
3つの別個のクローンのポリ(A)十付加部位における
差異は逆スラッシュによって示されている。
差異は逆スラッシュによって示されている。
ウシのcDNAプローブを調製するのに用いられたNa
e I及び旧ndllIの制限部位が示されている。
e I及び旧ndllIの制限部位が示されている。
実験の項で示す配列、又はそのフラグメント、少なくと
も約45個の塩基(15個以上のコドン)をもつフラグ
メントが、本発明のポリペプチドの発現に用いることが
できる。インビトロ突然変異誘発、突然変異誘発、アダ
プター等を用いることによって、その配列を天然配列か
ら変化させて、サイレント突然変異を有するか又は非野
生型アミノ酸をコードするコドンを有する配列を作るこ
とができる。従って、天然ポリペプチド、及び相応の生
理学的特性を有するがしかし1゛個以上のアミノ酸の異
なっているポリペプチドの両方を作ることができる。
も約45個の塩基(15個以上のコドン)をもつフラグ
メントが、本発明のポリペプチドの発現に用いることが
できる。インビトロ突然変異誘発、突然変異誘発、アダ
プター等を用いることによって、その配列を天然配列か
ら変化させて、サイレント突然変異を有するか又は非野
生型アミノ酸をコードするコドンを有する配列を作るこ
とができる。従って、天然ポリペプチド、及び相応の生
理学的特性を有するがしかし1゛個以上のアミノ酸の異
なっているポリペプチドの両方を作ることができる。
使用されるコード配列は、他の配列に連結するための平
滑末端または付着端を有していることができる。発現の
ために、多数の発現ベクターが商業的に入手し得るかま
たは文献に記載されている。
滑末端または付着端を有していることができる。発現の
ために、多数の発現ベクターが商業的に入手し得るかま
たは文献に記載されている。
従って、適当な宿主における発現のために、発現ベクタ
ー内に対象の配列を導入することができる。
ー内に対象の配列を導入することができる。
宿主は、原核生物または真核生物、すなわち、細菌、藻
類、菌類、例えば、酵母、哺乳動物の細胞、例えば、マ
ウス細胞、ハムスター細胞、モンキー細胞等であること
ができる。発現ベクターは、コード配列の挿入のために
完全に組立てられていようが、本発明のポリペプチドの
コード配列と組合わせて組立てられていようが、多くの
場合、以下のように特徴付けられる。常にというわけで
はないが一般には、宿主中で維持されるべき少数または
多数のコピー数のエピソーム要素を提供する、野生型複
製系以外の複製系が入手可能である。宿主ゲノム中にコ
ード配列を組込むことが望ましい場合には、複製系は必
要ないであろう。コード配列は、5′末端および3′末
端において、しばしば野生型の制御領域以外の、転写お
よび翻訳開始シグナルおよび終結制御シグナルのそれぞ
れによって挟まれている。従って、プロモーター領域は
5′末端において用いられ、キャップ配列、制御された
発現のためのオペレーター、およびエンハンサ−配列等
を含み、構成的発現のためにプロモーター制御を含んで
いないことができる。3′末端においては、ターミネー
ター、終止コドン、および最適にはポリアデニル化配列
等が存在する。
類、菌類、例えば、酵母、哺乳動物の細胞、例えば、マ
ウス細胞、ハムスター細胞、モンキー細胞等であること
ができる。発現ベクターは、コード配列の挿入のために
完全に組立てられていようが、本発明のポリペプチドの
コード配列と組合わせて組立てられていようが、多くの
場合、以下のように特徴付けられる。常にというわけで
はないが一般には、宿主中で維持されるべき少数または
多数のコピー数のエピソーム要素を提供する、野生型複
製系以外の複製系が入手可能である。宿主ゲノム中にコ
ード配列を組込むことが望ましい場合には、複製系は必
要ないであろう。コード配列は、5′末端および3′末
端において、しばしば野生型の制御領域以外の、転写お
よび翻訳開始シグナルおよび終結制御シグナルのそれぞ
れによって挟まれている。従って、プロモーター領域は
5′末端において用いられ、キャップ配列、制御された
発現のためのオペレーター、およびエンハンサ−配列等
を含み、構成的発現のためにプロモーター制御を含んで
いないことができる。3′末端においては、ターミネー
ター、終止コドン、および最適にはポリアデニル化配列
等が存在する。
転写および翻訳制御配列およびコード配列の発現造成物
は、しばしば、ベクターが導入されている形質転換され
た宿主に関する選択および発現ベクターを保有する細胞
に対する競争的好都合の提供の双方を可能にする1種も
しくはそれ以上のマーカーに連結される。マーカーは、
栄養要求宿主に対する原栄養性の付与による補完、殺生
物剤(biocide)耐性、例えば、種々の抗生物質
および重金属等に対する耐性、および免疫等含んでいる
ことができる。種々の配列は、宿主中で機能的であるよ
うに選択される。
は、しばしば、ベクターが導入されている形質転換され
た宿主に関する選択および発現ベクターを保有する細胞
に対する競争的好都合の提供の双方を可能にする1種も
しくはそれ以上のマーカーに連結される。マーカーは、
栄養要求宿主に対する原栄養性の付与による補完、殺生
物剤(biocide)耐性、例えば、種々の抗生物質
および重金属等に対する耐性、および免疫等含んでいる
ことができる。種々の配列は、宿主中で機能的であるよ
うに選択される。
多(の発現ベクターについて、多数の制限部位を与える
ポリリンカーが、配列と転写および翻訳開始制御配列と
終止制御配列の間に存在している。
ポリリンカーが、配列と転写および翻訳開始制御配列と
終止制御配列の間に存在している。
従って、コ〒ド配列の適当な設計によって、またはアダ
プターを用いることによって、コード配列をポリリンカ
ー領域内に挿入することができる。
プターを用いることによって、コード配列をポリリンカ
ー領域内に挿入することができる。
ある場合には、コード配列を5′−コード配列に連結し
て、融合生成物を得ることが望ましい場合があり、この
場合、この5′−配列がリーダー配列、とりわけ分泌リ
ーダー配列およびプロセッシングシグナルをコードする
。種々の分泌リーダーは例えば、次の文献に記載されて
いる:米国特許筒4,411.994号、UP八へ8,
632および116,201 。
て、融合生成物を得ることが望ましい場合があり、この
場合、この5′−配列がリーダー配列、とりわけ分泌リ
ーダー配列およびプロセッシングシグナルをコードする
。種々の分泌リーダーは例えば、次の文献に記載されて
いる:米国特許筒4,411.994号、UP八へ8,
632および116,201 。
コード配列は正しいリーディングフレームで分泌リーダ
ーおよびプロセッシングシグナルに連結されることによ
って、その融合コード配列を発現ベクター中に挿入して
発現造成物を提供することができる。
ーおよびプロセッシングシグナルに連結されることによ
って、その融合コード配列を発現ベクター中に挿入して
発現造成物を提供することができる。
ポリペプチドが細胞内に保存されている場合は、細胞の
増殖後、細胞を集菌しこれを溶解してポリペプチドを単
離することができる。ポリペプチドが分泌される場合に
は、栄養培地を連続的に交換してポリペプチドを単離す
ることができる。ポリペプチドの単離および精製のため
に種々の技法が存在しており、例えば、アフィンティー
クロマトグラフィー、HPLC1電気泳動、グラジェン
ト遠心分離および溶剤抽出等がある。
増殖後、細胞を集菌しこれを溶解してポリペプチドを単
離することができる。ポリペプチドが分泌される場合に
は、栄養培地を連続的に交換してポリペプチドを単離す
ることができる。ポリペプチドの単離および精製のため
に種々の技法が存在しており、例えば、アフィンティー
クロマトグラフィー、HPLC1電気泳動、グラジェン
ト遠心分離および溶剤抽出等がある。
用途に応じて、本発明の化合物は種々の方法で配合する
ことができる。生体内投与のため、本発明の化合物を生
理学的に許容される担体、例えば、滅菌水、食塩水、リ
ン酸緩衝溶液およびエタノール等中に導入することがで
きる。その濃度は、特定の適用、およびその適用が局所
的であるか全身的であるか、等に応じて広く異る。投与
は、非経口的、静脈内的、腹腔内的、動脈内的および皮
下的等であることができる。
ことができる。生体内投与のため、本発明の化合物を生
理学的に許容される担体、例えば、滅菌水、食塩水、リ
ン酸緩衝溶液およびエタノール等中に導入することがで
きる。その濃度は、特定の適用、およびその適用が局所
的であるか全身的であるか、等に応じて広く異る。投与
は、非経口的、静脈内的、腹腔内的、動脈内的および皮
下的等であることができる。
天然に存在するEBZDの濃度は一般に5〜500■/
dである。投与方法に応じて、用量は約0.5〜500
x/kgまで、より通常には約5〜501rg/kgま
で変化することができ、用量が25g/kgを越える場
合には精神安定作用が生ずる。特定の用量は、所望の反
応、投与方法および用量の反復性等によって変化する。
dである。投与方法に応じて、用量は約0.5〜500
x/kgまで、より通常には約5〜501rg/kgま
で変化することができ、用量が25g/kgを越える場
合には精神安定作用が生ずる。特定の用量は、所望の反
応、投与方法および用量の反復性等によって変化する。
以下に説明のため実施例を与えるが、これらの実施例は
限定を目的とするものではない。
限定を目的とするものではない。
実−川
ウシの のエンドーベンゾジアゼピノイドB1o−
5il TSK−250ゲルロ過HI’LCカラムを、
バイオ−ラッドラボラトリーズ(リッチモンド、カルフ
ォルニア)より購入した。μmBondapak−Co
gカラムをウォーターズアソシエート(ミルフォールド
、マサチューセッツ)より入手した。トリプシン(TP
CK処理)、キモトリプシンおよびスタフイロコツカル
・アウレウス(Sta h 1ococol aure
us)v8プロテアーゼは、ワーリントン(Wor t
h ing ton)から得る。エンドプロティナーゼ
Lys−Cをべ一すンガーマンハイムから得た。3H−
ラベル化ジアゼパム、RO15−1788、フルニトラ
ゼパムおよびβ−カルボリンをNEW 、ボストン、マ
サチューセッツから得た。キャリヤフリー125I−ヨ
ウ素はアマ−ジャム(アーリントンハイト、イリノイ)
製のものであった。
5il TSK−250ゲルロ過HI’LCカラムを、
バイオ−ラッドラボラトリーズ(リッチモンド、カルフ
ォルニア)より購入した。μmBondapak−Co
gカラムをウォーターズアソシエート(ミルフォールド
、マサチューセッツ)より入手した。トリプシン(TP
CK処理)、キモトリプシンおよびスタフイロコツカル
・アウレウス(Sta h 1ococol aure
us)v8プロテアーゼは、ワーリントン(Wor t
h ing ton)から得る。エンドプロティナーゼ
Lys−Cをべ一すンガーマンハイムから得た。3H−
ラベル化ジアゼパム、RO15−1788、フルニトラ
ゼパムおよびβ−カルボリンをNEW 、ボストン、マ
サチューセッツから得た。キャリヤフリー125I−ヨ
ウ素はアマ−ジャム(アーリントンハイト、イリノイ)
製のものであった。
新鮮な又は凍結したウシの脳(480g湿重量)を融解
し次いで細断した。細断した組織を、2379m1のエ
タノール(98%) 、18.5rnlの濃■C2、お
よび2、57dのアブロティニン〔ウシの肺源の23
TIU/!d(シグマケミカル社)〕から成る2400
dの抽出緩衝液中に懸濁させた。混合物をワーリングコ
マーシャル混合機中でホモジナイズした。ホモジネート
を4°Cで一夜で撹拌し、ベックマン型190−ター中
800Orpmで30分間遠心分離し、次いで上澄みを
注意深く除去した。最終量は約207Mであった。クロ
ロホルム(2070m)および207dの酸性の水(2
0Mlの水と4dの濃HCIを上澄みに添加し、混合物
を約1時間激しく撹拌し、次いで室温に放置し二相に分
離した。水性の上相を注意深く除去し次いでスペクトラ
ポール透析膜チューブ(3,500MWカットオフ、ア
メリカンサイエンティフィックプロダクト)中、4°C
で0.1 M酢酸20nを2回取り換えて透析した。透
析した上澄みを凍結乾燥した。凍結乾燥材料(785■
)を粗分側と称した。
し次いで細断した。細断した組織を、2379m1のエ
タノール(98%) 、18.5rnlの濃■C2、お
よび2、57dのアブロティニン〔ウシの肺源の23
TIU/!d(シグマケミカル社)〕から成る2400
dの抽出緩衝液中に懸濁させた。混合物をワーリングコ
マーシャル混合機中でホモジナイズした。ホモジネート
を4°Cで一夜で撹拌し、ベックマン型190−ター中
800Orpmで30分間遠心分離し、次いで上澄みを
注意深く除去した。最終量は約207Mであった。クロ
ロホルム(2070m)および207dの酸性の水(2
0Mlの水と4dの濃HCIを上澄みに添加し、混合物
を約1時間激しく撹拌し、次いで室温に放置し二相に分
離した。水性の上相を注意深く除去し次いでスペクトラ
ポール透析膜チューブ(3,500MWカットオフ、ア
メリカンサイエンティフィックプロダクト)中、4°C
で0.1 M酢酸20nを2回取り換えて透析した。透
析した上澄みを凍結乾燥した。凍結乾燥材料(785■
)を粗分側と称した。
ゲルバクロマドグラフィー
Blo−5it TSK−250カラム(60X 2.
1 cm)を高速液体クロマトグラフィー()IPLc
)システム(ウォーターズアソシエーツ)に取付けた。
1 cm)を高速液体クロマトグラフィー()IPLc
)システム(ウォーターズアソシエーツ)に取付けた。
粗分側を0.1%三フッ化酢酸を用い40%アセトニト
リル水溶液中に8ffIg/dの濃度で溶解した。カラ
ムを0、1%三フッ化酢酸(TFA)と共に40%アセ
トニトリルを用いて平衡化した。2dのアリコート(1
6■のタンパク質)を注入し次いでO,1%濃度のTF
Aを有する40%アセトニトリル水溶液を移動相として
均一に溶出を行った。流速を2d/分に設定しそしてチ
ャートスピードを0.25cm/分に設定した。
リル水溶液中に8ffIg/dの濃度で溶解した。カラ
ムを0、1%三フッ化酢酸(TFA)と共に40%アセ
トニトリルを用いて平衡化した。2dのアリコート(1
6■のタンパク質)を注入し次いでO,1%濃度のTF
Aを有する40%アセトニトリル水溶液を移動相として
均一に溶出を行った。流速を2d/分に設定しそしてチ
ャートスピードを0.25cm/分に設定した。
クロマトグラフィー処理を室温で行った。5 mlの分
画を採取した。各分画のアリコートを凍結乾燥し次いで
ベンゾジアゼピン(BZD)結合競合活性(BZD−B
CA)および成長抑制活性について3面分析した。
画を採取した。各分画のアリコートを凍結乾燥し次いで
ベンゾジアゼピン(BZD)結合競合活性(BZD−B
CA)および成長抑制活性について3面分析した。
BZD−BCAの位置を知った後(分画24)、先に述
べた如<、49回のクロマトグラフィー操作を行った。
べた如<、49回のクロマトグラフィー操作を行った。
全ての操作の活性分画を集め次いで凍結乾燥した。約6
5■の活性な乾燥粉末を得た。これをTSK−250分
画と称した。この分画は約936ユニツトのBZD−B
CA活性を含有していた。
5■の活性な乾燥粉末を得た。これをTSK−250分
画と称した。この分画は約936ユニツトのBZD−B
CA活性を含有していた。
TS)[−250の 3 クロマトグラフィーT
SK−250分画を0.1%TFAに溶解しく2mg/
d)、更にg −Bondapak C+sカラム(
78mm (内径)×30cm)を用い室温で逆相HP
LCにより分別した。試料を均一に適用し、カラムを洗
浄し次いで0.1%TFAで平衡化した。流速を2!d
/分に設定し、そしてチャート速度を0.25cm/分
に設定した。第一の溶剤0.1%TFAと第二の溶剤0
.1%TFA中のアセトニトリルと間での線状グラジェ
ント法を用いた。グラジェントの条件は20分内で0〜
28%、次いで140分内で28〜42%、10分内で
42〜52%更に6分内で52〜100%であった。全
ての溶剤は、HPLC等級のものであった。4蔵の分画
を採取した。
SK−250分画を0.1%TFAに溶解しく2mg/
d)、更にg −Bondapak C+sカラム(
78mm (内径)×30cm)を用い室温で逆相HP
LCにより分別した。試料を均一に適用し、カラムを洗
浄し次いで0.1%TFAで平衡化した。流速を2!d
/分に設定し、そしてチャート速度を0.25cm/分
に設定した。第一の溶剤0.1%TFAと第二の溶剤0
.1%TFA中のアセトニトリルと間での線状グラジェ
ント法を用いた。グラジェントの条件は20分内で0〜
28%、次いで140分内で28〜42%、10分内で
42〜52%更に6分内で52〜100%であった。全
ての溶剤は、HPLC等級のものであった。4蔵の分画
を採取した。
各分画のアリコートを凍結乾燥し、次いでBZD−BC
Aに対し3面分析した。大部分の活性部分が、31〜3
2%アセトニトリル濃度間で溶出した。
Aに対し3面分析した。大部分の活性部分が、31〜3
2%アセトニトリル濃度間で溶出した。
分画36と分画37をプールし、次いで12戚の0.1
%TFAで希釈した。混合物を、u −Bondapa
k −Cr aカラム〔3,9酎(内径)X30cm)
に均一に適用した。流速は1m/分であり、チャート速
度は0.25c111Z分であった。第一の溶剤O01
%TFAと第二の溶剤0.1%TFAを有するアセトニ
トリルとの間で直線グラジェント法を用いた。グラジェ
ント条件は次の通りであった。10分内で0〜30%、
次いで60分内で30〜40%であった。分画を採取し
た。殆ど全ての活性(約850ユニツト)部分は31%
までのアセトニトリル濃度で分画6内に溶離した。この
分画をHPLCC+a分画と称し、これは約680■の
タンパクを有していた。
%TFAで希釈した。混合物を、u −Bondapa
k −Cr aカラム〔3,9酎(内径)X30cm)
に均一に適用した。流速は1m/分であり、チャート速
度は0.25c111Z分であった。第一の溶剤O01
%TFAと第二の溶剤0.1%TFAを有するアセトニ
トリルとの間で直線グラジェント法を用いた。グラジェ
ント条件は次の通りであった。10分内で0〜30%、
次いで60分内で30〜40%であった。分画を採取し
た。殆ど全ての活性(約850ユニツト)部分は31%
までのアセトニトリル濃度で分画6内に溶離した。この
分画をHPLCC+a分画と称し、これは約680■の
タンパクを有していた。
また、ヒトの脳組織を用いて上述の手順に実質的に従っ
てヒト1liBZDを精製した。
てヒト1liBZDを精製した。
−シ プトソームのト1
粗シナプス膜分画を、体重200gまでのスプラーグー
ドーレイ系ラットの脳又は新鮮なウシの脳皮質のいずれ
かからZuck i n等(Proc、 Natl、
Acad。
ドーレイ系ラットの脳又は新鮮なウシの脳皮質のいずれ
かからZuck i n等(Proc、 Natl、
Acad。
Sci、 USA(1974)71 : 4802 4
806) (7)記載の如く調製した。シナプス膜を、
50mMのトリス−!(Cf (PH7,4)で3回洗
浄し、緩衝液中にくりかえし懸濁させ次いで遠心分離に
よりペレット化した。洗浄したシナプトソーム膜を50
ff1MトリスーHC1(pH7,4)に懸濁させ次い
で一20°Cで保存した。
806) (7)記載の如く調製した。シナプス膜を、
50mMのトリス−!(Cf (PH7,4)で3回洗
浄し、緩衝液中にくりかえし懸濁させ次いで遠心分離に
よりペレット化した。洗浄したシナプトソーム膜を50
ff1MトリスーHC1(pH7,4)に懸濁させ次い
で一20°Cで保存した。
EBZD−人 についてのアッセイ種々の画分又
は精製されたタンパク質による、洗浄されたシナプトソ
ームへの’H−BZDの結合の狙害を、結合競争活性の
指標として使用した。シナプトソーム膜への’H−BZ
Dの結合を、25州のβ−カルボリンの不在下又は存在
下のいずれかで使い捨ての12 X 75aoのポリプ
ロピレン管中において2通り実施した。その結合混合物
は、所望の種々の濃度の試験化合物、20mMのTri
s−HCj! (pH=7、4 ) 、シナプス膜懸濁
液(70〜100qのタンパク質)、1〜51IIMの
’H−BZD及び合計体積0.1 ml中0.5%の最
終濃度のジメチルスルホキシドを含んだ。4°Cで30
分間のインキュベーションの後、0.1MのTris−
HCI (pH= 7.4 )中lO%の冷ポリエチレ
ングリコール(PEG6000) 0.7 mを各々の
管に添加した。その懸濁液をすぐ4°CでGF/Bフィ
ルターにより真空濾過した。そのフィルターを、1mg
/meのBSAを含む5抛りの冷Tris−HCI (
p)I=7、4 ) 10dにより洗浄した。そのフィ
ルターを、計数バイアルに移し、そしてアクアシン(A
quas−sine)(NEN)10dを、各バイアル
に添加し、そしてBeckmanβ−カウンターを用い
て放射能を測定した。25−のβ−カルボリンの存在に
おいて結合した放射能(合計結合の2〜8%)は、非特
異的であると思われ、そしてデーターはそれに応じて修
正された。タンパク質濃度を、標準としてBSAを用い
て、Lowry、など、、J、 Biol、 Chem
、(1951) 193 :265〜275の方法によ
って測定した。
は精製されたタンパク質による、洗浄されたシナプトソ
ームへの’H−BZDの結合の狙害を、結合競争活性の
指標として使用した。シナプトソーム膜への’H−BZ
Dの結合を、25州のβ−カルボリンの不在下又は存在
下のいずれかで使い捨ての12 X 75aoのポリプ
ロピレン管中において2通り実施した。その結合混合物
は、所望の種々の濃度の試験化合物、20mMのTri
s−HCj! (pH=7、4 ) 、シナプス膜懸濁
液(70〜100qのタンパク質)、1〜51IIMの
’H−BZD及び合計体積0.1 ml中0.5%の最
終濃度のジメチルスルホキシドを含んだ。4°Cで30
分間のインキュベーションの後、0.1MのTris−
HCI (pH= 7.4 )中lO%の冷ポリエチレ
ングリコール(PEG6000) 0.7 mを各々の
管に添加した。その懸濁液をすぐ4°CでGF/Bフィ
ルターにより真空濾過した。そのフィルターを、1mg
/meのBSAを含む5抛りの冷Tris−HCI (
p)I=7、4 ) 10dにより洗浄した。そのフィ
ルターを、計数バイアルに移し、そしてアクアシン(A
quas−sine)(NEN)10dを、各バイアル
に添加し、そしてBeckmanβ−カウンターを用い
て放射能を測定した。25−のβ−カルボリンの存在に
おいて結合した放射能(合計結合の2〜8%)は、非特
異的であると思われ、そしてデーターはそれに応じて修
正された。タンパク質濃度を、標準としてBSAを用い
て、Lowry、など、、J、 Biol、 Chem
、(1951) 193 :265〜275の方法によ
って測定した。
ポリアクリルアミドゲル ”””’ PAGE)
0.1Mのリン酸ナトリウム(pH=7.2) 、0.
1%のSOS及び6Mの尿素を含む15.6%のポリア
クリルアミドビス−アクリルアミド(30: 0.8
)の15cmの分離ゲル(0,75ma+の厚さ)を使
用した。そのゲルは、ゲル20戚当りTEMED(Bi
oRad) 1Oplを含み、そして、20%の過硫酸
アンモニウムの1.04/dのゲルを用いることによっ
て重合されたものであ′る。分離ゲルの条件と同一の緩
衝液条件を用いる3、5%のアクリルアミド溶液の上層
ゲルを、下層ゲルの上に注いだ。上層ゲルの約3[[1
I11を残して、コム(Comb)を、その上のゲル中
に挿入した。
0.1Mのリン酸ナトリウム(pH=7.2) 、0.
1%のSOS及び6Mの尿素を含む15.6%のポリア
クリルアミドビス−アクリルアミド(30: 0.8
)の15cmの分離ゲル(0,75ma+の厚さ)を使
用した。そのゲルは、ゲル20戚当りTEMED(Bi
oRad) 1Oplを含み、そして、20%の過硫酸
アンモニウムの1.04/dのゲルを用いることによっ
て重合されたものであ′る。分離ゲルの条件と同一の緩
衝液条件を用いる3、5%のアクリルアミド溶液の上層
ゲルを、下層ゲルの上に注いだ。上層ゲルの約3[[1
I11を残して、コム(Comb)を、その上のゲル中
に挿入した。
0.01Mのリン酸ナトリウム(pH=7.2 ) 、
7 Mの尿素、1%のSO3及び1%の2−メルカプト
エタノール中サンプル40iZ1を、2分間煮沸し、そ
してすぐに適用した。そのランニング緩衝液は、0.1
%のSO3を含む0.1 Mのリン酸ナトリウム(pH
−7,2)であった。トラッキング染料がゲルの底に達
するまで、そのゲルを、室温で5 V / c+aで泳
動させた。そのゲルを、50%メタノール及び9%酢酸
中に固定し、固定溶液中において0.1%クーマシーブ
ルー(Coomasie blue)により染色し、そ
して50%メタノール及び9%酢酸により脱染色した。
7 Mの尿素、1%のSO3及び1%の2−メルカプト
エタノール中サンプル40iZ1を、2分間煮沸し、そ
してすぐに適用した。そのランニング緩衝液は、0.1
%のSO3を含む0.1 Mのリン酸ナトリウム(pH
−7,2)であった。トラッキング染料がゲルの底に達
するまで、そのゲルを、室温で5 V / c+aで泳
動させた。そのゲルを、50%メタノール及び9%酢酸
中に固定し、固定溶液中において0.1%クーマシーブ
ルー(Coomasie blue)により染色し、そ
して50%メタノール及び9%酢酸により脱染色した。
脱染色の後、そのゲルを乾燥せしめた。
15%の分離ゲル及び5%のスタッキングゲルを0PA
GE法もまた、使用された。ゲル上のタンパク質を、M
erril、など、、 5cience(1981)
2旦: 1437〜1439の銀染色法又はクーマシー
ブルー染色法のいずれかによって検出した。
GE法もまた、使用された。ゲル上のタンパク質を、M
erril、など、、 5cience(1981)
2旦: 1437〜1439の銀染色法又はクーマシー
ブルー染色法のいずれかによって検出した。
タンパク のヨウソヒ
Barridge、 Methods Enz mol
、 (1978)50 : 54〜65によって記載さ
れているクロラミン−T法を用いて+ zsIにより、
又はBiochera、J、(1973) 13:し5
29〜539に記載されている”5I−Bolton及
びHunter試薬を用いて、タンパク質をラベルした
。
、 (1978)50 : 54〜65によって記載さ
れているクロラミン−T法を用いて+ zsIにより、
又はBiochera、J、(1973) 13:し5
29〜539に記載されている”5I−Bolton及
びHunter試薬を用いて、タンパク質をラベルした
。
EBZDに・する− 産生
ウシの脳からの精製されたEBZDに対する抗血清をラ
ットにおいて調製した。生後6週間のSpragueD
awleyラットを、完全フロインドアジュバント中に
乳化された、合計20■の精製タンパク質により感作し
た。続く追加免疫接種を、不完全フロインドアジュバン
ト中タンパク質10I!gを用いて2週間隔で与えた。
ットにおいて調製した。生後6週間のSpragueD
awleyラットを、完全フロインドアジュバント中に
乳化された、合計20■の精製タンパク質により感作し
た。続く追加免疫接種を、不完全フロインドアジュバン
ト中タンパク質10I!gを用いて2週間隔で与えた。
各接種の後1週間で試験採血を行い、そして下記に概説
されているラジオイムノアッセイ法を用いて抗体につい
てスクリーンした。
されているラジオイムノアッセイ法を用いて抗体につい
てスクリーンした。
そのアッセイのために適切な抗血清は、−船釣に、2〜
3回のみの追加免疫接種の後、得られた。
3回のみの追加免疫接種の後、得られた。
ウサギ(およそ3kgの重さのニューシーラントホワイ
トウサギ)における精製されたウシの脳のEBZDに対
する抗血清をまた、ラットのために記載された同じ方法
によって調製した。但し、40鱈及び20μgのタンパ
ク質を、それぞれ、1次接種及び追加免疫注射のために
使用した。
トウサギ)における精製されたウシの脳のEBZDに対
する抗血清をまた、ラットのために記載された同じ方法
によって調製した。但し、40鱈及び20μgのタンパ
ク質を、それぞれ、1次接種及び追加免疫注射のために
使用した。
ラジオイムノアッセイ
精製されたウシの脳因子を、およ・そ3 XIO”cp
m/イの比活性にクロラミンTにより放射性ヨウ化し、
そして4°CでTNEN緩衝液(20mMのTrts
tlcI!、、pH= 7.4 ; 5mMのEDT
A ; 150mMのNaC1;0.05%のNP−
40; 0.1%のBSA)中に保存した。
m/イの比活性にクロラミンTにより放射性ヨウ化し、
そして4°CでTNEN緩衝液(20mMのTrts
tlcI!、、pH= 7.4 ; 5mMのEDT
A ; 150mMのNaC1;0.05%のNP−
40; 0.1%のBSA)中に保存した。
ラジオイムノアッセイのためには、次の試薬が次々とポ
リプロピレン管(3rnlの容量)に添加された:精製
された脳因子の標準又はサンプル10μノ、ラット抗血
清(TNEN緩衝液中において1:30に希釈された)
10m及び1Z5iによりラベルされたウシの脳因子(
〜5 X10’cpm) 30#。室温で45分間のイ
ンキュベーションの後、熱失活されホルマリンにより固
定されたS、アウレアス(S、aureus)の10%
懸濁液50dを添加し、そしてその混合物をさらに30
分間放置した。次に、免疫吸着剤をn−ブチルフタレー
ト油のクツションを通して遠心分離しく15,000x
g、1分)、そしてS、アウレアスペレット中の放射
能活性の量を、r−分光測定によって測定した。抗血清
の不在において結合した放射能は非特異的であると思わ
れ、そしてデーターはそれに応じて修正された。
リプロピレン管(3rnlの容量)に添加された:精製
された脳因子の標準又はサンプル10μノ、ラット抗血
清(TNEN緩衝液中において1:30に希釈された)
10m及び1Z5iによりラベルされたウシの脳因子(
〜5 X10’cpm) 30#。室温で45分間のイ
ンキュベーションの後、熱失活されホルマリンにより固
定されたS、アウレアス(S、aureus)の10%
懸濁液50dを添加し、そしてその混合物をさらに30
分間放置した。次に、免疫吸着剤をn−ブチルフタレー
ト油のクツションを通して遠心分離しく15,000x
g、1分)、そしてS、アウレアスペレット中の放射
能活性の量を、r−分光測定によって測定した。抗血清
の不在において結合した放射能は非特異的であると思わ
れ、そしてデーターはそれに応じて修正された。
RIA反応性物質についての検定されるべきMi織は次
のようにして加工された。新鮮な又は冷凍された組織(
およそ1gの正味重量)を、10戒の冷ホモジナイゼー
ション緩衝液(20mMのTris−11Cj2、p)
l=7.4 ; 5mMのEDTA ;150mMのN
aCj! ; 0.2%のNP40 ; 0.2 mM
のフェニルメチルスルホニルフルオリド;m1当り10
0カリクレイン阻害剤ユニツトのTrasylol)に
添加し、そしてPolytron組織ホモジナイザーに
より3回、15秒間の破壊により均質化した。その抽出
物を取り出し、そして100.000xgで30分間の
遠心分離により残骸を除去した。
のようにして加工された。新鮮な又は冷凍された組織(
およそ1gの正味重量)を、10戒の冷ホモジナイゼー
ション緩衝液(20mMのTris−11Cj2、p)
l=7.4 ; 5mMのEDTA ;150mMのN
aCj! ; 0.2%のNP40 ; 0.2 mM
のフェニルメチルスルホニルフルオリド;m1当り10
0カリクレイン阻害剤ユニツトのTrasylol)に
添加し、そしてPolytron組織ホモジナイザーに
より3回、15秒間の破壊により均質化した。その抽出
物を取り出し、そして100.000xgで30分間の
遠心分離により残骸を除去した。
次に、この上清液を、5分間95°Cへ加熱し、そして
低速度で遠心分離し、沈殿した蛋白質を除去した。一連
の1:3の希釈の抽出物を、T N E N緩衝液によ
り調製し、そしてラジオイムノアッセイに使用した。標
準曲線は各セットのアッセイを含み、そして免疫反応性
物質の量を、直接的な比較により算定した。
低速度で遠心分離し、沈殿した蛋白質を除去した。一連
の1:3の希釈の抽出物を、T N E N緩衝液によ
り調製し、そしてラジオイムノアッセイに使用した。標
準曲線は各セットのアッセイを含み、そして免疫反応性
物質の量を、直接的な比較により算定した。
ウシ及びヒトのEBZDを、エンドブロティナーゼしy
s−Cを含む0.1MのTris−アセテート(pH=
8、0 ) 40μノgにおいて24°Cで16時間消
化した。EBZD :酵素の比は、重量基準で10:1
であった。ペプチドフラグメントを、水中0.05%T
FAから0.045%TF八を含む60%アセトニトリ
ルまでの直線2時間グラジェントを用いてμ〜Bond
apak −C+ eカラム(Waters)でのrp
l(PLCによって分離した。ペプチドをモニターし、
そして214nMでのそれらの吸収によって同定し、集
め、凍結乾燥し、そしてアソセイのために使用した。
s−Cを含む0.1MのTris−アセテート(pH=
8、0 ) 40μノgにおいて24°Cで16時間消
化した。EBZD :酵素の比は、重量基準で10:1
であった。ペプチドフラグメントを、水中0.05%T
FAから0.045%TF八を含む60%アセトニトリ
ルまでの直線2時間グラジェントを用いてμ〜Bond
apak −C+ eカラム(Waters)でのrp
l(PLCによって分離した。ペプチドをモニターし、
そして214nMでのそれらの吸収によって同定し、集
め、凍結乾燥し、そしてアソセイのために使用した。
Blo−5il TSK−250のカラムからウシの脳
のEBZDの溶出プロフィールを決定した。BZO結合
の競争活性は、リボヌクレアーゼ(Mr=11.500
)よりもわずかに小さな中間サイズを有する単一のピー
クとしてカラムから現われた。分取用逆相カラムTSK
−250からの活性フラクション24のクロマトグラフ
ィーの結果、その活性は31〜32%のアセトニトリル
の間で溶出した。分析用逆相カラムに基づく、プールさ
れたフラクション36及び37の再クロマトグラフィー
は、対称的なピークとして活性蛋白質の溶出をもたらし
た。その精製は第1表に要約される。
のEBZDの溶出プロフィールを決定した。BZO結合
の競争活性は、リボヌクレアーゼ(Mr=11.500
)よりもわずかに小さな中間サイズを有する単一のピー
クとしてカラムから現われた。分取用逆相カラムTSK
−250からの活性フラクション24のクロマトグラフ
ィーの結果、その活性は31〜32%のアセトニトリル
の間で溶出した。分析用逆相カラムに基づく、プールさ
れたフラクション36及び37の再クロマトグラフィー
は、対称的なピークとして活性蛋白質の溶出をもたらし
た。その精製は第1表に要約される。
a:上記のアッセイ条件下で粗シナプトソーム膜への3
1−ジアゼパムの結合に対する40%競争のために必要
とする材料。
1−ジアゼパムの結合に対する40%競争のために必要
とする材料。
b:プールされた材料の直接計量による。
c:280mμでの吸光度から計算された。
d:低い比活性のため、この段階で直接的にアッセイす
ることは不可能であった。この数は、フラクション24
及び25中のTSK−250クロマトグラフイー処理の
後に回収された合計ユニットを示す。
ることは不可能であった。この数は、フラクション24
及び25中のTSK−250クロマトグラフイー処理の
後に回収された合計ユニットを示す。
84.2%の収率を伴う969倍の精製を、3段階方法
で達成した。阻害度は、蛋白質の濃度が上昇するにつれ
て、上昇した。しかしながら、最大の阻害度は、8禮の
濃度の純粋な蛋白質でさえわずかに52%に過ぎないこ
とが見出された。Ki値は、3H−ジアゼパム又は3)
1−RO15−1788のいずれがリガンドとして使用
されても、約5岸であることが見出された。
で達成した。阻害度は、蛋白質の濃度が上昇するにつれ
て、上昇した。しかしながら、最大の阻害度は、8禮の
濃度の純粋な蛋白質でさえわずかに52%に過ぎないこ
とが見出された。Ki値は、3H−ジアゼパム又は3)
1−RO15−1788のいずれがリガンドとして使用
されても、約5岸であることが見出された。
精製された蛋白質の均質性は、6Mの尿素の存在におい
てPAGEによって示された。ペプチドの分子量は、1
0.5にドルトンであると算定された。
てPAGEによって示された。ペプチドの分子量は、1
0.5にドルトンであると算定された。
Laemm 1 iの5OS−PAGE法による精製さ
れた蛋白質(ウシ又はヒト)の分析もまた、見掛のMr
〜7にドルトンを有する単一のバンドを与えた。精製さ
れたタンパク賞は、溶離用溶媒として0.1%のTFA
と共に、水中40%アセトニトリルを用いるBlo−5
il TSK−250力ラムC60cm X 7.5
ml!+の内部直径)から単一の対称ピークとして出現
した。その見掛分子量は、このゲル浸透クロマトグラフ
ィー法によって約11.5にドルトンであることが計算
された。この精製されたヒトの脳のEBZDは、類似す
る物理化学的特性及び生物学的特性を示した。
れた蛋白質(ウシ又はヒト)の分析もまた、見掛のMr
〜7にドルトンを有する単一のバンドを与えた。精製さ
れたタンパク賞は、溶離用溶媒として0.1%のTFA
と共に、水中40%アセトニトリルを用いるBlo−5
il TSK−250力ラムC60cm X 7.5
ml!+の内部直径)から単一の対称ピークとして出現
した。その見掛分子量は、このゲル浸透クロマトグラフ
ィー法によって約11.5にドルトンであることが計算
された。この精製されたヒトの脳のEBZDは、類似す
る物理化学的特性及び生物学的特性を示した。
シナプトソーム膜への、1!5■〜ラベルされた(クロ
ラミン−T法又はBolton及びHun ter法の
いずれかによる)精製タンパク質の特異的結合は観察さ
れなかった。
ラミン−T法又はBolton及びHun ter法の
いずれかによる)精製タンパク質の特異的結合は観察さ
れなかった。
用飢夏分奄
RIA系を展開して組織抽出物、体液およびm織培養細
胞中のEBZDを定量した。種々のペプチドによる、ウ
シEBZDに対するラット抗血清に結合したウシ脳から
のl2s(−ラベル化EBZDの除去を測定した。ウシ
およびヒトのEBZDは、ウシEBZD蛋白質に対して
調製されたラット抗血清に結合するI!’51ラベル化
ウシEBZDとの競争において同様な能力を示した。こ
のことは、両方の蛋白質中に全く同様な免疫原決定基が
存在していることを示している。
胞中のEBZDを定量した。種々のペプチドによる、ウ
シEBZDに対するラット抗血清に結合したウシ脳から
のl2s(−ラベル化EBZDの除去を測定した。ウシ
およびヒトのEBZDは、ウシEBZD蛋白質に対して
調製されたラット抗血清に結合するI!’51ラベル化
ウシEBZDとの競争において同様な能力を示した。こ
のことは、両方の蛋白質中に全く同様な免疫原決定基が
存在していることを示している。
エンドプロティナーゼLys−C消化によって得られそ
して逆相HPLCによって精製されたウシEBZDのペ
プチドフラグメントはいずれもなんらの免疫反応性も示
さなかった。従って、EBZDの免疫原決定基はエンド
プロティナーゼLys−Cによって生じた単一ペプチド
フラグメントのいずれにも保有されていない。ラビット
の種々の組織中のEBZDの分布を下記第2表に示す。
して逆相HPLCによって精製されたウシEBZDのペ
プチドフラグメントはいずれもなんらの免疫反応性も示
さなかった。従って、EBZDの免疫原決定基はエンド
プロティナーゼLys−Cによって生じた単一ペプチド
フラグメントのいずれにも保有されていない。ラビット
の種々の組織中のEBZDの分布を下記第2表に示す。
脳
腎臓
唾液腺゛
肝臓
胃
結腸
肺臓
肺
心臓
胸腺
膵臓
大腿筋
甲状腺(Thyroid)
血清または血漿
N、D、=検出できず。
RIA法の詳細は前述しである。
3.80
3.42
1.76
1.52
1.27
1.05
0.97
0.84
0.73
0.67
0.50
0.37
0.06
N、D。
血清または血漿以外の試験組織はすべて、RIAによっ
て検出されるEBZDを含有していた。ウシの脳、肺臓
および胸腺は組織1g(湿態)当り約11.5 、7.
6および6.8 l!g当量を含有していたが、ヒトの
脳は組織1g(湿態)当り15.7g当量を含有してい
ることが見い出された。ラビット脳中のEBZDの濃度
は、ウシまたはヒトの脳中に存在する濃度よりはるかに
低いものであることが見い出された。EBZDはモンキ
ーの脳中にも見い出された。
て検出されるEBZDを含有していた。ウシの脳、肺臓
および胸腺は組織1g(湿態)当り約11.5 、7.
6および6.8 l!g当量を含有していたが、ヒトの
脳は組織1g(湿態)当り15.7g当量を含有してい
ることが見い出された。ラビット脳中のEBZDの濃度
は、ウシまたはヒトの脳中に存在する濃度よりはるかに
低いものであることが見い出された。EBZDはモンキ
ーの脳中にも見い出された。
ウシのタンパク質に対する抗血清はラットおよびマウス
の脳中に免疫学的交差反応物質をほとんど検出しなかっ
た。EBZDがヒトの脳を髄液および腹水液中に存在し
ていることも見い出された。ヒト乳癌細胞(MCF 7
)肝癌細胞()IEP 2) 、神経芽腫細胞(MTB
14)、神経膠神経芽腫細胞(CCL 127)およ
び膠芽腫細胞()ITB 10)について計算したとこ
ろ、それぞれ濃縮細胞(〜109細胞)1成当り9.1
゜8.9 、8.6.0.32および0.26μg当量
のEBZDを含有していた。EBZD 1 nは約6X
10”分子を含んでいる。従って、MCF 7. HE
P 2お・よびHTB 14細胞は細胞1個当り〜5X
10’分子のEBZDを含有している。
の脳中に免疫学的交差反応物質をほとんど検出しなかっ
た。EBZDがヒトの脳を髄液および腹水液中に存在し
ていることも見い出された。ヒト乳癌細胞(MCF 7
)肝癌細胞()IEP 2) 、神経芽腫細胞(MTB
14)、神経膠神経芽腫細胞(CCL 127)およ
び膠芽腫細胞()ITB 10)について計算したとこ
ろ、それぞれ濃縮細胞(〜109細胞)1成当り9.1
゜8.9 、8.6.0.32および0.26μg当量
のEBZDを含有していた。EBZD 1 nは約6X
10”分子を含んでいる。従って、MCF 7. HE
P 2お・よびHTB 14細胞は細胞1個当り〜5X
10’分子のEBZDを含有している。
従って、EBZDは哺乳動物の組織中に広く分布してお
り、そしてDBI とは異り脳に特有のペプチドではな
い。広い組織分布は、EBZDの機能が組織に特異的な
ものというよりむしろ一般的なものであろうということ
を示唆している。
り、そしてDBI とは異り脳に特有のペプチドではな
い。広い組織分布は、EBZDの機能が組織に特異的な
ものというよりむしろ一般的なものであろうということ
を示唆している。
ト脳の種々の領域におけるEBZDの分布pg当量/!
a織1g(湿態) 3.4 7.5 5.3 1.3 2.6 17.4 26.7 14.3 1.7 16.2 8.3 によって測定した。
a織1g(湿態) 3.4 7.5 5.3 1.3 2.6 17.4 26.7 14.3 1.7 16.2 8.3 によって測定した。
第3表ニラピッ
組織
大脳
小脳
延髄
下垂体
嗅球
松果体
脈絡叢
橋
ヴエガ(Vega)神経
視神経
嗅索
EBZD濃度は前述の如くにRIA
第3表は、RIAによって測定されたラビット脳の種々
の領域におけるEBZDの分布を要約している。
の領域におけるEBZDの分布を要約している。
脳の領域はすべてEBZD様物質を保有しているが、6
8201度の実質的な局所的変化があることが示された
。試験したラビット脳の全領域の中で、最高濃度は脈絡
叢において見い出され、そして最低濃度は下垂体におい
て見い出された。
8201度の実質的な局所的変化があることが示された
。試験したラビット脳の全領域の中で、最高濃度は脈絡
叢において見い出され、そして最低濃度は下垂体におい
て見い出された。
EBZDの (analefic)活主体重2.3〜
2.6 kgの雄性ニューシーラントラビットをこの実
験の全体を通じて用いた。ヤコブ(Jacob)等、ニ
ューロファーマコル、(独y!吐輩maco1.)
(1972年)11:1〜16頁に記載されたの直接穿
刺法に若干の変更を施すことによってicν注射を行な
った。動物は、頭蓋に小さな穴(直径0、8 mm )
を開ける(ベンドパルビタール麻酔下)ことによって実
験の2日前に′!$備した。この穴は正中線に対して1
. Orrm側方およびブレグマに対して1.0帥口吻
側に位置している。実験の日、注射の直前に、皮膚の傷
上に局所麻酔薬を噴霧する。
2.6 kgの雄性ニューシーラントラビットをこの実
験の全体を通じて用いた。ヤコブ(Jacob)等、ニ
ューロファーマコル、(独y!吐輩maco1.)
(1972年)11:1〜16頁に記載されたの直接穿
刺法に若干の変更を施すことによってicν注射を行な
った。動物は、頭蓋に小さな穴(直径0、8 mm )
を開ける(ベンドパルビタール麻酔下)ことによって実
験の2日前に′!$備した。この穴は正中線に対して1
. Orrm側方およびブレグマに対して1.0帥口吻
側に位置している。実験の日、注射の直前に、皮膚の傷
上に局所麻酔薬を噴霧する。
#26の針を頭蓋の表面から12mmの深さまで鉛直に
挿入する。正確な位置決めは大脳を髄液の出現によって
指示される。針を引き抜き、針に薬剤溶液を充填して、
この針を同じ深さまで再度挿入する。
挿入する。正確な位置決めは大脳を髄液の出現によって
指示される。針を引き抜き、針に薬剤溶液を充填して、
この針を同じ深さまで再度挿入する。
注射は、常に、注射器微量ビユレットを用いて10Iの
容量で30〜60秒間にわたって実施する。対照の動物
には同容量の滅菌食塩水を与える。薬剤はすべて滅菌し
た等張の食塩水中に溶解し、そしてその遊離塩基として
表現される。
容量で30〜60秒間にわたって実施する。対照の動物
には同容量の滅菌食塩水を与える。薬剤はすべて滅菌し
た等張の食塩水中に溶解し、そしてその遊離塩基として
表現される。
動物は一般に実験の2〜3時間前一対の縦仕切り棒(S
tanchion)内に位置させる。結腸温度は、リー
ズ−ノースラップ・スピードマックス・レコーダー(L
eeds−Northrup 5peedos+ax
recorder)上に記録されるように特別に電線が
引かれているYSISキスンニング・テレサーモメータ
ー(YSIScanning Telethermom
eter)に接続されている直腸サーミスタプローブに
よって測定される。実験は22.0±1.0°Cの常温
室内で実施する。
tanchion)内に位置させる。結腸温度は、リー
ズ−ノースラップ・スピードマックス・レコーダー(L
eeds−Northrup 5peedos+ax
recorder)上に記録されるように特別に電線が
引かれているYSISキスンニング・テレサーモメータ
ー(YSIScanning Telethermom
eter)に接続されている直腸サーミスタプローブに
よって測定される。実験は22.0±1.0°Cの常温
室内で実施する。
興奮活性は立直り反射の回復時間の短縮によって示され
る。25■/kgのベンドパルビタールを静脈内に投与
されたラビットは麻酔にかかり、その麻酔時間の間は自
らを正常な直立位置まで動いて戻すことなく仰向けにな
っていることができる。
る。25■/kgのベンドパルビタールを静脈内に投与
されたラビットは麻酔にかかり、その麻酔時間の間は自
らを正常な直立位置まで動いて戻すことなく仰向けにな
っていることができる。
ラビットが仰向けの姿勢をこれ以上続けていることがで
きなくなった時を立直り反射の回復時間と考えた。
きなくなった時を立直り反射の回復時間と考えた。
瞳孔の拡大、運動活性の増大および呼吸速度の増大等を
含む種々のパラメータの肉眼的観察によって挙動を評価
した。さらに、ある種の雷同的(stereotypi
c)応答、例えば、強迫的にかじったり引掻いたりする
ことを注意深く観察した。
含む種々のパラメータの肉眼的観察によって挙動を評価
した。さらに、ある種の雷同的(stereotypi
c)応答、例えば、強迫的にかじったり引掻いたりする
ことを注意深く観察した。
EBZD
注射の10分後、動物は連続的な咀明反応を゛開始する
。呼吸は90分から204分まで増加した。
。呼吸は90分から204分まで増加した。
運動活性の増大0機能亢進(hyperreactiv
ity)なし。痛覚脱失なし。
ity)なし。痛覚脱失なし。
則虹屋
注射の10分後、呼吸は98分から65分まで減少。強
迫的咀明および軽度の興奮、興奮は短時間続いた0機能
亢進なし。痛覚脱失なし。
迫的咀明および軽度の興奮、興奮は短時間続いた0機能
亢進なし。痛覚脱失なし。
対曵工(
注射の4分後、動物は目を閉じる。呼吸減少(108分
から50分まで)。注射の1o分後、立直り反射欠如。
から50分まで)。注射の1o分後、立直り反射欠如。
動物は深い麻酔状態にはなかった。
bEBZD投与の28分後、立直り反射は回復した。痛
覚欠如なし。
覚欠如なし。
8日齢のヒナ鳥(chicken)の胚から心室を単個
細胞に分離し3日間回転培養に付した。この方法により
、直径約150ミクロンの小さな規則的球形の細胞が生
ずる。集塊内の細胞は互いに他と電気的に結合しており
、規則的な一定のリズムで同時に収縮する〔ミルダル(
Myrdal)およびデハーン(Dellaan)、ジ
ェイ、セル、フィズ、(ム蝕旦J社ム)(1983年)
旦互319〜325頁〕、電気生理学的特性を基準にす
れば、この調製物は成体の哺乳動物のプルキンエ線維、
主たる心臓の伝導系に似ている〔ミルダルおよびデハー
ン、デイ・イニシェイof the Heartbea
t)デニス・ノープル(Dents Noble)曙、
1975年、オツクスフォート・ユニバーシティ・プレ
ス社(Oxford University Pres
s) 、ロンドン、p、7〕。これらの集塊は24°C
で平衡化しbEBZDを用いて24時間処理した。2つ
の個別の実験において、100g/dの量で処理した集
塊の収縮速度は対照と有意に相違した。これを以下に示
す。
細胞に分離し3日間回転培養に付した。この方法により
、直径約150ミクロンの小さな規則的球形の細胞が生
ずる。集塊内の細胞は互いに他と電気的に結合しており
、規則的な一定のリズムで同時に収縮する〔ミルダル(
Myrdal)およびデハーン(Dellaan)、ジ
ェイ、セル、フィズ、(ム蝕旦J社ム)(1983年)
旦互319〜325頁〕、電気生理学的特性を基準にす
れば、この調製物は成体の哺乳動物のプルキンエ線維、
主たる心臓の伝導系に似ている〔ミルダルおよびデハー
ン、デイ・イニシェイof the Heartbea
t)デニス・ノープル(Dents Noble)曙、
1975年、オツクスフォート・ユニバーシティ・プレ
ス社(Oxford University Pres
s) 、ロンドン、p、7〕。これらの集塊は24°C
で平衡化しbEBZDを用いて24時間処理した。2つ
の個別の実験において、100g/dの量で処理した集
塊の収縮速度は対照と有意に相違した。これを以下に示
す。
実験l:
(測定された収縮速度(秒)15回の収縮量間隔)N
平 均 標準偏差 SE MEAN未処理 14
11.48 1.44 0.38処理 1
4 7.94 2,04 0.55実験2: N 平 均 標準偏差 SE MEAN未処理
13 24.59 3,18 0.813処
理 12 19.33 2.37 0.68各実験にお
いて、スチューデントTテストによれば、処理された母
集団は有意に未処理の母集団と異なっている。これら2
つの母集団が同じものであるという確率は0.0001
より小さイ(p=0.0000)。
平 均 標準偏差 SE MEAN未処理 14
11.48 1.44 0.38処理 1
4 7.94 2,04 0.55実験2: N 平 均 標準偏差 SE MEAN未処理
13 24.59 3,18 0.813処
理 12 19.33 2.37 0.68各実験にお
いて、スチューデントTテストによれば、処理された母
集団は有意に未処理の母集団と異なっている。これら2
つの母集団が同じものであるという確率は0.0001
より小さイ(p=0.0000)。
配f12丸定
ウシおよびヒトのEBZDのアミノ酸配列を、(a)エ
ンドブロティナーゼリシンC,(b)キモトリプシン、
(C)スタフィロコツカル・アウレウス(Sta h
1ococcal aureus) V8および(d)
臭化シアンを用いたbEBZDおよびhEBZDの消化
により得られたペプチドのマイクロシーフェンス分析に
よって決定した。ペプチドフラグメントは揮発性溶剤を
用いてrpHPLcによって精製した。アミン末端をブ
ロックしたペプチドを12N )ICf中で周囲温度に
おいて16時間インキュベーションした。次いで、・試
料を凍結乾燥によって乾燥させた。ペプチドを、470
A型気相プロテインシークエンサー(ProteinS
equencer) (アプライド・バイオシステムズ
社(Applied Biosystems、Inc、
))による自動反復エドマン分解に付した。rpHPL
Cによってフェニルチオヒダントインアミノ酸を分析し
た。
ンドブロティナーゼリシンC,(b)キモトリプシン、
(C)スタフィロコツカル・アウレウス(Sta h
1ococcal aureus) V8および(d)
臭化シアンを用いたbEBZDおよびhEBZDの消化
により得られたペプチドのマイクロシーフェンス分析に
よって決定した。ペプチドフラグメントは揮発性溶剤を
用いてrpHPLcによって精製した。アミン末端をブ
ロックしたペプチドを12N )ICf中で周囲温度に
おいて16時間インキュベーションした。次いで、・試
料を凍結乾燥によって乾燥させた。ペプチドを、470
A型気相プロテインシークエンサー(ProteinS
equencer) (アプライド・バイオシステムズ
社(Applied Biosystems、Inc、
))による自動反復エドマン分解に付した。rpHPL
Cによってフェニルチオヒダントインアミノ酸を分析し
た。
これとは別に、蛋白質(ウシおよびヒトEBZD )ま
たはペプチドを、6 N ’HCβを用いて105°C
で16〜20時間減圧において加水分解した。得られた
アミノ酸をフェニルチオカルバモイル誘導体に転化しピ
コ(Pico)TAGシステム〔ウォーターズ・アソシ
エーツ(Waters As5ociates))によ
って分析した。フェニルチオカルバモイルアミノ酸を2
54nMの吸光度によって検出した。
たはペプチドを、6 N ’HCβを用いて105°C
で16〜20時間減圧において加水分解した。得られた
アミノ酸をフェニルチオカルバモイル誘導体に転化しピ
コ(Pico)TAGシステム〔ウォーターズ・アソシ
エーツ(Waters As5ociates))によ
って分析した。フェニルチオカルバモイルアミノ酸を2
54nMの吸光度によって検出した。
U廻皇化ヱ盪造
bEBZDおよびhEBZD (7) 7ミノ酸配置を
、6NIICj2で加水分解した後、アミノ酸自動分析
装置を用いて決定した。これらの蛋白質には、システィ
ンを除くすべての共通のアミノ酸が存在していた。これ
らのデータから計算された最小分子量は約9,900で
あり、5O5−PAGEによって確認された値と一致す
る。
、6NIICj2で加水分解した後、アミノ酸自動分析
装置を用いて決定した。これらの蛋白質には、システィ
ンを除くすべての共通のアミノ酸が存在していた。これ
らのデータから計算された最小分子量は約9,900で
あり、5O5−PAGEによって確認された値と一致す
る。
N−末端アミノ酸は、数サイクルのエドマン分解を実施
した場合でさえ検出されなかった。このことは、bEB
ZDおよびhEBZDの末端アミノ基がブロックされて
いることを示唆している。配列は実験の部に記載のよう
に決定した。bEBZDおよびhEBZDの配列を、公
表されているDBIの配列と比較しながら以下に示す。
した場合でさえ検出されなかった。このことは、bEB
ZDおよびhEBZDの末端アミノ基がブロックされて
いることを示唆している。配列は実験の部に記載のよう
に決定した。bEBZDおよびhEBZDの配列を、公
表されているDBIの配列と比較しながら以下に示す。
った1個の塩基変化と一致する。これらの結果は、ヒト
およびウシのEBZDが異なる種の間で構造的に高度に
保存されていることを立証している。
およびウシのEBZDが異なる種の間で構造的に高度に
保存されていることを立証している。
bEBZD配列と異なるhEBZDアミノ酸配列中の残
基には下線を引いた。
基には下線を引いた。
hEBZDのアミノ酸配列とbEBZDのアミノ酸配列
との比較は、ヒトおよびウシのEBZDが数個の保存的
置換基によってのみ互いに他と相違しているのかもしれ
ないということを示している。6個のアミノ酸置換基の
中の5個がDNAレベルにおけるたウシの組織から単離
したポリ (A” )RNAをcDNA合成用の鋳型と
して使用した。第1鎖のcDNA合成はオリゴ(dT)
とトリ骨髄芽球症ウィルス(AMV)逆転写酵素とを使
用して実施した。第2鎖は大腸菌RNase H、DN
AポリメラーゼIおよびIIINAリガーゼ(NAD“
)を使用して合成した。S1ヌクレアーゼ消化および続
いて大腸菌DNAポリメラーゼIの大断片によるフィル
イン反応によって2本1jcDNAを平滑末端化した。
との比較は、ヒトおよびウシのEBZDが数個の保存的
置換基によってのみ互いに他と相違しているのかもしれ
ないということを示している。6個のアミノ酸置換基の
中の5個がDNAレベルにおけるたウシの組織から単離
したポリ (A” )RNAをcDNA合成用の鋳型と
して使用した。第1鎖のcDNA合成はオリゴ(dT)
とトリ骨髄芽球症ウィルス(AMV)逆転写酵素とを使
用して実施した。第2鎖は大腸菌RNase H、DN
AポリメラーゼIおよびIIINAリガーゼ(NAD“
)を使用して合成した。S1ヌクレアーゼ消化および続
いて大腸菌DNAポリメラーゼIの大断片によるフィル
イン反応によって2本1jcDNAを平滑末端化した。
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ
を使用して、デオキシグアニン残基約15個をcDNA
の3′末端に酵素的に加えた。次に、このGの圧部をも
つcDNAをA−50カラム上でサイズ分別して、50
0塩基対未満のcDNAと導入されなかったデオキシグ
アニン残基とを除去した。次に、プールしたcDNAの
濃縮を、は遼R1で消化したλgt、10 ONAの
存在下におけるエタノール沈殿によって実施した。
を使用して、デオキシグアニン残基約15個をcDNA
の3′末端に酵素的に加えた。次に、このGの圧部をも
つcDNAをA−50カラム上でサイズ分別して、50
0塩基対未満のcDNAと導入されなかったデオキシグ
アニン残基とを除去した。次に、プールしたcDNAの
濃縮を、は遼R1で消化したλgt、10 ONAの
存在下におけるエタノール沈殿によって実施した。
EcoRIで切断したλgt、10に対するGの足部を
もつcDNAの連結反応は、3′末端にデオキシシトシ
ン12個を含みそして5′末端に1EcoRI開裂DN
Aの1本鎖突出部に相補的な配列(AATT)を含む1
本鎖オリゴヌクレオチドリンカーを使用して新規の方法
によって実施した。連結したDNAのin vitr
。
もつcDNAの連結反応は、3′末端にデオキシシトシ
ン12個を含みそして5′末端に1EcoRI開裂DN
Aの1本鎖突出部に相補的な配列(AATT)を含む1
本鎖オリゴヌクレオチドリンカーを使用して新規の方法
によって実施した。連結したDNAのin vitr
。
パッケージングの後で、組換えファージを大腸菌株C6
00rk−mk” Hfj!中へ導入した。これは、組
換え(野生型でない)フェーダに感染すると細胞溶菌さ
れる。その方法により、放射性標識合成オリゴヌクレオ
チド〔17ヌクレオチド長:その配列はウシEBZD中
に見出される6個の連続するアミノ酸(KWDAWN)
によって推定した〕を使用し、プラークからのDNAを
二重にスクリーニングした。コドンが不明なので、オリ
ゴヌクレオチドの32種の縮重プールとしてMSIを合
成した。MSIによるスクリーニングにより陽性のプラ
ークを得これをプラーク精製し、そして1.8kbの挿
入部を含有することが示された。この挿入部をプラスミ
ドpEMBL中にサブクローン化した。これをpMPl
と称する。挿入部を制限地図化した後、続いて適当な数
片をM13株中に更にサブクローン化し、そしてSan
gerCou 1serのジデオキシ法によって配列を
決めた。
00rk−mk” Hfj!中へ導入した。これは、組
換え(野生型でない)フェーダに感染すると細胞溶菌さ
れる。その方法により、放射性標識合成オリゴヌクレオ
チド〔17ヌクレオチド長:その配列はウシEBZD中
に見出される6個の連続するアミノ酸(KWDAWN)
によって推定した〕を使用し、プラークからのDNAを
二重にスクリーニングした。コドンが不明なので、オリ
ゴヌクレオチドの32種の縮重プールとしてMSIを合
成した。MSIによるスクリーニングにより陽性のプラ
ークを得これをプラーク精製し、そして1.8kbの挿
入部を含有することが示された。この挿入部をプラスミ
ドpEMBL中にサブクローン化した。これをpMPl
と称する。挿入部を制限地図化した後、続いて適当な数
片をM13株中に更にサブクローン化し、そしてSan
gerCou 1serのジデオキシ法によって配列を
決めた。
pMPl中に含まれるcDNAは、MSIの種とほとん
ど同じ挿入部の5′末端から約300塩基対のDNA配
列を含んでいた。更に、pMPlのヌクレオチド配列に
より、配列が決定されているウシEBZDに関して決定
したアミノ酸配列と類似の(但し、同一ではない)アミ
ノ酸配列が予想された。これらの2種の蛋白質が密接に
関連していることはアミノ酸配列の顕著な保存性によっ
て示唆されている。配列が決まっているEBZDからア
ミノ酸3個を除去することにより、残りのアミノ酸をp
MPlの配列と関連させることができ、この結果アミノ
酸43%が保存される。更に、多数の変化が保存的置換
を含んでいる(前記の記載を参照されたい)。
ど同じ挿入部の5′末端から約300塩基対のDNA配
列を含んでいた。更に、pMPlのヌクレオチド配列に
より、配列が決定されているウシEBZDに関して決定
したアミノ酸配列と類似の(但し、同一ではない)アミ
ノ酸配列が予想された。これらの2種の蛋白質が密接に
関連していることはアミノ酸配列の顕著な保存性によっ
て示唆されている。配列が決まっているEBZDからア
ミノ酸3個を除去することにより、残りのアミノ酸をp
MPlの配列と関連させることができ、この結果アミノ
酸43%が保存される。更に、多数の変化が保存的置換
を含んでいる(前記の記載を参照されたい)。
pMPlの発見は、ウシEBZDが同様の生物学的活性
の蛋白質をコードしているであろう関連遺伝子の群の一
員であることを示している。最後に注意すべき点は、配
列の決定されたウシの脳の因子よりも大きい蛋白質をp
MPlがコードしている点である。
の蛋白質をコードしているであろう関連遺伝子の群の一
員であることを示している。最後に注意すべき点は、配
列の決定されたウシの脳の因子よりも大きい蛋白質をp
MPlがコードしている点である。
なぜなら、リーディングフレームが、その蛋白質の公知
の末端アミノ酸の上流および下流の両方に延びているか
らである。
の末端アミノ酸の上流および下流の両方に延びているか
らである。
並堕遺伝玉夏主屋
ウシの肺臓を使用している前記の方法を繰返した。得ら
れたcDNAは0.6kbpの挿入部であり、これをp
HMBL中にクローン化してpHBZDを得た。配列決
定を行なったところ、pMPlと相同のコード配列が得
られた。ウシのエンドゼピン(bEBZD)をコードす
るDN^断片を、Dra I消化および」憇1消化を組
合せることにより、cDNAプラスミド(EBZD)か
ら切り出した。その断片をゲル電気泳動によって精製し
、発現ベクター(pSM 1 、2)中にStu 1部
位に挿入した。pSM 1.2発現ベクターの形成は、
pBR322の複製開始点およびβ−ラクタマーゼ遺伝
子(Bolivar等、Gene(1977) 2 :
95) 、pTR213のlacプロモーターおよび
リボソーマル結合部位(Roberts等、Proc、
Natl、 Acad、 Sci、 USA(197
9)匹: 760−764 )をpLG300のi−Z
融合遺伝子(Guarente等、Ce1l(1980
)20 : 543−553 )にスプライシングする
ことによって行なった。得られたプラスミドはクローニ
ング部位例えばStu T部位に挿入された外来遺伝子
を融合蛋白質として発現することができる。この構造に
おいて、EBZDに関する全コード配列は、cro蛋白
質の最初の2個のアミノ酸をコードするDNAに位相を
合わせて融合された。プラスミドpsB108は挿入部
を正しい配向で含んでおり、プラスミドpsB103は
挿入部を誤った配向で含んでおり、そしてプラスミドp
sB125は挿入部を含んでいない。各種のプラスミド
を含む大腸菌HBIOIクローンを対数期まで増殖させ
、そして振とうしなから37°Cで2時間、最終濃度1
mMまでIPTGを加えることによって誘導した。この
細胞を遠心によって収集し、リゾチーム洗浄剤処理によ
って溶菌した。基本的に、溶菌物は上清(細胞質ゾル)
とペレット(細胞質内封入体)とに分けて、免疫化学的
技術によって分析することができる。
れたcDNAは0.6kbpの挿入部であり、これをp
HMBL中にクローン化してpHBZDを得た。配列決
定を行なったところ、pMPlと相同のコード配列が得
られた。ウシのエンドゼピン(bEBZD)をコードす
るDN^断片を、Dra I消化および」憇1消化を組
合せることにより、cDNAプラスミド(EBZD)か
ら切り出した。その断片をゲル電気泳動によって精製し
、発現ベクター(pSM 1 、2)中にStu 1部
位に挿入した。pSM 1.2発現ベクターの形成は、
pBR322の複製開始点およびβ−ラクタマーゼ遺伝
子(Bolivar等、Gene(1977) 2 :
95) 、pTR213のlacプロモーターおよび
リボソーマル結合部位(Roberts等、Proc、
Natl、 Acad、 Sci、 USA(197
9)匹: 760−764 )をpLG300のi−Z
融合遺伝子(Guarente等、Ce1l(1980
)20 : 543−553 )にスプライシングする
ことによって行なった。得られたプラスミドはクローニ
ング部位例えばStu T部位に挿入された外来遺伝子
を融合蛋白質として発現することができる。この構造に
おいて、EBZDに関する全コード配列は、cro蛋白
質の最初の2個のアミノ酸をコードするDNAに位相を
合わせて融合された。プラスミドpsB108は挿入部
を正しい配向で含んでおり、プラスミドpsB103は
挿入部を誤った配向で含んでおり、そしてプラスミドp
sB125は挿入部を含んでいない。各種のプラスミド
を含む大腸菌HBIOIクローンを対数期まで増殖させ
、そして振とうしなから37°Cで2時間、最終濃度1
mMまでIPTGを加えることによって誘導した。この
細胞を遠心によって収集し、リゾチーム洗浄剤処理によ
って溶菌した。基本的に、溶菌物は上清(細胞質ゾル)
とペレット(細胞質内封入体)とに分けて、免疫化学的
技術によって分析することができる。
発現したEBZD融合蛋白質のレベルを、競争的ラジオ
イムノアッセイによって測定した。その結果が示すとこ
ろによれば、正しい配向で挿入部をもつEBZD発現ベ
クター(ps8108)を含む大腸国クローンだけが高
いレベルのEBZDポリペプチドを産生ずる。大部分の
cro−EBZDは上清分画(細胞質ゾル)中に見出さ
れた。ペレット分画(細胞質封入体)中には、検出可能
な量だけが見出された。一方、psB103またはps
B125クローンのいずれの溶菌物においてもcro−
EBZDは検出されなかった。rPTGによる誘導後に
、細胞培養物11当り0.5■のcr。
イムノアッセイによって測定した。その結果が示すとこ
ろによれば、正しい配向で挿入部をもつEBZD発現ベ
クター(ps8108)を含む大腸国クローンだけが高
いレベルのEBZDポリペプチドを産生ずる。大部分の
cro−EBZDは上清分画(細胞質ゾル)中に見出さ
れた。ペレット分画(細胞質封入体)中には、検出可能
な量だけが見出された。一方、psB103またはps
B125クローンのいずれの溶菌物においてもcro−
EBZDは検出されなかった。rPTGによる誘導後に
、細胞培養物11当り0.5■のcr。
EBZDが産生されたものと推定される。
Blo−5il TSK−250分取用カラム(60x
2. l cm)を高圧液体クロマトグラフィー(l
(PLC)システム(Waters As5ociat
es)に取付けた。トリフルオロ酢酸(TF八)0.1
%を含む水中の40%アセトニトリル中に粗製分画を8
■/−の濃度で溶解した。カラムを0.1%TF八を含
む40%アセトニトリルで平衡化した。アリコート2d
(タンパク質16■)を注入し、最終濃度0.1%のT
FAを含む水中の40%アセトニトリル移動相によって
均一に展開を実施した。BPの位置(分画23)が分か
った後で、前記の操作を二〜三百回行なった。分画を監
視する方法は後述する細胞増殖調節アッセイであった。
2. l cm)を高圧液体クロマトグラフィー(l
(PLC)システム(Waters As5ociat
es)に取付けた。トリフルオロ酢酸(TF八)0.1
%を含む水中の40%アセトニトリル中に粗製分画を8
■/−の濃度で溶解した。カラムを0.1%TF八を含
む40%アセトニトリルで平衡化した。アリコート2d
(タンパク質16■)を注入し、最終濃度0.1%のT
FAを含む水中の40%アセトニトリル移動相によって
均一に展開を実施した。BPの位置(分画23)が分か
った後で、前記の操作を二〜三百回行なった。分画を監
視する方法は後述する細胞増殖調節アッセイであった。
前記の浸透クロマトグラフィーから脳因子(CIA)の
見掛けの分子量を計算したところ、約18kDalであ
った。
見掛けの分子量を計算したところ、約18kDalであ
った。
TSK−250の゛ 8 クロマトグラフィ−15
試行からのTSK−250画分23をプールした(容量
75m)。プールされた材料を水中0.1%TFAによ
り2倍に希釈した。この混合物を、水中0.1%TFA
によりあらかじめ平衡化されたμmボンダパック−Cl
カラム(78M内径X 300mm)に室温にて均一に
注入した。−次溶剤0.1%TF^と二次溶剤0.1%
TFAを伴うアセトニトリルとの間で直線グラジェント
を用いた。グラジェント条件は20分間に0〜28%、
140分間に28〜42%、10分間に42〜52%、
そして次に6分間に52〜100%であった。
試行からのTSK−250画分23をプールした(容量
75m)。プールされた材料を水中0.1%TFAによ
り2倍に希釈した。この混合物を、水中0.1%TFA
によりあらかじめ平衡化されたμmボンダパック−Cl
カラム(78M内径X 300mm)に室温にて均一に
注入した。−次溶剤0.1%TF^と二次溶剤0.1%
TFAを伴うアセトニトリルとの間で直線グラジェント
を用いた。グラジェント条件は20分間に0〜28%、
140分間に28〜42%、10分間に42〜52%、
そして次に6分間に52〜100%であった。
すべての溶剤はHPLCグレードであった。4dの両分
を集めた。各両分のアリコートを5hgのBSA と共
に乾燥し、そしてCIAについてアッセイした。
を集めた。各両分のアリコートを5hgのBSA と共
に乾燥し、そしてCIAについてアッセイした。
CIAの2個のピークを貯蔵した。第1の活性(α)は
32〜33.5%の間のアセトニトリル濃度において溶
出し、他方筒2のピーク(β)は34.5〜36%の間
のアセトニトリル濃度で溶出した。α活性のこれ以上の
精製は次のようにして行った。
32〜33.5%の間のアセトニトリル濃度において溶
出し、他方筒2のピーク(β)は34.5〜36%の間
のアセトニトリル濃度で溶出した。α活性のこれ以上の
精製は次のようにして行った。
10試行からの活性画分30及び31をプールし、そし
てO11%TF^により2倍に希釈した。希釈されたサ
ンプルをμmボンダパックカラム(78X 300mm
)に均一に適用し、そしてカラムを0.1%TFAで洗
浄しそして平衡化した。流速はld/分であり、そして
チャートスピードは0.ICl0/分であった。やはり
、第1溶剤0.1%TFAと第2溶剤0.1%TFAの
濃度を有するアセトニトリルとの間で直線グラジェント
を用いた。グラジェント条件は、40分間に0〜30%
、240分間に30〜38%、そして20分間に38〜
100%であった。最初の12画分は6戒であり、そし
て次に4rd画分を集めた。アリコートをCIAについ
てアッセイした。活性は32〜33.5%の間のアセト
ニトリル濃度において溶出した。
てO11%TF^により2倍に希釈した。希釈されたサ
ンプルをμmボンダパックカラム(78X 300mm
)に均一に適用し、そしてカラムを0.1%TFAで洗
浄しそして平衡化した。流速はld/分であり、そして
チャートスピードは0.ICl0/分であった。やはり
、第1溶剤0.1%TFAと第2溶剤0.1%TFAの
濃度を有するアセトニトリルとの間で直線グラジェント
を用いた。グラジェント条件は、40分間に0〜30%
、240分間に30〜38%、そして20分間に38〜
100%であった。最初の12画分は6戒であり、そし
て次に4rd画分を集めた。アリコートをCIAについ
てアッセイした。活性は32〜33.5%の間のアセト
ニトリル濃度において溶出した。
両分30〜32をプールした。12成の0.1%TFA
をプールされた両分に加えた。混合物(24dを、0.
1%TFAで平衡化された分析用μmボンダパックCI
Bカラム(3,9X 3000TI11)上に均一に適
用した。流速及びチャートスピードはそれぞれ0.4
d/分及び0.1cm/分であった。やはり、第1溶剤
0.1%TFAと第2溶剤0.1%TFAの濃度を有す
るアセトニトリルの間で直線グラジェントを用いた。
をプールされた両分に加えた。混合物(24dを、0.
1%TFAで平衡化された分析用μmボンダパックCI
Bカラム(3,9X 3000TI11)上に均一に適
用した。流速及びチャートスピードはそれぞれ0.4
d/分及び0.1cm/分であった。やはり、第1溶剤
0.1%TFAと第2溶剤0.1%TFAの濃度を有す
るアセトニトリルの間で直線グラジェントを用いた。
グラジェント条件は、25分間に0〜30%、200分
間に30〜38%、そして25分間に38〜100%で
あった。2rdの両分を集めた。両分のアリコートをC
IAについてアッセイした。活性は分析用C18カラム
から、約34%のアセトニトリル濃度において溶出した
。
間に30〜38%、そして25分間に38〜100%で
あった。2rdの両分を集めた。両分のアリコートをC
IAについてアッセイした。活性は分析用C18カラム
から、約34%のアセトニトリル濃度において溶出した
。
画分29−31をプールし、そして0.1%TF八で2
倍に希釈し、そしてμmポンダパックCI8カラム(3
,9X 300nm)に適用した。第1溶剤0.1%T
F^と第2溶剤0.1%TFAの濃度を有するn−プロ
パツールとの間の直線グラジェントを用いた。グラジェ
ント条件は、40分間に0−18%、225分間に18
〜27%、そして20分間に27〜35%であった。流
速は0.4m/分であり、そしてチャートスピードは0
.IC11/分に設定された。両分を集め、そしてアリ
コートをCIAについてアッセイした。活性は約23%
のn−プロパツール濃度において溶出した。
倍に希釈し、そしてμmポンダパックCI8カラム(3
,9X 300nm)に適用した。第1溶剤0.1%T
F^と第2溶剤0.1%TFAの濃度を有するn−プロ
パツールとの間の直線グラジェントを用いた。グラジェ
ント条件は、40分間に0−18%、225分間に18
〜27%、そして20分間に27〜35%であった。流
速は0.4m/分であり、そしてチャートスピードは0
.IC11/分に設定された。両分を集め、そしてアリ
コートをCIAについてアッセイした。活性は約23%
のn−プロパツール濃度において溶出した。
両分28及び29をプールし、そして0.1%TFAに
より5倍希釈し、そして0.1%TFAの濃度を有する
n−プロパツールを第2溶剤として用いてμ−ボンダパ
ックCl1lカラム(319X 300am)上で再ク
ロマトグラフ処理した。クロマトグラフ条件及びグラジ
ェント条件はすぐ上に記載したのと同じであった。最初
の8個の両分は6dであり、そして1、6 mの両分を
集めた。各両分のアリコートをCIAについてアッセイ
した。はとんどの活性が両分15〜17に現われた。画
分15〜17は約15xの蛋白質及ヒ約230×lO3
ユニットのCIAを含有していた。
より5倍希釈し、そして0.1%TFAの濃度を有する
n−プロパツールを第2溶剤として用いてμ−ボンダパ
ックCl1lカラム(319X 300am)上で再ク
ロマトグラフ処理した。クロマトグラフ条件及びグラジ
ェント条件はすぐ上に記載したのと同じであった。最初
の8個の両分は6dであり、そして1、6 mの両分を
集めた。各両分のアリコートをCIAについてアッセイ
した。はとんどの活性が両分15〜17に現われた。画
分15〜17は約15xの蛋白質及ヒ約230×lO3
ユニットのCIAを含有していた。
この画分をHPLCC+−画分とした。最終精製画分は
、CCL64を試験細胞として用いた蛋白質■当り15
.33xlO3ユニツトの比活性を有していた。
、CCL64を試験細胞として用いた蛋白質■当り15
.33xlO3ユニツトの比活性を有していた。
次の第4表は結果を要約する。
第4表 ウシ脳因子の精製
粗製物 3,680 1.551 0.421
TSK−2506302,7604,38HPLC−C
1B’ 0.015 230 15.33
3.0000 81 14.8 (*) CCL64細胞のDN^への12S(−デオキシウリジ
ンの取り込みを50%阻害するために必要な材料アッセ
イはNunc96ウエルプレート(Kamstrupv
ej90、Dに−4+000+ Roskilde 、
デンマーク)中で行った。ヒト肺癌細胞(A549)又
はミンクの肺細胞(CCL64)を試験細胞として使用
した。10%ウシ胎児血清(FCS)及びペニシリン/
ストレプトマイシン(P / S ) (0,57nt
g/dずつ)及びグルタミンを伴うドルベコ改変イーグ
ル培地(DMEM)50m中3.5×103細胞を、端
のウェル以外のすべてのウェルに導入した。端のウェル
には50I11のPBSを導入し、そしてプレートを3
7°Cにてインキュベートした。
TSK−2506302,7604,38HPLC−C
1B’ 0.015 230 15.33
3.0000 81 14.8 (*) CCL64細胞のDN^への12S(−デオキシウリジ
ンの取り込みを50%阻害するために必要な材料アッセ
イはNunc96ウエルプレート(Kamstrupv
ej90、Dに−4+000+ Roskilde 、
デンマーク)中で行った。ヒト肺癌細胞(A549)又
はミンクの肺細胞(CCL64)を試験細胞として使用
した。10%ウシ胎児血清(FCS)及びペニシリン/
ストレプトマイシン(P / S ) (0,57nt
g/dずつ)及びグルタミンを伴うドルベコ改変イーグ
ル培地(DMEM)50m中3.5×103細胞を、端
のウェル以外のすべてのウェルに導入した。端のウェル
には50I11のPBSを導入し、そしてプレートを3
7°Cにてインキュベートした。
試験サンプルを、10%FC5、P/S及びグルタミン
を含むDMEM中に懸濁して3連試験を行った。4日後
、50ハの試験サンプルを各試験ウェルに加え、他方対
照ウェルには50dの培地のみを加えた。プレートを3
7°Cにて3日間インキュベートした。4日目に、1′
!−ヨード−2′−デオキシウリジンの溶液((4ct
/mg o、 5mC1/ml (0,1Jアイソト
ープ/mれ10%FCS 、 P/S、グルタミンを含
有するDMEM中)100Iiを各ウェルに加え、そし
てプレートトを37“Cにてインキュベートした。5日
目に、培地をウェルから吸引し、200IのPBSで1
回洗浄した。次に、200 dのメタノールを各ウェル
に加え、プレートを10分間インキュベートし、そして
メタノールを吸引により除去した。水酸化ナトリウム(
200d、IM)を各ウェルに加え、プレートを30分
間37°Cにてインキュベートし、そして次に水酸化ナ
トリウムをタイターチック(Tttertec)プラグ
(フロー・ラプス)により取り出した。
を含むDMEM中に懸濁して3連試験を行った。4日後
、50ハの試験サンプルを各試験ウェルに加え、他方対
照ウェルには50dの培地のみを加えた。プレートを3
7°Cにて3日間インキュベートした。4日目に、1′
!−ヨード−2′−デオキシウリジンの溶液((4ct
/mg o、 5mC1/ml (0,1Jアイソト
ープ/mれ10%FCS 、 P/S、グルタミンを含
有するDMEM中)100Iiを各ウェルに加え、そし
てプレートトを37“Cにてインキュベートした。5日
目に、培地をウェルから吸引し、200IのPBSで1
回洗浄した。次に、200 dのメタノールを各ウェル
に加え、プレートを10分間インキュベートし、そして
メタノールを吸引により除去した。水酸化ナトリウム(
200d、IM)を各ウェルに加え、プレートを30分
間37°Cにてインキュベートし、そして次に水酸化ナ
トリウムをタイターチック(Tttertec)プラグ
(フロー・ラプス)により取り出した。
プラグを12 X 75aaiのプラスチックチューブ
に移し、そして放射能を定量測定するためにT−カウン
ターで計数した。
に移し、そして放射能を定量測定するためにT−カウン
ターで計数した。
ソフトアガー・コロニー阻 アッセイ
10%ウシ血清を含有するDMEM中0.5%寒天(ア
ガーノープル:デイフコラボラトリーズ、デトロイト、
ミシガン)の2.0 dの基層を60価のコスタ−組織
培養皿に加えた。同じ培地−ウシ血清混合物、1. O
XIO’ A349 Ag3 (ソフトアガー増殖クロ
ーン3)細胞及び2連の種々の濃度の試験されるべきサ
ンプルを含有する0、 3%寒天を加えた。
ガーノープル:デイフコラボラトリーズ、デトロイト、
ミシガン)の2.0 dの基層を60価のコスタ−組織
培養皿に加えた。同じ培地−ウシ血清混合物、1. O
XIO’ A349 Ag3 (ソフトアガー増殖クロ
ーン3)細胞及び2連の種々の濃度の試験されるべきサ
ンプルを含有する0、 3%寒天を加えた。
プレートを空気中5%Cotの加湿雰囲気中で37°C
にてインキュベートし、そして7日後に適切な補充物を
含有する0、3%寒天2. Ordの添加により再供給
した。コロニーを固定せず染色しないで測定し、そして
低倍率の無作為の視野5個当り6細胞より多いコロニー
の数を7日及び14日後に計数した。
にてインキュベートし、そして7日後に適切な補充物を
含有する0、3%寒天2. Ordの添加により再供給
した。コロニーを固定せず染色しないで測定し、そして
低倍率の無作為の視野5個当り6細胞より多いコロニー
の数を7日及び14日後に計数した。
コロニーノ ・アッセイ
このアッセイは6ウエルーフアルコンプレート(9,6
culの面積/ウェル)中で行った。A349細胞(2
00)を各ウェル中、10%FC3、P/S及びグルタ
ミンを含むIMlのDMEM中にプレートした。プレー
トした直後に、1.0 mlの培地中種々の濃度の試験
材料を2連で加えた。対照ウェルには試験材料をなんら
含まない1.0 tdの培地のみを加えた。プレート空
気中5%CO2の加湿雰囲気中37°Cにて10日間イ
ンキュベートし、50%メタノール中0.2%メチレン
ブルー1.0蔵を各ウェルに添加し、そして20分間放
置し、染料を除去し、そして各ウェルを0.1 mlの
水で2回洗浄し、そして空気乾燥した。
culの面積/ウェル)中で行った。A349細胞(2
00)を各ウェル中、10%FC3、P/S及びグルタ
ミンを含むIMlのDMEM中にプレートした。プレー
トした直後に、1.0 mlの培地中種々の濃度の試験
材料を2連で加えた。対照ウェルには試験材料をなんら
含まない1.0 tdの培地のみを加えた。プレート空
気中5%CO2の加湿雰囲気中37°Cにて10日間イ
ンキュベートし、50%メタノール中0.2%メチレン
ブルー1.0蔵を各ウェルに添加し、そして20分間放
置し、染料を除去し、そして各ウェルを0.1 mlの
水で2回洗浄し、そして空気乾燥した。
コロニーのサイズ及び数を定量測定した。
±理字昨1貫
DNA合成の50%阻害が、それぞれ98 n / m
fl、21ug / d及び95%g/mの粗画分、T
SK−250画分及び最終純蛋白質において観察された
。従って、A349ヒト肺癌細胞における50%DNA
合成阻害が純蛋白質の約9nM濃度において見られた。
fl、21ug / d及び95%g/mの粗画分、T
SK−250画分及び最終純蛋白質において観察された
。従って、A349ヒト肺癌細胞における50%DNA
合成阻害が純蛋白質の約9nM濃度において見られた。
bBFはまた、寒天(Ag)上でのヒト肺癌細胞A34
9の足場独立性増殖を阻害した。ソフトアガー中でのコ
ロニー形成の50%減少が約76ng/mρのbBFに
おいて見られた。A349細胞のコロニー形成率はこの
蛋白質により顕著に阻害された。13%g/d(1,2
4%M)の蛋白質濃度において、コロニー形成率は対照
のそれに比べて50%に過ぎなかった。約80ng/r
dのbBFの存在下ではへ549111胞のコロニーは
見られなかった。
9の足場独立性増殖を阻害した。ソフトアガー中でのコ
ロニー形成の50%減少が約76ng/mρのbBFに
おいて見られた。A349細胞のコロニー形成率はこの
蛋白質により顕著に阻害された。13%g/d(1,2
4%M)の蛋白質濃度において、コロニー形成率は対照
のそれに比べて50%に過ぎなかった。約80ng/r
dのbBFの存在下ではへ549111胞のコロニーは
見られなかった。
A349細胞を種々の濃度のbBFの存在下又は非存在
下で増殖せしめ、そして細胞の増殖を直接細胞計数にモ
ニターした場合、bBFは量依存的に細胞増殖を阻害す
ることが見出された。すなわち、DNAへの1251−
デオキシウリジンの取り込みは細胞増殖の良好な基準で
ある。
下で増殖せしめ、そして細胞の増殖を直接細胞計数にモ
ニターした場合、bBFは量依存的に細胞増殖を阻害す
ることが見出された。すなわち、DNAへの1251−
デオキシウリジンの取り込みは細胞増殖の良好な基準で
ある。
bBFはA349細胞、ヒト黒色腫細胞(A375八g
)及びヒト乳癌細胞(MCF −7)の種々のクローン
の増殖を阻害した。ヒト***線維芽細胞(Wl−26)
の増殖がbBFにより刺激された。脳因子はまた、ネズ
ミ線維芽細胞セルライン3T3−A31に対して増殖刺
激的である。
)及びヒト乳癌細胞(MCF −7)の種々のクローン
の増殖を阻害した。ヒト***線維芽細胞(Wl−26)
の増殖がbBFにより刺激された。脳因子はまた、ネズ
ミ線維芽細胞セルライン3T3−A31に対して増殖刺
激的である。
ヒトT−細胞機能(Zarling等、Transpl
antation(1976)釘、: 46B−47
63に対する脳因子の効果を研究するために、同種異系
的(allogeneicallいに誘導された増殖性
及び細胞変性ヒトリンパ球を生じさせそして測定するた
めのミクロ法を用いた。
antation(1976)釘、: 46B−47
63に対する脳因子の効果を研究するために、同種異系
的(allogeneicallいに誘導された増殖性
及び細胞変性ヒトリンパ球を生じさせそして測定するた
めのミクロ法を用いた。
末梢血リンパ球(PBL)を正常個体のヘパリン処理訊
液から、フィコール−ハイバク遠心により単離した。次
にFBI、をリン酸緩衝化塩溶液(PBS)で3回洗浄
し、そして10%の熱不活性化されたプールされた正常
ヒト血清(H5)が補充されたR PMI 1640の
培地(ギブコ、グランドアイル、NY)中に1×106
PBL/mff1の濃度で?A濁した。次に、O,l
dのこれらのPBL (応答細胞(respondin
g cell)と称する〕を96−ウェルプレートの2
連の丸底ウェルのそれぞれに加え、そして次に0.05
dの培地のみ又は2X10’個のX−線照射された(2
500Rad)同種異系細胞〔“刺激細胞”(stim
ulating cell)と称する]を含有する0、
05dの培地、及び0.05dの培地のみ又は種々の濃
度の脳因子(0,9〜75ユニツト脳因子/ウエルをも
たらす)を含有する培地を加えた。細胞を5%CO□イ
ンキュベーター中で37°Cにてインキュベートし、そ
して2日目及び5日目に0.05mNの培地を各ウェル
から取り出し、そして次にもとの濃度の脳因子を含有す
る培地0.05mRを添加した。
液から、フィコール−ハイバク遠心により単離した。次
にFBI、をリン酸緩衝化塩溶液(PBS)で3回洗浄
し、そして10%の熱不活性化されたプールされた正常
ヒト血清(H5)が補充されたR PMI 1640の
培地(ギブコ、グランドアイル、NY)中に1×106
PBL/mff1の濃度で?A濁した。次に、O,l
dのこれらのPBL (応答細胞(respondin
g cell)と称する〕を96−ウェルプレートの2
連の丸底ウェルのそれぞれに加え、そして次に0.05
dの培地のみ又は2X10’個のX−線照射された(2
500Rad)同種異系細胞〔“刺激細胞”(stim
ulating cell)と称する]を含有する0、
05dの培地、及び0.05dの培地のみ又は種々の濃
度の脳因子(0,9〜75ユニツト脳因子/ウエルをも
たらす)を含有する培地を加えた。細胞を5%CO□イ
ンキュベーター中で37°Cにてインキュベートし、そ
して2日目及び5日目に0.05mNの培地を各ウェル
から取り出し、そして次にもとの濃度の脳因子を含有す
る培地0.05mRを添加した。
増殖応答を決定するため、6日目に各群からウェルの内
容物をプールし、そして0.1 mを96−ウェルプレ
ートの4連のウェルのそれぞれに加え、次に0.025
dの容量中1pciの3((−チミジン(3H−TdR
、ニューイングランドニューフレア、ボストン、−八)
を加えた。6時間後、ウェルの内容物を多ウェル収得器
を用いてガラスフィルターストリップ上に収得し、これ
らのストリップをシンチレーション液体を含有するバイ
アルに移し、そして3.)I−TdR取り込みをβ−カ
ウンター中での計数により決定した。
容物をプールし、そして0.1 mを96−ウェルプレ
ートの4連のウェルのそれぞれに加え、次に0.025
dの容量中1pciの3((−チミジン(3H−TdR
、ニューイングランドニューフレア、ボストン、−八)
を加えた。6時間後、ウェルの内容物を多ウェル収得器
を用いてガラスフィルターストリップ上に収得し、これ
らのストリップをシンチレーション液体を含有するバイ
アルに移し、そして3.)I−TdR取り込みをβ−カ
ウンター中での計数により決定した。
細胞変性Tリンパ球(CTL)の生成に対する効果を決
定するため、6日目にウェルからブールされた残りのリ
ンパ球を96−ウェルプレートの3連の球底ウェルに加
え(0,15d/ウエル)、そして0.15dの4倍逐
次希釈物も3連のウェルのそれぞれに加えた。SIC,
ラベル化標的細胞(target cell)を調製す
るため、同種異系刺激細胞の提供者から生じたリンボブ
ラストイドセルライン(LCL)細胞1.5X10’を
500uci”Cr(Na2CrO,、=x−イングラ
ンドニュークレア、ボストン、 MA)により37゛C
にて1時間ラベルし、次に標的細胞を15%熱不活性化
ウシつ児血清(FCS)を含有する培地で3回洗浄し、
そしてこの培地に6X10’lH胞/ mlで再懸濁し
た。次に、0.05−の標的細胞を、エフェクター細胞
を収容する各ウェルに、及び培地のみ〔自然(spon
taneous) ” Cr放出を決定するため〕又
は洗剤のみ(SIC,放出を決定するため)を収容する
ウェルに加え、そしてプレートを37°Cにて6時間イ
ンキュベートした。次に、上清の一定のアリコートを各
ウェルから取り出し、そしてγカウンター中で計数する
ためにチューブに移した。特異的S+C,放出%を次の
ようにして決定した。
定するため、6日目にウェルからブールされた残りのリ
ンパ球を96−ウェルプレートの3連の球底ウェルに加
え(0,15d/ウエル)、そして0.15dの4倍逐
次希釈物も3連のウェルのそれぞれに加えた。SIC,
ラベル化標的細胞(target cell)を調製す
るため、同種異系刺激細胞の提供者から生じたリンボブ
ラストイドセルライン(LCL)細胞1.5X10’を
500uci”Cr(Na2CrO,、=x−イングラ
ンドニュークレア、ボストン、 MA)により37゛C
にて1時間ラベルし、次に標的細胞を15%熱不活性化
ウシつ児血清(FCS)を含有する培地で3回洗浄し、
そしてこの培地に6X10’lH胞/ mlで再懸濁し
た。次に、0.05−の標的細胞を、エフェクター細胞
を収容する各ウェルに、及び培地のみ〔自然(spon
taneous) ” Cr放出を決定するため〕又
は洗剤のみ(SIC,放出を決定するため)を収容する
ウェルに加え、そしてプレートを37°Cにて6時間イ
ンキュベートした。次に、上清の一定のアリコートを各
ウェルから取り出し、そしてγカウンター中で計数する
ためにチューブに移した。特異的S+C,放出%を次の
ようにして決定した。
次の第5表が結果を示す。
07
103.690
70、140
64.507
78.287
87.095
末梢血リンパ球(PBL)は正常個体■のヘパリン処理
血液から得られ、そして個体CがらのX−線照射された
(2500Rad)同種異系PBL (Cx)により刺
激され、そして6日後、3H−チミジン(’)I Td
R)の取り込みを上に詳述したようにして決定した。
血液から得られ、そして個体CがらのX−線照射された
(2500Rad)同種異系PBL (Cx)により刺
激され、そして6日後、3H−チミジン(’)I Td
R)の取り込みを上に詳述したようにして決定した。
CPM=カウント/分。
脳因子の同様な効果が試験した他のすべての提供者のP
BLのT−細胞増殖応答に対して観察された。脳因子に
よる一層顕著な程度の阻害がヒト細胞変性T−リンパ球
の生成に対して観察された。
BLのT−細胞増殖応答に対して観察された。脳因子に
よる一層顕著な程度の阻害がヒト細胞変性T−リンパ球
の生成に対して観察された。
同じ量のS I Cr放出を生じさせる未処理のエフェ
クター細胞の数として、75ユニツトの脳因子と共にイ
ンキュベートされた約16倍多くのエフェクター細胞が
42%のS I Cr放出を生じさせるために必要であ
る。
クター細胞の数として、75ユニツトの脳因子と共にイ
ンキュベートされた約16倍多くのエフェクター細胞が
42%のS I Cr放出を生じさせるために必要であ
る。
上記の結果から、この発明の化合物はインビトロ及びイ
ンビボの両方における広範囲の用途で使用され得ること
が明らかである。この発明のポリペプチド及び抗体は、
生理的流体、例えば血液、血清、血漿、尿、又は脳を髄
液中のこのような蛋白質の存在を細胞内的に又は細胞外
的に決定するため、組織中の細胞によって形成されるポ
リペプチドの量の決定のため、診断的に使用することが
できる。さらに、この発明の化合物はポリペプチドのり
セプターの決定のために使用することができる。さらに
、この発明の化合物は、正常細胞の存在下及び非存在下
で腫瘍細胞の増殖速度を調節するため、免疫調節剤とし
て、又はジアゼバムリセプターもしくはGALA−作動
性リセプターと関連する生理学的機能を調節するために
使用することができる。従って、脳組織由来の脳因子化
合物及びその断片は、外科的処置又は術後処置等のため
に、例えば骨髄、腫瘍、例えば黒色腫、肉腫、又は癌に
おける正常細胞と腫瘍細胞との混合物から腫瘍細胞を除
去するために他の添加物と組合わせて使用することがで
きる。脳因子化合物はまた、T−細胞の増殖の調節のた
めにも使用することができる。EBZD化合物はEBZ
Dリセプターの活性を調節するためにも使用することが
できる。
ンビボの両方における広範囲の用途で使用され得ること
が明らかである。この発明のポリペプチド及び抗体は、
生理的流体、例えば血液、血清、血漿、尿、又は脳を髄
液中のこのような蛋白質の存在を細胞内的に又は細胞外
的に決定するため、組織中の細胞によって形成されるポ
リペプチドの量の決定のため、診断的に使用することが
できる。さらに、この発明の化合物はポリペプチドのり
セプターの決定のために使用することができる。さらに
、この発明の化合物は、正常細胞の存在下及び非存在下
で腫瘍細胞の増殖速度を調節するため、免疫調節剤とし
て、又はジアゼバムリセプターもしくはGALA−作動
性リセプターと関連する生理学的機能を調節するために
使用することができる。従って、脳組織由来の脳因子化
合物及びその断片は、外科的処置又は術後処置等のため
に、例えば骨髄、腫瘍、例えば黒色腫、肉腫、又は癌に
おける正常細胞と腫瘍細胞との混合物から腫瘍細胞を除
去するために他の添加物と組合わせて使用することがで
きる。脳因子化合物はまた、T−細胞の増殖の調節のた
めにも使用することができる。EBZD化合物はEBZ
Dリセプターの活性を調節するためにも使用することが
できる。
前記の発明を、理解を明瞭にするために説明及び例によ
り幾分詳細に説明したが、幾らかの変化及び変更を、添
付された特許請求の範囲内で実施することができること
は自明である。
り幾分詳細に説明したが、幾らかの変化及び変更を、添
付された特許請求の範囲内で実施することができること
は自明である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、下記アミノ酸配列又は少なくとも約30個のアミノ
酸配列を有する生理学的に活性なフラグメントをコード
しており、そして適切な方向で、少なくとも1つの、野
生型プロモーター以外のプロモーター、野生型ターミネ
ーター以外のターミネーター、又は野生型複製系以外の
複製系に結合されているDNA配列を含むDNA発現造
成物:【遺伝子配列があります】 上記の配列で、一つの部位にある複数のアミノ酸は、そ
の部位における任意のアミノ酸をその部位における他の
任意のアミノ酸によって置き換えることができることを
示しており、そして星印(*)は、結合がその部位で用
いられてもよいことを意図している。 2、該複製系、プロモーター及びターミネーターが真核
生物宿主中で機能的である、請求の範囲第1項記載のD
NA発現造成物。
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US06/694,712 US4714683A (en) | 1985-01-25 | 1985-01-25 | Polypeptide tumor inhibitors and antibodies thereto |
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US06/766,864 US4806492A (en) | 1985-01-25 | 1985-08-15 | Polypeptide tumor inhibitors and antibodies thereto |
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JP2690956B2 (ja) * | 1987-08-22 | 1997-12-17 | 三井東圧化学株式会社 | 生体由来のタンパク質 |
DE68926448T2 (de) * | 1988-10-14 | 1996-12-12 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Bildsensor und verfahren zu dessen herstellung |
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US5648340A (en) * | 1991-10-31 | 1997-07-15 | Barnea; Eytan R. | Gestational agents for controlling cell proliferation |
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US5758132A (en) * | 1995-03-29 | 1998-05-26 | Telefonaktiebolaget Lm Ericsson | Clock control system and method using circuitry operating at lower clock frequency for selecting and synchronizing the switching of higher frequency clock signals |
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WO2006005590A1 (en) * | 2004-07-12 | 2006-01-19 | Geneprot Inc. | Polypeptide for the treatment of neurological disorders |
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US3839557A (en) * | 1972-01-24 | 1974-10-01 | Lilly Co Eli | Antibiotics monensin and a204 for improving ruminant feed efficiency |
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GB1524711A (en) * | 1975-03-14 | 1978-09-13 | Shell Int Research | Macrocyclic polyethers |
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SU726096A1 (ru) * | 1977-07-07 | 1980-04-05 | Институт химии Уральского научного центра АН СССР | Амиды дибензо-18-краун-6, как промежуточные продукты дл синтеза их комплексов с сол ми металлов |
SU732270A1 (ru) * | 1977-07-07 | 1980-05-05 | Институт химии Уральского научного центра АН СССР | Комплексные соединени дибензо-18- краун-6 с сол ми металлов как катализаторы реакции переэтерификации и поликонденсации в синтезе полиэтилентерефталата |
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IT1134503B (it) * | 1980-11-28 | 1986-08-13 | Proter Spa | Composti della diclorodietilaminofenilalanina ad azione antitumorale |
SU981318A1 (ru) * | 1981-07-31 | 1982-12-15 | Предприятие П/Я А-1997 | Способ получени производных 2,5,8,15,18,21-гексаоксатрицикло/20,4,0,09,14/ гексакозана |
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