JPH046464A - 免疫学的検査法 - Google Patents
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
広く使われている。その中でもサンドインチ法が最も検
査適用範囲が広くまた感度の高い方法である。
法ではまずステップ1において、抗体2を内壁面に固相
化した反応容器1内に試料を分注する。次にステップ2
において第1反応が行われ、試料中に目的の抗原が存在
する場合には、抗原抗体反応により抗体2と抗原3とが
結合する。次にステップ3において抗体2と結合した抗
原と結合しなかった抗原を洗浄操作により分離するB/
F分解が行われ、反応容器1の内部には抗体2と結合し
た抗原だけが残る。次にステップ4で酵素標識抗体4を
分注する。ステップ5で第2反応が行われ抗体2と結合
した抗原3と上記酵素標識抗体4とが抗原・抗体反応に
より結合し、抗原3をはさんで抗体2と酵素標識抗体4
とがサンドインチ状の結合物を形成し、抗原3に結合し
た酵素標識抗体4は反応容器1の内壁に固定される。
識抗体4とを連結することができないので酵素標識抗体
4は反応管内壁に固定されることはない。
なかった酵素標識抗体とを洗浄によって分離する。B/
F分離が行われ、上記抗原3に結合し、反応容器1の内
壁に固定された標識抗体だけが反応容器1の内に残る。
ている酵素5と反応して発色する発色基質を分注し、ス
テップ8において発色反応を行わせた後、ステップ9に
おいて、その発色の度合を比色法にて測定する。
ステップ6のB/F分離操作により洗い流されて、反応
容器内に残っていないから、上記発色反応は起らない。
て異なる。また試料中の抗原の量に応じて上記固相化抗
体2に結合する抗原3の量も異なり、従ってその結合し
た抗原3に結合する酵素標識抗体の量も異なるので、上
記発色反応による発色の度合を知ることにより試料中の
検査目的とする抗原の量を知ることができる。
た微細孔を有するフィルター6を充填した円筒状の反応
容器1に微粒子の表面に抗体を固相化した固相担体7を
多数含む第1の反応試薬と試料を分注する。上記フィル
ター6の微細孔のポアサイズは上記固相担体7が単独で
も洗浄などによってもフィルター6を通過できずにフィ
ルター上あるいは内部に引っ掛かって留まる程度の大き
さである。
で第1反応を行い試料中に目的の抗原が存在する場合に
は、固相担体7上に固相化された抗体2と試料中の抗原
3とが抗原・抗体反応を起して抗原3は、固相担体7表
面上に結合する。次にステップ3で固相担体7に結合し
た抗原と結合しない抗原を洗浄操作により分離するB/
F分離を行う。すなわち反応容器lの上方から洗浄液を
注入すると固相担体と結合しなかった抗原あるいは抗体
は洗浄液と一緒にフィルター6を通過して下方に流出す
る。これにより反応容器1内には固相担体7表面に結合
した抗原だけが残ることになる。
5で第2反応が行われ、反応容器1内の固相担体7の表
面上に結合された抗原3と酵素標識抗体4とが抗原・抗
体反応により結合し、抗原3をはさんで抗体2と酵素標
識抗体4とがサンドインチの結合物を形成し、抗原3に
結合した酵素標識抗体4は、固相担体の表面に固定され
ることになる。
と抗体2とを連結することができないので、酵素標識抗
体4は、固相担体表面に固定されることはない。
た酵素標識抗体と固定されなかった標識抗体とを上記ス
テ・ノブ3と同様な方法で洗浄して分離するB/F分離
を行う。
5と反応して螢光を発する螢光基質を分注し、発生した
螢光を受光素子11で測光し、その光量から、試料中の
検査目的とする抗原の量を知ることができる。
は、まずステップ1において内壁に検査目的に応じた抗
体2を固相化した反応容器1の中で、試料および試料中
の目的の抗原3と同し抗原に酵素5を標識した標識抗原
8を混合するとステップ2において、試料中の抗原3と
標識抗原8とが抗体2に対して競合的に反応し、抗原3
と標識抗原8の量の比によって、それぞれが抗体2と結
合する量が決まり標識抗原8の分注量を一定にしておけ
ば、試料中の抗原3の量に応して、抗体2に結合する量
が決まる。
らなかった余分の抗原3やその他の共存物質を除去した
後、ステップ4において標識酵素5と反応して、発色す
る発色基質を分注し、ステップ5において発色反応を行
わせた後、ステップ6においてその発色の程度を光#9
からの励起光を当て受光素子11により比色することに
より試料中の目的抗原の量を知ることができる。
分離などの操作が繁雑でまた結果の出るまでの時間も長
かった。また固相化抗体の固相は反応容器内壁面に限定
されるため、検液中の抗原と固相化抗体との接触の機会
を多くし反応を安定して迅速に行わせようとすると、反
応工程の間常に攪拌操作を行わせていなければならない
不便さがあった。
しであるので、反応工程においてこの微粒子が検液の中
で均一に分散して抗原・抗体反応が行われるため特別な
攪拌操作をしなくても検液中の抗原と微粒子表面上の抗
体との接触の機会は多く安定して迅速な抗原・抗体反応
は得られるが、免疫反応は2回必要であり、B/F分離
などの操作が繁雑であり、また検査結果を得るまでに時
間がかかる。
、従来技術1と同様、反応工程中宮に攪拌操作を必要と
するわずられしさがあり、またこの方法は、通用できる
抗原あるいは抗体の種類が限られるため、広範囲の検査
項目に適用できないと言う欠点がある。
工程を1回としかつ特別な攪拌操作をしなくても安定し
て迅速に反応が行われ、また検査の通用範囲も広い免疫
学的検査法を提供することを目的とする。
標識物質をコーティングした微粒子あるいは標識物質を
含有した微粒子に検査目的に応じた抗原あるいは抗体を
固相化した固相担体と上記固相担体の1個は通過できる
が複数個の結合物は通過できない程度の微細孔を多数有
するフィルター即ち微孔質フィルターとを用い、上記固
相担体の複数個と検査すべき試料とを上記フィルターの
上、あるいはフィルターの中で混合し、抗原・抗体反応
により凝集反応をさせた後、 検液を洗浄し、上記凝集して複数個結合した面相抗体は
フィルター上あるいは中に残し、抗原・抗体反応にあず
からなかった単体の固相担体および検液中のその他の共
存物質を濾過し、次いでフィルター上、あるいはフィル
ター中に残った固相担体の表面にコーティングされた、
あるいは固相担体に含有された上記標識物質の量を測定
することにより試料中の目的の抗原あるいは抗体の存在
の有無や量を測定することを特徴とする。
等の適用範囲と感度を持ち、かつ免疫反応が1回ですみ
反応時間が短かくてすむ。
質、酵素、放射性物質、発光基質および螢光基質等が含
まれる。
、赤血球の1個は通過できるが、複数個の赤血球が結合
した凝集物は通過できない程度の微孔質フィルター上で
凝集反応を行わせた後、検液を洗浄し、反応にあずから
なかった単体の赤血球およびその他の共存物質は上記フ
ィルターを通して濾過除去し、抗原・抗体反応により複
数個の赤血球が結合した凝集物だけをフィルター上に残
した後、このフィルター上に残った凝集物が形成する凝
集像を観察することにより血液中の赤血球の血液型の判
定あるいは血液中の血液型抗体の判定または検出を行う
ことを特徴とする免疫学的測定法に関するものである。
に検査目的に応じた抗原あるいは抗体を固相化した固相
担体を上記固相担体の1個は通過できるが複数個の固相
担体が結合した凝集物は通過できない程度の微孔質フィ
ルター上で、検査すべき試料と混和して凝集反応を行わ
せた後、洗浄を行い、凝集反応にあずからなかった単体
の固相担体およびその他の共存物質を上記フィルターを
通して濾過除去し抗原・抗体反応により複数個の固相担
体が結合した凝集物だけを上記フィルター上に残し、次
いでこのフィルター上に残った凝集物が形成する凝集像
を観察することにより試料中の抗原あるいは抗体の存在
の有無や量を測定することを特徴とする免疫学的測定法
に関するものである。
ー、薬物などの検査に好適な方法であり、以下第1図A
、Bにより説明する。
粒子に抗体2を感作したものを固相担体7として用いた
。
り、第1図Bは試料中に検査目的の抗原が無い場合であ
る。まず第1図Aにおいてステップ1で固相抗体7の1
個は通過させるが、複数個の結合物は通過できない程度
、本例では5μm程度の微孔質フィルター6を充てんし
た円筒状の反応容器1の中に試料と固相担体7を多数含
む反応試液を分注しフィルター6上で混和した。第1図
Aにおいては、試料中の検査目的の抗原3がステ・ノブ
2における抗原・抗体反応で、抗原3を仲立ちにして固
相担体7同志が結合するいわゆる凝集反応による凝集が
起り、凝集物を生成した。一方策1図Bにおいては試料
中に目的の抗原がなく、固相担体同士を仲立ちして結合
させるものがないから凝集は起らない。次にステップ3
において洗浄操作を行った。洗浄のやり方としては本例
では反応容器1の上方から洗浄液を注入し、それと同時
に反応容器1の下方から除圧で、洗浄液を吸引したが、
あるいは、吸水性の物質を反応容器1に充てんしたフィ
ルター6の下部に接触させてフィルター6の上部から注
入した洗浄液を、フィルター6の下部から吸い取る方法
等積々の方法が考えられる。
相担体7の結合物が形成され、その結合した固相担体は
フィルター上に残り、凝集反応にあずからなかった単体
の固相担体と、その他の試料中反応試液がフィルター6
を通過して下方に濾過された。
凝集反応が起らず、全ての固相担体が単体なので、洗浄
操作によりフィルター6上に固相担体が残ることはない
。
面に光源9により励起光を当てると、フィルター6の表
面に残った固相担体7の表面にコーティングされた螢光
物質が励起され螢光を発するのでこの螢光の強度を適当
な光学フィルター10を通して受光素子11で測光した
。
、凝集した固相担体7の数に関係し、更に凝集した固相
担体の数は、試料中の抗原の量に関係するので、上記螢
光の強度を知ることにより、試料中の目的の抗原の量を
知ることができる。
を含んだ検液が上記フィルター6の表面に一面に広がっ
た極めて薄い検液層の中で固相担体が密集した状態で行
われるため試料中の抗原3と固相担体7の表面上の抗体
2とが接触する機会で極めて多く、従って凝集反応は迅
速に行われ、検査結果を早く知ることができる。
物などの検査に好適な方法であり、発光性物質としてル
ミノールを用い、ルミノールヲ表面にコーティングした
微粒子に抗体を感作したものを固相担体7として用いた
。
実施例1と同様であるが、ステップ4において反応容器
1内にルミノールを発光させる物質、本例では、ペルオ
キシダーゼ(POD)と820□を分注することにより
凝集してフィルター6上に残った固相担体表面にコーテ
ィングされたルミノールが発光するので、この発光強度
を適当なフィルター10を通して受光素子11にて測光
することにより試料中の目的の抗原の濃度を知ることが
できた。
には、凝集反応は起らないのでステップ3における洗浄
操作の後フィルター6上には固相担体7は残っていない
のでステップ4においてペルオキシダーゼ(POD)お
よびH,02などを反応容器1内に分注しても発光は起
らないので試料中に目的の抗原が存在しなかった事が分
った。
に、試料中の目的の抗体に対応する抗原を固相化してお
けば、試料中の抗体を検出することもできる。
液型を判定する場合について示す。
ップ1において赤血球を含む試料(全血あるいは赤血球
浮遊液)と抗血清の抗A血清を反応容器1内に分注し混
和した。次にステップ2で抗原・抗体反応が行われ、試
料中の赤血球15の表面に上記分注した抗血清中の抗体
2に対応する血液型抗原16と凝集反応が起り、上記赤
血球同志が抗体2を仲立ちにして凝集しフィルター6上
に凝集塊を形成した。
面に、上記分注した抗血清中の抗体2に対応する血液型
抗原16が存在しない場合には凝集反応は行われず従っ
てフィルター6上あるいはフィルター中には単体の赤血
球15のみが存在することになる。次にステップ3で洗
浄操作を行った。洗浄の方法は実施例1と同様である。
た余分の赤血球15やその他の共存物質はフィルター6
を通して濾過除去され、フィルター6上には凝集反応に
あずかって凝集した赤血球の凝集塊だけが残るので、第
3図A−aに示すように、凝集にあずからなかった余分
な赤血球によるボヤケなどのない凝集塊だけのクリヤー
な凝集像14を得ることができた。これをステップ4に
おいてレンズ12などの光学系を通して撮像素子13な
どでパターン認識させ、凝集を判定するかあるいは目視
判定した。
フィルター上の赤血球は全て単体であるから全ての赤血
球および検液中の、その他の共存物質はフィルター6を
通して濾過除去されるので第3図B−bに示すようにフ
ィルター6上には赤血球は全く残らないので、これをス
テップ4において撮像素子13でパターン認識したり目
視観察した時、明確に非凝集であることが分る。
血清を用いればABO式血液型を判定することができ、
その他種々の抗血清を用いることにより種々の血液型を
判定することができる。
リーニング用の0型皿球を試薬として上記操作を行えば
試料中の不規則抗体の検出もできる。
抗体反応が1回で済むため操作の手間が少なく、また検
査結果が早く分る。
行わせることができるので、抗原・抗体反応の工程を短
時間で完了させることができる。
ッセイ(RIA)、発光免疫測定法(LIAあるいはC
LEIA)および螢光免疫測定法(FIA)などと同様
にホルモン、ウィルスの抗原あるいはウィルスの抗体、
腫瘍マーカー、および薬物などの検査に通用できるとと
もに更にいわゆる凝集法で行われる血液型判定、不規則
抗体スクリーニングあるいはウィルスの検出なども適用
できる。
に、凝集にあずからなかった余分の粒子(赤血球など)
が、フィルター6の上に存在しないので従来の凝集像に
比べて極めてクリヤーなパターンが観察できるので判定
の怒度が向上する。
施例2の方法の工程図、 第2図Bは実施例2の対照方法の工程図、第3図Aは実
施例3の方法の工程図、 第3図A−aは実施例3のステップ3で濾過した後のフ
ィルター上の赤血球の凝集像を示す説明図、 第3図Bは実施例3の対照方法の工程図、第3図B−b
は実施例3の対照方法のステップ3で濾過した後のフィ
ルター上の状態を示す説明図、 第4図は従来技術1の方法の工程図、 第5図は従来技術2の方法の工程図、 第6図は従来技術3の方法の工程図である。 1・・・反応容器 2・・・抗体3・・・抗原 5・・・酵素 7・・・固相担体 9・・・光源 11・・・受光素子 13・・・撮像素子 15・・・赤血球 4・・・酵素標識抗体 6・・・フィルター 8・・・標識抗原 10・・・フィルター 12・・・レンズ 14・・・凝集像 16・・・血液型抗原 (ステ、77°ブノ (ステ、プf) 第1 図 ヲ情−ヲ舌ト 測光 (ステ、)2) (ステ、7°2) (ステ、、7’3) (ス−r7)4) 第6図 麿討射 宥瓶交 、1lll先 (ステップり (ステラ7°2) (スラ)プ3) (ステラ1’4) (スう゛7デ5う (ステップ6)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、表面に標識物質をコーティングした微粒子あるいは
標識物質を含有した微粒子に検査目的に応じた抗原ある
いは抗体を固相化した固相担体と上記固相担体の1個は
通過できるが複数個の結合物は通過できない程度の微孔
質フィルターとを用い、上記固相担体の複数個と検査す
べき試料とを上記フィルターの上あるいはフィルター中
で混合し、抗原・抗体反応による凝集反応をさせた後、
検液を洗浄し、反応にあずからなかった単体の上記固相
担体および検液中のその他の共存物質は上記フィルター
を通して濾過除去し、抗原・抗体反応により、上記固相
担体が複数個結合した凝集物を上記フィルター上あるい
はフィルター中に残し、次いでフィルター上あるいはフ
ィルター中に残った固相担体の表面にコーティングされ
たあるいは固相担体に含有された上記標識物質の量を測
定することにより試料中の目的の抗原あるいは抗体の存
在の有無や量を測定することを特徴とする免疫学的検査
法。 2、赤血球凝集反応において、赤血球の1個は通過でき
るが、複数個の赤血球が結合した凝集物は通過できない
程度の微孔質フィルター上で凝集反応を行わせた後、検
液を洗浄し、反応にあずからなかった単体の赤血球およ
びその他の共存物質は上記フィルターを通して濾過除去
し、抗原・抗体反応により複数個の赤血球が結合した凝
集物だけをフィルター上に残した後、このフィルター上
に残った凝集物が形成する凝集像を観察することにより
血液中の赤血球の血液型の判定あるいは血液中の血液型
抗体の判定または検出を行うことを特徴とする免疫学的
測定法。 3、着色した微細粒子の表面に検査目的に応じた抗原あ
るいは抗体を固相化した固相担体を上記固相担体の1個
は通過できるが複数個の固相担体が結合した凝集物は通
過できない程度の微孔質フィルター上で、検査すべき試
料と混和して凝集反応を行わせた後、洗浄を行い、凝集
反応にあずからなかった単体の固相担体およびその他の
共存物質を上記フィルターを通して濾過除去し抗原・抗
体反応により複数個の固相担体が結合した凝集物だけを
上記フィルター上に残し、次いでこのフィルター上に残
った凝集物が形成する凝集像を観察することにより試料
中の抗原あるいは抗体の存在の有無や量を測定すること
を特徴とする免疫学的測定法。
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