JPH046464A - 免疫学的検査法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔従来の技術〕 免疫学的検査法としては従来へテロジニアスＥｒＡ法が
広く使われている。その中でもサンドインチ法が最も検
査適用範囲が広くまた感度の高い方法である。

第４図にその一例として従来技術１を示す。図示する方
法ではまずステップ１において、抗体２を内壁面に固相
化した反応容器１内に試料を分注する。次にステップ２
において第１反応が行われ、試料中に目的の抗原が存在
する場合には、抗原抗体反応により抗体２と抗原３とが
結合する。次にステップ３において抗体２と結合した抗
原と結合しなかった抗原を洗浄操作により分離するＢ／
Ｆ分解が行われ、反応容器１の内部には抗体２と結合し
た抗原だけが残る。次にステップ４で酵素標識抗体４を
分注する。ステップ５で第２反応が行われ抗体２と結合
した抗原３と上記酵素標識抗体４とが抗原・抗体反応に
より結合し、抗原３をはさんで抗体２と酵素標識抗体４
とがサンドインチ状の結合物を形成し、抗原３に結合し
た酵素標識抗体４は反応容器１の内壁に固定される。

ここで試料中に抗原３が無い場合には、抗体２と酵素標
識抗体４とを連結することができないので酵素標識抗体
４は反応管内壁に固定されることはない。

次にステップ６において結合した酵素標識抗体と結合し
なかった酵素標識抗体とを洗浄によって分離する。Ｂ／
Ｆ分離が行われ、上記抗原３に結合し、反応容器１の内
壁に固定された標識抗体だけが反応容器１の内に残る。

次にステップ７において、上記酵素標識抗体４に結合し
ている酵素５と反応して発色する発色基質を分注し、ス
テップ８において発色反応を行わせた後、ステップ９に
おいて、その発色の度合を比色法にて測定する。

試料中に抗原３が無い場合には、上記酵素標識抗体は、
ステップ６のＢ／Ｆ分離操作により洗い流されて、反応
容器内に残っていないから、上記発色反応は起らない。

上記発色反応の発色の度合は、結合した酵素の量に応じ
て異なる。また試料中の抗原の量に応じて上記固相化抗
体２に結合する抗原３の量も異なり、従ってその結合し
た抗原３に結合する酵素標識抗体の量も異なるので、上
記発色反応による発色の度合を知ることにより試料中の
検査目的とする抗原の量を知ることができる。

次に、第５図に他の例として従来技術２を示す。

図示する例では、内部にグラスファイバーなどで形成し
た微細孔を有するフィルター６を充填した円筒状の反応
容器１に微粒子の表面に抗体を固相化した固相担体７を
多数含む第１の反応試薬と試料を分注する。上記フィル
ター６の微細孔のポアサイズは上記固相担体７が単独で
も洗浄などによってもフィルター６を通過できずにフィ
ルター上あるいは内部に引っ掛かって留まる程度の大き
さである。

ステップ１で分注された試料と固相担体７はステップ２
で第１反応を行い試料中に目的の抗原が存在する場合に
は、固相担体７上に固相化された抗体２と試料中の抗原
３とが抗原・抗体反応を起して抗原３は、固相担体７表
面上に結合する。次にステップ３で固相担体７に結合し
た抗原と結合しない抗原を洗浄操作により分離するＢ／
Ｆ分離を行う。すなわち反応容器ｌの上方から洗浄液を
注入すると固相担体と結合しなかった抗原あるいは抗体
は洗浄液と一緒にフィルター６を通過して下方に流出す
る。これにより反応容器１内には固相担体７表面に結合
した抗原だけが残ることになる。

次にステップ４で酵素標識抗体４を分注するとステップ
５で第２反応が行われ、反応容器１内の固相担体７の表
面上に結合された抗原３と酵素標識抗体４とが抗原・抗
体反応により結合し、抗原３をはさんで抗体２と酵素標
識抗体４とがサンドインチの結合物を形成し、抗原３に
結合した酵素標識抗体４は、固相担体の表面に固定され
ることになる。

ここで試料中に抗原３が無い場合には、酵素標識抗体４
と抗体２とを連結することができないので、酵素標識抗
体４は、固相担体表面に固定されることはない。

次にステップ６において、固相担体７の表面に固定され
た酵素標識抗体と固定されなかった標識抗体とを上記ス
テ・ノブ３と同様な方法で洗浄して分離するＢ／Ｆ分離
を行う。

その後、ステップ７で酵素標識抗体４に標識された酵素
５と反応して螢光を発する螢光基質を分注し、発生した
螢光を受光素子１１で測光し、その光量から、試料中の
検査目的とする抗原の量を知ることができる。

第６図に更に他の例の従来技術３を示す。図示する例で
は、まずステップ１において内壁に検査目的に応じた抗
体２を固相化した反応容器１の中で、試料および試料中
の目的の抗原３と同し抗原に酵素５を標識した標識抗原
８を混合するとステップ２において、試料中の抗原３と
標識抗原８とが抗体２に対して競合的に反応し、抗原３
と標識抗原８の量の比によって、それぞれが抗体２と結
合する量が決まり標識抗原８の分注量を一定にしておけ
ば、試料中の抗原３の量に応して、抗体２に結合する量
が決まる。

ステップ３において、Ｂ／Ｆ分離を行い、反応にあずか
らなかった余分の抗原３やその他の共存物質を除去した
後、ステップ４において標識酵素５と反応して、発色す
る発色基質を分注し、ステップ５において発色反応を行
わせた後、ステップ６においてその発色の程度を光＃９
からの励起光を当て受光素子１１により比色することに
より試料中の目的抗原の量を知ることができる。

〔発明が解決しようとする課題］ 上述した従来技術１は、免疫反応を２回行うためＢ／Ｆ
分離などの操作が繁雑でまた結果の出るまでの時間も長
かった。また固相化抗体の固相は反応容器内壁面に限定
されるため、検液中の抗原と固相化抗体との接触の機会
を多くし反応を安定して迅速に行わせようとすると、反
応工程の間常に攪拌操作を行わせていなければならない
不便さがあった。

また従来技術２は、多数の微粒子の表面に抗体を固相化
しであるので、反応工程においてこの微粒子が検液の中
で均一に分散して抗原・抗体反応が行われるため特別な
攪拌操作をしなくても検液中の抗原と微粒子表面上の抗
体との接触の機会は多く安定して迅速な抗原・抗体反応
は得られるが、免疫反応は２回必要であり、Ｂ／Ｆ分離
などの操作が繁雑であり、また検査結果を得るまでに時
間がかかる。

更に、従来技術３においては、免疫反応は１回てすむが
、従来技術１と同様、反応工程中宮に攪拌操作を必要と
するわずられしさがあり、またこの方法は、通用できる
抗原あるいは抗体の種類が限られるため、広範囲の検査
項目に適用できないと言う欠点がある。

本発明は以上の様な従来技術の欠点を解決し、免疫反応
工程を１回としかつ特別な攪拌操作をしなくても安定し
て迅速に反応が行われ、また検査の通用範囲も広い免疫
学的検査法を提供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的を達成した本発明の免疫学的検査法は、表面に
標識物質をコーティングした微粒子あるいは標識物質を
含有した微粒子に検査目的に応じた抗原あるいは抗体を
固相化した固相担体と上記固相担体の１個は通過できる
が複数個の結合物は通過できない程度の微細孔を多数有
するフィルター即ち微孔質フィルターとを用い、上記固
相担体の複数個と検査すべき試料とを上記フィルターの
上、あるいはフィルターの中で混合し、抗原・抗体反応
により凝集反応をさせた後、 検液を洗浄し、上記凝集して複数個結合した面相抗体は
フィルター上あるいは中に残し、抗原・抗体反応にあず
からなかった単体の固相担体および検液中のその他の共
存物質を濾過し、次いでフィルター上、あるいはフィル
ター中に残った固相担体の表面にコーティングされた、
あるいは固相担体に含有された上記標識物質の量を測定
することにより試料中の目的の抗原あるいは抗体の存在
の有無や量を測定することを特徴とする。

本発明の上記方法によると、従来のサンドインチ法と同
等の適用範囲と感度を持ち、かつ免疫反応が１回ですみ
反応時間が短かくてすむ。

本発明で使用する標識物質には、発色性物質、螢光性物
質、酵素、放射性物質、発光基質および螢光基質等が含
まれる。

また、他の観点から本発明は赤血球凝集、反応において
、赤血球の１個は通過できるが、複数個の赤血球が結合
した凝集物は通過できない程度の微孔質フィルター上で
凝集反応を行わせた後、検液を洗浄し、反応にあずから
なかった単体の赤血球およびその他の共存物質は上記フ
ィルターを通して濾過除去し、抗原・抗体反応により複
数個の赤血球が結合した凝集物だけをフィルター上に残
した後、このフィルター上に残った凝集物が形成する凝
集像を観察することにより血液中の赤血球の血液型の判
定あるいは血液中の血液型抗体の判定または検出を行う
ことを特徴とする免疫学的測定法に関するものである。

更に、他の観点から本発明は、着色した微細粒子の表面
に検査目的に応じた抗原あるいは抗体を固相化した固相
担体を上記固相担体の１個は通過できるが複数個の固相
担体が結合した凝集物は通過できない程度の微孔質フィ
ルター上で、検査すべき試料と混和して凝集反応を行わ
せた後、洗浄を行い、凝集反応にあずからなかった単体
の固相担体およびその他の共存物質を上記フィルターを
通して濾過除去し抗原・抗体反応により複数個の固相担
体が結合した凝集物だけを上記フィルター上に残し、次
いでこのフィルター上に残った凝集物が形成する凝集像
を観察することにより試料中の抗原あるいは抗体の存在
の有無や量を測定することを特徴とする免疫学的測定法
に関するものである。

以下図面を参照して本発明を実施例により説明する。

［実施例］ 尖施貫土 本例は血清中のホルモン、ウィルス、ＭＩＴ！、マーカ
ー、薬物などの検査に好適な方法であり、以下第１図Ａ
、Ｂにより説明する。

螢光物質を表面にコーティングした直径３μｍ程度の微
粒子に抗体２を感作したものを固相担体７として用いた
。

第１図Ａは試料中に検査目的の抗原が存在する場合であ
り、第１図Ｂは試料中に検査目的の抗原が無い場合であ
る。まず第１図Ａにおいてステップ１で固相抗体７の１
個は通過させるが、複数個の結合物は通過できない程度
、本例では５μｍ程度の微孔質フィルター６を充てんし
た円筒状の反応容器１の中に試料と固相担体７を多数含
む反応試液を分注しフィルター６上で混和した。第１図
Ａにおいては、試料中の検査目的の抗原３がステ・ノブ
２における抗原・抗体反応で、抗原３を仲立ちにして固
相担体７同志が結合するいわゆる凝集反応による凝集が
起り、凝集物を生成した。一方策１図Ｂにおいては試料
中に目的の抗原がなく、固相担体同士を仲立ちして結合
させるものがないから凝集は起らない。次にステップ３
において洗浄操作を行った。洗浄のやり方としては本例
では反応容器１の上方から洗浄液を注入し、それと同時
に反応容器１の下方から除圧で、洗浄液を吸引したが、
あるいは、吸水性の物質を反応容器１に充てんしたフィ
ルター６の下部に接触させてフィルター６の上部から注
入した洗浄液を、フィルター６の下部から吸い取る方法
等積々の方法が考えられる。

ここで、第１図Ａにおいては凝集反応が起り複数個の固
相担体７の結合物が形成され、その結合した固相担体は
フィルター上に残り、凝集反応にあずからなかった単体
の固相担体と、その他の試料中反応試液がフィルター６
を通過して下方に濾過された。

第１図Ｂにおいては、試料中に目的の抗原が存在せず、
凝集反応が起らず、全ての固相担体が単体なので、洗浄
操作によりフィルター６上に固相担体が残ることはない
。

次に第１図Ａの場合はステップ４で、フィルター６の表
面に光源９により励起光を当てると、フィルター６の表
面に残った固相担体７の表面にコーティングされた螢光
物質が励起され螢光を発するのでこの螢光の強度を適当
な光学フィルター１０を通して受光素子１１で測光した
。

ここで測定される螢光の強度はフィルター６上に残った
、凝集した固相担体７の数に関係し、更に凝集した固相
担体の数は、試料中の抗原の量に関係するので、上記螢
光の強度を知ることにより、試料中の目的の抗原の量を
知ることができる。

上記、凝集反応は少量の液中に多量の微粒子の固相担体
を含んだ検液が上記フィルター６の表面に一面に広がっ
た極めて薄い検液層の中で固相担体が密集した状態で行
われるため試料中の抗原３と固相担体７の表面上の抗体
２とが接触する機会で極めて多く、従って凝集反応は迅
速に行われ、検査結果を早く知ることができる。

災施拠１ 本例も血清中のホルモン、ウィルス、腫瘍マーカー、薬
物などの検査に好適な方法であり、発光性物質としてル
ミノールを用い、ルミノールヲ表面にコーティングした
微粒子に抗体を感作したものを固相担体７として用いた
。

以下第２図Ａ、Ｂにより説明する。

第２図Ａの反応工程のステップ１からステップ３までは
実施例１と同様であるが、ステップ４において反応容器
１内にルミノールを発光させる物質、本例では、ペルオ
キシダーゼ（ＰＯＤ）と８２０□を分注することにより
凝集してフィルター６上に残った固相担体表面にコーテ
ィングされたルミノールが発光するので、この発光強度
を適当なフィルター１０を通して受光素子１１にて測光
することにより試料中の目的の抗原の濃度を知ることが
できた。

また第２図Ｂに示すように試料中に目的の抗原がない時
には、凝集反応は起らないのでステップ３における洗浄
操作の後フィルター６上には固相担体７は残っていない
のでステップ４においてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）お
よびＨ，０２などを反応容器１内に分注しても発光は起
らないので試料中に目的の抗原が存在しなかった事が分
った。

以上実施例１および実施例２において固相担体７の表面
に、試料中の目的の抗体に対応する抗原を固相化してお
けば、試料中の抗体を検出することもできる。

１呈炎主 本例は、赤血球凝集反応による血液型判定のＡＢＯ式血
液型を判定する場合について示す。

以下第３図Ａ、Ｂにより説明する。第３図Ａに示すステ
ップ１において赤血球を含む試料（全血あるいは赤血球
浮遊液）と抗血清の抗Ａ血清を反応容器１内に分注し混
和した。次にステップ２で抗原・抗体反応が行われ、試
料中の赤血球１５の表面に上記分注した抗血清中の抗体
２に対応する血液型抗原１６と凝集反応が起り、上記赤
血球同志が抗体２を仲立ちにして凝集しフィルター６上
に凝集塊を形成した。

一方策３図Ｂに示す場合には、試料中の赤血球１５の表
面に、上記分注した抗血清中の抗体２に対応する血液型
抗原１６が存在しない場合には凝集反応は行われず従っ
てフィルター６上あるいはフィルター中には単体の赤血
球１５のみが存在することになる。次にステップ３で洗
浄操作を行った。洗浄の方法は実施例１と同様である。

そうすると、第３図Ａの場合には凝集にあずからなかっ
た余分の赤血球１５やその他の共存物質はフィルター６
を通して濾過除去され、フィルター６上には凝集反応に
あずかって凝集した赤血球の凝集塊だけが残るので、第
３図Ａ−ａに示すように、凝集にあずからなかった余分
な赤血球によるボヤケなどのない凝集塊だけのクリヤー
な凝集像１４を得ることができた。これをステップ４に
おいてレンズ１２などの光学系を通して撮像素子１３な
どでパターン認識させ、凝集を判定するかあるいは目視
判定した。

一方策３図Ｂの場合にはステップ３で洗浄操作を行うと
フィルター上の赤血球は全て単体であるから全ての赤血
球および検液中の、その他の共存物質はフィルター６を
通して濾過除去されるので第３図Ｂ−ｂに示すようにフ
ィルター６上には赤血球は全く残らないので、これをス
テップ４において撮像素子１３でパターン認識したり目
視観察した時、明確に非凝集であることが分る。

以上の反応において、抗血清として抗Ａ血清および抗Ｂ
血清を用いればＡＢＯ式血液型を判定することができ、
その他種々の抗血清を用いることにより種々の血液型を
判定することができる。

また血清あるいは血しょうを試料とし、不規則抗体スク
リーニング用の０型皿球を試薬として上記操作を行えば
試料中の不規則抗体の検出もできる。

〔発明の効果］ 以上説明してきたように、本発明によると、１）抗原・
抗体反応が１回で済むため操作の手間が少なく、また検
査結果が早く分る。

２）多量の微粒子の固相担体を用いて抗原・抗体反応を
行わせることができるので、抗原・抗体反応の工程を短
時間で完了させることができる。

３）従来の酵素免疫測定力（ＥＩＡ）、ラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡあるいはＣ
ＬＥＩＡ）および螢光免疫測定法（ＦＩＡ）などと同様
にホルモン、ウィルスの抗原あるいはウィルスの抗体、
腫瘍マーカー、および薬物などの検査に通用できるとと
もに更にいわゆる凝集法で行われる血液型判定、不規則
抗体スクリーニングあるいはウィルスの検出なども適用
できる。

４）血液型判定等凝集像自体を観察して検査をする場合
に、凝集にあずからなかった余分の粒子（赤血球など）
が、フィルター６の上に存在しないので従来の凝集像に
比べて極めてクリヤーなパターンが観察できるので判定
の怒度が向上する。

【図面の簡単な説明】

第１図Ａは実施例１の方法の工程図、 第１図Ｂは実施例１の対照方法の工程図、第２図Ａは実
施例２の方法の工程図、 第２図Ｂは実施例２の対照方法の工程図、第３図Ａは実
施例３の方法の工程図、 第３図Ａ−ａは実施例３のステップ３で濾過した後のフ
ィルター上の赤血球の凝集像を示す説明図、 第３図Ｂは実施例３の対照方法の工程図、第３図Ｂ−ｂ
は実施例３の対照方法のステップ３で濾過した後のフィ
ルター上の状態を示す説明図、 第４図は従来技術１の方法の工程図、 第５図は従来技術２の方法の工程図、 第６図は従来技術３の方法の工程図である。 １・・・反応容器　　　　　２・・・抗体３・・・抗原 ５・・・酵素 ７・・・固相担体 ９・・・光源 １１・・・受光素子 １３・・・撮像素子 １５・・・赤血球 ４・・・酵素標識抗体 ６・・・フィルター ８・・・標識抗原 １０・・・フィルター １２・・・レンズ １４・・・凝集像 １６・・・血液型抗原 （ステ、７７°ブノ （ステ、プｆ） 第１ 図 ヲ情−ヲ舌ト 測光 （ステ、）２） （ステ、７°２） （ステ、、７’３） （ス−ｒ７）４） 第６図 麿討射 宥瓶交 、１ｌｌｌ先 （ステップり （ステラ７°２） （スラ）プ３） （ステラ１’４） （スう゛７デ５う （ステップ６）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、表面に標識物質をコーティングした微粒子あるいは
   標識物質を含有した微粒子に検査目的に応じた抗原ある
   いは抗体を固相化した固相担体と上記固相担体の１個は
   通過できるが複数個の結合物は通過できない程度の微孔
   質フィルターとを用い、上記固相担体の複数個と検査す
   べき試料とを上記フィルターの上あるいはフィルター中
   で混合し、抗原・抗体反応による凝集反応をさせた後、
   検液を洗浄し、反応にあずからなかった単体の上記固相
   担体および検液中のその他の共存物質は上記フィルター
   を通して濾過除去し、抗原・抗体反応により、上記固相
   担体が複数個結合した凝集物を上記フィルター上あるい
   はフィルター中に残し、次いでフィルター上あるいはフ
   ィルター中に残った固相担体の表面にコーティングされ
   たあるいは固相担体に含有された上記標識物質の量を測
   定することにより試料中の目的の抗原あるいは抗体の存
   在の有無や量を測定することを特徴とする免疫学的検査
   法。 ２、赤血球凝集反応において、赤血球の１個は通過でき
   るが、複数個の赤血球が結合した凝集物は通過できない
   程度の微孔質フィルター上で凝集反応を行わせた後、検
   液を洗浄し、反応にあずからなかった単体の赤血球およ
   びその他の共存物質は上記フィルターを通して濾過除去
   し、抗原・抗体反応により複数個の赤血球が結合した凝
   集物だけをフィルター上に残した後、このフィルター上
   に残った凝集物が形成する凝集像を観察することにより
   血液中の赤血球の血液型の判定あるいは血液中の血液型
   抗体の判定または検出を行うことを特徴とする免疫学的
   測定法。 ３、着色した微細粒子の表面に検査目的に応じた抗原あ
   るいは抗体を固相化した固相担体を上記固相担体の１個
   は通過できるが複数個の固相担体が結合した凝集物は通
   過できない程度の微孔質フィルター上で、検査すべき試
   料と混和して凝集反応を行わせた後、洗浄を行い、凝集
   反応にあずからなかった単体の固相担体およびその他の
   共存物質を上記フィルターを通して濾過除去し抗原・抗
   体反応により複数個の固相担体が結合した凝集物だけを
   上記フィルター上に残し、次いでこのフィルター上に残
   った凝集物が形成する凝集像を観察することにより試料
   中の抗原あるいは抗体の存在の有無や量を測定すること
   を特徴とする免疫学的測定法。