JPH03117486A - 動物細胞膜に蛋白質を挿入する方法 - Google Patents
動物細胞膜に蛋白質を挿入する方法Info
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
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- A61K9/5068—Cell membranes or bacterial membranes enclosing drugs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
-
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- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0006—Modification of the membrane of cells, e.g. cell decoration
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は動物細胞に電界パルスを印加することにより動
物細胞に蛋白質を挿入する方法に関する。
物細胞に蛋白質を挿入する方法に関する。
(従来技術)
電気穿孔(electroporation)又は電気
融合(electrofusion)はチンマーマン他
の[セルフュージョン」ブレナムプレス、ニューヨーク
、1989の[細胞電気操作の電気遺伝子物理的及び生
物学的観点」の章;並びにグンター・エイ・ポフマンイ
也、IEEE Eng、in Med。
融合(electrofusion)はチンマーマン他
の[セルフュージョン」ブレナムプレス、ニューヨーク
、1989の[細胞電気操作の電気遺伝子物理的及び生
物学的観点」の章;並びにグンター・エイ・ポフマンイ
也、IEEE Eng、in Med。
and Bio、Magazine、198f3゜N
o、6の「誘電破壊−融合/電気穿孔]と題する論文に
記載がある。
o、6の「誘電破壊−融合/電気穿孔]と題する論文に
記載がある。
次ぎの論文には蛋白質の細胞中への自然挿入に関して記
数がある。メドフ他「崩壊促進因子(1) A F )
の細胞膜への挿入後の細胞膜表面の補完活性の禁止J
、J、Exp、Medl、j60.155g−1578
(1984);ザルマンイ也[突発四面色素夜尿症にお
ける相同抑制因子」、J、ofExp、Med、、1旦
、!5.572〜577 (1987); r再構成蛋
白質含有小胞中のグロブリンの挿入と非対称配向J 、
Eur、、J。
数がある。メドフ他「崩壊促進因子(1) A F )
の細胞膜への挿入後の細胞膜表面の補完活性の禁止J
、J、Exp、Medl、j60.155g−1578
(1984);ザルマンイ也[突発四面色素夜尿症にお
ける相同抑制因子」、J、ofExp、Med、、1旦
、!5.572〜577 (1987); r再構成蛋
白質含有小胞中のグロブリンの挿入と非対称配向J 、
Eur、、J。
Bioehem、86.539−546 (1978)
;ザルマン他「目標細胞膜に挿入した相同制限因子によ
る抗体依存性リンパ球細胞毒性」、J、Exp、Med
、、166.947−955(1987);スコツト他
「膜蛋白質の再構成J 、J、ofBiologiea
lchem263.1850−18506、(1988
)。
;ザルマン他「目標細胞膜に挿入した相同制限因子によ
る抗体依存性リンパ球細胞毒性」、J、Exp、Med
、、166.947−955(1987);スコツト他
「膜蛋白質の再構成J 、J、ofBiologiea
lchem263.1850−18506、(1988
)。
しかしこれらの文献は電気挿入に関するものではなく、
細胞膜に蛋白質を挿入する効率的な方法は提供されてい
ない。
細胞膜に蛋白質を挿入する効率的な方法は提供されてい
ない。
(発明の目的)
本発明は細胞膜に蛋白質を挿入する効率的な方法を提供
することを目的とする。
することを目的とする。
(発明の概要)
本発明は、細胞膜(例えば動物細胞)に蛋白質を挿入す
るに当たり、細胞膜を貫通する長さの疎水性の膜貫通配
列を有する挿入すべき蛋白質の緩衝溶液の存在下に、細
胞を電気挿入媒質(懸濁液)中に懸濁した状態で前記細
胞を電界に曝らし、次いでこの処理された細胞を再封孔
媒質に接触させる、細胞膜への蛋白質挿入方法を提供す
る。
るに当たり、細胞膜を貫通する長さの疎水性の膜貫通配
列を有する挿入すべき蛋白質の緩衝溶液の存在下に、細
胞を電気挿入媒質(懸濁液)中に懸濁した状態で前記細
胞を電界に曝らし、次いでこの処理された細胞を再封孔
媒質に接触させる、細胞膜への蛋白質挿入方法を提供す
る。
(発明の詳細な説明)
本発明は、細胞を電気挿入媒質中に懸濁した状態で前記
細胞に電W、好まり、 <は1つ以−にの電界パルスを
印加し、次いでこの処理された細胞を再封孔媒質に接触
させる、細胞膜を貫通する長さの疎水性の膜貞通配列を
有する蛋白質な細駒膜・\挿入する方法を提供する。
細胞に電W、好まり、 <は1つ以−にの電界パルスを
印加し、次いでこの処理された細胞を再封孔媒質に接触
させる、細胞膜を貫通する長さの疎水性の膜貞通配列を
有する蛋白質な細駒膜・\挿入する方法を提供する。
本発明の方法は2℃から39℃、特に約37℃で実施す
るのが好ましい。
るのが好ましい。
本発明の方法は再封fLまで八めて1時間から4時間、
特に約3時間で実行することが好ましい。 本発明の電
気挿入系は液体に懸濁された非導電性膜どその両側の水
溶液よりなる構造と12でモデル化出来る。
特に約3時間で実行することが好ましい。 本発明の電
気挿入系は液体に懸濁された非導電性膜どその両側の水
溶液よりなる構造と12でモデル化出来る。
電界にされさ第1ると細胞膜には電気コンデンサの誘電
体層における電611分離(分極)と同様の電イ1′:
1分雛が膜内に生じる。こ第1により膜を通じての電位
差が生じる。膜−トの反対電荷が互いに吸弓!−2膜(
こ1f力を加えて膜を薄くする7臨界型位差(電界強度
)になると膜の局部的な絶縁破壊が起ぎて孔が明き媒質
や細胞質の流れが可能になる。
体層における電611分離(分極)と同様の電イ1′:
1分雛が膜内に生じる。こ第1により膜を通じての電位
差が生じる。膜−トの反対電荷が互いに吸弓!−2膜(
こ1f力を加えて膜を薄くする7臨界型位差(電界強度
)になると膜の局部的な絶縁破壊が起ぎて孔が明き媒質
や細胞質の流れが可能になる。
も12.電界強度と電界パルス幅が過度でなければ電界
の除去にJ:り穴は治癒(閉鎖)される。
の除去にJ:り穴は治癒(閉鎖)される。
木光明は、一般に細胞に適用出来る。なぜなら2本発明
はある種の細胞の考えられる特種な条件の必要性を考慮
に入れて、細胞の脂質膜を取り扱うからである。本発明
に使用出来る非制限的な例を挙げると、赤血球(赤面細
胞)、リンパ細胞、単細胞、あらゆる種類のは乳類の培
養細胞、線維芽細胞、内皮細胞、神経細胞にューロン)
、大食細胞(マクロファージ)等であるが、これらは数
例に過ぎない。本発明はまた、植物細胞と、細菌や酵母
菌などの微生物にも適用出来る。
はある種の細胞の考えられる特種な条件の必要性を考慮
に入れて、細胞の脂質膜を取り扱うからである。本発明
に使用出来る非制限的な例を挙げると、赤血球(赤面細
胞)、リンパ細胞、単細胞、あらゆる種類のは乳類の培
養細胞、線維芽細胞、内皮細胞、神経細胞にューロン)
、大食細胞(マクロファージ)等であるが、これらは数
例に過ぎない。本発明はまた、植物細胞と、細菌や酵母
菌などの微生物にも適用出来る。
いかなる細胞も、必要ならば特殊な電気的、化学的及び
(又は)生物学的条件下で、本発明の電気挿入を受けつ
る。細胞の例として、ヒトとサルの細飽系統(He l
a、VCI、Verc)、ネズミとハムスターの線略
系統(NIH3T3、CHO)、昆虫線側、酸8菌、細
菌や植物細胞などがある。
(又は)生物学的条件下で、本発明の電気挿入を受けつ
る。細胞の例として、ヒトとサルの細飽系統(He l
a、VCI、Verc)、ネズミとハムスターの線略
系統(NIH3T3、CHO)、昆虫線側、酸8菌、細
菌や植物細胞などがある。
細fl’&は動物細胞が好ましく、最も好ましのが温血
動物の細胞である。細胞はヒト\))(lνの温血動物
、例λばウシ、ネコ、ウサギ、ザル、ネズミ、ヤギ、ヒ
ツジ、ウマから抽出出来る。細胞は血流から採取するの
が好まし2い。赤血球がより好まし。
動物の細胞である。細胞はヒト\))(lνの温血動物
、例λばウシ、ネコ、ウサギ、ザル、ネズミ、ヤギ、ヒ
ツジ、ウマから抽出出来る。細胞は血流から採取するの
が好まし2い。赤血球がより好まし。
い。細口[第1はヒトのりンバT線側か1例えば培養さ
第1たイ1核の中1j物細胞、CEM細胞のよ一′)な
培養細胞でも良い。
第1たイ1核の中1j物細胞、CEM細胞のよ一′)な
培養細胞でも良い。
疎水性の膜n通配列を有する任意の蛋白質が本発明で使
用出来る。グリコホン、CD4、CD2、CD3、MH
CC1ass I及びIN、LDl、、受N体、イン
シュリン受容体、仲のホルモン受容体、遺伝γ的に処理
され、膜貫通長さを有する疎水性の特定の^e列を持つ
可溶性の任意の蛋白質も本発明で使用し得る。挿入に好
まし5い蛋白質はヒトのCD4である。
用出来る。グリコホン、CD4、CD2、CD3、MH
CC1ass I及びIN、LDl、、受N体、イン
シュリン受容体、仲のホルモン受容体、遺伝γ的に処理
され、膜貫通長さを有する疎水性の特定の^e列を持つ
可溶性の任意の蛋白質も本発明で使用し得る。挿入に好
まし5い蛋白質はヒトのCD4である。
電気挿入は実験式V=Co +1.5 REcoθに従
って起きる。■は得られた膜電位、■oは自然状態の模
型イ☆、Rは細胞の半径、Eは電界強度、θは膜の与え
られた部(r2と電界の成す角度である。
って起きる。■は得られた膜電位、■oは自然状態の模
型イ☆、Rは細胞の半径、Eは電界強度、θは膜の与え
られた部(r2と電界の成す角度である。
イオン担体A23187で赤血球を予め処理することに
より、膜電位の低下を行なうと、ウサギの細胞中へのグ
リコホリンの挿入効率は85%に減少する。明らかに、
外部電界を与えない状態では、細胞1個あj、二りの細
胞の挿入効率は最低となる64つの電界パルスを印加す
ると、多量の挿入が為される。第8図は外部電界を与え
ない場へと、4つの電界パルスを使用した場合における
、ネズミの赤血球へのヒトグリコホリンの挿入に対する
電光強度を示している。
より、膜電位の低下を行なうと、ウサギの細胞中へのグ
リコホリンの挿入効率は85%に減少する。明らかに、
外部電界を与えない状態では、細胞1個あj、二りの細
胞の挿入効率は最低となる64つの電界パルスを印加す
ると、多量の挿入が為される。第8図は外部電界を与え
ない場へと、4つの電界パルスを使用した場合における
、ネズミの赤血球へのヒトグリコホリンの挿入に対する
電光強度を示している。
本発明に使用した電界の最大パルス数は、多数の電界パ
ルス下での細胞の挙動、及びその過稈における生物学的
、化学的な時間制限条件によってのみ制限される。最大
が100パルスであるが、制限されたパルス数で最大の
効率が達成されるかぎりそれほど使用する必要はない。
ルス下での細胞の挙動、及びその過稈における生物学的
、化学的な時間制限条件によってのみ制限される。最大
が100パルスであるが、制限されたパルス数で最大の
効率が達成されるかぎりそれほど使用する必要はない。
多数のパルスを使用する目的は、細胞が電界へさらされ
る確率を高めることである。
る確率を高めることである。
損なわれない細胞を得るには穿孔の臨界電界以下ならど
んなパルス高も使用出来るが、挿入量ははパルス高の減
少に伴い減少する。臨界電界以上の電界パルスも効率は
良いが、細胞は膨張又は溶解する。同様なことが短い電
界パルス(例えば400u秒以下)によっても起こり、
有効ではあるが効率は悪い。長いパルスは効率が良いで
あろうが、熱の増大と細胞の損傷を生じる。しかし、電
界強度に依存して数秒までの電界パルスが使用出来る。
んなパルス高も使用出来るが、挿入量ははパルス高の減
少に伴い減少する。臨界電界以上の電界パルスも効率は
良いが、細胞は膨張又は溶解する。同様なことが短い電
界パルス(例えば400u秒以下)によっても起こり、
有効ではあるが効率は悪い。長いパルスは効率が良いで
あろうが、熱の増大と細胞の損傷を生じる。しかし、電
界強度に依存して数秒までの電界パルスが使用出来る。
一般に、印加される電界強度とパルスの期間は反比例し
、又細胞の型にも依存する。パルスの間隔はマイクロ秒
から分まで可能で、各パルス印加後の電界室の放熱と細
胞の回復が唯一の制限である。
、又細胞の型にも依存する。パルスの間隔はマイクロ秒
から分まで可能で、各パルス印加後の電界室の放熱と細
胞の回復が唯一の制限である。
パルスの波形は方形である必要はなく、必要とされるエ
ネルギー(E、T)が与えられるかぎりいかなるパルス
の形も有効である。指数減衰形、鋸歯形、及び交流パル
ス波形も使用することが出来る。電界は必ずしもパルス
の形でなくても連続的(直流)であり得る1本発明で使
用する電界パルスの特性で好ましい組合せの1つはパル
ス間隔が5秒である8つの連続したパルスである。電界
パルスで好ましいのはヒトの赤血球に対しては1.3k
V/cmの高さを持つもの、ウザギの赤血球に対しては
1.6kV/cmの高さを持つもの、及びネズミの赤血
球に対しては1.5〜2゜1kV/cmの高さを持つも
のである。具体例ではパルスの持続時間は少なくとも4
00μ秒であるのが好ましい。別の具体例では電気穿孔
にはパルス間隔が15秒である4つの連続した幅1m秒
のパルスが好ましい。細胞の電気穿孔に使用する電界パ
ルスは方形パルスが好ましく、又臨界電界以下であるこ
とが好ましい。
ネルギー(E、T)が与えられるかぎりいかなるパルス
の形も有効である。指数減衰形、鋸歯形、及び交流パル
ス波形も使用することが出来る。電界は必ずしもパルス
の形でなくても連続的(直流)であり得る1本発明で使
用する電界パルスの特性で好ましい組合せの1つはパル
ス間隔が5秒である8つの連続したパルスである。電界
パルスで好ましいのはヒトの赤血球に対しては1.3k
V/cmの高さを持つもの、ウザギの赤血球に対しては
1.6kV/cmの高さを持つもの、及びネズミの赤血
球に対しては1.5〜2゜1kV/cmの高さを持つも
のである。具体例ではパルスの持続時間は少なくとも4
00μ秒であるのが好ましい。別の具体例では電気穿孔
にはパルス間隔が15秒である4つの連続した幅1m秒
のパルスが好ましい。細胞の電気穿孔に使用する電界パ
ルスは方形パルスが好ましく、又臨界電界以下であるこ
とが好ましい。
細胞とパルス発生装置の電力に応じて、いがなる等張媒
質も本発明で電気挿入媒質として使用出来る0本発明の
具体例では、マンニトール、ヒスチジンのほか、NaC
1、K Cl 、 N a zHPO4、NaH* P
O4、スタチオーゼ(stachyose) 、イヌリ
ン、テトラサツカライド等のある種の炭化水素が使用出
来る。生理学的pHの使用が好ましいが、使用する細胞
と蛋白質にもよるが任意のp)(を使用出来る。
質も本発明で電気挿入媒質として使用出来る0本発明の
具体例では、マンニトール、ヒスチジンのほか、NaC
1、K Cl 、 N a zHPO4、NaH* P
O4、スタチオーゼ(stachyose) 、イヌリ
ン、テトラサツカライド等のある種の炭化水素が使用出
来る。生理学的pHの使用が好ましいが、使用する細胞
と蛋白質にもよるが任意のp)(を使用出来る。
本発明で使用した電気挿入媒質は、ある具体例ではマン
ニトールとヒスチジンの混合物が好ましい、他の好まし
い具体例ではPBSをp H8。
ニトールとヒスチジンの混合物が好ましい、他の好まし
い具体例ではPBSをp H8。
8で利用する。
本発明で使用する再封孔媒質は1つ以−FのKCl、N
aC1、BSA、BSA、MgC1゜、及びグルコース
のPBS水溶液が好ましく、p H7,4が好ましい、
MgC1オも又使用出来る。赤血球は生理学的pH(=
7.4)が好ましい。
aC1、BSA、BSA、MgC1゜、及びグルコース
のPBS水溶液が好ましく、p H7,4が好ましい、
MgC1オも又使用出来る。赤血球は生理学的pH(=
7.4)が好ましい。
本発明の好ましい具体例では再封孔の後、例えばPBS
又はADSOLのような保存媒質による保温操作(イン
キュベージ3ン)を20〜39℃、好ましくは37℃で
1〜2時間、好ましくは1時間、又2〜6℃、好ましく
は4℃で6〜12時間実行する。電気挿入は懸濁液のへ
マドクリットに依存する。第9図は赤血球ごとの蛋白質
分子の連続付加に対して、ヘマトクリットの増加と共に
挿入効率が高まることを示している。溶液のへマドクリ
ットは0.001%から98%であるのが好ましい。な
おヘマトクリットは総体積に対する赤血球の割合で定義
される。
又はADSOLのような保存媒質による保温操作(イン
キュベージ3ン)を20〜39℃、好ましくは37℃で
1〜2時間、好ましくは1時間、又2〜6℃、好ましく
は4℃で6〜12時間実行する。電気挿入は懸濁液のへ
マドクリットに依存する。第9図は赤血球ごとの蛋白質
分子の連続付加に対して、ヘマトクリットの増加と共に
挿入効率が高まることを示している。溶液のへマドクリ
ットは0.001%から98%であるのが好ましい。な
おヘマトクリットは総体積に対する赤血球の割合で定義
される。
細胞1個あたりに挿入される蛋白質分子の量は付加した
蛋白質濃度と共に増加する。粉末で添加される場合を含
めて、任意の蛋白質濃度が使用出来る。a度範囲は0.
01mg/m4から200 m g / m Qが好ま
しく、134 m g / m (2が特に好ましい。
蛋白質濃度と共に増加する。粉末で添加される場合を含
めて、任意の蛋白質濃度が使用出来る。a度範囲は0.
01mg/m4から200 m g / m Qが好ま
しく、134 m g / m (2が特に好ましい。
第10図はネズミの赤血球1個あたりに挿入されたグリ
コホリン分子と86%のへマドクリットで添加されたグ
リコホリンと濃度の関係を示しでいる。
コホリン分子と86%のへマドクリットで添加されたグ
リコホリンと濃度の関係を示しでいる。
赤血球膜と、挿入される蛋白質の疎水性配列との疎水的
相互作用は、電気挿入の基本原理である。ヘマトクリッ
ト懸濁液に及ぼす挿入効率が依存しているものは、疎水
性相の増加と考えられよう。更に電気挿入はホスファデ
ジルコリンニトロ−ベンゾ−7−オキサ−1,3−デア
ゾール(米国アラバマ州ベルハム所在のアバチンチ・ポ
ーラーー・リビッズ社のアクリル標識PCN、BD)の
赤血球内への自然挿入を増加する。
相互作用は、電気挿入の基本原理である。ヘマトクリッ
ト懸濁液に及ぼす挿入効率が依存しているものは、疎水
性相の増加と考えられよう。更に電気挿入はホスファデ
ジルコリンニトロ−ベンゾ−7−オキサ−1,3−デア
ゾール(米国アラバマ州ベルハム所在のアバチンチ・ポ
ーラーー・リビッズ社のアクリル標識PCN、BD)の
赤血球内への自然挿入を増加する。
第11図は同量のPCNBDに対するネズミ赤血球膜の
へマドクリットの関数として蛋白質挿入効率を示してい
る。PCNBDが自然挿入により低いヘマトクリットに
対して高い挿入性を有するのを除けば、グリコホリンと
PCNBDは同様な反応を示すことが分る。この類似性
は電気挿入に疎水性が関与する他の証拠である。
へマドクリットの関数として蛋白質挿入効率を示してい
る。PCNBDが自然挿入により低いヘマトクリットに
対して高い挿入性を有するのを除けば、グリコホリンと
PCNBDは同様な反応を示すことが分る。この類似性
は電気挿入に疎水性が関与する他の証拠である。
さらに、L−アルファホスファチジン酸シバルミトール
(米国ミズーリ州セント・ルイス所在のシグマ社)は挿
入を35%向」−シた。
(米国ミズーリ州セント・ルイス所在のシグマ社)は挿
入を35%向」−シた。
最後に、疎水性配列を持たないヒ1へのβ2ミクログロ
ブリン抗体(米国ミズーリ州セント・ルイス所在のシグ
マ社)はウサギの抗ヒトβ、ミクログロブリン(米国ニ
ューヨーク州つエストガーグ、アラキュレート・ケミカ
ル・アンド・づイエンティフィック社)で検出したとこ
ろ本発明の方法では挿入出来ないことがわかった。
ブリン抗体(米国ミズーリ州セント・ルイス所在のシグ
マ社)はウサギの抗ヒトβ、ミクログロブリン(米国ニ
ューヨーク州つエストガーグ、アラキュレート・ケミカ
ル・アンド・づイエンティフィック社)で検出したとこ
ろ本発明の方法では挿入出来ないことがわかった。
本発明は薬物相体として赤血球、特に後天性免疫不全症
候群(AIDS)に対する赤血球CD’を標的にするこ
とも含む。がんや感染病における標的成分として、及び
細胞表面受容体を使用する全ての応用に、種々の蛋白質
、抗体又は抗原を担持する赤血球は使用出来る。
候群(AIDS)に対する赤血球CD’を標的にするこ
とも含む。がんや感染病における標的成分として、及び
細胞表面受容体を使用する全ての応用に、種々の蛋白質
、抗体又は抗原を担持する赤血球は使用出来る。
本発明の生成物は例えばマラリアを治療するためのワク
チンとして使用出来る。
チンとして使用出来る。
細胞あたりの蛋白質分子の比率は電界パルスを受ける前
に全ての細胞によって充分に覆われるような比率が好ま
しい。溶液中の蛋白質の状g(単量体か重合体か)に依
存して、細胞あたり約108個の蛋白質分子であるのが
好ましい。低濃度のマグネシウム及びカルシウムイオン
(例えば赤血球に対しては0.5mM以下のカルシウム
と0.5mM以下のマグネシウム)を使用することが好
ましい。非常に低い濃度(例えば0゜5mM以下)では
細胞膜上の蛋白質の吸着作用は低下し高い濃度(例えば
0.5mM)では細胞は溶解する。
に全ての細胞によって充分に覆われるような比率が好ま
しい。溶液中の蛋白質の状g(単量体か重合体か)に依
存して、細胞あたり約108個の蛋白質分子であるのが
好ましい。低濃度のマグネシウム及びカルシウムイオン
(例えば赤血球に対しては0.5mM以下のカルシウム
と0.5mM以下のマグネシウム)を使用することが好
ましい。非常に低い濃度(例えば0゜5mM以下)では
細胞膜上の蛋白質の吸着作用は低下し高い濃度(例えば
0.5mM)では細胞は溶解する。
マグネシウム及びカルシウムは細胞膜上での相互作用に
より蛋白質が吸着するのを助ける。−旦そうなると蛋白
質分子は溶液中にあるときよりも膜に近付く。この吸着
はある時間で最適になので、このとき電界パルスを印加
するのが良い。
より蛋白質が吸着するのを助ける。−旦そうなると蛋白
質分子は溶液中にあるときよりも膜に近付く。この吸着
はある時間で最適になので、このとき電界パルスを印加
するのが良い。
本発明は以下の実施例を参照して更に説明するが、発明
を限定するものと解してはならない。
を限定するものと解してはならない。
犬上皇」−(ヒトグリコポリンのネズミ及びウサギの赤
血球への電気挿入) パルス発生器は606Coberパルス発生器を使用し
た。電気挿入に使用したテフロン室は直径1.2cmの
円筒形を成し、各端は12cmX2.5cmのステンレ
ス鋼製の電極で形成し、電極間隙を0.2cmとした。
血球への電気挿入) パルス発生器は606Coberパルス発生器を使用し
た。電気挿入に使用したテフロン室は直径1.2cmの
円筒形を成し、各端は12cmX2.5cmのステンレ
ス鋼製の電極で形成し、電極間隙を0.2cmとした。
電界及び電流をN i co l et2090デジタ
ルオッシロスコープで測定した。
ルオッシロスコープで測定した。
犬遣主」」7
ネズミの血液から採取したばかりの赤血球をPBS (
燐酸塩緩衝かん水)pH7,4緩衝液中に0.145M
のNaC1を溶解した溶液で3回洗浄し、電気挿入媒質
(EM)(0,3Mのマンニトール及び6mMのヒスチ
ジンよりなるp、87.8の媒質)で2回洗浄した。0
゜5mMのCa Cl 、l及び0.5mMのKCIを
添加した後、この細胞を氷上で5分間保温し、次いで3
7℃で5分間保温した(ヘモクリット90%)。その直
後に、0.15MのKC11mc中ヒトグリコホリンM
M4mgの溶液(4mg/ml)と所定体積のEMを添
加して、蛋白質濃度を1.25ug/10’細胞にした
。
燐酸塩緩衝かん水)pH7,4緩衝液中に0.145M
のNaC1を溶解した溶液で3回洗浄し、電気挿入媒質
(EM)(0,3Mのマンニトール及び6mMのヒスチ
ジンよりなるp、87.8の媒質)で2回洗浄した。0
゜5mMのCa Cl 、l及び0.5mMのKCIを
添加した後、この細胞を氷上で5分間保温し、次いで3
7℃で5分間保温した(ヘモクリット90%)。その直
後に、0.15MのKC11mc中ヒトグリコホリンM
M4mgの溶液(4mg/ml)と所定体積のEMを添
加して、蛋白質濃度を1.25ug/10’細胞にした
。
次ぎに懸濁液を37℃で5分間保持した。その後、懸濁
液を遠心分離にかり、上澄みをヘマトクリット16%と
なる様に除去した。この25μeの最終的な細胞懸濁液
を4℃でパルス高さ1゜5 k V / c mの電界
パルス(マウスの赤血球電気挿入の臨界値(2,6kV
/cm)より低い)にさらした。電気挿入は、細胞懸濁
液25μβを5秒間隔で相次ぐ8個の方形電界パルスに
さらすことにより行なった。パルス高さは細胞の大きさ
に依存するが、その値は電気挿入の臨界値より小さい。
液を遠心分離にかり、上澄みをヘマトクリット16%と
なる様に除去した。この25μeの最終的な細胞懸濁液
を4℃でパルス高さ1゜5 k V / c mの電界
パルス(マウスの赤血球電気挿入の臨界値(2,6kV
/cm)より低い)にさらした。電気挿入は、細胞懸濁
液25μβを5秒間隔で相次ぐ8個の方形電界パルスに
さらすことにより行なった。パルス高さは細胞の大きさ
に依存するが、その値は電気挿入の臨界値より小さい。
パルス幅は400M秒であった。
次ぎに、細胞を37℃で1時間再封孔し、更に再封孔媒
質(RM)(1,211gのKCI。
質(RM)(1,211gのKCI。
0.9gのグルコース、0.5gのBSA、1゜02g
のNaC1,及び燐酸塩で緩衝したかん水(PBS)5
mM、pH7,4,250mJ2まで)中で更に1時間
再封孔し、最後にRMで1回洗浄し、0.45rriの
NaC1−PBS7.4緩衝液で2回洗浄した。
のNaC1,及び燐酸塩で緩衝したかん水(PBS)5
mM、pH7,4,250mJ2まで)中で更に1時間
再封孔し、最後にRMで1回洗浄し、0.45rriの
NaC1−PBS7.4緩衝液で2回洗浄した。
夫急血止上
採取したばかりの血液から得た赤血球を、PBSpH8
,8緩Ii液中に0.14MのNaC1を溶解したもの
で5回洗浄した。
,8緩Ii液中に0.14MのNaC1を溶解したもの
で5回洗浄した。
10PBSpH8,8緩衝液に懸濁又は親液化した細胞
を赤血球ベレット(ヘマトクリット90%)に添加した
。氷上で20分間保温した後37℃で15分間保温し、
次いで37℃で15分間隔で4個の電界パルスを印加し
た。各パルスは幅1m秒、高さ1.3kV/cm(ヒト
の赤血球に対し) 、1.6kV/cm (ウサギの赤
血球に対し)、及び2.1kV/cm(ネズミの赤血球
に対し)であった、最後に赤血球を血清で1回洗浄し、
5PBMpH7,4緩衝液で2回洗浄した。ヘモクリッ
ト50%のものを5PBMpH74緩衝液中、又は保存
液(ADSOL、・・・100+nj2中2.2gのデ
キストローゼ、900mgの塩化ナトリウム、750m
gのマンニトール、27mgのアゾナイン(米国イリノ
イ州ディーアフィールド所在のFenwalLabor
atories社))中37℃で保温すれば、赤血球膜
に挿入された蛋白質の青白を伸ばすことが出来る。
を赤血球ベレット(ヘマトクリット90%)に添加した
。氷上で20分間保温した後37℃で15分間保温し、
次いで37℃で15分間隔で4個の電界パルスを印加し
た。各パルスは幅1m秒、高さ1.3kV/cm(ヒト
の赤血球に対し) 、1.6kV/cm (ウサギの赤
血球に対し)、及び2.1kV/cm(ネズミの赤血球
に対し)であった、最後に赤血球を血清で1回洗浄し、
5PBMpH7,4緩衝液で2回洗浄した。ヘモクリッ
ト50%のものを5PBMpH74緩衝液中、又は保存
液(ADSOL、・・・100+nj2中2.2gのデ
キストローゼ、900mgの塩化ナトリウム、750m
gのマンニトール、27mgのアゾナイン(米国イリノ
イ州ディーアフィールド所在のFenwalLabor
atories社))中37℃で保温すれば、赤血球膜
に挿入された蛋白質の青白を伸ばすことが出来る。
史1JIλ
CD4受容体を実施例1bに記載した条件を同じ条件下
に赤血球膜(ヒト、ウサギ、ネズミ)に挿入した。gp
120表現HIV感染H9細胞と反応したとき凝集密度
に達した。
に赤血球膜(ヒト、ウサギ、ネズミ)に挿入した。gp
120表現HIV感染H9細胞と反応したとき凝集密度
に達した。
見上皇ユ(免疫蛍光分析)
グリコホリンな赤血球膜に挿入した後、洗浄した細胞を
2μβの0.17mg/mff1OF7抗グリコホリン
モノクロナル抗体(カリフォルニア大学りヴアーモア・
ナショナル・ラボラトリ−バイオケミカル・ディヴイジ
ョン)と共に30分間室温に保温し、次ぎに0.145
MのNaCIPBSpH7,4緩衝液で3回洗浄した。
2μβの0.17mg/mff1OF7抗グリコホリン
モノクロナル抗体(カリフォルニア大学りヴアーモア・
ナショナル・ラボラトリ−バイオケミカル・ディヴイジ
ョン)と共に30分間室温に保温し、次ぎに0.145
MのNaCIPBSpH7,4緩衝液で3回洗浄した。
細胞を次ぎにフィコエリトリン複合アフイニビュアF
(ab’ )2断片ヤギーマウスIgG(米国ペンシル
バニア州ウェスト・グローヴ所在のジャクソン・イミュ
ノ・リサーチ・ラボラトリ−)又は蛍光複合アフイニビ
エアF (ab’ )2断片ウサギーマウスIgG(米
国ニューヨーク州つエストバーグ所在のアキュレート・
ケミカル社)と共に保温した。処理した細胞を最後に0
.145MのNaCIPBS7.4緩衝液で3回洗浄し
た。
(ab’ )2断片ヤギーマウスIgG(米国ペンシル
バニア州ウェスト・グローヴ所在のジャクソン・イミュ
ノ・リサーチ・ラボラトリ−)又は蛍光複合アフイニビ
エアF (ab’ )2断片ウサギーマウスIgG(米
国ニューヨーク州つエストバーグ所在のアキュレート・
ケミカル社)と共に保温した。処理した細胞を最後に0
.145MのNaCIPBS7.4緩衝液で3回洗浄し
た。
夫急JLu
電気挿入をしない他は実施例1aに従って処理したネズ
ミ赤血球(RBC)を対照試料とする。
ミ赤血球(RBC)を対照試料とする。
青色励起による実施例試料及び対照試料の蛍光の観察に
より、電気挿入処理を受けていない対照試料は細胞膜上
にFITC蛍尤による蛍光性緑色点を有することが分か
った。電気挿入をした試料は凝集した高度に蛍光性の細
胞を有した。凝集は挿入したグリコホリンを有する細胞
の間を結合するl OF7抗グリコホリンによる。この
凝集は細胞の凝集を起こすことが出来るには106個の
桁の細胞に結合されたグリコホリンが必要であるとの考
えを導く(第1図)、、擬似ELISAはこの挿入数の
桁を確認し、1個の細胞あたり4,2×lOS個のグリ
コホリンが挿入されたことを示す(実施例6を参照)。
より、電気挿入処理を受けていない対照試料は細胞膜上
にFITC蛍尤による蛍光性緑色点を有することが分か
った。電気挿入をした試料は凝集した高度に蛍光性の細
胞を有した。凝集は挿入したグリコホリンを有する細胞
の間を結合するl OF7抗グリコホリンによる。この
凝集は細胞の凝集を起こすことが出来るには106個の
桁の細胞に結合されたグリコホリンが必要であるとの考
えを導く(第1図)、、擬似ELISAはこの挿入数の
桁を確認し、1個の細胞あたり4,2×lOS個のグリ
コホリンが挿入されたことを示す(実施例6を参照)。
上記のことはCa0とMg0が低イオンi1度の媒質に
低濃度(0,5mM)で存在するとグリコホリンの赤血
球の細胞膜への固定を助け、その結果数に細胞膜に充分
近接しているグリコポリンは電界パルスの印加期間に結
合することを示している。
低濃度(0,5mM)で存在するとグリコホリンの赤血
球の細胞膜への固定を助け、その結果数に細胞膜に充分
近接しているグリコポリンは電界パルスの印加期間に結
合することを示している。
CoulterEPICSプロフィル計による細胞蛍光
分析を使用したのでは、細胞の凝集があるので蛋白質結
合割合の正確な評価が困難である(第1a図)。ある単
独細胞に対しては型光は1個の細胞あたり平均2.5X
10’蛍光性分子(F I TC)に相当する測定値
を示した。この数値は凝集を起こすに必要なグリコホリ
ン挿入の評価割合に一致する(第2図) 丈11L支上 挿入したCD4は0KT4A、0KT4G、及び0KT
4Dを含む異なった抗CD4モノクロナル抗体(米国一
ニージャージ州ラリタン所在のオルト・ダイアグノース
ティック・システム社)、BL4/10T4 (米国メ
イン州ウェストプルツク所在のアマツク社)、CYTO
29(米国ニコ、−ヨーク州プリンストン所在、サイト
ゲン社)、及びLeu3A (HIVウィルスのg、
p l 20被覆蛋白質を有する活性エピトープ)(米
国カリフォルニア州マウンテン・ビュー所在のベクトン
ーディキンソン・イミュノサイトメトリー・システム社
)で検出し、ついでフィコエリトリン複合F (ab’
)2断片ヤギ抗マウスIgG又はフルオレセイン複合
アフィンピュアF(ab’)2断片ウザギ抗マウスIg
Gで検出した。
分析を使用したのでは、細胞の凝集があるので蛋白質結
合割合の正確な評価が困難である(第1a図)。ある単
独細胞に対しては型光は1個の細胞あたり平均2.5X
10’蛍光性分子(F I TC)に相当する測定値
を示した。この数値は凝集を起こすに必要なグリコホリ
ン挿入の評価割合に一致する(第2図) 丈11L支上 挿入したCD4は0KT4A、0KT4G、及び0KT
4Dを含む異なった抗CD4モノクロナル抗体(米国一
ニージャージ州ラリタン所在のオルト・ダイアグノース
ティック・システム社)、BL4/10T4 (米国メ
イン州ウェストプルツク所在のアマツク社)、CYTO
29(米国ニコ、−ヨーク州プリンストン所在、サイト
ゲン社)、及びLeu3A (HIVウィルスのg、
p l 20被覆蛋白質を有する活性エピトープ)(米
国カリフォルニア州マウンテン・ビュー所在のベクトン
ーディキンソン・イミュノサイトメトリー・システム社
)で検出し、ついでフィコエリトリン複合F (ab’
)2断片ヤギ抗マウスIgG又はフルオレセイン複合
アフィンピュアF(ab’)2断片ウザギ抗マウスIg
Gで検出した。
対照資料は対応する実施例資料に対する対照として用い
た。ここに対照試料は実施例1bの全工程を行なったが
、グリコホリン又はCD4の代わりにウシ血清アルブミ
ンを使用した。
た。ここに対照試料は実施例1bの全工程を行なったが
、グリコホリン又はCD4の代わりにウシ血清アルブミ
ンを使用した。
蛍光顕微鏡下で 挿入蛋白質を有する赤血球はウサギ赤
血球への挿入グリコホリンのキャッピングに特有の明る
い蛍光点を示した(第4図)。第5図はヒト赤血球の細
胞膜への電気挿入CD4で蛍光的に染色したモノクロナ
ル抗体の検出を示す。
血球への挿入グリコホリンのキャッピングに特有の明る
い蛍光点を示した(第4図)。第5図はヒト赤血球の細
胞膜への電気挿入CD4で蛍光的に染色したモノクロナ
ル抗体の検出を示す。
フロー細胞測定ををCoulerEPICSプロフィル
計で行なった。フィコエリトリンは575nm帯域透過
放射フィルターで、又蛍光は525nm帯域透過放射フ
ィルターで測定した。
計で行なった。フィコエリトリンは575nm帯域透過
放射フィルターで、又蛍光は525nm帯域透過放射フ
ィルターで測定した。
測定器の整列は5個のマイクロメータ直径免疫検査(I
mmunocheck)ビーズで行なった。光電倍増管
の高電圧を、種々の蛍光強度を有する免疫発光(Imm
unobr i ght)ビーズを使用して、これらの
蛍光標準のヂャンネルでの特性蛍光ピークを得るように
セットした。分析のために次のヒストグラムを集めた。
mmunocheck)ビーズで行なった。光電倍増管
の高電圧を、種々の蛍光強度を有する免疫発光(Imm
unobr i ght)ビーズを使用して、これらの
蛍光標準のヂャンネルでの特性蛍光ピークを得るように
セットした。分析のために次のヒストグラムを集めた。
1)90度側面敗乱に対する前面散乱、2)対数緑色又
は赤色蛍光に対する細胞数。
は赤色蛍光に対する細胞数。
型光強度と細胞数のフロー細胞分析により、全数の細胞
の強度が対照試料に対してシフトしたことが分かった。
の強度が対照試料に対してシフトしたことが分かった。
これは赤血球の全体がゼノプロテインの電気挿入を受け
たことを示す、蛍光強度の平均ピークチャンネルは1個
の細胞あたりに挿入された蛋白質の数を評価するのに使
用した。第6図はウサギの赤血球にグリコホリンを挿入
した場合を示し、第7図はウサギの赤血球にCD4を挿
入した場合を示す。
たことを示す、蛍光強度の平均ピークチャンネルは1個
の細胞あたりに挿入された蛋白質の数を評価するのに使
用した。第6図はウサギの赤血球にグリコホリンを挿入
した場合を示し、第7図はウサギの赤血球にCD4を挿
入した場合を示す。
標準傾向ビーズ(Coulter)を使用し赤血球1個
あたりの挿入分平均数が200であることが分かった。
あたりの挿入分平均数が200であることが分かった。
挿入効率は(細胞あたりの添加分子数あたりの挿入分子
数の割合)は1/1000であった。この効率は過小に
評価されている。なぜなら、活性エピトープ(抗原決定
基)のみが検出され且つ添加分子数が活性エピトープを
有する蛋白質分子数を正確に表わさない重量から推測さ
れるような免疫蛍光によって、挿入分子の測定が行なわ
れたからである。
数の割合)は1/1000であった。この効率は過小に
評価されている。なぜなら、活性エピトープ(抗原決定
基)のみが検出され且つ添加分子数が活性エピトープを
有する蛋白質分子数を正確に表わさない重量から推測さ
れるような免疫蛍光によって、挿入分子の測定が行なわ
れたからである。
電気挿入の他の応用はビオチニル化ヒトグリコホリンの
ヒト赤血球への挿入である。使用した装置及び媒質は今
までに述べたものと同じものである。電界パルスの高さ
はヒト赤血球への挿入に対する臨界電界高さ2.2kV
/cmよりも低い1.3kV/cmであった。
ヒト赤血球への挿入である。使用した装置及び媒質は今
までに述べたものと同じものである。電界パルスの高さ
はヒト赤血球への挿入に対する臨界電界高さ2.2kV
/cmよりも低い1.3kV/cmであった。
ヒトグリコホリンMN(米国ミズーリ州セントルイス所
在のシグマ・ケミカル社)を0゜5 m g / mρ
の0.1Mの重炭酸ソーダに溶解した。4℃で撹拌しな
がら同量のl m g / mρのスクシニミジルD−
ビオチン(分子プローブ)をジメチルホルムアルデヒド
に滴下した。溶液を攪拌しながら4℃に維持した。0.
15MのKCIで4回透析し、0.3Mのマンニトール
で1回透析して電気挿入に使用するグリコホリン−ビオ
チンのマンニトール溶液を得た。
在のシグマ・ケミカル社)を0゜5 m g / mρ
の0.1Mの重炭酸ソーダに溶解した。4℃で撹拌しな
がら同量のl m g / mρのスクシニミジルD−
ビオチン(分子プローブ)をジメチルホルムアルデヒド
に滴下した。溶液を攪拌しながら4℃に維持した。0.
15MのKCIで4回透析し、0.3Mのマンニトール
で1回透析して電気挿入に使用するグリコホリン−ビオ
チンのマンニトール溶液を得た。
天116
1皿旦上」づA
赤血球1個あたりのグリコホリン挿入分子数の定量的な
評価を行なうために、擬似ELISA試験を行なった。
評価を行なうために、擬似ELISA試験を行なった。
この試験ではグリコホリン−ビオチン分子をアルカリ性
フオスポターゼアビジン複合体(ICN)により標識し
た。EKISA板(米国マサツセッツ州ケンブリッジ所
在コスタ社)を使用し、色強度を41mnフィルター付
きDYNATECHMr700で読み取った。
フオスポターゼアビジン複合体(ICN)により標識し
た。EKISA板(米国マサツセッツ州ケンブリッジ所
在コスタ社)を使用し、色強度を41mnフィルター付
きDYNATECHMr700で読み取った。
先ず光学強度対ビオチニル化グリコボリンの標準曲線を
描き、ビオチニル化グリコホリンの背景に対して補正し
た。グリコホリン−ビオチンを担持した懸濁細胞の血/
l!f溶液を作製した。37℃で90分間乾燥した後、
細胞を洗浄緩衝液(PBS7.4.1%BSA、0.5
%TWEEN20)で3回洗浄した。板を所定量の洗浄
緩衝液を添加でブロックし、ついで37℃で1時間保温
した。洗浄緩衝液で3回洗浄した後、アルカリ性フォス
ホターゼアビジン希薄液(1:10000)を添加し、
37℃で1時間保温した。洗浄緩衝液で3かい洗浄した
のち、蒸留水で3回洗浄し、基質緩衝液(リン酸バラニ
トロフェノールのヂエチレンアミン(DEA)緩衝液p
H9,8中0.4mg/mp、溶液)を添加し、室温で
1時間保温した。最後に、2.5NのNaOHを加えて
反応を停止した。板の読みは410nmであった。
描き、ビオチニル化グリコホリンの背景に対して補正し
た。グリコホリン−ビオチンを担持した懸濁細胞の血/
l!f溶液を作製した。37℃で90分間乾燥した後、
細胞を洗浄緩衝液(PBS7.4.1%BSA、0.5
%TWEEN20)で3回洗浄した。板を所定量の洗浄
緩衝液を添加でブロックし、ついで37℃で1時間保温
した。洗浄緩衝液で3回洗浄した後、アルカリ性フォス
ホターゼアビジン希薄液(1:10000)を添加し、
37℃で1時間保温した。洗浄緩衝液で3かい洗浄した
のち、蒸留水で3回洗浄し、基質緩衝液(リン酸バラニ
トロフェノールのヂエチレンアミン(DEA)緩衝液p
H9,8中0.4mg/mp、溶液)を添加し、室温で
1時間保温した。最後に、2.5NのNaOHを加えて
反応を停止した。板の読みは410nmであった。
細胞の係数をCoulter計数器により行なった。
上記のものに類似の擬似ELISA試験を行なってマウ
ス赤血球に挿入されたヒトグリコホリンを定量したが、
アルカリ性フォスホターゼアビジンの代わりに10F7
抗グリコホリンとアルカリ性フィスホターゼアビジンF
(ab’)a断片ヤギ抗マウスIgGを使用した。
ス赤血球に挿入されたヒトグリコホリンを定量したが、
アルカリ性フォスホターゼアビジンの代わりに10F7
抗グリコホリンとアルカリ性フィスホターゼアビジンF
(ab’)a断片ヤギ抗マウスIgGを使用した。
火l」乳ユ
グリコホリン−ビオチンのヒト 血 の細■Ω1見」東
人 ヒトの採取したばかりの赤血球をPH10゜4の緩衝液
に0.145NaCnを溶解したもので3回洗浄し次い
でEMで2回洗浄した。0゜5mMのCa Cl i及
び105mMのMgctzを添加した後、氷上で5分間
、37℃で5分間保温した(ヘマトクリット90%)、
その後直ちに106個の細胞あたりに1.25μgのグ
リコホリンとなる所定量のグリコホリン−ビオチン溶液
を添加し、ついで37℃で分間保温した。得られた@濁
液な遠心分離し、上澄みを除いてヘマトクリット16%
にした。25μCの最終懸濁液を4℃で電界パルスにさ
らした。
人 ヒトの採取したばかりの赤血球をPH10゜4の緩衝液
に0.145NaCnを溶解したもので3回洗浄し次い
でEMで2回洗浄した。0゜5mMのCa Cl i及
び105mMのMgctzを添加した後、氷上で5分間
、37℃で5分間保温した(ヘマトクリット90%)、
その後直ちに106個の細胞あたりに1.25μgのグ
リコホリンとなる所定量のグリコホリン−ビオチン溶液
を添加し、ついで37℃で分間保温した。得られた@濁
液な遠心分離し、上澄みを除いてヘマトクリット16%
にした。25μCの最終懸濁液を4℃で電界パルスにさ
らした。
パルス印加した後直ちに細胞を37℃で1時間RMの存
在下に保温した。ついで、細胞なRM(実施例1a参照
)で1回洗浄し、更に0゜145MのNaClのPBS
pH7,4で2回洗浄した。試料の半分をアビジン−F
ITC(分子プローブ)で標識し、他の半分なELIS
A試験に使用した。
在下に保温した。ついで、細胞なRM(実施例1a参照
)で1回洗浄し、更に0゜145MのNaClのPBS
pH7,4で2回洗浄した。試料の半分をアビジン−F
ITC(分子プローブ)で標識し、他の半分なELIS
A試験に使用した。
電界パルスを使用しないで上の方法を全面的に実施して
得た試料を対照試料とした。
得た試料を対照試料とした。
更に他の対照試験とし、アビジン−FITCの非特異的
結合を検査するために次の試験を行なったグリコホリン
−ビオチンを使用しないでRBCに対して上記と全面的
に同じ方法で電気挿入処理を行なった。蛍光は全熱観察
されなかった。
結合を検査するために次の試験を行なったグリコホリン
−ビオチンを使用しないでRBCに対して上記と全面的
に同じ方法で電気挿入処理を行なった。蛍光は全熱観察
されなかった。
擬似ELISA試験はヒト赤血球1個あたり3.5X1
0’個までの挿入が起きたことを示した。この挿入割合
は、第3a図及び第31)図に示したように、アビジン
による細胞間結合によるビオチニル化グリコホリン担持
赤血球の凝集と一致する。この場合及び抗グリコホリン
抗体の場合の凝集の共通な現象は、操作条件によるので
はなく、高度の挿入によるものであることの証拠である
。アビジン及び抗グリコホリン抗体を電界パルス処理を
受けた細胞に添加した対照試料では何らの凝集も起きな
かった。これは本発明の方法が赤血球中へのCD4の挿
入その他薬剤櫟的に役立つ他の分子の挿入に極めて強力
な手段として適用出来ることを示す。
0’個までの挿入が起きたことを示した。この挿入割合
は、第3a図及び第31)図に示したように、アビジン
による細胞間結合によるビオチニル化グリコホリン担持
赤血球の凝集と一致する。この場合及び抗グリコホリン
抗体の場合の凝集の共通な現象は、操作条件によるので
はなく、高度の挿入によるものであることの証拠である
。アビジン及び抗グリコホリン抗体を電界パルス処理を
受けた細胞に添加した対照試料では何らの凝集も起きな
かった。これは本発明の方法が赤血球中へのCD4の挿
入その他薬剤櫟的に役立つ他の分子の挿入に極めて強力
な手段として適用出来ることを示す。
精製したrCD4及びヒトグリコホリンな、(”’I)
−ポルトン−ハンター試薬(10I−BHR)(米国マ
サチュセッツ州ボストンのニュー7 リサーチ、プロダ
クツ社¥J)を使用して指示に従って+ss 1欅識し
た。
−ポルトン−ハンター試薬(10I−BHR)(米国マ
サチュセッツ州ボストンのニュー7 リサーチ、プロダ
クツ社¥J)を使用して指示に従って+ss 1欅識し
た。
雄のウサギにニーシーラント産2.5〜3kgの白色)
の耳たぶ動脈からの4mβの血液を、ヘパリン処理した
管に採取した。蛋白質を実施例1bの方法に従って70
0μ℃の充填赤血球に挿入した。挿入後に赤血球をCr
51 (Na’Cr Oa )キット(米国ミズーリ州
セントルイスのマリンクロット社製)を使用して指示に
従って”Cr1l識した。赤血球−C,D4“ (グリ
コホリン゛)懸濁液を同じウサギの耳たぶに静脈注射し
た。
の耳たぶ動脈からの4mβの血液を、ヘパリン処理した
管に採取した。蛋白質を実施例1bの方法に従って70
0μ℃の充填赤血球に挿入した。挿入後に赤血球をCr
51 (Na’Cr Oa )キット(米国ミズーリ州
セントルイスのマリンクロット社製)を使用して指示に
従って”Cr1l識した。赤血球−C,D4“ (グリ
コホリン゛)懸濁液を同じウサギの耳たぶに静脈注射し
た。
血液試料(1,5rr+ff)を自動γ線計数器(米国
イリノイ州エルク、グローブ、ビレッジのティー、エム
、アナリチック社製のTMアナリヂック1911ガンマ
、トラック)を使用して計数した。第12図は電気挿入
処理をした赤血球及び挿入した蛋白質の寿命を示す。色
分析の結果は電気挿入は生体内での赤血球の寿命に影響
を与えないことを示し、半減期は17日であった。挿入
した蛋白質の寿命はそれより短かった(7日)。
イリノイ州エルク、グローブ、ビレッジのティー、エム
、アナリチック社製のTMアナリヂック1911ガンマ
、トラック)を使用して計数した。第12図は電気挿入
処理をした赤血球及び挿入した蛋白質の寿命を示す。色
分析の結果は電気挿入は生体内での赤血球の寿命に影響
を与えないことを示し、半減期は17日であった。挿入
した蛋白質の寿命はそれより短かった(7日)。
免疫反応は挿入したCD4にもグリコホリンにも検出さ
れなかった。従って、電気挿入は循環中に免疫活性を保
持する完全な長さのCD4に対する長寿命の担体な提供
する。
れなかった。従って、電気挿入は循環中に免疫活性を保
持する完全な長さのCD4に対する長寿命の担体な提供
する。
同−源からの血漿又はへマドクリット50%の生理液に
再分散したCD4”はエイズ患者の血液流に注入して循
環している遊tll#HIVウィルス、循環しているg
p120、及びgp120分子を表面に有する感染細胞
の除去剤として使用出来る。後者の場合、RBC(赤血
球)−CD4”は網状内皮系により認識され食菌される
凝集物を形成する。
再分散したCD4”はエイズ患者の血液流に注入して循
環している遊tll#HIVウィルス、循環しているg
p120、及びgp120分子を表面に有する感染細胞
の除去剤として使用出来る。後者の場合、RBC(赤血
球)−CD4”は網状内皮系により認識され食菌される
凝集物を形成する。
CD4°赤血球は又感染した食細胞に差し向けるための
HI V感染に対して効果的な特定の抗ウィルス剤(例
えばAZT)と共に負荷することが出来る。
HI V感染に対して効果的な特定の抗ウィルス剤(例
えばAZT)と共に負荷することが出来る。
本発明の電気挿入法は、特定の表面抗原又は受容体を含
む病気(例えばB型肝炎ウィルス及びマラリア)の治療
、又は電気挿入された膜蛋白を有する赤血球による標識
剤の運搬が望まれる場合に、他の膜蛋白質を赤血球膜に
挿入するのにも使用出来る。
む病気(例えばB型肝炎ウィルス及びマラリア)の治療
、又は電気挿入された膜蛋白を有する赤血球による標識
剤の運搬が望まれる場合に、他の膜蛋白質を赤血球膜に
挿入するのにも使用出来る。
本発明は又赤血球膜に適当な抗体を電気挿入し、次いで
これを患者に投与することにより自己免疫症を治療する
のにも使用出来る。
これを患者に投与することにより自己免疫症を治療する
のにも使用出来る。
ヒトグリコホリンのヒトリンパT細胞
(CEM)!IIへの挿入を、赤血球について上に述べ
た方法と同様にして実施した。CEM細胞あたり約10
00グリコホリンが検出された。この結果は真核細胞に
も本発明の電気挿入法が実施出来ることを示している。
た方法と同様にして実施した。CEM細胞あたり約10
00グリコホリンが検出された。この結果は真核細胞に
も本発明の電気挿入法が実施出来ることを示している。
採取したばかりの赤血球を、PBSpH8゜8の緩衝液
に0.14NaCβを溶解したもので5回洗浄した。1
0PBSpH8,8緩衝液に懸濁させた又はそれで親液
化した膜蛋白質(グリコホリン又はCD4)を赤血球ペ
レット(ヘマククリット90%)に加えた。氷上で20
分間保温し、更に37℃で3時間保温した赤血球を血漿
で1回洗浄し、5PBS pH7,4緩衝液で2回洗
浄した。添加蛋白質の1度に依存して、フロー細胞計分
析を使用した免疫型光分析により4500エピトープま
での決定がなされた。
に0.14NaCβを溶解したもので5回洗浄した。1
0PBSpH8,8緩衝液に懸濁させた又はそれで親液
化した膜蛋白質(グリコホリン又はCD4)を赤血球ペ
レット(ヘマククリット90%)に加えた。氷上で20
分間保温し、更に37℃で3時間保温した赤血球を血漿
で1回洗浄し、5PBS pH7,4緩衝液で2回洗
浄した。添加蛋白質の1度に依存して、フロー細胞計分
析を使用した免疫型光分析により4500エピトープま
での決定がなされた。
以上により本発明を説明したが、本発明の範囲内で多く
の変形例が可能であることは当業者には明らかである。
の変形例が可能であることは当業者には明らかである。
第1a図はヒ]・グリコホリンを担持したネズミ赤血球
の凝集を示す蛍光顕微鏡写真、第11′)図はヒトグリ
コホリンを担持したネズミ赤血球の凝集を示す他の蛍光
顕微鏡写真、第2a図は細胞蛍光Xf’ (EPIC3
PROFILE)により得た細胞と蛍光強度の関係を示
ず蛍光ヒストグラムで、電界パルスを印加しない対照試
料に対するもので計数した1213細胞上に高い蛍光性
の細胞がないことを示し、第2b図は細胞型光計により
得た細胞と蛍光強度の関係を示す蛍光ヒストダラムで、
電界パルスを印加した場合を示し、1742ネズミ赤血
球の10.4%がグリコホリン挿入に対応し2て約2.
5X10’のFITCを含イ1することを示し、第3a
図はビオチニル化グリコホリンを担持したヒト赤血球の
凝集を示す白色光顕微鏡写真、第3 b図はビオチニル
化グリコホリンを担持したヒト赤血球の凝集を示す蛍光
顕微鏡写真、第4a図は10F7抗ヒトグリコホリン抗
体及び−次的蛍光抗体(ヤギ抗ネズミフィコエリトリン
)と反応させた後の1気挿入グリコポリン抗体を担持し
たウサギ赤血球の蛍光顕微鏡写真、第4h図は第4a図
のウサギ赤血球の白色光顕微鏡写真、第5a図は0KT
4C及びL e u 3 aモノクロナル抗体及びヤギ
抗マウスフィコエリトリン抗体と反応させた後の電気挿
入CD4担持ヒ1−赤血球の蛍光顕微鏡写真で、輝点は
モノクロナル抗体と反応させるさいの挿入蛋白質のギヤ
ッピング特性を示すものであり、第5b図は第4a図で
観察されたヒト赤血球の白色光顕微鏡であり、細胞は処
理によってとくに影響を受けていない様子を示し、第6
図はウサギ赤血球−グリコポリンのフロー細胞計分析(
臓」′♀)を対照細胞の分析(実l1il)に対比し“
〔蛍光強度シフトを示し、たグラフで強度レベルは40
00グリコボリン数/細胞に相当し、第7図はウサギ赤
血球CD4のフロー細胞計分析(也(、♀)を対照細E
の分析(実線)に対比して蛍光強度シフトを示したグラ
フで強度レベルは2000CD4分子数、/細胞に相当
し、第8図はネズミRBC細胞−グリコポイリン細胞に
ついて細胞あたりの挿入された蛋白質分子数の蛍光相対
強度(フォロー細胞分析計で測定)の印加電界パルス数
に対する依存性を示すグラフ、第9図はネズミ赤血球の
挿入効率(Iは細胞あたりの挿入蛋白質分子数/細胞あ
たりに添加し、・た蛋白質)の蛋白質、1度依存性を示
すグラフ、第10図はネズミ赤血球−グリコホリンの細
胞あたりの蛋白質挿入数の蛋白質Lalり:依存性を小
すグラフ、第11図はネズミ赤血球のP CN B I
I)挿入効率(相対蛍光強度で表示)のヘマ1−クリッ
ト依存付を示すグラフ、及び第12図は”’l−CD4
及びl″1lI−グリコホリンの挿入を行な−)たつ→
Jギ赤血球(filCrで標識)の牛存朋間を示1グラ
フである。
の凝集を示す蛍光顕微鏡写真、第11′)図はヒトグリ
コホリンを担持したネズミ赤血球の凝集を示す他の蛍光
顕微鏡写真、第2a図は細胞蛍光Xf’ (EPIC3
PROFILE)により得た細胞と蛍光強度の関係を示
ず蛍光ヒストグラムで、電界パルスを印加しない対照試
料に対するもので計数した1213細胞上に高い蛍光性
の細胞がないことを示し、第2b図は細胞型光計により
得た細胞と蛍光強度の関係を示す蛍光ヒストダラムで、
電界パルスを印加した場合を示し、1742ネズミ赤血
球の10.4%がグリコホリン挿入に対応し2て約2.
5X10’のFITCを含イ1することを示し、第3a
図はビオチニル化グリコホリンを担持したヒト赤血球の
凝集を示す白色光顕微鏡写真、第3 b図はビオチニル
化グリコホリンを担持したヒト赤血球の凝集を示す蛍光
顕微鏡写真、第4a図は10F7抗ヒトグリコホリン抗
体及び−次的蛍光抗体(ヤギ抗ネズミフィコエリトリン
)と反応させた後の1気挿入グリコポリン抗体を担持し
たウサギ赤血球の蛍光顕微鏡写真、第4h図は第4a図
のウサギ赤血球の白色光顕微鏡写真、第5a図は0KT
4C及びL e u 3 aモノクロナル抗体及びヤギ
抗マウスフィコエリトリン抗体と反応させた後の電気挿
入CD4担持ヒ1−赤血球の蛍光顕微鏡写真で、輝点は
モノクロナル抗体と反応させるさいの挿入蛋白質のギヤ
ッピング特性を示すものであり、第5b図は第4a図で
観察されたヒト赤血球の白色光顕微鏡であり、細胞は処
理によってとくに影響を受けていない様子を示し、第6
図はウサギ赤血球−グリコポリンのフロー細胞計分析(
臓」′♀)を対照細胞の分析(実l1il)に対比し“
〔蛍光強度シフトを示し、たグラフで強度レベルは40
00グリコボリン数/細胞に相当し、第7図はウサギ赤
血球CD4のフロー細胞計分析(也(、♀)を対照細E
の分析(実線)に対比して蛍光強度シフトを示したグラ
フで強度レベルは2000CD4分子数、/細胞に相当
し、第8図はネズミRBC細胞−グリコポイリン細胞に
ついて細胞あたりの挿入された蛋白質分子数の蛍光相対
強度(フォロー細胞分析計で測定)の印加電界パルス数
に対する依存性を示すグラフ、第9図はネズミ赤血球の
挿入効率(Iは細胞あたりの挿入蛋白質分子数/細胞あ
たりに添加し、・た蛋白質)の蛋白質、1度依存性を示
すグラフ、第10図はネズミ赤血球−グリコホリンの細
胞あたりの蛋白質挿入数の蛋白質Lalり:依存性を小
すグラフ、第11図はネズミ赤血球のP CN B I
I)挿入効率(相対蛍光強度で表示)のヘマ1−クリッ
ト依存付を示すグラフ、及び第12図は”’l−CD4
及びl″1lI−グリコホリンの挿入を行な−)たつ→
Jギ赤血球(filCrで標識)の牛存朋間を示1グラ
フである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)疎水性の膜貫通配列を有する挿入すべき蛋白質の緩
衝溶液の存在下に細胞を電気挿入媒質中に懸濁した状態
で前記細胞に電界を印加し、次いでこの処理された細胞
を再封孔媒質に接触させる、細胞膜への蛋白質挿入方法
。 2)細胞が血液中の動物細胞である前記第1項記載の挿
入方法。 3)細胞が赤血球である前記第2項記載の挿入方法。 4)電界が電界パルスである前記第1項記載の挿入方法
。 5)電界パルスが5秒以内の間隔で印加される8個以内
の電界パルスである前記第4項記載の挿入方法。 6)電界パルスの高さが電気穿孔電界以下の高さである
前記第4項記載の挿入方法。 7)電界パルスが少なくとも400μ秒の長さを有する
前記第4項記載の挿入方法。 8)電界パルスが方形波である前記第4項記載の挿入方
法。 9)電界パルスが15分間隔で印加される4個以下の電
界パルスである前記第4項記載の挿入方法。 10)電界パルスが1m秒以下の長さである前記第4項
記載の挿入方法。 11)電界パルス高さが1.3〜2.1kv/cmであ
る前記第4項記載の挿入方法。 12)電気挿入媒質がpH7.8以下のマンニトール又
はヒスチジンである前記第1項記載の挿入方法。 13)再封孔が等張液である前記第1項記載の挿入方法
。 14)再封孔媒質がPBS中のKCl、 NaCl、BSA、HSA、MgCl_2、グルコース
より選択される一種以上の水性混合物である前記第13
項記載の挿入方法。 15)懸濁が0.001〜98%へマトクリット の割
合で行なわれる前記第1項記載の挿入方法。 16)蛋白質がヒトグロブリンである前記第1項記載の
導入方法。 17)蛋白質がCD4受容体である前記第1項記載の挿
入方法。 18)蛋白質の細胞に対する分子割合は、各細胞が電界
印加に先だって蛋白質で完全に覆われる程 度である前
記第1項記載の挿入方法。 19)蛋白質は細胞一個当たり約10^6個である前記
第18項記載の挿入方法。 20)電気挿入媒質はpH8.8以下のPBSで ある
前記第1項記載の挿入方法。 21)温度2〜39℃で実施される前記第1項記 載の
挿入方法。 22)1〜4時間行なわれる前記第1項記載の挿入方法
。 23)温度37℃で3時間行なわれる前記第1項 記載
の挿入方法。 24)緩衝溶液がL−アルファ−ホスファチド酸ジパル
ミトイルである前記第1項記載の挿入方法。 25)再封孔後に更に20〜39℃で1〜2時間保存媒
質と共に保温する工程を付加した前記第1項記載の挿入
方法。 26)再封孔後に更に2〜6℃で6〜12時間保存媒質
と共に保温する工程を付加した前記第1頂記載の挿入方
法。 27)細胞が培地中の有核動物細胞である前記第1項記
載の挿入方法。 28)細胞がCEMである前記第27項記載の挿入方法
。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US25455088A | 1988-10-05 | 1988-10-05 | |
US254550 | 1988-10-05 | ||
US40766489A | 1989-09-19 | 1989-09-19 | |
US407664 | 1989-09-19 | ||
CA000614874A CA1327174C (en) | 1988-10-05 | 1989-09-29 | Electro-insertion of proteins into animal cell membranes |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03117486A true JPH03117486A (ja) | 1991-05-20 |
JP2651943B2 JP2651943B2 (ja) | 1997-09-10 |
Family
ID=27168517
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1258955A Expired - Lifetime JP2651943B2 (ja) | 1988-10-05 | 1989-10-05 | 動物細胞膜に蛋白質を挿入する方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0362758B1 (ja) |
JP (1) | JP2651943B2 (ja) |
AU (1) | AU638417B2 (ja) |
CA (1) | CA1327174C (ja) |
DE (1) | DE68914571T2 (ja) |
ES (1) | ES2054974T3 (ja) |
IL (1) | IL91890A (ja) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3925680A1 (de) * | 1989-08-03 | 1991-02-07 | Kruess Gmbh Wissenschaftliche | Verfahren zur herstellung vitaler wirkstoff-beladener humanerythrozyten |
IT1245867B (it) * | 1991-06-03 | 1994-10-25 | Consiglio Nazionale Ricerche | Vaccini utilizzanti eritrociti come veicoli di antigeni |
AU5014393A (en) * | 1992-08-13 | 1994-03-15 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | The use of cd4 plasma membrane vesicles (pmv) as a therapeutic agent for aids |
US5612207A (en) * | 1993-03-23 | 1997-03-18 | Cbr Laboratories, Inc. | Method and apparatus for encapsulation of biologically-active substances in cells |
US6074605A (en) * | 1995-03-10 | 2000-06-13 | Entremed, Inc. | Flow electroporation chamber and method |
US5720921A (en) * | 1995-03-10 | 1998-02-24 | Entremed, Inc. | Flow electroporation chamber and method |
US6773669B1 (en) | 1995-03-10 | 2004-08-10 | Maxcyte, Inc. | Flow electroporation chamber and method |
DE10031179A1 (de) * | 2000-06-27 | 2002-01-31 | Amaxa Gmbh | Verfahren zur Einbringung von Nukleinsäuren und anderen biologisch aktiven Molekülen in den Kern höherer eukaryontischer Zellen mit Hilfe elektrischen Stroms |
US7029916B2 (en) | 2001-02-21 | 2006-04-18 | Maxcyte, Inc. | Apparatus and method for flow electroporation of biological samples |
DE10119901A1 (de) | 2001-04-23 | 2002-10-24 | Amaxa Gmbh | Schaltungsanordnung zur Einbringung von Nukleinsäuren und anderen biologisch aktiven Molekülen in den Kern höherer eukaryontischer Zellen mit Hilfe elektrischen Stroms |
AU2002326717A1 (en) | 2001-08-22 | 2003-03-10 | Maxcyte, Inc. | Apparatus and method for electroporation of biological samples |
KR101301929B1 (ko) | 2004-05-12 | 2013-09-02 | 맥스시티 인코포레이티드 | 조절된 유동 전기 천공 챔버에 관한 방법 및 장치 |
ES2465467T3 (es) | 2004-06-14 | 2014-06-05 | Lonza Cologne Ag | Procedimiento y disposición de circuito para el tratamiento de material biológico |
GR1005420B (el) | 2006-01-20 | 2007-01-31 | Σπυριδων Ευαγγελου Κιντζιος | Μιμητικα κυτταρα |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2656746C2 (de) * | 1976-12-15 | 1986-06-26 | Kernforschungsanlage Jülich GmbH, 5170 Jülich | Verwendung von beladenen Erythrozyten |
FR2529463B1 (fr) * | 1982-07-05 | 1986-01-10 | Centre Nat Rech Scient | Procede et dispositif pour l'encapsulation dans les erythrocytes d'au moins une substance a activite biologique, notamment des effecteurs allosteriques de l'hemoglobine et erythrocytes ainsi obtenus |
IL86650A0 (en) * | 1987-06-30 | 1988-11-30 | Biophor Corp | Animal derived cells and liposomes,having an antigenic protein incorporated into their membrane |
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