JPH03117486A - 動物細胞膜に蛋白質を挿入する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は動物細胞に電界パルスを印加することにより動
物細胞に蛋白質を挿入する方法に関する。

（従来技術） 電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）又は電気
融合（ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ）はチンマーマン他
の［セルフュージョン」ブレナムプレス、ニューヨーク
、１９８９の［細胞電気操作の電気遺伝子物理的及び生
物学的観点」の章；並びにグンター・エイ・ポフマンイ
也、ＩＥＥＥ　　Ｅｎｇ、ｉｎ　　Ｍｅｄ。

ａｎｄ　　Ｂｉｏ、Ｍａｇａｚｉｎｅ、１９８ｆ３゜Ｎ
ｏ、６の「誘電破壊−融合／電気穿孔］と題する論文に
記載がある。

次ぎの論文には蛋白質の細胞中への自然挿入に関して記
数がある。メドフ他「崩壊促進因子（１）　Ａ　Ｆ　）
の細胞膜への挿入後の細胞膜表面の補完活性の禁止Ｊ　
、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄｌ、ｊ６０．１５５ｇ−１５７８
（１９８４）；ザルマンイ也［突発四面色素夜尿症にお
ける相同抑制因子」、Ｊ、ｏｆＥｘｐ、Ｍｅｄ、、１旦
、！５．５７２〜５７７　（１９８７）；　ｒ再構成蛋
白質含有小胞中のグロブリンの挿入と非対称配向Ｊ　、
Ｅｕｒ、、Ｊ。

Ｂｉｏｅｈｅｍ、８６．５３９−５４６　（１９７８）
；ザルマン他「目標細胞膜に挿入した相同制限因子によ
る抗体依存性リンパ球細胞毒性」、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ
、、１６６．９４７−９５５（１９８７）；スコツト他
「膜蛋白質の再構成Ｊ　、Ｊ、ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｅａ
ｌｃｈｅｍ２６３．１８５０−１８５０６、（１９８８
）。

しかしこれらの文献は電気挿入に関するものではなく、
細胞膜に蛋白質を挿入する効率的な方法は提供されてい
ない。

（発明の目的） 本発明は細胞膜に蛋白質を挿入する効率的な方法を提供
することを目的とする。

（発明の概要） 本発明は、細胞膜（例えば動物細胞）に蛋白質を挿入す
るに当たり、細胞膜を貫通する長さの疎水性の膜貫通配
列を有する挿入すべき蛋白質の緩衝溶液の存在下に、細
胞を電気挿入媒質（懸濁液）中に懸濁した状態で前記細
胞を電界に曝らし、次いでこの処理された細胞を再封孔
媒質に接触させる、細胞膜への蛋白質挿入方法を提供す
る。

（発明の詳細な説明） 本発明は、細胞を電気挿入媒質中に懸濁した状態で前記
細胞に電Ｗ、好まり、　＜は１つ以−にの電界パルスを
印加し、次いでこの処理された細胞を再封孔媒質に接触
させる、細胞膜を貫通する長さの疎水性の膜貞通配列を
有する蛋白質な細駒膜・＼挿入する方法を提供する。

本発明の方法は２℃から３９℃、特に約３７℃で実施す
るのが好ましい。

本発明の方法は再封ｆＬまで八めて１時間から４時間、
特に約３時間で実行することが好ましい。　本発明の電
気挿入系は液体に懸濁された非導電性膜どその両側の水
溶液よりなる構造と１２でモデル化出来る。

電界にされさ第１ると細胞膜には電気コンデンサの誘電
体層における電６１１分離（分極）と同様の電イ１′：
１分雛が膜内に生じる。こ第１により膜を通じての電位
差が生じる。膜−トの反対電荷が互いに吸弓！−２膜（
こ１ｆ力を加えて膜を薄くする７臨界型位差（電界強度
）になると膜の局部的な絶縁破壊が起ぎて孔が明き媒質
や細胞質の流れが可能になる。

も１２．電界強度と電界パルス幅が過度でなければ電界
の除去にＪ：り穴は治癒（閉鎖）される。

木光明は、一般に細胞に適用出来る。なぜなら２本発明
はある種の細胞の考えられる特種な条件の必要性を考慮
に入れて、細胞の脂質膜を取り扱うからである。本発明
に使用出来る非制限的な例を挙げると、赤血球（赤面細
胞）、リンパ細胞、単細胞、あらゆる種類のは乳類の培
養細胞、線維芽細胞、内皮細胞、神経細胞にューロン）
、大食細胞（マクロファージ）等であるが、これらは数
例に過ぎない。本発明はまた、植物細胞と、細菌や酵母
菌などの微生物にも適用出来る。

いかなる細胞も、必要ならば特殊な電気的、化学的及び
（又は）生物学的条件下で、本発明の電気挿入を受けつ
る。細胞の例として、ヒトとサルの細飽系統（Ｈｅ　ｌ
　ａ、ＶＣＩ、Ｖｅｒｃ）、ネズミとハムスターの線略
系統（ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ）、昆虫線側、酸８菌、細
菌や植物細胞などがある。

細ｆｌ’＆は動物細胞が好ましく、最も好ましのが温血
動物の細胞である。細胞はヒト＼））（ｌνの温血動物
、例λばウシ、ネコ、ウサギ、ザル、ネズミ、ヤギ、ヒ
ツジ、ウマから抽出出来る。細胞は血流から採取するの
が好まし２い。赤血球がより好まし。

い。細口［第１はヒトのりンバＴ線側か１例えば培養さ
第１たイ１核の中１ｊ物細胞、ＣＥＭ細胞のよ一′）な
培養細胞でも良い。

疎水性の膜ｎ通配列を有する任意の蛋白質が本発明で使
用出来る。グリコホン、ＣＤ４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＭＨ
ＣＣ１ａｓｓ　　Ｉ及びＩＮ、ＬＤｌ、、受Ｎ体、イン
シュリン受容体、仲のホルモン受容体、遺伝γ的に処理
され、膜貫通長さを有する疎水性の特定の＾ｅ列を持つ
可溶性の任意の蛋白質も本発明で使用し得る。挿入に好
まし５い蛋白質はヒトのＣＤ４である。

電気挿入は実験式Ｖ＝Ｃｏ　＋１．５　ＲＥｃｏθに従
って起きる。■は得られた膜電位、■ｏは自然状態の模
型イ☆、Ｒは細胞の半径、Ｅは電界強度、θは膜の与え
られた部（ｒ２と電界の成す角度である。

イオン担体Ａ２３１８７で赤血球を予め処理することに
より、膜電位の低下を行なうと、ウサギの細胞中へのグ
リコホリンの挿入効率は８５％に減少する。明らかに、
外部電界を与えない状態では、細胞１個あｊ、二りの細
胞の挿入効率は最低となる６４つの電界パルスを印加す
ると、多量の挿入が為される。第８図は外部電界を与え
ない場へと、４つの電界パルスを使用した場合における
、ネズミの赤血球へのヒトグリコホリンの挿入に対する
電光強度を示している。

本発明に使用した電界の最大パルス数は、多数の電界パ
ルス下での細胞の挙動、及びその過稈における生物学的
、化学的な時間制限条件によってのみ制限される。最大
が１００パルスであるが、制限されたパルス数で最大の
効率が達成されるかぎりそれほど使用する必要はない。

多数のパルスを使用する目的は、細胞が電界へさらされ
る確率を高めることである。

損なわれない細胞を得るには穿孔の臨界電界以下ならど
んなパルス高も使用出来るが、挿入量ははパルス高の減
少に伴い減少する。臨界電界以上の電界パルスも効率は
良いが、細胞は膨張又は溶解する。同様なことが短い電
界パルス（例えば４００ｕ秒以下）によっても起こり、
有効ではあるが効率は悪い。長いパルスは効率が良いで
あろうが、熱の増大と細胞の損傷を生じる。しかし、電
界強度に依存して数秒までの電界パルスが使用出来る。

一般に、印加される電界強度とパルスの期間は反比例し
、又細胞の型にも依存する。パルスの間隔はマイクロ秒
から分まで可能で、各パルス印加後の電界室の放熱と細
胞の回復が唯一の制限である。

パルスの波形は方形である必要はなく、必要とされるエ
ネルギー（Ｅ、Ｔ）が与えられるかぎりいかなるパルス
の形も有効である。指数減衰形、鋸歯形、及び交流パル
ス波形も使用することが出来る。電界は必ずしもパルス
の形でなくても連続的（直流）であり得る１本発明で使
用する電界パルスの特性で好ましい組合せの１つはパル
ス間隔が５秒である８つの連続したパルスである。電界
パルスで好ましいのはヒトの赤血球に対しては１．３ｋ
Ｖ／ｃｍの高さを持つもの、ウザギの赤血球に対しては
１．６ｋＶ／ｃｍの高さを持つもの、及びネズミの赤血
球に対しては１．５〜２゜１ｋＶ／ｃｍの高さを持つも
のである。具体例ではパルスの持続時間は少なくとも４
００μ秒であるのが好ましい。別の具体例では電気穿孔
にはパルス間隔が１５秒である４つの連続した幅１ｍ秒
のパルスが好ましい。細胞の電気穿孔に使用する電界パ
ルスは方形パルスが好ましく、又臨界電界以下であるこ
とが好ましい。

細胞とパルス発生装置の電力に応じて、いがなる等張媒
質も本発明で電気挿入媒質として使用出来る０本発明の
具体例では、マンニトール、ヒスチジンのほか、ＮａＣ
１、Ｋ　Ｃｌ　、　Ｎ　ａ　ｚＨＰＯ４、ＮａＨ＊　Ｐ
Ｏ４、スタチオーゼ（ｓｔａｃｈｙｏｓｅ）　、イヌリ
ン、テトラサツカライド等のある種の炭化水素が使用出
来る。生理学的ｐＨの使用が好ましいが、使用する細胞
と蛋白質にもよるが任意のｐ）（を使用出来る。

本発明で使用した電気挿入媒質は、ある具体例ではマン
ニトールとヒスチジンの混合物が好ましい、他の好まし
い具体例ではＰＢＳをｐ　Ｈ８。

８で利用する。

本発明で使用する再封孔媒質は１つ以−ＦのＫＣｌ、Ｎ
ａＣ１、ＢＳＡ、ＢＳＡ、ＭｇＣ１゜、及びグルコース
のＰＢＳ水溶液が好ましく、ｐ　Ｈ７，４が好ましい、
ＭｇＣ１オも又使用出来る。赤血球は生理学的ｐＨ（＝
７．４）が好ましい。

本発明の好ましい具体例では再封孔の後、例えばＰＢＳ
又はＡＤＳＯＬのような保存媒質による保温操作（イン
キュベージ３ン）を２０〜３９℃、好ましくは３７℃で
１〜２時間、好ましくは１時間、又２〜６℃、好ましく
は４℃で６〜１２時間実行する。電気挿入は懸濁液のへ
マドクリットに依存する。第９図は赤血球ごとの蛋白質
分子の連続付加に対して、ヘマトクリットの増加と共に
挿入効率が高まることを示している。溶液のへマドクリ
ットは０．００１％から９８％であるのが好ましい。な
おヘマトクリットは総体積に対する赤血球の割合で定義
される。

細胞１個あたりに挿入される蛋白質分子の量は付加した
蛋白質濃度と共に増加する。粉末で添加される場合を含
めて、任意の蛋白質濃度が使用出来る。ａ度範囲は０．
０１ｍｇ／ｍ４から２００　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｑが好ま
しく、１３４　ｍ　ｇ　／　ｍ　（２が特に好ましい。

第１０図はネズミの赤血球１個あたりに挿入されたグリ
コホリン分子と８６％のへマドクリットで添加されたグ
リコホリンと濃度の関係を示しでいる。

赤血球膜と、挿入される蛋白質の疎水性配列との疎水的
相互作用は、電気挿入の基本原理である。ヘマトクリッ
ト懸濁液に及ぼす挿入効率が依存しているものは、疎水
性相の増加と考えられよう。更に電気挿入はホスファデ
ジルコリンニトロ−ベンゾ−７−オキサ−１，３−デア
ゾール（米国アラバマ州ベルハム所在のアバチンチ・ポ
ーラーー・リビッズ社のアクリル標識ＰＣＮ、ＢＤ）の
赤血球内への自然挿入を増加する。

第１１図は同量のＰＣＮＢＤに対するネズミ赤血球膜の
へマドクリットの関数として蛋白質挿入効率を示してい
る。ＰＣＮＢＤが自然挿入により低いヘマトクリットに
対して高い挿入性を有するのを除けば、グリコホリンと
ＰＣＮＢＤは同様な反応を示すことが分る。この類似性
は電気挿入に疎水性が関与する他の証拠である。

さらに、Ｌ−アルファホスファチジン酸シバルミトール
（米国ミズーリ州セント・ルイス所在のシグマ社）は挿
入を３５％向」−シた。

最後に、疎水性配列を持たないヒ１へのβ２ミクログロ
ブリン抗体（米国ミズーリ州セント・ルイス所在のシグ
マ社）はウサギの抗ヒトβ、ミクログロブリン（米国ニ
ューヨーク州つエストガーグ、アラキュレート・ケミカ
ル・アンド・づイエンティフィック社）で検出したとこ
ろ本発明の方法では挿入出来ないことがわかった。

本発明は薬物相体として赤血球、特に後天性免疫不全症
候群（ＡＩＤＳ）に対する赤血球ＣＤ’を標的にするこ
とも含む。がんや感染病における標的成分として、及び
細胞表面受容体を使用する全ての応用に、種々の蛋白質
、抗体又は抗原を担持する赤血球は使用出来る。

本発明の生成物は例えばマラリアを治療するためのワク
チンとして使用出来る。

細胞あたりの蛋白質分子の比率は電界パルスを受ける前
に全ての細胞によって充分に覆われるような比率が好ま
しい。溶液中の蛋白質の状ｇ（単量体か重合体か）に依
存して、細胞あたり約１０８個の蛋白質分子であるのが
好ましい。低濃度のマグネシウム及びカルシウムイオン
（例えば赤血球に対しては０．５ｍＭ以下のカルシウム
と０．５ｍＭ以下のマグネシウム）を使用することが好
ましい。非常に低い濃度（例えば０゜５ｍＭ以下）では
細胞膜上の蛋白質の吸着作用は低下し高い濃度（例えば
０．５ｍＭ）では細胞は溶解する。

マグネシウム及びカルシウムは細胞膜上での相互作用に
より蛋白質が吸着するのを助ける。−旦そうなると蛋白
質分子は溶液中にあるときよりも膜に近付く。この吸着
はある時間で最適になので、このとき電界パルスを印加
するのが良い。

本発明は以下の実施例を参照して更に説明するが、発明
を限定するものと解してはならない。

犬上皇」−（ヒトグリコポリンのネズミ及びウサギの赤
血球への電気挿入） パルス発生器は６０６Ｃｏｂｅｒパルス発生器を使用し
た。電気挿入に使用したテフロン室は直径１．２ｃｍの
円筒形を成し、各端は１２ｃｍＸ２．５ｃｍのステンレ
ス鋼製の電極で形成し、電極間隙を０．２ｃｍとした。

電界及び電流をＮ　ｉ　ｃｏ　ｌ　ｅｔ２０９０デジタ
ルオッシロスコープで測定した。

犬遣主」」７ ネズミの血液から採取したばかりの赤血球をＰＢＳ　（
燐酸塩緩衝かん水）ｐＨ７，４緩衝液中に０．１４５Ｍ
のＮａＣ１を溶解した溶液で３回洗浄し、電気挿入媒質
（ＥＭ）（０，３Ｍのマンニトール及び６ｍＭのヒスチ
ジンよりなるｐ、８７．８の媒質）で２回洗浄した。０
゜５ｍＭのＣａ　Ｃｌ　、ｌ及び０．５ｍＭのＫＣＩを
添加した後、この細胞を氷上で５分間保温し、次いで３
７℃で５分間保温した（ヘモクリット９０％）。その直
後に、０．１５ＭのＫＣ１１ｍｃ中ヒトグリコホリンＭ
Ｍ４ｍｇの溶液（４ｍｇ／ｍｌ）と所定体積のＥＭを添
加して、蛋白質濃度を１．２５ｕｇ／１０’細胞にした
。

次ぎに懸濁液を３７℃で５分間保持した。その後、懸濁
液を遠心分離にかり、上澄みをヘマトクリット１６％と
なる様に除去した。この２５μｅの最終的な細胞懸濁液
を４℃でパルス高さ１゜５　ｋ　Ｖ　／　ｃ　ｍの電界
パルス（マウスの赤血球電気挿入の臨界値（２，６ｋＶ
／ｃｍ）より低い）にさらした。電気挿入は、細胞懸濁
液２５μβを５秒間隔で相次ぐ８個の方形電界パルスに
さらすことにより行なった。パルス高さは細胞の大きさ
に依存するが、その値は電気挿入の臨界値より小さい。

パルス幅は４００Ｍ秒であった。

次ぎに、細胞を３７℃で１時間再封孔し、更に再封孔媒
質（ＲＭ）（１，２１１ｇのＫＣＩ。

０．９ｇのグルコース、０．５ｇのＢＳＡ、１゜０２ｇ
のＮａＣ１，及び燐酸塩で緩衝したかん水（ＰＢＳ）５
ｍＭ、ｐＨ７，４，２５０ｍＪ２まで）中で更に１時間
再封孔し、最後にＲＭで１回洗浄し、０．４５ｒｒｉの
ＮａＣ１−ＰＢＳ７．４緩衝液で２回洗浄した。

夫急血止上 採取したばかりの血液から得た赤血球を、ＰＢＳｐＨ８
，８緩Ｉｉ液中に０．１４ＭのＮａＣ１を溶解したもの
で５回洗浄した。

１０ＰＢＳｐＨ８，８緩衝液に懸濁又は親液化した細胞
を赤血球ベレット（ヘマトクリット９０％）に添加した
。氷上で２０分間保温した後３７℃で１５分間保温し、
次いで３７℃で１５分間隔で４個の電界パルスを印加し
た。各パルスは幅１ｍ秒、高さ１．３ｋＶ／ｃｍ（ヒト
の赤血球に対し）　、１．６ｋＶ／ｃｍ　（ウサギの赤
血球に対し）、及び２．１ｋＶ／ｃｍ（ネズミの赤血球
に対し）であった、最後に赤血球を血清で１回洗浄し、
５ＰＢＭｐＨ７，４緩衝液で２回洗浄した。ヘモクリッ
ト５０％のものを５ＰＢＭｐＨ７４緩衝液中、又は保存
液（ＡＤＳＯＬ、・・・１００＋ｎｊ２中２．２ｇのデ
キストローゼ、９００ｍｇの塩化ナトリウム、７５０ｍ
ｇのマンニトール、２７ｍｇのアゾナイン（米国イリノ
イ州ディーアフィールド所在のＦｅｎｗａｌＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ社））中３７℃で保温すれば、赤血球膜
に挿入された蛋白質の青白を伸ばすことが出来る。

史１ＪＩλ ＣＤ４受容体を実施例１ｂに記載した条件を同じ条件下
に赤血球膜（ヒト、ウサギ、ネズミ）に挿入した。ｇｐ
１２０表現ＨＩＶ感染Ｈ９細胞と反応したとき凝集密度
に達した。

見上皇ユ（免疫蛍光分析） グリコホリンな赤血球膜に挿入した後、洗浄した細胞を
２μβの０．１７ｍｇ／ｍｆｆ１ＯＦ７抗グリコホリン
モノクロナル抗体（カリフォルニア大学りヴアーモア・
ナショナル・ラボラトリ−バイオケミカル・ディヴイジ
ョン）と共に３０分間室温に保温し、次ぎに０．１４５
ＭのＮａＣＩＰＢＳｐＨ７，４緩衝液で３回洗浄した。

細胞を次ぎにフィコエリトリン複合アフイニビュアＦ　
（ａｂ’　）２断片ヤギーマウスＩｇＧ（米国ペンシル
バニア州ウェスト・グローヴ所在のジャクソン・イミュ
ノ・リサーチ・ラボラトリ−）又は蛍光複合アフイニビ
エアＦ　（ａｂ’　）２断片ウサギーマウスＩｇＧ（米
国ニューヨーク州つエストバーグ所在のアキュレート・
ケミカル社）と共に保温した。処理した細胞を最後に０
．１４５ＭのＮａＣＩＰＢＳ７．４緩衝液で３回洗浄し
た。

夫急ＪＬｕ 電気挿入をしない他は実施例１ａに従って処理したネズ
ミ赤血球（ＲＢＣ）を対照試料とする。

青色励起による実施例試料及び対照試料の蛍光の観察に
より、電気挿入処理を受けていない対照試料は細胞膜上
にＦＩＴＣ蛍尤による蛍光性緑色点を有することが分か
った。電気挿入をした試料は凝集した高度に蛍光性の細
胞を有した。凝集は挿入したグリコホリンを有する細胞
の間を結合するｌ　ＯＦ７抗グリコホリンによる。この
凝集は細胞の凝集を起こすことが出来るには１０６個の
桁の細胞に結合されたグリコホリンが必要であるとの考
えを導く（第１図）、、擬似ＥＬＩＳＡはこの挿入数の
桁を確認し、１個の細胞あたり４，２×ｌＯＳ個のグリ
コホリンが挿入されたことを示す（実施例６を参照）。

上記のことはＣａ０とＭｇ０が低イオンｉ１度の媒質に
低濃度（０，５ｍＭ）で存在するとグリコホリンの赤血
球の細胞膜への固定を助け、その結果数に細胞膜に充分
近接しているグリコポリンは電界パルスの印加期間に結
合することを示している。

ＣｏｕｌｔｅｒＥＰＩＣＳプロフィル計による細胞蛍光
分析を使用したのでは、細胞の凝集があるので蛋白質結
合割合の正確な評価が困難である（第１ａ図）。ある単
独細胞に対しては型光は１個の細胞あたり平均２．５Ｘ
　１０’蛍光性分子（Ｆ　Ｉ　ＴＣ）に相当する測定値
を示した。この数値は凝集を起こすに必要なグリコホリ
ン挿入の評価割合に一致する（第２図） 丈１１Ｌ支上 挿入したＣＤ４は０ＫＴ４Ａ、０ＫＴ４Ｇ、及び０ＫＴ
４Ｄを含む異なった抗ＣＤ４モノクロナル抗体（米国一
ニージャージ州ラリタン所在のオルト・ダイアグノース
ティック・システム社）、ＢＬ４／１０Ｔ４　（米国メ
イン州ウェストプルツク所在のアマツク社）、ＣＹＴＯ
２９（米国ニコ、−ヨーク州プリンストン所在、サイト
ゲン社）、及びＬｅｕ３Ａ　（ＨＩＶウィルスのｇ、　
ｐ　ｌ　２０被覆蛋白質を有する活性エピトープ）（米
国カリフォルニア州マウンテン・ビュー所在のベクトン
ーディキンソン・イミュノサイトメトリー・システム社
）で検出し、ついでフィコエリトリン複合Ｆ　（ａｂ’
　）２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ又はフルオレセイン複合
アフィンピュアＦ（ａｂ’）２断片ウザギ抗マウスＩｇ
Ｇで検出した。

対照資料は対応する実施例資料に対する対照として用い
た。ここに対照試料は実施例１ｂの全工程を行なったが
、グリコホリン又はＣＤ４の代わりにウシ血清アルブミ
ンを使用した。

蛍光顕微鏡下で　挿入蛋白質を有する赤血球はウサギ赤
血球への挿入グリコホリンのキャッピングに特有の明る
い蛍光点を示した（第４図）。第５図はヒト赤血球の細
胞膜への電気挿入ＣＤ４で蛍光的に染色したモノクロナ
ル抗体の検出を示す。

フロー細胞測定ををＣｏｕｌｅｒＥＰＩＣＳプロフィル
計で行なった。フィコエリトリンは５７５ｎｍ帯域透過
放射フィルターで、又蛍光は５２５ｎｍ帯域透過放射フ
ィルターで測定した。

測定器の整列は５個のマイクロメータ直径免疫検査（Ｉ
ｍｍｕｎｏｃｈｅｃｋ）ビーズで行なった。光電倍増管
の高電圧を、種々の蛍光強度を有する免疫発光（Ｉｍｍ
ｕｎｏｂｒ　ｉ　ｇｈｔ）ビーズを使用して、これらの
蛍光標準のヂャンネルでの特性蛍光ピークを得るように
セットした。分析のために次のヒストグラムを集めた。

１）９０度側面敗乱に対する前面散乱、２）対数緑色又
は赤色蛍光に対する細胞数。

型光強度と細胞数のフロー細胞分析により、全数の細胞
の強度が対照試料に対してシフトしたことが分かった。

これは赤血球の全体がゼノプロテインの電気挿入を受け
たことを示す、蛍光強度の平均ピークチャンネルは１個
の細胞あたりに挿入された蛋白質の数を評価するのに使
用した。第６図はウサギの赤血球にグリコホリンを挿入
した場合を示し、第７図はウサギの赤血球にＣＤ４を挿
入した場合を示す。

標準傾向ビーズ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用し赤血球１個
あたりの挿入分平均数が２００であることが分かった。

挿入効率は（細胞あたりの添加分子数あたりの挿入分子
数の割合）は１／１０００であった。この効率は過小に
評価されている。なぜなら、活性エピトープ（抗原決定
基）のみが検出され且つ添加分子数が活性エピトープを
有する蛋白質分子数を正確に表わさない重量から推測さ
れるような免疫蛍光によって、挿入分子の測定が行なわ
れたからである。

電気挿入の他の応用はビオチニル化ヒトグリコホリンの
ヒト赤血球への挿入である。使用した装置及び媒質は今
までに述べたものと同じものである。電界パルスの高さ
はヒト赤血球への挿入に対する臨界電界高さ２．２ｋＶ
／ｃｍよりも低い１．３ｋＶ／ｃｍであった。

ヒトグリコホリンＭＮ（米国ミズーリ州セントルイス所
在のシグマ・ケミカル社）を０゜５　ｍ　ｇ　／　ｍρ
の０．１Ｍの重炭酸ソーダに溶解した。４℃で撹拌しな
がら同量のｌ　ｍ　ｇ　／　ｍρのスクシニミジルＤ−
ビオチン（分子プローブ）をジメチルホルムアルデヒド
に滴下した。溶液を攪拌しながら４℃に維持した。０．
１５ＭのＫＣＩで４回透析し、０．３Ｍのマンニトール
で１回透析して電気挿入に使用するグリコホリン−ビオ
チンのマンニトール溶液を得た。

天１１６ １皿旦上」づＡ 赤血球１個あたりのグリコホリン挿入分子数の定量的な
評価を行なうために、擬似ＥＬＩＳＡ試験を行なった。

この試験ではグリコホリン−ビオチン分子をアルカリ性
フオスポターゼアビジン複合体（ＩＣＮ）により標識し
た。ＥＫＩＳＡ板（米国マサツセッツ州ケンブリッジ所
在コスタ社）を使用し、色強度を４１ｍｎフィルター付
きＤＹＮＡＴＥＣＨＭｒ７００で読み取った。

先ず光学強度対ビオチニル化グリコボリンの標準曲線を
描き、ビオチニル化グリコホリンの背景に対して補正し
た。グリコホリン−ビオチンを担持した懸濁細胞の血／
ｌ！ｆ溶液を作製した。３７℃で９０分間乾燥した後、
細胞を洗浄緩衝液（ＰＢＳ７．４．１％ＢＳＡ、０．５
％ＴＷＥＥＮ２０）で３回洗浄した。板を所定量の洗浄
緩衝液を添加でブロックし、ついで３７℃で１時間保温
した。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、アルカリ性フォス
ホターゼアビジン希薄液（１：１００００）を添加し、
３７℃で１時間保温した。洗浄緩衝液で３かい洗浄した
のち、蒸留水で３回洗浄し、基質緩衝液（リン酸バラニ
トロフェノールのヂエチレンアミン（ＤＥＡ）緩衝液ｐ
Ｈ９，８中０．４ｍｇ／ｍｐ、溶液）を添加し、室温で
１時間保温した。最後に、２．５ＮのＮａＯＨを加えて
反応を停止した。板の読みは４１０ｎｍであった。

細胞の係数をＣｏｕｌｔｅｒ計数器により行なった。

上記のものに類似の擬似ＥＬＩＳＡ試験を行なってマウ
ス赤血球に挿入されたヒトグリコホリンを定量したが、
アルカリ性フォスホターゼアビジンの代わりに１０Ｆ７
抗グリコホリンとアルカリ性フィスホターゼアビジンＦ
（ａｂ’）ａ断片ヤギ抗マウスＩｇＧを使用した。

火ｌ」乳ユ グリコホリン−ビオチンのヒト　血　の細■Ω１見」東
人 ヒトの採取したばかりの赤血球をＰＨ１０゜４の緩衝液
に０．１４５ＮａＣｎを溶解したもので３回洗浄し次い
でＥＭで２回洗浄した。０゜５ｍＭのＣａ　Ｃｌ　ｉ及
び１０５ｍＭのＭｇｃｔｚを添加した後、氷上で５分間
、３７℃で５分間保温した（ヘマトクリット９０％）、
その後直ちに１０６個の細胞あたりに１．２５μｇのグ
リコホリンとなる所定量のグリコホリン−ビオチン溶液
を添加し、ついで３７℃で分間保温した。得られた＠濁
液な遠心分離し、上澄みを除いてヘマトクリット１６％
にした。２５μＣの最終懸濁液を４℃で電界パルスにさ
らした。

パルス印加した後直ちに細胞を３７℃で１時間ＲＭの存
在下に保温した。ついで、細胞なＲＭ（実施例１ａ参照
）で１回洗浄し、更に０゜１４５ＭのＮａＣｌのＰＢＳ
ｐＨ７，４で２回洗浄した。試料の半分をアビジン−Ｆ
ＩＴＣ（分子プローブ）で標識し、他の半分なＥＬＩＳ
Ａ試験に使用した。

電界パルスを使用しないで上の方法を全面的に実施して
得た試料を対照試料とした。

更に他の対照試験とし、アビジン−ＦＩＴＣの非特異的
結合を検査するために次の試験を行なったグリコホリン
−ビオチンを使用しないでＲＢＣに対して上記と全面的
に同じ方法で電気挿入処理を行なった。蛍光は全熱観察
されなかった。

擬似ＥＬＩＳＡ試験はヒト赤血球１個あたり３．５Ｘ１
０’個までの挿入が起きたことを示した。この挿入割合
は、第３ａ図及び第３１）図に示したように、アビジン
による細胞間結合によるビオチニル化グリコホリン担持
赤血球の凝集と一致する。この場合及び抗グリコホリン
抗体の場合の凝集の共通な現象は、操作条件によるので
はなく、高度の挿入によるものであることの証拠である
。アビジン及び抗グリコホリン抗体を電界パルス処理を
受けた細胞に添加した対照試料では何らの凝集も起きな
かった。これは本発明の方法が赤血球中へのＣＤ４の挿
入その他薬剤櫟的に役立つ他の分子の挿入に極めて強力
な手段として適用出来ることを示す。

精製したｒＣＤ４及びヒトグリコホリンな、（”’Ｉ）
−ポルトン−ハンター試薬（１０Ｉ−ＢＨＲ）（米国マ
サチュセッツ州ボストンのニュー７　リサーチ、プロダ
クツ社￥Ｊ）を使用して指示に従って＋ｓｓ　１欅識し
た。

雄のウサギにニーシーラント産２．５〜３ｋｇの白色）
の耳たぶ動脈からの４ｍβの血液を、ヘパリン処理した
管に採取した。蛋白質を実施例１ｂの方法に従って７０
０μ℃の充填赤血球に挿入した。挿入後に赤血球をＣｒ
５１　（Ｎａ’Ｃｒ　Ｏａ　）キット（米国ミズーリ州
セントルイスのマリンクロット社製）を使用して指示に
従って”Ｃｒ１ｌ識した。赤血球−Ｃ，Ｄ４“　（グリ
コホリン゛）懸濁液を同じウサギの耳たぶに静脈注射し
た。

血液試料（１，５ｒｒ＋ｆｆ）を自動γ線計数器（米国
イリノイ州エルク、グローブ、ビレッジのティー、エム
、アナリチック社製のＴＭアナリヂック１９１１ガンマ
、トラック）を使用して計数した。第１２図は電気挿入
処理をした赤血球及び挿入した蛋白質の寿命を示す。色
分析の結果は電気挿入は生体内での赤血球の寿命に影響
を与えないことを示し、半減期は１７日であった。挿入
した蛋白質の寿命はそれより短かった（７日）。

免疫反応は挿入したＣＤ４にもグリコホリンにも検出さ
れなかった。従って、電気挿入は循環中に免疫活性を保
持する完全な長さのＣＤ４に対する長寿命の担体な提供
する。

同−源からの血漿又はへマドクリット５０％の生理液に
再分散したＣＤ４”はエイズ患者の血液流に注入して循
環している遊ｔｌｌ＃ＨＩＶウィルス、循環しているｇ
ｐ１２０、及びｇｐ１２０分子を表面に有する感染細胞
の除去剤として使用出来る。後者の場合、ＲＢＣ（赤血
球）−ＣＤ４”は網状内皮系により認識され食菌される
凝集物を形成する。

ＣＤ４°赤血球は又感染した食細胞に差し向けるための
ＨＩ　Ｖ感染に対して効果的な特定の抗ウィルス剤（例
えばＡＺＴ）と共に負荷することが出来る。

本発明の電気挿入法は、特定の表面抗原又は受容体を含
む病気（例えばＢ型肝炎ウィルス及びマラリア）の治療
、又は電気挿入された膜蛋白を有する赤血球による標識
剤の運搬が望まれる場合に、他の膜蛋白質を赤血球膜に
挿入するのにも使用出来る。

本発明は又赤血球膜に適当な抗体を電気挿入し、次いで
これを患者に投与することにより自己免疫症を治療する
のにも使用出来る。

ヒトグリコホリンのヒトリンパＴ細胞 （ＣＥＭ）！ＩＩへの挿入を、赤血球について上に述べ
た方法と同様にして実施した。ＣＥＭ細胞あたり約１０
００グリコホリンが検出された。この結果は真核細胞に
も本発明の電気挿入法が実施出来ることを示している。

採取したばかりの赤血球を、ＰＢＳｐＨ８゜８の緩衝液
に０．１４ＮａＣβを溶解したもので５回洗浄した。１
０ＰＢＳｐＨ８，８緩衝液に懸濁させた又はそれで親液
化した膜蛋白質（グリコホリン又はＣＤ４）を赤血球ペ
レット（ヘマククリット９０％）に加えた。氷上で２０
分間保温し、更に３７℃で３時間保温した赤血球を血漿
で１回洗浄し、５ＰＢＳ　　ｐＨ７，４緩衝液で２回洗
浄した。添加蛋白質の１度に依存して、フロー細胞計分
析を使用した免疫型光分析により４５００エピトープま
での決定がなされた。

以上により本発明を説明したが、本発明の範囲内で多く
の変形例が可能であることは当業者には明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図はヒ］・グリコホリンを担持したネズミ赤血球
の凝集を示す蛍光顕微鏡写真、第１１′）図はヒトグリ
コホリンを担持したネズミ赤血球の凝集を示す他の蛍光
顕微鏡写真、第２ａ図は細胞蛍光Ｘｆ’　（ＥＰＩＣ３
ＰＲＯＦＩＬＥ）により得た細胞と蛍光強度の関係を示
ず蛍光ヒストグラムで、電界パルスを印加しない対照試
料に対するもので計数した１２１３細胞上に高い蛍光性
の細胞がないことを示し、第２ｂ図は細胞型光計により
得た細胞と蛍光強度の関係を示す蛍光ヒストダラムで、
電界パルスを印加した場合を示し、１７４２ネズミ赤血
球の１０．４％がグリコホリン挿入に対応し２て約２．
５Ｘ１０’のＦＩＴＣを含イ１することを示し、第３ａ
図はビオチニル化グリコホリンを担持したヒト赤血球の
凝集を示す白色光顕微鏡写真、第３　ｂ図はビオチニル
化グリコホリンを担持したヒト赤血球の凝集を示す蛍光
顕微鏡写真、第４ａ図は１０Ｆ７抗ヒトグリコホリン抗
体及び−次的蛍光抗体（ヤギ抗ネズミフィコエリトリン
）と反応させた後の１気挿入グリコポリン抗体を担持し
たウサギ赤血球の蛍光顕微鏡写真、第４ｈ図は第４ａ図
のウサギ赤血球の白色光顕微鏡写真、第５ａ図は０ＫＴ
４Ｃ及びＬ　ｅ　ｕ　３　ａモノクロナル抗体及びヤギ
抗マウスフィコエリトリン抗体と反応させた後の電気挿
入ＣＤ４担持ヒ１−赤血球の蛍光顕微鏡写真で、輝点は
モノクロナル抗体と反応させるさいの挿入蛋白質のギヤ
ッピング特性を示すものであり、第５ｂ図は第４ａ図で
観察されたヒト赤血球の白色光顕微鏡であり、細胞は処
理によってとくに影響を受けていない様子を示し、第６
図はウサギ赤血球−グリコポリンのフロー細胞計分析（
臓」′♀）を対照細胞の分析（実ｌ１ｉｌ）に対比し“
〔蛍光強度シフトを示し、たグラフで強度レベルは４０
００グリコボリン数／細胞に相当し、第７図はウサギ赤
血球ＣＤ４のフロー細胞計分析（也（、♀）を対照細Ｅ
の分析（実線）に対比して蛍光強度シフトを示したグラ
フで強度レベルは２０００ＣＤ４分子数、／細胞に相当
し、第８図はネズミＲＢＣ細胞−グリコポイリン細胞に
ついて細胞あたりの挿入された蛋白質分子数の蛍光相対
強度（フォロー細胞分析計で測定）の印加電界パルス数
に対する依存性を示すグラフ、第９図はネズミ赤血球の
挿入効率（Ｉは細胞あたりの挿入蛋白質分子数／細胞あ
たりに添加し、・た蛋白質）の蛋白質、１度依存性を示
すグラフ、第１０図はネズミ赤血球−グリコホリンの細
胞あたりの蛋白質挿入数の蛋白質Ｌａｌり：依存性を小
すグラフ、第１１図はネズミ赤血球のＰ　ＣＮ　Ｂ　Ｉ
Ｉ）挿入効率（相対蛍光強度で表示）のヘマ１−クリッ
ト依存付を示すグラフ、及び第１２図は”’ｌ−ＣＤ４
及びｌ″１ｌＩ−グリコホリンの挿入を行な−）たつ→
Ｊギ赤血球（ｆｉｌＣｒで標識）の牛存朋間を示１グラ
フである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）疎水性の膜貫通配列を有する挿入すべき蛋白質の緩
   衝溶液の存在下に細胞を電気挿入媒質中に懸濁した状態
   で前記細胞に電界を印加し、次いでこの処理された細胞
   を再封孔媒質に接触させる、細胞膜への蛋白質挿入方法
   。 ２）細胞が血液中の動物細胞である前記第１項記載の挿
   入方法。 ３）細胞が赤血球である前記第２項記載の挿入方法。 ４）電界が電界パルスである前記第１項記載の挿入方法
   。 ５）電界パルスが５秒以内の間隔で印加される８個以内
   の電界パルスである前記第４項記載の挿入方法。 ６）電界パルスの高さが電気穿孔電界以下の高さである
   前記第４項記載の挿入方法。 ７）電界パルスが少なくとも４００μ秒の長さを有する
   前記第４項記載の挿入方法。 ８）電界パルスが方形波である前記第４項記載の挿入方
   法。 ９）電界パルスが１５分間隔で印加される４個以下の電
   界パルスである前記第４項記載の挿入方法。 １０）電界パルスが１ｍ秒以下の長さである前記第４項
   記載の挿入方法。 １１）電界パルス高さが１．３〜２．１ｋｖ／ｃｍであ
   る前記第４項記載の挿入方法。 １２）電気挿入媒質がｐＨ７．８以下のマンニトール又
   はヒスチジンである前記第１項記載の挿入方法。 １３）再封孔が等張液である前記第１項記載の挿入方法
   。 １４）再封孔媒質がＰＢＳ中のＫＣｌ、 ＮａＣｌ、ＢＳＡ、ＨＳＡ、ＭｇＣｌ＿２、グルコース
   より選択される一種以上の水性混合物である前記第１３
   項記載の挿入方法。 １５）懸濁が０．００１〜９８％へマトクリット　の割
   合で行なわれる前記第１項記載の挿入方法。 １６）蛋白質がヒトグロブリンである前記第１項記載の
   導入方法。 １７）蛋白質がＣＤ４受容体である前記第１項記載の挿
   入方法。　 １８）蛋白質の細胞に対する分子割合は、各細胞が電界
   印加に先だって蛋白質で完全に覆われる程　度である前
   記第１項記載の挿入方法。 １９）蛋白質は細胞一個当たり約１０＾６個である前記
   第１８項記載の挿入方法。 ２０）電気挿入媒質はｐＨ８．８以下のＰＢＳで　ある
   前記第１項記載の挿入方法。 ２１）温度２〜３９℃で実施される前記第１項記　載の
   挿入方法。 ２２）１〜４時間行なわれる前記第１項記載の挿入方法
   。 ２３）温度３７℃で３時間行なわれる前記第１項　記載
   の挿入方法。 ２４）緩衝溶液がＬ−アルファ−ホスファチド酸ジパル
   ミトイルである前記第１項記載の挿入方法。 ２５）再封孔後に更に２０〜３９℃で１〜２時間保存媒
   質と共に保温する工程を付加した前記第１項記載の挿入
   方法。 ２６）再封孔後に更に２〜６℃で６〜１２時間保存媒質
   と共に保温する工程を付加した前記第１頂記載の挿入方
   法。 ２７）細胞が培地中の有核動物細胞である前記第１項記
   載の挿入方法。 ２８）細胞がＣＥＭである前記第２７項記載の挿入方法
   。