JPH0147997B2 - - Google Patents

Info

Publication number
JPH0147997B2
JPH0147997B2 JP57113364A JP11336482A JPH0147997B2 JP H0147997 B2 JPH0147997 B2 JP H0147997B2 JP 57113364 A JP57113364 A JP 57113364A JP 11336482 A JP11336482 A JP 11336482A JP H0147997 B2 JPH0147997 B2 JP H0147997B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hukn
adsorbent
chitosan
units
urine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
JP57113364A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS596883A (ja
Inventor
Koichiro Nakanishi
Hajime Hiratani
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Original Assignee
JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by JCR Pharmaceuticals Co Ltd filed Critical JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Priority to JP57113364A priority Critical patent/JPS596883A/ja
Priority to DE8383303662T priority patent/DE3376018D1/de
Priority to EP83303662A priority patent/EP0098123B1/en
Priority to US06/509,030 priority patent/US4510248A/en
Publication of JPS596883A publication Critical patent/JPS596883A/ja
Publication of JPH0147997B2 publication Critical patent/JPH0147997B2/ja
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6445—Kallikreins (3.4.21.34; 3.4.21.35)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
本発明は人尿カリクレイン（以下HUKNと略
称することもある）を人尿より工業的規模で収率
良く、高純度に取得する方法に関するものであ
る。カリクレインは動物の生体内各部で生産され
る蛋白質分解酵素で、血清中のキニノーゲンを分
解してキニンを生成せしめ、それを介して血圧降
下、血流量増加等の作用を有する。このものはこ
れまで哺乳動物、特に豚の膵臓及び尿を原料とし
て精製されてきた。しかしながら、従来の異種動
物を起源とするものは、非経口的に投与すると異
種蛋白による抗原抗体反応などの副作用が生じる
可能性がある。人尿を原料とするHUKNは、同
種蛋白であるため、抗原抗体反応などの副作用は
なく、たとえHUKN以外の夾雑蛋白を含んでい
たとしても、人体に対する副作用は極めて少な
い。 HUKNの人尿からの濃縮精製法としては、シ
リカゲルを用いる方法（特公昭46―19067）アル
ギニン―セフアロースを用いる方法（特開昭55―
99191）、第三級アミンを交換基とする高架橋度マ
クロポーラス型陰イオン交換樹脂を用いる方法
（特開昭50―5515）等が知られている。 しかし、これらの方法は精製度、回収率、経費
および操作簡便性の面で必ずしも満足のいくもの
とは言い難い。 そこで本発明者らは、人尿を原料として工業的
規模で収率良く、高純度のカリクレインの得られ
る精製法を鋭意研究した。 本発明者らは、各種無機吸着剤、イオン交換体
たん白凝集剤等の材料について尿よりのHUKN
の回収率、精製倍率を次のように比較検討した。
同一正常人尿を１ずつ分割して試料とし、上記
の各材料５ｇずつを用いて吸着、溶出して溶出液
中のHUKN活性およびたん白質量を測定して回
収率と比活性を算出し次表の結果を得た。 表中、No.１〜３の吸着剤は和光純薬(株)製で、No.
１は商品名ワコーゲルＣ―100として市販され、
No.２は200〜300メツシユである。同No.４はブラウ
ン社（***）製、No.５とNo.７はフアルマシア（ジ
ヤパン）製、No.６は三菱化成工業(株)製、No.８は共
和油脂工業(株)製で、商品名フローナツクＮとして
市販されている。
【表】 上記結果より、キトサンは、HUKNを選択的
に吸着し、回収率、精製倍率が優れていることを
見いだした。キトサンは、カニあるいはエビ等の
甲殻類の皮殻から製したキチンを濃アルカリで加
熱加水分解したもので〔２―アミノ―２―デオキ
シ―Ｄ―グルコース〕ｎの製造を有する多糖類で
分子量は約20万で、粒度3.5mm以下の有効かつ無
害な高分子凝集剤として使用されている。 本発明は上記の発見に基づくもので、人尿とキ
トサンをPH4.0〜7.0で接触させることにより尿中
のカリクレインを選択的にキトサンに吸着させ、
次いで吸着体よりアルカリ性溶液でカリクレイン
を溶出することを特徴とするカリクレインの濃縮
精製法である。 キトサンと接触させる人尿のPHは4.0〜7.0、好
ましくは5.0に調整するのがよい。 キトサンの使用量は一般に尿１当り１〜10ｇ
程度でよい。キトサンを接触させることにより人
尿中のHUKNは選択的にキトサンに吸着される。 吸着は常温で行いうる。 吸着体を取し、水で充分洗浄したのち、アル
カリ性溶液でHUKNを溶出する。アルカリ性溶
液のPHは8.1〜12.0の範囲とするのは望ましく、
そのような溶液の好ましい例は、たとえば、1N
―アンモニア水、0.1〜0.3Mトリス塩酸緩衝液な
どである。 キトサンを吸着体として用いることにより
HUKNを選択的に吸着させることができるばか
りでなく、吸着体の分離、洗浄、溶出を従来の方
法におけるよりも短時間に行うことができ、また
尿の処理を大量に行なう場合には吸引過法、遠
心分離法等の簡便な操作を適用できるのできわめ
て有利である。 人尿中に万一混入するかも知れない肝炎ビール
ス等を不活性化するためには、HUKNを吸着し
たキトサンを、たとえばPH6.0の緩衝液中で60℃、
10時間以上加温したのち、吸着体からHUKNを
溶出してもよい。 吸着剤としてイオン交換や無機吸着剤を用いる
場合、溶出後の吸着剤を再生するためには酸およ
びアルカリ溶液による洗浄や加熱による活性化等
の工程を要するが、本発明のキトサンを用いた場
合は溶出後の吸着を水洗するだけで再使用するこ
とができる。 以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説
明する。 実施例 １ 健康な成人男子尿10に撹拌しながら2N―塩
酸を加え、PH5.5に調整した。これにキトサン100
ｇを加え、１時間撹拌してHUKNを吸着せしめ
た後、過にてHUKN―吸着体を得た。次にそ
の吸着体を純水にて十分洗浄した。そしてその吸
着体から1N―アンモニア水で溶出・過を行な
つてHUKN―抽出液400mlを得た。 得られたHUKNの総活性は1368単位（回収率
72％）、純度は蛋白質１mg当り34単位であつた。 実施例 ２ 健康な成人男子尿10に撹拌しながら2N―塩
酸を加えPH4.5に調整する。これにキトサン50ｇ
を加えて１時間撹拌してHUKNを吸着せしめた
後、過にてHUKN―吸着体を得た。次にその
吸着体を純水にて十分洗浄した。そしてその吸着
体から0.3M―トリス―塩酸緩衝液（PH10.0）に
て抽出し、HUKN―抽出液300mlを得た。 得られたHUKNの総活性は1350単位（回収率
71％）、純度は蛋白質１mg当り33単位であつた。 実験例 ３ 健康な成人男子尿10に、撹拌しながら2N―
塩酸を加え、PH6.5に調整する。これにキトサン
100ｇを加えて１時間撹拌してHUKNを吸着せし
めた後、過にてHUKN―吸着体を得た。次に
吸着体を純水にて十分洗浄した。そしてその吸着
体から0.1M―トリス―塩酸緩衝液（PH8.0）にて
抽出した後、過を行なつてHUKN―抽出液400
mlを得た。 得られたカリクレインの総活性は1225単位（回
収率72％）、純度は蛋白質１mg当り27単位であつ
た。 実施例 ４ 健康な成人男子尿10に撹拌しながら2N―塩
酸を加えPH5.5に調整する。これにキトサン50ｇ
を加えて１時間撹拌してHUKNを吸着せしめた
後、過にてHUKN―吸着体を得た。次にその
吸着体を0.15M―塩化ナトリウムを含む0.05M―
リン酸緩衝液（PH6.0）で充分洗浄、過した後
同じ後衝液300mlを加えて60℃、10時間加温した。
過にて吸着体を分離し、その吸着体から1.5N
アンモニア水で溶出・過を行つてHUKN―抽
出液450mlを得た。 得られたHUKNの総活性は1085単位（回収率
65％）純度は蛋白質１mg当り37単位であつた。 実施例 ５ 健康な成人男子尿10に、2N―塩酸を撹拌し
ながら加えてPH5.0に調整する。これにキトサン
100ｇを加え、１時間撹拌してHUKNを吸着せし
めた後、過にてHUKN―吸着体を得た。次に
その吸着体を純水にて十分洗浄した。そしてその
吸着体に1N―アンモニア水を加えて抽出後、
過を行なつてHUKN―抽出液400mlを得た。 得られたHUKNの総活性は1260単位（回収率
71％）、純度は蛋白質１mg当り33単位であつた。 次に、そのHUKN―抽出液を0.05M―リン酸
緩衝液に対して透析し、同じ緩衝液で緩衝化した
DEAE―Celluloseカラム（直径３cm、高さ20cm）
に吸着させ、同じ緩衝液で洗浄した後0.4Mの塩
化ナトリウムを含む0.05M―リン酸緩衝液（PH
7.0）にて溶出し、HUKN―溶液51mlを得た。 得られたHUKNの総活性は1070単位（回収率
60％）、純度は蛋白質１mg当り310単位であつた。 実施例 ６ 健康な成人男子尿10に、2N―塩酸を撹拌し
ながら加えてPH5.0に調整する。これにキトサン
100ｇを加えて、１時間撹拌してHUKNを吸着せ
しめた後、過にてHUKN―吸着体を得た。次
にその吸着体を純水にて十分洗浄した。そしてそ
の吸着体に0.2M―トリス―塩酸緩衝液（PH9.0）
を加えて抽出し、過によつてHUKN―抽出液
300mlを得た。 得られたHUKNの総活性は1385単位（回収率
71％）、純度は蛋白質１mg当り32単位であつた。 次にこのHUKN―抽出液に硫酸アンモニウム
200ｇを加え、生じた沈殿を遠心分離により得る。
この沈殿を0.1M―リン酸緩衝液（PH7.5）25mlに
溶解し、同じ緩衝液で緩衝化したSephadex Ｇ―
100カラム（直径2.6cm、高さ100cm）を通過させ
ることによりHUKN―溶液を得た。 得られたHUKNの総活性は1090単位（回収率
56％）純度は蛋白質１mg当たり290単位であつた。 実施例 ７ 健康な成人男子尿20に、2N―塩酸を加えて
PH5.0に調整し、キトサン200ｇを加えて１時間撹
拌してHUKNを吸着せしめた後、過にて
HUKN―吸着体を得た。さらにその吸着体を純
水にて十分洗浄した。次にその吸着体に0.2M―
トリス―塩酸緩衝液（PH9.0）を加えて抽出し、
過によつてHUKN―抽出液800mlを得た。 得られたHUKNの総活性は2856単位（回収率
68％）、純度は蛋白質１mg当り33単位であつた。 次にその抽出液を0.5Mの塩化ナトリウムを含
む0.1M―炭酸水素ナトリウム緩衝液PH9.0に対し
て透析し、同じ緩衝液で緩衝化したアプロチニン
―セフアロースカラム（直径2.0cm、高さ20cm）
に吸着させ、0.5Mの塩化ナトリウムを含む0.1M
―酢酸緩衝液（PH3.5）にて溶出してHUKN―溶
液20mlを得た。 得られたHUKNの総活性は2142単位（回収率
51％）、純度は蛋白質１mg当り840単位であつた。 なお実施例１〜７におけるHUKNの単位は、
本発明者らが人尿から抽出精製したHUKNを血
管拡張測定法（Journal of Biochemis try，58，
201，1965）により単位を決定し、これを標準品
として螢光合成基質法（Journal of
Biochemisty82，1495，1977）により測定した。
蛋白質量はLowry―Folin法を用いて牛血清アル
ブミンを標準にして測定した。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ 人尿とキトサンをPH4.0〜7.0で接触させるこ
    とにより尿中のカリクレインを選択的にキトサン
    に吸着させ、次いで吸着体よりアルカリ性溶液で
    カリクレインを溶出することを特徴とするカリク
    レインの濃縮精製法。
JP57113364A 1982-06-30 1982-06-30 人尿カリクレインの濃縮精製法 Granted JPS596883A (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP57113364A JPS596883A (ja) 1982-06-30 1982-06-30 人尿カリクレインの濃縮精製法
DE8383303662T DE3376018D1 (en) 1982-06-30 1983-06-24 A process for concentrating and purifying human urinary kallikrein
EP83303662A EP0098123B1 (en) 1982-06-30 1983-06-24 A process for concentrating and purifying human urinary kallikrein
US06/509,030 US4510248A (en) 1982-06-30 1983-06-29 Process for concentrating and purifying human urinary kallikrein

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP57113364A JPS596883A (ja) 1982-06-30 1982-06-30 人尿カリクレインの濃縮精製法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS596883A JPS596883A (ja) 1984-01-13
JPH0147997B2 true JPH0147997B2 (ja) 1989-10-17

Family

ID=14610402

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP57113364A Granted JPS596883A (ja) 1982-06-30 1982-06-30 人尿カリクレインの濃縮精製法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US4510248A (ja)
EP (1) EP0098123B1 (ja)
JP (1) JPS596883A (ja)
DE (1) DE3376018D1 (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4780209A (en) * 1984-06-06 1988-10-25 Japan Chemical Research Co., Ltd. Process for concentrating and separating trypsin inhibitor and kallidinogenase in human urine
US4746611A (en) * 1985-01-10 1988-05-24 Agency Of Industrial Science & Technology Process for recovering cellulases
WO1989000192A1 (en) * 1987-06-30 1989-01-12 Amgen Inc. Production of kallikrein
EP0546533A2 (en) * 1991-12-10 1993-06-16 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. Medical use of kininogenase
US5469305A (en) * 1993-12-17 1995-11-21 Seagate Technology, Inc. AC timing asymmetry reduction circuit including summing DC offset voltage with timing signal

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5544726B2 (ja) * 1973-05-17 1980-11-13
US4167447A (en) * 1976-07-19 1979-09-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method for insolubilizing enzymes on chitosan
JPS5599191A (en) * 1979-01-18 1980-07-28 Mochida Pharmaceut Co Ltd Purification of kallikrein in human urine
DE3103257A1 (de) * 1981-01-31 1982-08-26 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Verfahren zur herstellung des hochreinen enzyms kallikrein aus schweinepankreas-extrakten
JPS5838151B2 (ja) * 1981-07-03 1983-08-20 衛 杉浦 カリクレインの精製法

Also Published As

Publication number Publication date
EP0098123A3 (en) 1985-06-19
US4510248A (en) 1985-04-09
JPS596883A (ja) 1984-01-13
EP0098123B1 (en) 1988-03-16
DE3376018D1 (en) 1988-04-21
EP0098123A2 (en) 1984-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4380511A (en) Purification of bovine thrombin
GB2025977A (en) Process for the purification and concentratio of urokinease
JPH07258286A (ja) ビタミンｋ依存性タンパク質の単離および精製方法
JPH0147997B2 (ja)
EP0167152B1 (en) Protease adsorbent and process for purifying tpa utilizing the same
JPS6147511B2 (ja)
EP0188053A2 (en) Purification of superoxide dismutase
JPS5840472B2 (ja) カリクレイン含有液中のキニン分解酵素の除去法
JP2882828B2 (ja) 人尿トリプシンインヒビターの精製方法
JP2661790B2 (ja) 入尿トリプシンインヒビターの精製方法
JP3508149B2 (ja) ヒト血清アルブミンおよびその製造方法
JPH0260316B2 (ja)
JP2739232B2 (ja) 生物学的親和性を有するセルロースゲルの使用方法
JPS61224996A (ja) マウスインタ−フエロンの精製法
JPS6023646B2 (ja) 高純度カリクレインの精製方法
RU2096464C1 (ru) Способ получения цитохрома с
JP3383332B2 (ja) 新規ペプチド及びエンドトキシン除去方法
JP3071029B2 (ja) リゾチームの精製回収方法
JPH0778080B2 (ja) 乳からラクトフエリンを分離、精製する方法
JPS5834179B2 (ja) 蛋白吸着体及び該蛋白吸着体を用いるウロキナ−ゼの精製方法
JPH0723397B2 (ja) 人尿トリプシンインヒビターおよび人尿カリクレインの濃縮分離方法
JPH01180451A (ja) アフィニティー分離用吸着体
JPS5838150B2 (ja) カリクレインの精製法
JPH06245786A (ja) コロミン酸の精製方法
JPS5848159B2 (ja) ウロキナ−ゼの精製方法