JPH02501622A - シス‐９‐オクタデセン酸組成物の製造方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 シス−９−オクタデセン酸組成物の製造方法発明の分野 この発明は、一般に、シス−９−オクタデセン酸（すなわち、オレイン酸）の製 造方法の分野に関する。より特定すると、この発°明は、オレイン系高含量ひま わり種子油（ｈｊｇｈ　ｏｌｅｆｃｓｕｎｆｌｏｗｅｒ　５ｅｅｄ　ｏｉｌ）を 酵素加水分解して、非常に純粋な形状のオレイン酸を製造することに関し、そし て、このような加水分解から誘導される非常に純粋なオレイン酸組成物に関毎年 、米国では、約１００億ポンドの脂肪酸が生産されている。

製造される脂肪酸の約８０％は、獣脂（ｔａｌ　ｌｏｗ）の工業的な加水分解か ら誘導されている。（Ｍ、　Ｗ、ノアーモ（Ｆｏｒｇｏ）、ベイリ−Ｂａ１ｌｅ 　’ｓの工　油および　生　、４版、２巻、Ｄ、スウェーン（Ｓｔｅｒｎ）編、 Ｊ、ライレイ（Ｗｉ　１ｅｙ）、二ニーヨーク、１９８２、ｐ、３７９を参照せ よ）。はとんどの脂肪酸は、工業上の脂肪破砕方法により生成される。しかしな がら、最近では、脂肪酸を生成するための脂肪の加水分解に関連して、酵素の使 用に関し、興味が高まっている。脂肪を破砕するための、高圧蒸気を用いる従来 の方法に比較して、酵素を用いることの有利な点は、主として、以下の（１）、 （２）および（３）にある：　（１）より特異的な反応であるために、より清浄 かつ純粋な生成物が得られること；（２）必要なエネルギーがより低くてよ０こ と；および（３）得られる甘い水が、より純粋であること、すなわち、この加水 分解から得られるグリセリン−水混合物は、より純粋である。オレイン酸すなわ ちシス−９−オクタデセン酸は、天然の脂肪および油、または生物脂質中に存在 するモノ不飽和脂肪酸である。オレイン酸は、ＣＨ３（ＣＨ２）７　（Ｃｌ　： ＣＨ）　（ＣＨ２）７ｃｏｏＨであり、そしてレッドオイルとして知られて（Ｘ る。オレイン酸は、工業および生物学の両方の分野にて、非常に重要な基質であ る。より清浄かつ純粋な生成物は、製薬のような生成物と組み合わせて用いられ るとき、本質的に安全性が高くなる；また、より純粋な出発物質を用いることに よって、より純粋な精製化学的誘導体を生成することができる。

オレイン酸は、最も一般的には、出発物質として獣脂を用いて、高圧蒸気の脂肪 破砕工程から得られる。このような脂肪破砕工程からオレイン酸を生成するとき 、オレイン酸は、一般には、純粋な形状で得られない。非常に純粋化されたオレ イン酸は無色無臭であり、酸化劣化に関する安定性に優れている。これらの特性 により、オレイン酸は、多くの食品生成物および薬剤生成物と組み合わせて、非 常に有用となる。

純粋なオレイン酸は、それが優れた物理的特性、化学的特性および生理学的特性 を有するために、安全に用いられ得る。

このような特性のために、オレイン酸は、精製化学または特殊化学の分野にて、 有効かつ広範囲に利用される。例えば、オレイン酸は、薬剤、化粧品および食品 にて広（用ｔ）られ、生体センサーや生体界面活性剤に関連して、生物化学的領 域における、応用例が見いだされている。オレイン酸はまた、生物学的な作用を 刺激するエレクトロニクスの分野、および他の急速に発展しつつある多くのバイ テクノロジーの分野に関連する応用例が見いだされている。

オレイン酸の多くの用途では、このオレイン酸は非常に純粋である必要がある。

市販のオレイン酸には、一般に、異なる炭素数および異なる二重結合数を有する 脂肪酸同族体が含有される。さらに、市販のオレイン酸は、しばしば、種々の少 量の不純物を含有する。不純なオレイン酸組成物は、色、臭気、安定性、安全性 などに関して望ましくない性質や特性を有する。これらの特性により、多くのバ イテクノロジーの分野にて、このような組成物を充分に応用できなくなる。

高度に精製されたオレイン酸を製造する方法において、化学的および物理的な処 理段階は、米国特許３４４．６０１．８５６号（これは、１９８６年７月２２日 に発行された）に開示されている。しかしながら、多くのより一般的なオレイン 酸精製方法は、エイ専一の　′およ区１肱主双亘（４版、２巻、ジョン　ライレ イおよびサンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ）、二ニーヨーク、１９ ８２、（ｐ、　３７９−３８７））に開示されている。ベイジーの文献にて開示 されている方法は、現在、商業的に最も用いられていると考えられる方法である 。

トリグリセリドから脂肪酸を生成するために酵素が使用され得ること、およびこ のような酵素をトリグリセリドに適用することから生じる加水分解反応のバイテ クノロジーの分野での応用が見いだされ得ることは、上で示されている。例えば 、人の体液にて、モノ−、ジーおよび特にトリグリセリドを量的に決定すること は、以下のような多（の病気や障害の臨床診断に用いられている；動脈硬化症、 真性の糖尿病、ネフローゼ、胆管閉塞、内分泌の乱れによる種々の代謝の不調。

臨床上°の分析では、一般に、グリセロールエステルが、まず、加水分解されて 、グリセロールおよび対応する脂肪酸を遊離することが必要とされている。この ような方法に関連して、グリセロールエステル分析に有用であることが見いださ れている酵素組成物は、米国特許第４，０５６，４４２号に開示されている。

この特許は、以下の水性媒体中にて、加水分解に有用な組成物を開示している： この水性媒体は、存在する全リパーゼの１００単位あたり、久旦ム五左旦盈　ア ルヒザス（肱江旺旦ａｒｒｈｉｚｕｓ）リパーゼの１５〜９５単位、およびＬＺ ｚＬ！　シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ■１１ｎｄｒ＋に組）リパーゼの５〜 ８５単位の混合物を含有する。

トリグリセリドの加水分解のための特定の方法および組成物は、米国特許ｊｌＥ ４，２５９，４４０号（これは、マイルズ（Ｍｉｌｅｓ）ラボラトリイズ、イン コーポレーテイドにより、１９８１年３月３１日に発行された）に開示されてい る。この方法は、す／ｆ−ゼおよびコレステロールエステラーゼを、グリセロー ル分析系と組み合わせて、トリグリセリドに加える段階、および生成するグリセ ロールの量を基にして、存在するトリグリセリドの量を決定する段階を包含する 。一般に、トリグリセリドの酵素加水分解を表す他の特許には、特許番号４．２ ５９．４４０号がある。

酵素を用いて加水分解を行うことの潜在的に不利な点の１つは価格なので、酵素 を基質に固定化することを包含する酵素技術が開発されている。米国特許第４， ２７５，０１１号は、油および脂肪のエステル交換方法を開示している。この方 法には、このような油や脂肪を、水溶性の微生物酵素で処理することが包含され る。この微生物酵素は、不活性で粉体状の水不溶性分散剤上にて吸収される。そ の後、この不活性基質上に吸収された酵素は、反応媒体から回収される。

ｉ更臣！且 オレイン系高含量ひまわり種子油の酵素加水分解により、高純度のオレイン酸を 製造する方法が開示されている。この方法には、オレイン系成分含量の非常に高 いひまわり種子油を得ることが包含される。ひまわり種子油は、トリグリセリド を含有する。本発明に関連して用いられるようなオレイン系高含量ひまわり種子 油は、６０％またはそれ以上のオレイン系成分含量、より好ましくは、８０％ま たはそれ以上のオレイン系成分含量、さらにより好ましくは、８８％またはそれ 以上のオレイン系成分含量、最も好ましくは、約９５％のオレイン系成分含量を 有する。このような高含量のオレイン系油は、トリグリセリドを加水分解酵素と 接触させることにより、酵素加水分解を受けミ高純度のオレイン酸組成物を含む 反応生酸物を提供する。酵素加水分解から生じる反応媒体は、オレイン酸、グリ セロール、および多くの不純な酸を含有する。

この反応を水性媒体中で行うことにより、グリセロールおよび他の水溶性の化合 物は、水不溶性のオレイン酸から容易に分離され得る。

この発明に関連して、用語”オレイン系高含量ひまわり種子油”、′オレイン系 高含量ひまわり油”および“オレイン系高含置注”は、同義的に用いられ、ひま わりの植物体くその油は、脂肪酸部分を有するトリグリセリドを含有する）の種 子から抽出される油を意味する。ここで、このような脂肪酸部分の６０％または それ以上（好ましくは、８０％またはそれ以上、より好ましくは、８８％または それ以上、最も好ましくは、約９５％）は、オレイン酸である。さらに、ここで 、オレ以下、すなわち、オレイン系部分：リノール系部分は、１：（０，２５ま たはそれ以下）、好ましくは、１　：　０．０９またはそれ以下、最も好ましく は、１　：　（０，０９−０，０１）である。

さらに、用語“高純度のオレイン酸組成物”およびその類似語は、“オレイン系 高含量ひまわり油”を出発物質として用い、そして本発明に関連してここで開示 され、記述されているような方法を行うことにより、得られるオレイン酸組成物 を示す。本発明の典型的な高純度のオレイン酸組成物は、およそ、以下の物理的 特性を有する： 旦鷹！夏目人且 比重（ＩＳ、ＩｌｉｏＣ）　０．８９９色（ＡＳＴＭ）　Ｌ２．０ 色（ガードナー）５−６ ％Ｒ２００，１３ 酸価　２０１ °　ヨウ素価　８７．８ タイター　１８℃ これらの物理的パラメーターは、最初の油のオレイン系成分含量に基づいて、あ る程度変化する。

本発明の第１の目的は、オレイン系高含量ひまわり種子油の酵素加水分解により 、高純度のオレイン酸組成物を製造する方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、オレイン系高含量ひまわり種子油のこのような酵素加水分 解方法のうち、異なる酵素を用いて、このひまわり油のトリグリセリドから全て のオレイン酸を効果的に分離する方法を提供することにある。

本発明の有利な点は、このひまわり油のトリグリセリドの加水分解が、エネルギ ー効率の良い方法で行われ得ることにある。

本発明の特徴は、オレイン系高含量ひまわり種子油の加水分解から生じる反応生 成物が、バイテクノロジーの分野にて、種々の用途を有する高純度のオレイン酸 組成物であることにある。

野の技術上の進歩をそれぞれ組み合わせていることにある＝（１）農業用の植物 の開発；（２）生物化学的な酵素加水分解；および（３）化学工学の精製方法。

これらは、以下の分野での進歩を組み合わせることにより、なされる：（１）細 胞質の雄性不稔（ｍａｌｅ’　５ｔｅｒｉｌｉｔｙ　）方法に基づく、植物体の 品種改良；（２）油のトリグリセリドを加水分解するための特定のリパーゼの使 用；および（３）オレイン酸を精製するために特異的に適応される化学反応およ び物理的分離方法。

本発明のこれらの目的および他の目的、有利な点および特徴は、以下でより完全 に記述されるような物質、方法および用途の詳細を読むことによって、当業者に より明らかとなるだろう。本明細書の一部を形成する添付の一般式やフローチャ ートにおいて、同一の記号は、同一の分子部分や段階を示す。

ましい　態　の！細なき日 シス−９−オクタデセン酸（この後では、オレイン酸および高純度のオレイン酸 組成物として、示されている）の本発明の製造方法を開示し記述する前に、この 発明は、記述の特定の方法や組成物に限定されず、方法や組成物自体は、もちろ ん、変えられ得ることが理解されるべきである。ここで用いられる専門用語は、 もし特定の実施態様だけを記述する目的であれば、限定される意図ではないこと もまた、理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の請求の範囲によっての み限定されるからである。

この明細書および添付の請求の範囲で用いられるように、単数形“ａ″、”ａｎ ”およびｔｈｅ”は、前後関係から明らかに指示されているのでなければ、複数 の指示物を包含することが、指摘されるべきである。それゆえ、例えば、“ａｔ ｒｆｇｌｙｅｅｒｉｄｅ”との言及は、トリグリセリドの混合物を包含し、“ａ ｎ　ｅｎｚｙｍｅ”との言及は、酵素の混合物の言及を包含し、そしてｔｈｅ　 ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ”との言及は、複数の加水分解叉部を包含する。

本発明は、基本的には関連のない科学領域における技術上の成果を組み合わせる ことにより、高純度のオレイン酸の組成物を提供する独自の方法である。現在の 植物体品種改良技術を用いて、特にオレイン系成分含量が高い油を含有する種子 を得ることができる。

非常に効率の良い選択的な酵素を用いて、このオレイン系高含置注の特定のトリ グリセリドから、脂肪酸を効果的に除去することができる。この方法はエネルギ ー効率の良い方法で加水分解を行うので、収量および純度の両方を改良する。

次いで、加水分解されたトリグリセリド生成物に対し、化学的および物理的な精 製方法および単離方法が適用され、非常に純粋なオレイン酸組成物が高収量で得 られる。この発明を完全に記述し開示するために、発明の３つの主要な局面（以 下のチャートに示されている）が、まず、個々に示される。

↓ ↓ （以下余白） １）　籠肋ｇえ旦 ひまわり（ヒリアンサス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）属）は、植物油の世界的な原 料として、大豆に次℃′で２番目である。米国だけで、主として両ダフタ州やミ ネソタ州にて、毎年、およそ４００万ニーカーのひまわりが栽培されている。米 国での平均したひまわりの収量は、１ヘクタールあたり約１２００〜約１４００ キログラムの範囲である。収穫された種子から得られる油の含量は、乾燥重量基 準で、平均して約４０〜４５％である。油含量（全植物体重量のパーセントとし て）、およびこれらのひまわり植物体の収量の両方を増すことは、植物体品種改 良プロジェクトの主要な目的である。本発明は、原料物質として、このひまわり 植物体を利用する。

平均して、過去ｌＯ学年間、米国にて栽培されているひまわりのニーカー面積゛ は、急速に拡大していることが見いだされている。このことは、一部には、ひま わりの品種改良やひまわり植物体の変種改良の分野における、いくつかの重要な 開発による。１つの重要な開発は、細胞質の雄性不稔の発見および繁殖力の回復 のための遺伝子の発見にあった。この発見は、ハイブリッドひまわり植物体の生 成を可能にした。この方法を利用して生成されるハイブリッドは、１９７０年代 の初期に導入された。このようなひまわり植物体は、病気に対する抵抗性が改良 され、高さや開花の点で均一性が増したことに伴い、放任授粉の多様性を克服し て、約２Ｓ％の収量の伸びを示した。さらに、これらのハイブリッドは、自家和 合性（これは、良好な種の組を得るために、昆虫授粉媒体の個体数への依存性を 緩和する）の割合が高かっ゛た。細胞質の雄性不稔方法を利用したひまわり植物 体の開発は、米国特許第４．６２７゜１９２号に開示され、その内容は、ここに 示されている。

ひまわりにおける細胞質の雄性不稔（ＣＭＳ）や遺伝的な繁殖力回復の記述は、 フィック（Ｆｉｃｋ）らにより、１品種改良および遺伝学″　（ひまわ　の・“ および　＠、ｐ、２７９−３３８（Ｊ、Ｆ、カーター、ｍ　１９７８））にて提 出されている。その内容は、ひまわりに関連した細胞質の雄性不稔の品種改良方 法および遺伝的な繁殖力回復方法の開示について、ここに示されている。ＣＭＳ を用いた特定のひまわりハイブリッドの生成は、米国特許第４゜３７８．６５５ 号に記述されている。これらの内容は、特定のひまわりハイブリッドおよびこの ようなハイブリッドの生成方法の開示に関して、ここに示されている。細胞質の 雄性不稔は、現在では、後にハイブリッドを生成する際に使用する、実質的に機 能しない花粉を有するひまわり植物体の生産を選択する方法である。しかし、米 国特許第４．３７８．６５５号に記述の他の方法もまた、利用可能である。これ らの方法には、劣性遺伝子の存在や化学的生殖子撲滅薬の適用に基づく、完全な または部分的な遺伝的不稔の使用が包含される。高レベルの自家不和合性を有す る植物体もまた、ハイブリッドの生成方法に、用いられ得る。

ひまわり油は、主として、バルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸およびリノ ール酸から構成され、オレイン酸およびリノール酸は、従来のひまわり種子油の 全脂肪酸含量の約９０％を占める。しかしながら、ひまわり埋子油は、以下を含 めた１３種の脂肪酸を含有することが知られている：リノール酸、オレイン酸、 バルミチン酸、ステアリン酸、リルン酸、バルミトイル酸、アラキン酸、マルガ リン酸、バルミチン酸、およびベヘン酸。（Ｔ、カブリナ（Ｃｕｐｒｉｎａ）ら 、ある丞交玉工旦まわ　２　、およびひまわ　のバイブ１ツド　の　のＬＩＥ（ 農業および園芸学会、ユーゴスラビア、１９８３）を参照せよ。その内容は、ひ まわり油の含量の開示に関して、ここに示されている）。不飽和酸は、１個、２ 個または３個の遊離結合を有する。これらの不飽和酸は、例えば、それぞれ、オ レイン酸、リノール酸およびリルン酸である。他の酸（例えば、ステアリン酸お よびバルミチン酸）は、飽和である。

オレイン酸とリノール酸との間には、逆の相関関係の存在することが認められて いる。このことは、特に生長時期における温度のような環境要因により非常な影 響を受ける。オレイン酸含量およびリノール系含量の総計は、一般に、油の酸含 量の約９０％である。従って、リノール系含量が約１０％まで増すにつれて、オ レイン系含量は約８０％まで減少する。この関係は、経験則にすぎず、厳密に解 釈されるべきではない。

冷涼な北方気候により、一般には、よりリルン酸含量の高いひまわり種子が得ら れる。これに対して、高いオレイン酸値は、暖かい南方地域にて生育された種子 に、より特徴的である。高いリノール酸含量の濃縮物は、ソフトマーガリンやサ ラダドレッシングで用いられるひまわり油にて望ましい。

高いオレイン酸含量は、多くの他の用途に対しより好ましい。

例えば、オレイン系高含皺ひまわり種子油は、本発明（これは、高純度のオレイ ン酸の生成を包含する）に関して、望ましい。オレイン酸の純度は、リノール酸 の不足に関係し、得気候で生育された種子から誘導される従来の粗ひまわり油の 酸化安定性は、北方で生育されたひまわり種子から抽出された粗製油の酸化安定 性のほぼ２倍である。

本発明に関連して、用語“品種”および“変種”は、種（ひまわり（Ｈｅｌｉａ ｎｔｈｕｓ　Ａｎｎｕｕｓ））内の植物体群（例えば、”Ｃ／Ｌ／ベネット（Ｐ ｅｒｖｅｎｅｔｓ））を示すために、同義的に用いられる。

これらは、その棟内の他の変種から区別されるような、ある種の一定の特徴を共 有している。本発明と関連して用いられる変種は、変種内における個体間の全体 的な変異を示し得る。

このことは、主として、引き続（世代の子孫のメンデルの形質分離に基づいてい る。“系統”は、“変種”と区別されて、いくつかの世代の自己授粉によって、 一般に、（排他的ではないものの）、個体間にほとんど変種が表われないような 、一群の植物体を表す。さらに、“系統”は、組織培養方法を用いて単一の親植 物体から栄養繁殖するような、一群の植物体を包含するべく、本発明の開示のた めに、充分に広範囲に定義されている。このような系統を使用して新規なハイブ リッドを開発することは、米国特許第４．３２６．３５８号および第４、３８１ ．６２４号に記述されている。これらの内容は、このような組織培養方法の開示 に関して、ここに示されている。変種または系統は、それが、特定の特１に対し て、以下の範囲で遺伝的に同系接合なら、この特質に対する“純粋な品種改良” と考慮される：その範囲はこの純粋に品種改良された変種または系統が自己受粉 された場合、子孫間の独立した特質分離が有意な量で観察されない程度である。

上で示されるように、種々の脂肪酸（例えば、ステアリン酸、オレイン酸および リノール酸）は、得られる種々の種子の油に特徴的である。このような酸の含量 は、油を構成するトリグリセリドの全脂肪酸含量のパーセントとして、表され得 る。本発明に関連して用いられるひまわり種子から得られる油を記述するために この方法がここで利用される。例えば、以下で記述される、オレイン酸含量に対 するリノール酸含量の無単位の比は、トリグリセリド上の全脂肪酸部分のリノー ル酸パーセントを、オレイン酸部分の同様のパーセントで割ることにより、算出 される。それゆえ、この数値がより小さいことは、リルン酸に対してオレイン酸 のパーセントがより大きいことを表す。

本発明に関連して、ひまわり種子から誘導される油（ここで、この油のトリグリ セリドは、このひまわり種子油内に存在するトリグリセリドの全脂肪酸部分の含 量に対して、約６０％（好ましくは、８０％）より大きいオレイン酸部分の含量 を有する）を利用することは望ましい。この種子内のオレイン酸の量に対する、 リノール酸の量の比は、およそ０．２５より小さい。すなわち、オレイン系部分 とリノール系部分との比は、１　：　０．２５、好ましくは、１　：　０．０９ またはそれ以下である。より好ましくは、棟内のオレイン酸部分の量に対するリ ノール酸部分の量の比は、約０．０１〜約０．０９の範囲である。すなわち、オ レイン酸：リノール酸の比は、１　：　（０，０９−０，０１）である。

以下で示されるように、油のトリグリセリドから特定の脂肪酸を選択的に除去す るような酵素を利用することは可能である。しかしながら、この酵素の選択は、 しばしば、リノール酸およびオレイン酸（これらは、同じ数の炭素原子を含有し 、そして不飽和位置が重複している）の間の区別に対し、充分に特異的でない。

従って、高いオレイン系成分含量（８０重量％またはそれ以上、より好ましくは 、８８重量％またはそれ以上、最も好ましくは、約９５重量％）と組み合わせて 、異常に低いリノール酸含量を有する油を得ることが、特に重要である。本発明 に関連して、このひまわり種子油が、ひまわり種子の実質的に同種の集合体から 得られることは、注目されるべきである。この集合体のあらゆる特定のひまわり 油は、高含量または低含量のオレイン酸を含有していてもよく、オレイン酸に対 するリノール酸の異なる比を有していてもよい。

しかしながら、ひまわり油の実質的に同種の集合体から得られるトリグリセリド の統計的な混合物は、平均して、６０％またはそれ以上のオレイン系物質（好ま しくは、８０％またはそれ以上、より好ましくは、８８％またはそれ以上、最も 好ましくは、９５％またはそれ以上のオレイン系物質）を含有する油を提供する 。この油のオレイン系に対するリノール系の比は、０．２５より小さく、好まし くは、０．０９より小さく、より好ましくは、約１　：　（０，０９−０，０１ ）の範囲である。

ひまわり植物体に依存して、この油の酸部分から取り出される油は、これら酸部 分の相対量が変わるにつれて、変わる。

本発明に関連して用いられる典型的な油は、示されたパーセント量で以下の酸部 分を含有するニ オレイン（１８炭素原子、１・・個〇二重結合）　８０．０リノール（１８炭素 原子、２個の二重結合）８．１ステアリン（１Ｂ炭素原子、二重結合なし）５． ５パルミチン（１６炭素原子、二重結合なし）４．２ベヘン（２２炭素原子、二 重結合なし）０．７リルン（１８炭素原子、３個の二重結合）０．２一般に、± ｌＯ％の変動は、本発明の範囲内である。

上で示されるように、米国特許第４．６２７．１９２号に記述のような品種改良 方法により、このようなオレイン系高含量ひまわり種子油を得ることが可能であ る。この特許の内容は、このような品種改良方法の開示に関して、ここに示され ている。

さらに、米国特許出願第７６９．５０２号（１９８５年８月２６日に出願された ）の内容は、ひまわり品種改良方法の開示および、このようなひまわりから収穫 される種子に由来の油の開示に関して、ここに示されている。

本発明に関連して好ましく用いられるオレイン系高含量ひまわり油は、最も一般 的には、米国特許第４．６２７．１９２号に開示の品種改良方法から得られる。

しかし、このような油は、他の方法で成育された植物体から得られるひまわり種 子から得られ°るかも知れない。従って、上で記述のようなオレイン系成分含量 、およびオレイン酸に対するリノール酸の比を有するいずれのひまわり種子油も 、本発明に有用であることが、指摘されるべきである。このような種子を生じる 植物体は、多くの方法で得られるかも知れない。このような方法には、組織培養 による植物体物質の操作、遺伝物質を標的宿主植物体細胞に挿入するためのベク ターおよび転写系（例えば、Ｔ１プラスミドベクター、遺伝物質の顕微注射、お よびカリフラワーモザイクウィルスベクター）および遺伝子単離方法と牛ヤラク タリゼーション方法が包含される。

２）　Ｊ至皿水兄反 上で示されるように、脂肪や油を加水分解するための多くの異なる方法が存在す る。この方法には、けん化や酸加水分解による分解が包含される。このような方 法には、高温および蒸気圧を適用するトリグリセリドの分解、およびトウィチェ ル（Ｔｖｉｔｃｈｅｌｌ）の分解方法が包含される。一般に、このような分解方 法を用いて得られる脂肪酸組成物は、それらがより暗い色を有することで示され るように、特に純粋ではない。

得られる甘い水は、全（不純である。それらの不純性のために、その組成物の酸 化不安定性および、多くのバイテクノロジーへの応用に関連した使用−の不適合 性が起こる。このような方法から得られる加水分解された生成物を純粋にするた めには、最終生成物を生成するのに必要なエネルギー量を増すような蒸留段階を 行うことが必要である。

必要な蒸留段階は、単離される脂肪酸の鎖長に依存して変えられる。鎖長が増え るにつれて、蒸留を行うのに必要な温度および真空の程度も増す。これにより、 さらに、追加のエネルギーが必要なため、経費も増大する。さらに、蒸留温度　 、が増すにつれて、脂肪酸それ自体の間で反応が起こり得、重合や酸化劣化が生 じる。このことは、このような方法から得られる脂肪酸の収量を低下させる。重 合反応が起こることに加えて、ある種の脂肪酸はその二重結合の箇所で異性化さ れ、多量の異性化脂肪酸が生成する。このことは、得られる脂肪酸生成物の収量 を低下させる。

上の問題点に注コして、本発明は、池内のトリグリセリドから脂肪酸を分離する ために、いずれの高温高圧方法も利用していない。本発明は、脂肪および油の分 解を行うために、酵素加水分解を利用している。本発明に従って行われる酵素加 水分解反応は、非常に選択的であり、非常に低いエネルギーしか必要としない。

反応の選択性により、トリグリセリドから除去される特定の脂肪酸の量が増し、 それゆえ、得られる産出物の純度が増す。さらに、加水分解中に高温は必要とさ れず、高温は実際に望ましくないので、脂肪酸は、高温下物質を加水分解するべ く、特定の微生物から誘導される酵素の性能は、しばしば、その物質に特異的で ある。従って、本発明に関連して用いられる酵素加水分解反応は、上で記述のオ レにン系高含量ひまわり種子油に対してのみ行われる。

本発明を得るために、このようなオレイン系高含量ひまわり種子油を酵素的に加 水分解するのに必要な特定の反応条件は、酵素のタイプおよび量、反応混合物の ｐＨ１添加剤のタイプおよび量、温度、および水の量（これらは、高純度のオレ イン酸組成物および高収量を得るために必要である）に関連して、注意深く検討 されている。このようなパラメーターの調整は、反応の加水分解割合および／ま たは選択性を増大させ得る。

酵素のタイプに関連して、本発明に関して用いられる酵素は、以下のような異な るカテゴリーに分割され得る：（１）非部位特異的な酵素； 種々の酵素、および酵素の特定の組合せは、オレイン系高含量ひまわり種子油出 発物質の貢を基準にして、高収量で高純度のオレイン酸を得るために、本発明に 関連して特に有用であることが見いだされている。

本発明に関連して用いられるオレイン系高含量ひまわり種子油は、以下の一般構 造式（１）を有するトリグリセリドから構成される： ここで、ＲＳＲ’およびＲ”は、酸部分の炭化水素部分であり、その８０％また はそれ以上は、オレイン酸部分である。上も示されるように、好ましくは、８８ ％またはそれ以上の酸部分はオレイン酸部分であり、最も好ましくは、約９５％ またはそれ以上はオレイン酸部分である。

非部位特異的な酵素が、一般構造式（Ｉ）のトリグリセリドと接触されるとき、 この酵素は、脂肪酸部分の全てを３つの位置で分離し、そしてグリセロールと分 離脂肪酸との混合物を残す。部位特異的な酵素が、トリグリセリドに関連して利 用されるとき、この部位特異的な酵素は、一般に、２つの第一級トリグリセリド 部位から、脂肪酸部分を分離する。それゆえ、このような部位特異的部分の、こ のようなトリグリセリドとの１００％効率的な反応により、この脂肪酸部分の２ ７３が分離される。脂肪酸特異的な酵素がトリグリセリドと反応に供されるとき 、この酵素は特定の脂肪酸が位置している脂肪酸部位と反応する。（この酸は、 一般に、特定の不飽和部分により、認識される）。例えば、酵素は、オレイン系 脂肪酸部分とだけ反応し得る。この脂肪酸部分は、９番目のδ炭素にて、不飽和 部分を有する。しかしながら、このような脂肪酸特異的な部分はまた、他の非オ レイン部分（これはまた、９番目の炭素にて、不飽和部分がある）と反応に供さ れる。

本発明に関連して、得られるオレイン酸生成物の収量や純度は０、オレイン系高 含量ひまわり種子油を得るために、上で記述の植物体品種改良方法を利用するこ とにより、増大することが最初に発見された。ここで、このトリグリセリドは、 特に高含量のオレイン系部分を有する。その後、種々の酵素および反応条件の相 違は、最も可能な出発物質の最も可能な用途を得るべく、研究された。これは、 酵素を変え、種々のｐ■、添加剤量および水の量にて、異なる酵素を異なる方法 で混合することにより、なされた。従って、この発明のある実含量ひまわり種子 油出発物質を使用し、比較的高純度のオレイン酸を高収量で得ることを包含する 。水／油界面にて酵素加水分解を行うことにより、得られる加水分解された生成 物は、脂肪酸およびグリセロールから構成される。グリセロールは、水相にて溶 解性である。次いで、この水相は除去され、高純度のオレイン酸組成物が比較的 高収量で残留する。

酵素を混合するか、または段階的反応で産出物を得るために酵素を段階的に用い ることにより、本発明に関連した異なるタイプの酵素を用いることは、可能であ る。生物化学的な用語体系によって、酵素は６つの群に分けられる。本発明は、 加水分解酵素（より特定すると、水溶性リパーゼ）の使用を包含する。

（以下余白） 以下は、本発明に関連して用いられる非部位選択的なリパーゼを誘導するような 微生物の表である：ｖｉｓｅｏｓｕｍ） 以下は、本発明に関連して用いられる部位選択的な酵素を誘導するような微生物 の表である： これらの微生物は９番目のδ炭素原子を有する脂肪酸に対し選択的な酵素原料で ある。

酵素のある特定の組合せは、本発明に関連して特に有用であることが見いだされ ている。これらの組合せは、以下の微生物の組合せから誘導される。

微生物の酵素原料に加えて、動物原料は、この発明に関連して、用いられ得る。

この動物原料には、例えば、ブタすい臓リパーゼ（Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｐａｎｃｒ ｅａｔｉｃ　１ｉｐａｓｅ）、ウシすい臓すノ（−ゼ（Ｂｏｖｉｎｅ　ｐａｎｃ ｒｅａｔｉｃ　１ｉｐａｓｅ）、およびブタ肝臓エステラーゼ（Ｐｏｒｃｉｎｅ 　１ｉｖｅｒ　ｅｓｔｅｒａｓｅ）があるＯ本発明に関連して行われる酵素加水 分解反応に関し、利用される酵素の量は、加水分解され得るトリグリセリドの量 に依存する。この酵素の量は、トリグリセリドの加水分解に関連して、活性の単 位（Ｕ）で表される。利用される酵素の量は、用いられる特定の酵素に依存して 、変わる。本発明は、オレイン系高含量ひまわり種子油に酵素を適用するにすぎ ないので１．酵素の量やタイプは、加水分解される油に依存して、実質的に変わ らない。しかしながら、他の考慮事項（例えば、反応時間、温度および反応媒体 のｐＨ）は、利用される酵素の皿に影響を与える。本発明に関連して、オレイン 系高含量ひまわり種子油の１グラムあたり、１０〜ｓ、　ｏｏｏ単位、好ましく は、１０〜１００またはそれ以上の単位、より好ましくは、２０〜４０単位の酵 素を利用するのが有用である。

用いられる酵素量が、酵素原料と共にどのように変化するかを表すために、量に 関する範囲を、以下に提案する：１）　ＬＺヱを盈　ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ 　匹脛旦）　：　７−１０Ｕ／ＩＩ１．ｅｑ、２３．８−３４．Ｏ０７ｇ。

２）　１９　を族貴（Ｐｏｒｅｉｎｅ　旺旺■蛙Ｒ）：　１００−１０００Ｕ／ ＋ｉ、ｅｑ、３４０−３，４０００７ｇ。

３）工土上ユ至土Ｉ　”ヱヱエエ玉（Ｇｅｏｔｒｊｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ） 　：　２５υ／＋ｍ、ｅｑ、８５．Ｏ０７ｇ。

４）　９ｘニヱ且二五！（Ｐｓｅｕｄｏ＋ｎｏｎａｓ）　：　３４０７ｇ。

５）コヨ丑」−ｙ！λノＪｉ１（Ｐｅｎｉｃｔｌｌｉｕｍ）：　Ｉ　Ｕ／＋、ｅ ｑ、３．４０７ｇ。

６）アスベルギラス　ニガー（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎｉ　ｅｒ）　：商業 的に認められる工程で用いられるとき、一般に、より少量の酵素が用いられる。

ある特定の酵素原料のためのより好ましい範囲は、以下のごとくである：１）Ｌ 乙工久！（Ｃａｎｄｉｄａ）　：　２３．８−３４．　Ｏ０７ｇ。

２）ブ９　（Ｐｏｒｃｉｎｅ）　：　３４００７ｇ。

３敢銀二）　＋）ムム！（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）　：　８５．Ｏ０７ｇ、また はそれ以下４）シュードモナス　（Ｐｓｅｕｄｏ＋ｎｏｎａｓ）　：　３４０７ ｇ。

５）ム血旦璽（独μと）：　８５．Ｏ０７ｇまたはそれ以下６）７二二土ヱ１五 ！（口と」住■ｕｓ）：３４υ／ｇまたはそれ以下本発明に関連して行われる酵 素加水分解反応は、好ましくは、オレイン系高含量ひまわり種子油の量の、約０ ．５〜１．５倍の範囲の量の水の存在下にて、なされる。この水は、加水分解が 効果的に行われ得るのに充分な量で、存在しなければならない。しかしながら、 含有させる水が多過ぎても、加水分解の効率を低下させ、そして反応媒体の水相 を効果的に除去し処置するのが困難となる。本発明の酵素加水分解反応は、油／ 水の界面にて起こる。

油と水との相対量は、各基で変えられ、最適の結果を得るために調製されなけれ ばならない。一般に、水／油化は、最も好ましくは、約３５℃±２℃の温度にて 、（１−’／２）　：　（１−１’／２）、好ましくは、１　：　（１−１’／ ２）である。温度は、１．３部位−特異的な酵素を用いると一般的に約３８−４ ０℃であり、より一般的には、この温度は、２０−６０℃の範囲とされ得る。

酵素反応混合物のｐＨは、加水分解に影響を与える。加水分解反応により、水不 溶性のカルボン酸を生じる。しかしながら、ｌ）Ｂを約４，５〜約１０．０の範 囲（より好ましくは、５．５〜９の範囲）に制御するべく、充分な量の緩衝液を 含有させることが望まれ得る。さらに、この反応は、他の添加剤（これは、一般 には、本発明に関連して有用ではないものの）の存在下にて、行われ得る。

本発明の酵素加水分解は、好ましくは、約２０℃〜６０°Ｃの温度範囲で、より 好ましくは、約３０℃〜５０℃の温度範囲で行われる。この温度は、この方法を 経済的に行うのに充分に速く反応を進行させるために、一般に、約２０℃より高 く保たれねばならない。また、この温度は、トリグリセリドとの相互作用以前に 、酵素を不活性化することを避けるために、６０℃以下にされなければならない 。トリグリセリドの酵素加水分解を進行させるために、反応混合物を連続的に攪 拌することもまた、望ましい。

油／水の相対量は、他の要因（例えば、攪拌量、温度および酵素原料）と共に変 化する。油／水の界面の量は、攪拌により、そしである程度まで温度により、明 らかに影響を受ける。水に対する油の比は、好ましくは、１：（１１／２）、よ り好ましくは、１：１．２であり、この温度は、好ましくは、３０℃〜５０℃で ある。攪拌は、一般に、均一な公散中にて油および水の相を保持するために、充 分な速度で行われる。

以下の実施例は、オレイン酸組成物をいかにして製造し、そしてこの発明の加水 分解反応をいかにして行うかの完全な開示および記述を当業者に提供するために 、提供されている。

この実施例は、この発明にかかわる範囲を限定するつもりはない。用いられる数 値（例えば、量、温度など）に関して、正確さを保証するべく努力がなされてい るものの、ある程度の実験的な誤差や偏差は、考慮されるべきである。他に指示 がなければ、部は重量部であり、温度は摂氏であり、そして圧力は、大気圧また はその付近である。

え血五工 り乙至グ凰　ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ　■眩■、）（Ａ＋ａａｎｏ　Ｉｎｔ、 Ｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏ−）から得られるリパーゼ（１０Ｕ／＋、ｅｑ、オイル）の １．Ｇｏ。

単位に対し、蒸留水３５穐１を加える。次いで、オレイン系高含量ひまわり種子 油の１００　ｔａ、ｅｑ、を加える。この混合物を、攪拌しながら、約３５℃〜 ４０℃の温度にて約２２−２４時間反応させる。

この混合物を沈降させ、２層を形成させる。オレイン酸組成物を得るべく、水、 グリセロールおよび他の溶解性不純物を含有する下層を除去する。加水分解は、 約８８％〜９４％の範囲である。

大Ｊｌｔ色 反応中のｐＨを約５．５に維持するべく、酢酸塩緩衝液を水に加えること以外は 、実施例１の方法を繰り返す。加水分解は実施例１に匹敵する。つまり約８８％ 〜９４％である。

Ｋ立皿立 ｈｙヱグス　ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ匹脛■）１０００単位およびユニシリウ ム　シクロビウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｎ＋　ｃ　ｃｌｏ　ｉｕｍ）１００単 位を、水３５　ｍｌに溶解させる。次いで、オレイン系高含量ひまわり種゛子油 （これは、８０％またはそれ以上のオレイン酸部分を含有する）　１００　＋ｍ 、ｅｑ、を加える。この混合物を、攪拌しながら、約３５℃〜４０℃の温度にて 約６時間反応させる。この混合物を沈降させ、２層を形成させる。オレイン酸組 成物を得るべく、水、グリセロールおよび他の水溶性不純物を含有する下層を除 去する。加水分解は、６時間で９０％以上まで上がる。

もし継続されるなら、この加水分解は、２４時間で９８％以上まで上げられる。

尖胤皿土 ケカビ　ミニヘイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ）１０００単位およびベニシ！Ｊ ’７Ａ　シフ０ピウＡ（ｐ６ユユ」違１ふ至匝吐岨）１００単位を、水３５　ｍ ｌに溶解させる。次いで、オレイン系高含量ひまわり種子油１００　ｔｅｑ、を 加える。この混合物を、攪拌しながら、約３５℃〜４０℃の温度にて約２２−２ ４時間反応させる。この混合物を沈降させ、２層を形成させる。オレイン酸組成 物を得るべく、水、グリセロールおよび他の水溶性不純物を含有する下層を除去 する。加水分解は、９６％以上である。

実ｉ列」− ペニシリウム　シクロピウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃ　ｃｏｏ　ｉｕｍ） から得られるリパーゼの２００単位、およびシュードモナス　（ｈｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ）（１０１１１０＋、ｅｑ、オイル）から得られるリパーゼ２．０００単 位に対し、蒸留水の約７０ｍ１を加える。次いで、オレイン系高含量ひまわり種 子油（これは、８０％またはそれ以上のオレイン酸部分を含有する）の２００　 ｍ、ｅｑ、を加える。この混合物を、約３５℃〜４０℃の温度にて約２２−２４ 時間反応させる。この混合物を沈降させ、２層を形成させる。オレイン酸組成物 を得るべく、水、グリセロールおよび他の水溶性不純物を含有する下層を除去す る。加水分解は、９３％以上である。

Ｌ皿医立 ｆ　ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ　匹旺■）から得られるリパ゛　−ゼ１，０００ 単位；ムＬ且！　ミニヘイ（Ｍｕｃｏｙ　ｍ１ｅｈｅｉ）から得られるリパーゼ １，０００単位、および二已乞ＩＪ　’７人盈　シクロビラＡ　（Ｐｅｎｉｃｉ ｌｌｉｕｍ　ヒ坦」１坦）から得られるリパーゼ３００単位に対し、蒸留水約１ ０５ａ＋１を加える。次いで、オレイン系高含量ひまわり種子油の３００　ｍ、 ｅｑ、を加える。この混合物を、約５．５のｐＨ範囲にて、約３５°Ｃの温度で 約２２−２４時間反応させる。この混合物を沈降させ、２層を形成させる。オレ イン酸組成物を得るべく、水、グリセロールおよび他の水溶性不純物を含有する 下層を除去する。加水分解は、約８０％〜９５％の範囲である。

Ｋ胤五工 左ヱヱ叉！　ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ匹ｚｏｓａ）から得られるリパーゼに対 し、蒸留水１０〜１００ｍ１を加える。次いで、オレイン系高含量ひまわり種子 油１０〜１００　ｍ、ｅＱ、を加える。このリパーゼは、油１グラムあたり１０ 〜３５単位のリンく−ゼを提供するべく、加えられるべきである。この混合物を 、約３５℃の温度で約４−２４時間反応させる。この混合物を沈降させ、２層を 形成させる。オレイン酸組成物を得るべく、水、グリセロールおよび他の水溶性 不純物を含有する下層を除去する。

°・および　、 “植物体品種改良”に関連した上の開示に従って、オレイン系高含量ひまわり種 子油は、種の実質的に同種の集合体から得られる。上で定義されるようなオレイ ン系高含量ひまわり種子油には、次のようなトリグリセリドが含有される。この トリグリセリドは、オレイン系部分が、トリグリセリド上の少なくとも６０％の 脂肪酸部分を構成する。さらに、得られるオレイン系高含量ひまわり種子油は、 オレイン酸に対するリノール酸の量の特に定義された比を有する。“酵素加水分 解”下にて上で記述の加水分解方法に関連して、オレイン系高含量ひまわり種子 油を利用することにより、オレイン酸含量が非常に高い加水分解反応生成物を得 ることが可能である。

オレイン酸の特定の純度は、用いられる最初のオレイン系高含量ひまわり種子油 に依存して、ある程度変わる。上の記述に従って、オレイン系高含量ひまわり種 子油を利用すること、およびオレイン酸を得るべくこの油を加水分解させること から誘導されるオレイン酸組成物は、本発明の最も広範な局面であると考えられ ている。しかしながら、このオレイン系高含量ひまわり種子油から得られるオレ イン酸組成物は、ここで詳細に記述するような物理的および化学的方法により、 さらに精製され得る。

まず、酵素加水分解を行った後、この反応生成物を２相に分離する。上相は、ト リグリセリドから除去された脂肪酸を含有する。そして、下相の水相は、主とし て、グリセロールやある不純物（これは、オレイン系高含量ひまわら種子油に由 来する）が溶解されている水から構成される。従って、この酵素加水分解生成物 の精製の最初の段階は、下相の水相（これは、水溶性化合物を有する水を含有す る）を分離することにある。残りの上相は、非常に高濃度のオレイン酸を含有す る。

このオレイン酸組成物の性質は、用いられる最初のひまわり種に依存して変わる 。以下は、典型的なこのようなオレイン酸高含量組成物に特徴的である： 扛叉亘豊盈 比重（１５，６℃にて）　０．８９９ 色（ＡＳＴＭ）　Ｌ２．０ 色（ガードナー）５−６ ％Ｈ２Ｏ０，１３ 酸価　２０１ ヨウ素価　８７．８ タイター　１８℃ 化１」月１激 オレイン酸８０％、リノール酸８．１％、ステアリン酸５，５％、パルミチン酸 ４．２％、ベヘン酸０．７％、およびリルン酸０゜２％。

この油はまた、ある種の金属（例えば、Ｃａ％Ｂｕｓ　ＺｎおよびＦｅ）を少Ｒ Ｃ例えば、１−１００　ｐｐｍ）で含有している。上の物理的特徴および化学的 特徴のそれぞれは、異なる程度まで変化するが、＝般に、±１０％で変わる。

上のことから、この上相は、不純な脂肪酸く例えば、リノール酸および、オレイ ン酸より長鎖および／または短鎖の他の脂肪酸、そしてより不飽和度の大きい脂 肪酸および不飽和度の小さい脂肪酸）を含有する。これらの不純物脂肪酸は、次 いで、１種またはそれ以上の化学的または物理的分離方法を利用することにより 、分離され得る。例えば、米国特許第４、６０１．８５６号に記述の方法のよう な化学的分離方法を用いることは、可能である。これらの内容は、オレイン酸の 化学的な精製方法の開示に関し、ここに示されている。

この発明のオレイン酸高含量組成物は、上で記述の酵素加水分解工程から生じる 上相として、得られる。このオレイン酸高含量組成物は、いくつかの異なるタイ プの脂肪酸、および上で示した他の不純物を含有する。このオレイン酸組成物を さらに精製するために、異なる鎖長の脂肪酸や異なる不飽和度を有する脂肪酸を 分離することは、可能である。より特定すると、１８個より多くまたはそれより 少ない炭素原子を有するような脂肪酸、または１個より多くまたは１個より少な い不飽和結合を有する脂肪酸はオレイン酸（１８個の炭素原子を有しそして単一 の不飽和結合を含有する）から分離され得る。

本発明のオレイン系高含量脂肪酸組成物は、この組成物を低温処理することによ り、防寒処置がなされる。結晶化が始まるまで、温度を徐々に低下させることに より、オレイン酸より飽和度の高い脂肪酸を分離することは可能である。従って 、温度を徐々に低下させることにより、ステアリン酸やパルミチン酸のような脂 肪酸が結晶化して組成物内に沈澱するような点に達するだろう。次いでこれらの 脂肪酸は除去されて、さらに精製された高含量のオレイン酸組成物を提供する。

極性溶媒（例えば、アセトンおよびメタノール）は、飽和酸（例えば、ステアリ ン酸およびパルミチン酸）を、はとんど定量的に結晶化させ得る。これに対して 、オレイン酸のような不飽和酸は、溶媒内に溶解したままになる。従って、組成 物内の不純なパルミチン酸およびステアリン酸を結晶化させるのに充分な量で、 アセトンおよび／またはメタノールをこのオレイン系高含量組成物に包含させる ことにより、分離が達成され得る。結晶化が起こった後、結晶化した不純なパル ミチン酸およびステアリン酸を分離するために、ろ過が行われ得る。一般に、ア セトンま九はメタノール溶媒は、脂肪酸１リツトルあたり、溶媒３−４リツトル の割合で、この組成物に加えられる。溶媒を加えた後、結晶化を行うために、温 度を低下させる。一般に、この温度は、−１０°Ｃ〜−１５℃まで低下され、結 晶化が起こった後、真空ロータリーフィルターを利用してろ過が行われる。次い で、このフィルターは、冷却アセ）・ンで噴霧され、遊離のオレイン酸が除去さ れ得る。フラッシュ蒸留および蒸気除去により、このオレイン酸組成物から溶媒 が除去される。

上で示される方法に加えて、洗浄剤（例えば、デシル硫酸ナトリウム）を含有す る水中にて、この脂肪酸組成物を冷却することにより、オレイン酸組成物を精製 することが可能である。水性分散中に形成される結晶は、洗浄剤のフィルムで被 覆される。これらの結晶は、この混合物が遠心分離されるとき、水相中に残留す る。油相には、結晶や水分がない。

分留を利用して、オレイン酸高含量組成物を精製することも可能である。このよ うな方法は、米国特許第２．０５４．０９６号；２、２２４．９８４号：　２． ３２２．０５６号；および２．６７４．５７０号に記述されている。これらの全 ての内容は、脂肪酸分別精製方法の開示に関して、ここに示されている。

Ｌ直五ｌ まず、上の実施例１で記述の酵素加水分解方法を行う。酵素加水分解を行った後 、下相の水相を分離し、そしてこの発明のオレイン酸高含量組成物を含む上相を 得る。およそ１リツトルのオレイン酸組成物を得、そしてこの１リツトルのオレ イン酸組成物に、３リツトルのメタノールを加えて、−１０℃と一１５℃の間の 点まで、温度を低下させる。結晶が完全に現れるまで、低温を維持する。結晶化 された物質を除去するために、ろ過を行い、高度に精製されたオレイン酸組成物 を得る。

現発明は、最も実際的でより好ましい実施態様であると考慮されることに関し、 ここに示され記述されている。しかしながら、この発明の範囲内にて、その実施 態様からの逸脱があり得、この開示を読むことによって、当業者により明らかな 変形がなされ得ることが認められる。より好ましい実施態様と考えられる、この 発明の特定の実施態様に関して、他者が考えを異にすることも、さらに認められ る。

（以下余白） 国際調査報告 １ｍａ−＊ＩＩａｙ−ｈ峠畢曖＜ｈｍｐ＊ｍ、ｐ：Ｔ／’ＪＳＥＢ１０３４ＢＯ 国際調査報告 ＵＳ　８８０３４８０ ＳＡ　２５１４９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．オレイン酸組成物の製造方法であらて、該方法は、以下の段階を包含する： ひまわりの種子の集合体から、オレイン系高含量ひまわり種子油を得ること；該 油は、トリグリセリドを含有し、該トリグリセリドは、６０％またはそれ以上の オレイン系部分から構成される脂肪酸部分を含有する；さらに、オレイン系部分 に対するリノール系部分の比は、約０．２５より小さい；該トリグリセリドを加 水分解するような条件下にて、該オレイン系高含量ひまわり種子油を、水性媒体 中にて加水分解酵素と接触させることにより、該油を酵素加水分解すること； オレイン酸層を形成させ、水性のグリセロール含有媒体から分離すること；およ び 該水性のグリセロール含有媒体を除去して、高純度のオレイン酸組成物を得るこ と。 ２．請求項１で請求された方法であって、前記トリグリセリドでは、オレイン系 部分に対するリノール系部分の比は０．０９より小さい。 ３．請求項１で請求された方法であって、前記種子は、実質的に同種の種子集合 体であり、前記オレイン系部分は、約８０％またはそれ以上の量で、前記トリグ リセリド上に存在する。 ４．請求項３で請求された方法であって、前記オレイン系部分は、約８８％の量 で、前記トリグリセリド上に存在する。 ５．請求項２で請求された方法であって、前記トリグリセリドでは、オレイン系 部分に対するリノール系部分の比は、約０．０９〜約０．０１の範囲である。 ６．請求項１で請求された方法であって、前記種子は、実質的に同種の種子集合 体であり、前記オレイン系部分は、約９５％の量で存在し、そして前記トリグリ セリドでは、オレイン系部分に対するリノール系部分の比は、約０．０９〜約０ ．０１の範囲である。 ７．請求項１で請求された方法であって、前記酵素加水分解は、約４．５〜約１ ０．０の範囲のｐＨにて、約２０℃〜約６０℃の範囲の温度で行われる。 ８．請求項７で請求きれた方法であって、前記温度は３０℃〜５０℃の範囲であ り、そして前記ｐＨは約５．５〜約９．０の範囲である。 ９．請求項１で請求された方法であって、前記酵素加水分解は、部位選択的リバ ーゼおよび非部位選択的リバーゼを含む加水分解酵素の配合物を用いて行われる 。 １０．請求項１で請求された方法であって、前記加水分解酵素は、以下から誘導 されるリバーゼからなる群から選択される：カンジダ属ルゴーサュＣａｎｄｉｄ ａｒｕｇｏｓａ）、カンジダ属リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａｌｉｐｏｌｙｔｉｃ ａ）、ケカビ属ブシリス（Ｍｕｃｏｒ　ｐｕｓｉｌｉｓ）、ゲオトリム属カンデ ィダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ）、シュードモナス属種（Ｐｓ ｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｓＰ．），　　およびベニシリウム属シクロビウム（Ｐｅ ｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）。 １１．請求項１で請求された方法であって、前記加水分解酵素は、カンジダ属ル ゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ）およびベニシリウム属シクロビウム（Ｐ ｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）の組合せから誘導されるリバーゼで ある。 １２．請求項１で請求された方法であって、前記加水分解酵素は、アスベギラス 属ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）およびベニシリウム属シクロビ ウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）の組合せから誘導されるリ バーゼである。 １３．請求項１で請求された方法であって、前記加水分解酵素は、ケカビ属シエ ヘイ（Ｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）、カンジダ属ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇ ｏｓａ）およびベニシリウムシクロビウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｙｃｌｏ ｐｉｕｍ）の組合せから誘導されるリバーゼである。 １４．請求項１で請求された方法であって、前記加水分解酵素は、ケカビ属ブシ リス（ＭｕｃｏｒＰｕｓｉｌｉｓ）およびベニシリウム属シクロビウム（Ｐｅｎ ｉｃｉｌｌｉｕｍｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）の組合せから誘導されるリバーゼである 。 １５．請求項１で請求された方法であって、前記加水分解酵素は、クロモバクテ リアム属ビスコサム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｒｅｉｕｍｖｉｓｃｏｓｕｍ）およ びベニシリウム属シクロビウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｙｃｌｏｐｉｕｍ） の組合せから誘導されるリバーゼである。 １６．請求項１で請求された方法であって、前記加水分解酵素は、ケカビ属ミエ ヘイ（Ｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）およびベニシリウム属シクロビウム（Ｐｅｎｉ ｃｉｌｌｉｕｍｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）の組合せから誘導されるリバーゼである。 １７．請求項１で請求された方法であって、前記加水分解酵素は、シュードモナ ス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）およびベニシリウム属シクロビウム（ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｙｃｌｏｐｕｍ）の組合せから誘導されるリバーゼで ある。 １８．請求項１で請求された方法であって、前記水性媒体は、以下からなる群か ら選択される緩衝液を有する水から、実質的に構成される：４．５〜約９．５の ｐＨ範囲を維持し得るような酢酸塩緩衝液およびリン酸塩緩衝液。 １９．請求項１８で請求された方法であって、前記水は、酵素加水分解中にて、 ５．５〜９．０のｐＨ範囲を維持し得るようなｐＨ緩衝液を含有する。 ２０．オレイン酸組成物の製造方法であって、該方法は、以下の段階を包含する ： トリグリセリドを含有するオレイン系高含量ひまわり種子油を、該トリグリセリ ドを加水分解するべく、３０℃〜５０℃の範囲の温度および約５．５〜約９．０ の範囲のｐＨにて、水性媒体中で、部位選択的リバーゼおよび非部位選択的リバ ーゼの配合物と接触させることにより、該油を酵素加水分解させること、ここで 、該トリグリセリドは、８０％またはそれ以上のオレイン酸から構成される脂肪 酸部分を含有し、さらに、オレイン系部分に対するリノール系部分の比は、約０ ．２５より小さい；該水性媒体を分離して、高純度のオレイン酸組成物を得るこ と。 ２１．請求項２０で請求された方法であって、さらに、以下を包含する： アセトンおよびメタノールからなる群から選択されん溶媒を、前記高純度のオレ イン酸組成物に加えること；該高純度のオレイン酸組成物の温度を、約０℃〜− ２０℃の範囲の点まで低下させること； 脂肪酸の結晶化が起こるまで、該温度を０℃〜−２０℃の範囲で維持すること； および 該結晶化された脂肪酸を除去するべく、ろ過して、さらに精製されたオレイン酸 組成物を得ること。 ２２．請求項１で請求された方法であって、さらに、以下の段階を包含する： 前記高純度のオレイン酸組成物の温度を、−１０℃〜−１５℃の範囲の温度まで 低下させること； 脂肪酸の結晶化が起こるまで、−１０℃〜−１５℃の範囲の温度を維持すること ；および 該結晶化された脂肪酸を除去するために、ろ過すること。