JPH02234681A - 新規ｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、プロモーター活性を有する新規なＤＮＡ，シ
グナルペプチドをコードする新規なＤＮＡ、及び抑制性
酸性ホスファターゼをコードする新規なＤ　Ｎ　Ａに関
する。

〔従来の技術〕

組み換えＤＮＡ技術を用いて有用なタンパク質の生産を
行う場合、宿主として大腸菌と並んで酵母サツ力ロミセ
ス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ　）が広く用いられている。酵母の宿主・
ベクター系は、大腸菌や枯草菌が原核生物であるのに対
して、酵母は真核生物であるので、他の真核生物、特に
啼乳動物細胞と数々の共通点を有しているために啼乳動
物由来のタンパク質遺伝子を発現させるのに有利である
。さらに酵母は、微生物であるので培養が容易であり、
古くから発酵醸造に用いられているためその安全性が確
認されており、その遺伝生化学的解析が数多くなされて
いる、などの利点を持つ。

現在、酵母を宿主として、組み換えＤＮＡによる有用タ
ンパク質の生産を行おうとする場合、産物の生産量を上
げるた必に、生産されたタンパク質を細胞外に分泌する
ための分泌ベクターがいくつか開発されている。しかし
、これらによる分泌生産はまだまだ生産性が低く、実用
化できる系はまだ開発されていないのが現状である。

現在、有用タンパク質を分泌生産するためのいくつかの
酵母ベクターが開発されており、利用が可能である。し
かし、生産性を上げるためには分泌能の優れた酵母を用
いた分泌生産系の開発が必要である。

〔発明が解決しようとする課題〕

したがって本発明の目的は、すぐれたプロモーター活性
を有するＤＮＡ及びタンパク質の菌体外分泌を促進する
シグナルペプチドをコードするＤＮＡを提供することで
ある。本発明の他の目的は、抑制性酸性ホスファターゼ
をコードするＤ　Ｎ　Ａを提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

酵素を大量に菌体外に分泌生産する酵母の酵素遺伝子の
プロモーター領域、菌体外分泌に関与する領域（シグナ
ルベブチド）等の塩基配列は、タンパク質の分泌生産に
適した構造になっているものと考えられるので、このよ
うな領域が単離されれば有用タンパク質の分泌生産の目
的に有効に利用することができる。

本発明者らは、酵母クリベロミセス・マルクシアヌス（
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ）　
　Ｃクリベロミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）〕の持つ酵素の高分泌生
産能を利用することを目的としてこの菌種の分泌酵素で
ある抑制性酸性ホスファターゼに着目し、抑制性酸性ホ
スファターゼをコードしている領域をクローン化し、そ
の制限酵素切断地図を作成するとともに、その塩基配列
を決定し、タンパク質の菌体外分泌に機能するシグナル
配列を見い出し、この発明を完成した。

本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡは、第１図に
示す第１番目から第１３２番目までの塩基配列の少なく
とも一部の塩基配列、またｉま少なくとも一部と実質的
に相同な塩基配列を有する。

本発明のシグナルペプチドをコードするＤＮＡは、第１
図に示す第１３３番目から第１９５番目までの塩基配列
の少なくとも一部の塩基配列、さらに具体的には、第１
３３番目から第１８９番目まで、又は第１３３番目から
第１８０番目までの塩基配列の少なくとも一部の塩基配
列、または少なくとも一部と実質的に相同な塩基配列を
有する。

本発明は、また、第２図に示す抑制性酸性ホスファター
ゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡを提供するものである。

本発明はさらに、第２図に示す、第１７番目から第４８
３番目まで、第２０番目から第４８３番目まで、第２２
番目から第４８３番目までのアミノ酸配列で表わされる
抑制性酸性ホスファターゼ活性を有するタンパク質のア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡを提供するものである。

さろに具体的には、本発明は第１図に示す第１番目から
第１５８１番目までの塩基配列を有する、抑制性酸性ボ
スファターゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡを提供するものである。

本発明のプロモーターおよびシグナルペプチドを用いれ
ば薬理学的に重要なタンパク質遺伝子の発現および分泌
生産を行うことができる。

たとえば本発明のプロモーター活性を有する部分とシク
゛ナルペプチド部分を適当な制限酵素処理により言周製
し、シグナルペプチド部分の上流にプロモーターを、下
流に各種構造遺伝子を組み込んだ分泌用ベクターを作製
する。当該ベクターで宿主の形質転換を行い、当該形質
転換体を培養することにより目的とする遺伝子産物を分
泌生産することができる。本発明のプロモーター活性を
有するＤＮＡあるいはシグナルペプチドを有するＤＮＡ
としては全合成あるいは半合成したものも用いることが
できる。

プロモーターおよびシグナルペプチドを組み込むヘクタ
ーとしてはＹＥＩ）１３［：ジー７　（Ｇｅｎｅ）８，
１２１，　　（１９７９）：］やＹＲｐ７　〔プロシ−
ジング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイｘ
ンス（Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔｌ，　Ａｃａｄ，　　Ｓｃｉ
　ＩＩＳＡ）　　７　３１０３５　　（１９７９＞Ｅな
どが挙げられる。プロモーターの下流に組み込む遺伝子
の例としてはヒトα−インターフェロン遺伝子、ヒトβ
−インターフェロン遺伝子、ヒトＴ−インターフェロン
遺伝子、ヒト成長ホルモン遺伝子、ヒトインターロイキ
ンー２遺伝子などが挙げられる。形質転換する宿主とし
ては酵母が好ましく、たとえばサツ力ロミセス属菌ある
いはクリベロミセス属菌が挙げられる。

〔発明の具体的説明〕

本発明のＤＮＡは、第１図に示す塩基配列、またはこれ
と実質的に相同の塩基配列を含む。第１図に示す塩基配
列は、Ｋ，ｍａｒｘｉａｎｕｓ　（κ，　ｆｒａｇｉｌ
ｉｓ）ＮＲＲＬ　Ｙ６１０　　（ＡＴＣＣ−　１　２　
４　２　４）から分離、採取された抑制性酸性ホスファ
ターゼ遺伝子の塩基配列である。

本発明において、或る特定の塩基配列を含むＤＮＡとは
、当該遺伝子そのもののみならず、当該遺１云子に適当
なマーカーを与える配列が結合されたものおよび外来Ｄ
ＮＡが結合されたもの等のように、当該遺伝子にさらに
他のＤＮＡ配列が結合されたものをも包含する。さら１
こ、或る特定の塩基配列と実質的に相同の塩基配列と｛
ま、当該塩基配列中の一部の塩基が他の塩基に置換され
、または塩基配列中に他の塩基配列が挿入され、または
塩基配列が一部脱落したものであって、圭該遺伝子と同
様なブロモークー活性を有する塩基配列、ある′Ｊ）は
、当該遺伝子がコードするシグナルベプチド又はタンパ
ク質と同様の活性を有するングナルペプチド又はタンパ
ク質をコードする塩基配列を意味する。

遺伝子において、同一の生理機能をもたらす塩基配列が
複数存在することくたとえば構造遺伝子において、１つ
のアミノ酸をコードするコドンは複数存在する）は周知
であり、また現在の技術レベルにおいては塩基配列中の
特定の塩基を他の塩基に置換することは容易に行なうこ
とができるので、当該遺伝子の塩基配列の一部の塩基が
他の塩基に置換され、または塩基配列中に他の塩基配列
が挿入され、または塩基配列が一部脱落したものであっ
て、当該遺伝子と同様なプロモーター活性を有する塩基
配列、あるいは、当該遺伝子がコードするシグナルペプ
チド又はタンパク質と同様の活性を有するシグナルベブ
チド又はタンパク質をコードする塩基配列はすべて本発
明の範囲内に含まれる。

本発明の抑制性酸性ホスファターゼのプロモーター領域
および構造遺伝子を含むＤ　Ｎ　Ａは次のようにして得
ることができる。

まず、酵母クリベロミセス・マルクシアヌスからＤ　Ｎ
　Ａを抽出する。酵母からＤ　Ｎ　Ａを抽出するには、
たとえばメソンズ　イン　セル　バイオロジー０１ｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ），　　１
　２．　　１　３（１　９　７　５）に記載の方法ある
いはこれに準じた方法が使用できる。

次に得られたＤＮＡを適当な制限酵素で処理したのち、
同じ制限酵素あるいは同じ接着末端を生じさせる制限酵
素で処理したプラスミド、あるいＱ はファージに、上記で得られたＤＮＡ断片を組み込んで
遺伝子バンクを作製する。プラスミドとしては、たとえ
ばｐＢＲ３　２　２や大腸菌一酵母シャトルベクターた
とえばＹＥｐｌ３（ジーン（Ｇｅｎｅ）　，８，１２１
，　　（１９７９）Ｅが、またファージとしてはｃｈａ
ｒｏｎ系ファージ〔ジャーナル・オブ・ウィロロジー（
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，），　　２　９，　　５　５　５．　
（１９７９）Ｅなどが用いられる。

このようにしてクローン化されたＤＮＡを保持するベク
ターで、宿主微生物を形質転換する。宿主微生物として
は、酵母が好ましく、たとえばサツ力ロミセス属菌が挙
げられる。具体的には、サッカロミセス・セレビシエ、
さらに具体的にはサツ力ロミセス・セレビシエ　ＮＡ８
７−１１Ａ＆が挙げられる。なお、上記宿主微生物はｐ
ｈｏ５変異体く抑制性酸性ホスファターゼＤＮＡを欠失
させたもの）であることが好ましい。このようにして得
ちれた遺伝子バンクを用いて、ｐｈｏ５変異体を形質転
換することにより抑制性酸性ホスファターゼのプロモー
ター領域およびその構造遺伝子が連結されたベクターを
保持する形質転換体が得られる。

形質転換するには、公知の方法たとえばプロトプラスト
法ＣＡ，　ｌｉｎｎｅｎ　ｅｔ，ａｌ，プロシージング
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，　Ａｃａｄ，　Ｓｃｉ，　ＵＳＡ
），　　７　５，　　１　９　２　９，（１９７８）］
、あるいは金属処理法［ｔｌ．　ｌｔｏｅｔ，　ａ＋，
，ジャーナル・オブ・バクテリオロジ（Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ，），１５３．　　ｉ６５，　　（１９８３）
　〕によって行なわれる。

上記方法で得られた形質転換体が、抑制性酸性ホスファ
ターゼのプロモーターおよびその構造遺伝子を保持する
かどうかは、次に記載の方法により確認することができ
る。すなわち、当該形質転換体をたとえばパークホルダ
ー改変低リン酸培地〔Ａ，　Ｔｏｈ−ｅ　ｅｔ　ａｌ，
，ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ，　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ，），　　１　１　３，　　７　２　７，
（１９７３）〕上にコロニーを形成させ、α−ナフチル
リン酸およびファーストブルー塩Ｂとを含有する寒天を
重層する。抑制性酸性ホスファターゼのプロモーターお
よびその構造遺伝子を含むＤ１ｌ ＮＡがクローン化されていればコロニーが赤色を示すこ
とからその存在を確認することができる。

次に当該遺伝子を含む形質転換体からプラスミドを抽出
し、これをたとえば制限酵素で切断後、たとえばアガロ
ースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電気
泳動によって挿入された遺伝子を含むＤＮＡを単離する
ことができる。この一連の基本操作はすでに公知であり
、たとえばモレキニラー　クローニング（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）（　１　９　８　２　）　（
Ｃｏｌ’ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）に詳しく記載されている。

当該遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列は、たとえばサンガ
ー法（プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス（　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．八ｃａｄ
．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ）　　，　　　？　　４．　　　
５　　４　　６　　３，　　（１９７７），　　サイｘ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），　　２　１　４，　１２０５
．　（１９８１））、あるいはマキサムーギルバート法
〔′プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイｘンス（Ｐｒｏｃ，　　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
，　Ｓｃｉ，　　ＵＳＡ）　，　　７　４，５６０，　
　（１９７７））などの方法を用いて決定できる。

〔発明の効果〕

本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡ，シグナルペ
プチドをコードするＤＮＡは、薬理学的に重要なタンパ
ク質遺伝子の発現および分泌生産に有効に利用すること
ができ、特に、酵母による有用なタンパク質の生産性の
高い分泌生産系の確立に有効に利用することができる。

〔発明の実施例〕

実施例１　クローニングベクターの構築（第３図参照） クローニングベクターを作製するため大腸菌一酵母シャ
トルベクターＹＲｐ７（プロシージング・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイｘンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ，　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＩＪＳＡ　）　，　　？　
３，１０３５　（１９７９）Ｅより制限酵素ＢｃｏＲＩ
処理で取得した自律複製開始配列（ＡＲＳ）を含む酵母
染色体遺伝子断片をＤＮＡポリメラーゼ■〔クレノウ（
Ｋｌｅｎｏｗ）断片〕により平滑末端にし、ｐＵＣ１９
〔ジー：／　（Ｇｅｎｅ）　，　　３　３，　　１　０
　３（１９８５））　（７）ｌ３ ＤＮＡポリメラーゼ■　〔クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断
片〕により平滑末端にした制限酵素Ｎａｒｌ切断部位に
挿入した。この新しく作製した大腸菌一酵母シアトルベ
クターをｐＨＮ１１４と命名した（第３図）。

実施例２　　Ｋ，　　ｍａｒｘｉａｎｕｓ　Ｙ６　１　
（ｌ遺伝子バンクの作製 常法より得たＫ，　　ｍａｒｘｉａｎｕｓ　　Ｙ　６　
１　０の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消
化し、３５０００ｒｐｍ　　（日立ＲＰＳ４ＣＩＴ　Ｏ
−ター）、８．５時間のシヨ糖密度勾配遠心により４ｋ
ｂ以上のＤＮＡ断片を分画した。この分画した染色体Ｄ
ＮＡ断片をクローニングベクターρＩＩＮ１１４の制限
酵素Ｂａｍ旧切断部位に挿入し、０．　２　ｍｇ／一の
５−ブロモー４−クロロ−３−インドリルーβ−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド、０．０５ｍｇ／一のイソブロビルー
β一Ｄ−チオガラクトビラノシド含有寒天培地で白いコ
ロニーとして選択し、約５１００株のアンビシリン耐性
大腸菌からなる酵母遺伝子バンクを作製した。

実施例３　抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子のクローニ
ング 上記の酵母遺伝子バンクを用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅＮＡ８　７　−　１　１　Ａ　（ＭＡＴαｐｈｏ３
−１　　ｐｈｏ５−ＩＩｅｕ２−３　　１ｅｕ９−１１
２　　ｔｒｐｌ　ｈｉｓ３　＞を形質転換し、０．０５
％のα−ナフチルリン酸、０．２５％のファーストブル
ー塩Ｂ，　０．　１　Ｍ　　Ｎａ一酢酸緩衝液（ｐ｝１
４．５）で調製した０．８％寒天溶液を用いたコロニー
染色法で、抑制性酸性ホスファターゼ産生能を示すもの
をスクリーニングした。得られた約１．５ｘｉｏ’個の
形質転換体を調べたところ、２５個の酸性ホスファター
ゼ産生能を示す形質転換体が得られた。そのうち２個の
形質転換体からプラスミドＤ　Ｎ　Ａを調製し、Ｅ，　
ｃｏｌｉ　　ＭＣ　１　０　６　１の形質転換に用いた
。得られた形質転換体はすべて同一分子量のブラスミド
を持っていた。

このブラスミドをｐｌＫＤ５０と命名し、再びＳ．ｃｅ
ｒｅｖ＋ｓ＋ａｅ　　Ｎ　Ａ　８　７　−　１　１　八
の形質転換に用いた。得られた形質転換体の抑制性酸性
ホスファターゼ産生能を調べたところ、すべて抑制性酸
性ホ１ａ スファターゼ産生能を示した。したがってｐＩＫＤ５０
にはＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓの抑制性酸性ホスファター
ゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入されていると考えられ
た。

実施例４　　ｐｌＫＤ５０を保持する形質転換体の抑制
性酸性ホスファターゼ活性 ｐｉκ０５０をＳ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　ＮＡ　
８　７　−　１　１　．Ａに組み込んだ形質転換体をパ
ークホルダー改変高リン酸（２、２ｍλ１）および低リ
ン酸（０．　２　２ｍ！，ｌ）寒天（１，５％〉培地で
３０℃、２０時間培養した後、コロニー染色法で酸性ホ
スファターゼ活性を調べたところ、高リン酸培地では活
性は認められなかったが、低リン酸培地では活性が認め
られた。

また当該形質転換体のｐＨ変化による抑制性酸性ホスフ
ァターゼ活性の変化を調べるため、パークホルダー改変
低リン酸培地ＩＭで３０℃、２０時間振とう培養した後
、菌体を集め、等張緩衝液［０．８Ｍ　　ＫＣｆｌ，　
　０．１Ｍ　　Ｎａ−酢酸（ｐＨ５、２）〕で２回洗浄
し、等張緩衝液５ｍｌに０．２ｍｇ／ｍｌになるようザ
イモリエースを加え、３７℃、３０分間の処理によりプ
ロトブラスト化し、１　５　０　０ｒｐｍ、１０分間の
遠心でプロトプラストを集め、その上清を用いて酸性ホ
スファターゼの至適ｐＨ′＋調べた。

この結果を第４図に示す。この結果から酸性ホスファタ
ーゼの至適ｐＨは、ｐＨ５．３〜５．６であることがわ
かった。

以上の結果からクローン化されたＤＮＡはリン酸による
抑制を受けており、活性の至適ｐＨがｐＨ５．３〜５．
６であることから、ｐｌＫＤ５０にはプロモーター領域
を含む抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子がクローン化さ
れていると結論した。

実施例５　抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子を含むＤ　
Ｎ　．Ａ断片の制限酵素地図の作成（第５図参照） 抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子を含む３ａｍ　８１〜
Ｓａｕ３ＡＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を２２種の制限酵素（八
ｃｃ　Ｉ，八ｐａ　Ｉ，　　Ｂａｌ　　Ｉ，　　Ｂａｍ
　　旧，　　Ｂｇｌ　　　ＩＩ，Ｃｌａｌ，　　Ｅｃｏ
　　Ｒ［，｝１ａｅ　ＩＩ，　ＨｉｎｃＩＩ，Ｈｉｎｄ
　ＤＩ．ＫｐｎＩ，Ｍｌｕｌ，ＰｓｔＩ，Ｐｖｕ　Ｉｆ
，Ｓａｃ　Ｉ，Ｓａｌ　Ｉ，Ｓｃａ　Ｉ，Ｓ＋＋＋ａ　
Ｉ，Ｓｐｈ　Ｉ，Ｓｔｕ　ＩＸｂａ　　），ＸｈｏＩ）
を用いて解析した。常法にしだがｌ８ って各種制限酵素の単独あるいは２種類の組み合せによ
って生じた反応物を０．８％あるいは１．２％のアガロ
ースゲル電気泳劾にかげ、その切断パターンから各制限
酵素の切断部位を推定した（第５図）。分子量マーカー
としてλＤＮＡの旧ｎｄＩＩ［分解物あるいはＨｉｎｄ
ＩＩ［・ＥｃｏＲ　Ｉ分解物を用いた。なお切断部位は
確認できたもののみ記入した。

実施例６　クローン化されたＤ　Ｎ　Ａ断片上の抑制性
酸性ホスファターゼ遺伝子の位置の 推定 クローン化されたＤＮＡ断片上の抑制性酸性ホスファタ
ーゼ遺伝子の位置を推定するため、ｐｌＫＤ５０の欠失
誘導体をヘニコフの方法（Ｓ，　Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ジ
ーン（Ｇｅｎｅ），２８，３５１．　　（１９８４）Ｅ
およびヤニシューペロンらの方法（Ｃ．Ｙａｎｉｓｃｈ
−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ，　ａｌ．，　　ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）　，　　３　３，　　１　０　３，（１９８５）３
を改変したキロシーケンス用デレーションキット　（タ
カラ社製）を用いて作成した。

ｐｌＫＤ５　０　（１　０μｇ）を２４ユニットの制限
酵素Ｓａｌ　　Ｉと１２ユニノトの制限酵素ｓｐｈ　　
Ｉとを加えた１００μ・ｉ’の反応液（　７ｍ！Ｊ　　
Ｔｒｉｓ−１４Ｃ　ｌ　（ｐＨ７．　５）　，　　７ｍ
Ｍ　　ＭｇＣＬ’，　１　７　５ｍ）４　　ＮａＣ！，
７ｍＭ２−メルカプトエタノール］中で３７℃、２時間
反応させ、フェノール抽出さらにクロロホルム抽出し、
２．５倍量の冷エタノールを加えてＤＮＡを沈澱させた
。得られたＤＮＡを１００μβのエキソヌクレアーゼ■
緩衡液Ｃ　５　０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＫＣ！（ｐＨ８．
０）　，　　１　０　０ｍ！．｛　　ＮａＣｊ！．　　
５ｍＭ　　ＭｇＣＬＩＱｍＭ２−メルカブトエタノール
〕で溶解し、１８０ユニットのエキソヌクレアーゼ■を
加え３７℃で反応させた。そして１分毎に反応液をｌＯ
μβずつサンプリングし、１００μβのＭＢヌクレアー
ゼ緩衝液（４０ｍＭＮａ一酢酸（ｐＨ　４．　５　）．
１　０　０ｍＭ　　ＮａＣ１．　　２ｍＭ　　ＺｎＣｊ
！２．　１　０％　グリセロール〕中へ順次入れ反応を
止めた。反応終了後、６５℃、５分間インキニベーショ
ンしてエキソヌクレアーゼ■を失活させた。当該反応液
を３７℃にもどし、５０ユニットのムング　ビーン　ヌ
クレアーゼを加え３７℃、６０分間反応させ、フェノー
ル抽出さらにクロロホルム抽出し、２．５倍Ｍの冷エタ
ノールを加えて再びＤＮＡを沈澱させた。

得られたＤＮＡを５０μｆのクレノウ緩衝液〔７ｍＭ　
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ２　（ｐＨ７：５）　，　０．　１
ｍＭ　　ＥＤＴＡ，　　２　０ｍＭ　　ＮａＣｊ！，　
　？ｍＭ　　ｉＡｇｃｉ２．　０．１ｍ！Ｊ　　ｄＡＴ
Ｐ，　０．１ｍＭ　　ｃｌＤＴＰ，　　０．　１ｍＭ　
　ｄｃＴＰ．　０．　１ｍ，Ｌｌ　　ｄＴＴＰ〕で溶解
し、２ユニットのクレノウ断片を加え３７℃、１５分間
反応させた後、２．５倍量の冷エタノールを加えて沈澱
させたＤ　Ｎ　Ａを４０μｌのＴＥ緩衝液〔ｌ　（ｌｍ
？Ｊ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７．６＞　，　１ｍ？
Ｊ　ＥＤＴＡ）に溶かした。このＤＮＡ溶液１０μｌを
１００μｌのライゲーション溶液Ａ（タカラ社製）に加
えさらに１２μβのライゲーション溶液Ｂ（タカラ社製
）を加えて５℃、２０時間反応させた。

上記反応液１　０μｊ！を用いてＥ．　ｃｏｌｉ　　Ｍ
Ｃ１０６１を形質転換し、得られたアンビシリン耐性形
質転換体からブラスミドＤＮＡを回収し、ｐＩκ０５０
にクローン化されたＢａｍ　ｔ｛ｒ−Ｓａｕ３ＡＩ　Ｄ
　ＮＡ断片のＳａｕ３ＡＩ側から約０．３　〜１，８ｋ
ｂが欠失した９種の欠失ブラスミド（ｐｌＫＤ　５　０
　−　１〜ｐｌＫＤ５０一９）を得た。

これら得られた欠失ブラスミドＤＮＡでＳｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ　　Ｎ　Ａ　８　７　−　１　１　Ａをそれぞ
れ形質転換し、得られた形質転換体の抑制性酸性ホスフ
ァターゼ産生能を調べた。各欠失プラスミドの産生能を
第６図に示した（各ブラスミド右端の＋，−）。

また同様にｐｌＫＤ５０にクローン化されたＢａｍ　Ｈ
ｌ〜Ｓａｕ３ＡＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片のＢａｍ旧側から欠
失させた欠失ブラスミドを作製し、その形質転換体の抑
制性酸性ホスファターゼ産生能を調べたが、産生能を示
すものは得られなかった。以上の結果から、抑制性酸性
ホスファターゼ遺伝子は第６図のｐｌＫＤ５０−７の持
つ約１，５ｋｂの断片に存在することがわかった。そこ
でこのｐｌＫＤ５０−７をｐｌＫＤ５１と新たに命名し
た。

実施例７　　Ｋ，ｍａｒｘｉａｎｕｓの抑制性酸性ホス
フ７ターゼ遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列 の決定 Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓの抑制性酸性ホスファターゼ遺
伝子を含むと考えられるｐｌＫＤ５１のＤＮＡ断片の全
塩基配列をサンガー法に従って決定した。その２Ｉ 結果翻訳可能領域は存在したものの、それが途中で切れ
ていることがわかったため、Ｉ］ＩＫＤ５１がクローン
化している約１．６ｋｂのＤＮＡ断片より約２００ｂｐ
大きいｐｌＫＤ５０のＢａｍ旧〜Ｅｃｏ　Ｒｌ　（約１
．８ｋｂ＞断片をρ［ｌＣ　１９にクローン化し、残り
の全塩基配列を決定した（第１図）。

この配列のうちに１４４９ｋｂの翻訳可能領域が存在し
た。このフレームより予想される転写方向は、Ｂａｍ旧
切断部位からεｃｏ　Ｒｌ切断部位への方向であり、Ｂ
ａｍ旧切断部位からおよそ１３０ｂｐ下流に翻訳開始コ
ドン”Ａ　Ｔ　Ｇ　”が出現する。ＡＴＧより上流６８
ｂｐにＴＡＴＴＡという配列が見出され、これがＴＡＴ
Δボックスとして機能していると考えられる。また分泌
タンパク質ｉこ特微的な疎水性アミノ酸に富む配列がＡ
ＴＧより下流約６０ｂｐまでに見い出され、これがシグ
ナル配列として機能していると考えられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の抑制性酸性ボスファターゼ遺伝子の
塩基配列を示す。 第２図は、本発明の抑制性酸性ホスファターゼのシグナ
ルベプチドを含むタンパク質のアミノ酸配列を示す。 第３図は、大腸菌一酵母シアトルベクターｐＨＮ１１４
の構築工程を示す図面である。 第４図は、本発明の抑制性酸性ボスファクーゼの至適ｐ
Ｈを示す図面である。 第５図は、本発明の抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子の
制限酵素地図である。 第６図は、本発明の抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子を
含むブラスミドと各種の欠失プラスミドの抑制性酸性ホ
スファターゼ産生能を示す図面である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）第１図に示す第１番目から第１３２番目までの塩
   基配列の少なくとも一部の塩基配列、または少なくとも
   一部と実質的に相同な塩基配列を有し、プロモーター活
   性を有するＤＮＡ。
2. （２）第１図に示す第１３３番目から第１９５番目まで
   の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列、または少なく
   とも一部と実質的に相同な塩基配列を有し、シグナルペ
   プチドをコードするＤＮＡ。
3. （３）第２図に示す抑制性酸性ホスファターゼ活性を有
   するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
4. （４）第２図に示す第１７番目から第４８３番目までの
   アミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
5. （５）第２図に示す第２０番目から第４８３番目までの
   アミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
6. （６）第２図に示す第２２番目から第４８３番目までの
   アミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
7. （７）第１図に示す第１番目から第１５８１番目までの
   塩基配列を有するＤＮＡ。