JPH0569510B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、酵母に澱粉資化性を賦与し、そして
酵母における発現、分泌ベクター創製に使用し得
る酵母グルコアミラーゼ遺伝子を含むDNA配列
に関する。 一般に、澱粉を基質とする工業的アルコール発
酵は、(i)アミラーゼ群による澱粉のグルコースへ
の糖化、および(ii)酵母菌によるグルコースのエタ
ノールへの転換の2つの過程により成立する。こ
れらの2つの過程を一つの生物によつて触媒させ
ることは、生産システムの合理化上必要であり、
多年来求められていた技術体系の一つである。 従来、酵母菌の中でも特定の菌であるサツカロ
ミセス・ジアスタテイカス(Saccharomyces
diastaticus)が澱粉を加水分解してグルコース
を生成させるグルコアミラーゼを分泌することが
知られていた。しかしながら、サツカロミセス・
ジアスタテイカスはグルコースからのエタノール
生産能およびグルコアミラーゼ産生分泌能とも弱
く、澱粉を基質とする直接アルコール発酵に使用
する工業用菌株としては不適格であつた。 他方、グルコールを基質とするアルコール発酵
は、通常、サツカロミセス・セレビシエ
(Saccharomyces cerevisiae)が、工業用菌株と
して用いられている。サツカロミセス・セレビシ
エのアルコール耐性度は、17%から21%に達する
が、サツカロミセス・セレビシエは、グルコアミ
ラーゼ産生能を全く有せず、澱粉を基質とする直
接アルコール発酵はできなかつた。 そこで、本発明者等は、サツカロミセス・ジア
スタテイアスの分泌酵素であるグルコアミラーゼ
遺伝子をアルコール生産に使用する工業用菌種で
あるサツカロミセス・セレビシエに導入すれば、
酵母菌による澱粉基質とした直接アルコール生産
が可能となることに着目した。さらに、導入すべ
きグルコアミラーゼ遺伝子の給源として、サツカ
ロミセス・ジアスタテイカスを選択する理由は遺
伝子受容菌がサツカロミセス・セレビシエである
からである。即ち両者は、ともにサツカロミセス
属に属し、遺伝学的に近縁関係にあるためサツカ
ロミセス・ジアスタテイカスのグルコアミラーゼ
遺伝子が、サツカロミセス・セレビシエによつて
も発現し、遺伝子産物の産生が予測されるのであ
る。グルコアミラーゼ遺伝子の給源として、サツ
カロミセス・ジアスタテイカス以外に、アスペル
ギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、リ
ゾプス・デルマア(Rhizopus delemar)などの
糸状菌が考えられるが、生物学的近縁度が低く、
これら菌株のグルコアミラーゼ遺伝子をサツカロ
ミセス・セレビシエで発現させることは、極めて
困難であると考えられる。 このように、本発明者等は、遺伝子組換えの手
法により、澱粉を基質として、直接アルコール発
酵に使用し得る工業用菌株の育種と目標として鋭
意研究を行い、サツカロミセス・ジアスタテイカ
スをグルコアミラーゼ遺伝子のクローニングに成
功し、該遺伝子の構造を決定し、さらに該遺伝子
をサツカロミセス・セレビシエに導入して得られ
た形質転換株が、澱粉からのアルコール直接発酵
能を有することを確認した。この結果は、酵母系
におけるグルコアミラーゼ遺伝子のクローニング
に関するはじめての成功例であり、グルコースか
ら、アルコールを直接発酵させるという多年求め
られてきた技術体系の実施に向けて1つの可能な
方法を提供するという意味で、その意義は極めて
大きい。さらに本発明によつて得られたもう1つ
の大きな利点はサツカロミセス・ジアスタテイカ
スのグルコアミラーゼが、菌体外分泌酵素である
点にある。即ち、本発明によつて得られたグルコ
アミラーゼをコードするDNA配列は、グルコア
ミラーゼ自身を酵母菌体外に多量に分泌、蓄積さ
せることを勿論可能にするが、さらに酵母系にお
ける遺伝子の強力な発現を行い得るプロモーター
領域およびリボゾーム結合領域、および蛋白の効
率的な分泌を行う分泌に関与する領域を有するも
のであるので、このDNA配列の下流に所望の異
種遺伝子、例えば、インターフエロン、成長ホル
モン、インターロイキン、神経成長因子、カリク
レイン、プラスミノーゲンアクテベーター、ある
いは、その他と生理活性ポリペプチド、または、
酵素等の構造遺伝子を結合することにより酵母菌
を宿主としてこれらの蛋白を菌体外に効率的に分
泌蓄積させる発現分泌ベクターの造成を可能にす
るものである。しかも、本発明によつて得られた
DNA配列が、サツカロミセス属以外の酵母にお
いても、有効であることは、該DNA配列を用い
て実施例に示すように、シゾサツカロミセス・ポ
ンベ(Schizosaccharomyces pombe)を形質転
換して得られた形質転換株が、サツカロミセス・
ジアスタテイカス由来のグルコアミラーゼを産生
することから、明らかである。即ち、本発明によ
つて得られたDNA配列は、サツカロミセス属以
外の酵母系においても、異種遺伝子産物の発現、
分泌ベクターの造成に使用し得るものである。 また、本発明のDNA配列のうち、遺伝子の発
現に関与する部分であるプロモーター領域ならび
にリボゾーム結合領域の塩基配列、および蛋白の
分泌に関与する領域の塩基配列を各々単独で、あ
るいは、いずれかを組み合わせた形で取り出して
使用する場合、あるいは、蛋白をコードする領域
の塩基配列について、指定するアミノ酸配列が異
ならないように置換して得たDNA配列も更に、
本発明のDNA配列の任意の部分の塩基を他のも
のと置換したり、新たに塩基を挿入したり、また
は削除した場合、あるいは塩基配列の一部を転位
させた場合に得られる誘導体も、遺伝子の発現、
および分泌に良好な結果を与えることが想定さ
れ、本発明の範疇に入るものである。 以下、具体例によつて本発明のDNA配列を含
むサツカロミセス・ジアスタテイカスのグルコア
ミラーゼ遺伝子の取得方法および本発明のDNA
塩基配列の決定および、本発明のDNAを用いて
形質転換して得られる澱粉資化性を有するサツカ
ロミセス・セレビシエによる澱粉からアルコール
直接醗酵および、本発明のDNAによるサツカロ
ミセス属以外の酵母の形質転換例について説明す
る。 実施例 1 サツカロミセス・ジアスタテイカス染色体遺伝
子のジーン・ライブラリーの作製 サツカロミセス・ジアスタテイカス
(Saccharomyces diastaticus)5106−9A株
(STA1)(FERMP−7641)をYEPD培地(1%
酵母エキス、2%ペプトンおよび2%グルコー
ス)2を用いて28℃で2日間培養し、 得られた菌体からR.W.Davis等の方法(R.W.
Davis et al;Advancud bacteriol genetics、
Cold Spring HarborLaboratory1980)により染
色体DNAを抽出して、1.0mgのDNAを得た。こ
の染色体DNA200μgを制限酵素Sau3AI(宝酒造
製)を用いて、37℃部分分解し、得られた反応物
全量から蔗糖密度勾配(10〜40%)遠心法によ
り、約5kb以上のDNAを分画し、回収した。該
回収DNAを50mMトリス−塩酸緩衝液(PH7.5)
100μに溶解し、供与染色体断片とした。この
供与染色断片を、本発明者等が作製した酵母−大
腸菌シヤトルベクタ−pKS2−20(K.Suzuki、Y.
Imai、I.Yamashita and S.Fukui;Journal of
Bocteriolology 155、747〜754、(1983))の
Bma H I切断部位にT4リガーゼ(宝酒造製)
を用いて文献記載の方法(M.Carlson and D.
Botstein;Cell、28、145(1982))による結合し
た。得られた融合プラスミドを100mM塩化カル
シウムを用いる方法(S.N.Cohn A.C.Y.Chang
and L.Hsu;proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69、
2110〜2114(1972)によりE.ColiJA221(Leu-、
AmpS)(NRRLNo.15014)に導入し、アンピシリ
ン耐性を示す形質転換株約20000株を取得した。
これらの20000株の形質転換株の各々から、ラピ
ツト法(David S.Holmes and Michael
Quigley;Analytical Biochemistry 144、193、
1981)によりプラスミドDNAを抽出し、混合し
て、ジーン・ライブラリーとした。 実施例 2STA1遺伝子を含むプラスミド
pSTA1の分離 実施例1で得たジーンライブラリーDNA100μ
を用いてサツカロミセス・セレビシエ338
(Leu-、Sta-)(Saccharomyces cerevisiae、
FERMP−7637)をJ.D.Beggsの方法(Nature
(London)275、104〜109、1978)により形質転
換して選択培地にプレーテイングしLeu+、Sta+
を示す形質転換株を得た。約30000株のLeu+を示
す形質転換株からコロニーの回りにグルコアミラ
ーゼの産生を示すハローを生じる形質転換株
(Sta+)5株が得られた。なお、選択培地の組成
は1%グルコース、2%可溶澱粉、1.2Mソルビ
トール、20mg/mlヒスチジン、30mg/mlリジン、
2%寒天である。コロニーの回りにハローを生じ
た5株の形質転換株のうちの1株をYEPDの培地
10mlで28℃で24時間培養して得られる菌体から文
献記載の方法(H.C.Birnboim and J.Doly;
Nucleic Acids Res.;)によりプラスミドを抽
出した所、該形質転換株から1μgのプラスミド
DNAが得られた。このプラスミドDNAを用いて
実施例1に記載したのと同じ方法により、E.coli
JA221株を形質転換し、Leu+、Amr、Tcを示
す形質転換化株を得た。この形質転換株をLB
(0.5%酵母エキス、1%ペプトン、0.5%NaCl)
の培地5mlを用いて37℃、16時間培養して得られ
る菌体から、プラスミドを上記Birnboim and
Dolyの方法により分離、精製したところ1μgの
プラシミドDNAが得られた。このプラスミド
DNAを用いて、本実施例の最初に記載した方法
により、サツカロミセス・セレビシエ338(Leu-、
Sta-)を形質転換した所、Sta+を示す形質転換
株を得られたので、このプラスミドをpSTA1と
名づけた。pSTA1の制限酵素地図は第1図に示
される。pSTA1は第1図に示すように2.8kbの挿
入DNAを有し、制限酵素Bam HIサイトが1ケ
所、Sal Iサイトが2ケ所、Pvu サイトが2
ケ所、Hind サイト、Eco RIサイト、Pst I
サイトが各1ケ所存在していた。 実施例 3分泌酵素グルコアミラーゼ遺伝子
STA1の塩基配列の決定 実施例2で得られたpSTA1を有する形質転換
株(E.coli JA221−pSTA1、FERMP−7640)
をLB培地2を用いて37℃で16時間培養した菌
体から実施例2の示した方法により、プラスミド
の調整を行つた結果1mgの精製プラスミドが得ら
れた。このプラスミドの制限酵素Sal Iおよび
Bam HIで部分分解し、アガロース電気泳動で、
約2.8kbの挿入DNA断片を精製、分離した。この
挿入DNA断片についてMaxamとGilbertの方法
(A.Maxam and W.Galbert、proc.Natl.Acad.
SciU.S.A.74、560(1977))により、第2図に示し
た塩基配列決定のための戦略図によつて、全塩基
配列を決定した。その結果、次に示すDNA塩基
配列が、得られ、この塩基配列はサツカロミセ
ス・ジアスタテイカスのグルコアミラーゼ遺伝子
の発現、分泌に必要なRNAポリメラーゼの結合
部位、リボゾームの結合部位(RBS)、シグナル
配列(Signal sequence)おおび分泌された成熟
蛋白に対応するDNA配列、停止配列(Stop)さ
らに下流には、ポリAシグナル(Poly A
signal)を含むことが判明した。 実施例 4 形質転換株サツカロミセス・セレビシエ338−
pSTA1は、サツカロミセス・ジアスタテイカス
5106−9A株(STA1)と同じグルコアミラーゼ
を分泌する。 実施例2で得られたpSTA1を用いて実施例2
で示したのと同じ方法により、サツカロミセス・
セレビシエ338株の形質転換して得られる株サツ
カロミセス・セレビシエ338−pSTA1
(Saccharomyces cerevisiae、FERMP−7638)
をYPS培地(1%イースト・エキス、2%ペプ
トン、3%可溶性澱粉)1を用いて28℃で3日
間培養した。この培養液上清のグルコアミラーゼ
活性を文献記載の方法(I.Yamashita and S.
Fukui、Agric.Biol.Cmem;47、2689、1983)に
より測定しDNA供与株であるサツカロミセス・
ジアスタテイカス5106−9A株由来のグルコアミ
ラーゼと比較した。その結果、サツカロミセス・
セレビシエ338−pSTA1株は第1表に示すように
至適温度、至適PH、熱安定性に関し、サツカロミ
セス・ジアスタテイカス5106−9A株由来のもの
と全く同じ性質を示すグルコアミラーゼを産生、
分泌し、しかもその産生量は、1.0×106単位1
に達し、サツカロミセス・ジアスタテイカス5106
−9A株の産生、分泌量の10倍以上であつた。さ
らに、両菌株由来の精製酵素をエンドグリコシダ
ーゼH(Endo H、生化学工業製)で処理して、
得られペプチドの分子量をSDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法で比較するといずれのグルコ
アミラーゼも41000ダルトンを示した。また、サ
ツカロミセス・ジアスタテイカス5106−9A株の
分泌するグルコアミラーゼのペプチド部分を抗原
とするモノクローナル抗体を調整し、サツカロミ
セス・セレビシエ338−pSTA1のグルソアミラー
ゼと反応させたところ、強い沈降反応がみられ
た。
酵母における発現、分泌ベクター創製に使用し得
る酵母グルコアミラーゼ遺伝子を含むDNA配列
に関する。 一般に、澱粉を基質とする工業的アルコール発
酵は、(i)アミラーゼ群による澱粉のグルコースへ
の糖化、および(ii)酵母菌によるグルコースのエタ
ノールへの転換の2つの過程により成立する。こ
れらの2つの過程を一つの生物によつて触媒させ
ることは、生産システムの合理化上必要であり、
多年来求められていた技術体系の一つである。 従来、酵母菌の中でも特定の菌であるサツカロ
ミセス・ジアスタテイカス(Saccharomyces
diastaticus)が澱粉を加水分解してグルコース
を生成させるグルコアミラーゼを分泌することが
知られていた。しかしながら、サツカロミセス・
ジアスタテイカスはグルコースからのエタノール
生産能およびグルコアミラーゼ産生分泌能とも弱
く、澱粉を基質とする直接アルコール発酵に使用
する工業用菌株としては不適格であつた。 他方、グルコールを基質とするアルコール発酵
は、通常、サツカロミセス・セレビシエ
(Saccharomyces cerevisiae)が、工業用菌株と
して用いられている。サツカロミセス・セレビシ
エのアルコール耐性度は、17%から21%に達する
が、サツカロミセス・セレビシエは、グルコアミ
ラーゼ産生能を全く有せず、澱粉を基質とする直
接アルコール発酵はできなかつた。 そこで、本発明者等は、サツカロミセス・ジア
スタテイアスの分泌酵素であるグルコアミラーゼ
遺伝子をアルコール生産に使用する工業用菌種で
あるサツカロミセス・セレビシエに導入すれば、
酵母菌による澱粉基質とした直接アルコール生産
が可能となることに着目した。さらに、導入すべ
きグルコアミラーゼ遺伝子の給源として、サツカ
ロミセス・ジアスタテイカスを選択する理由は遺
伝子受容菌がサツカロミセス・セレビシエである
からである。即ち両者は、ともにサツカロミセス
属に属し、遺伝学的に近縁関係にあるためサツカ
ロミセス・ジアスタテイカスのグルコアミラーゼ
遺伝子が、サツカロミセス・セレビシエによつて
も発現し、遺伝子産物の産生が予測されるのであ
る。グルコアミラーゼ遺伝子の給源として、サツ
カロミセス・ジアスタテイカス以外に、アスペル
ギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、リ
ゾプス・デルマア(Rhizopus delemar)などの
糸状菌が考えられるが、生物学的近縁度が低く、
これら菌株のグルコアミラーゼ遺伝子をサツカロ
ミセス・セレビシエで発現させることは、極めて
困難であると考えられる。 このように、本発明者等は、遺伝子組換えの手
法により、澱粉を基質として、直接アルコール発
酵に使用し得る工業用菌株の育種と目標として鋭
意研究を行い、サツカロミセス・ジアスタテイカ
スをグルコアミラーゼ遺伝子のクローニングに成
功し、該遺伝子の構造を決定し、さらに該遺伝子
をサツカロミセス・セレビシエに導入して得られ
た形質転換株が、澱粉からのアルコール直接発酵
能を有することを確認した。この結果は、酵母系
におけるグルコアミラーゼ遺伝子のクローニング
に関するはじめての成功例であり、グルコースか
ら、アルコールを直接発酵させるという多年求め
られてきた技術体系の実施に向けて1つの可能な
方法を提供するという意味で、その意義は極めて
大きい。さらに本発明によつて得られたもう1つ
の大きな利点はサツカロミセス・ジアスタテイカ
スのグルコアミラーゼが、菌体外分泌酵素である
点にある。即ち、本発明によつて得られたグルコ
アミラーゼをコードするDNA配列は、グルコア
ミラーゼ自身を酵母菌体外に多量に分泌、蓄積さ
せることを勿論可能にするが、さらに酵母系にお
ける遺伝子の強力な発現を行い得るプロモーター
領域およびリボゾーム結合領域、および蛋白の効
率的な分泌を行う分泌に関与する領域を有するも
のであるので、このDNA配列の下流に所望の異
種遺伝子、例えば、インターフエロン、成長ホル
モン、インターロイキン、神経成長因子、カリク
レイン、プラスミノーゲンアクテベーター、ある
いは、その他と生理活性ポリペプチド、または、
酵素等の構造遺伝子を結合することにより酵母菌
を宿主としてこれらの蛋白を菌体外に効率的に分
泌蓄積させる発現分泌ベクターの造成を可能にす
るものである。しかも、本発明によつて得られた
DNA配列が、サツカロミセス属以外の酵母にお
いても、有効であることは、該DNA配列を用い
て実施例に示すように、シゾサツカロミセス・ポ
ンベ(Schizosaccharomyces pombe)を形質転
換して得られた形質転換株が、サツカロミセス・
ジアスタテイカス由来のグルコアミラーゼを産生
することから、明らかである。即ち、本発明によ
つて得られたDNA配列は、サツカロミセス属以
外の酵母系においても、異種遺伝子産物の発現、
分泌ベクターの造成に使用し得るものである。 また、本発明のDNA配列のうち、遺伝子の発
現に関与する部分であるプロモーター領域ならび
にリボゾーム結合領域の塩基配列、および蛋白の
分泌に関与する領域の塩基配列を各々単独で、あ
るいは、いずれかを組み合わせた形で取り出して
使用する場合、あるいは、蛋白をコードする領域
の塩基配列について、指定するアミノ酸配列が異
ならないように置換して得たDNA配列も更に、
本発明のDNA配列の任意の部分の塩基を他のも
のと置換したり、新たに塩基を挿入したり、また
は削除した場合、あるいは塩基配列の一部を転位
させた場合に得られる誘導体も、遺伝子の発現、
および分泌に良好な結果を与えることが想定さ
れ、本発明の範疇に入るものである。 以下、具体例によつて本発明のDNA配列を含
むサツカロミセス・ジアスタテイカスのグルコア
ミラーゼ遺伝子の取得方法および本発明のDNA
塩基配列の決定および、本発明のDNAを用いて
形質転換して得られる澱粉資化性を有するサツカ
ロミセス・セレビシエによる澱粉からアルコール
直接醗酵および、本発明のDNAによるサツカロ
ミセス属以外の酵母の形質転換例について説明す
る。 実施例 1 サツカロミセス・ジアスタテイカス染色体遺伝
子のジーン・ライブラリーの作製 サツカロミセス・ジアスタテイカス
(Saccharomyces diastaticus)5106−9A株
(STA1)(FERMP−7641)をYEPD培地(1%
酵母エキス、2%ペプトンおよび2%グルコー
ス)2を用いて28℃で2日間培養し、 得られた菌体からR.W.Davis等の方法(R.W.
Davis et al;Advancud bacteriol genetics、
Cold Spring HarborLaboratory1980)により染
色体DNAを抽出して、1.0mgのDNAを得た。こ
の染色体DNA200μgを制限酵素Sau3AI(宝酒造
製)を用いて、37℃部分分解し、得られた反応物
全量から蔗糖密度勾配(10〜40%)遠心法によ
り、約5kb以上のDNAを分画し、回収した。該
回収DNAを50mMトリス−塩酸緩衝液(PH7.5)
100μに溶解し、供与染色体断片とした。この
供与染色断片を、本発明者等が作製した酵母−大
腸菌シヤトルベクタ−pKS2−20(K.Suzuki、Y.
Imai、I.Yamashita and S.Fukui;Journal of
Bocteriolology 155、747〜754、(1983))の
Bma H I切断部位にT4リガーゼ(宝酒造製)
を用いて文献記載の方法(M.Carlson and D.
Botstein;Cell、28、145(1982))による結合し
た。得られた融合プラスミドを100mM塩化カル
シウムを用いる方法(S.N.Cohn A.C.Y.Chang
and L.Hsu;proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69、
2110〜2114(1972)によりE.ColiJA221(Leu-、
AmpS)(NRRLNo.15014)に導入し、アンピシリ
ン耐性を示す形質転換株約20000株を取得した。
これらの20000株の形質転換株の各々から、ラピ
ツト法(David S.Holmes and Michael
Quigley;Analytical Biochemistry 144、193、
1981)によりプラスミドDNAを抽出し、混合し
て、ジーン・ライブラリーとした。 実施例 2STA1遺伝子を含むプラスミド
pSTA1の分離 実施例1で得たジーンライブラリーDNA100μ
を用いてサツカロミセス・セレビシエ338
(Leu-、Sta-)(Saccharomyces cerevisiae、
FERMP−7637)をJ.D.Beggsの方法(Nature
(London)275、104〜109、1978)により形質転
換して選択培地にプレーテイングしLeu+、Sta+
を示す形質転換株を得た。約30000株のLeu+を示
す形質転換株からコロニーの回りにグルコアミラ
ーゼの産生を示すハローを生じる形質転換株
(Sta+)5株が得られた。なお、選択培地の組成
は1%グルコース、2%可溶澱粉、1.2Mソルビ
トール、20mg/mlヒスチジン、30mg/mlリジン、
2%寒天である。コロニーの回りにハローを生じ
た5株の形質転換株のうちの1株をYEPDの培地
10mlで28℃で24時間培養して得られる菌体から文
献記載の方法(H.C.Birnboim and J.Doly;
Nucleic Acids Res.;)によりプラスミドを抽
出した所、該形質転換株から1μgのプラスミド
DNAが得られた。このプラスミドDNAを用いて
実施例1に記載したのと同じ方法により、E.coli
JA221株を形質転換し、Leu+、Amr、Tcを示
す形質転換化株を得た。この形質転換株をLB
(0.5%酵母エキス、1%ペプトン、0.5%NaCl)
の培地5mlを用いて37℃、16時間培養して得られ
る菌体から、プラスミドを上記Birnboim and
Dolyの方法により分離、精製したところ1μgの
プラシミドDNAが得られた。このプラスミド
DNAを用いて、本実施例の最初に記載した方法
により、サツカロミセス・セレビシエ338(Leu-、
Sta-)を形質転換した所、Sta+を示す形質転換
株を得られたので、このプラスミドをpSTA1と
名づけた。pSTA1の制限酵素地図は第1図に示
される。pSTA1は第1図に示すように2.8kbの挿
入DNAを有し、制限酵素Bam HIサイトが1ケ
所、Sal Iサイトが2ケ所、Pvu サイトが2
ケ所、Hind サイト、Eco RIサイト、Pst I
サイトが各1ケ所存在していた。 実施例 3分泌酵素グルコアミラーゼ遺伝子
STA1の塩基配列の決定 実施例2で得られたpSTA1を有する形質転換
株(E.coli JA221−pSTA1、FERMP−7640)
をLB培地2を用いて37℃で16時間培養した菌
体から実施例2の示した方法により、プラスミド
の調整を行つた結果1mgの精製プラスミドが得ら
れた。このプラスミドの制限酵素Sal Iおよび
Bam HIで部分分解し、アガロース電気泳動で、
約2.8kbの挿入DNA断片を精製、分離した。この
挿入DNA断片についてMaxamとGilbertの方法
(A.Maxam and W.Galbert、proc.Natl.Acad.
SciU.S.A.74、560(1977))により、第2図に示し
た塩基配列決定のための戦略図によつて、全塩基
配列を決定した。その結果、次に示すDNA塩基
配列が、得られ、この塩基配列はサツカロミセ
ス・ジアスタテイカスのグルコアミラーゼ遺伝子
の発現、分泌に必要なRNAポリメラーゼの結合
部位、リボゾームの結合部位(RBS)、シグナル
配列(Signal sequence)おおび分泌された成熟
蛋白に対応するDNA配列、停止配列(Stop)さ
らに下流には、ポリAシグナル(Poly A
signal)を含むことが判明した。 実施例 4 形質転換株サツカロミセス・セレビシエ338−
pSTA1は、サツカロミセス・ジアスタテイカス
5106−9A株(STA1)と同じグルコアミラーゼ
を分泌する。 実施例2で得られたpSTA1を用いて実施例2
で示したのと同じ方法により、サツカロミセス・
セレビシエ338株の形質転換して得られる株サツ
カロミセス・セレビシエ338−pSTA1
(Saccharomyces cerevisiae、FERMP−7638)
をYPS培地(1%イースト・エキス、2%ペプ
トン、3%可溶性澱粉)1を用いて28℃で3日
間培養した。この培養液上清のグルコアミラーゼ
活性を文献記載の方法(I.Yamashita and S.
Fukui、Agric.Biol.Cmem;47、2689、1983)に
より測定しDNA供与株であるサツカロミセス・
ジアスタテイカス5106−9A株由来のグルコアミ
ラーゼと比較した。その結果、サツカロミセス・
セレビシエ338−pSTA1株は第1表に示すように
至適温度、至適PH、熱安定性に関し、サツカロミ
セス・ジアスタテイカス5106−9A株由来のもの
と全く同じ性質を示すグルコアミラーゼを産生、
分泌し、しかもその産生量は、1.0×106単位1
に達し、サツカロミセス・ジアスタテイカス5106
−9A株の産生、分泌量の10倍以上であつた。さ
らに、両菌株由来の精製酵素をエンドグリコシダ
ーゼH(Endo H、生化学工業製)で処理して、
得られペプチドの分子量をSDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法で比較するといずれのグルコ
アミラーゼも41000ダルトンを示した。また、サ
ツカロミセス・ジアスタテイカス5106−9A株の
分泌するグルコアミラーゼのペプチド部分を抗原
とするモノクローナル抗体を調整し、サツカロミ
セス・セレビシエ338−pSTA1のグルソアミラー
ゼと反応させたところ、強い沈降反応がみられ
た。
【表】
*1 少なくとも、2時間以上にわたつて活性
の減少はみられなかつた。
実施例 5サツカロミセス・セレビシエ338−
pSTA1による澱粉を基質としたエタノールの
生産 サツカロミセス・セレビシエ338−pSTA1を
YPS倍地(1%イースト・エキス、2%ペプト
ン、3%可溶性澱粉)5mlを用いて、20℃で3日
間静置培養し、培地中のエタノース量とグルコー
ス量を高速液体クロカトグラフイー(ポンプ、日
立製;カラム、Showdex:Ionpak801;緩衝液、
5%リン酸液;デイテクター、屈折計RI−8東
洋ソーダ)で測定した。その結果培地1中にエ
タノール9.76gとグルコース0.32gの生成が認め
られ、消費澱粉のほとんどすべてが、エタノール
に転換されていた。 実施例 6 本発明のDNAを含むプラムミドpSTA1による
***酵母シゾサツカロミセス・ポンベの形質転換
株による澱粉からのグルコアミラーゼの産生、分
泌 実施例2で得られたpSTA1の用いて、実施例
2で示した方法により、シゾサツカロミセス・ポ
ンベHM123(h-、leu1) (Schizosaccharomyces pombe)FERMP−
7639の形質転換を行い得られた転換株を、実施例
4に記載した方法により、培養して、産生分泌さ
れたグルコアミラーゼの性質を検討したところ形
質転換株は培地1中に1.5×106単位のSTA1遺
伝子由来のグルコアミラーゼを産生、分泌してい
ることを確認した。この結果は本発明のDNA配
列およびpSTA1はサツカロミセス属以外の酵母
であるシゾサツカロミセス属においても、機能す
ることを示し、本発明のDNA配列が、酵母にお
ける発現、分泌ベクターの造成に使用し得ること
を意味する。
の減少はみられなかつた。
実施例 5サツカロミセス・セレビシエ338−
pSTA1による澱粉を基質としたエタノールの
生産 サツカロミセス・セレビシエ338−pSTA1を
YPS倍地(1%イースト・エキス、2%ペプト
ン、3%可溶性澱粉)5mlを用いて、20℃で3日
間静置培養し、培地中のエタノース量とグルコー
ス量を高速液体クロカトグラフイー(ポンプ、日
立製;カラム、Showdex:Ionpak801;緩衝液、
5%リン酸液;デイテクター、屈折計RI−8東
洋ソーダ)で測定した。その結果培地1中にエ
タノール9.76gとグルコース0.32gの生成が認め
られ、消費澱粉のほとんどすべてが、エタノール
に転換されていた。 実施例 6 本発明のDNAを含むプラムミドpSTA1による
***酵母シゾサツカロミセス・ポンベの形質転換
株による澱粉からのグルコアミラーゼの産生、分
泌 実施例2で得られたpSTA1の用いて、実施例
2で示した方法により、シゾサツカロミセス・ポ
ンベHM123(h-、leu1) (Schizosaccharomyces pombe)FERMP−
7639の形質転換を行い得られた転換株を、実施例
4に記載した方法により、培養して、産生分泌さ
れたグルコアミラーゼの性質を検討したところ形
質転換株は培地1中に1.5×106単位のSTA1遺
伝子由来のグルコアミラーゼを産生、分泌してい
ることを確認した。この結果は本発明のDNA配
列およびpSTA1はサツカロミセス属以外の酵母
であるシゾサツカロミセス属においても、機能す
ることを示し、本発明のDNA配列が、酵母にお
ける発現、分泌ベクターの造成に使用し得ること
を意味する。
第1図は、pSTA1の制限酵素地図を示す。第
2図は、pSTA1の挿入DNAの塩基配列決定のた
めの戦略図を示す。
2図は、pSTA1の挿入DNAの塩基配列決定のた
めの戦略図を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 サツカロミセス・ジアスタテイカスのグルコ
アミラーゼ遺伝子の発現に関与するプロモーター
領域、リボゾーム結合領域、蛋白の菌体外への分
泌に関与する領域および酵素蛋白のアミノ酸配列
をコードする領域に含むDNA配列が下記の塩基
配列であることを特徴とするDNA配列。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59116636A JPS60262593A (ja) | 1984-06-08 | 1984-06-08 | 酵母グルコアミラ−ゼ遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59116636A JPS60262593A (ja) | 1984-06-08 | 1984-06-08 | 酵母グルコアミラ−ゼ遺伝子 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS60262593A JPS60262593A (ja) | 1985-12-25 |
JPH0569510B2 true JPH0569510B2 (ja) | 1993-10-01 |
Family
ID=14692103
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59116636A Granted JPS60262593A (ja) | 1984-06-08 | 1984-06-08 | 酵母グルコアミラ−ゼ遺伝子 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS60262593A (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0260404B1 (en) * | 1986-08-21 | 1995-05-31 | VAN DEN BERG, Robert | Amylolytic enzymes producing microorganisms constructed by recombinant DNA technology and their use for fermentation processes |
-
1984
- 1984-06-08 JP JP59116636A patent/JPS60262593A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
AGRICULTURAL AND BIOLOGICAL CHEMISTRY=1983 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS60262593A (ja) | 1985-12-25 |
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