JPH0634720B2 - 蛋白の発現と分泌に関与する領域を含むｄｎａ配列 - Google Patents
蛋白の発現と分泌に関与する領域を含むｄｎａ配列Info
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- JPH0634720B2 JPH0634720B2 JP59065156A JP6515684A JPH0634720B2 JP H0634720 B2 JPH0634720 B2 JP H0634720B2 JP 59065156 A JP59065156 A JP 59065156A JP 6515684 A JP6515684 A JP 6515684A JP H0634720 B2 JPH0634720 B2 JP H0634720B2
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- protein
- region
- bacillus
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
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- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は遺伝子の発現とその結果合成された蛋白の分泌
に関与する領域を含むDNA配列に関する。本発明は特に
バチルス属細菌で大量に発現分泌される中性プロテアー
ゼの遺伝子に由来する遺伝子の発現と蛋白の分泌に関与
する領域を含むDNA配列に関する。
に関与する領域を含むDNA配列に関する。本発明は特に
バチルス属細菌で大量に発現分泌される中性プロテアー
ゼの遺伝子に由来する遺伝子の発現と蛋白の分泌に関与
する領域を含むDNA配列に関する。
遺伝子の発現に関する領域としてはRNAポリメラーゼが
認識し結合する領域である−３５および−１０領域を含
むプロモーター領域、およびRNAポリメラーゼにより合
成されたmRNAがリボソームと結合するための塩基配列を
指定するリボソーム結合領域がある。発現の効率に関し
てそれらの領域の塩基配列は極めて重要であるが、それ
のみならずそれらの塩基配列間の距離即ち塩基数も非常
に重要であることが知られている（Moran，Jr.et al.，
Mol.gen.Genet.186 339（1982））。
認識し結合する領域である−３５および−１０領域を含
むプロモーター領域、およびRNAポリメラーゼにより合
成されたmRNAがリボソームと結合するための塩基配列を
指定するリボソーム結合領域がある。発現の効率に関し
てそれらの領域の塩基配列は極めて重要であるが、それ
のみならずそれらの塩基配列間の距離即ち塩基数も非常
に重要であることが知られている（Moran，Jr.et al.，
Mol.gen.Genet.186 339（1982））。
また、発現の結果合成された蛋白の菌体内から菌体外へ
の分泌には、成熟蛋白として菌体外に分泌された蛋白の
アミノ末端より上流のポリペプチドを指定する領域が重
要である。該ポリペプチドは、菌体内で合成された新生
蛋白においては成熟蛋白のアミノ末端上流に結合した形
で存在しているが、該ポリペプチドがペプチダーゼで切
りとられることに連動して、新生蛋白は菌体外へ分泌さ
れ成熟蛋白となる。従つて該ポリペプチドを指定する遺
伝子の領域は発現された蛋白の分泌に必須の領域であ
る。
の分泌には、成熟蛋白として菌体外に分泌された蛋白の
アミノ末端より上流のポリペプチドを指定する領域が重
要である。該ポリペプチドは、菌体内で合成された新生
蛋白においては成熟蛋白のアミノ末端上流に結合した形
で存在しているが、該ポリペプチドがペプチダーゼで切
りとられることに連動して、新生蛋白は菌体外へ分泌さ
れ成熟蛋白となる。従つて該ポリペプチドを指定する遺
伝子の領域は発現された蛋白の分泌に必須の領域であ
る。
近年の分子生物学の著しい発展により異種の生物由来の
遺伝子を適当なベクターと連結し宿主菌へ導入すること
により異種蛋白を宿主菌で産生させることが可能となつ
た。
遺伝子を適当なベクターと連結し宿主菌へ導入すること
により異種蛋白を宿主菌で産生させることが可能となつ
た。
宿主菌としてバチルス属細菌を用いることは、該細菌が
多量の蛋白を菌体外に分泌する性質があり、病原性を有
せず永い間醗酵工業で用いられた経験があること（Deba
bov，“The Molecular Biology of the Bacilli”１ 3
32（1982），Dubnau，D.A.編Academic Press）から工業
的に重要な意義を有するものである。
多量の蛋白を菌体外に分泌する性質があり、病原性を有
せず永い間醗酵工業で用いられた経験があること（Deba
bov，“The Molecular Biology of the Bacilli”１ 3
32（1982），Dubnau，D.A.編Academic Press）から工業
的に重要な意義を有するものである。
しかしながらバチルス属細菌を宿主として異種遺伝子を
発現させる場合は、バチルス属細菌のRNAポリメラーゼ
およびリボソームがプロモーター領域およびリボソーム
結合領域の認識に関して厳格な特異性をもつため（堀之
内末治，蛋白質核酸 酵素281468（1983））、それらの
領域がバチルス属由来のものである必要がある（Goldfa
rb，D，S，etal.，Nature293 309（1981））。
発現させる場合は、バチルス属細菌のRNAポリメラーゼ
およびリボソームがプロモーター領域およびリボソーム
結合領域の認識に関して厳格な特異性をもつため（堀之
内末治，蛋白質核酸 酵素281468（1983））、それらの
領域がバチルス属由来のものである必要がある（Goldfa
rb，D，S，etal.，Nature293 309（1981））。
このような観点からバチルス属細菌のファージのプロモ
ーター領域およびリボソーム結合領域を含むDNA配列と
異種遺伝子とを結合してバチルス属細菌を宿主とした異
種蛋白の産生の試みがなされている（Williams，D.M.et
al.，Gene16 199（1981））。
ーター領域およびリボソーム結合領域を含むDNA配列と
異種遺伝子とを結合してバチルス属細菌を宿主とした異
種蛋白の産生の試みがなされている（Williams，D.M.et
al.，Gene16 199（1981））。
このようにしてバチルス属細菌において異種遺伝子を発
現させた場合、その結果合成された蛋白を菌体外へ分泌
させることは産生蛋白の回収および精製の工程を容易な
ものとする点で工業上の意義が大である。従つてバチル
ス属細菌の菌体外分泌酵素の発現および分泌に関与する
領域を含むDNA配列は、バチルス属細菌を宿主とした異
種蛋白の産生および分泌に意義を有するものであるが、
実用上の観点からはプロモーター領域、リボソーム結合
領域および蛋白分泌に関与する領域を含むDNA配列を得
る場合、大量発現および分泌と言う点で菌体外に短時間
のうちに多量に分泌蓄積される菌体外酵素遺伝子に由来
するものであることが望ましい。
現させた場合、その結果合成された蛋白を菌体外へ分泌
させることは産生蛋白の回収および精製の工程を容易な
ものとする点で工業上の意義が大である。従つてバチル
ス属細菌の菌体外分泌酵素の発現および分泌に関与する
領域を含むDNA配列は、バチルス属細菌を宿主とした異
種蛋白の産生および分泌に意義を有するものであるが、
実用上の観点からはプロモーター領域、リボソーム結合
領域および蛋白分泌に関与する領域を含むDNA配列を得
る場合、大量発現および分泌と言う点で菌体外に短時間
のうちに多量に分泌蓄積される菌体外酵素遺伝子に由来
するものであることが望ましい。
本発明者らはバチルスアミロリキファシエンスの中性プ
ロテアーゼが該細菌で最も短時間のうちに多量に分泌さ
れる蛋白であることに着目し、該中性プロテアーゼ遺伝
子をバチルスズブチリスを宿主としてクローニングする
ことに成功したが、その際培養開始後８時間目でバチル
スアミロリキファシエンスの５０倍にも及ぶ該中性プロ
テアーゼを宿主菌が菌体外に分泌蓄積することを見出し
た。そこで該中性プロテアーゼ遺伝子の強力なプロモー
ター領域、リボソーム結合領域および蛋白分泌に関与す
る領域を含むDNA配列の構造解析を試み、その塩基配列
を明らかにして本発明を完成した。
ロテアーゼが該細菌で最も短時間のうちに多量に分泌さ
れる蛋白であることに着目し、該中性プロテアーゼ遺伝
子をバチルスズブチリスを宿主としてクローニングする
ことに成功したが、その際培養開始後８時間目でバチル
スアミロリキファシエンスの５０倍にも及ぶ該中性プロ
テアーゼを宿主菌が菌体外に分泌蓄積することを見出し
た。そこで該中性プロテアーゼ遺伝子の強力なプロモー
ター領域、リボソーム結合領域および蛋白分泌に関与す
る領域を含むDNA配列の構造解析を試み、その塩基配列
を明らかにして本発明を完成した。
本発明のDNA配列は第１図に示すとおりで、この配列の
うちプロモーター領域に見出されるRNAポリメラーゼの
認識および結合のための塩基配列である−３５領域およ
び−１０領域は本発明の場合はそれぞれTTGCAGおよびTA
TTATAで共通とされる配列（堀之内末治，蛋白質 核酸
酵素28 1468（1983））に類似している。
うちプロモーター領域に見出されるRNAポリメラーゼの
認識および結合のための塩基配列である−３５領域およ
び−１０領域は本発明の場合はそれぞれTTGCAGおよびTA
TTATAで共通とされる配列（堀之内末治，蛋白質 核酸
酵素28 1468（1983））に類似している。
またリボソーム結合領域の塩基配列は本発明の場合、AA
AGGGGGでバチルスズブチリスのrRNAと完全に相補的な配
列であるAAAGGAGG（Mclaughlin，J.R.，J.Biol.Chem256
11283（1981））と一塩基しか異ならないものである。
AGGGGGでバチルスズブチリスのrRNAと完全に相補的な配
列であるAAAGGAGG（Mclaughlin，J.R.，J.Biol.Chem256
11283（1981））と一塩基しか異ならないものである。
従つて本発明のDNA配列プロモーター領域およびリボソ
ーム結合領域はRNAポリメラーゼおよびリボソームが強
力に結合し強い発現を行いうる型のものである。
ーム結合領域はRNAポリメラーゼおよびリボソームが強
力に結合し強い発現を行いうる型のものである。
また本発明のDNA配列のうち菌体外に蓄積される中性プ
ロテアーゼ成熟蛋白のアミノ末端より上流部分のポリペ
プチドをコードする領域は核中性プロテアーゼの菌体外
分泌の際に必須の領域、即ち蛋白の分泌に関与する領域
を含むが、本発明のDNA配列を有するバチルスアミロリ
キファシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子をバチルスズ
ブチリスを宿主としてクローニングした場合は極めて多
量の中性プロテアーゼが短時間のうちに分泌蓄積される
ことから本発明の蛋白分泌に関与する領域はバチルス属
細菌の種を超えて効果的なものであることが明らかであ
る。
ロテアーゼ成熟蛋白のアミノ末端より上流部分のポリペ
プチドをコードする領域は核中性プロテアーゼの菌体外
分泌の際に必須の領域、即ち蛋白の分泌に関与する領域
を含むが、本発明のDNA配列を有するバチルスアミロリ
キファシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子をバチルスズ
ブチリスを宿主としてクローニングした場合は極めて多
量の中性プロテアーゼが短時間のうちに分泌蓄積される
ことから本発明の蛋白分泌に関与する領域はバチルス属
細菌の種を超えて効果的なものであることが明らかであ
る。
以上述べたように本発明のDNA配列は遺伝子の強力な発
現とその結果合成される蛋白の効率的な分泌に関与する
もので、バチルス属微生物による異種遺伝子産物である
蛋白の製造に関し大きな意義を有するものである。
現とその結果合成される蛋白の効率的な分泌に関与する
もので、バチルス属微生物による異種遺伝子産物である
蛋白の製造に関し大きな意義を有するものである。
即ち、本発明のDNA配列は遺伝子の強力な発現を行いう
るプロモーター領域およびリボソーム結合領域、および
蛋白の効率的な分泌を行う分泌に関与する領域を有する
ものであるので、このDNA配列の下流に所望の異種遺伝
子、例えばインターフェロン、成長ホルモン、インター
ロイキン、神経成長因子、カリクレイン、プラスミノー
ゲンアクチベーター或はその他の生理活性ポリペプチド
または酵素等の構造遺伝子を結合することにより、バチ
ルス属細菌を宿主としてこれらの蛋白を菌体外に効率的
に分泌蓄積させることが可能となる。
るプロモーター領域およびリボソーム結合領域、および
蛋白の効率的な分泌を行う分泌に関与する領域を有する
ものであるので、このDNA配列の下流に所望の異種遺伝
子、例えばインターフェロン、成長ホルモン、インター
ロイキン、神経成長因子、カリクレイン、プラスミノー
ゲンアクチベーター或はその他の生理活性ポリペプチド
または酵素等の構造遺伝子を結合することにより、バチ
ルス属細菌を宿主としてこれらの蛋白を菌体外に効率的
に分泌蓄積させることが可能となる。
また本発明のDNA配列のうち遺伝子の発現に関与する部
分であるプロモーター領域およびリボソーム結合領域の
塩基配列、および蛋白の分泌に関与する領域の塩基配列
を夫々単独で、あるいはいずれかを組合せた形でとり出
して使用する場合或はその塩基配列を合成の手法で得て
使用する場合も、遺伝子の発現または分泌に良好な結果
を与えるものであり異種遺伝子由来の蛋白の製造に大き
な意義を有するものである。
分であるプロモーター領域およびリボソーム結合領域の
塩基配列、および蛋白の分泌に関与する領域の塩基配列
を夫々単独で、あるいはいずれかを組合せた形でとり出
して使用する場合或はその塩基配列を合成の手法で得て
使用する場合も、遺伝子の発現または分泌に良好な結果
を与えるものであり異種遺伝子由来の蛋白の製造に大き
な意義を有するものである。
また本発明のリボソーム結合領域から下流の蛋白をコー
ドする領域の塩基配列について指定するアミノ酸配列が
異ならないように置換して得たDNA配列が発現して合成
される蛋白は本発明のDNA配列によつてコードされる蛋
白と全く同じであり、従つてその有する機能も何ら異な
るものではないことは明白である。このような塩基配列
は当然本発明の範疇に入る。更に本発明のDNA配列の任
意の部分の塩基を他のものと置換したり、新たに塩基を
挿入したりまたは削除した場合、或は塩基配列の一部を
転移させた場合に得られる誘導体についても、本発明の
主眼となるプロモーター領域或はリボソーム結合領域ま
たは蛋白の分泌に関与する領域の特性、即ち遺伝子の強
力な発現または蛋白の効率的な分泌を保持したものは本
発明の範疇に入るものである。
ドする領域の塩基配列について指定するアミノ酸配列が
異ならないように置換して得たDNA配列が発現して合成
される蛋白は本発明のDNA配列によつてコードされる蛋
白と全く同じであり、従つてその有する機能も何ら異な
るものではないことは明白である。このような塩基配列
は当然本発明の範疇に入る。更に本発明のDNA配列の任
意の部分の塩基を他のものと置換したり、新たに塩基を
挿入したりまたは削除した場合、或は塩基配列の一部を
転移させた場合に得られる誘導体についても、本発明の
主眼となるプロモーター領域或はリボソーム結合領域ま
たは蛋白の分泌に関与する領域の特性、即ち遺伝子の強
力な発現または蛋白の効率的な分泌を保持したものは本
発明の範疇に入るものである。
以下具体例によつて本発明のDNA配列を含むバチルスア
ミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子を得る
方法および、本発明のDNA配列の塩基配列の決定につい
て説明する。
ミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子を得る
方法および、本発明のDNA配列の塩基配列の決定につい
て説明する。
実施例１ （バチルスアミロリキファシエンスからの染色体の調製
および制限酵素による切断） バチルスアミロリキファシエンスＦ株（ATCC23350）を
肉汁培地（Difco社製ニュートリエントブロス）２を
用いて３７℃で１５時間培養した後集菌し、Saito−Miu
raの方法（Saito，H.，and Miura，Ｋ−Ｉ．，Biochim
Biophys．Acta72 619（1963））に従い５mgの精製染色
体DNAを得た。この染色体DNA５００μｇを制限酵素Sau3
AI（宝酒造製）１００単位を用い３７℃で５分間インキ
ュベートした。反応系の組成は１０mMトリスー塩酸緩衝
液（pH7.5）、７mMMgCl2、１００mMNaClである。
および制限酵素による切断） バチルスアミロリキファシエンスＦ株（ATCC23350）を
肉汁培地（Difco社製ニュートリエントブロス）２を
用いて３７℃で１５時間培養した後集菌し、Saito−Miu
raの方法（Saito，H.，and Miura，Ｋ−Ｉ．，Biochim
Biophys．Acta72 619（1963））に従い５mgの精製染色
体DNAを得た。この染色体DNA５００μｇを制限酵素Sau3
AI（宝酒造製）１００単位を用い３７℃で５分間インキ
ュベートした。反応系の組成は１０mMトリスー塩酸緩衝
液（pH7.5）、７mMMgCl2、１００mMNaClである。
反応後１μｇのDNAを供試し0.7％アガロースゲル電気泳
動により調べた結果、本反応者は２kb〜８kbのサイズの
DNAフラグメントを主とする供与染色体の部分切断物で
あることが認められた。そこで本反応物の残り全量を0.
7％低融点アガロースゲル電気泳動により９０Ｖ３時間
泳動し約1.5kb〜９kb部分のゲルを切り出し、フェノー
ル抽出およびクロロホルム抽出により精製しエタノール
沈殿によりDNAを回収した。該回収DNAを５０mMトリース
塩酸緩衝液（pH7.5）２００μに溶解し供与染色体断
片として以下の実験に供した。
動により調べた結果、本反応者は２kb〜８kbのサイズの
DNAフラグメントを主とする供与染色体の部分切断物で
あることが認められた。そこで本反応物の残り全量を0.
7％低融点アガロースゲル電気泳動により９０Ｖ３時間
泳動し約1.5kb〜９kb部分のゲルを切り出し、フェノー
ル抽出およびクロロホルム抽出により精製しエタノール
沈殿によりDNAを回収した。該回収DNAを５０mMトリース
塩酸緩衝液（pH7.5）２００μに溶解し供与染色体断
片として以下の実験に供した。
実施例２ （供与染色体断片とベクターとの結合および形質転換） 実施例１で得られた供与染色体断片は、次に制限酵素Ba
mＨＩで完全に切断して大腸菌アルカリ性ホスファター
ゼで末端リン酸エステルを加水分解したプラスミドPUB1
10に結合した。PUB110のBamＨＩ処理はPUB110１００μ
ｇ、BamＨＩ（宝酒造製）５０単位で３７℃４時間のイ
ンキュベーションで行つた。反応系の組成は１０mMトリ
スー塩酸緩衝液（pH8.0）、７mM MgCl2、100mM NaCl、
２mM２−メルカプトエタノール、0.01％ウシ血清アルブ
ミンである。
mＨＩで完全に切断して大腸菌アルカリ性ホスファター
ゼで末端リン酸エステルを加水分解したプラスミドPUB1
10に結合した。PUB110のBamＨＩ処理はPUB110１００μ
ｇ、BamＨＩ（宝酒造製）５０単位で３７℃４時間のイ
ンキュベーションで行つた。反応系の組成は１０mMトリ
スー塩酸緩衝液（pH8.0）、７mM MgCl2、100mM NaCl、
２mM２−メルカプトエタノール、0.01％ウシ血清アルブ
ミンである。
得られたBamＨＩ切断PUB110はフェノール抽出を３回行
い、エタノール沈殿で回収した。回収PUB110は次に大腸
菌アルカリ性ホスファターゼにより末端リン酸エステル
結合を加水分解した。反応系の組成は大腸菌アルカリ性
ホスファターゼＡ１９（宝酒造製）５単位、0.1Ｍロリ
ース塩酸緩衝液（pH8.0）でインキュベーションは６５
℃で４時間行つた、その後フェノール抽出を３回行つて
エタノール沈殿によりPUB110を回収した。回収PUB110は
１００μの５０mMトリース塩酸緩衝液（pH7.5）で溶
解した。
い、エタノール沈殿で回収した。回収PUB110は次に大腸
菌アルカリ性ホスファターゼにより末端リン酸エステル
結合を加水分解した。反応系の組成は大腸菌アルカリ性
ホスファターゼＡ１９（宝酒造製）５単位、0.1Ｍロリ
ース塩酸緩衝液（pH8.0）でインキュベーションは６５
℃で４時間行つた、その後フェノール抽出を３回行つて
エタノール沈殿によりPUB110を回収した。回収PUB110は
１００μの５０mMトリース塩酸緩衝液（pH7.5）で溶
解した。
かくして得られたBamＨＩおよび大腸菌アルカリ性ホス
ファターゼで処理したPUB110と実施例１で得られた供与
染色体断片との結合にはT4リガーゼ（宝酒造製）を用い
た。反応には供与染色体断片５０μ、PUB110２０μ
を使用した。反応系の組成はT4リガーゼ５単位、６６mM
トリース塩酸緩衝液（pH7.6）、6.6mM MgCl2、10mMジチ
オスライトール１mM ATPである。反応は１５℃で４時間
行つた。反応後反応液から0.1μｇDNAに相当する量を抜
きとり、0.7％アガロース電気泳動を行つた結果ベクタ
ーであるPUB110と供与染色体が結合し組換え体DNA分子
となつていることが認められた。
ファターゼで処理したPUB110と実施例１で得られた供与
染色体断片との結合にはT4リガーゼ（宝酒造製）を用い
た。反応には供与染色体断片５０μ、PUB110２０μ
を使用した。反応系の組成はT4リガーゼ５単位、６６mM
トリース塩酸緩衝液（pH7.6）、6.6mM MgCl2、10mMジチ
オスライトール１mM ATPである。反応は１５℃で４時間
行つた。反応後反応液から0.1μｇDNAに相当する量を抜
きとり、0.7％アガロース電気泳動を行つた結果ベクタ
ーであるPUB110と供与染色体が結合し組換え体DNA分子
となつていることが認められた。
このようにして得られた組換え体DNA分子による形質転
換はchangのプロトプラスト（chang，S.，and Cohen，
S，N.，Mol.Gen.Genet.186111（1978））に従つて実施
した。プロトプラストの再生培地にはカナマイシンを最
終濃度１００μｇ／ｍとなるように加えた。クローニ
ングの宿主菌にはバチルスズブチリス１Ａ２７４株（オ
ハイオ大学バチルスストックセンター保存株）を用い
た。形質転換により得られたカナマイシン耐性株は次に
0.8％カゼインー４０μｇ／ｍカナマイシン含有TBAB
（Difco社製）寒天培地に植継ぎ３７℃で１４時間イン
キュベートしてコロニーのまわりのハロー形成の有無を
調べた。約１万株のカナマイシン耐性形質転換株につい
て調べた結果、１株（＃１５０）はコロニーのまわりに
顕著に大きいハローを形成していた。
換はchangのプロトプラスト（chang，S.，and Cohen，
S，N.，Mol.Gen.Genet.186111（1978））に従つて実施
した。プロトプラストの再生培地にはカナマイシンを最
終濃度１００μｇ／ｍとなるように加えた。クローニ
ングの宿主菌にはバチルスズブチリス１Ａ２７４株（オ
ハイオ大学バチルスストックセンター保存株）を用い
た。形質転換により得られたカナマイシン耐性株は次に
0.8％カゼインー４０μｇ／ｍカナマイシン含有TBAB
（Difco社製）寒天培地に植継ぎ３７℃で１４時間イン
キュベートしてコロニーのまわりのハロー形成の有無を
調べた。約１万株のカナマイシン耐性形質転換株につい
て調べた結果、１株（＃１５０）はコロニーのまわりに
顕著に大きいハローを形成していた。
実施例３ （形質転換株からの組換えDNA分子の調製と供与株の中
性プロテアーゼ遺伝子を含むことの確認） 実施例２で得たハローを形成する形質転換株＃１５０を
シングルコロニー単離して得た大ハロー形成株をペンア
ッセイ培地（Difco社製）５０ｍを用いて３７℃１４
時間培養後集菌した。集菌菌体を５０mMトリース塩酸緩
衝液（pH7.5）、５mM EDTA、５０mM NaClで洗浄した後
アルカリ法（Birnboinm，Ｈ，Ｃ．，and Poly，Ｊ．Nuc
leic Acid Res.71513（1979））に依りプラスミドを調
製した。得られたプラスミドを制限酵素EcoRIおよびBgl
II、BamHIで処理した後0.7％アガロースゲル電気泳動で
調べたところEcoRI、BglIIにより該プラスミドは１箇所
切断され、サイズ6.2kbのものであることおよびBamHIで
は切断されないことが見出された。ベクターとして用い
たPUB110はサイズ4.5kbでEcoRI、BglIIおよびBamHIによ
り１箇所切断されるものである。従つて大ハロー形成形
質転換株から得られたプラスミドはPUB110のBamHI部位
にサイズ約1.7kbの供与染色体断片が挿入した組換えDNA
分子であることが判明した。この組換えDNA分子を用い
て次にバチルスズブチリス１Ａ２０株（オハイオ大学バ
チルスストックセンター保存株）の形質転換をコンピテ
ント法によつて行つた。
性プロテアーゼ遺伝子を含むことの確認） 実施例２で得たハローを形成する形質転換株＃１５０を
シングルコロニー単離して得た大ハロー形成株をペンア
ッセイ培地（Difco社製）５０ｍを用いて３７℃１４
時間培養後集菌した。集菌菌体を５０mMトリース塩酸緩
衝液（pH7.5）、５mM EDTA、５０mM NaClで洗浄した後
アルカリ法（Birnboinm，Ｈ，Ｃ．，and Poly，Ｊ．Nuc
leic Acid Res.71513（1979））に依りプラスミドを調
製した。得られたプラスミドを制限酵素EcoRIおよびBgl
II、BamHIで処理した後0.7％アガロースゲル電気泳動で
調べたところEcoRI、BglIIにより該プラスミドは１箇所
切断され、サイズ6.2kbのものであることおよびBamHIで
は切断されないことが見出された。ベクターとして用い
たPUB110はサイズ4.5kbでEcoRI、BglIIおよびBamHIによ
り１箇所切断されるものである。従つて大ハロー形成形
質転換株から得られたプラスミドはPUB110のBamHI部位
にサイズ約1.7kbの供与染色体断片が挿入した組換えDNA
分子であることが判明した。この組換えDNA分子を用い
て次にバチルスズブチリス１Ａ２０株（オハイオ大学バ
チルスストックセンター保存株）の形質転換をコンピテ
ント法によつて行つた。
コンピテント細胞の調製はAnagnostopoulos−spizizen
の方法（Anagnostopoulos，Ｃ．，and Spizizen，Ｊ．
Ｊ．Bactcriol81741（1961））に従つた。約５μｇの組
換えDNA分子とりこみ後の培養液（１０００μ）は0.8
％カゼイン−４０μｇ／ｍカンナマイシン含有TBAB寒
天培地に５０μずつプレーティングした。得られたカ
ンナマイシン耐性形質転換株の１００％が大ハロー形成
株であつた。そこでこの形質転換株MT−0150（FERMBP−
４２５）をペンアッセイ培地を用いて３７℃で８時間培
養しその培養上清のプロテアーゼ活性を測定した。測定
の方法はカゼイン分解法（「実験農芸化学」P284朝倉出
版（１９７８））に依つた。測定の結果この形質転換株
は、中性プロテアーゼをバチルスアミロリキファシエン
スに比し５０倍も多量に分泌していることが明らかにな
つた。またこの培養上清を抗原としてバチルスアミロリ
キファシエンスおよびバチルスズブチリスの中性プロテ
アーゼに対する抗血清を用いた免疫二重拡散法の結果、
該形質転換株の分泌する中性プロテアーゼは、バチルス
アミロリキファシエンス型のものであることが判明し
た。さらにMT−0510によつて分泌される中性プロテアー
ゼおよびバチルスアミロリキファシエンス、バチルスズ
ブチリス両者の菌体外中性プロテアーゼをそれぞれ培養
上清から回収・精製してアミノ末端のアミノ酸配列を決
定した結果、該形質転換株MT−0150の産生する中性プロ
テアーゼはバチルスズブチリス型ではなく、バチルスア
ミロリキファシエンスのものであることが明らかになつ
た（第２図）。また核形質転換株MT−0150によつて多量
に産生分泌されるバチルスアミロリキファシエンス遺伝
子由来のプロテアーゼの成熟蛋白のアミノ末端がバチル
スアミロリキファシエンスのものと同一であることか
ら、バチルスアミロリキファシエンス中性プロテアーゼ
遺伝子の分泌に関与する領域は、バチルス属の種を超え
て正常に機能するものであることが明らかである。
の方法（Anagnostopoulos，Ｃ．，and Spizizen，Ｊ．
Ｊ．Bactcriol81741（1961））に従つた。約５μｇの組
換えDNA分子とりこみ後の培養液（１０００μ）は0.8
％カゼイン−４０μｇ／ｍカンナマイシン含有TBAB寒
天培地に５０μずつプレーティングした。得られたカ
ンナマイシン耐性形質転換株の１００％が大ハロー形成
株であつた。そこでこの形質転換株MT−0150（FERMBP−
４２５）をペンアッセイ培地を用いて３７℃で８時間培
養しその培養上清のプロテアーゼ活性を測定した。測定
の方法はカゼイン分解法（「実験農芸化学」P284朝倉出
版（１９７８））に依つた。測定の結果この形質転換株
は、中性プロテアーゼをバチルスアミロリキファシエン
スに比し５０倍も多量に分泌していることが明らかにな
つた。またこの培養上清を抗原としてバチルスアミロリ
キファシエンスおよびバチルスズブチリスの中性プロテ
アーゼに対する抗血清を用いた免疫二重拡散法の結果、
該形質転換株の分泌する中性プロテアーゼは、バチルス
アミロリキファシエンス型のものであることが判明し
た。さらにMT−0510によつて分泌される中性プロテアー
ゼおよびバチルスアミロリキファシエンス、バチルスズ
ブチリス両者の菌体外中性プロテアーゼをそれぞれ培養
上清から回収・精製してアミノ末端のアミノ酸配列を決
定した結果、該形質転換株MT−0150の産生する中性プロ
テアーゼはバチルスズブチリス型ではなく、バチルスア
ミロリキファシエンスのものであることが明らかになつ
た（第２図）。また核形質転換株MT−0150によつて多量
に産生分泌されるバチルスアミロリキファシエンス遺伝
子由来のプロテアーゼの成熟蛋白のアミノ末端がバチル
スアミロリキファシエンスのものと同一であることか
ら、バチルスアミロリキファシエンス中性プロテアーゼ
遺伝子の分泌に関与する領域は、バチルス属の種を超え
て正常に機能するものであることが明らかである。
実施例４ （バチルスアミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ
遺伝子の大量調製と塩基配列の決定） 実施例３で得た本発明のDNA配列を有するバチルスズブ
チリスMT−0150株を肉汁培地（Difco社製ニュートリエ
ントブロス）５を用いて３７℃で１４時間培養した菌
体からGryczanの方法（Gryczan，Ｔ．Ｊ．Ｊ．Bacterio
l134318（1978））に従いプラスミドの調製を行つた結
果本発明のDNA配列を有する精製プラスミド（PNP150）
２mgを得た。得られたPNP150のバチルスアミロリキファ
シエンスの中性プロテアーゼ遺伝子を含む挿入DNA断片
について、MaxamとGilbertの方法（Maxam，Ａ．，Gilbe
rt，Ｗ．Proc.Natl.Acad.Sci,USA74560（1977））に従
い塩基配列を決定した。その結果第１図に示すバチルス
アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼのアミノ末
端部分、即ち中性プロテアーゼの構造遺伝子の頭部にあ
たる塩基配列が明らかとなつた。さらにその上流には遺
伝子の発現のために必要なプロモーター領域、即ちRNA
ポリメラーゼの認識とDNAとの結合に必要な−３５およ
び−１０の領域を見ることができる。またそのプロモー
ター領域の下流には蛋白の合成の場であるリボソームと
の結合に必要な領域も見ることができる。該領域の数塩
基から下流は蛋白をコードするオープンリーディングフ
レーンムであつた。該オープンリーディングフレーンム
のうち中性プロテアーゼのアミノ末端から上流の部分は
中性プロテアーゼの分泌の際に切りとられるものである
が、この領域は蛋白の分泌に関与する重要な部分を含む
ものである。
遺伝子の大量調製と塩基配列の決定） 実施例３で得た本発明のDNA配列を有するバチルスズブ
チリスMT−0150株を肉汁培地（Difco社製ニュートリエ
ントブロス）５を用いて３７℃で１４時間培養した菌
体からGryczanの方法（Gryczan，Ｔ．Ｊ．Ｊ．Bacterio
l134318（1978））に従いプラスミドの調製を行つた結
果本発明のDNA配列を有する精製プラスミド（PNP150）
２mgを得た。得られたPNP150のバチルスアミロリキファ
シエンスの中性プロテアーゼ遺伝子を含む挿入DNA断片
について、MaxamとGilbertの方法（Maxam，Ａ．，Gilbe
rt，Ｗ．Proc.Natl.Acad.Sci,USA74560（1977））に従
い塩基配列を決定した。その結果第１図に示すバチルス
アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼのアミノ末
端部分、即ち中性プロテアーゼの構造遺伝子の頭部にあ
たる塩基配列が明らかとなつた。さらにその上流には遺
伝子の発現のために必要なプロモーター領域、即ちRNA
ポリメラーゼの認識とDNAとの結合に必要な−３５およ
び−１０の領域を見ることができる。またそのプロモー
ター領域の下流には蛋白の合成の場であるリボソームと
の結合に必要な領域も見ることができる。該領域の数塩
基から下流は蛋白をコードするオープンリーディングフ
レーンムであつた。該オープンリーディングフレーンム
のうち中性プロテアーゼのアミノ末端から上流の部分は
中性プロテアーゼの分泌の際に切りとられるものである
が、この領域は蛋白の分泌に関与する重要な部分を含む
ものである。
第１図は、バチルスアミロリキファシエンスの中性プロ
テアーゼ遺伝子のプロモーター領域、リボソーム結合領
域および分泌に関与する領域を含む塩基配列を示す図で
あり、そのうち１７９番目から１８４番目は−３５領域
を、同じく２０３番目から２０９番目は−１０領域を、
同じく２３６番目から２４３番目はリボソーム結合領域
を、同じく２５１番目から９１３番目は分泌に関与する
領域を含む塩基配列を、同じく９１４番目から９１９番
目は成熟菌体外蛋白アミノ末端をコードする塩基配列の
各部分をそれぞれ示す。 第２図及び第３図は、菌体外中性プロテアーゼのアミノ
末端アミノ酸配列を示す図であり、第２図はバチルスア
ミロリキファシエンスのもの及びMT−0150のものを、第
３図はバチルスズブチリスのものをそれぞれ示す。
テアーゼ遺伝子のプロモーター領域、リボソーム結合領
域および分泌に関与する領域を含む塩基配列を示す図で
あり、そのうち１７９番目から１８４番目は−３５領域
を、同じく２０３番目から２０９番目は−１０領域を、
同じく２３６番目から２４３番目はリボソーム結合領域
を、同じく２５１番目から９１３番目は分泌に関与する
領域を含む塩基配列を、同じく９１４番目から９１９番
目は成熟菌体外蛋白アミノ末端をコードする塩基配列の
各部分をそれぞれ示す。 第２図及び第３図は、菌体外中性プロテアーゼのアミノ
末端アミノ酸配列を示す図であり、第２図はバチルスア
ミロリキファシエンスのもの及びMT−0150のものを、第
３図はバチルスズブチリスのものをそれぞれ示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (56)参考文献 特開 昭58−162291（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−19092（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−132895（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−91980（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−70075（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−145090（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−203194（ＪＰ，Ａ) 日本農芸化学会 昭58年度大会講演要旨 集（昭58．３．10）Ｐ．33 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，154（２) Ｐ．831−837（1983) Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，95（１）Ｐ．87 −94（1984) Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，156（１) Ｐ．327−337（1983) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，112（２）Ｐ．678− 683（1983）Ａｐｐｌ．Ｅｎｕｉｒｏｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，46（５）Ｐ．1059 −1065（1983)
Claims (1)
- 【請求項１】バチルス・アミロリキファシエンスＦ株の
中性プロテアーゼ遺伝子の発現に関与するプロモーター
領域、リボゾーム結合領域及び発現の結果合成された、
合成された蛋白の菌体外への分泌に関与する領域を含む
ＤＮＡ塩基配列が下記の塩基配列であるＤＮＡ塩基配
列。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59065156A JPH0634720B2 (ja) | 1984-04-03 | 1984-04-03 | 蛋白の発現と分泌に関与する領域を含むｄｎａ配列 |
| EP84116373A EP0149241B1 (en) | 1983-12-28 | 1984-12-27 | Dna base sequence containing regions involved in the production and secretion of a protein, recombinant dna including the whole or a part of the dna base sequence, and method of producing proteins by use of the recombinant dna |
| DE8484116373T DE3484346D1 (de) | 1983-12-28 | 1984-12-27 | Dns-basensequenz enthaltende regionen einbegriffen in der herstellung und sekretion eines proteins, rekombinante dns das ganze oder einen teil der dns-basensequenz enthaltend und verfahren zur herstellung von proteinen unter verwendung der rekombinanten dns. |
| US08/359,863 US5612192A (en) | 1983-12-28 | 1994-12-20 | DNA base sequence containing regions involved in the production and secretion of a protein, recombinant DNA including the whole or a part of the DNA base sequence, and method of producing proteins by use of the recombinant DNA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59065156A JPH0634720B2 (ja) | 1984-04-03 | 1984-04-03 | 蛋白の発現と分泌に関与する領域を含むｄｎａ配列 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60210986A JPS60210986A (ja) | 1985-10-23 |
| JPH0634720B2 true JPH0634720B2 (ja) | 1994-05-11 |
Family
ID=13278731
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59065156A Expired - Lifetime JPH0634720B2 (ja) | 1983-12-28 | 1984-04-03 | 蛋白の発現と分泌に関与する領域を含むｄｎａ配列 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0634720B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0149241B1 (en) * | 1983-12-28 | 1991-03-27 | Agency Of Industrial Science And Technology | Dna base sequence containing regions involved in the production and secretion of a protein, recombinant dna including the whole or a part of the dna base sequence, and method of producing proteins by use of the recombinant dna |
| JPH0669377B2 (ja) * | 1985-11-25 | 1994-09-07 | 工業技術院長 | Ｄｎａ塩基配列およびベクタ− |
| JP2500312B2 (ja) * | 1986-01-13 | 1996-05-29 | 工業技術院長 | ヒト成長ホルモンの生産法 |
-
1984
- 1984-04-03 JP JP59065156A patent/JPH0634720B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２（２）Ｐ．６７８−６８３（１９８３）Ａｐｐｌ．Ｅｎｕｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４６（５）Ｐ．１０５９−１０６５（１９８３） |
| Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４（２）Ｐ．８３１−８３７（１９８３） |
| Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５６（１）Ｐ．３２７−３３７（１９８３） |
| Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９５（１）Ｐ．８７−９４（１９８４） |
| 日本農芸化学会昭５８年度大会講演要旨集（昭５８．３．１０）Ｐ．３３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60210986A (ja) | 1985-10-23 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |