JPH02186982A

JPH02186982A - ヒトＩｇＡの分泌能を有するヒト‐ヒトハイブリド‐マ

Info

Publication number: JPH02186982A
Application number: JP1002773A
Authority: JP
Inventors: Yoji Niimoto; 洋士新本; Shunichi Dosemari; 俊一堂迫; Hironori Murakami; 浩紀村上
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1989-01-11
Filing date: 1989-01-11
Publication date: 1990-07-23

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】恵呈上公租丹圀国本発明は、ヒトＩｇＡ抗体を分泌するヒト−ヒトハイブ
リドーマに関する。

従来挟止ＩｇＡは、母乳や唾液、涙、***などの分泌液中で最も
優勢な免疫グロブリンであり、感染防御の最も初期の段
階において、口腔、鼻腔、食道、気道などで、ウィルス
細菌を不活化する機能を担っている。

従来は、ＩｇＡを生産するためには、ＩｇＡを多く含む
上記分泌液より精製回収することが一触的であった。し
かして、１９７５年にに０ｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ
（Ｎａｔｕｒｅ　ｒネーチ＋　　Ｊ　ｖｏｌ、２５６．
４９５−４９７）により確立されたハイプリドーマ法に
よりマウス牌細胞とマウス骨髄腫細胞をポリエチレング
リコール（以下ＰＥＧと略称する）存在下で細胞融合し
、抗体を持続的に生産する方法が開発された。この方法
を利用することにより、目的とする抗体を細胞培養によ
り、大量に、しかも簡便に得ることが可能となった。

しかし、この方法においては、細胞融合に使用する親株
としての骨髄腫細胞に適したものがマウス由来の細胞株
であり、したがって、生産される抗体もマウス型の抗体
であって、ヒトにとっては異物であるため、治療等への
応用には限界があった。

一方、ヒト型の抗体を大量に得るため、バーキットリン
パ腫の患者より分離されたニブスタン・バーウィルス（
以下ＥＢウィルスと称する）がヒトＢリンパ球を不死化
し、かつ不死化されたＢ細胞株が持続的に抗体を生産す
るとの知見が明らかとなり、ヒトの末梢血又は母乳など
よりリンパ球を分離し、このリンパ球をＥＢウィルスに
より形質転換し、得られた細胞株を培養する方法が採用
されている。例えば、特開昭６０−５８９２０号公報に
は、ヒト初乳、又は末梢血より得た８９７８球をＥＢウ
ィルスにより形質転換し、得られた細胞株を培養し、ヒ
ト型ＴｇＡ抗体を得る方法が開示されている。しかし、
これらの方法は、形質転換の効率が悪く、又ヒト感染性
のウィルスを使うことに問題があり、したがって、実際
にはあまり使われていないのが現状である。

ここ数年来、ヒト型抗体を得るため、細胞融合に適した
ヒト骨髄腫細胞を得る研究が進み、いくつかのヒト型抗
体を分泌するハイブリドーマが得られている。

例えば、特開昭６０−１４１２８５号公報には、ＮＡＴ
−３０と名付けられた細胞株が開示されており、又、大
量らはＨＯ−３２３と名付けたリンパ芽球様細胞株ＷＩ
Ｌ２−ＮＳ由来の細胞を開示している（ＣｅｌｌＢｉｏ
ｌ、１ｎｔｅｒｎ、Ｒｅｐｏｒｔｓ、ｖｏｌ、１０．　
ｐ７７〜８８１９８６）。

しかし、これらの細胞株を含むヒト−ヒトハイブリドー
マ作成用親株は、融合効率がマウスハイブリドーマに較
べて低く、また、親株自身が抗体産生株であって、常時
ＩｇＭ抗体を分泌しているため、ＩｇＡ抗体の生産を目
的として細胞融合を行った場合、得られる抗体は、Ｉｇ
ＡとＩｇＭの複合抗体を分泌するようになってしまい、
ＩｇＡのみを分泌するハイブリドーマの作製には適して
いないことが明らかにされている　（新本他、八ｇｒｉ
ｃ、Ｂｉｏ１．ｃｈｅｍ。

「アグリ力ルチュアルバイオロジカルケミストリイＪ　
、ｖｏｌ、５０＋　ｐ２２１７．１９８６年〉。

また、特開昭６３−１８５３７４号公報には、上述のＨ
Ｏ−３２３株からクローニングしたＨＯＭＯ−７株が、
細胞内抗体濃度がきわめて低く、細胞外に抗体を分泌し
ないため、ヒト抗体を生産するためのハイブリドーマ作
成用親株として適していることが開示されている。

この細胞株は、ヒボキサンチン−グアニン−ホスホリボ
シルトランスフェラーゼ（以下ＨＧ　Ｐ　ＲＴと称する
）欠損株であり、ＨＡＴ選沢培地に感受性を有している
ことが特徴である。このため、該細胞株は８９７８球と
の融合細胞の選択には適するが、しかし、一方の細胞が
Ｂリンパ芽球様細胞のように、ＨＡＴ耐性を有している
場合はハイブリドーマのクローニングは困難であるとい
う問題がある。

上述のような状況から、これまでヒトＩｇＡのみを分泌
する効率の良いヒト−ヒトハイブリドーマはこれまで報
告されていない。

日が”しようとする諜本発明は如上の状況に鑑みなされたものであって、ヒト
ＩｇＡ抗体のみを分泌するヒト−ヒトハイブリドーマの
細胞を提供することを課題とする。

僅　を”′するための本発明において、ヒト［ｇＡ抗体生産ハイブリドーマを
得るためには、細胞融合用の親株を得る必要ががある。

上述のとおり、本発明の目的であるヒト−ヒトハイブリ
ドーマを得るために、ヒトＢリンパ球細胞およびヒト由
来Ｂリンパ芽球様細胞との細胞融合操作に適した細胞株
は、今まで得られていなかった。このような親株として
適した細胞の備える条件として以下の項目をあげること
ができる。

すなわち、 ■　増殖が速い。

■　低細胞密度からの増殖が可能 ■　細胞融合効率が高い ■　実質的には抗体を分泌していない ■　適当な薬剤耐性マーカーを持っている■　無血清培
地中で増殖可能などの性質を兼ねそなえていることが必要である。

特に、本発明においては、Ｂリンパ芽球様細胞はＨＡＴ
選択培地に生育するため、細胞融合親株としては、別の
選択マーカーを親株に付与しなければならない。

本発明者らは、この目的に通う細胞株を得て、本発明を
完成するに至った。

以下にヒトＩｇＡ抗体分泌ハイプリドーマの作成につい
て説明する。

（１）　　細胞融合用親株の取得上述した通り、従来、ヒ（・−ヒトハイブリドーマの作
成に使用する親株は、８−アザグアニン、或いは６−チ
オグアニン耐性で、アミノプテリン存在下で、死滅する
ＨＡＴ感受性株であるが、本発明で使用するＩ３１ｊン
バ芽球穐細胞は、ＨＡＴ培地中でも生育するため、他の
選択マーカーを付与することが必要となる。導入する選
択マーカーとしては、種々の薬剤耐性があげられるが、
ウアバイン耐性を選択マーカーとして導入することが特
に好ましい。この選択マーカーを導入する細胞として、
ＩｇＭを細胞外に分泌せず、かつ細胞内濃度が極めて低
いヒト由来の骨髄腫細胞株が望ましい。例えば、上述し
たＷＩＬ２−Ｎ３株由来の６−チオグアニン耐性株であ
るＨＯ−３２３株、特開昭６３−１８５３７４号に開示
されたＨＯＭＯ−７株が挙げられる。ＨＯ−３２３株は
ＩｇＭを細胞外に分泌する。このＨＯ−３２３株にウア
バイン耐性を付与するにあたっては、新本らが（Ａｇｒ
ｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　ｒアグリカルチエアルバ
イオロジカルケミストリイＪｖｏｌ。

５０ｐ２６５３〜２６５４　（１９８４）　）に開示し
ているウアバイン含有培地中で継代培養する方法が採用
し得る。

このようにして得たウアバイン耐性０−２株をさらにセ
ルクローニングを行い、目的とするＩｇＭを分泌せず、
かつ細胞内ＩｇＭｔｆｉ度のきわめて低い新しい親株を
選択することができる。

セルクローニングにあたっては、細胞内１　ｇ　Ｍ　ｔ
ｒ’１度を指標としてこれを行う。細胞の培養に用いる
培地はＭｉ織培養に通常用いられるものであれば、種々
のものが使用できる。例えば、イーグルの最少必須培地
、ハムのＦ１２培地、ＲＰＭ夏　１６４０培地及びｅＲ
ＤＦ培地等を挙げることができる。

これらの培地に牛胎児血清（Ｆｅ２）あるいは増殖因子
類を加えて親株細胞あるいはハイブリドーマを培養する
。

培養のクローニングには、限界希釈法と軟寒天平板法が
あるが、多数のクローンの取得が容易な限界希釈法が実
際的である。

９６六マイクロカルチヤープレートに、平均１穴あたり
０．１〜１個の上述の０−２細胞をまき込む。

０−２細胞は９６穴マイクロカルチヤープレート中では
単一細胞からでも増殖可能なため、特にフィーダー細胞
を培養穴に加えておく必要はない。また、プレートは平
底穴のものよりも、丸底穴のものの方が、まき込み直後
の細胞数の少ない時期にも細胞を碑認しやすいため好ま
しい。培地は２〜３日毎に半量交換し、５％ＣＯ□、９
５％エアーの雰囲気下で３７℃で２〜５週間行う。

増加したクローンを２４穴カルチヤープレートに移し、
さらに、培養を続け、細胞が穴の底面積の半分を占める
程度に増殖した時期に細胞内１８Ｍ？ｊｍ度を測定する
。［ｇｌｖ１度の測定としては、細胞破砕後、抗ＩｇＭ
抗体を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定す
るなどの方法を例示し得る。

特に、［ｇＭ？店Ｊｌの低いクローンをハイブリドーマ
作製用親株として採用する。このようにして得た親株の
内で特に優れた株、０−２２１１４は徽工研菌寄託Ｎｌ
１１０４７０として寄託されている。

！２１　１ｇＡ分泌細胞の取得ＩｇＡ分泌細胞としては、ヒト末梢血リンパ球、乳中リ
ンパ球、ヒトリンパ節細胞、ヒトＢリンパ球をＥＢウィ
ルスにより形質転換させたＩｇＡ分泌Ｂリンパ芽球様細
胞などが例示できる。

さらに、特開昭６１−１７２８２４号公報に開示された
ヒトＢリンパ球をＩｇＡ分泌細胞に分化させた後、ＢＢ
ウィルスにより形質転換させたＩｇＡ分泌Ｂ＋Ｊンパ芽
球様細胞などが使用可能である。

（３）親株とＩｇＡ分泌細胞の細胞融合細胞の融合は、
ＰＥＧを用いる方法、センダイウィルスを用いる方法、
電気融合法等の物理的な方法などいずれもが採用できる
。

融合操作終了後、細胞を９６穴プレートにまき細胞の選
択を行う。リンパ球を細胞融合した場合、ＨＡＴ選択培
地を使用することで目的とする融合細胞を得ることが可
能である。また、ＥＢウィルスで形質転換をしたＢリン
パ芽球様細胞を細胞融合した場合は、０．１〜１０μ門
、好ましくは２μ門のウアバインを含むＨＡＴ選択培地
に生育する細胞より目的とする融合細胞を得ることがで
きる。

（４）ハイブリドーマのクローニング上記（３）の方法により得られたヒトＩｇＡ分泌ハイブ
リドーマの内から生育の速いハイブリドーマを選ぶため
にクローニングを行う。クローニングにあたっては、限
界希釈法、ソフトアガー平板法、フィブリンゲル平板法
、セルソータによる細胞分画法などが使用できる。

このようにして得たヒトＩｇＡ分泌ハイブリドマは、以
下の細胞生物学上の特性を有する。

■　ヒト１ｇＡ抗体のみを分泌する、 ■　ＨＡＴ選択培地耐性である、 ■　ウアバイン耐性である、 ■　継代培養は限界なく可能である、 ■　無血清培地で生育可能である。

以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例１ヒト−ヒトハイブリドーマ　　　のヒトＢリンパ芽球様細胞ＷＩＬ２−ＮＳ　（ＡＴＣＣＣ
ＲＬ　８１５５）を特開昭６３−１８５３７４号に開示
の方法で、ＨＡＴ感受性を付与させた。尚、ＷＩＬ２−
ＮＳは米国ＡＴＣＣ，大日本製薬から購入可能である。

すなわち、上記細胞を１０μｇ／−インシュリン、２５
μｓ／−ラクトフェリン、１０μ門エタノールアミン及
び２．５ｎＭセレニウム添加培地で２週間培養し、増殖
してきた細胞を０．２４％軟寒天培地１０％ＦＣ３培地
でクローニングし、抗体非分泌性クローンを選択した。

更に、３０μｇ／ｗｄ１６−チオグアニン添加１０％Ｆ
ＣＳ培地で培養し、６−チオグアニン耐性株を得た。こ
のうち、アミノプテリン感受性、融合効率及び増殖速度
の最も高い株がＨＯ−３２３である。

ＨＯ−３２３株は、ＨＡＴ惑受性ではあるが、さらにマ
ーカーとしてウアバイン耐性を付与した。

０．１μＨのウアバインを含む１０％ＦＣ３含有ＲＰＭ
１１６４０培地にＨＯ−３２３株を２Ｘ１０”個／−に
なるように懸濁し、９６穴プレートに０．１−づつまき
こみ、３日後にさらに同培地を０．１−づつ添加し、２
日ごとに培地を半量ずつ交換しながら５％Ｃｏｔ　９５
％エアーの雰囲気下で３７℃２ａ間培養を続けた。９穴
に細胞の増殖が見られた。この９穴を○−１，０−２，
０−３−・−・・０−９として、それぞれを２４穴プレ
ートから１０ｃｍシャーレへと０．１μ門のウアバイン
を含むｉｏ％ＦＣ３含有ＲＰＭ１１６４０培地で増殖さ
せた。次いで、培地中のウアバイン濃度を１週間毎に０
．５μ門、１μｈ、２μ門、５μ門、１０μ門の順に上
昇させながら継代し、生存株を得た。この生存株として
０−２株があり、この株をさらに、セルクローニングし
てハイブリドーマ用の親株を得た。

０−２細胞を培養穴あたり平均０．５個となるように１
５枚の９６穴マイクロカルチヤープレートにまきこんだ
。培地はｌＯ％ＦＣ３を添加したＲＰＭＩ１６４０培地
を用い、３日毎に培地の半量ずつを交換し、３週間培養
を行った。１５枚のプレートの内６７０穴に細胞の増殖
が見られた′。これらの増殖した細胞を２４穴カルチヤ
ープレートに移し、最初の５日間はｌＮｉの培地を添加
した。２日毎に１ｄずつ培地を交換し、１０日後に各人
の細胞の半量をマイクロ遠心チューブに回収し、残りの
半量は培養をｍ′Ｉｆｔシた。回収した細胞を１０００
　Ｘ　Ｇで１０分間遠心後、上清を除去して細胞ペレッ
トを得た。この細胞ベレットに、１％Ｔｗｅｅｎ　２０
を添加した１／１０希釈リン酸緩衝生理食塩水０．５−
を加え、細胞を破砕溶解した。遠心チューブ内で細胞分
散液を良く撹拌した後、１０，０ＯＯＸＧで５分間遠心
して細胞残渣を沈澱させ、上清中に遊離したＩｇＭ９ｆ
ｆｉ度をＥＬＩＳＡ法で測定した。破砕液中のＩｇＭ？
Ｊ１度がｌｎｇ／ｄ以下のクローンが４個得られた。こ
れらのクローン中でＩｇＭ濃度の特に低いクローンｏ−
２２を再クローニングし、細胞破砕液中のＩｇＭ濃度が
０、１ｎｇ／−以下のクローン○−２２２７株、Ｏ−２
２１１４株を得た。

これら３クローンともヒト−ヒトハイブリドーマ作製用
親株として必要な特徴を兼ね備えていた。

実施例２ヒトＩＡ　　’　ハイブリドーマの作実施例１で得たヒト−ヒトハイブリドーマ用親株０−２
２．０−２２２７．０−２２１１４を親株としてＢリン
パ芽球様細胞と細胞融合を行い、ヒトＩｇＡ分泌ハイブ
リドーマを得た。

ヒｌ−１ｇＡ分泌Ｂリンパ芽球様細胞は、ヒト末梢血リ
ンパ球をＥＢウィルスにより形質転換した細胞より、ヒ
ト１ｇＡを高濃度に分泌している株を選択した。このよ
うにして選択した株を２１−２株として使用した。

ハイブリドーマ作成のため、ｌＸ１０７個の親細胞と同
数の２１−２株を混合し、これを５０％ＰＥＧにより細
胞融合させた。融合操作後、親株換算で３Ｘ１０’個／
穴の濃度になるように、細胞を９６穴マイクロカルチヤ
ープレートにまき、次いで２μＨのウアバインを含むＨ
ＡＴ培地（ＯＨＡＴ培地）を０．１−ずつ添加し、３７
℃、５％ＣＯ□、エアー９５％雰囲気下で培養を行った
。培地は、２〜３日毎に０ＨＡＴ培地を半量ずつ交換し
ながら３週間培養を行った。ハイブリドーマが増殖した
穴を数え、さらに上゛清中に分泌されたｒｇＡ、　ｒｇ
ＭｉＦＩ度を測定した。抗体の測定にあたっては、ＥＬ
ＩＳＡ法により測定を行った。表に示すように高率でヒ
）ＩｇＭのみを分泌するバイブリドーマが得られた。特
に、０−２２１１４を親株とした場合はさらに高い率で
目的とするハイブリドーマが得られた。

表（ハイプリドーマのＩｇＡ分泌）さらに、各１ｇＡのみを分泌する穴より得た細胞をさら
にクローニングし、それぞれ継代培養したがいずれの株
も ■　ヒトＩｇＡ抗体のみを分泌する、 ■　ＨＡＴ選択培地耐性である、 ■　ウアバイン耐性である、 ■　継代培養は限界なく可能である、 ■　無血清培地で生育可能である。

等の特性を備えていた。

このようにして得た株の内で特にＩｇＭ生産能の高い株
を微工研菌寄託１ｂ１０４７１として寄託した。

光里少苅ス本発明により、ヒ）ＩｇＡのみを分泌する特異性を有す
るヒト−ヒトハイブリドーマを得ることが可能となる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）細胞質内ＩｇＭ濃度の極めて低い、ヒト由来のＢ
リンパ芽球様細胞の親株と、ヒトリンパ球あるいはＩｇ
Ａ分泌Ｂリンパ芽球様細胞を細胞融合させて成るＩｇＡ
の分泌能を有するヒト−ヒトハイブリドーマ。
（２）ヒト由来のＢリンパ芽球様細胞がＷＩＬ２−ＮＳ
（ＡＴＣＣＣＲＬ８１５５）由来のチオグアニン及びウ
アバインの耐性株であり、かつアミノプテリンの存在下
で死滅する細胞である請求項（１）に記載のヒト−ヒト
ハイブリドーマ。
（３）ヒト−ヒトハイブリドーマは下記の細胞生物学的
特性を有するものである請求項（１）に記載のヒト−ヒ
トハイブリドーマ。［１］ヒトＩｇＡ抗体のみを分泌する、［２］ＨＡＴ選択培地耐性である、［３］ウアバイン耐性である、［４］継代培養は限界なく可能である、［５］無血清培地で生育可能である。