JP2012529270A - ハイブリッド/キメラ細胞を生成する方法およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ハイブリッド細胞およびハイブリッド細胞を生成するための方法に関する。特に、本発明は、少なくとも3つの細胞のハイブリダイゼーションから生成されたハイブリッド細胞に関し、ここで、少なくとも2つの細胞が異なる系統(lineage)に由来するものである。本発明はさらに、診断、予防、治療および/または研究の様々な用途において有用なタンパク質の発現のためのハイブリット細胞の使用に関する。
本明細書の全体を通じての先行技術のあらゆる議論は、当該従来技術が広く公知であるか、または当該分野においてよく知られている一般的な知識の一部を形成していることの自認として決して見做されるべきではない。
a)ヒトの組織からの派生:
b)培養における高密度の成長;
c)商業的に実行可能なタンパク質収量を示す;
d)外来性遺伝子の安定な導入が可能である;
e)遺伝子増幅法を適用できる;
f)ヒト−ヒトハイブリドーマの場合のように、モノクローナル抗体の産生のための親細胞が使用可能である;
g)長期間にわたる安定なタンパク質の発現を示す;
h)無血清および無グルタミン培地において成長する能力;
i)エンドペプチターゼ活性を欠いており、したがってタンパク質の分解が低下している;
j)病原性の物質(ウイルスDNAおよびマイコプラズマが挙げられる)がない;
k)天然に生じるヒトのタンパク質、好ましくは組織および細胞特異的なタンパク質にみられる翻訳後修飾と機能的に類似または同一である翻訳後修飾を示すタンパク質を生産する。これら翻訳後修飾としては、糖タンパク質の炭化水素部分が挙げられ得るが、これに限定されない。
多融合細胞(multi-fusion cells)は不安定であり、融合に関わる細胞が多いほど、得られたハイブリッド細胞の不安定性が高まると、一般的に考えられている。驚くべきことに、本発明において、複数の細胞(例えば3つの細胞)の融合から得られたハイブリッド細胞は機能的な安定性を示す。特に、異なる系統に由来する細胞が体細胞融合されるか、または体細胞ハイブリダイズされて、実質的に安定なキメラ/ハイブリッド細胞を形成し得ることがわかっている。とりわけ、本発明は、トリハイブリッド(tri-hybrid)を生じる少なくとも3つの親細胞のハイブリダイゼーションから生成された系統交雑の(cross-lineage)キメラ/ハイブリッド細胞であって、少なくとも2つの親細胞が異なる系統に由来しており、骨髄腫細胞がハイブリダイゼーションに含まれていない系統交雑のキメラ/ハイブリッド細胞に関する。
未拘束(uncommitted)の前駆細胞に由来する細胞、または幹細胞であり、骨髄腫細胞ではない第1の細胞;
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第2の細胞;ならびに
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第3の細胞
のハイブリダイゼーションによって生成された、ハイブリッド細胞を提供する。
未拘束の前駆細胞に由来する細胞、または幹細胞であり、骨髄腫細胞ではない第1の細胞;
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第2の細胞;ならびに
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第3の細胞
をハイブリダイズする工程を包含している。
本発明に照らして、「含んでいる(comprise)」および「含んでいる(comprising)」などは、それらの排他的な意味ではなく、「包含しているが、これに限定されない」というそれらの包括的な意味において解釈されるべきである。
ハイブリッド細胞は、2以上のゲノムに由来する構成要素を含んでいる細胞(接合体およびそれらの派生物以外)である。それは、例えば2以上の生物学的な細胞(親細胞)の、体細胞ハイブリダイゼーション(または全細胞ハイブリダイゼーション)から構築される細胞である。親細胞は、同じ系統(または種)または異なる系統(または種)のいずれかから入手され得る。同じ系統および種から生成されたハイブリッド細胞は自己ハイブリッド(auto-hybrid)と呼ばれ、一方、異なる系統のハイブリッド細胞は異種ハイブリッドと呼ばれる。
キメラ細胞は、2以上の異なる種に由来するゲノムを有している、人工的に生成されたハイブリッド細胞である。
系統交雑のハイブリッド細胞は、異なる細胞系統に由来する2以上の細胞に由来するゲノムを有している人工的に生成されたハイブリッド細胞である。造血細胞は2つの主な系統:リンパ球系(T細胞、B細胞およびNK細胞)ならびに骨髄系(単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球および好酸球、赤血球、巨核球/血小板、樹状細胞)に分けられる。
トリハイブリッド細胞は、3つの細胞に由来するゲノムを有している、人工的に生成されたハイブリッド細胞である。
細胞に言及するときに、「安定な」という用語は、所定の成長パラメータもしくは生産パラメーターの一貫性を証明する細胞の能力、または増加する世代数に対して細胞株の生産特性の一貫性を意味する。安定な形質転換体に言及して用いられるとき、それは、比較的に一定のレベルにおいて導入遺伝子を、実質的に無期限に発現する細胞株を意味する。
本明細書に照らして、「体細胞ハイブリダイゼーション」という用語は、細胞の原形質膜が良好に接触するよう誘導され、接触点において親細胞の原形質膜の可逆的な破壊が同時に誘導され、新たに形成された単一細胞の外膜の内部にそれぞれの親細胞の本体または細胞小器官が組み込まれるような方法において、単一の生細胞が2以上の二倍体(非生殖細胞)の細胞(親細胞)から生成される過程を指す。新たに形成された単一の細胞はハイブリダイズされた細胞またはハイブリッド細胞と呼ばれる。
「幹細胞」という用語は、有糸***による***能および種々の異なる細胞型への分化能を有している特殊化していない細胞(unspecialised cell)を指す。幹細胞は、胚性幹細胞、臍帯に由来する「成熟な」幹細胞または成体に由来する幹細胞を包含し得る。幹細胞は、すべての細胞型に分化する無制限の能力を有している細胞、すなわち全能細胞を包含している。また、幹細胞は、特殊化した細胞(例えば、全能性、多能性、低能性(oligopotent)または単能性幹細胞)への分化能に制限されている細胞を包含し得る。
「不死化された細胞」という用語は、無制限に成長する能力を有している細胞を指す。不死化された細胞はインビボの悪性腫瘍または胚に由来し得ることが明確であろう。代替的に、不死化された細胞は、無制限に成長する能力を誘導する処理を細胞に施すことによって入手し得る。これら処理は、例えば、インビトロの形質転換処理(例えばウイルス遺伝子の導入)を包含し得る。当該ウイルス遺伝子は、例えば、エプスタイン・バールウイルス(EBV)、シミアンウイルス40(SV40) T抗原、アデノウイルス E1AおよびE1B、ならびにヒトパピローマウイルス(HPV) E6およびE7である。代替的に、不死化された細胞はテロメラーゼ逆転写酵素タンパク質(TERT)の発現または他の方法を経た細胞に由来し得る。また、不死化された細胞は、発癌遺伝子の発現が改変されている細胞に由来し得る。不死化された細胞は無制限に成長する能力を誘導する任意の処理(UV照射、または不死化の機構が不明である任意の形質転換を包含しているが、これらに限定されない)に由来し得る。
「骨髄腫細胞」という用語は、プラズマ細胞の悪性腫瘍を指す。
「ハイブリドーマ」という用語は、免疫化された動物の脾臓に由来するB細胞と、骨髄腫細胞とのハイブリダイゼーションによって生成される細胞を指す。ハイブリドーマはモノクローナル抗体の産生能を有している不死化された細胞である。
「未拘束の前駆細胞」という用語は、任意の特定の系統に拘束されることなく、一部の種類の細胞にのみ分化し得るが、自己をもはや回復し得ない幹細胞の初期の子孫を指す。
骨髄性の共通前駆細胞は、骨髄系統に制限された造血幹細胞の子孫であり、巨核球/赤血球または顆粒球/マクロファージ前駆細胞のいずれかになり得るが、リンパ球系細胞になり得ない。
リンパ系の共通前駆細胞は、リンパ球系統に制限された造血幹細胞の子孫であり、B、T細胞およびナチュラルキラー細胞になり得るが、骨髄細胞になり得ない。
Bリンパ球系統に由来する細胞は、B細胞の任意の型になるB系統の分化の後の、リンパ系の共通前駆細胞に由来する任意の細胞である。
Tリンパ球系統由来の細胞は、T細胞の任意の型になるT系統の分化の後の、リンパ球共通前駆体に由来する任意の細胞である。
顆粒球−マクロファージ前駆細胞は、骨髄性の共通前駆細胞に由来しており、顆粒球および単球の系統に分化するが、巨核球および赤血球の系統には分化しない前駆細胞である。
巨核球−赤血球前駆細胞は、骨髄性の共通前駆細胞に由来しており、巨核球および赤血球の系統に分化するが、顆粒球および単球の系統には分化しない前駆細胞である。
プレB細胞は、膜結合型IgMの重鎖が代替軽鎖と共に発現している段階において発達中のB細胞である。
未成熟なB細胞は、抗体の位置の組換え段階においてVJがL鎖上に再構成され、VDJがH鎖上(IgM受容体の発現がみられる)に再構成される骨髄において発達中のB細胞を指す。
ナイーブB細胞は、その表面の免疫グロブリンの無作為な遺伝子再構成を経て骨髄において分化し、成熟しているが、末梢において対応する抗原といまだに接触していない成熟B細胞である。
T依存性の様式または非依存性の様式におけるクローン性増殖、およびプラズマ細胞への最終分化の組合せを生じるBCRを介した抗原認識を通じて、末梢において対応する抗原に接触した成熟B細胞型である。
エフェクターB細胞は、特定の抗原に特異的な抗体および免疫系の他の細胞を機能させるために過剰のサイトカインを分泌する短期生存型のB細胞の一種である、抗体分泌プラズマ細胞としばしば同義である。
記憶B細胞は、初期の免疫反応の間に接触した抗原に特異的である活性化B細胞から形成された長期生存型のB細胞であり、同じ抗原に対する2回目のばくろに続く迅速な応答が可能である。
プラズマ細胞は、最終的な有糸***後の短期生存型の免疫系の細胞であり、CD4+リンパ球(Th細胞)による刺激によってB細胞から分化し、大量の抗体を分泌する。
前T細胞は、TCRのβ鎖が二重陰性(CD4−CD8−)のT細胞(CD3+)において発現しており、VbDbJbが揃いっている段階において発達中のT細胞である。
未成熟T細胞は、骨髄から胸腺に移動しているが、そのTCRの再構成もしくは自己の主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子上に提示された自己ペプチドに対するTCR結合能についての選択が完了していないか、またはそれぞれMHCクラスIもしくはII分子に対する細胞のTCR特異性と正確に相互関係を示すTキラー系統もしくはTヘルパー系統への分化を経ていない発達中のT細胞である。系統分化は補助受容体分子であるCD8またはCD4の一方の発現を喪失することによって表現型として特徴付けられる。
骨髄において分化し、そのTCRの再構成を伴う胸腺における中心的な選択のポジティブおよびネガティブな過程および補助受容体分子の1つの喪失を首尾よく経ているが、末梢において対応する抗原といまだに接触していない成熟T細胞。
活性化T細胞は、抗原提示細胞上における主要組織適合遺伝子複合体ペプチド(ペプチド:MHCの複合体)およびB7ファミリーメンバーのそれぞれによる、細胞表面上のTCRおよびCD28の両方の結合を通して、抗原特異的なエフェクターT細胞になりつつあるT細胞である。
エフェクターT細胞は、細胞に適切なペプチド:MHCの複合体を有している当該細胞との接触によって即座に応答可能な短期生存型のTリンパ球の一種である。
図1.同定および分取−精製したCD71+K562細胞。
本発明の好ましい実施形態を、添付の図面を参照して、以下の非限定的な実施例によってさらに記載する。
1.細胞の選択、細胞の操作および単一細胞のクローニング
以下の実施例は、系統交雑のトリハイブリッドの生成および所望のタンパク質の発現に用いる哺乳類細胞株および初代培養された細胞の、選択および単離(または分取)を包含している細胞の調製について記載している。特定の特性を有している細胞の単一集団を得るための特定の選択法の選択、または特定の表現型の細胞を単離するための特定の(複数の)マーカーの使用は、まったく限定的ではなく、むしろ暗示的である。他の細胞マーカーまたは分取の手順は、同様の結果を出すために用いられ得る。
NaHCO3(JRH Biosciences)、20mMのHepes(Sigma)、4mMのL−グルタミン(Sigma)によって改変し、10%のウシ胎児血清FCS(JRH Biosciences)を補ったRPMI1640(Roswell Park Memorial Institute培地)を用いて、加湿した5%のCO2雰囲気の37℃のCO2インキュベーターにおいて、標準的な(通常の)条件下において、すべての不死の細胞株(下記を参照)を懸濁培養において成長させた。特に記載がない限り、本明細書に記載の組織培養培地(TC培地)は、本発明に関するすべての不死の細胞株、初代培養された癌細胞、初代培養された細胞培養および樹立したトリハイブリッド細胞株を培養するための標準培地である。一般的に、用いたすべての不死の細胞株、初代培養された癌細胞および初代培養された細胞を抗生物質のない環境において培養した。しかし、危険性の高いバクテリアおよび/または真菌による汚染の疑いがある場合、2%のアンピシリン(5000ユニット)/ストレプトマイシン(5mg)溶液(Sigma)を標準培地に加えた。
本発明において用いられ得るヒト細胞株は、以下のとおりである:
a)骨髄性の共通前駆細胞系統、K562(ヒト慢性骨髄性白血病に由来する細胞株)、
b)Tリンパ球系統、MOLT4(ヒトTリンパ球芽球)、および
c)Bリンパ球系統、WIL2NS(ヒトBリンパ球芽球)。
本発明において用いられ得る非ヒト細胞株は、マウス骨髄腫細胞株−Sp2(Bリンパ球プラズマ細胞)である。
細胞の単離または分取、細胞の操作および単一細胞のクローニングは、本発明を通して重要な工程である。ここには、我々は目的の単一細胞の操作および/またはクローニングのために確立した単一細胞の供給系について説明する。単一細胞の供給系(図55)は、ガラスのマイクロピペット、1mlのシリンジおよび1次元簡易操作装置(one-dimensional coarse manipulator)から主に構成される。図56は、目的の単一細胞を拾い上げるために用いられるガラスのL字型マイクロピペットを示す。このピペットを、ヘマトクリットキャピラリーチューブ(75ミリメートル(mm)の長さ、それぞれ1.5mmおよび1.10mmの外径および内径)から作製した。熱を用いることによって、チューブの一端を、約250〜300マイクロメートル(μm)の内径および約30μmの先端の壁厚を有している先端(1)が得られるように引っ張った。マイクロピペットの他端には手を加えなかった(2)。細胞供給系(図55)において、シリンジ(4)を簡易操作装置上に載せ、同様に簡易操作装置を磁気スタンド(16)に載せている。この系は、シリンジのピストン(6)がシリンジに対して前方または後方に非常にゆっくりと動かされ得るように機能する。目的の単一細胞を操作するために、柔軟性のある医療用品質のチューブ(3)を用いて、図に示されるようにシリンジをマイクロピペット(2)の手を加えていない端に接続しなければならない。この単一細胞の供給系は、任意の細胞操作の前に、70%のアルコールを用いて数回にわたって洗浄することによって殺菌し、最終的に、必要なあらゆる適切な組織培養培地または溶液によって気泡を含ずに満たされる必要がある。
各細胞株由来の細胞のクローンを単一細胞のクローニングによって樹立した。本発明において用いられる任意の生物学的な細胞(例えば、K562細胞株の細胞)の単一細胞のクローニングまたは操作の方法を以下に記載する。
一例として、以下の方法は、蛍光標示式細胞分取器(fluorescence-activated cell sorter (FACS))を用いた、K562細胞株からのCD71陽性細胞の細胞選択および分取について説明する。
細胞ハイブリダイゼーション実験のための細胞の骨髄単球の表現型を確認するために、FACS分析に続く分取およびを用いてCD71+K562細胞をさらにCD15+細胞に関して濃縮し、続いて分取した。
マウス骨髄腫細胞株Sp2をトリハイブリッドの生成において用いたとき、その集団を、ヒトCD71のアナログであるマウストランスフェリン受容体(TfR)を発現している細胞に関して濃縮した。
一例として、下記の方法は、急性骨髄性白血病(AML)の患者から得られた骨髄のサンプルからの、骨髄系統の形質転換細胞の選択について説明する。対応する血液悪性腫瘍の骨髄のサンプルから他の系統の細胞を選択するために、同様の方法を適用し得る。
初代培養された細胞は任意のリンパ組織(例えば、末梢血、臍帯血、脾臓、骨髄、胸腺、扁桃腺、および所属リンパ)に由来し得る。第1の段階において、単核細胞を単離するためにすべてのリンパ組織を処理した。
説明および同意の後に、末梢血のサンプルを健康な個人から収集した。各血液サンプルはヘパリン処理されたチューブ(Vacutainer, BD)に回収し、プールし、RPMI1640を用いて希釈した。
以下の方法は、脾臓、胸腺、扁桃腺または所属リンパ節から単核細胞を単離するために、本発明に使用された手法を説明する。
Bリンパ球系統、Tリンパ球系統および骨髄系統のヒト細胞を、FACS分析および細胞分取または磁気細胞分取を用いて標準的な手順によって単離した。系統特異的な初代培養された細胞を種々の組織から単離するための細胞染色および分取の非限定的な例を以下に示す。
組織サンプルをまず、項目1.3.1に記載のように単核細胞集団を抽出するために処理した。次いで、蛍光細胞染色、続いて細胞分取を、単核細胞集団の単離から4時間以内に行った。この細胞を、染色するまで標準的な培養条件(項目1.1参照)下に完全培地に懸濁させた。
以下は、初代培養された細胞からのB細胞およびT細胞の染色および分取の例である。通常、B細胞およびヘルパーT細胞の選択はそれぞれCD19およびCD4の表面発現に基づいており、一方で、骨髄単球細胞はCD14および/またはCD16の表面発現に基づいていた。
適切なアダプターを備えているマイクロ遠心チューブに少数の細胞(≦5×105個)を直接分取した。分取の前に、補完したRPMI1640の少量(0.1から0.2ml)を回復チューブに加えて、分取したサンプルと混合させ、分取した細胞の生存性を向上させた。許容される回復した細胞の数が供給された分取の後、20μlの分取した細胞の各サンプルをその純度の変化を再分析するために染色用培地を用いて1:10に希釈した。許容可能な純度は≧95%であった。分取したサンプルの1mlにつき、20から40μlのFCSをさらに加え、続いて350g、4℃において7分間にわたって遠心分離した。次いで、細胞を標準的な組織培養培地に再懸濁させた。十分な細胞が利用可能であれば、収量を決定するためにその数を数えた。
項目1.3.1に記載のように、単核細胞を臍帯血のサンプルから調製した。蛍光細胞染色、続く細胞分取を単核細胞集団の単離から4時間以内に行った。この特定の例において、上述の方法(項目1.3.3.1.1)にしたがって、ヒトの臍帯血からのCD5陰性(ナイーブ)B細胞およびCD5陽性(抗原を経験した)B細胞の分取を、マウス抗ヒトCD5−FITC抗体(BD Pharmingen)、マウス抗ヒトCD19−PE抗体(BD Pharmingen)または適切な同位体対照を用いて行った。
項目1.3.1の記載と同様の方法を用いて、単核細胞を臍帯血のサンプルから調製した。蛍光細胞染色、続いて細胞分取を単核細胞集団の単離から4時間以内に行った。この特定の実施例において、上述した細胞の方法(項目1.3.3.1.1)にしたがって、ヒトの臍帯血からのCD5陽性(抗原を経験した)T細胞およびCD5陰性(ナイーブ)T細胞の分取を、マウス抗ヒトCD5−FITC抗体(BD Pharmingen)、マウス抗ヒトCD3−PE抗体(BD Pharmingen)または適切な同位体対照を用いて行った。FACSを用いて染色した細胞を分析した。少なくとも20000の絞り込んだ結果を分析した。CD5陰性T細胞(CD3+CD5−)またはCD5陽性T細胞(CD3+CD5+)のいずれか一方を含んでいる画分を回収するために、分取ゲートを設定した。図6はマウス抗ヒトCD3抗体およびマウス抗ヒトCD5抗体を用いて染色したサンプルの典型的なプロファイルを示す。
分取した集団を回復および分析するために用いた実質的に同様の方法については、項目1.3.3.1.2に記載している。
上述の方法(項目1.3.1)を用いて、単核細胞を骨髄から抽出した。蛍光細胞染色に続く細胞分取を単核細胞集団の単離から4時間以内に行った。活性化B細胞の染色および分取は、上記の項目1.3.3.1.1に記載されている。すなわち、10μlのマウス抗ヒトCD72−FITC抗体(BD Pharmingen)および20μlのマウス抗ヒトCD20−PE抗体(BD Pharmingen)または適切な同位体対照(PEマウスIgG2b,κ抗体)を用いた。FACSを用いて染色した細胞を分析した。プレB細胞、休止B細胞、活性化B細胞、濾胞樹状細胞からなるCD20陽性集団(CD20+CD72−)、または初期B細胞(CD20−CD72+)もしくは活性化B細胞(CD20+CD72+)からなるCD72陽性細胞のいずれか一方を含んでいる画分を回収するために、分取ゲートを設定した。図7はマウス抗ヒトCD20およびマウス抗ヒトCD72抗体を用いて染色したサンプルの典型的なプロファイルを示す。
項目1.3.3.1.2の記載と実質的に同様の方法を、分取した細胞を回復および分析するために用いた。
MACS CD4 Multisortキット(Miltenyi Biotec GmbH)を用いて、CD4−CD8−二重陰性の胸腺細胞、CD4+CD8+二重陽性の胸腺細胞、ならびにCD4+およびCD8+単独陽性の胸腺細胞の集団を、製造者の手順にしたがって分取した。要約すると、項目1.3.2の記載と同様の方法を用いて回収した胸腺細胞をCD4 Multisort CD4マイクロビーズと共に30分間にわたってインキュベートした。5mMのEDTAおよび0.5%のBSAを含んでいるPBSを用いて洗浄した後、標識した細胞を磁気カラムによって分離した。陽性として選択された胸腺細胞(磁気カラム上に保持された)はCD4+単独陽性およびCD4+CD8+二重陽性の細胞集団を含んでいた。一方、CD4が減少した細胞集団(カラムから逃れた)はCD8+単独陽性およびCD4−CD8−二重陰性の細胞を含んでいた。CD4陽性として選択された細胞集団からマイクロビーズを除去するために、MACS Multisort分離試薬と共に細胞をインキュベートした。20分後に消化を止め、細胞をCD8マイクロビーズによって30分間にわたって標識した。CD4+CD8+二重陽性の胸腺細胞を正の選択によって得た。一方、CD4+単独陽性細胞は細胞集団が枯渇したことがわかった。CD4の枯渇した細胞集団をCD8マイクロビーズと共に30分間にわたってインキュベートした。標識した細胞を磁気カラムにかけた後、CD8+単独陽性の細胞を、CD4−CD8−二重陰性の胸腺細胞から分離できた。4つの異なる胸腺細胞亜集団の純度をフローサイトメトリー解析によって評価した。許容される純度は95%より高いものである。
項目1.3.2に記載の方法を用いて、単核細胞をヒト扁桃腺から抽出した。蛍光細胞染色に続く細胞分取を単核細胞集団の単離から4時間以内に行った。CD54+T細胞(細胞間接着分子−1またはICAM−1)を単核扁桃細胞集団から抽出し、マウス抗ヒトCD3−PE抗体(BD Pharmingen)およびマウス抗ヒトCD54−FITC抗体(BD Pharmingen)または適切な同位体対照の使用は項目1.3.3.1.1に記載のような細胞染色/分取方法を用いて選択した。FACSを用いて染色した細胞を分析した。CD3+T細胞(すなわちCD3+CD54−細胞)または活性化CD54+T細胞(すなわちCD3+CD54+細胞)のいずれか一方を含んでいる画分を回収するために、分取ゲートを設定した。図8はマウス抗ヒトCD3案乳亜およびマウス抗ヒトCD54抗体を用いて染色したサンプルのFACSプロファイルを示す。CD3+細胞を系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用い、一方でCD54+活性化T細胞を発現実験のために用いた。
8〜12週齢のBALB/cマウスを特定の病原体のない動物施設において飼育した。組織抽出の前に、マウスをCO2にさらすことによって安楽死させた。末梢血を腋窩または大腿動脈の穿刺によって得、ヘパリン処理されたチューブの中に回収した。単核細胞集団の単離は、ヒト末梢血単核細胞の単離に関する項目1.3.1の記載と同様の手順を用いて行った。マウス脾臓を機械的に破砕し、項目1.3.2に記載のようなヒト脾臓の単核細胞の単離のための手順を用いて単離した。
Tリンパ球系統および骨髄系統のマウス細胞をFACS分析および細胞分取または磁気細胞分取を用いて、標準的な工程によって単離した。初代培養された系統特異的なマウス細胞の単離のための細胞染色および分取の非限定的な例を以下に示す。
異なるエフェクターT細胞の選択はCD4およびCD8の表面発現に基づいた。
磁気ビーズ(Miltenyi Biotec)による負の選択を用いることによって、マウス単球を末梢血単核集団から単離した。単核細胞を磁気細胞分取緩衝液(PBS、0.1%wt/volのBSA、0.5mMのEDTA)に懸濁し、製造業者の手順にしたがって、T細胞(CD90)、B細胞(B220)およびNK細胞(CD49b)に対する抗体を含んでいる抗体MicroBeadsの混合物と共にインキュベートした。次いで、この細胞をLD−ネガティブセレクションカラムに通した。陰性の(単球)画分を回収した。純度を決定するために、この細胞をCD11bに対する抗体と結合させたPEならびにCD90、B220、CD49b、NK1.1およびLy6G(BD Pharmingen)に対する抗体と結合させたFITCを用いて染色した。単球をCD11b+CD90−B220−CD49b−NK1.1−Ly6G−/(low)であるとみなし、純度のプロファイルをFACSによって確認した。マウス単球集団の純度のプロファイルを図46に示す。100%の細胞がCD11bについて陽性である一方、98%を超える細胞がB220、CD90、CD49bおよびNK1.1について陰性であった。CD11b陽性細胞の約38%が、Ly6Gを低いレベルにおいて発現していた。
2.所望のタンパク質を分泌している初代培養された細胞の生成
所望のタンパク質を分泌する初代培養されたヒト細胞の生成のために用いた方法を以下に示す。細胞ハイブリダイゼーション実験のために、または分析実験における対照としてか、もしくはトリハイブリッド発現系において発現しているタンパク質の分析のための参照として、これらの細胞を用いた。
臍帯血のリンパ球をまず項目1.3.1に記載のように密度勾配遠心によって分離し、次いで培養液においてフィトヘマグルチニン(PHA)によって活性化させ、続いてIL−2(1000U/ml)について細胞発現させた。ヒトGM−CSFの産生をELISAによって分析した。この産生に基づく濃度は15から40ng/ml/106細胞に分布した。
マウス抗ヒトCD154抗体(BD Pharmingen)によって被覆した丸底96ウェルプレート(Corning)のウェルに、精製したB細胞(項目1.3.3.1参照)を3.75×105/mlにおいて播いた。10%の熱不活性化尿素−低IgG FBS(Gibco/BRL)ならびに100U/mlのインターロイキン4(IL−4)(R&D systems)および50ng/mlのインターロイキン10(IL10)を補った(培養3日目の後に加えた)完全RPMI2640培地において、この細胞を培養した。培養物を2から3日毎に培養培地の半分を交換することによって新しく補給した。細胞生存率および細胞数を、血球計算板を用いて、トリパンブルー排除によって3回にわたって評価した。5日目および10日目において、培養したリンパ球を、回収し、PBSにおいて2回にわたって洗浄して、マウス抗ヒトCD19−PE抗体、マウス抗ヒトIgM−FITC抗体またはマウス抗ヒトIgG−FITC抗体(全てBD Pharmingen製)を用いたFACSによって分析した。すべての染色を、1×106の細胞あたり1μgの各抗体を用いて4℃において行った。すべての分析において、95%を超える細胞が同位体適合の陰性対照の染色にしたがったマーカーの組について二重陰性であった。死細胞および残骸を含んでいる領域を分析から排除した。すべての分析を5000から10000の生細胞を絞り込むことによって行った。
3.体細胞ハイブリダイゼーション
体細胞ハイブリダイゼーションの種々の方法が当該技術において周知である。これらとしては、例えば、センダイウイルスのような融合性(fusagenic)ウイルスを用いる生物学的方法(Kohler and Milstein, 1975)、ポリエチレングリコール(PEG)を用いる化学的方法(Wojciezsyn, et al, 1983)、および電界を用いる電気的方法(Neil, and Zimmermann, 1993)が挙げられるが、これらに限られない。各方法は目的の細胞の原形質膜が可逆的に透過可能となり、ハイブリダイズすることを誘導し得るか、または引き起こし得る。
本発明のいくつかの実施形態において、電気的な細胞技術をトリハイブリッドのようなハイブリダイズされた細胞の生成に用い得る。
細胞ハイブリダイゼーションの前に目的の個々の細胞を増殖させるため、上述した単一細胞の増殖/供給系(項目1.1.1)を本発明を通じて用いた。
本発明において、2つのL字型の微小電極を用いた。図57は被覆されていない直径128μmのニッケル合金から作製した微小電極(7)を示す。微小電極の柄を、外径1.5mmのヘマトクリットキャピラリーチューブ(8)によって覆った。微小電極のL字型部(9および10)を、電極の水平な部分および垂直な部分の両方の表面の一致する領域が、培地または適切な溶液にさらされるように配置した(Mahaworasilpa, 1992)。細胞ハイブリダイゼーションの工程の前に、2つの微小電極を2つの微細マイクロマニピュレーター(fine micromanipulators)(各微小電極について1つずつ)の上に載せた。これらの微小電極を各電極の平行な電極配置が得られるような方法において設計した(図58)。各微細マイクロマニピュレーターを水圧によって駆動させし、0.5μmの精度の動きがX、YまたはZ方向において行えるようにした。
図59は標準的な96ウェルTCプレートのウェルにおける2つの平行な電極を示す。このウェルは本発明のいくつかの実施形態において、細胞ハイブリダイゼーションのチャンバーの役割を果たす。細胞ハイブリダイゼーションを行うため、微小電極を標準的な96ウェル組織培養プレートのウェル(12)に入っている適切な培地(11)に沈めた。図60および図61はそれぞれ、平行な電極配置の上面図および側面図を示す。ここでは、例えば、ハイブリダイズされるべくあらかじめ選択された3つの細胞をそれらが適切なAC電界の存在において一続きの細胞に整列するまたは形成することを誘導し得るようにおいて、平行な電極の間に置く。
4.電気的な細胞ハイブリダイゼーション法による系統交雑のトリハイブリッドの生成の実施例
以下の項目は、異なる系統もしくは細胞型であるか、または同じ系統/もしくは細胞型であるが異なる表現型である、いずれかに由来する細胞のハイブリダイゼーションによって得たトリハイブリッド細胞株の生成の例を提供する。安定な各トリハイブリッドが親細胞の表現型の特性を同時に有していることを確認するために分析を行った。この確認は系統特異的な細胞表面マーカー、系統特異的なマーカーの細胞内発現、系統特異的なマーカーのRNA転写産物の存在、核型分類、および/または系統特異的なタンパク質の分泌の分析に基づいた。以下の例は系統交雑のトリハイブリッドの最も典型的な表現型の特性について説明する。しかし、これらの例は、選択した特定のマーカーに限定されない。
この種の系統交雑のトリハイブリッドを1つの骨髄K562細胞、1つのTリンパ球MOLT4細胞および1つのBリンパ球WIL2NS細胞をハイブリダイズすることによって生成した。このようにして得られた系統交雑のトリハイブリッドをKMW株と名付けた(続いてその識別番号を付与した)。KMWの系統交雑のトリハイブリッドの生成の工程に関する以下の段階、溶液(ハイブリダイゼーション、培養および回復培地)および本発明に用いるパラメーターを以下に記載する。
K562、WIL2NS、およびMOLT4細胞株を我々の標準培地(項目1.1参照)において培養した。定法にしたがって、各細胞株を3日毎に継代した。細胞ハイブリダイゼーションの前に、最も速い増殖速度を有している細胞型の安定な各クローンを、項目1.1.2に記載の手順を用いて樹立した。いくつかの実験において、項目1.1.3に記載のように樹立したCD71+に関して濃縮されている細胞集団を用いた。また、いくつかの事例において、CD71+に関して濃縮されているK562集団のCD15+細胞(項目1.1.3.1)を用いた。
TC96ウェルプレートの少数のウェルを細胞ハイブリダイゼーションウェルとして用いた。各ウェルを約150μlのハイブリダイゼーション培地によって満たした。この培地は、240mMのソルビトール(Sigma)、2.0mMのKH2PO4(Sigma)、0.4mMのCaCl2(Sigma)、0.2mMのMg(C2H3O2)2(Sigma)および0.2mMのCa(C2H3O2)2(Sigma)を含んでおり、0.2%のウシ血清アルブミン、BSA(Sigma)によって補われていた。電気的な細胞ハイブリダイゼーションの前に、あらかじめ選択した細胞型の各クローンの細胞を一度ハイブリダイゼーション培地において数分間にわたって洗浄し、新鮮なハイブリダイゼーション培地を含んでいるウェルに移した。このウェルはプレハイブリダイゼーションウェルとして設計した。細胞ハイブリダイゼーションの工程の前に、選択した各クローンの単一の洗浄した細胞を項目1.1.1にしたがって、3つの細胞(選択した各クローンから1つずつ)のみを1対の同一の平行な電極(ウェルの底に沈めた(図61において示されるように))の間に置くように操作した。電極の距離は400マイクロメートル(すなわち400μm)において設定した。
CDマーカーの発現
樹立したKMW系統交雑のトリハイブリッド細胞株の確認の例を以下に示す。
系統交雑のトリハイブリッドを、1つの骨髄K562細胞、初代培養された1つのヒトB細胞および初代培養された1つのヒトT細胞の体細胞ハイブリダイゼーションによって生成した。この系統交雑のトリハイブリッドをKBTと名付け、その後ろに識別番号を付与した。
KBT系統交雑のトリハイブリッドの生成前のK562細胞の調製については、上述の通りである(項目4.1.1)。(i)脾臓、末梢血または臍帯血に由来する成熟B細胞(CD19+);骨髄に由来する初期B細胞(CD20−CD72+);骨髄に由来する活性化B細胞(CD20+CD72+);臍帯血に由来する、抗原を経験したB細胞(CD19+CD5+)、および(ii)脾臓、末梢血、臍帯血および胸腺に由来するヘルパーT細胞(CD4+)、脾臓、末梢血、臍帯血および胸腺に由来する細胞傷害性T細胞(CD8+);臍帯血に由来する、抗原を経験したT細胞(CD3+CD5+);臍帯血に由来するCD3+T細胞;胸腺に由来する二重陰性T細胞(CD3+CD4−CD8−)、胸腺に由来する二重陽性のT細胞(CD3+CD4+CD8+)を含んでいるKBT系統交雑のトリハイブリッドの生成に用いた初代培養された細胞を実験において用いた。初代培養された種々のリンパ球の、種々のリンパ組織からの単離は、項目1.3に上述されている。
KBT系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順は、培地ならびにAC電界およびパルスを変更したことを除いて、KMW系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用いたもの(項目4.1.2)と同様である。これらの実験において用いたハイブリダイゼーション培地は、230mMのソルビトール、1.8mMのKH2PO4、0.5mMのCaCl2、0.2mMのMg(C2H3O2)2および0.3mMのCa(C2H3O2)2を含んでおり、0.3%のBSAによって補われていた。0.5MHzおよび65〜75kV/mのAC電界を、それぞれ100μ秒のパルス幅および175〜185kV/mの強度を伴う3秒間隔における3回にわたる連続した方形波パルスと同時に印加した。3回目の方形波パルスの終了後、AC電界をさらに5秒間にわたって連続的に出力し、細胞のハイブリダイゼーションが系統交雑のトリハイブリッドを生成するという結果になった。この新しく作り出した系統交雑のトリハイブリッド細胞の安定な株の回復および樹立のための手順は、4.1.2に記載されている。
細胞表面上におけるCDマーカーの発現
1つの不死の骨髄(K562)細胞、初代培養された1つの成熟B細胞、および初代培養された1つのエフェクターTヘルパー細胞から樹立したKBT系統交雑のトリハイブリッド細胞株
系統交雑のトリハイブリッド細胞株を、例えば、通常の培養条件下において数ヶ月間にわたって樹立した後、この細胞株を系統特異的なCDマーカーの発現について分析した。ハイブリダイゼーション前の細胞の調製(項目1.3.1.1)についての記載と同様の手順を用いて、KBT細胞株の細胞をマウス抗ヒトCD19およびCD4抗体を用いて標識した。図11(d)は、1つの不死の骨髄単球細胞および初代培養された2つの細胞から樹立したKBT系統交雑のトリハイブリッド細胞株のFACSプロファイル(CD19およびCD4標識)を示す。代表的に、このような安定な系統交雑のトリハイブリッドにおける95%より多い細胞が、親である初代培養された細胞と同様の密度を伴って、BおよびT細胞の両方に関するCDマーカーを発現していた。
他の実施形態において、1つのK562細胞、抗原を経験した1つのB細胞および抗原を経験した1つのT細胞に由来するKBT細胞株を樹立した。この細胞をFACSを用いてCD19、CD3およびCD5の共発現について分析した。
他の実施形態において、1つのK562、胸腺から単離した1つのT細胞(CD4+CD8+について二重陽性)および骨髄から単離した1つの活性化B細胞(CD20+およびCD72+)(項目1.3.3.4に記載されている)の細胞ハイブリダイゼーションに由来するKBT細胞株を樹立した。この細胞を細胞表面上におけるCD4、CD8、CD20およびCD72の共発現について分析した。
この記載は、1つの不死のヒトBリンパ球(WIL2NS)、初代培養された1つのヒトT細胞、および初代培養された1つのヒト単球からの系統交雑のトリハイブリッド細胞の生成の例である。この系統交雑のトリハイブリッド株をWTMと名付け、その後ろに識別番号を付与した。
WTM系統交雑のトリハイブリッドの生成において用いられるWIL2NS細胞の調製については、上述の項目4.1.1に記載されている。脾臓および末梢血に由来するCD14+CD16−またはCD14+CD16L単球;脾臓、末梢血、臍帯血および胸腺に由来するヘルパーT細胞(CD4+);脾臓、末梢血、臍帯血および胸腺に由来する細胞傷害性T細胞(CD8+);臍帯血に由来する、抗原を経験したT細胞(CD3+CD5+)およびCD3+T;胸腺に由来する二重陰性のT細胞(CD3+CD4−CD8−)および二重陽性のT細胞(CD3+CD4+CD8+)を包含している、初代培養された細胞をこれらの実験において用いた。初代培養された種々のリンパ球の、種々のリンパ組織からの単離については上述の通りである(項目1.3.3)。いくつかの実施形態において、骨髄に由来するCD34+CD15+骨髄単球性の前駆細胞をCD14陽性単球の代わりに用いた。
WTM系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順は、培地を変更したことを除いて、KMW系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用いたもの(項目4.1.2参照)と同様であった。これらの実験において用いたハイブリダイゼーションの培地は、235mMのソルビトール、1.8mMのKH2PO4、0.5mMのCaCl2、0.3mMのMg(C2H3O2)2および0.25mMのCa(C2H3O2)2(Sigma)を含んでおり、0.3%のBSAによって補われていた。項目4.2.2の記載とまったく同じ電気的な手順をWTMの生成のために用いた。この新しく作り出した系統交雑のトリハイブリッド細胞の安定な株の回復および樹立のための手順については、項目4.1.2に記載されている。
CDマーカーの発現
1つの不死のリンパ球(WIL2NS)、初代培養された1つのT細胞および初代培養された1つの単球から樹立したWTM系統交雑のトリハイブリッド細胞株
1つのWIL2NS細胞、初代培養された1つのT細胞、および1つの単球の細胞ハイブリダイゼーションに由来するWTM細胞株を樹立した。系統交雑のトリハイブリッド細胞株を通常の条件(項目1.1参照)下において6ヶ月間にわたって培養した後、系統交雑のトリハイブリッド細胞集団を系統特異的なCDマーカーの発現について分析した。初代培養されたこれらのT細胞をハイブリダイゼーションのために用いたときの、WIL2NSから生じたCD19、初代培養された単球に由来するCD14、および初代培養されたT細胞に由来するCD4の共発現について確認するために、三色のFACS分析を用いた。
WTM系統交雑のトリハイブリッド細胞株を生成するためにCD5+抗原を経験したT細胞を用いたときに、三色のFACS分析を用いることによって、CD19およびCD14と同時にCD5の発現を確認した。手順は、マウス抗ヒトCD19−PE抗体およびマウス抗ヒトCD5−FITC抗体を、マウス抗ヒトCD19−FITC抗体およびマウス抗ヒトCD4−PE抗体の代わりに用いたことを除いて、基本的に上記の通りである。系統交雑のトリハイブリッド細胞上におけるこれらのCDの発現のFACSプロファイルを図15に示す。不死の細胞に由来し、B細胞の表現型の要因となるCD19の発現のレベルは細胞集団の約91〜99%において一貫しているようであるが、抗原を経験したT細胞に由来するCD5、および初代培養された単球に由来するCD14の発現はWMTハイブリッド細胞の間で異なっていることが、この分析によって示された。CD19陽性細胞のわずか63%が同様にCD5について陽性であり、CD19陽性細胞の79%がCD14について陽性であった。特に、CD14の発現のレベルはこのようなWMT系統交雑のトリハイブリッド細胞の間で低いレベルから高いレベルまで異なっていた。一方、細胞集団はCD5+およびCD5−系統交雑のトリハイブリッド細胞に明確に分かれた。
WTM系統交雑のトリハイブリッド株を生成するために細胞傷害性CD8陽性T細胞を用いたとき、CD19、CD8およびCD14の共発現を確認するために、この項目において記載したものと同様の三色の標識の手順を用いて、FACS分析を行った。図16は、このWTM系統交雑のトリハイブリッド細胞株の細胞上におけるCD19、CD8およびCD14の発現のFACSプロファイルを示す。CD19の発現およびそのレベルはこれらWMT系統交雑のトリハイブリッド細胞の間で一定に維持されている一方で、これら細胞のわずか46%が初代培養された細胞傷害性T細胞に由来するCD8を低レベルにおいて共発現しており、41%が初代培養された単球に由来するCD14を共発現していた。特に、これらWMT細胞の間におけるCD14の発現のレベルは低レベルから高レベルまで異なっていた。
WTM系統交雑のトリハイブリッド細胞株の生成のために胸腺に由来するCD二重陽性のT細胞(CD4+CD8+)を用いたとき、CD19、CD8およびCD14の発現を分析に加えて、CD4およびCD8の共発現の分析を用いた。図17は、系統交雑のトリハイブリッド細胞株の細胞上におけるCD4およびCD8の共発現についてのFACSプロファイルを示す。二重陽性のT細胞を用いたこの例において、WTM系統交雑のトリハイブリッド細胞の96%がCD4およびCD8の両方について陽性であった。CD4+CD8+陽性のT細胞に由来するWTM系統交雑のトリハイブリッド細胞上におけるCD19およびCD14の発現プロファイルは、細胞傷害性CD8陽性エフェクターT細胞に由来するWTM系統交雑のトリハイブリッド細胞と基本的に類似していた。
WTM系統交雑のトリハイブリッド細胞株を生成するために骨髄に由来するCD34+CD15+骨髄単球細胞を用いたとき、CD19(B系統)、CD3(T系統)、CD15(骨髄系統)およびCD34(前駆細胞)について表面マーカーを分析した。要約すると、マウス抗ヒトCD19−PE抗体、マウス抗ヒトCD4−FITC抗体(BD Pharmingen)およびマウス抗ヒトCD15−PerCP抗体の組合せ、またはマウス抗ヒトCD34−PE抗体、マウス抗ヒトCD4−FITC抗体およびマウス抗ヒトCD15−PerCP抗体の組合せによって、このWTM系統交雑のトリハイブリッド細胞株の細胞を標識した。上述の手順(項目1.3.3.1.1)にしたがって、細胞染色を行った。CD34+CD15+骨髄単球性の前駆細胞に由来するWTM系統交雑のトリハイブリッド細胞の典型的な発現プロファイルを図18に示す。この分析は、WTM系統交雑のトリハイブリッド細胞の約81%がB系統および骨髄単球の表現型(CD19+CD15+)を共有しており、CD19+の61%がT系統のマーカーであるCD4についても陽性であることを示した。CD4+系統交雑のトリハイブリッド細胞の34%がそれらの表面上にCD34も保持しており、CD34+トリハイブリッド細胞の68%がCD15を発現していた。面白いことに、CD34およびCD15はどちらも同じ起源(骨髄単球性の前駆細胞)に由来するにも関わらず、CD34+系統交雑のトリハイブリッド細胞の28%がCD15の発現を維持していなかった。
この種の系統交雑のトリハイブリッドの生成を、1つの不死の骨髄細胞(K562)、1つの不死のBリンパ球(WIL2NS)および初代培養された1つのヒトT細胞によって生成した。この種の系統交雑のトリハイブリッドをKWTと名付け、その後ろに識別番号を付与した。
これら細胞ハイブリダイゼーション実験のためのK562およびWIL2NS細胞の調製については、項目4.1.1に記載されている。細胞ハイブリダイゼーションの前に、最も速い増殖速度を示している細胞型の安定な各クローンを、項目1.1.1に記載されている工程を用いて樹立した。いくつかの実施形態において、項目1.1.3に記載のようなCD71+に関して濃縮されている細胞集団を用いた。さらなる実施形態において、項目1.1.3.1に記載のように選択したCD71+に関して濃縮されているK562集団のCD15+細胞を用いた。脾臓、末梢血、臍帯血および胸腺に由来するヘルパーT細胞(CD4+);脾臓、末梢血、臍帯血および胸腺に由来する細胞傷害性T細胞(CD8+);臍帯血に由来する抗原を経験したT細胞(CD3+CD5+)およびCD3+T細胞;胸腺に由来する二重陰性のT細胞(CD3+CD4−CD8−)および二重陽性のT細胞(CD3+CD4+CD8+)を包含しているKWT系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用いた初代培養された細胞をこれらの実験に用いた(項目1.3参照)。
KWT系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順は、KMW系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用いたもの(項目4.1.2参照)と類似であった。
CDマーカーの発現
1つの不死の骨髄細胞(K562)、1つの不死のリンパ球系(WIL2NS)および初代培養された1つのT細胞から樹立したKWT系統交雑のトリハイブリッド細胞株
1つのK562細胞、1つのWIL2NS細胞、および初代培養された1つのT細胞の細胞ハイブリダイゼーションに由来するKWT細胞株を樹立した。系統交雑のトリハイブリッド細胞株が通常の培養条件下において6ヶ月間にわたって安定であった後、系統交雑のトリハイブリッド細胞集団を系統特異的なCDマーカーの発現について分析した。K562に由来するCD15、WIL2NSに由来するCD19、および初代培養されたエフェクターTヘルパー細胞に由来するCD4の共発現について確認するために、三色のFACS分析を用いた。KWT系統交雑のトリハイブリッド細胞の細胞染色のための手順は、基本的にKWT系統交雑のトリハイブリッドについての記載(項目4.1.3)と同様であった。CD4+エフェクターT細胞に由来するKWT系統交雑のトリハイブリッド細胞のFACSプロファイルを図19に示す。KWT系統交雑のトリハイブリッド細胞の大多数は、骨髄単球、BおよびTリンパ球系統の混合表現型の特性を明らかに示した。KWT系統交雑のトリハイブリッド細胞の100%が細胞表面上に、初代培養されたエフェクターT細胞に由来する、Tリンパ球系統のマーカーであるCD4を発現した一方で、これら細胞の54%が同時にWIL2NS株の不死の細胞に由来するB系統マーカーCD19について陽性であり、これらCD4+CD19+細胞の24%が不死の骨髄単球性の前駆細胞株K562に由来するCD15について陽性であった。
KWT系統交雑のトリハイブリッド株を生成するために二重陽性のT細胞(CD4+CD8+細胞)を用いたとき、初代培養された胸腺細胞に由来するCD4およびCD8の両方の発現プロファイルを同様に分析した。CDプロファイリングのための手順は、マウス抗ヒトCD19−FITC抗体の代わりにマウス抗ヒトCD8−FITC抗体を用いたことを除いて、基本的にCD4+T細胞に由来するKWT系統交雑のトリハイブリッドに関して上述したものと同様であった。二重陽性(CD4+CD8+細胞)のT細胞に由来する系統交雑のトリハイブリッド細胞の典型的なCD発現プロファイルを図20に示す。この結果は、KWT系統交雑のトリハイブリッド細胞の99%がCD4+について陽性であり、69%がCD8について陽性であり、CD4+細胞の26%がCD15骨髄単球細胞マーカーについて陽性であり、CD8+細胞の23%がCD15について陽性であることを示し、これはCD4+CD8+CD15+細胞が全細胞集団の約23%に相当することを意味した(細胞のほぼ100%がCD4+であるため、二重陽性CD8+CD15+集団はCD4に対しても陽性であり得る)。CD4+エフェクターT細胞に由来するKWTトリハイブリッドの場合と同様に、CD19+細胞は全細胞集団の52%に相当し、そのうちの22%がCD15を共発現していた。したがって、22〜23%に相当する全CD15+細胞集団はCD4、CD8およびCD19を共発現していた。
KWT系統交雑のトリハイブリッド株を生成するために抗原を経験したCD5陽性のT細胞を用いた際、CD5の発現を分析した。マウス抗ヒトCD19抗体およびマウス抗ヒトCD5抗体の間において結合させた蛍光体を入れ替えたことを除いて、WTM系統交雑のトリハイブリッドの分析のために用いたもの(項目4.6)と同様の手順を用いて、マウス抗ヒトCD19−FITCおよびマウス抗ヒトCD5−PE抗体を用いて、KWTハイブリッド細胞を標識した。図21に示される結果は、KWT系統交雑のトリハイブリッド細胞の90%が抗原を経験したT細胞に由来するCD5について陽性であり、CD5細胞の49%がWIL2NS細胞(B細胞)に由来するCD19に対しても陽性であることを示した。系統交雑のトリハイブリッド細胞の間のCD19+細胞の全割合は約56%であった。
この種の系統交雑のトリハイブリッドの生成を2つの不死のリンパ球(WIL2NS)および初代培養された1つのヒト単球の体細胞ハイブリダイゼーションによって行った。この系統交雑のトリハイブリッドをWWMと名付け、その後ろに識別番号を付与した。
WIL2NS細胞株を項目4.1.1の記載と同様の手順において培養した。
WWM系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順は、KBT系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用いたもの(項目4.2.2参照)と同様であった。
CDマーカーの発現
WWT系統交雑のトリハイブリッド細胞株が通常の培養条件(項目1.1参照)下において6ヶ月間にわたって安定であった後、系統交雑のトリハイブリッド細胞集団を系統特異的なCDマーカーの発現について分析した。
以下の例は、ヒト以外の哺乳類細胞(特にマウス細胞)を用いて系統交雑のトリハイブリッドを生成し得ることを示す。他の哺乳類細胞からの系統交雑のトリハイブリッドの生成において同様の原理を適用し得ることがわかった。
ここでは、1つの不死のマウスBリンパ球(Sp2)、初代培養された1つのマウスT細胞、および初代培養された1つのマウス単球からの系統交雑のトリハイブリッド細胞の生成について説明する。この系統交雑のトリハイブリッド株をSTmMmと名付け、その後ろに識別番号を付与した。
STmMm系統交雑のトリハイブリッドの生成において用いたSp2細胞の調製については、項目1.1.4に記載されている。末梢血に由来するCD11b+CD90−B220−CD49b−NK1.1−Ly6G−/low単球;脾臓または末梢血に由来するマウスヘルパーT細胞(CD4+);脾臓または末梢血に由来するマウス細胞傷害性T細胞(CD8+);脾臓または末梢血に由来する二重陽性のT細胞(CD4+CD8+)を包含している、初代培養されたマウス細胞をこれらの実験に用いた。初代培養された種々のマウスリンパ球の、脾臓または末梢血からの単離については上述の通りである(項目1.3.5)。
STmMm系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順は、培地ならびにAC電界およびパルスを変更したことを除いて、WTM系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用いたもの(項目4.3.2参照)と同様であった。これらの実験において用いたハイブリダイゼーション培地は、265mMのソルビトール、1.5mMのKH2PO4、0.4mMのCaCl2および0.3mMのMg(C2H3O2)2(Sigma)を含んでおり、0.2%のBSAによって補われていた。0.5MHzおよび65〜75kV/mのAC電界を、それぞれ70μ秒のパルス幅および250〜280kV/mの強度を伴う3秒間隔における3回にわたる連続した方形波パルスと同時に印加した。この新しく作り出した系統交雑のトリハイブリッド細胞の安定な株の回復および樹立のための手順については、項目4.1.2に記載されている。
1つのSp2細胞、初代培養された1つのマウスT細胞および1つのマウス単球に由来するSTmMm細胞株を樹立した。系統交雑のトリハイブリッド細胞株を通常の培養条件(項目1.1参照)下において6ヶ月間にわたって培養した後、系統交雑のトリハイブリッド細胞集団を系統特異的なCDマーカーの発現について分析した。初代培養されたこれらのT細胞をハイブリダイゼーションのために用いたときの、Sp2細胞に由来するCD138、初代培養されたマウス単球に由来するCD11b、および初代培養されたマウスT細胞に由来するCD4の共発現について確認するために、三色のFACS分析を用いた。
この例は、2つの不死のマウスBリンパ球(Sp2)および初代培養された1つのマウス単球からの系統交雑のトリハイブリッド細胞株の生成を詳細について説明する。この系統交雑のトリハイブリッド株をSSMmと名付け、その後ろに識別番号を付与した。
SSMm系統交雑のトリハイブリッドの生成において用いたSp2細胞の調製については、項目1.1.4に記載されている。末梢血に由来するマウスCD11b+CD90−B220−CD49b−NK1.1−Ly6G−/low単球をこれら実験に用いた。初代培養されたマウス単球の、末梢血からの単離については上述の通りである(項目1.3.5)。
SSMm系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順は、STmMm系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用いたもの(項目4.6.1.2参照)と同様であった。
SSMm系統交雑のトリハイブリッド細胞株が通常の培養条件(項目1.1参照)下において6ヶ月間にわたって安定であった後、系統交雑のトリハイブリッド細胞集団を系統特異的なCDマーカーの発現について分析した。
この例は、ヒトおよび非ヒト哺乳類細胞(特にマウス)を用いた系統交雑のキメラトリハイブリッドの生成について詳細に説明する。他の哺乳類細胞からの系統交雑のトリハイブリッドの生成において同様の原理を適用し得ることがわかった。
1つの不死のマウスBリンパ球(Sp2)、1つの不死のヒトBリンパ球(WIL2NS)、ならびに初代培養された1つのマウス単球または初代培養されたヒト単球からの系統交雑のキメラトリハイブリッド細胞株の生成。系統交雑のトリハイブリッド株をSWMm(マウス単球を用いた)およびSWMh(ヒト単球を用いた)と名付けた。各例において、トリハイブリッドの略称に続いて、識別番号を付与した。
SWMmおよびSWMh系統交雑のキメラトリハイブリッドの生成において用いたSp2およびWIL2NS細胞の調製については、項目1.1.4および項目1.1.3のそれぞれに記載されている。CD11b+CD90−B220−CD49b−NK1.1−Ly6G−/lowの、初代培養された末梢血に由来するマウス単球をこれらの実験に用いた。初代培養されたマウス単球の、末梢血からの単離については上述されている(項目1.3.5)。ヒト単球を脾臓、末梢血または臍帯血に由来する混合リンパ球から単離した。単球の単離はCD14マーカーの発現およびいくつかの実施例においては低いレベルのCD16の発現に基づいており、項目1.3.3.1.1に記載のようなFACSまたは磁気ビーズのいずれかに基づいた。異なるリンパ組織からの単球を用いたとき、ハイブリダイゼーションのパラメーターまたは得られた系統交雑のトリハイブリッドにおいて違いはないようであった。
SWMmおよびSWMh系統交雑のトリハイブリッドの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順は、STmMm系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用いたものと同様であった(項目4.6.1.2.参照)。
SWMmおよびSWMh系統交雑のキメラトリハイブリッド細胞株が通常の培養条件(項目1.1参照)下において6ヶ月間にわたって安定であった後、系統交雑のキメラトリハイブリッド細胞集団を系統特異的なCDマーカーの発現について分析した。
5.CDマーカーの分布に基づいた、特異的な異系統の表現型を有している細胞についての、系統交雑のトリハイブリッドの濃縮
以下の項目は、異なる表現型特性に基づいて系統交雑のトリハイブリッド細胞株の亜系統を樹立する一例をもたらす。この試みは、系統特異的な細胞表面マーカー、系統特異的なマーカーの細胞内発現、系統特異的なマーカーのRNA転写産物の存在、核型分類、および/または系統特異的なタンパク質の分泌の分析に基づいた。所望の特性を有している系統交雑のトリハイブリッド細胞を、FACSによって全体の集団から単離した。以下の例は、CD14の発現に基づいている2つのトリハイブリッド集団を有しているWWM系統交雑のトリハイブリッドに基づいている。しかし、この例は、選択した特定の系統交雑のトリハイブリッドまたはマーカーには決して限定されない。
生成した亜系統の系統交雑のトリハイブリッドの性質を確認するため、元の系統交雑のトリハイブリッド細胞、CD19+CD14+に関して濃縮されている継代培養物およびCD14陰性の継代培養物を、CD14についてRT−PCR分析にかけた。ヒトCD14+単球を陽性対照として用いた。上述のようにFACSを用いて、対照細胞を末梢血から単離した(項目1.3.3)。
5’ - CACACTCGCCTGCCTTTTCC - 3’(配列番号1)および
3’−プライマー 5’ GATTCCCGTCCAGTGTCAGG - 3’(配列番号2)を有していた。
6.核型分類
系統交雑のトリハイブリッドの、ハイブリッドの起源を確認するためだけでなく、細胞発生特性を確立するために、系統交雑のトリハイブリッドの核型分類を行った。
一例として、元の細胞株の任意の染色体の不安定性を記録するために、K562の細胞およびWIL2NS細胞株を、初期および後期の継代について核型分類した。所定の細胞株(例えばK562株)について、新たに解凍した株の核型は、通常の培養条件下において数ヶ月間にわたって維持した細胞株と同一であることがわかった。
は以下のとおりである:
クローン1が10%を占める
クローン2が55%を占める
クローン3が10%を占める
クローン4が20%を占める
クローン5が5%を占める。
系統の異なる3つの不死の細胞および初代培養された細胞の種々の組合せに由来しており、さらに所望のタンパク質の発現のために用いる系統交雑のトリハイブリッドを核型分類した。また、これらの核型を元の不死の細胞株(系統交雑のトリハイブリッドの生成に用いた)のものと比較した。
K562不死の骨髄細胞株および初代培養されたBリンパ球およびTリンパ球に由来する2つのKBT系統交雑のトリハイブリッド株を核型分類した。活性化B細胞(CD20+CD72+)および二重陽性のT細胞(CD4+CD8+)に由来し、CD発現特性に基づいた種々の型の細胞を有しているKBT系統交雑のトリハイブリッド(項目4.2.3)も比較のために核型分類した。図26は、K562+B(CD19+)+T(CD4+)ハイブリダイゼーションに由来するKBT系統交雑のトリハイブリッド株(KBT−1株と称する)の典型的な核型を示す。KBT−1の単一細胞クローンが、分類群における66の典型的染色体数を有している近三倍体であることを示した。
不死の骨髄細胞株K562、不死のBリンパ球株WIL2NS、および初代培養されたTリンパ球に由来する3つのKWT系統交雑のトリハイブリッド株を核型分類した。二重陽性のT細胞(CD4+CD8+)に由来し、CD発現特性(項目4.2.3)に基づいた種々のタイプの細胞を有しているKWT系統交雑のトリハイブリッド(KWT−3と称する)も比較のために核型分類した。
2つの不死のBリンパ球(2つのWIL2NS株)および初代培養された単球(CD14+)に由来するWWM系統交雑のトリハイブリッド株も核型分類した。CD14+細胞に関して濃縮されているこの系統交雑のトリハイブリッドの亜系統を同様に核型分類した。図31Aおよび31Bは、それぞれ元のWWM系統交雑のトリハイブリッドおよびそのCD14+に関して濃縮されている亜系統の核型を示す。それぞれの場合において、全部で20の細胞に由来するGバンドを形成した***中期の染色体を、400bphsにおいて分析した。元のWWM系統交雑のトリハイブリッドは47本の染色体(11の細胞(55%)においてみられた)を有している単一優性クローン(a single dominant clone)を含んでいた。しかし、分析した残りの9の細胞は近三倍体(ランダムな染色体欠損を伴う)から近四倍体(ランダムな染色体欠損を伴う)に分布する。これら細胞の何れの間でも一貫性はなかった。一方、CD14+に関して濃縮されているWWM系統交雑のトリハイブリッドの核型は、19の細胞において検出された単一クローンの異常を示した。たった1個の四倍体細胞が検出された。
7.PCRによるEBVゲノムの検出
PCR分析のためにおよび所定の系統交雑のトリハイブリッド細胞株のために、ゲノムDNAを5×106の系統交雑のトリハイブリッドから抽出した。製造者の手順にしたがってQIAamp DNA Micro kit(Qiagen)を用いて、MOLT−4細胞を陰性対照として使用し、一方でCO88BV59−1を陽性対照として使用した。定性PCR分析において、EBVゲノムのBamHI W領域を特異的プライマーを用いて増幅した。上流および下流のプライマー配列は、それぞれ、5’-CAAGAACCCAGACGAGTCCGTAGAA-3’(配列番号3)および5’-AAGAAGCATGTATACTAAGCCTCCC-3’(配列番号4)である(Kimura, et al., 1999)。10mMのTris−HCl(pH8.3)、1.5mMのMgCl2、50mMのKCl、200μMのdNTP、0.6μMの各プライマーおよび0.5UのTaqポリメラーゼ(Lomb Life Science)を含んでいる反応混合物に、10ngの抽出したDNAを加えた。GeneAmp PCR system 9600(Perkin Elmer)を用いて、95℃における2分間の最初の変性に続いて、95℃における15秒間および60℃における1分間を28サイクル行った。増幅させたサンプルを2%アガロースゲルにおいて分離した。
8.マイコプラズマ試験
本発明において用いた任意の細胞株および生成した系統交雑のトリハイブリッド株に対するマイコプラズマ試験を、製造者の手順にしたがってマイコプラズマPCR検出キット(Lomb Scientific)を用いて行った。この試験による結果は、すべての細胞株および系統交雑のトリハイブリッドがマイコプラズマを有していないことを示した。
9.系統交雑のトリハイブリッドの発現系におけるタンパク質の発現およびそれらのキャラクタリゼーション
本発明のおいて具体化したトリハイブリッドの異系統細胞系は、種々の生体物質の調製に用いられ得る。当該生体分子としては、生体分子(例えば、タンパク質、ペプチド、炭化水素、脂質およびそれらのキメラ分子)が挙げられるが、これらに限定されない。特に、生体分子としては、サイトカイン、成長因子ホルモン、受容体またはそれらのフラグメントもしくはキメラ分子が挙げられ得る。トリハイブリッドの異系統細胞から発現したタンパク質のような所望の生体分子が、分泌、膜結合またはその両方を受け得ることを、当業者は理解し得る。さらに、種々のタンパク質のサブユニットが系統交雑のトリハイブリッド細胞において共発現(例えば免疫グロブリンの発現および特にモノクローナル抗体の生産)され得ることを、当業者は理解し得る。また、トリハイブリッドの異系統細胞が種々の機能的タンパク質またはペプチドフラグメントを発現させるために用いられ得ることを、当業者はさらに理解し得る。免疫グロブリンの場合に、当該機能的タンパク質またはペプチドフラグメントは、Fab、Fab’、F(ab’)2およびFvフラグメント(単鎖Fvフラグメントが挙げられる)断片である。
9.1.1.ヒトGM−CSFの発現
CD14陽性細胞を濃縮したWWM系統交雑のトリハイブリッド株(項目5に記載されている)を、この特定の例においてパートナー細胞として用いた。項目1.3.3.1.1に記載のように単離した活性化ヒトCD4陽性リンパ球を、ヒトGM−CSFの起源として用いた。電気的な細胞ハイブリダイゼーションの手順は、基本的に項目4.3.2に記載されているWWM系統交雑のトリハイブリッドの生成のために用いたものと同様であった。得られたWWMとCD4+培養T細胞とのハイブリッドが安定になった後、細胞株として維持し、ProGMと名付けた。
ProGMの上清をサンドイッチ型のELISAによってヒトGM−CSFについて試験した。96ウェルELISAプレート(Corning)を、50μlの精製したウサギポリクローナル抗GM−CSF抗体(10μg/ml)により、4℃において一晩にわたって被覆した。抗体溶液を除去した後、プレート上の残っているタンパク質の結合部位を5%のBSAを含んでいる100μlのPBS(5%BSA−PBS)によってブロックした。次いで、ProGMハイブリッド細胞株由来の50μlの培養上清をウェルに加え、37℃において2時間にわたってインキュベートした。0.05%のTween20を含んでいるPBS(Tween−PBS)を用いて3回にわたって洗浄した後、50μlのウサギ抗GM−CSF抗体(10μg/ml)と共に室温において1時間にわたってインキュベートした。Tween−PBSによって3回にわたって洗浄した後、ペルオキシダーゼを結合させた、200倍希釈の抗ウサギ免疫グロブリンと共に室温において2時間にわたってインキュベートした。Tween−PBSによって3回にわたってリンスした後、ABTSおよび0.01%の過酸化水素と共にインキュベートすることによって最後の反応を可視化した。415nmにおける吸収を測定した。組換えヒトGM−CSFを基準として用いた。すべての分析を、所定のサンプルに関して2回にわたって行った。その結果は、ProGMが最適化されていない培養条件下においてヒトGM−CSFを0.7から1.1μg/ml/106細胞の範囲において産生することを示した。
FACSによって決定したとおりの表現型マーカー(さらなる詳細については項目4.4.3参照)有し、項目6.2.2に記載のように核型分類した、抗原を経験したT細胞(CD3+CD5+)に由来するKWT系統交雑のトリハイブリッド株(KWT−2と称する)を、電気的な細胞ハイブリダイゼーションを介したヒト免疫グロブリンの発現のために用いた。特に、KWT−2系統交雑のトリハイブリッドをこの特定の例においてパートナー細胞株として用いた。項目1.3.3に記載のように単離した、初代培養されたCD40活性化IgM陽性またはIgG陽性B細胞を、ヒトIgの起源として用いた。電気的な細胞ハイブリダイゼーションの手順は項目4.4.2に記載されているKWT系統交雑のトリハイブリッド株の生成のために用いたものと基本的に同様であった。得られたハイブリッドが安定になった後、それらを維持し、ProIMまたはProIG細胞株と名付けた(項目1.1参照)。
ProIMまたはProIG由来の上清を、IgMまたはIgGの存在について、上述したELISA(項目1.3.3参照)によって分析した。細胞を丸底96ウェルプレートにおいて、1ウェルあたり1×105に播き、標準的な条件下において24時間にわたって培養した。血球計算板およびトリパンブルー排除を用いて、細胞のカウントおよび生存率を行った。その結果を表6Aおよび6Bに要約している。各値は3回にわたる独立した計測の平均値±標準偏差(SD)として示されている。
ヒトCD54の発現についての方法論
FACSによって決定したとおりの表現型マーカー(さらなる詳細については項目4.4.3参照)を有し、項目6.2.2に記載のように核型分類した、成熟TヘルパーT細胞(CD4+)に由来するKWT系統交雑のトリハイブリッド(KWT−1と称する)を、電気的な細胞ハイブリダイゼーションを介したヒトCD54の発現のためにさらに用いた。特に、KWT系統交雑のトリハイブリッドをこの特定の例においてパートナー細胞株として用いた。項目1.3.3に記載のように単離した、初代培養されたヒトCD54陽性のT細胞を、ヒトCD54分子の起源として用いた。ハイブリダイゼーションの手順はKWT系統交雑のトリハイブリッド株の生成のために用いたもの(項目4.4.2参照)と基本的に同様であった。得られたハイブリッドが安定になった後、それらを標準的な培養条件(項目1.1参照)下において細胞株として維持し、ProCD54と名付けた。
ProCD54細胞の表面上におけるCD54の発現を、FACS分析を用いることによって確認した。元のKWT系統交雑のトリハイブリッド細胞の100%が、それらの表面上にCD4を発現していた(図19参照)。そのため、ProCD54細胞の表面上におけるCD4の発現を、得られた細胞株の安定性のための基準として用いた。要約すると、100μlの分量あたり1×105の細胞をマウス抗ヒトCD54−FITCおよびマウス抗ヒトCD4−PE抗体を用いて標識し、続いて項目1.3.3.1(CD54+T細胞の単離)における記載と同様の手順を行った。ProCD54細胞の表面上におけるCD4およびCD54の発現の典型的なプロファイルを図34aに示す。元のProCD54細胞の約72%が、CD54について陽性であった。一方、CD4の発現のレベルはKWT系統交雑のトリハイブリッド細胞のものよりもやや低いようであったが、100%の細胞がそのCD4の発現を維持していた。適切なゲートを設定した後、中間から高いレベルのCD54の発現を有しているCD4+CD54+細胞集団(全細胞集団の約42%)を絞り込み、分取した(図34a)。分取した細胞を標準培養培地に再懸濁し、数ヶ月間にわたって培養において維持した。得られた亜系統をProCD54EXと名付けた。次いで、本項目において上述した同様の手順を用いて、この亜系統をそのCD4およびCD54の発現について分析した。ProCD54EXの表面上におけるCD4およびCD54の発現の典型的なプロファイルを図34bに示す。図からわかるように、標準的な条件下における6ヶ月間の培養後、細胞の少なくとも98%がCD4およびCD54の両方の発現を維持していた。さらに、CD54の発現は中間のレベルにおいて均質になった。
多数の従来技術(ベクターを介した遺伝子移入が挙げられる)によって、特定の遺伝子を培養した細胞へ導入し得る。本発明の一実施形態において、トリハイブリッドの系統交雑の細胞に、所望のタンパク質をコードしている遺伝子を一過性にトランスフェクトした。これにより、DNAの取込みから数時間以内に、遺伝子産物(RNAまたはタンパク質のいずれか一方)が得られる。本発明の代替の実施形態において、トリハイブリッドの系統交雑の細胞に、所望のタンパク質をコードしている遺伝子を安定にトランスフェクトした。これは宿主細胞のクロマチンに融合されているプラスミドベクターDNAを含んでいる。
成熟B細胞(CD19+)および成熟Tヘルパー細胞(CD4+)に由来するKBT系統交雑のトリハイブリッド(系統交雑のトリハイブリッド細胞の100%が、FACS(項目4.2.3参照)によって決定されたようにBおよびT細胞の表現型マーカーの両方を共有しており、項目6.2.1に記載のように核型分類された)を、遺伝子トランスフェクション実験のために用いた。系統交雑のトリハイブリッド株の細胞における、所望のタンパク質の一過性トランスフェクションの一実施例として、KBT系統交雑のトリハイブリッドの細胞にヒトIL−4受容体α鎖(hIL4−Rα)をトランスフェクトした。
骨髄サンプルからのPBML細胞の調製については、項目1.3.1に記載されている。100ng/mlの組換えヒトIL−4(R&D systems)と共に標準的な培養条件下において24時間にわたってインキュベートした合計1×106のPBML細胞からhIL4−RαのcDNAをクローンとして増幅させた。総RNAを抽出し(RNeasy Mini Kit,Qiagen)、First Strand cDNA精製キット(Amersham Pharmacia)を用いてcDNAを合成した。hIL4−RαのcDNAを増幅するためにPCRを用いた。センス鎖のプライマー5’-AGGGGCGCGCAGATAATTAAA-3’(配列番号9)
およびアンチセンス鎖のプライマー5’-AGTGGGGCCAATCACCTTCATA-3’(配列番号10)を用いて増幅を行った。2つのBamHI制限部位をhIL4−Rαフラグメントに付加するためにネステッドPCRを用いた[センス鎖のプライマー 5’-GGATCCGCGCAGATAATTAAAGA-3’、(配列番号11) アンチセンス鎖のプライマー 5’-GGATCCAAATCACCTTCATACCAT-3’(配列番号12]。増幅されたcDNAを希釈し、94℃において1分間の最初の変性を行い、続いて94℃において20秒、59℃において45秒、72℃において3分を31サイクル行った。IL4RのcDNAフラグメントをクローニングベクターpGEM−T(Promega)にライゲーションし、JM109コンピテント細胞(Promega)にトランスフェクトした。Plasmid Mini Kit(Qiagen)を用いることによって、プラスミドDNAを調製した。
図37は、hIL4−Rα鎖を一過性にトランスフェクトしたKBT系統交雑のトリハイブリッド細胞株(トランスフェクション後24、48および72時間)からの細胞抽出物のウェスタンブロット分析を示す。トランスフェクションから24時間後の、hIL4−Rα鎖をトランスフェクトしたKBT細胞においてhIL4−Rα鎖を検出し、hIL4−Rα鎖の発現レベルはトランスフェクションから48および72時間後において次第に増加していた。トランスフェクトしていないKBT細胞をhIL4−Rα鎖に対する陰性対照として用いた。hIL4−RαのcDNAの調整のため用いたヒトPBML細胞からの細胞抽出物を、hIL4−Rα鎖に対する陽性対照として用いた。
系統交雑のトリハイブリッド株の細胞における、所望のタンパク質の安定なトランスフェクションの一として、KBT細胞株の細胞にヒトインターロイキン2(hIL−2)遺伝子をトランスフェクトした。
RSVの長い末端繰り返し配列の制御下にラットプレプロインスリンII遺伝子を含んでいるhIL−2発現ベクターpBC12/RSV/IL2(IS)を、トランスフェクションのために用いた。全長のインスリンのリーダー領域および翻訳開始コドンをコードしているインスリン配列が組み込まれている。このキメラのhIL−2のmRNAは、天然型のhIL−2のリーダーおよび開始コドンを含んでいるhIL−2のmRNAよりも、非常に大量のhIL2タンパク質を産生する(Cullen, 1988)。
トランスフェクトしたKBT(KBT TR−IL2)細胞におけるhIL−2のmRNAの発現を、hIL−2に特異的なプライマーを用いたPCRによって確認した。磁気ビーズ分取によってPBMLから得たヒトCD8+T細胞(項目1.3.3.5に記載されている)、およびジャーカット細胞株、クローンE6−1を、陽性対照として用いた。K562細胞、およびトランスフェクトしていないKBTハイブリッド細胞を、陰性対照として用いた。製造者の手順にしたがってRNeasy Miniキット(Qiagen)における種々の処理をした後、トランスフェクトしたKBT細胞から総RNAを抽出した。次のプライマーは、公知の配列に基づいて用いたhIL−2プライマーである(Wang et al, 1989):
5’プライマー= 5’-GAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCC-3’(配列番号13)
3’プライマー= 5’-TGTTTCAGATCCCTTTAGTTCCAG-3’(配列番号14)
増幅を35サイクルにわたって行った。PCRサイクルは、94℃において40秒、hIL2に対する55℃のアニーリング温度、続く72℃における40秒間の伸長からなっていた。PCR産物を2%のアガロースゲルにおいてエチジウムブロマイドによって可視化した。その結果を図38に示す。発現のレベルは、CD8+ヒトTリンパ球およびジャーカット細胞から得られたものと類似している。トランスフェクトしていないKBT細胞およびK562細胞を陰性対照として用いた。
トリハイブリッド系を用いる同時のタンパク質発現の一例として、hIgMを発現させるためにトリハイブリッド細胞をヒトsIgM+CD25+Bリンパ球とハイブリダイズし、続いてhIL−2を用いて安定にトランスフェクトした。hIgMおよびhIL−2の両方を安定に発現しているハイブリッド細胞系に、さらにhIL−4Rαを一過性にトランスフェクトした。この実施例において、hIgMは第1のタンパク質に相当し、hIL−2は同時に発現される第2のタンパク質に相当し、hIL−4Rαは同時に発現される第3のタンパク質に相当した。代替的に、トリハイブリッド細胞に対してhIL−2を安定にトランスフェクトし、続いてヒトshIgM+CD25+B細胞との体細胞ハイブリダイゼーションを行った。hIL−2およびhIgMの両方がハイブリッド細胞系から発現されることを確認した後、このハイブリッド細胞系に、さらにhIL−4Rαを一過性にトランスフェクトした。この実施例において、hIL−2は第1のタンパク質に相当し、hIgMは同時に発現される第2のタンパク質に相当し、hIL−4Rαは同時に発現される第3のタンパク質に相当した。
成熟B細胞(CD19+)および成熟TヘルパーT細胞(CD4+)に由来するKBT系統交雑のトリハイブリッド(系統交雑のトリハイブリッド細胞の100%が、FACSによって決定したようにB細胞およびT細胞の両方の表現型マーカーを共有しており(項目4.2.3参照)、項目6.2.1に記載のように核型分類された)を、これらの実験に用いた。いくつかの実施例において、項目9.2.2に記載されている突然変異生成の工程に由来し、10−4Mのヘポキサンチンおよび10−5Mのチミジンを補った標準培地に維持したdhFr欠損KBT細胞(KBTdhFr−)を実験に用いた。また、hIL−2をトランスフェクトした細胞株KBT TR−IL2(項目9.2.2参照)もいくつかの例に用いた。
KBT細胞またはKBTdhFr−細胞もしくは株KBT TR−IL2細胞とshIgM+CD25+B細胞(記憶B細胞の一部)との間の電気的な細胞ハイブリダイゼーションの手順は、基本的に、項目4.4.2に記載されているKBT系統交雑のトリハイブリッド株の生成のために用いたものと同様であった。得られたハイブリッドが安定になった後、それらを項目1.1に記載のように維持した。得られたハイブリッドによるshIgMおよびCD25の共発現をFACS分析によって確認し(図62参照)、hIgMの産生をELISAによって分析した。また、KBT TR−IL2細胞をshIgM+CD25+B細胞とのハイブリダイゼーションに用いた場合において、hIL−2の産生をhIgMと同時に分析した。
hIL−2を用いた系の安定なトランスフェクションの前に体細胞ハイブリダイゼーションを行うときに、hIgM産生系に、項目9.2.2に記載の方法論を用いてhIL−2をトランスフェクトした。hIgMおよびhIL−2の両方の同時産生をELISAによって確認した。
hIgMおよびhIL−2の両方を分泌している安定なハイブリッド系をさらに、項目9.2.1の記載と同様の方法を用いて、hIL−4Rα遺伝子を用いたエレクトロポレーションによって、一過性にトランスフェクトした。hIgM、hIL−2およびhIL−4Rαの共発現をELISAによって確認した。
同じハイブリッド細胞系の細胞によって同時に発現および共発現されている3つのタンパク質の産生レベルを、表7aおよび表7bに要約している。分析のために、細胞を24ウェルプレートにおいて、1つのタンパク質の発現のために0.5×105/mlの密度まで成長させ、2つのタンパク質の発現のために1.2×105/mlの密度まで成長させ、3つのタンパク質の発現のために3.2×105/mlの密度まで成長させた。この系は3つのタンパク質を同時に産生可能なだけでなく、第1のタンパク質の産生レベルを第2のタンパク質の共発現にしたがって増加させ、第3のタンパク質の発現によってさらに増加させた。同様の方法において、第2のタンパク質の産生は第3のタンパク質の発現によって増加した。
10.ProGMハイブリッドの生成のための無血清培養条件への順応
市販の製品としてのProGMハイブリッド細胞の頑強性を証明するために、1.2Lの使用可能量(working volume)を有しているスピナーフラスコに培養量を拡大し、無血清の環境に培養的に順応させた。
FCS含有量を7.5、5.0、2.5、1.0、0.5および0%まで徐々に減らすことによって、hGM−CSFを最も多く産生しているProGMハイブリッドのクローンを、無血清の環境において成長するように順応させた。最も頑強な細胞成長および上記hGM−CSFの産生を示している継代培養物のみを、連続して低くなる血清の環境に移した。選択した各継代培養物を、保存用の5%のDMSOを含んでいる我々の標準培地において冷凍した。2つの無血清培養培地を順応の目的のために用いた。市販の無血清および無タンパク質の限定培地Hybri-Max(Sigma)またはExcel(JHR)をいくつか改変して用いた。細胞の生存率を7日目にトリパンブルー排除によって評価した。hGM−CSFの濃度を同日にELISAによって決定した。
無血清培養条件への順応の結果を表8に示す。
11.1.スピナーフラスコにおける産生
方法論
1.2Lの使用可能量を有しているスピナーフラスコを、50rpmにおいて攪拌した。無血清の環境における成長について順応したProGMハイブリッド細胞(ProGMsf)を1×105/mlの濃度において播いた。5%のCO2を含んでいる加湿した雰囲気、37℃において、培養物をインキュベートした。達成した最大の細胞密度は5×105/mlであった。トリパンブルー排除法を用いて生細胞を判定した。毎日の培地交換を、9日目まで行った。細胞上清(600ml)を1000rpmにおいて10分間にわたって遠心分離し、培地を除去して新鮮な培地と交換し、細胞をスピナーフラスコに戻した。分泌されたhGM−CSFの濃度をELISAによって決定した。1:500に希釈した100μlのラット抗ヒトGM−CSF(R&D)を用いて、各ウェルを被覆した。0.05%v/vのTween20を含んでいるPBT(PBS−T)を用いて洗浄した後、100μlのPBS−5%v/vのBSAにおける標準のrhGM−CSF(Invitrogen)(0.195〜200ng/mlの範囲に及ぶ)またはそれぞれ100倍希釈した100μlのサンプルを、ウェルに加えた(2回分ずつ)。すべてのインキュベーションを37℃において1時間行った。その後、PBS−Tを用いてプレートを洗浄し、PBS−BSA−Tにおいて1:1000に希釈した100μlのウサギ抗ヒトGM−CSF(R&D)抗体を加え、インキュベーションおよび洗浄をした後、同じ緩衝液において1:1000に希釈した100μlのヤギ抗ウサギ免疫グロブリン−HRP結合体を加えた。もう一度、プレートをインキュベートおよび洗浄し、100μlの基質を加えた。450nmにおける吸光度を測定した。
1mlあたり5×105という比較的に低い細胞密度は、ProGMsfの細胞成長に対する最適下限の培養条件を示している。より高い密度(106細胞/mlの次数の)を得るためには、グルコース含有量および他の補完物を含んでいる培養条件のさらなる最適化を必要とし得る。また、乳酸塩およびアンモニウムの含有量の綿密なモニタリング(close monitoring)が妥当とされている。最適下限の成長にもかかわらず、培養上清中のhGM−CSFの濃度は、1mlあたり2.8から4.2μgの間に分布した。細胞密度および時間について標準化した場合、ProGMsfは、0.6から0.9μgのhGM−CSF/ml/106/24時間の産生速度を示した。比較として、CHO細胞における0.3μgのタンパク質/ml/106/24時間の産生は高いとみなされている。
方法論
ProGMsf培養物由来の上清を40℃においてPM−10膜(Amicon)を用いて約10倍に濃縮した。大腸菌由来のヒトGM−CSFに対するラット抗ヒトGM−CSFをAffi−Gel 10(Bio-Rad)に対して製造者の手順にしたがって結合させ、PBS(137mMのNaCl、3mMのKCl、8mMのNa2HPO4、1.5mMのKH2PO4)を用いて平衡化させることによって調製した免疫アフィニティーカラムに、サンプル濃縮物をロードした。0.1mMのクエン酸ナトリウム、pH2.8を用いて、結合させタンパク質を溶出させた。次いで、アフィニティーカラムから溶出したタンパク質を、RP 300 HPLCカラムにロードし、0.1ml/分の流速において、60分間にわたって、0〜60%のアセト硝酸塩勾配を用いて溶出させた。得られた溶出プロファイルを図40に示す。RP−HPLCから回収された部分をELISA、銀染色およびウェスタンブロット分析のために集めた。
表9は、典型的な二段階精製からのhGM−CSFの回収を示す。アフィニティーカラムからの最初の回収率はわずか59%であり、わずか2%のhGM−CSFがRPHPLC後に失われた。アフィニティー精製後の低い回収率の原因となっている複数の可能性が存在する。hGM−CSFの13%が貫流および洗浄の段階において失われたため、アフィニティーカラムの結合容量がProGMsfの上清中のhGM−CSFの量より小さくなり得る。低い回収率は、ProGMsfハイブリッドによって産生されたhGM−CSFのグリコシル化型と比較して、大腸菌由来のhGM−CSFに対するラット抗体の親和性が低いことにも起因し得る。最終的な収率についての考え得る他の改良は、より最適化された溶出条件の開発であり得る。図41において(項目12参照)、RP−HPLC後に回収した画分のウェスタンブロットは、hGM−CSfが画分24〜36(24〜36分において溶出している)において溶出したことを明らかにした。高い分子量型(28〜32kDa)は画分24から27において溶出し、一方で、より低い分子量の分子(18〜22kDa)は画分34から36において溶出した。これらのクロマトグラフィーの条件は、hGM−CSFの異なる分子量型を(特に高い分子量および中間の分子量の画分において)完全には分離しなかった。
12.グリコシダーゼによる消化
方法論
ProGMsfハイブリッドに由来する精製したヒトGM−CSFを、1%のSDS、1MのP−メルカプトエタノール、100mMのリン酸ナトリウム、pH7.0において、100℃において3分間にわたって熱変性させ、0.8UのシークエンスグレードのPNGアーゼF(Sigma)を加え、37℃においてさらなる長時間にわたってインキュベートした。
図43にみられるように、N−消化後、ProGMsfハイブリッドに由来するhGM−CSF型は時間に依存して、大腸菌に由来するhGM−CSFに近い位置に移動した。しかし、消化後の何れのバンドも大腸菌によって産生された非グリコシル化型と一致しなかった。これらの結果は、ProGMsfハイブリッドに由来するhGM−CSFがN−グリコシル化部位およびO−グリコシル化部位の両方においてグリコシル化されること、ならびに分子量の分布が不均質なグリコシル化によって引き起こされることを示唆する。hGM−CSFのすべての分子におけるO−グリコシル化のこの発見は、保護されていないO−グリコシル化部位の免疫原性の観点から重要である;O−グリコシル化を欠いている組換えヒトGM−CSFは、臨床試験において抗体を発達させることが報告されている。
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Claims (65)
- 未拘束の前駆細胞に由来する細胞、または幹細胞であり、骨髄腫細胞ではない第1の細胞;
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第2の細胞;ならびに
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第3の細胞
のハイブリダイゼーションによって生成された、ハイブリッド細胞。 - 上記第2の細胞がBリンパ球系統に由来する細胞であり、上記第3の細胞がBリンパ球系統に由来する細胞である、請求項1に記載のハイブリッド細胞。
- 上記第2の細胞がTリンパ球系統に由来する細胞であり、上記第3の細胞がTリンパ球系統に由来する細胞である、請求項1に記載のハイブリッド細胞。
- 上記第2の細胞がBリンパ球系統に由来する細胞であり、上記第3の細胞がTリンパ球系統に由来する細胞である、請求項1に記載のハイブリッド細胞。
- 上記第1の細胞が骨髄性の共通前駆細胞に由来する細胞である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞。
- 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞が、骨髄単球性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球である、請求項5に記載のハイブリッド細胞。
- 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞が、以下のCD抗原:CD16、CD15またはCD14のうち少なくとも1つを提示している、請求項5に記載のハイブリッド細胞。
- 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞が単球である、請求項5に記載のハイブリッド細胞。
- 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞が初代培養された骨髄単球性の前駆細胞である、請求項5に記載のハイブリッド細胞。
- 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞が不死化された細胞である、請求項5に記載のハイブリッド細胞。
- 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞が、脾臓、末梢血、臍帯血または骨髄に由来するものである、請求項5に記載のハイブリッド細胞。
- Bリンパ球系統に由来する上記細胞が、プレB細胞、未成熟なB細胞、ナイーブB細胞、活性化B細胞またはエフェクターB細胞である、請求項2または4に記載のハイブリッド細胞。
- 上記エフェクターB細胞が、抗原を経験したB細胞またはプラズマ細胞である、請求項12に記載のハイブリッド細胞。
- Bリンパ球系統に由来する上記細胞が、以下のCD抗原:CD19、CD20、CD72またはCD5のうち少なくとも1つを提示している、請求項2または4に記載のハイブリッド細胞。
- Tリンパ球系統に由来する上記細胞が、前T細胞、未成熟T細胞、ナイーブT細胞、活性化T細胞またはエフェクターT細胞である、請求項3または4に記載のハイブリッド細胞。
- Tリンパ球系統に由来する上記細胞が、以下のCD抗原:CD3、CD4、CD5またはCD8のうち少なくとも1つを提示している、請求項3または4に記載のハイブリッド細胞。
- Bリンパ球系統に由来する上記細胞が不死化された細胞である、請求項2または4に記載のハイブリッド細胞。
- Tリンパ球系統に由来する上記細胞が不死化された細胞である、請求項3または4に記載のハイブリッド細胞。
- Bリンパ球系統に由来する上記細胞がリンパ組織に由来するものである、請求項2または4に記載のハイブリッド細胞。
- Tリンパ球系統に由来する上記細胞がリンパ組織に由来するものである、請求項3または4に記載のハイブリッド細胞。
- 上記リンパ組織が、末梢血、臍帯血、脾臓、骨髄、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺および所属リンパ節から選択される、請求項19または20に記載のハイブリッド細胞。
- 上記細胞の少なくとも1つがヒト細胞である、請求項1〜21のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞。
- 上記細胞の少なくとも1つがマウス細胞である、請求項1〜22のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞。
- 骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞がK562細胞である、請求項5に記載のハイブリッド細胞。
- 上記第2の細胞または上記第3の細胞が、WIL2−NS細胞またはMOLT4細胞である、請求項1に記載のハイブリッド細胞。
- Bリンパ球系統に由来する上記細胞が、WIL2−NS細胞である、請求項2または4に記載のハイブリッド細胞。
- 上記Tリンパ球系統に由来する上記細胞が、MOLT4細胞である、請求項3または4に記載のハイブリッド細胞。
- 上記第1の細胞がK562細胞であり、上記第2の細胞がWIL2−NS細胞であり、上記第3の細胞がMOLT4細胞である、請求項1または4に記載のハイブリッド細胞。
- 上記第1の細胞がK562細胞であり、上記第2の細胞が初代培養されたB細胞であり、上記第3の細胞が初代培養されたT細胞である、請求項1または4に記載のハイブリッド細胞。
- 上記第1の細胞が初代培養されたヒト単球であり、上記第2の細胞がWIL2−NS細胞であり、上記第3の細胞が初代培養されたT細胞である、請求項1または4に記載のハイブリッド細胞。
- 上記第1の細胞が初代培養されたヒト骨髄性の共通前駆細胞であり、上記第2の細胞がWIL2−NS細胞であり、上記第3の細胞が初代培養されたヒトT細胞である、請求項1または4に記載のハイブリッド細胞。
- 上記第1の細胞がK562細胞であり、上記第2の細胞がWIL2−NS細胞であり、上記第3の細胞が初代培養されたT細胞である、請求項1または4に記載のハイブリッド細胞。
- 上記第1の細胞が初代培養された単球であり、上記第2の細胞がWIL2−NS細胞であり、上記第3の細胞がWIL2−NS細胞である、請求項1または2に記載のハイブリッド細胞。
- 上記第1の細胞が初代培養されたマウス単球であり、上記第2の細胞がSP2細胞であり、上記第3の細胞が初代培養されたマウスT細胞である、請求項1または4に記載のハイブリッド細胞。
- 上記第1の細胞が初代培養されたマウス単球であり、上記第2の細胞がSP2細胞であり、上記第3の細胞がSP2細胞である、請求項1または2に記載のハイブリッド細胞。
- 上記第1の細胞が初代培養されたヒトまたはマウス単球であり、上記第2の細胞がWIL2−NS細胞であり、上記第3の細胞がSP2細胞である、請求項1または2に記載のハイブリッド細胞。
- 所望のタンパク質の1つを発現している、請求項1〜36のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞。
- 所望のタンパク質の2つ以上を発現している、請求項1〜36のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞。
- 所望のタンパク質の2つを発現している、請求項38に記載のハイブリッド細胞。
- 所望のタンパク質の3つを発現している、請求項38に記載のハイブリッド細胞。
- 上記タンパク質が内在性タンパク質である、請求項37に記載のハイブリッド細胞。
- 上記タンパク質のうち少なくとも1つが内在性タンパク質である、請求項38〜40のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞。
- 上記タンパク質が組換えタンパク質である、請求項37に記載のハイブリッド細胞。
- 上記タンパク質のうち少なくとも1つが組換えタンパク質である、請求項38〜40のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞。
- 上記タンパク質がサイトカインである、請求項36〜44のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞。
- 上記タンパク質がコロニー刺激因子である、請求項37〜44のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞。
- 上記タンパク質がインターロイキンである、請求項37〜44のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞。
- 上記タンパク質がGM−CSFである、請求項37〜44のいずれか1項または46に記載のハイブリッド細胞。
- 上記タンパク質がインターロイキン2である、請求項37〜44のいずれか1項または47に記載のハイブリッド細胞。
- 上記タンパク質が受容体またはそのフラグメントである、請求項37〜44のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞。
- 上記タンパク質が可溶性の受容体である、請求項37〜44のいずれか1項または50に記載のハイブリッド細胞。
- 上記タンパク質がヒトIL−4受容体α鎖である、請求項36〜44のいずれか1項または50に記載のハイブリッド細胞。
- 上記タンパク質が免疫グロブリンである、請求項36〜44のいずれか1項または50に記載のハイブリッド細胞。
- 上記免疫グロブリンがIgMである、請求項53に記載のハイブリッド細胞。
- 上記免疫グロブリンがIgGである、請求項53に記載のハイブリッド細胞。
- 上記タンパク質がCD54である、請求項37〜44のいずれか1項または51に記載のハイブリッド細胞。
- 上記ハイブリダイゼーションが電気的手段によってなされる、請求項1〜56のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞。
- 上記ハイブリダイゼーションが化学的手段によってなされる、請求項1〜56のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞。
- 所定のタンパク質を発現している細胞とさらにハイブリダイズされた、請求項1〜58のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞。
- 上記ハイブリダイゼーションが個々の細胞3つをハイブリダイズすることによって行われる、請求項1〜58のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞。
- 上記ハイブリダイゼーションが3つの細胞集団を用いて行われ、当該集団のそれぞれが同一の細胞型を複数含んでいる、請求項1〜58のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞。
- 所望の翻訳後修飾または所望の機能性を示すタンパク質の発現を可能にするために、特定の細胞型を特徴付けるマーカーに関して濃縮されている、請求項1〜61のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞。
- 請求項1〜62のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞を生成する方法であって、
未拘束の前駆細胞に由来する細胞または幹細胞であり、骨髄腫細胞ではない第1の細胞;
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第2の細胞;ならびに
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第3の細胞
をハイブリダイズする工程を包含している、方法。 - 請求項1〜62のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞においてタンパク質を発現させる工程を包含している、タンパク質を製造する方法。
- 請求項1〜62のいずれか1項に記載のハイブリッド細胞において生産された、タンパク質。
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