KR880002318B1 - 무혈청 배지 - Google Patents

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무혈청 배지

제1도는 정상 혈청 농도의 배지에서 배양한 대조균과 혈청농도를 3%로 감소시키고 B-세포성장 인자를 첨가한 배지에서 배양한 시험군에서 나말바 세포의 성장을 비교한 성장 곡선 비교도이다.

제2도는 형청 농도를 1%로 감소시키고, B-세포성장 인자를 첨가한 배지와 이를 첨가하지 않은 배지에서 배양한 나말바 세포의 성장을 정상 혈청농도의 배지에서 배양한 나말바 세포의 성장과 비교한 성장 곡선 비교도 이다.

제3도는 9가지 무기이온 성분 각각을 첨가하는 것에 따르는 나말바 세포의 성장과 증식을 대조군과 비교한 비교도 이다.

제4도는 호르몬, 성장 인자 및 기타 성분들 각각을 첨가하는 것에 따르는 나말바 세포의 성장과 증식을 대조군과 비교한 비교도이다.

본 발명은 임파종 세포와 골수종 세포 및 이들로 부터 유래하는 하이브리도마(hybridoma)세포들을 배양하는데 사용될 수 있는 무혈청 배지(serum-free media)에 관한 것이다.

본 발명의 무혈청 배지는 이러한 세포들의 배양에 사용되어 왔던 종래의 배지성분 중에서 혈청 성분을 완전히 제거하고, 이를 무기 이온, 호르몬 및 기타 성분들을 대체하여 제조한 것으로, 세포를 장기간에 걸쳐서 정상적으로 성장시킬 수 있는 동시에 목적하는 물질도 효과적으로 생성시킬 수 있는 것이다. 포유 동물 세포를 배양하는데 필수 불가결한 배지 성분으로서 가장 일반적으로 사용되어온 혈청은 그 공급원의 종, 나이, 성별등에 따라서 구성성분이 매우 불균일하며(Proceedings of the Society for Experimental Biology and Mecidine 149, 344, 1975), 조성 및 기능이 완전히 밝혀지지 않은 성분들도 포함되어 있으므로 배양하고자 하는 특정 세포의 성장과 성숙을 일괄성있게 통제시킬 수 없는 것이었다.

따라서, 특성 세포군의 성장과 성숙에 효과적인 배지 성분을 구체적으로 규명하기 위한 연구가 계속 이루어지므로써 조직 배양에서의 혈청의 주요 역할은 그 세포의 성장에 요구되는 호르몬과 성장 인자를 공급하는 것임을 밝혀짐에 따라(Control of proliferation in animal cells, p97, 1974/proc Natl.Acad.Sci. USA75, 901, 1978), 혈청을 호르몬과 성장 인자로 대체한 무혈청 배지에서의 세포 배양에 성공하였다.

(Methods in Enzymol.45, 94, 1979/Anal.Biochem. 114,422, 1981 & Nature, 259, 132, 1976/proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 75,901,1978/Cells, tissue and organ cultures in neurobiology p619, 1977/In vitro 14,24,1978). 또한, 최근에 들어서서는 단일 클론항체의 생산과 관련된 세포균의 산업적인 대량 생산에 관하여 관심이 높아져 가고있는 실정으로 부분적으로는 이러한 세포들의 특정 종류에 대하여 혈청 대신 호르몬을 사용한 것이 보고된 바있다.

(Antimicrob. Agents Chemotherapy 18(6), 930, 1980/Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1158, 1982). 그러나, 임파종 세포, 골수종 세포 및 하이브리도마 세포에 사용된 종래의 무혈청 배지는 영양 요구가 까다로운 NS-1(P3/NS1/1-Ag4-1)세포와 이로 부터 유래된 하이브리도마 세포는 성장 시킬수 없는 등 적용할 수 있는 세포종의 범위가 한정되어 있으며, 이러한 무혈청 배지에서 성장시킨 세포들은 물리적인 접촉에 의하여 매우 손상 받기 쉬우므로 세포들이 고밀도로 성장한 상태에서는 세포 생존률에 상당한 손실이 있는 것이다. 따라서, 통기성을 유지시키고 세포간에 일정한 공간을 확보시키기 위하여 세포들을 계속 순환시켜야 하는 대량 생산의 경우에 있어서는 원하는 물질의 생산량이 떨어지게 되는 것이다.

또한, Sp2(Sp2/0-Ag 14)와 그 하이브리도마 세포는 이러한 무혈청 배지에서 성장한 경우에 혈청이 첨가된 배지에서 성장한 경우보다 세포 성장률이 낮았으며, 클로닝 효율성도 1-3%로 혈청이 첨가된 배지에서의 60-90%에 비하여 상당히 낮았다. 하이브리도마 세포에서의 이러한 성장률의 둔화는 단일클론항체의 생산에 여러가지의 변형을 초래하는 인자로 작용 할 수 있는 것이다.

따라서 본 발명에서는 기존의 배지 성분증에서 혈청 성분을 제거하여 목적 세포에 대한 불확실한 영향력(성장 촉진 또는 성장억제)을 제거하고, 그 조성 및 기능이 명확히 밝혀진 성분들도 이루어진 합성 배지를 제조함으로서 원하는 세포의 효율적인 성장과 성숙을 기할 수 있게 한 것이다.

본 발명의 합성 무혈청 배지는 세포의 성장과 성숙에 대한 효과가 입증된 바 있는 트랜스페린(transferrin), 인슐린, 인혈청 알부민(human serum albumin), 소혈청 알부민(Anal.Biochem. 102, 255-270, 1980/The Journal of Experimental Medicine 147,923-933, 1978) 및 모노에탄올 아민(Proc.Natl.Acad.Sci. USA 79, 1158-1162, 1982)과, 락트 알부민 하이드로리세이트(lactalbumin hydrolysate), 글리세롤, 카르복시메틸셀룰로오즈(CMC), B-세포 성장 인자(B-cell growth factor)및 무기이온을 공통 성분으로 하여 공통적으로 적용될 수 있는 범위를 확보함과 동시에 특정 세포의 요구 특이성에 따라서 다양한 구성 성분을 첨가하거나 배제함으로서 각각의 세포들이 최적의 상태에서 성장, 성숙할 수 있도록 한 것이다.

또한, 본 발명의 합성 무혈청 배지는 혈청으로 부터 유래하는 불순물을 근본적으로 포함하고 있지 않으므로, 고순도의 세포 생산물을 용이하고 신속하게 분리할 수 있게 한다.

따라서, 대량 생산의 경우에 있어서 분리, 정제 과정에 소요되는 경비를 절감시킬 수 있게 하며 의학적인 측면에서도 혈청 단백질의 오염에 의하여 야기될 수 있는 제반 문제들을 제거하여 주는 것이다.

본 발명의 합성 무혈청 배지는 임파종 세포, 골수종 세포 및 하이브리도마 세포의 배양에 사용되어 온 종래의 무혈청 배지에 비하여 더욱 다양한 종류의 B-임파종세포, 골수종 세포 및 하이브리도마 세포들에 적용될 수 있다. 특히, 본 발명의 합성 배지는 마우스의 골수종 세포인 NSO와 Sp2 및 이들을 융합 배우자(fusion partner)로 하여 유래된 하이브리도마 세포, 사람의 골수종 세포인 사람 마이엘로마 RPMI 8226과 사람 임파종 세포인 나말바(Namalva)세포와 이들로부터 유래된 하이브리도마 세포등에 있어서 괄목 할만한 성장과 성숙이 나타나게 하는데, 이는 본 발명의 합성 무혈청 배지가 상기한 다양한 세포들의 상이한 영양 요구성을 충분히 만족시킨다는 것을 입증하는 것이다.

상기한 다양한 세포군들은 본 발명의 배지에서 배양된 경우에 혈청 배지에서 배양된 경우와 유사한 세포 성장률을 나타내었으며, 각각의 하이브리도마 세포로 부터 생성된 항체의 양은 혈청 배지에서 배양된 경우보다 많았고(120%), 이때 생산된 항체는 본래의 단일 클론 항체의 선택성이 조금도 변형되지 않은 것이었다. 또한, 클로닝 효율성도 10-12%로 종래의 무혈청 배지에서 보다 높게 나타났으며, 기계적 지주에 대해서도 혈청 배지에서 배양된 세포들 보다 우수한 저항성(세포 생존률 96%이상)을 나타내었다. 이는 종래의 무혈청 배지에서는 고려되지 않았던 삼투압을 적합수준(328-390 mosm/ℓ)으로 조정함으로서 유도된 것으로 본 발명의 합성 무혈청 배지를 사용하여 목적하는 세포를 산업적으로 대량 생산하는 경우에 현격한 생산성의 향상을 가져올 수 있게 한 것이다.

본 발명에서는 기본 세포주로는 사람 임파종 세포인 나말바 세포를 이용하였으며, 무혈청 배지의 적용 시험에는 사람 마이엘로마 RPMI 8226, NSO, Sp2, 548, 46, 20(사람 인터페론에 대한 단일클론항체 생산 세포주)등을 사용하였다.

본 발명에서는 나말바 세포를 설정한 다음, 이 세포의 성장에 B-세포 성장인자가 영향을 미친다는 것을 밝혀내고 이에 대한 적정 농도를 결정하였다. 이로 부터 혈청농도를 줄이고 B-세포 성자 인자를 함유시킨 배지에서 나말바 세포를 장기간 배양하는데 성공하였다.

이러한 조건하에서 무기염류, 호르몬 및 기타 성분 각각을 배지에 첨가한 후, 세포의 성장 여부를 대조군(정상 혈청 농도의 배지에서 성장한 나말바 세포들)과 비교하여 최종 성분 및 이에 대한 적정 농도를 결정한 다음, 혈청을 함유하지 않은 RPMI 1640 배지에 각 성분을 적정 농도로 첨가하여 무혈청 배지를 제조하였다. 그런다음, 이 무혈청 배지에서 나말바 세포를 장기간 배양한 결과 6개월 이상의 배양에서 세포의 분열시간, 형태 및 인터페론의 생산에 아무런 영향도 없었다. 또한, 적용 시험 결과 이 배지를 상기한 세포들에도 사용 할 수 있음을 확인하였다.

[실시예 1]

B-세포 성자인자(BCGF)에 의한 나말바 세포의 순환 시험

나말바 세포는 7%NBCS(New Born Calf Serum)를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 정상적으로 성장하는데, 이러한 정상적인 성장을 나타내는 나말바 세포의 분열 시간은 최적의 조건하에서 24시간이며, 이 때의 세포 농도는 2-3×10⁶cells/ml에 도달하게 된다.

본 실시예에서는 나말바 세포를 증간 대수 증식기까지 정상적으로 배양한 다음, 이 배양액을 실온에서 1500×g로 10분간 원심 분리하여 세포들을 수확하였다. 그런다음 배양 용기에 3% NBCS를 함유하는 RPMI 1640 배지 20㎖를 가하여 세포 농도가 약 2.0×10⁴cells/㎖로 되도록 하였다. 여기에 B-세포 성장 인자(BCGF)를 최종 농도 0.2%(v/v)로 되도록 조절하여 가하고, 5%이산화탄소가 공급되는 37℃의 배양기에 비교하였다.

7% NBCS를 함유하는 RPMI1640배지에서 배양하는 세포들을 대조군으로하여 배양기로 부터 일정한 시간 간격으로 시료를 취하여 트립판 블루로 염색 한 다음, 헤모사이토메타를 사용하여 살아 있는 세포의 수를 측정 하였다.

이때 20패세시(passage)시켜 순화(adaptation)시킨 세포를 시험군과 대조군에서 같은 수로 사용하여 실시 하였는데, 측정 결과 세포는 3% NBCS를 포함하는 배지에서도 7%NBCS를 포함하는 배지에서와 거의 유사하게 성장함을 알 수 있었다. (제1도)

따라서, 혈청농도를 7%에서 3%로 낮춘 배지에 B-세포성장 인자를 가해주는 것만으로도 세포를 정상적으로 성장시킬수 있으며, 이는 B-세포 계통의 성장에 필수적인 성분이라는 것을 알 수 있었다.

상술한 방법으로 B-세포 성장 인자만을 사용하여 혈청 농도를 감소시킨 결과, 최소한 1%의 혈청 농도에서도 거의 정상적인 성장을 나타내었다(제2도).

즉, 혈청 농도를 1%로 낮춘 배지에서는 세포들이 거의 성장하지 않았으나, 혈청농도를 1%로 낮춘 배지에 최종농도가 0.2v/v%로 되도록 B-세포 성장인자를 가해준 배지에서는 세포들이 거의 정상적으로 성장하였다.

따라서, B-세포 성장 인자를 사용함으로서 최대한 1%의 혈청농도에서는 나말바 세포를 정상적으로 성장시킬 수 있는 것이다.

[실시예 2]

나말바 세포의 성장에 영향을 미치는 무기이온과 호르몬의 조성 및 적정 농도의 결정.

무혈청 배지를 사용하여 나말바 세포를 배양하기 위해서는 이에 필수적인 무기이온, 호르몬 및 기타 성장인자들의 조성 및 농도를 결정할 필요가 있는 것이다.

따라서 하기의 표1에 기재한 23가지의 성분 중에서 나말바 세포의 성장에 영향을 나타내는 것 만을 밝혀내어 무혈청 배지를 제조 하는데 사용하였다.

[표 1]

먼저 나말바 세포의 성장에 대한 무기이온의 영향을 9가지 무기이온 각각에 대하여 조사하였다.

나말바 세포를 3% NBCS를 포함하는 RPMI 1640배지에서 중간 대수 중식까지 정상적으로 성장시킨 다음, 실온에서 1500×g로 10분간 원심분리하여 세포들을 수확하였다. 세포 농도가 2×10⁵cell/㎖로 되도록 조절한 다음, T-25배양용기에 7㎖씩 넣고 B-세포 성장 인자를 0.1v/v%로 첨가하였다.

이 배양 용기에 9가지 무기이온 각각을 표1에 기재된 적정농도로 적절히 조절하여 가한 다음, 5%이산화탄소가 공급되는 37℃의 배양기에서 배양하였다. 3일과 5일 경과 후에 배양기로 부터 일정량의 배양액을 취하여 살아 있는 세포의 수를 측정하였다. 측정 결과, Cu, Zu 및 Fe가 나말바 세포의 성장에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.(제3도).

호르몬, 성장 인자 및 기타 화합물들로 된 표1의 13가지 성분들에 대해서도 상술한 방법으로 조사한 결과, 트랜스페린, 인슐린, 소혈청 알부민, 락트 알부민 하이드로리 세이트, 글리세롤 및 카르복시메틸 셀룰로오즈가 나말바 세포의 성장에 영향을 미침을 알 수 있었다(제4도).

나말바 세포의 성장에 영향을 미치는 9가지 성분들에 대한 최소 요구량(나말바 세포의 성장에 급격한 변화를 초래하지 않는 양)을 상술한 방법으로 결정하여 표2에 가재하였다.

[표 2]

[실시예 3]

나말바 세포의 정상적인 배양을 위한 합성 무혈청 배지의 제조.

상술한 실시예 1과 실시예 2에서 얻어진 결과를 이용하여 나말바 세포를 정상적으로 성장시킬수 있는 무혈청 배지를 제조하였다.

RPMI 1640배지 성분중에서 혈청을 완전히 제거하고 Cu(0.8ng/㎖), Zn(40 ng/㎖), Fe(30 ng/㎖), 인슐린(3㎍/㎖), 트랜스페린(3㎍/㎖), 소혈청 알부민(2㎎/㎖), 락트알부민 하이드로리 세이트(7㎎/㎖), 글리세롤(5㎍/㎖) 및 카르복시 메틸 셀룰로오즈(2㎍/㎖)를 가하고(표2), B-세포 성장인자를 0.1v/v%의 농도로 가하였다. 3% NBCS를 포함하는 RPMI 1640배지에서 순화시킨 나말바 세포를 1500×g로 10분간 원심 분리하여 세포를 수확한 다음, 상기한 RPMI 1640배지 (혈청대신 표2의 성분과 B-세포 성장 인자를 포함하는 배지)에 2-3×10⁵cells/㎖의 농도가 되도록 적절히 가하였다. 전체 부피가 500㎖가 되면, 스파이너 플라스크(spinner flask)에 넣고 5%이산화탄소가 공급되는 37℃의 배양기에 배양하였다. 일정한 시간 간격으로 배양액을 취하여 헤모사이토메타를 사용하여 트립판 블루 염료 배척 (dye exclusion)방법으로 살아 있는 세포의 수를 측정한 결과, 20패세지 이상을 경과하는 동안의 분열시간은 18-20시간 이었으며, 살아있는 세포의수도 96%를 유지하였다. 또한, 오랜기간 동안의 배양에 의해서도 세포의 크기나 형태가 변하지 않았으며 7%의 혈청농도를 지닌 배지에서 배양한 경우와 거의 유사한 성장과 증식을 하였다.

[실시예 4]

동물 및 사람 B-세포의 합성 무혈청 배지에 대한 적용 시험 및 세포 생성물의 비교.

본 실시예에서는 나말바 세포의 배양에 사용한 합성 무혈청 배지를 나말바 세포와 유사한 동물과 사람의 B-세포 계통의 세포들(NSO,Sp2, 548,46,20, 사람 마이엘로마 RPMI 8226)에도 적용할 수 있는지 시험하였다.

실시예3에서와 같은 방법으로 시험한 결과 사용된 모든 세포주들이 나말바 세포와 같이 거의 정상적으로 성장, 증식함을 확인할 수 있었다. 무혈청 배지에서 성장 시킨 세포들에 의하여 생성, 분비된 물질들의 역가 및 생성량은 생물학적 분석법 및 면역학적 방사선 분석법으로 측정하였다.

무혈청 배지에서 배양한 나말바 세포의

-인터페론 생성량을 측정하기 위하여, 다음과 같은 방법으로

-인터페론을 유발시켰다. 5%이산화탄소가 공급되는 37℃의 배양기에서 세포 농도 2×10⁵cells/㎖이 되도록 나말바 세포를 배양한 후, 나트륨-부티레이트를 최종 농도 1mM이 되도록 첨가하고 24시간 동안 배양하였다. 그런다음, 비루스(Hemaglutin virus of Japan, HVJ)를 50HAU/㎖의 농도로 가하고 계속하여 2시간 배양한 다음, 배양액을 실온에서 1500×g로 10분간 원심 분리하여 세포들을 수확하였다.

여기에 신선한 무혈청 배지를 가하고 5시간 배양하고 배양기의 온도를 28℃로 낮추어 계속하여 17시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 상기한 방법으로 원심 분리하여 상등액을 분리함으로서 비루스 유발에 의하여 생성된 조

-인터페론의 용액을 얻었다. 이 용액을 생물학적 분석법 및 면역학적 방사선 분석법으로 분석하여

-인터페론의 역가를 측정하였다.

생물학적 분석법에 의한

-인터페론의 여가 측정은 다음과 같이 행 하였다. 96구멍 플레이트에 조

-인터페론 용액과 표준

-인터페론 용액(Standard

-IFN solution)을 50㎕씩 넣고 10분간 자외선을 조사한 다음, 2배 계열 회석하고 4×10⁵cells/44ℓ 농도의 WISH세포를 100㎕씩 각각 가한 다음, 5%이산화탄소가 공급되는 배양기에서 22-24시간동안 배양하였다. 생리식염수를 함유한 인산완충 용액(PBS)10044ℓ를 가하여 1회 세척하여 96구멍 플레이트내의 내용물을 완전히 제거하고, 100-1000 TCID₅₀의 바시쿨라 스토마티티스 비루스(Vacicular Stomatitis virus, VSV)를 세포 대조군을 제외한 모든 구멍에 100㎕씩 가하고 다시 20-24시간 배양하여 비루스를 공격하게 하였다. 그런다음, 내용물을 제거하고 0.02%뉴트랄 레드 100㎕씩을 가하여 세포를 염색하였다. 30분 경과후레 상기한 방법으로 내용물을 제거하고, 10분간 자외선을 조사하여 비루스를 불활성화 하였다. 그런다음 세포가 함유하고 있는 뉴트랄 레드를 추출하여 545nm에서의 흡광도를 측정하여 표준

-인터페론 용액과 비교함으로서 조

-인터페론 용액의 역가를 측정하였다.

생성된

-인터페론의 역가를 민역학적 방사선 분석법으로도 측정하였다(표 2).

나말바 세포로 부터 생성 분비된

-인터페론의 역가를 생물학적 분석법 및 면역학적 분석법으로 측정한 결과, 시험군과 대조군에서 거의 비슷한 활성(5×10³IU/㎖)이 나타났다.

비루스 유발에 의하여 나말바 세포로 부터 생성 분리된

-인터페론의 역가 비교

따라서, 무혈청 배지에서의 배양이 나말바 세포의 성장과

-인터페론의 생성에 아무런 영향도 미치지 않음을 알 수 있었다. 548, 46, 20세포주에 의하여 생성된

-인터페론에 대한 단일클론항체와 사람 마이에로마 RPMI 8226에 의하여 생성된 람다사술(IgG lambda-type light chain)을 면역학적 방사선 분석법을 사용하여 정량하였다.

[ 표 2]

548.46.20 세포주에 의한

-인터페론에 대한 단일 콜론 항체의 생산량은 대조군과 비교하여 시험군에서 약20%증가하였다. 사람 마이엘로마 RPMI 8226은 시험군에서도 대조군에서와 거의 유사한 성장과 증식을 하나, 람다 사슬의 생성량은 약간 적었다.

548.46.20 세포주와 사람 마이엘로마 RPMI 8226으로 부터 생성 분리된 항체량의 비교

항체를 생성, 분비하지 않는 마우스 유래의 마이엘로마인 NSO와 Sp2세포는 융합 배우자로서 널리 이용되는데 이러한 세포들도 본 발명의 무혈청 배지에서 거의 정상적으로 성장, 증식 하였다. 또한 뚜렷한 분열 시간의 지연과 형태의 변화를 관찰할 수 없었으며, 클로닝의 효율성도 10-12%로 종래의 무혈청 배지에서 보다 높게 나타났다.

Claims (5)

1. 동물 및 사람의 B-임파종 세포와 골수종 세포 및 이들로 부터 유래한 하이브리도마를 배양하는 데 사용되는 배지에 있어서, 종래 배지의 혈청 성분 대신에 성장 및 증식에 영향을 주는 각 성분들 즉, CU, Zn, Fe, 인슐린, 트랜스페린, 소혈청 알부민 락트 알부민 하이드로리세이트, 글리세롤, 카르복시메틸 셀룰로오즈 및 B-세포 성장 인자를 적정 농도로 포함함을 특징으로 하는 무혈청 배지.
2. 제1항에 있어서, B-임파종 세포와 골수종 세포 및 하이브리도마세포는 사람으로부터 유래한 세포주임을 특징으로 하는 무혈청 배지.
3. 제1항에 있어서,혈청 성분 대신에 B-세포 성장인자(BCGF), 글리세롤, 카르복시메틸 셀룰로오즈 및 락트 알부민 하이드로리세이트를 포함함을 특징으로 하는 무혈청 배지.
4. 제1항에 있어서, Cu 8.0×10^-2㎍/㎖, Zn 0.4×10¹㎍/㎖, Fe 0.3×10¹㎍/㎖, 인슐린 300㎍/㎖ 트랜스페린 300㎍/㎖, 우혈청 알부민 200㎎/㎖, 락트알부민 하이드로리세이트 700 ㎎/㎖, 글리세롤 500㎍/㎖, 카르복시메틸셀룰로오즈 200㎎/㎖과 B-세포 성장 인자를 0.1v/v%로 포함함을 특징으로 하는 무혈청배지.
5. 제3항의 무혈청 배지에 혈청을 1-3%첨가하여 B-세포 계통의 세포주를 배양함을 특징으로 하는 B-세포계통의 세포주의 배양 방법.

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