JP2764101B2 - ヒトハイブリドーマ作製用の親細胞株 - Google Patents
ヒトハイブリドーマ作製用の親細胞株Info
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Description
【発明の詳細な説明】 1) 産業上の利用分野 本発明はヒトハイブリドーマ作製用の新規な親細胞株
に関する。更に詳細には、ヒト免疫グロブリン合成細胞
に由来し、ヒト免疫グロブリン非合成であり、かつ、ヒ
ト抗体産生細胞との融合特性とヒトハイブリドーマの選
択特性、及びヒトハイブリドーマに高い抗体産生能を付
与する能力を有する、ヒトハイブリドーマ作製用の新規
な親細胞株に関する。
に関する。更に詳細には、ヒト免疫グロブリン合成細胞
に由来し、ヒト免疫グロブリン非合成であり、かつ、ヒ
ト抗体産生細胞との融合特性とヒトハイブリドーマの選
択特性、及びヒトハイブリドーマに高い抗体産生能を付
与する能力を有する、ヒトハイブリドーマ作製用の新規
な親細胞株に関する。
2) 従来の技術 1975年に、ケラーとミルシュタインは、親細胞株とし
てマウスミエローマ細胞株、P3X63Ag8を用いてマウス脾
臓細胞と融合後、アミノプテリン、ヒポキサンチン及び
チミジンを含む選択培養液中で培養することにより、初
めてマウスモノクローナル抗体を産生する単一マウスハ
イブリドーマを選択分離した〔G.KhlerとC.Milstein,
Nature,256,495(1975)〕。その後、親細胞株としてマ
ウスミエローマ細胞株、マウスミエローマ細胞とヒト細
胞とのハイブリドーマであるヘテロミエローマ細胞株、
ヒトミエローマ細胞株あるいはヒトリンパ芽球細胞株を
用いてヒト抗体産生細胞と融合することによりヒトモノ
クローナル抗体を産生する単一ヒトハイブリドーマを作
製することが試みられている。しかし、マウスミエロー
マ細胞株やヘテロミエローマ細胞株を親細胞株に用いて
ヒト抗体産生細胞と融合した場合、作製されたヒトハイ
ブリドーマはヒト抗体と共にマウスの蛋白質を合成、分
泌するため、ヒトへ投入するヒトモノクローナル抗体の
産生株として用いるに必ずしも適当ではない。
てマウスミエローマ細胞株、P3X63Ag8を用いてマウス脾
臓細胞と融合後、アミノプテリン、ヒポキサンチン及び
チミジンを含む選択培養液中で培養することにより、初
めてマウスモノクローナル抗体を産生する単一マウスハ
イブリドーマを選択分離した〔G.KhlerとC.Milstein,
Nature,256,495(1975)〕。その後、親細胞株としてマ
ウスミエローマ細胞株、マウスミエローマ細胞とヒト細
胞とのハイブリドーマであるヘテロミエローマ細胞株、
ヒトミエローマ細胞株あるいはヒトリンパ芽球細胞株を
用いてヒト抗体産生細胞と融合することによりヒトモノ
クローナル抗体を産生する単一ヒトハイブリドーマを作
製することが試みられている。しかし、マウスミエロー
マ細胞株やヘテロミエローマ細胞株を親細胞株に用いて
ヒト抗体産生細胞と融合した場合、作製されたヒトハイ
ブリドーマはヒト抗体と共にマウスの蛋白質を合成、分
泌するため、ヒトへ投入するヒトモノクローナル抗体の
産生株として用いるに必ずしも適当ではない。
一方、ヒト染色体のみを有する親細胞株とヒト抗体産
生細胞の融合によるヒトハイブリドーマの作製の試み
は、1980年にオルソンとカプラン、及びクローチェら
〔L.OlssonとH.S.Kaplan,Proc.Natl.Acad.Sci.,77,542
9,(1980)、C.M.Croceら、Nature,288,488(1980)〕
が報告した。その後、多くのヒトハイブリドーマの作製
の報告があるが、作製したヒトハイブリドーマに高い抗
体産生能を付与できるようなヒトハイブリドーマ作製に
適した親細胞株は程度の差はあれ細胞自体がヒト免疫グ
ロブリンを合成している。例えば、ヒトミエローマ細胞
株、RPMI 8226とヒトリンパ芽球細胞株、KR−4とのヒ
トハイブリドーマに選択特性を付与したKR−12は、現在
数少ないヒトハイブリドーマ作製に適した親細胞株であ
るが、それぞれの細胞株に由来する重鎖(ヒトガンマ
鎖)および軽鎖(ヒトラムダ鎖、ヒトカッパ鎖)を合
成、分泌する〔特開昭61−128886号公報〕。ヒトミエロ
ーマ細胞あるいはヒトリンパ芽球細胞に由来するヒトハ
イブリドーマ作製用の親細胞株としては、ATCC CRL 803
2およびATCC CRL 8038〔特開昭57−126422号〕、WI−L2
−729 HF2〔特開昭57−208987号公報〕、ATCC CRL 8083
〔特開昭58−501257号公報〕、ATCC CRL 8147〔特開昭5
9−66883号公報〕、UC 729−6〔US−4451570号公
報〕、ATCC CRL 8221〔特開昭59−198970号公報〕、LTR
228〔特開昭60−251881号公報〕、HIH/T01〔特開昭62−
155083号公報〕、ATCC HB9320〔特開平1−60373号公
報〕が出願されている。これら親細胞株の一部は、ヒト
免疫グロブリンを分泌しないが、いずれもヒト免疫グロ
ブリンを合成している。
生細胞の融合によるヒトハイブリドーマの作製の試み
は、1980年にオルソンとカプラン、及びクローチェら
〔L.OlssonとH.S.Kaplan,Proc.Natl.Acad.Sci.,77,542
9,(1980)、C.M.Croceら、Nature,288,488(1980)〕
が報告した。その後、多くのヒトハイブリドーマの作製
の報告があるが、作製したヒトハイブリドーマに高い抗
体産生能を付与できるようなヒトハイブリドーマ作製に
適した親細胞株は程度の差はあれ細胞自体がヒト免疫グ
ロブリンを合成している。例えば、ヒトミエローマ細胞
株、RPMI 8226とヒトリンパ芽球細胞株、KR−4とのヒ
トハイブリドーマに選択特性を付与したKR−12は、現在
数少ないヒトハイブリドーマ作製に適した親細胞株であ
るが、それぞれの細胞株に由来する重鎖(ヒトガンマ
鎖)および軽鎖(ヒトラムダ鎖、ヒトカッパ鎖)を合
成、分泌する〔特開昭61−128886号公報〕。ヒトミエロ
ーマ細胞あるいはヒトリンパ芽球細胞に由来するヒトハ
イブリドーマ作製用の親細胞株としては、ATCC CRL 803
2およびATCC CRL 8038〔特開昭57−126422号〕、WI−L2
−729 HF2〔特開昭57−208987号公報〕、ATCC CRL 8083
〔特開昭58−501257号公報〕、ATCC CRL 8147〔特開昭5
9−66883号公報〕、UC 729−6〔US−4451570号公
報〕、ATCC CRL 8221〔特開昭59−198970号公報〕、LTR
228〔特開昭60−251881号公報〕、HIH/T01〔特開昭62−
155083号公報〕、ATCC HB9320〔特開平1−60373号公
報〕が出願されている。これら親細胞株の一部は、ヒト
免疫グロブリンを分泌しないが、いずれもヒト免疫グロ
ブリンを合成している。
そのため、ヒトハイブリドーマ作製に適した既存の親
細胞株よりヒト免疫グロブリン非合成な細胞株を変異誘
導することにが試みられている。例えば、成書〔L.B.Sc
hook編著、「Monoclonal Antibody Production Techiqu
es and Applications」(1987),MARCEL DEKKER,INC.,p
12〕には、KR−12より変異を誘導した細胞集団に補体存
在下に抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応させ、細胞膜表
面にヒト免疫グロブリンを発現している細胞を死滅させ
た後、セルソーター及び限界希釈法によるクローニング
操作をして細胞表面にヒト免疫グロブリンが非発現な細
胞を分離したが、ヒト免疫グロブリン非合成細胞の取得
には至らなかったことが記載されている。
細胞株よりヒト免疫グロブリン非合成な細胞株を変異誘
導することにが試みられている。例えば、成書〔L.B.Sc
hook編著、「Monoclonal Antibody Production Techiqu
es and Applications」(1987),MARCEL DEKKER,INC.,p
12〕には、KR−12より変異を誘導した細胞集団に補体存
在下に抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応させ、細胞膜表
面にヒト免疫グロブリンを発現している細胞を死滅させ
た後、セルソーター及び限界希釈法によるクローニング
操作をして細胞表面にヒト免疫グロブリンが非発現な細
胞を分離したが、ヒト免疫グロブリン非合成細胞の取得
には至らなかったことが記載されている。
ヒトリンパ芽球細胞に由来するヒト免疫グロブリンを
合成しない細胞株としては、HOM07〔特開昭63−185374
公報〕が出願されているが、作製したヒトハイブリドー
マの抗体産生量についての実施例の記載はない。
合成しない細胞株としては、HOM07〔特開昭63−185374
公報〕が出願されているが、作製したヒトハイブリドー
マの抗体産生量についての実施例の記載はない。
ヒトミエローマ細胞やヒトリンパ芽球細胞あるいはヒ
トハイブリドーマ以外に由来する親細胞株の存在も報告
されている。しかし、バーキットリンパ腫に由来する親
細胞株の出願〔特開昭60−141285号公報、特開昭61−24
2575号公報〕には、作製したヒトハイブリドーマの抗体
分泌量についての記載はない。ヒトメラノーマ細胞に由
来する親細胞株の出願〔特開昭59−132885号公報〕に
は、ヒトハイブリドーマの作製について実施例の記載は
ない。
トハイブリドーマ以外に由来する親細胞株の存在も報告
されている。しかし、バーキットリンパ腫に由来する親
細胞株の出願〔特開昭60−141285号公報、特開昭61−24
2575号公報〕には、作製したヒトハイブリドーマの抗体
分泌量についての記載はない。ヒトメラノーマ細胞に由
来する親細胞株の出願〔特開昭59−132885号公報〕に
は、ヒトハイブリドーマの作製について実施例の記載は
ない。
3) 発明が解決しようとする問題点 作製されたヒトハイブリドーマの抗体産生量が低い場
合、抗体の生産コストが高くなり、一般的には、産業上
の利用はかなり限定される。そのため、作製したヒトハ
イブリドーマに高い抗体産生能を付与することができな
い親細胞株は、産業上の有用性が低い。
合、抗体の生産コストが高くなり、一般的には、産業上
の利用はかなり限定される。そのため、作製したヒトハ
イブリドーマに高い抗体産生能を付与することができな
い親細胞株は、産業上の有用性が低い。
一方、親細胞株自体がヒト免疫グロブリンを合成して
いると、作製したヒトハイブリドーマがヒト抗体産生細
胞に由来するヒト免疫グロブリンと親細胞株に由来する
ヒト免疫グロブリンを合成するため、時に、一部が組み
換わった複数の抗体を分泌する可能性がある。さらに、
抗体の抗原への結合特異性はヒト免疫グロブリンの重鎖
と軽鎖の双方の可変アミン酸配列領域の構造に由来する
ため、ヒト抗体産生細胞と親細胞株に由来する重鎖と軽
鎖が、組み換えを起こすと、分泌される抗体の目的抗原
への結合活性や特異性が低下することが推測される。事
実、シンモトらはヒトIgMを合成する分泌がしない親細
胞株、HO323とヒトリンパ球とのヒトハイブリドーマ
は、親細胞に由来するヒトIgMの重鎖と軽鎖とヒトリン
パ球に由来するヒトIgAの重鎖と軽鎖が組み換った抗体
を産生することを報告している〔H.Shinmotoら、Agric.
Biol.Chem.,50,2217(1986)〕。また、KR−12と破傷風
毒素に対する反応性を有するヒトIgMを産生する細胞株
とのヒトハイブリドーマは、ほぼ同量のヒトIgGとヒトI
gMを分泌し、さらに、2種の抗体のうちヒトIgMのみが
破傷風毒素に対する反応性を有することを報告している
〔D.Kozborら、J.Immunol.,133,3001(1984)〕。
いると、作製したヒトハイブリドーマがヒト抗体産生細
胞に由来するヒト免疫グロブリンと親細胞株に由来する
ヒト免疫グロブリンを合成するため、時に、一部が組み
換わった複数の抗体を分泌する可能性がある。さらに、
抗体の抗原への結合特異性はヒト免疫グロブリンの重鎖
と軽鎖の双方の可変アミン酸配列領域の構造に由来する
ため、ヒト抗体産生細胞と親細胞株に由来する重鎖と軽
鎖が、組み換えを起こすと、分泌される抗体の目的抗原
への結合活性や特異性が低下することが推測される。事
実、シンモトらはヒトIgMを合成する分泌がしない親細
胞株、HO323とヒトリンパ球とのヒトハイブリドーマ
は、親細胞に由来するヒトIgMの重鎖と軽鎖とヒトリン
パ球に由来するヒトIgAの重鎖と軽鎖が組み換った抗体
を産生することを報告している〔H.Shinmotoら、Agric.
Biol.Chem.,50,2217(1986)〕。また、KR−12と破傷風
毒素に対する反応性を有するヒトIgMを産生する細胞株
とのヒトハイブリドーマは、ほぼ同量のヒトIgGとヒトI
gMを分泌し、さらに、2種の抗体のうちヒトIgMのみが
破傷風毒素に対する反応性を有することを報告している
〔D.Kozborら、J.Immunol.,133,3001(1984)〕。
4) 問題を解決するための手段 本発明者らは、ヒトのみに由来し、作製したヒトハイ
ブリドーマに高い抗体産生能を付与し、細胞自体はヒト
免疫グロブリンを合成しないヒトハイブリドーマ用の親
細胞株を創製すべく鋭意研究を行ってきた。その結果、
ヒト免疫グロブリン重鎖(ヒトガンマ鎖)と軽鎖(ヒト
ラムダ鎖、ヒトカッパ鎖)を合成、分泌するヒトハイブ
リドーマに由来する変異細胞株であって、重鎖(ヒトガ
ンマ鎖)を合成しない、あるいは、重鎖(ヒトガンマ
鎖)および軽鎖(ヒトラムダ鎖)を合成しない、重鎖
(ヒトガンマ鎖)および軽鎖(ヒトラムダ鎖、ヒトカッ
パ鎖)を合成しないヒトハイブリドーマ作製用の新規な
親細胞株を分離することに成功した。
ブリドーマに高い抗体産生能を付与し、細胞自体はヒト
免疫グロブリンを合成しないヒトハイブリドーマ用の親
細胞株を創製すべく鋭意研究を行ってきた。その結果、
ヒト免疫グロブリン重鎖(ヒトガンマ鎖)と軽鎖(ヒト
ラムダ鎖、ヒトカッパ鎖)を合成、分泌するヒトハイブ
リドーマに由来する変異細胞株であって、重鎖(ヒトガ
ンマ鎖)を合成しない、あるいは、重鎖(ヒトガンマ
鎖)および軽鎖(ヒトラムダ鎖)を合成しない、重鎖
(ヒトガンマ鎖)および軽鎖(ヒトラムダ鎖、ヒトカッ
パ鎖)を合成しないヒトハイブリドーマ作製用の新規な
親細胞株を分離することに成功した。
ケラーは、複数の異なる抗体を分泌するマウスハイブ
リドーマを作製し、マウス免疫グロブリンの重鎖と軽鎖
の発現の欠失の様相を調べた結果、染色体の欠落により
主にマウス免疫グロブリン重鎖の発現の欠失が認められ
ることを報告している〔G.Khler,Proc.Natl,Acad.Sc
i.,77,2197(1980)〕。一方、本発明者らは過去にマウ
スミエローマ細胞とマウス脾臓細胞とのマウスハイブリ
ドーマ株を凍結保存と継代培養を連続的に繰り返すと、
抗体の合成、分泌能を失うにもかかわらず、ミエローマ
細胞としての高い増殖形質を保持したマウスハイブリド
ーマが高頻度に出現することを見いだしていた。
リドーマを作製し、マウス免疫グロブリンの重鎖と軽鎖
の発現の欠失の様相を調べた結果、染色体の欠落により
主にマウス免疫グロブリン重鎖の発現の欠失が認められ
ることを報告している〔G.Khler,Proc.Natl,Acad.Sc
i.,77,2197(1980)〕。一方、本発明者らは過去にマウ
スミエローマ細胞とマウス脾臓細胞とのマウスハイブリ
ドーマ株を凍結保存と継代培養を連続的に繰り返すと、
抗体の合成、分泌能を失うにもかかわらず、ミエローマ
細胞としての高い増殖形質を保持したマウスハイブリド
ーマが高頻度に出現することを見いだしていた。
そこで、それ自体公知で一般に入手可能なヒトハイブ
リドーマ細胞株、ATCC CRL 8658に異変を誘発後、クロ
ーニングにより、増殖性能を保持するがヒト免疫グロブ
リンの重鎖(ヒトガンマ鎖)あるいはヒト免疫グロブリ
ンの重鎖(ヒトガンマ鎖)と軽鎖(ヒトラムダ鎖、ヒト
カッパ鎖)の両方あるいは一方を構成、分泌しない細胞
をスクリーニングして新規な単一細胞株を作製した。作
製した新規細胞株はヒト抗体産生細胞との融合特性を有
し、ヒトハイブリドーマの選択特性を保持し、かつ、作
製したヒトハイブリドーマがヒト抗体産生細胞に由来す
るヒト免疫グロブリンを合成、分泌することを確認し、
ヒトモノクローナル抗体の実生産に適したヒトハイブリ
ドーマの作製に有用な親細胞株であることを見し出し
た。
リドーマ細胞株、ATCC CRL 8658に異変を誘発後、クロ
ーニングにより、増殖性能を保持するがヒト免疫グロブ
リンの重鎖(ヒトガンマ鎖)あるいはヒト免疫グロブリ
ンの重鎖(ヒトガンマ鎖)と軽鎖(ヒトラムダ鎖、ヒト
カッパ鎖)の両方あるいは一方を構成、分泌しない細胞
をスクリーニングして新規な単一細胞株を作製した。作
製した新規細胞株はヒト抗体産生細胞との融合特性を有
し、ヒトハイブリドーマの選択特性を保持し、かつ、作
製したヒトハイブリドーマがヒト抗体産生細胞に由来す
るヒト免疫グロブリンを合成、分泌することを確認し、
ヒトモノクローナル抗体の実生産に適したヒトハイブリ
ドーマの作製に有用な親細胞株であることを見し出し
た。
特に本発明で強調されることは、ヒト抗体産生細胞と
のヒトハイブリドーマに高い抗体産生能力を付与する形
質を維持しながら、親細胞株自体がヒト免疫グロブリン
を合成するという好ましくない形質のみを取り除いた細
胞株の取得を目的として、変異誘発を行い、本発明の重
鎖(ヒトガンマ鎖)を合成しない、あるいは、重鎖(ヒ
トガンマ鎖)および軽鎖(ヒトラムダ鎖)を合成しな
い、重鎖(ヒトガンマ鎖)および軽鎖(ヒトラムダ鎖、
ヒトカッパ鎖)を合成しない親細胞株の分離に成功した
ことである。更に、この新規な親細胞株がヒトリンパ芽
球細胞株との融合特性を有すること、例示されるヒトハ
イブリドーマに高いヒト抗体産生能力を付与すること、
重鎖として、ヒトリンパ芽球細胞に由来する重鎖のみの
産生が確認されたことである。
のヒトハイブリドーマに高い抗体産生能力を付与する形
質を維持しながら、親細胞株自体がヒト免疫グロブリン
を合成するという好ましくない形質のみを取り除いた細
胞株の取得を目的として、変異誘発を行い、本発明の重
鎖(ヒトガンマ鎖)を合成しない、あるいは、重鎖(ヒ
トガンマ鎖)および軽鎖(ヒトラムダ鎖)を合成しな
い、重鎖(ヒトガンマ鎖)および軽鎖(ヒトラムダ鎖、
ヒトカッパ鎖)を合成しない親細胞株の分離に成功した
ことである。更に、この新規な親細胞株がヒトリンパ芽
球細胞株との融合特性を有すること、例示されるヒトハ
イブリドーマに高いヒト抗体産生能力を付与すること、
重鎖として、ヒトリンパ芽球細胞に由来する重鎖のみの
産生が確認されたことである。
従って、本発明の目的は、各種疾患の予防、治療、診
断などの広い分野に使用出来るヒトモノクローナル抗体
の工業的生産用の細胞株作製のための親細胞株を提供す
ることにある。
断などの広い分野に使用出来るヒトモノクローナル抗体
の工業的生産用の細胞株作製のための親細胞株を提供す
ることにある。
なお、本発明の主旨はヒト免疫グロブリン合成細胞か
らのヒト免疫グロブリン非合成細胞の作製に関するもの
であり、出発材料としてはヒトミエローマ細胞株、RPMI
8226とヒトリンパ芽球細胞株、GM 1500のヒトハイブリ
ドーマ細胞株、ATCC CRL 8658という特定の細胞株にの
み限定されるものではなく、各種ヒトミエローマ細胞、
ヒトリンパ芽球細胞あるいはそれら細胞の融合により新
たに創製されたヒトハイブリドーマも使用できる。さら
に、RPIM 8226あるいはRPMI 8226のヒト免疫グロブリン
合成能を欠落した細胞株に由来するヒトハイブリドーマ
や、GM 1500あるいはGM 1500のヒト免疫グロブリン合成
能を欠落した細胞株に由来するヒトハイブリドーマが使
用できる。これらから誘導される変異株の他、一般に入
手可能な複数の細胞より作製したヒトハイブリドーマが
適宜選択される。
らのヒト免疫グロブリン非合成細胞の作製に関するもの
であり、出発材料としてはヒトミエローマ細胞株、RPMI
8226とヒトリンパ芽球細胞株、GM 1500のヒトハイブリ
ドーマ細胞株、ATCC CRL 8658という特定の細胞株にの
み限定されるものではなく、各種ヒトミエローマ細胞、
ヒトリンパ芽球細胞あるいはそれら細胞の融合により新
たに創製されたヒトハイブリドーマも使用できる。さら
に、RPIM 8226あるいはRPMI 8226のヒト免疫グロブリン
合成能を欠落した細胞株に由来するヒトハイブリドーマ
や、GM 1500あるいはGM 1500のヒト免疫グロブリン合成
能を欠落した細胞株に由来するヒトハイブリドーマが使
用できる。これらから誘導される変異株の他、一般に入
手可能な複数の細胞より作製したヒトハイブリドーマが
適宜選択される。
(具体的な説明) 本発明の新規なヒト免疫グロブリン非合成突然変異細
胞株は、例えば、KR−12などの公知のヒトハイブリドー
マより染色体の変異や脱落の誘発操作により突然変異細
胞集団を作製し、この細胞集団よりヒト免疫グロブリン
合成能を一部あるいはすべてを欠落した細胞の存在をス
クリーニングし、クローニング操作により単一細胞株を
分離できる。さらに、クローニング途中の細胞あるいは
分離した単一細胞株に再度の変異誘発操作を行い、クロ
ーニングを繰り返すことにより、ヒト免疫グロブリンの
合成能を一部あるいはすべてを欠落した細胞の単一細胞
株を分離できる。最後に8−アザグアニンとウアバイン
を含む培地に適応させることによってヒト免疫グロブリ
ン非合成突然変異細胞株を創製することができる。
胞株は、例えば、KR−12などの公知のヒトハイブリドー
マより染色体の変異や脱落の誘発操作により突然変異細
胞集団を作製し、この細胞集団よりヒト免疫グロブリン
合成能を一部あるいはすべてを欠落した細胞の存在をス
クリーニングし、クローニング操作により単一細胞株を
分離できる。さらに、クローニング途中の細胞あるいは
分離した単一細胞株に再度の変異誘発操作を行い、クロ
ーニングを繰り返すことにより、ヒト免疫グロブリンの
合成能を一部あるいはすべてを欠落した細胞の単一細胞
株を分離できる。最後に8−アザグアニンとウアバイン
を含む培地に適応させることによってヒト免疫グロブリ
ン非合成突然変異細胞株を創製することができる。
本発明で使用されるヒト免疫グロブリン合成細胞株と
しては、前述のKR−12などの公知の細胞株の他に、各種
ヒトミエローマ細胞、ヒトリンパ芽球細胞あるいはそれ
ら細胞の融合により新たに創製されたヒトハイブリドー
マも例示される。本発明に使用したKR−12は、ATCC(ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション)よりCR
L 8658として入手できる。
しては、前述のKR−12などの公知の細胞株の他に、各種
ヒトミエローマ細胞、ヒトリンパ芽球細胞あるいはそれ
ら細胞の融合により新たに創製されたヒトハイブリドー
マも例示される。本発明に使用したKR−12は、ATCC(ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション)よりCR
L 8658として入手できる。
染色体の変異や脱落の誘発は、複数回の凍結・融解、
過密度培養、低酸素濃度培養、低温あるいは高温培養、
短時間の培養温度の変化などの操作による環境変化や、
紫外線や放射線等をパルス的にあるいは連続的に照射す
る操作などを加えることにより行える。また、8−アザ
グアニン、6−チオグアニン、コルヒチン、エチルメタ
ンスルンフォネート(EMS)、N−メチル−N′−ニト
ロ−N−ニトロソグアニジン(MNNG)、アクリジン・マ
スタードなどの変異原性の薬剤を培地中に一定量添加す
ることによっても行える。これらの方法を適宜単独、あ
るいは組み合わせて染色体の変異や脱落の誘発を効率的
に行うことが望ましい。
過密度培養、低酸素濃度培養、低温あるいは高温培養、
短時間の培養温度の変化などの操作による環境変化や、
紫外線や放射線等をパルス的にあるいは連続的に照射す
る操作などを加えることにより行える。また、8−アザ
グアニン、6−チオグアニン、コルヒチン、エチルメタ
ンスルンフォネート(EMS)、N−メチル−N′−ニト
ロ−N−ニトロソグアニジン(MNNG)、アクリジン・マ
スタードなどの変異原性の薬剤を培地中に一定量添加す
ることによっても行える。これらの方法を適宜単独、あ
るいは組み合わせて染色体の変異や脱落の誘発を効率的
に行うことが望ましい。
細胞培養は、例えば、5×104個/mlから2×106個/ml
の細胞密度となるように培養液に分散し、適当な細胞培
養容器に播種した後、5%炭酸ガス存在下37℃で行うこ
とができる。培養液の例としては、RPMI 1640やダルベ
ッコの変法イーグル培地(DMEM)等の基礎培地に、ウシ
胎児血清(FCS)の適量を添加したものが好適である。
また、各種の無血清培地も使用できる。例えば、NYSF 4
04無血清培地にウシ血清アルブミンの適量を添加したも
のが推奨される。継代培養は、3日から7日間隔で細胞
の回収と播種の操作を繰り返すとよい。
の細胞密度となるように培養液に分散し、適当な細胞培
養容器に播種した後、5%炭酸ガス存在下37℃で行うこ
とができる。培養液の例としては、RPMI 1640やダルベ
ッコの変法イーグル培地(DMEM)等の基礎培地に、ウシ
胎児血清(FCS)の適量を添加したものが好適である。
また、各種の無血清培地も使用できる。例えば、NYSF 4
04無血清培地にウシ血清アルブミンの適量を添加したも
のが推奨される。継代培養は、3日から7日間隔で細胞
の回収と播種の操作を繰り返すとよい。
細胞の凍結は、一般的手法により行える。例えば、細
胞を適当な細胞凍結保存液に1×105個/mlから5×107
個/mlの細胞密度となるように分散し、液体窒素あるい
は液体窒素ガス中または、−20℃から−80℃の冷凍庫中
で凍結、保存する。細胞凍結保存液には、上記基礎培地
や中性緩衝液等に動物血清、アルブミン、ぶどう糖やジ
メチルスルフオキサイド(DMSO)などを適量添加して用
いることが推奨される。
胞を適当な細胞凍結保存液に1×105個/mlから5×107
個/mlの細胞密度となるように分散し、液体窒素あるい
は液体窒素ガス中または、−20℃から−80℃の冷凍庫中
で凍結、保存する。細胞凍結保存液には、上記基礎培地
や中性緩衝液等に動物血清、アルブミン、ぶどう糖やジ
メチルスルフオキサイド(DMSO)などを適量添加して用
いることが推奨される。
凍結細胞の凍結融解と融解後の処理及び再培養の操作
は、一般的手法により行える。例えば、凍結された細胞
は、温水中で急速に融解し、融解後の細胞は培養液等で
洗浄して保存液に含まれるDMSOを洗い出した後に培養液
に分散して培養を行うと良い。
は、一般的手法により行える。例えば、凍結された細胞
は、温水中で急速に融解し、融解後の細胞は培養液等で
洗浄して保存液に含まれるDMSOを洗い出した後に培養液
に分散して培養を行うと良い。
突然変異細胞よりの本発明の細胞株のクローニング
は、軟寒天法〔成書「組織培養応用研究法」(1985)、
ソフトサイエンス社、p289など〕、あるいは限界希釈法
〔成書「単クローン抗体」(1983)、講談社、p73な
ど〕により行うことができる。例えば、限界希釈法によ
るクローニングでは、突然変異を誘発させた細胞集団を
20%のFCSを含む培養液に分散し、フィーダ細胞として
マウス脾臓細胞を播種した96ウエル平底プレート(以
下、フィーダプレートと略す)のウエルあたり1個とな
るように播種し、5%炭酸ガス存在下37℃で培養する。
単一のコロニーとして増殖の認められたウエルについて
培養上清中のヒト免疫グロブリン量をスクリーニングす
る。ヒト免疫グロブリン産生の認められないウエルの細
胞について、再度、限界希釈法によるクローニングを行
う。クローニングの操作を複数回繰り返すことにより、
ヒト免疫グロブリン非分泌の細胞株を単一な細胞集団と
して得ることができる。なお、クローニング時に、ヒポ
キサンチンリン酸リボシル基転移酵素(以下、HGPRTと
略す)を合成する細胞を死滅させる薬剤を培養液に添加
することにより、HGPRT欠損細胞を効率的に選別でき
る。この様な薬剤としては8−アザグアニンなどが推奨
される。
は、軟寒天法〔成書「組織培養応用研究法」(1985)、
ソフトサイエンス社、p289など〕、あるいは限界希釈法
〔成書「単クローン抗体」(1983)、講談社、p73な
ど〕により行うことができる。例えば、限界希釈法によ
るクローニングでは、突然変異を誘発させた細胞集団を
20%のFCSを含む培養液に分散し、フィーダ細胞として
マウス脾臓細胞を播種した96ウエル平底プレート(以
下、フィーダプレートと略す)のウエルあたり1個とな
るように播種し、5%炭酸ガス存在下37℃で培養する。
単一のコロニーとして増殖の認められたウエルについて
培養上清中のヒト免疫グロブリン量をスクリーニングす
る。ヒト免疫グロブリン産生の認められないウエルの細
胞について、再度、限界希釈法によるクローニングを行
う。クローニングの操作を複数回繰り返すことにより、
ヒト免疫グロブリン非分泌の細胞株を単一な細胞集団と
して得ることができる。なお、クローニング時に、ヒポ
キサンチンリン酸リボシル基転移酵素(以下、HGPRTと
略す)を合成する細胞を死滅させる薬剤を培養液に添加
することにより、HGPRT欠損細胞を効率的に選別でき
る。この様な薬剤としては8−アザグアニンなどが推奨
される。
培養上清中のヒト免疫グロブリンのスクリーニング
は、一般のラジオイムノアッセイ法や酵素抗体分析法
(ELISA法)などの方法により行うことができる。例え
ば、ELISA法による場合は、固相に抗ヒト免疫グロブリ
ン抗体を固定し(この時使用される抗体を以下、固相化
抗体と略す)、培養上清の一部を反応させる。次に、酵
素標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応させ、基質を加
え酵素反応により生じる呈色割合より培養上清中のヒト
免疫グロブリンの検出および量の測定が行える。ヒトガ
ンマ鎖、ヒトラムダ鎖またはヒトカッパ鎖の測定は、固
相化抗体として各々抗ヒトIgG(ヒトガンマ鎖特異)抗
体、抗ヒトラムダ鎖抗体または抗ヒトカッパ鎖抗体を、
酵素標識抗体として各々パーオキシダーゼ標識抗ヒトIg
G(ヒトガンマ特異)抗体、パーオキシダーゼ標識抗ヒ
トラムダ鎖抗体またはパーオキシダーゼ標識抗ヒトカッ
パ鎖抗体を使用することにより行える。
は、一般のラジオイムノアッセイ法や酵素抗体分析法
(ELISA法)などの方法により行うことができる。例え
ば、ELISA法による場合は、固相に抗ヒト免疫グロブリ
ン抗体を固定し(この時使用される抗体を以下、固相化
抗体と略す)、培養上清の一部を反応させる。次に、酵
素標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応させ、基質を加
え酵素反応により生じる呈色割合より培養上清中のヒト
免疫グロブリンの検出および量の測定が行える。ヒトガ
ンマ鎖、ヒトラムダ鎖またはヒトカッパ鎖の測定は、固
相化抗体として各々抗ヒトIgG(ヒトガンマ鎖特異)抗
体、抗ヒトラムダ鎖抗体または抗ヒトカッパ鎖抗体を、
酵素標識抗体として各々パーオキシダーゼ標識抗ヒトIg
G(ヒトガンマ特異)抗体、パーオキシダーゼ標識抗ヒ
トラムダ鎖抗体またはパーオキシダーゼ標識抗ヒトカッ
パ鎖抗体を使用することにより行える。
本発明の親細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリ
ンおよびチミジンを含む培養液(HAT培地)、あるいは
ヒポキサンチンおよびアゼセリンを含む培養液(HA培
地)中で死滅する。このHGPRT欠損の性質は、10μg/ml
から100μg/ml濃度の8−アザグアニンを含む培養液中
で培養することにより維持出来る。また、本細胞株は10
μM濃度のウアバインを含む培養液中で死滅しない。本
選択特性により本発明の親細胞株とヒト抗体産生細胞と
のヒトハイブリドーマが作製ができ、更に、作製したヒ
トハイブリドーマは実質的にヒト抗体産生細胞に由来す
る重鎖よりなる抗体のみを培養液中に分泌する。
ンおよびチミジンを含む培養液(HAT培地)、あるいは
ヒポキサンチンおよびアゼセリンを含む培養液(HA培
地)中で死滅する。このHGPRT欠損の性質は、10μg/ml
から100μg/ml濃度の8−アザグアニンを含む培養液中
で培養することにより維持出来る。また、本細胞株は10
μM濃度のウアバインを含む培養液中で死滅しない。本
選択特性により本発明の親細胞株とヒト抗体産生細胞と
のヒトハイブリドーマが作製ができ、更に、作製したヒ
トハイブリドーマは実質的にヒト抗体産生細胞に由来す
る重鎖よりなる抗体のみを培養液中に分泌する。
本発明の親細胞株は、前述の培養液を用い継代培養を
行うことができるとともに、前述の凍結保存液を用い、
長期間安定に凍結保存が出来る。
行うことができるとともに、前述の凍結保存液を用い、
長期間安定に凍結保存が出来る。
本発明の細胞とヒト抗体産生細胞との融合は、ポリエ
チレングリコール(以下、PEGと略す)などの一般的な
融合試薬はや、センダイウイルス(Hemagglutinating v
irus of Japan;HVJ)などのウイルス粒子を使用して行
える。例えば、平均分子量1000から6000程度のPEGを、R
PMI 1640培地やDMEM培地中に30から50%(W/V)の濃度
に添加したものが融合液として推奨される。また、融合
効率を高めるため、融合液DMSOを添加することも望まし
い。また、電気融合装置などを用いた物理的手法によっ
ても行える。細胞融合においては、本発明の細胞に対し
て1から10倍のヒト抗体産生細胞を用いることが望まし
い。ヒト抗体産生細胞には、エプスタイン・バー・ウイ
ルス(以下、EBウイルスと略す)により形質転換した細
胞集団、および形質転換した細胞集団からクローニング
により得た単一EBウイルス形質転換細胞株を用いること
ができる。また、生体内により分離したヒト抗体産生細
胞を含むリンパ球画分およびヒトB細胞画分、これをマ
イトージェンあるいは抗原により刺激、増殖させた抗体
産生細胞などが細胞融合用のヒト抗体産生細胞として用
いることができる。
チレングリコール(以下、PEGと略す)などの一般的な
融合試薬はや、センダイウイルス(Hemagglutinating v
irus of Japan;HVJ)などのウイルス粒子を使用して行
える。例えば、平均分子量1000から6000程度のPEGを、R
PMI 1640培地やDMEM培地中に30から50%(W/V)の濃度
に添加したものが融合液として推奨される。また、融合
効率を高めるため、融合液DMSOを添加することも望まし
い。また、電気融合装置などを用いた物理的手法によっ
ても行える。細胞融合においては、本発明の細胞に対し
て1から10倍のヒト抗体産生細胞を用いることが望まし
い。ヒト抗体産生細胞には、エプスタイン・バー・ウイ
ルス(以下、EBウイルスと略す)により形質転換した細
胞集団、および形質転換した細胞集団からクローニング
により得た単一EBウイルス形質転換細胞株を用いること
ができる。また、生体内により分離したヒト抗体産生細
胞を含むリンパ球画分およびヒトB細胞画分、これをマ
イトージェンあるいは抗原により刺激、増殖させた抗体
産生細胞などが細胞融合用のヒト抗体産生細胞として用
いることができる。
上記方法によりヒト抗体産生細胞と本発明の細胞とを
細胞融合させ、これを24ウエルまたは96ウエルの培養プ
レートに分注し、5%炭酸ガス存在下37℃選択培地中で
培養する。この間、3日から5日ごとに選択培地の半量
を新しい選択培地と交換することが望ましい。この際、
フィーダー細胞としてマウスの腹腔浸出細胞等を共存さ
せるヒトハイブリドーマの増殖を早めることができる。
該細胞集団よりヒトハイブリドーマを選択培地により選
別する。ヒト抗体産生細胞が無限増殖能を有さない細胞
の場合、選択培地としてHAT培地あるいはHA培地が使用
できる。また、ヒト抗体産生細胞がEBウイルス形質転換
細胞などの無限増殖能を有する細胞の場合、選択培地と
してウアバインを含有するHAT培地またはHA培地が使用
できる。
細胞融合させ、これを24ウエルまたは96ウエルの培養プ
レートに分注し、5%炭酸ガス存在下37℃選択培地中で
培養する。この間、3日から5日ごとに選択培地の半量
を新しい選択培地と交換することが望ましい。この際、
フィーダー細胞としてマウスの腹腔浸出細胞等を共存さ
せるヒトハイブリドーマの増殖を早めることができる。
該細胞集団よりヒトハイブリドーマを選択培地により選
別する。ヒト抗体産生細胞が無限増殖能を有さない細胞
の場合、選択培地としてHAT培地あるいはHA培地が使用
できる。また、ヒト抗体産生細胞がEBウイルス形質転換
細胞などの無限増殖能を有する細胞の場合、選択培地と
してウアバインを含有するHAT培地またはHA培地が使用
できる。
実施例 以下、実施例によりこの発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例1.ヒト免疫グロブリン非合成細胞株の作製−1 (1) 変異細胞株の作製 ヒトハイブリドーマ細胞株、ATCC CRL 8658を、10ml
の10%FCSを含むRPMI 1640培地(以下、10%FCS培養液
と略す)に1×105個/ml密度となるように懸濁し、底面
積75cm2のプラスチック製培養フラスコ(75Tフラスコ、
コースター)に播種後、5%炭酸ガス存在下、37℃で5
日間静置培養した。
の10%FCSを含むRPMI 1640培地(以下、10%FCS培養液
と略す)に1×105個/ml密度となるように懸濁し、底面
積75cm2のプラスチック製培養フラスコ(75Tフラスコ、
コースター)に播種後、5%炭酸ガス存在下、37℃で5
日間静置培養した。
培養物を15ml容量のプラスチック製遠心管(コーニン
グ)に移し、遠心分離(200×g、10分間)により細胞
を集め、75%FCSおよび10%DMSOを含むRPMI 1640培地
(以下、凍結保存液と略す)に1×106個/ml密度となる
ように懸濁した。2ml容量のストックチューブ(コーニ
ング)の1本当たりに1mlの細胞懸濁液を分注し、−20
℃に1時間静置して凍結させた後、−80℃に移し保存し
た。
グ)に移し、遠心分離(200×g、10分間)により細胞
を集め、75%FCSおよび10%DMSOを含むRPMI 1640培地
(以下、凍結保存液と略す)に1×106個/ml密度となる
ように懸濁した。2ml容量のストックチューブ(コーニ
ング)の1本当たりに1mlの細胞懸濁液を分注し、−20
℃に1時間静置して凍結させた後、−80℃に移し保存し
た。
凍結した細胞懸濁液を含むストックチューブを、37℃
の湯浴中に緩やかに撹拌しながら融解した。融解した細
胞懸濁液を、15ml容量のプラスチック製遠心管に移し、
10mlの10%FCS培養液で2回洗浄した。
の湯浴中に緩やかに撹拌しながら融解した。融解した細
胞懸濁液を、15ml容量のプラスチック製遠心管に移し、
10mlの10%FCS培養液で2回洗浄した。
前述と同様、10mlの10%FCS培養液に1×105個/ml密
度となるように懸濁し、75Tフラスコに播種後、静置培
養した。以上の細胞培養(5日間)と凍結保存(2日
間)の操作を6週間にわたり継続して行った。
度となるように懸濁し、75Tフラスコに播種後、静置培
養した。以上の細胞培養(5日間)と凍結保存(2日
間)の操作を6週間にわたり継続して行った。
凍結保存した細胞懸濁液を融解し、10%FCS培養液で
2回洗浄後、10mlの10%FCS培養液に5×104個/ml密度
となるように懸濁し、75Tフラスコに播種後、4日間静
置培養した。培養物を遠心分離して細胞を集め、1×10
6個/ml密度となるように200μg/ml濃度のEMSを含む1ml
の10%FCS培養液に懸濁し、6ウエル培養プレート(コ
ースター)の1ウエルに播種後、24時間静置培養した。
培養物を遠心分離し、10%FCS培養液で2回洗浄して、
1.2×106個の細胞を得た。これを12mlの10%FCS培養液
に懸濁し、75Tフラスコに播種後、4日間静置培養し
た。培養物を遠心分離し、10%FCS培養液で2回洗浄し
て、6.0×105個の細胞を得た。これを6mlの10%FCS培養
液に懸濁し、75Tフラスコに播種後、3日間静置培養し
た。培養物を遠心分離して、7.0×105個の変異誘導細胞
を得た。
2回洗浄後、10mlの10%FCS培養液に5×104個/ml密度
となるように懸濁し、75Tフラスコに播種後、4日間静
置培養した。培養物を遠心分離して細胞を集め、1×10
6個/ml密度となるように200μg/ml濃度のEMSを含む1ml
の10%FCS培養液に懸濁し、6ウエル培養プレート(コ
ースター)の1ウエルに播種後、24時間静置培養した。
培養物を遠心分離し、10%FCS培養液で2回洗浄して、
1.2×106個の細胞を得た。これを12mlの10%FCS培養液
に懸濁し、75Tフラスコに播種後、4日間静置培養し
た。培養物を遠心分離し、10%FCS培養液で2回洗浄し
て、6.0×105個の細胞を得た。これを6mlの10%FCS培養
液に懸濁し、75Tフラスコに播種後、3日間静置培養し
た。培養物を遠心分離して、7.0×105個の変異誘導細胞
を得た。
(2) スクリーニング、クローニング 変異誘導細胞を、15μg/ml濃度の8−アザグアニン
(東京化成)を含む20%FCS培養液に10個/ml密度となる
ように懸濁し、あらかじめフィーダー細胞としてマウス
脾臓細胞をウエルあたり1×105個播種した10枚の96ウ
エル平底培養プレート(コーニング)の各ウエルに0.1m
lずつ播種し、静置培養した。2週間から3週間後、単
一なクローンとしてコロニーが十分に増殖したウエルか
ら順次、培養上清を採取した。上清中のヒト免疫グロブ
リンの有無をEIA用96ウエル平底プレート(グライナ
ー)を用い、固相化抗体液としてヤギ抗ヒト免疫グロブ
リン抗体(タゴ)を、酵素標識抗体としてパーオキシダ
ーゼ標識ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体(タゴ)を使用
したELISA法でスクリーニングした。その結果、細胞増
殖の認められた250ウエルの内、10ウエル(1C3、1G10、
3F6、3H2、4B11、5C5、7A8、8D1、8H7、10F8)の培養上
清ではヒトガンマ鎖が検出されなかった。
(東京化成)を含む20%FCS培養液に10個/ml密度となる
ように懸濁し、あらかじめフィーダー細胞としてマウス
脾臓細胞をウエルあたり1×105個播種した10枚の96ウ
エル平底培養プレート(コーニング)の各ウエルに0.1m
lずつ播種し、静置培養した。2週間から3週間後、単
一なクローンとしてコロニーが十分に増殖したウエルか
ら順次、培養上清を採取した。上清中のヒト免疫グロブ
リンの有無をEIA用96ウエル平底プレート(グライナ
ー)を用い、固相化抗体液としてヤギ抗ヒト免疫グロブ
リン抗体(タゴ)を、酵素標識抗体としてパーオキシダ
ーゼ標識ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体(タゴ)を使用
したELISA法でスクリーニングした。その結果、細胞増
殖の認められた250ウエルの内、10ウエル(1C3、1G10、
3F6、3H2、4B11、5C5、7A8、8D1、8H7、10F8)の培養上
清ではヒトガンマ鎖が検出されなかった。
10ウエル中の細胞を、それぞれ別個に集め、20%FCS
培養液に10個/ml密度となるように懸濁し、1細胞株あ
たり1枚当てのフィーダープレートの各ウエルに0.1ml
ずつ播種し、静置培養した。2週間から3週間後、単一
なクローンとしてコロニーが増殖したウエルから順次、
培養上清を採取し、上清中のヒトガンマ鎖の産生をELIS
A法でスクリーニングした。その結果、7A8を播種したプ
レートでは、単一なクローンとしてコロニーが増殖した
68ウエルの培養上清原液すべてにヒトガンマ鎖の産生が
認められないことが判明した。このヒトガンマ鎖当の産
生が認められなかったウエルの細胞について再度同様な
クローニング操作を繰り返して、1株の単一細胞株を
得、MP 4109と命名した。MP 4109は微工研に微工研条寄
第2129号として寄託されている。
培養液に10個/ml密度となるように懸濁し、1細胞株あ
たり1枚当てのフィーダープレートの各ウエルに0.1ml
ずつ播種し、静置培養した。2週間から3週間後、単一
なクローンとしてコロニーが増殖したウエルから順次、
培養上清を採取し、上清中のヒトガンマ鎖の産生をELIS
A法でスクリーニングした。その結果、7A8を播種したプ
レートでは、単一なクローンとしてコロニーが増殖した
68ウエルの培養上清原液すべてにヒトガンマ鎖の産生が
認められないことが判明した。このヒトガンマ鎖当の産
生が認められなかったウエルの細胞について再度同様な
クローニング操作を繰り返して、1株の単一細胞株を
得、MP 4109と命名した。MP 4109は微工研に微工研条寄
第2129号として寄託されている。
実施例2.ヒト免疫グロブリン非合成細胞株の作製−2 (1) 変異細胞株の作製 実施例1でヒトガンマ鎖が検出されなかった10ウエル
(1C3、1G10、3F6、3H2、4B11、5C5、7A8、8D1、8H7、1
0F8)の中の細胞を集め、5mlの20%FCS培養液に懸濁
し、底面積25cm2のフラスコ(25Tフラスコ、コーニン
グ)に播種後、4日間静置培養した。培養物を遠心分離
して、3×106個の細胞を得た。これを0.5μg/ml濃度の
MNNGを含む3mlの10%FCS培養液に懸濁し、6ウエル培養
プレートの3ウエルに1mlずつ分注し、24時間静置培養
した。3ウエルの培養物を遠心分離し、10%FCS培養液
で2回洗浄し、3.2×106個の細胞を得た。このうち、1
×106個の細胞を10mlの10%FCS培養液に懸濁し、75Tフ
ラスコに播種後、2日間静置培養した。培養物を遠心分
離して、1.2×106個の細胞を得た。これを10mlの10%FC
S培養液に懸濁し、75Tフラスコに播種後、2日間静置培
養した。培養物を遠心分離して、5.5×105個の細胞を得
た。これを5mlの10%FCS培養液に懸濁し、25Tのフラス
コに播種後、2日間静置培養した。培養物を遠心分離し
て、2.5×105個の細胞を得た。これを2mlの10%FCS培養
液に懸濁し、6ウエル培養プレートの2ウエルに1mlず
つ播種後、2日間静置培養した。培養物を遠心分離し
て、7.0×105個の変異誘導細胞を得た。
(1C3、1G10、3F6、3H2、4B11、5C5、7A8、8D1、8H7、1
0F8)の中の細胞を集め、5mlの20%FCS培養液に懸濁
し、底面積25cm2のフラスコ(25Tフラスコ、コーニン
グ)に播種後、4日間静置培養した。培養物を遠心分離
して、3×106個の細胞を得た。これを0.5μg/ml濃度の
MNNGを含む3mlの10%FCS培養液に懸濁し、6ウエル培養
プレートの3ウエルに1mlずつ分注し、24時間静置培養
した。3ウエルの培養物を遠心分離し、10%FCS培養液
で2回洗浄し、3.2×106個の細胞を得た。このうち、1
×106個の細胞を10mlの10%FCS培養液に懸濁し、75Tフ
ラスコに播種後、2日間静置培養した。培養物を遠心分
離して、1.2×106個の細胞を得た。これを10mlの10%FC
S培養液に懸濁し、75Tフラスコに播種後、2日間静置培
養した。培養物を遠心分離して、5.5×105個の細胞を得
た。これを5mlの10%FCS培養液に懸濁し、25Tのフラス
コに播種後、2日間静置培養した。培養物を遠心分離し
て、2.5×105個の細胞を得た。これを2mlの10%FCS培養
液に懸濁し、6ウエル培養プレートの2ウエルに1mlず
つ播種後、2日間静置培養した。培養物を遠心分離し
て、7.0×105個の変異誘導細胞を得た。
(2) スクリーニング、クローニング 変異誘導細胞を10%FCS培養液で1回洗浄し、10%FCS
培養液に40個/ml密度となるように懸濁し、あらかじめ
フィーダー細胞としてマウス脾臓細胞をウエルあたり1
×105個播種した4枚の96 1/2ウエル平底培養プレート
(コーニング)の各ウエルに0.1mlずつ播種し、15日間
静置培養した。その間、3日から4日ごとに培地の半分
量を新しいものと交換した。単一なクローンとしてコロ
ニーが十分に増殖したウエルから培養上清を採取し、上
清中のヒト免疫グロブリンの有無をELISA法でスクリー
ニングした。
培養液に40個/ml密度となるように懸濁し、あらかじめ
フィーダー細胞としてマウス脾臓細胞をウエルあたり1
×105個播種した4枚の96 1/2ウエル平底培養プレート
(コーニング)の各ウエルに0.1mlずつ播種し、15日間
静置培養した。その間、3日から4日ごとに培地の半分
量を新しいものと交換した。単一なクローンとしてコロ
ニーが十分に増殖したウエルから培養上清を採取し、上
清中のヒト免疫グロブリンの有無をELISA法でスクリー
ニングした。
単一なクローンとしてコロニーが増殖した285ウエル
の培養上清についてヒト免疫グロブリンの測定を行った
結果、4ウエル(S1A6、S2C10、S2G7、S4D3)の培養上
清はヒトガンマ鎖、ヒトラムダ鎖及びヒトカッパ鎖の産
生が、2ウエル(S2E7、S4E2)の培養上清はヒトガンマ
鎖とヒトラムダ鎖の産生が、1ウエル(S1F5)の培養上
清はヒトガンマ鎖とヒトカッパ鎖の産生が陰性であっ
た。各ウエル中の細胞を、拡大培養し、培養上清につい
てヒト免疫グロブリン量の測定を再度行った結果、S4D3
の細胞を播種したウエルの培養上清はヒトカッパ鎖の産
生が、S2E7の細胞を播種したウエルの培養上清は、ヒト
ラムダ鎖の産生が陰性であった。次に、S2E7の細胞を、
10%FCS培養液で20個/ml密度になるように懸濁し、再ク
ローニングした(フィーダープレート4枚使用)。播種
16日間後、単一なクローンとしてコロニーが十分に増殖
したウエルについて、培養上清中のヒト免疫グロブリン
産生の有無をELISA法でスクリーニングした。測定した2
3ウエルの培養上清のうち、17ウエル(1D3、2A9、2F7、
4B2他)の培養上清はヒトガンマ鎖とヒトラムダ鎖の産
生が陰性であった。翌日、4B2中の細胞を、クローニン
グした(フィーダープレート3枚使用)。播種16日後、
単一なクローンとしてコロニーが十分に増殖したウエル
について、培養上清中のヒト免疫グロブリン産生の有無
をELISA法でスクリーニングした。測定した281ウエルの
培養上清はすべてヒトカッパ鎖の産生が陽性で、ヒトガ
ンマ鎖とヒトラムダ鎖の産生は陰性であった。このう
ち、増殖性の優れた単一細胞株を選択し、MP 4112と命
名した。MP 4112は微工研条寄第2128号として寄託され
ている。
の培養上清についてヒト免疫グロブリンの測定を行った
結果、4ウエル(S1A6、S2C10、S2G7、S4D3)の培養上
清はヒトガンマ鎖、ヒトラムダ鎖及びヒトカッパ鎖の産
生が、2ウエル(S2E7、S4E2)の培養上清はヒトガンマ
鎖とヒトラムダ鎖の産生が、1ウエル(S1F5)の培養上
清はヒトガンマ鎖とヒトカッパ鎖の産生が陰性であっ
た。各ウエル中の細胞を、拡大培養し、培養上清につい
てヒト免疫グロブリン量の測定を再度行った結果、S4D3
の細胞を播種したウエルの培養上清はヒトカッパ鎖の産
生が、S2E7の細胞を播種したウエルの培養上清は、ヒト
ラムダ鎖の産生が陰性であった。次に、S2E7の細胞を、
10%FCS培養液で20個/ml密度になるように懸濁し、再ク
ローニングした(フィーダープレート4枚使用)。播種
16日間後、単一なクローンとしてコロニーが十分に増殖
したウエルについて、培養上清中のヒト免疫グロブリン
産生の有無をELISA法でスクリーニングした。測定した2
3ウエルの培養上清のうち、17ウエル(1D3、2A9、2F7、
4B2他)の培養上清はヒトガンマ鎖とヒトラムダ鎖の産
生が陰性であった。翌日、4B2中の細胞を、クローニン
グした(フィーダープレート3枚使用)。播種16日後、
単一なクローンとしてコロニーが十分に増殖したウエル
について、培養上清中のヒト免疫グロブリン産生の有無
をELISA法でスクリーニングした。測定した281ウエルの
培養上清はすべてヒトカッパ鎖の産生が陽性で、ヒトガ
ンマ鎖とヒトラムダ鎖の産生は陰性であった。このう
ち、増殖性の優れた単一細胞株を選択し、MP 4112と命
名した。MP 4112は微工研条寄第2128号として寄託され
ている。
実施例3.ヒト免疫グロブリン非合成細胞株の作製−3 (1) 突然変異細胞の作製 実施例2と同様にして、培養時期の異なるヒトハイブ
リドーマ細胞株、ATCC CRL 8658からヒトガンマ鎖とヒ
トラムダ鎖を合成しない細胞を作製し、5×105個の細
胞を150μg/ml濃度のEMSを含む5mlの10%FCS培養液に懸
濁し、底面積25cm2のフラスコ(25Tフラスコ、コーニン
グ)に播種後、24時間静置培養した。培養物を遠心分離
して、変異誘導細胞を得た。
リドーマ細胞株、ATCC CRL 8658からヒトガンマ鎖とヒ
トラムダ鎖を合成しない細胞を作製し、5×105個の細
胞を150μg/ml濃度のEMSを含む5mlの10%FCS培養液に懸
濁し、底面積25cm2のフラスコ(25Tフラスコ、コーニン
グ)に播種後、24時間静置培養した。培養物を遠心分離
して、変異誘導細胞を得た。
(2) スクリーニング、クローニング 変異誘導細胞を10%FCS培養液で2回洗浄した後1.2×
106個/mlの密度の細胞浮遊液とし、この細胞浮遊液0.1m
lを0.3%アガロース(シープラークアガロース、エフ・
エム・シー社)を含む培養液24mlを加え混合した。つぎ
に、あらかじめ0.5%アガロースを含む培養液4mlを分注
して固めた6cmシャーレに、細胞および0.3%アガロース
を含む培養液3mlを分注して固めた(7枚)。細胞を分
注した6cmシャーレは5%炭酸ガス存在下、37℃で静置
培養した。2週間後、軟寒天中に細胞が増殖しコロニー
が肉眼的に認められるようになったら、各コロニーをパ
スツールピペットを用いて、あらかじめウエル当たり0.
1mlの培養液を分注した96ウエル平底培養プレートの各
ウエルに移し培養した。2日後に培養液0.1mlを加え、
さらに3日後、培養上清を採取し、上清中のヒトカッパ
鎖の有無をELISA法でスクリーニングした。
106個/mlの密度の細胞浮遊液とし、この細胞浮遊液0.1m
lを0.3%アガロース(シープラークアガロース、エフ・
エム・シー社)を含む培養液24mlを加え混合した。つぎ
に、あらかじめ0.5%アガロースを含む培養液4mlを分注
して固めた6cmシャーレに、細胞および0.3%アガロース
を含む培養液3mlを分注して固めた(7枚)。細胞を分
注した6cmシャーレは5%炭酸ガス存在下、37℃で静置
培養した。2週間後、軟寒天中に細胞が増殖しコロニー
が肉眼的に認められるようになったら、各コロニーをパ
スツールピペットを用いて、あらかじめウエル当たり0.
1mlの培養液を分注した96ウエル平底培養プレートの各
ウエルに移し培養した。2日後に培養液0.1mlを加え、
さらに3日後、培養上清を採取し、上清中のヒトカッパ
鎖の有無をELISA法でスクリーニングした。
432ウエルの培養上清についてヒトカッパ鎖の測定を
行った結果、4ウエル(2F10、2G9、3E9、4H7)の培養
上清ヒトカッパ鎖の産生が陰性であった。各ウエル中の
細胞を、拡大培養し、培養上清についてヒトカッパ鎖の
測定を再度行った結果、2G9の細胞を播種したウエルの
培養上清は、ヒトカッパ鎖の産生が陰性であった。次
に、2G9の細胞を、10%FCS培養液で10個/ml密度になる
ように懸濁し、10%FCS培養液で1回洗浄し、10%FCS培
養液に40個/ml密度となるように懸濁し、あらかじめフ
ィーダー細胞としてマウス脾臓細胞をウエルあたり1×
105個播種した2枚の96 1/2ウエル平底培養プレート
(コーニング)の各ウエルに0.1mlずつ播種し、8日間
静置培養した。その間、3日から4日ごとに培地の半分
量を新しいものと交換した。播種9日後、単一なクロー
ンとしてコロニーが十分に増殖したウエルについて、培
養上清中のヒトカッパ鎖産生の有無をELISA法でスクリ
ーニングし。測定した184ウエルの培養上清はすべてヒ
トカッパ鎖の産生が陰性であった。このうち、増殖性の
優れた単一細胞株を選択し、MP 4126と命名した。MP 41
26は微工研条寄第2615号として寄託されている。
行った結果、4ウエル(2F10、2G9、3E9、4H7)の培養
上清ヒトカッパ鎖の産生が陰性であった。各ウエル中の
細胞を、拡大培養し、培養上清についてヒトカッパ鎖の
測定を再度行った結果、2G9の細胞を播種したウエルの
培養上清は、ヒトカッパ鎖の産生が陰性であった。次
に、2G9の細胞を、10%FCS培養液で10個/ml密度になる
ように懸濁し、10%FCS培養液で1回洗浄し、10%FCS培
養液に40個/ml密度となるように懸濁し、あらかじめフ
ィーダー細胞としてマウス脾臓細胞をウエルあたり1×
105個播種した2枚の96 1/2ウエル平底培養プレート
(コーニング)の各ウエルに0.1mlずつ播種し、8日間
静置培養した。その間、3日から4日ごとに培地の半分
量を新しいものと交換した。播種9日後、単一なクロー
ンとしてコロニーが十分に増殖したウエルについて、培
養上清中のヒトカッパ鎖産生の有無をELISA法でスクリ
ーニングし。測定した184ウエルの培養上清はすべてヒ
トカッパ鎖の産生が陰性であった。このうち、増殖性の
優れた単一細胞株を選択し、MP 4126と命名した。MP 41
26は微工研条寄第2615号として寄託されている。
実施例4.染色体数の測定 MP 4109、MP 4112、MP 4126の染色体数分布の測定
は、吉田の方法〔成書「動物細胞利用実用化マニュア
ル」(1984)、リアライズ社、p337〕に準じて行った。
は、吉田の方法〔成書「動物細胞利用実用化マニュア
ル」(1984)、リアライズ社、p337〕に準じて行った。
対数増殖期にあるMP 4109、MP 4112、MP 4126を集め
(約1×106個)を、0.1μg/濃度のコルセミド(シグマ
社)を含む10%FCS培養液中で、90分間培養した。培養
後、遠心分離(200×g、5分間)により得られた細胞
残渣に5mlの0.075M塩化カリウム水溶液を加えて軽く撹
拌し、37℃に20分間放置した。放置後、1mlの固定液
(カルノア液;メタノール:酢酸=3:1)を加えて軽く
撹拌し、4℃に30分間放置した。次に、遠心分離(180
×g、5分間)し、上清を3ml除き、同量の固定液を加
えて撹拌した。遠心分離後に除く上清量を4、5、6ml
と増やし、同様の操作を繰り返した。最終に、細胞残渣
に0.5mlの固定液を加え、懸濁液とした。スライドグラ
ス上にこの懸濁液を数滴おとし、沸騰水浴上に約1分間
放置した後、室温にて自然乾燥させた。
(約1×106個)を、0.1μg/濃度のコルセミド(シグマ
社)を含む10%FCS培養液中で、90分間培養した。培養
後、遠心分離(200×g、5分間)により得られた細胞
残渣に5mlの0.075M塩化カリウム水溶液を加えて軽く撹
拌し、37℃に20分間放置した。放置後、1mlの固定液
(カルノア液;メタノール:酢酸=3:1)を加えて軽く
撹拌し、4℃に30分間放置した。次に、遠心分離(180
×g、5分間)し、上清を3ml除き、同量の固定液を加
えて撹拌した。遠心分離後に除く上清量を4、5、6ml
と増やし、同様の操作を繰り返した。最終に、細胞残渣
に0.5mlの固定液を加え、懸濁液とした。スライドグラ
ス上にこの懸濁液を数滴おとし、沸騰水浴上に約1分間
放置した後、室温にて自然乾燥させた。
1/15Mリン酸緩衝液(pH7.0)で20倍に希釈したギムザ
液中に、スライドグラスを15分間浸けた後、水道水で余
分な染色液を洗いおとし、乾燥させた。乾燥後、封入剤
を滴下し、カバーグラスをかけ、光学顕微鏡下写真撮影
し、染色体数を計測した。第1表、第2表、第3表に示
すように、MP 4109、MP 4112、MP 4126は各々染色体数8
9本、75本、73本にモードを有していた。
液中に、スライドグラスを15分間浸けた後、水道水で余
分な染色液を洗いおとし、乾燥させた。乾燥後、封入剤
を滴下し、カバーグラスをかけ、光学顕微鏡下写真撮影
し、染色体数を計測した。第1表、第2表、第3表に示
すように、MP 4109、MP 4112、MP 4126は各々染色体数8
9本、75本、73本にモードを有していた。
実施例5.合成、分泌ヒト免疫グロブリンの測定 MP 4109、MP 4112、MP 4126が細胞外へ分泌するヒト
免疫グロブリン量の測定用試料の調製は以下の様に行っ
た。対数増殖期の細胞を集め、10%FCS培養液に1×106
個/ml密度となるように懸濁して、6ウエル培養プレー
トの各々ウエルに1mlずつ播種し、5%炭酸ガス存在下
で、37℃で静置培養した。24時間後、遠心分離(250×
g、10分間)により培養上清を分離し、これを測定試料
とした。ATCC CRL 8658を同様に培養して、ヒトガンマ
鎖、ヒトラムダ鎖、ヒトカッパ鎖分泌の陽性コントロー
ル試料とした。
免疫グロブリン量の測定用試料の調製は以下の様に行っ
た。対数増殖期の細胞を集め、10%FCS培養液に1×106
個/ml密度となるように懸濁して、6ウエル培養プレー
トの各々ウエルに1mlずつ播種し、5%炭酸ガス存在下
で、37℃で静置培養した。24時間後、遠心分離(250×
g、10分間)により培養上清を分離し、これを測定試料
とした。ATCC CRL 8658を同様に培養して、ヒトガンマ
鎖、ヒトラムダ鎖、ヒトカッパ鎖分泌の陽性コントロー
ル試料とした。
MP 4109の細胞内でのヒト免疫グロブリン合成量の測
定試料の調製は以下の様に行った。対数増殖期の細胞を
集め(1×107個)、1%のポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート(シグマ)を含む1mlのリン酸緩衝
液に懸濁し、ポッター型ホモジナイザーで破砕した。細
胞破砕液を遠元分離(50,000×g、30分間)して得られ
た上清を、0.22μmのフィルターで濾過し、測定試料と
した。ATCC CRL 8658を同様に処理し、ヒトガンマ鎖、
ヒトラムダ鎖、ヒトカッパ鎖合成の陽性コントロール試
料に、また、Raji細胞を同様に処理し、ヒト免疫グロブ
リン非合成の陰性コントロール試料とした。試料中のヒ
トガンマ鎖量、ヒトラムダ鎖およびヒトカッパ鎖量の測
定はELISA法にて測定した。
定試料の調製は以下の様に行った。対数増殖期の細胞を
集め(1×107個)、1%のポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート(シグマ)を含む1mlのリン酸緩衝
液に懸濁し、ポッター型ホモジナイザーで破砕した。細
胞破砕液を遠元分離(50,000×g、30分間)して得られ
た上清を、0.22μmのフィルターで濾過し、測定試料と
した。ATCC CRL 8658を同様に処理し、ヒトガンマ鎖、
ヒトラムダ鎖、ヒトカッパ鎖合成の陽性コントロール試
料に、また、Raji細胞を同様に処理し、ヒト免疫グロブ
リン非合成の陰性コントロール試料とした。試料中のヒ
トガンマ鎖量、ヒトラムダ鎖およびヒトカッパ鎖量の測
定はELISA法にて測定した。
MP 4109の培養上清中および細胞破砕液中にヒトガン
マ鎖は検出されなかった。なお、MP 4109が培養上清中
に分泌するヒトラムダ鎖量およびヒトカッパ鎖量はいず
れもATCC CRL 8658の約5分1であった。MP 4112の培養
上清中および細胞破砕液中にヒトガンマ鎖およびヒトラ
ムダ鎖は検出されなかった。なお、MP 4112が培養上清
中に分泌するヒトカッパ鎖量はATCC CRL 8658の約3分
の1であった。MP 4126の培養上清中および細胞破砕液
中にヒトガンマ鎖、ヒトカッパ鎖およびヒトラムダ鎖は
検出されなかった。
マ鎖は検出されなかった。なお、MP 4109が培養上清中
に分泌するヒトラムダ鎖量およびヒトカッパ鎖量はいず
れもATCC CRL 8658の約5分1であった。MP 4112の培養
上清中および細胞破砕液中にヒトガンマ鎖およびヒトラ
ムダ鎖は検出されなかった。なお、MP 4112が培養上清
中に分泌するヒトカッパ鎖量はATCC CRL 8658の約3分
の1であった。MP 4126の培養上清中および細胞破砕液
中にヒトガンマ鎖、ヒトカッパ鎖およびヒトラムダ鎖は
検出されなかった。
実施例6.細胞倍加時間の測定 対数増殖期のMP 4109、MP 4112、MP 4126を集め、10
%FCS培養液に5×104個/ml密度となるように懸濁し
て、6ウエル培養プレートの各ウエルに1mlずつ播種
し、5%炭酸ガス存在下、37℃で静置培養した。培養開
始後7日間にわたり、1日1回、ウエル中の細胞数を血
球計算板を使用して正確に計測した。各回3ウエル中の
細胞数を計測した。その平均値から計算されるMP 410
9、MP 4112、MP 4126の対数増殖期における細胞倍加時
間は各々24.6時間、25.6時間、20.5時間であった。
%FCS培養液に5×104個/ml密度となるように懸濁し
て、6ウエル培養プレートの各ウエルに1mlずつ播種
し、5%炭酸ガス存在下、37℃で静置培養した。培養開
始後7日間にわたり、1日1回、ウエル中の細胞数を血
球計算板を使用して正確に計測した。各回3ウエル中の
細胞数を計測した。その平均値から計算されるMP 410
9、MP 4112、MP 4126の対数増殖期における細胞倍加時
間は各々24.6時間、25.6時間、20.5時間であった。
実施例7.ヒトハイブリドーマの作製−1 健常人末梢血から分離したヒト抗体産生細胞(リンパ
球)にB95−8細胞(感染性のEBウイルスを産生するマ
ーモセットリンパ芽球細胞)の培養上清を加えて、EBウ
イルス感染さた後、培養上清中にヒトIgM産生の認めら
れたウエルの細胞をクローニングして得られたヒトIgM
産生ヒトリンパ芽球細胞、87H4Gを融合のパートナーに
使用してヒトハイブリドーマの作製を行った。あらかじ
め10%FCS培養液中で増殖させたヒトIgM産生ヒトリンパ
芽球細胞とMP4109を各々RPMI1640培地で洗浄した。3×
107個のヒトリンパ芽球細胞と同数のMP 4109細胞を50ml
容量のプラスチック製遠心管中で混合した。遠心分離
(175×g、10分間)後、遠心上清を吸引除去し、遠心
管内に50%PEG(M.W.1500、和光純薬)および10%DMSO
を含むRPMI 1640培地0.5mlを静かに加えゆっくり回転さ
せて、細胞を融合させた。2分後、RPMI 1640培地10ml
を加え静かに撹拌後、遠心分離(175×g、10分間)し
た。遠心上清を吸引除去し、2×10-4Mヒポキサンチン
(シグマ)、1μg/mlアザセリン(シグマ)、5μMウ
アバイン(シグマ)を含む20%FCS培養液(以下HA−O
培養液と略す)を加えて1×106個/mlの密度の細胞懸濁
液とし、96ウエル平底培養プレートのウエル当たり0.1m
lずつ播種(合計627ウエル)した。細胞は5%炭酸ガス
存在下、37℃で静置培養した。4日後に0.1mlのHA−O
培養液を加え、その後、4日から5日毎に半量のHA−O
培養液を新しいHA−O培養液で交換した。7週間後まで
のヒトハイブリドーマのコロニー増殖が認められたウエ
ル数は627ウエル中78ウエルであった。この結果、融合
頻度は2.6×10-6と計算された。
球)にB95−8細胞(感染性のEBウイルスを産生するマ
ーモセットリンパ芽球細胞)の培養上清を加えて、EBウ
イルス感染さた後、培養上清中にヒトIgM産生の認めら
れたウエルの細胞をクローニングして得られたヒトIgM
産生ヒトリンパ芽球細胞、87H4Gを融合のパートナーに
使用してヒトハイブリドーマの作製を行った。あらかじ
め10%FCS培養液中で増殖させたヒトIgM産生ヒトリンパ
芽球細胞とMP4109を各々RPMI1640培地で洗浄した。3×
107個のヒトリンパ芽球細胞と同数のMP 4109細胞を50ml
容量のプラスチック製遠心管中で混合した。遠心分離
(175×g、10分間)後、遠心上清を吸引除去し、遠心
管内に50%PEG(M.W.1500、和光純薬)および10%DMSO
を含むRPMI 1640培地0.5mlを静かに加えゆっくり回転さ
せて、細胞を融合させた。2分後、RPMI 1640培地10ml
を加え静かに撹拌後、遠心分離(175×g、10分間)し
た。遠心上清を吸引除去し、2×10-4Mヒポキサンチン
(シグマ)、1μg/mlアザセリン(シグマ)、5μMウ
アバイン(シグマ)を含む20%FCS培養液(以下HA−O
培養液と略す)を加えて1×106個/mlの密度の細胞懸濁
液とし、96ウエル平底培養プレートのウエル当たり0.1m
lずつ播種(合計627ウエル)した。細胞は5%炭酸ガス
存在下、37℃で静置培養した。4日後に0.1mlのHA−O
培養液を加え、その後、4日から5日毎に半量のHA−O
培養液を新しいHA−O培養液で交換した。7週間後まで
のヒトハイブリドーマのコロニー増殖が認められたウエ
ル数は627ウエル中78ウエルであった。この結果、融合
頻度は2.6×10-6と計算された。
コロニーの増殖が認められたウエルより4ウエルを無
作為に選び、ヒトハイブリドーマを24ウエルプレート、
6ウエルプレート、6cmシャーレ、75Tフラスコへと拡大
培養した。4株のヒトハイブリドーマを、各々20%FCS
培養液に1×106個/ml密度となるように懸濁し、6ウエ
ルプレートの各ウエル当たり1mlずつ播種し、5%炭酸
ガス存在下、37℃で静置培養した。24時間後に、遠心分
離(200g×g、10分)して培養上清を分離し、培養上清
中のヒトミュウ鎖量およびヒトガンマ鎖量をELISA法に
て測定した。その結果を第4表に示した。いずれのヒト
ハイブリドーマも、ヒトIgM産生ヒトリンパ芽球細胞由
来の重鎖であるヒトミュウ鎖は分泌するが、他の重鎖
(ヒトガンマ鎖)は分泌しなかった。
作為に選び、ヒトハイブリドーマを24ウエルプレート、
6ウエルプレート、6cmシャーレ、75Tフラスコへと拡大
培養した。4株のヒトハイブリドーマを、各々20%FCS
培養液に1×106個/ml密度となるように懸濁し、6ウエ
ルプレートの各ウエル当たり1mlずつ播種し、5%炭酸
ガス存在下、37℃で静置培養した。24時間後に、遠心分
離(200g×g、10分)して培養上清を分離し、培養上清
中のヒトミュウ鎖量およびヒトガンマ鎖量をELISA法に
て測定した。その結果を第4表に示した。いずれのヒト
ハイブリドーマも、ヒトIgM産生ヒトリンパ芽球細胞由
来の重鎖であるヒトミュウ鎖は分泌するが、他の重鎖
(ヒトガンマ鎖)は分泌しなかった。
実施例8.ヒトハイブリドーマの作製−2 実施例7と同様にして、ヒトIgM産生ヒトリンパ芽球
細胞、87H4GとMP 4112を各々3×107個づつ融合させ
た。7週間後までのヒトハイブリドーマのコロニー増殖
が認められたウエル数は610ウエル中69ウエルであっ
た。この結果、融合頻度は2.4×10-6と計算された。
細胞、87H4GとMP 4112を各々3×107個づつ融合させ
た。7週間後までのヒトハイブリドーマのコロニー増殖
が認められたウエル数は610ウエル中69ウエルであっ
た。この結果、融合頻度は2.4×10-6と計算された。
コロニーの増殖が認められたウエルより4ウエルを無
作為に選び、ヒトハイブリドーマを24ウエルプレート、
6ウエルプレート、6cmシャーレ、75Tフラスコへと拡大
培養した。4株のヒトハイブリドーマを、各々20%FCS
培養液に1×106個/ml密度となるように懸濁し、6ウエ
ルプレートの各ウエル当たり1mlずつ播種し、5%炭酸
ガス存在下、37℃で静置培養した。24時間後に、遠心分
離(200×g、10分)して培養上清を分離し、培養上清
中のヒトミュウ鎖量およびヒトガンマ鎖量をELISA法に
て測定した。測定結果を第5表に示した。いずれのヒト
ハイブリドーマも、ヒトIgM産生ヒトリンパ芽球細胞、8
7H4G由来の重鎖であるヒトミュウ鎖は分泌するが、他の
重鎖(ヒトガンマ鎖)は分泌しない。
作為に選び、ヒトハイブリドーマを24ウエルプレート、
6ウエルプレート、6cmシャーレ、75Tフラスコへと拡大
培養した。4株のヒトハイブリドーマを、各々20%FCS
培養液に1×106個/ml密度となるように懸濁し、6ウエ
ルプレートの各ウエル当たり1mlずつ播種し、5%炭酸
ガス存在下、37℃で静置培養した。24時間後に、遠心分
離(200×g、10分)して培養上清を分離し、培養上清
中のヒトミュウ鎖量およびヒトガンマ鎖量をELISA法に
て測定した。測定結果を第5表に示した。いずれのヒト
ハイブリドーマも、ヒトIgM産生ヒトリンパ芽球細胞、8
7H4G由来の重鎖であるヒトミュウ鎖は分泌するが、他の
重鎖(ヒトガンマ鎖)は分泌しない。
実施例9.ヒトハイブリドーマの作製−3 健常人末梢血から分離したヒト抗体産生細胞(リンパ
球)にB95−8細胞(感染性のEBウイルスを産生するマ
ーモセットリンパ芽球細胞)の培養上清を加えて、EBウ
イルス感染さた後、培養上清中にヒトIgM産生の認めら
れたウエルの細胞をクローニングして得られた、ヒトIg
M(ヒトミュー鎖、ヒトラムダ鎖)産生ヒトリンパ芽球
細胞、87L8GNMとMP 4126を実施例7と同様にして各々2.
5×107個づつ融合させた。7週間後までにヒトハイブリ
ドーマのコロニー増殖が認められたウエル数は480ウエ
ル中6ウエルであった。この結果、融合頻度は2.4×10
-7と計算された。
球)にB95−8細胞(感染性のEBウイルスを産生するマ
ーモセットリンパ芽球細胞)の培養上清を加えて、EBウ
イルス感染さた後、培養上清中にヒトIgM産生の認めら
れたウエルの細胞をクローニングして得られた、ヒトIg
M(ヒトミュー鎖、ヒトラムダ鎖)産生ヒトリンパ芽球
細胞、87L8GNMとMP 4126を実施例7と同様にして各々2.
5×107個づつ融合させた。7週間後までにヒトハイブリ
ドーマのコロニー増殖が認められたウエル数は480ウエ
ル中6ウエルであった。この結果、融合頻度は2.4×10
-7と計算された。
コロニーの増殖が認められたウエルより4ウエルを無
作為に選び、ヒトハイブリドーマを24ウエルプレート、
6ウエルプレート、6cmシャーレ、75Tフラスコへと拡大
培養した。4株のヒトハイブリドーマを、各々20%FCS
培養液に1×106個/ml密度となるように懸濁し、6ウエ
ルプレートの各ウエル当たり1mlずつ播種し、5%炭酸
ガス存在下、37℃で静置培養した。24時間後に、遠心分
離(200×g、10分)して培養上清を分離し、培養上清
中のヒトミュウ鎖量およびヒトガンマ鎖量をELISA法に
て測定した。その結果を第6表に示した。いずれのヒト
ハイブリドーマも、ヒトIgM産生ヒトリンパ芽球細胞由
来の重鎖であるヒトミュウ鎖は分泌するが、他の重鎖
(ヒトガンマ鎖)は分泌しない。また、培養上清中のヒ
トカッパ鎖とヒトラムダ鎖をELISA法にて検出したとこ
ろヒトラムダ鎖は検出されたがヒトカッパ鎖は検出され
なかった。
作為に選び、ヒトハイブリドーマを24ウエルプレート、
6ウエルプレート、6cmシャーレ、75Tフラスコへと拡大
培養した。4株のヒトハイブリドーマを、各々20%FCS
培養液に1×106個/ml密度となるように懸濁し、6ウエ
ルプレートの各ウエル当たり1mlずつ播種し、5%炭酸
ガス存在下、37℃で静置培養した。24時間後に、遠心分
離(200×g、10分)して培養上清を分離し、培養上清
中のヒトミュウ鎖量およびヒトガンマ鎖量をELISA法に
て測定した。その結果を第6表に示した。いずれのヒト
ハイブリドーマも、ヒトIgM産生ヒトリンパ芽球細胞由
来の重鎖であるヒトミュウ鎖は分泌するが、他の重鎖
(ヒトガンマ鎖)は分泌しない。また、培養上清中のヒ
トカッパ鎖とヒトラムダ鎖をELISA法にて検出したとこ
ろヒトラムダ鎖は検出されたがヒトカッパ鎖は検出され
なかった。
6) 発明の効果 本発明の新規親細胞株を用いることにより、ヒト抗体
産生細胞とのヒトハイブリドーマの作製が達成される。
産生細胞とのヒトハイブリドーマの作製が達成される。
本発明で注目すべきことは、本発明の新規親細胞株MP
4109、MP 4112、MP 4126とヒト抗体産生細胞の細胞融
合により作製されるヒトハイブリドーマは、その産生す
るヒトモノクローナル抗体に、親細胞株に由来するヒト
免疫グロブリン重鎖をまったく含まない。ヒトハイブリ
ドーマ作製用の親細胞株がヒト免疫グロブリン重鎖非合
成であることは、ヒトハイブリドーマの産生するヒトモ
ノクローナル抗体を産業上利用する場合に、特に大きな
意義を有するものである。すなわち、本発明の重鎖非合
成親細胞株とIgA型、IgG型、IgM型、IgE型またはIgD型
ヒト抗体産生細胞の細胞融合により作製されるヒトハイ
ブリドーマは親細胞由来の重鎖を合成しないため、目的
とするIgA型、IgG型、IgM型、IgE型またはIgD型抗体の
精製が容易となる。また、本発明の重鎖非合成親細胞株
とヒト抗体産生細胞の細胞融合により作製されるヒトハ
イブリドーマは、目的とする抗体に親細胞由来の重合鎖
が組み換わった抗体を産生する可能性がない。さらに、
MP 4126とヒト抗体産生細胞の細胞融合により作製され
るヒトハイブリドーマはヒト抗体産生細胞由来のヒト免
疫グロブリンのみを合成するため、目的とする抗体の精
製が容易となる。本発明の新規親細胞株の使用はヒト抗
体産生細胞の種類や使用目的により適宜選択できる。
4109、MP 4112、MP 4126とヒト抗体産生細胞の細胞融
合により作製されるヒトハイブリドーマは、その産生す
るヒトモノクローナル抗体に、親細胞株に由来するヒト
免疫グロブリン重鎖をまったく含まない。ヒトハイブリ
ドーマ作製用の親細胞株がヒト免疫グロブリン重鎖非合
成であることは、ヒトハイブリドーマの産生するヒトモ
ノクローナル抗体を産業上利用する場合に、特に大きな
意義を有するものである。すなわち、本発明の重鎖非合
成親細胞株とIgA型、IgG型、IgM型、IgE型またはIgD型
ヒト抗体産生細胞の細胞融合により作製されるヒトハイ
ブリドーマは親細胞由来の重鎖を合成しないため、目的
とするIgA型、IgG型、IgM型、IgE型またはIgD型抗体の
精製が容易となる。また、本発明の重鎖非合成親細胞株
とヒト抗体産生細胞の細胞融合により作製されるヒトハ
イブリドーマは、目的とする抗体に親細胞由来の重合鎖
が組み換わった抗体を産生する可能性がない。さらに、
MP 4126とヒト抗体産生細胞の細胞融合により作製され
るヒトハイブリドーマはヒト抗体産生細胞由来のヒト免
疫グロブリンのみを合成するため、目的とする抗体の精
製が容易となる。本発明の新規親細胞株の使用はヒト抗
体産生細胞の種類や使用目的により適宜選択できる。
本発明の親細胞株は、その有する選択特性により、各
種の起源を異にするヒト抗体産生細胞との細胞融合後、
作製されたヒトハイブリドーマを選択的に増殖させるこ
とが出来る。ヒト抗体産生細胞には、例えば、健康人ま
たは各種疾患の患者由来の脾臓、リンパ節、扁桃腺、末
梢血などから分離される抗体産生細胞や、これら抗体産
生細胞をEBウイルスにより形質転換した細胞集団、およ
び形質転換した細胞集団からクローニングにより得た単
一EBウイルス形質転換細胞株を用いることができる。ま
た、特定抗原免疫により特定抗原に対する高い血中抗体
価が誘導されたヒトの抗体産生細胞や、ヒト抗体産生細
胞(B細胞)をポークウィードマイトージェン(PWM)
などの因子と特定抗原を添加した培養液中で数日間培養
することにより刺激、増殖させた抗体産生細胞などが細
胞融合用のヒト抗体産生細胞として用いることが出来
る。
種の起源を異にするヒト抗体産生細胞との細胞融合後、
作製されたヒトハイブリドーマを選択的に増殖させるこ
とが出来る。ヒト抗体産生細胞には、例えば、健康人ま
たは各種疾患の患者由来の脾臓、リンパ節、扁桃腺、末
梢血などから分離される抗体産生細胞や、これら抗体産
生細胞をEBウイルスにより形質転換した細胞集団、およ
び形質転換した細胞集団からクローニングにより得た単
一EBウイルス形質転換細胞株を用いることができる。ま
た、特定抗原免疫により特定抗原に対する高い血中抗体
価が誘導されたヒトの抗体産生細胞や、ヒト抗体産生細
胞(B細胞)をポークウィードマイトージェン(PWM)
などの因子と特定抗原を添加した培養液中で数日間培養
することにより刺激、増殖させた抗体産生細胞などが細
胞融合用のヒト抗体産生細胞として用いることが出来
る。
本発明の新規親細胞株とヒト抗体産生細胞の細胞融合
により、各種疾患の診断、予防、治療に用い得るヒトモ
ノクローナル抗体の作製が達成される。例えば、サイト
メガロウイル(CMV)、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTL
V)、ヘルペスシンプレックスウイルス(HSV)、バリセ
ラゾスターウイルス(VZV)、B型肝炎ウイルス(HB
V)、インフルエンザウイルス、RSウイルス(RSV)等の
ウイルス、緑膿菌、病原性大腸菌、インフルエンザ菌、
肺炎球菌、黄色ぶどう状球菌等の細菌、アスペルギル
ス、カンジダ等の真菌に対するヒトモノクローナル抗体
の作製が可能となる。また、診断、治療の他、細胞分
類、電気泳動分析、物質精製、組織学、細胞学などの幅
広い分野において使用できるヒトモノクローナル抗体の
作製が達成される。例えば、癌抗原、緑膿菌が産生する
エキソトキシンA等の毒素、すぎ花粉などの各種アレル
ゲン、ホルモン、生理活性タンパク質、組織適合抗原に
対するヒトモノクローナル抗体の作製が可能となる。ヒ
ト抗体産生細胞の生産する抗体のグロブリンクラスは、
IgG、IgM、IgA、IgD、IgEのいずれであってもよい。
により、各種疾患の診断、予防、治療に用い得るヒトモ
ノクローナル抗体の作製が達成される。例えば、サイト
メガロウイル(CMV)、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTL
V)、ヘルペスシンプレックスウイルス(HSV)、バリセ
ラゾスターウイルス(VZV)、B型肝炎ウイルス(HB
V)、インフルエンザウイルス、RSウイルス(RSV)等の
ウイルス、緑膿菌、病原性大腸菌、インフルエンザ菌、
肺炎球菌、黄色ぶどう状球菌等の細菌、アスペルギル
ス、カンジダ等の真菌に対するヒトモノクローナル抗体
の作製が可能となる。また、診断、治療の他、細胞分
類、電気泳動分析、物質精製、組織学、細胞学などの幅
広い分野において使用できるヒトモノクローナル抗体の
作製が達成される。例えば、癌抗原、緑膿菌が産生する
エキソトキシンA等の毒素、すぎ花粉などの各種アレル
ゲン、ホルモン、生理活性タンパク質、組織適合抗原に
対するヒトモノクローナル抗体の作製が可能となる。ヒ
ト抗体産生細胞の生産する抗体のグロブリンクラスは、
IgG、IgM、IgA、IgD、IgEのいずれであってもよい。
また、本発明の親細胞株は細胞融合用の親細胞株とし
て使用できるだけでなく、各種の遺伝子を導入、発現さ
せて各種のタンパク質を産生するホスト細胞としても使
用できる。さらに、ヒト抗体産生細胞とのヒトハイブリ
ドーマを作製し、ヒト抗体遺伝子調製用の材料細胞に使
用することも出来る。
て使用できるだけでなく、各種の遺伝子を導入、発現さ
せて各種のタンパク質を産生するホスト細胞としても使
用できる。さらに、ヒト抗体産生細胞とのヒトハイブリ
ドーマを作製し、ヒト抗体遺伝子調製用の材料細胞に使
用することも出来る。
本発明の新規親細胞株は、細胞融合により作製したヒ
トハイブリドーマに高い抗体分泌能を付加することが出
来る。本性質により、作製したヒトハイブリドーマを大
量に培養してヒトモノクローナル抗体を製造する場合
に、培養期間の短縮化と製造コストの低減をもたらすこ
とが出来る。
トハイブリドーマに高い抗体分泌能を付加することが出
来る。本性質により、作製したヒトハイブリドーマを大
量に培養してヒトモノクローナル抗体を製造する場合
に、培養期間の短縮化と製造コストの低減をもたらすこ
とが出来る。
なお、本発明の親細胞株を選別するか、あるいは突然
変異を誘発後の選別により新たなヒト免疫グロブリン非
合成の細胞株を取得できる。あるいは、本発明の親細胞
株とヒトミエローマ細胞や、ヒトリンパ芽球細胞を細胞
融合し、新たな親細胞株を創製できる。本発明の親細胞
株は、さらに、選択特設を付与するために新たに遺伝子
を導入したり、突然変異を誘発させることにより、新た
な親細胞株を誘導できる。例えば、ネオマイシンなどに
対する薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドを導入した
り、耐性遺伝子を有する細胞と細胞融合させることもで
きる。
変異を誘発後の選別により新たなヒト免疫グロブリン非
合成の細胞株を取得できる。あるいは、本発明の親細胞
株とヒトミエローマ細胞や、ヒトリンパ芽球細胞を細胞
融合し、新たな親細胞株を創製できる。本発明の親細胞
株は、さらに、選択特設を付与するために新たに遺伝子
を導入したり、突然変異を誘発させることにより、新た
な親細胞株を誘導できる。例えば、ネオマイシンなどに
対する薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドを導入した
り、耐性遺伝子を有する細胞と細胞融合させることもで
きる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI (C12N 5/06 C12R 1:91) (56)参考文献 特開 昭61−128886(JP,A) 特開 昭63−185374(JP,A) 特開 昭62−155083(JP,A) 特開 昭60−141285(JP,A) (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12N 5/00 - 5/28 C12N 15/00 - 15/90 BIOSIS(DIALOG) WPI(DIALOG)
Claims (2)
- 【請求項1】ヒトミエローマ細胞であるRPMI 8226とヒ
トリンパ芽球細胞であるGM 1500の融合細胞であるヒト
免疫グロブリン合成細胞株ATCC CRL 8658に由来し、自
己増殖能とヒト抗体産生細胞との細胞融合能を有するヒ
トγ鎖非合成突然変異細胞株微工研条寄第2128号、第21
29号、およびそれらに由来する細胞株。 - 【請求項2】ヒトミエローマ細胞であるRPMI 8226とヒ
トリンパ芽球細胞であるGM 1500の融合細胞であるヒト
免疫グロブリン合成細胞株ATCC CRL 8658に由来し、自
己増殖能とヒト抗体産生細胞との細胞融合能を有するヒ
ト免疫グロブリン非合成突然変異細胞株微工研条寄第26
15号、およびそれらに由来する細胞株。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63-281461 | 1988-11-09 | ||
JP63-281460 | 1988-11-09 | ||
JP28146188 | 1988-11-09 | ||
JP28146088 | 1988-11-09 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02242671A JPH02242671A (ja) | 1990-09-27 |
JP2764101B2 true JP2764101B2 (ja) | 1998-06-11 |
Family
ID=26554197
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1288764A Expired - Lifetime JP2764101B2 (ja) | 1988-11-09 | 1989-11-08 | ヒトハイブリドーマ作製用の親細胞株 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
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JP (1) | JP2764101B2 (ja) |
KR (1) | KR900008035A (ja) |
AU (1) | AU617553B2 (ja) |
CA (1) | CA2002067A1 (ja) |
DE (1) | DE68918229T2 (ja) |
DK (1) | DK553189A (ja) |
ES (1) | ES2059783T3 (ja) |
FI (1) | FI895316A0 (ja) |
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FR2817869B1 (fr) * | 2000-12-07 | 2005-01-14 | Technopharm | Anticorps monoclonal humain dirige contre le virus influenza ou un fragment de celui-ci |
CN113125227A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-07-16 | 上海乐辰生物科技有限公司 | 核型分析用制备高分辨染色体的秋水溶液及应用 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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NZ198851A (en) | 1980-11-07 | 1984-07-31 | Wistar Inst | Stable,continuous human myeloma cell line capable of hybridisation with antibody-producing cells:production of hybrid cell line |
US4451570A (en) | 1981-03-26 | 1984-05-29 | The Regents Of The University Of California | Immunoglobulin-secreting human hybridomas from a cultured human lymphoblastoid cell line |
US4647535A (en) | 1981-08-12 | 1987-03-03 | Research Corporation | Human nonsecretory plasmacytoid cell line |
US4434230A (en) | 1981-08-12 | 1984-02-28 | Research Corporation | Human nonsecretory plasmacytoid cell line |
US4529694A (en) * | 1982-04-16 | 1985-07-16 | The Children's Medical Center Corporation | Cell fusion |
JPS59132885A (ja) | 1983-01-20 | 1984-07-31 | Suntory Ltd | 新規細胞ライン |
CA1218947A (en) | 1983-04-06 | 1987-03-10 | Pearl M.J. Chen | Human hybrid cell lines |
JPS60141285A (ja) * | 1983-12-29 | 1985-07-26 | Hironori Murakami | ヒトハイブリド−マ作成用親細胞株 |
US4624921A (en) | 1984-04-26 | 1986-11-25 | Cetus Corporation | Human lymphoblastold cell line and hybridomas derived therefrom |
US4693975A (en) * | 1984-11-20 | 1987-09-15 | The Wistar Institute | Human hybridroma fusion partner for production of human monoclonal antibodies |
US4720459A (en) * | 1985-02-14 | 1988-01-19 | Medical College Of Wisconsin Research Foundation, Inc. | Myelomas for producing human/human hybridomas |
JPS61242575A (ja) | 1985-04-22 | 1986-10-28 | Wakunaga Seiyaku Kk | G418耐性ヒト−バ−キツトリンパ腫由来細胞 |
JP2599123B2 (ja) * | 1985-12-28 | 1997-04-09 | 萩原 義秀 | 新規なヒトbセル・リンパ芽球細胞変異株 |
JPS63185374A (ja) * | 1987-01-28 | 1988-07-30 | Morinaga & Co Ltd | ヒト−ヒトハイブリド−マ作製用親細胞株 |
US5001065A (en) | 1987-05-27 | 1991-03-19 | Cetus Corporation | Human cell line and triomas, antibodies, and transformants derived therefrom |
-
1989
- 1989-11-02 CA CA002002067A patent/CA2002067A1/en not_active Abandoned
- 1989-11-03 NO NO89894386A patent/NO894386L/no unknown
- 1989-11-06 DK DK553189A patent/DK553189A/da not_active Application Discontinuation
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- 1989-11-08 JP JP1288764A patent/JP2764101B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-08 AU AU44496/89A patent/AU617553B2/en not_active Ceased
- 1989-11-09 ES ES89311614T patent/ES2059783T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-09 DE DE68918229T patent/DE68918229T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-11-09 KR KR1019890016265A patent/KR900008035A/ko not_active Application Discontinuation
- 1989-11-09 EP EP89311614A patent/EP0368662B1/en not_active Expired - Lifetime
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CA2002067A1 (en) | 1990-05-09 |
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DE68918229D1 (de) | 1994-10-20 |
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