JP2708518B2 - 合成酵母リーダーペプチド - Google Patents

合成酵母リーダーペプチド

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は合成酵母リーダーペプチド、このようなリー
ダーペプチドをエンコードするDNA配列、ベクターおよ
び形質転換した酵母株に関する。
発明の背景 酵母株は、細胞内で合成されるが、しかし細胞外で機
能する多くのタンパク質を産生する。このような細胞外
タンパク質は分泌タンパク質と言われている。これらの
分泌タンパク質は、小胞体（ER）の膜を横切る発現生産
物の有効な方向を確実にする予備配列を含む前駆体また
はプレプロテイン形で細胞内に初期に発現される。予備
配列は通常シグナルペプチドと言われているが、これは
一般にトランスロケーションの間に所望生産物から切断
される。一たん分泌経路へ入ると、タンパク質はゴルジ
装置へ運ばれる。ゴルジ体からタンパク質はたとえば細
胞液胞または細胞膜のようなコンパートメントへ導びく
異なった経路を進むか、または細胞外への径路を通り外
部の培地へ分泌される（プフェファー，エス．アール.P
feffer,S.R.およびロスマン，ジェイ．イー.Rothman,J.
E.,Ann.Rev.Biochem.56（1987）829−852）。
酵母に対し異種タンパク質の酵母における発現および
分泌について幾つかのアプローチが提案されてきた。ヨ
ーロッパ公開特許出願第0088632A号には、酵母に対し異
種のタンパク質を発現し、処理し、そして分泌する方
法、すなわち所望タンパク質とシグナルペプチドをエン
コードするDNAを有する発現ビヒクルで酵母株を形質転
換し、形質転換体の培養物を調製し、培養物を増殖し、
培養基からタンパク質を回収する方法が記載されてい
る。シグナルペプチドは所望するタンパク質自身のシグ
ナルペプチド、異種シグナルペプチドまたは天然および
異種シグナルペプチドのハイブリッドでもよい。
酵母に対し異種のシグナルペプチドの使用が出会う問
題は、異種シグナルペプチドが有効なトランスロケーシ
ョンおよび／またはシグナルペプチド後の開裂を保証し
ないことである。
サッカロミセス セレヴィシアエ（Saccharomyces ce
revisiae）MFα（α−因子）は、19個のアミノ酸長のシ
グナルまたはプレペプチドと続く64個のアミノ酸長の
“リーダー”またはプロペプチドとからなり３つのＮ−
結合グリコシル化部位とそれに続く（Lys Arg（Asp/Gl
u,Ala）2-3α−因子）４を包囲する165個のアミノ酸の
プレプロ形として合成される（クルジャン，ジェイ.Kur
jan,J.およびヘルスコウィッツ，アイ.Herskowitz,I.Ce
ll 30（1982）933−943）。プレプロMFαのシグナル−
リーダー部はサッカロミセス セレヴィシアエにおける
異種タンパク質の合成および分泌を得るために広く用い
られている。
酵母に対し相同のシグナル／リーダーペプチドの使用
はa.o.米国特許第4,546,082号明細書、ヨーロッパ公開
特許出願第0116201A号、0123294A号、0123544A号、0163
529A号および0123289A号およびデンマーク国特許第2484
/84号および第3614/83号明細書から公知である。
ヨーロッパ特許第0123289A号にはサッカロミセス セ
レヴィシアエ α−因子前駆体の使用が記載されてお
り、一方デンマーク国第2484/84号にはサッカロミセス
セレヴィシアエ インベルターゼ シグナルペプチド
の利用が記載されそしてデンマーク国第3614/83号には
外来プロテイン分泌のためのサッカロミセス セレヴィ
シアエ PH05 シグナルペプチドの利用が記載されてい
る。
米国特許第4,546,082号明細書、ヨーロッパ特許第001
6201A号、第0123294A号、第0123544A号および第0163529
A号には、サッカロミセス セレヴィシアエ（MFα１ま
たはMFα２）からのα−因子シグナル−リーダーを酵母
において発現された異種タンパク質の分泌方法に利用す
る方法が記載されている。サッカロミセス セレヴィシ
アエ MFα シグナル／リーダー配列をエンコードする
DNA配列を所望タンパク質の遺伝子の５′末端と融合す
ることによる所望タンパク質の分泌およびプロセッシン
グが示されている。
多数の分泌タンパク質は、２つの連続した塩基性アミ
ノ酸のカルボキシ末端でペプチド結合を切断しうるタン
パク質加水分解プロセッシングシステムを受けるような
経路をたどる。この酵素活性は、サッカロミセス セレ
ヴィシアエ中でKEX2遺伝子によりエンコードされる（ジ
ュリウス，ディ．エー.Julius,D.A.ら、Cell 37（1984
b）,1075）。KEX2遺伝子生産物による生産物のプロセッ
シングは活性なサッカロミセスセレヴィシアエ接合因子
α（MFαまたはα−因子）の分泌に必要であるがしかし
活性なサッカロミセス セレヴィシアエ接合因子αの分
泌には含まれない。
分泌の増大する証拠は真核細胞でのタンパク質の局在
化における欠乏ルートであり、ここでは分泌されるべき
タンパク質またはその前駆体のコンフォメーションが方
法の効率性に対し重要なパラメーターである（プフェフ
ァー，エス．アールおよびロスマン，ジェイ．イー.,An
n.Rev.Biochem.56（1987）829−852）ことは、サッカロ
ミセス セレヴィシアエにおける分泌のためのMFαリー
ダーより一層効率的なリーダーを探すという結論に導び
く。
したがって、本発明の目的は小さなタンパク質の酵母
における分泌用のα−因子リーダーより効率的なリーダ
ーを提供することである。
ヨーロッパ特許出願第163,529号に記載されたタイプ
のインシュリン前駆体を用いたエム．イーゲル−ミタニ
（M.Egel−Mitani）ら、GENE（1988）（出版物）により
記載されたタイプの競合実験において、我々は、インシ
ュリン前駆体からシグナル−リーダーを分離するリシン
−アルギニン配列で効果のないプロセッシングによるも
のであるらしいが、前駆体のＮ−末端により起こされる
べきインシュリン前駆体の発現および分泌において制限
因子を見出した。
本発明の別の目的は、二塩基性配列におけるエンドペ
プチダーゼをエンコードしたKEX2を用いて成熟タンパク
質の非常に効率的はプロセッシングを確実にしこれによ
り成熟生産物の収量を向上させる酵母における異種タン
パク質の分泌系を提供することである。
発明の詳細な記載 本発明の第一の面によれば、次式（Ｉ）： （式中、 X1はAlaまたはGlnであり； X2はIle、アミノ酸残基10個までのペプチド鎖、また
はペプチド結合であり； X3はアミノ酸残基５個までのペプチド鎖またはペプチ
ド結合であり； X4およびX5はLysまたはArgであり； ｎは１または０である。） を有する新規合成リーダーペプチドを提供するものであ
る。
本発明によるリーダーペプチドの例は次のとおりであ
る 本発明の第二の面によれば、上記式（Ｉ）を有するリ
ーダーペプチドをエンコードするDNA配列を提供するも
のである。
このようなDNA配列の例は第８−10図に示される。
本発明の第三の面によれば、上流に所望生産物をエン
コードするDNA配列が位置しそして適当なプロモーター
およびシグナル配列が操作可能に接続した前記式（Ｉ）
を有するリーダーペプチドをエンコードするDNA配列を
含む複製可能な酵母ベクターを提供するものである。
プロモーターは、酵母において転写活性を示すDNA配
列であって酵母に対し相同または異種のいずれかのタン
パク質をエンコードする遺伝子から由来するものであれ
ばいずれでもよい。プロモーターは酵母に対し相同であ
るタンパク質をエンコードする遺伝子から由来するのが
好ましい。適当なプロモーターの例はサッカロミセス
セレヴィシアエ MFα１プロモーターである。他の適当
なプロモーターはサッカロミセス セレヴィシアエ TP
I,ADHまたはPGKプロモーターである。
本発明によるベクターは、普通、上流に上記リーダー
ペプチド（Ｉ）をエンコードするDNA配列が位置するシ
グナルペプチド配列を含む。シグナルペプチドは発現し
た生産物を細胞の分泌経路へ確実に向けさせるシグナル
ペプチドであればよい。シグナルペプチドは天然産生シ
グナルペプチドもしくはその機能部分または合成ペプチ
ドである。適当なシグナルペプチドはα因子シグナルペ
プチド、マウス唾液アミラーゼからのシグナルペプチド
または変更したカルボキシペプチダーゼシグナルであ
る。マウス唾液アミラーゼシグナル配列は、オー．ハー
ゲンベクレ（O.Hagenbchle）ら、Nature（1981）289,
643−646に記載されている。カルボキシペプチダーゼシ
グナルはエル．エー．ヴァールス（L.A.Valls）ら、Cel
l 48（1987）887−897に記載されている。
所望産生物およびシグナル／リーダー配列をエンコー
ドする遺伝子は、プロモーターたとえばTPIプロモータ
ー（PTPI）およびターミネーターたとえばTPIターミネ
ーター（TTPI）をコードするフラグメントと組み合わせ
る（ティ．アルバーT.Alberおよびジイ．カワサキG.Kaw
asaki:Nucleotide Sequence of the Triose Phosphat I
somerase Gene of Saccharomyces cerevisiae J.Mol.Ap
plied Genet １（1982）419−434）。
発現プラスミドはさらに酵母２μ複製遺伝子REPI−３
および複製の起源ならびに１つ以上の選択可能なマーカ
ーたとえばヨーロッパ特許出願第85303702.6号に記載の
サッカロミセス ポンベ（Saccharomyces pombe）TPI遺
伝子とからなる。
本発明によるシグナルおよび／またはリーダーペプチ
ドをエンコードするDNA配列、プロモーターおよびター
ミネーター配列の連結および酵母複製に必要な情報を含
む適当な酵母プラスミド中への挿入に用いられる方法は
すべて当該技術分野でよく知られた手段である。
本発明の第四の面によれば、本発明によるベクターで
形質転換された酵母株を提供するものである。
本発明の第五の面によれば、上流に所望生産物をエン
コードするDNA配列が位置しそして適当なプロモーター
とシグナル配列が接続した上記式（Ｉ）で表わされるリ
ーダーペプチドをエンコードするDNA配列を含むベクタ
ーで形質転換された酵母株を適当な培地で培養し、その
際分泌された生産物を培養基から単離することによる酵
母中のタンパク質産生方法を提供するものである。
本発明方法で使用される酵母体は所望のタンパク質を
高収量にて産生する適当な酵母株のいずれでもよい。酵
母体は、たとえばシゾサッカロミセス ポンベ（Schizo
saccharomyces pombe）およびサッカロミセス ウバル
ム（Saccharomyces uvarum）のような酵母体も使用され
るるが、サッカロミセス セレヴィシアエ（Saccharomy
ces crevisiae）およびサッカロミセス クルイベリ（S
accharomyces kluyveri）が好ましい。
本発明方法は酵母中に多くの異なったタンパク質また
はポリペプチドの産生を許す。このような化合物の例は
ヒトインシュリン前駆体、ヨーロッパ特許出願第163,52
9号、第194,864号および第214,826号に記載のようなイ
ンシュリン類似前駆体およびグルカゴンならびにアプロ
チニンである。
本発明の一実施態様によれば、上記式（Ｉ）を有する
リーダーペプチドをエンコードするDNA配列は所望生産
物に対する遺伝子に直接接続するであろう。分泌の間リ
ーダーペプチドが発現生産物から切断され、培養基から
の所望生産物（たとえばグルガゴンまたはアプロチニ
ン）の単離がこれ以上インビトロ転化をすることなく可
能になる。
分泌の間Ｃ−末端Lys−Arg残基でのリーダーペプチド
のさらに効果的プロセッシングを確実にするために、別
のＮ−末端アミノ酸配列を有する所望生産物を発現する
のが好ましい。この追加したアミノ酸配列は後でインビ
トロ転化により分子の残りの部分から切断されなければ
ならない。このようなインビトロ切断の目的で、追加の
ペプチド鎖は所望生産物に対しＮ−末端に位置する選択
的切断部位を備えている。所望生産物がメチオニンを含
まない場合、所望タンパク質に隣接するメチオニンで臭
素化シアノゲンが切断する。また、トリプシン様プロテ
アーゼを用いて所望タンパク質に隣接するアルギニンま
たはリシンでアルギニンまたはリシン切断が意図され
る。
最後に、追加ペプチド鎖はこれが他の適当なタンパク
質加水分解酵素に対する切断部位を構成するような場合
このような酵素によりインビトロで切断される。
ここで使用されているように、“酵母に対し異種のタ
ンパク質”という表現は酵母体により作られていないタ
ンパク質を意味する。“分泌”とは細胞壁を通って培地
へ発現産物が移出することまたは少なくとも細胞膜を通
過することを意味する。“プロセッシング”とは、シグ
ナル／リーダーペプチドのいかなる部分も伴なうことな
く異種タンパク質を産生するために成熟タンパク質から
のシグナル／リーダーペプチドの細胞切断を意味する。
“シグナル／リーダーペプチド”とは細胞の分泌経路へ
発現生産物を向けさせるプレプロ範囲であって疎水性組
成物のＮ−末端シグナル配列に続いて親水性リーダー範
囲からなるものである。“成熟タンパク質”とは発現ビ
ヒクルに挿入されたDNA配列によりエンコードされるタ
ンパク質である。成熟タンパク質は活性タンパク質もし
くはポリペプチドまたはその前駆体であってさらにイン
ビトロ転化により活性な最終生産物へ転化される。
図面の簡単な説明 本発明をさらに添付の図面を用いて説明する。
第１図はpMT743プラスミドおよびプラスミドpT7αMI3
の構築を示し、 第２図はプラスミドpT7−178およびpLaC178の構築を
示し、 第３図はプラスミドpT7−193,pT7−194およびpT7−19
5の構築を示し、 第４図はプラスミドpT7−200およびpLaC200の構築を
示し、 第５図はプラスミドpT7−196の構築を示し、 第６図はプラスミドpLaC212spx3の構築を示し、 第７図はpT7αMI3のEcoR I−XbaフラグメントのDNA配
列およびその下の一文字記号による相当するタンパク質
を示し、 第８図はpT7−178のEcoR I−Xba IフラグメントのDNA
配列およびその下の一文字記号による相当するタンパク
質を示し、 第９図はpT7−193のEcoR I−Xba IフラグメントのDNA
配列およびその下の一文字記号による相当するタンパク
質を示し、 第10図はpT7−194のEcoR I−Xba IフラグメントのDNA
配列およびその下の一文字記号による相当するタンパク
質を示し、 第11図はpT7−195のEcoR I−Xba IフラグメントのDNA
配列およびその下の一文字記号による相当するタンパク
質を示し、 第12図はpT7−200のEcoR I−Xba IフラグメントのDNA
配列およびその下の一文字記号による相当するタンパク
質を示し、 第13図はpLaC212spx3のEcoR I−Xba Iフラグメントの
DNA配列およびその下の一文字記号による相当するタン
パク質を示し、 第14図はプラスミドpKFN371,pT7212spx−3017およびp
T7α−0174の構築を示し、 第15図はプラスミドpLaC212spx3−0174およびpKFN216
の構築を示す。
本発明はある種のインシュリン前駆体産生を示す次の
例により例示される。
詳細な説明 1. プラスミドおよびDNA物質 すべての発現プラスミドはＣ−POTタイプのものであ
る。このようなプラスミドはヨーロッパ特許出願第8530
3702.6号に記載されておりそしてプラスミド安定化の目
的でサッカロミセス ポンベ トリオース ホスファッ
ト イソメラーゼ遺伝子（POT）を含むことが特徴的で
ある。POT遺伝子を含むプラスミドは寄託された大腸菌
（E.coli）株（ATCC 39685）から入手可能である。プラ
スミドはさらにサッカロミセス セレヴィシアエ トリ
オース ホスファット イソメラーゼプロモーターおよ
びターミネーター（PTPIおよびTTPI）を含む。これら
は、シグナル／リーダー／インシュリン前駆体配列をエ
ンコードするEcoR I−Xba I制限部位により定める範囲
を除いてpMT743（エム．イーゲル−ミタニら、GENE（19
88）（出版物）（第１図参照）と同一である。
この関係で記載されたフラグメントをコードするシグ
ナル／リーダー／インシュリン前駆体の複合体は実際的
理由のために大腸菌プラスミドpT7αMI3において生じ
た。このプラスミド（第１図参照）はpBR322由来であ
り、ここでEcoR I部位はクレノウポリメラーゼおよびdN
TPフラッシュエンドプラスミドを用いてEcoR I切断部を
再連結することにより除去されそしてBamH I−Sph Iフ
ラグメントは上記pMT743の2.2kb Sph I−BamH Iフラグ
メントにより置き換えられる。この後者のフラグメント
は、MFαリーダーおよびシグナルならびにサッカロミセ
ス セレヴィシアエ トリオース ホスファット イソ
メラーゼプロモーターおよびターミネーター配列と連結
したインシュリン前駆体Ｂ（１−29）−Ala−Ala−Lys
−Ａ（１−21）をエンコードする配列を含む。このSph
I−BamH Iフラグメントにおいて、シグナル／リーダー
／インシュリン前駆体をエンコードする配列は0.5kb Ec
oR I−Xba Iフラグメントに含まれる。次の例に記載し
た構築作業の一般的原則はMFαリーダー配列を本発明に
よるリーダー配列に代えることである。シグナル配列な
らびに所望生産物の配列もまた置き換えられうる。pT7
αMI3のEcoR I−Xba IフラグメントのDNA配列を第７図
に示す。
幾つかの構築物はさらにサッカロミセス クルイベリ
（S.Kluyveri）α接合フェロモン遺伝子からのフラグメ
ントを包含する（エム．イーゲル−ミタニおよびエム．
トリール ハンセンM.Trier Hansen（1987）Nucl.Acid.
Res.15,6306）。
最後に幾つかの合成DNAフラグメントが適用される。
合成DNA−フラグメントはホスホロアミダイト化学お
よび市販されている試薬を用いて自動DNA合成機（アッ
プライドバイオシステム モデル 380A）中で合成され
た（エス．エル．ビューケージS.L.Beaucageおよびエ
ム．エッチ．カルーサーズM.H.Caruthers（1981）Tetra
hedron Letters 22,1859−1869）。オルゴヌクレオチド
を変性条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動により
精製した。
アニーリング前に相補的DNA一本鎖をT4ポリヌクレオ
チドキナーゼおよびATPによりキナーゼ化した。
この方法で得られるフラグメントは次のようである： 使用される他の方法および物質のすべては技術知識の
通常の状態である（ティ．マニアティスら（1982）Mole
cular Cloning.Cold Spring Harbor Press）。
次の例１−４は本発明による様々なシグナル−リーダ
ー配列を用いたＢ（１−29）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１
−21）型インシュリン前駆体の発現および分泌を説明
し、例５は前記型であるがただしＢ（27）位におけるア
ミノ酸残基がArgで置換されＡ（21）位におけるアミノ
酸残基がGlyで置換されたインシュリン前駆体の発現お
よび分泌を説明する。以下のテキストで使用するように
Ｂ（１−29）はＢ（１）PheからＢ（29）Lysまでのヒト
インシュリンの短くしたＢ鎖を意味し、Ａ（１−21）は
ヒトインシュリンのＡ鎖を意味する。
例 １ pLaC178構築 pTαMI3の4.5kb Sal I−Xba Iフラグメント、1317bp
Sal I−Hinc IIフラグメントおよび333bp EcoR I＊−Xb
a Iフラグメントを合成するフラグメントNOR243/244と
ともに結合し： その結果pT7−172を得た。
pT7−172の5.6kb EcoR I−Xba I、172bp EcoR I−Pvu
IIおよび278bp Hinf I−Xba Iフラグメントを合成フラ
グメントNOR245/246とともに結合し： その結果pT7−178を得た。
pMT743のSph I−BamH IフラグメントをpT7−178の2.2
kb Sph I−BamH Iフラグメントに代えるとpLaC178が得
られる。pLaC178の構築を第２図に示す。
pT7−178のEcoR I−Xba IフラグメントのDNA配列を第
８図に示す。
pLaC193−195構築 pTαMI3の5.6kb EcoR I−Xba Iおよび203bp PVu II−
Xba Iフラグメントを合成フラグメントNOR308/309とと
もに結合した。
得られたプラスミド210bp EcoR V−Xba Iフラグメン
トをpT7−178の138bp EcoR I−Mae IIIおよび5.6kb Eco
R I−Xba Iフラグメントならびにサッカロミセス クリ
イベリMFα遺伝子からの以下に示すフラグメントと結合
した： 74bp Mae III−EcoR V、その結果pT7−193となる。
47bp Mae III−Sau3A、その結果pT7−194となる。
32bp Mae III−Msp I、その結果pT7−195となる。
アンダーラインした制限端部はクレノウポリメラーゼ
およびdNTPにより充てんされた。これらのプラスミドの
構築は第３図に示す。
pMT743のSph I−BamH IフラグメントをpT7−193から1
95プラスミドのSph I−BamH Iフラグメントに代える
と、それぞれプラスミドpLaC193から195が得られた。
プラスミドpLaC193は次のリーダー配列をエンコード
する： シグナル配列はコドン適正化サッカロミセス セレヴ
ィシアエ シグナル配列である（ミチ イーゲル ミタ
ニ Michi Egel Mitaniら（1988）同上）。pT7−193のEc
oR I−Xba IフラグメントのDNA配列を第９図に示す。
プラスミドpLaC194は次のリーダー配列をエンコード
する： シグナル配列は上記のようである。pT7−194のEcoR I
−Xba IフラグメントのDNA配列を第10図に示す。
プラスミドpLaC195は次のリーダー配列をエンコード
する： シグナル配列は上記のようである。pT7−195のEcoR I
−Xba IフラグメントのDNA配列を第11図に示す。
例 ２ pLaC200構築 pT7−194の213bp EcoR I−Dde Iおよび5.9kb Hpa I−
EcoR Iフラグメントを合成フラグメントNOR348/350とと
もに結合し： その結果、pT7−200を得た。pMT743のSph I−BamH I
フラグメントをpT7−200の2.2kb Sph I−BamH Iフラグ
メントに代えるとpLaC200が得られた。pLaC200の構築を
第４図に示す。
プラスミドpLaC200は以下のリーダー配列をエンコー
ドする： シグナル配列は例１のものと同じである。pT7−200の
EoR I−Xba IフラグメントのDNA配列を第12図に示す。
例 ３ pLaC212spx3構築 プラスミドpT7−178を、合成DNA NOR 544 を適用して、ほとんどケイ．ノリスK.Norrisら（1983）
Nucl.Acid Res.11,5103−5112に記載されているように
二重プライマー法によりインビトロで突然変異させた
（第５図）。
得られたプラスミドはここで82bp EcoR I−Xmn Iフラ
グメントの単離を可能にするXmn I切断部位を含み、こ
れはマウス唾液アミラーゼシグナルペプチド残基３個〜
15個のエンコードするpMSA104からの37bp Xmn I−Apa I
フラグメント（オー．ハーゲンベクレO.Hagenbchle
ら、Nature（1981）289,643−646）とともにさらにpT7
−178の251bp Msp I−Xbaおよび5.6kb EcoR I−Xbaフラ
グメントおよび合成DNAフラグメントNOR217/218: を含む連結で結合し、その結果変更マウス唾液シグナル
（アミノ酸残基３−15）を含むプラスミドpT7−196（第
５図）が得られた。
pMT743のSph I−BamH IフラグメントをpT7−196の2.2
kb Sph I−BamH Iフラグメントに代えると、pLaC196が
得られた。
変更したマウス唾液アミラーゼシグナルペプチドは、 （式中、小文字のヌクレオチドは示唆したヌクレオチド
91％と他のヌクレオチドの各々３％とからなるプールか
ら混入された。）から作られる合成アダプターNOR520ま
たは521T（第6a図）Xmn I−Apa Iフラグメントを代える
ことによりさらに突然変異化された。NOR520および521
は自動アニールされ（アンダーラインした３′末端）、
クレノウポリメラーゼとdNTPにより延長され、それぞれ
90および72bpの二本鎖DNAフラグメントが得られた。こ
れらのフラグメントをApa Iにより切断し、得られた47b
pのフラグメントNOR521Tおよび38bpのNOR521Tがポリア
クリルアミドゲル電気泳動により精製された。
この方法から得られるプラスミドは大腸菌株の形質転
換体から単離されそして個々にサッカロミセス セレビ
シアエ株MT663へ形質転換された。得られた酵母形質転
換体をモノクローナルマウス抗インシュリン前駆体を用
いたコロニーイムノブロッティング法によりインシュリ
ン前駆体分泌についてスクリーニングしそしてホースラ
ディッスペルオキシダーゼ抱合ウサギ抗マウスIgGで装
飾した。最も強い反応を与える形質転換体をさらに分析
した。これらのほとんどはシグナルペプチドが へ変わったプラスミドpLaC196spx3を有していた。
EcoR I部位からXab Iに向かうマキサム−ギルバート
配列決定により測定された正確なヌクレオチド配列は第
13図に示される。
spx3シグナルペプチドは上記内容において得られた分
泌インシュリン前駆体レベルから評価されるようにpLaC
196の最初にシグナルペプチドより優れた２つのファク
ターである。
驚くべきことにNOR520T突然変異体から生ずるspx3は
予想より短かい２つのコドンであり、これに対するただ
１つの説明はNOR520の最初の一本鎖における長さの違
い、またはNOR520Tへの途中で延長反応におけるポリメ
ラーゼジャンプによるものにちがいない。
pLaC196spx3のリーダーインシュリン前駆体部分をエ
ンコードするMae III−Xba IフラグメントをpLaC200の
類似Mae III−Xba Iフラグメントに代えるとpLaC200spx
3が得られた（第6b図）。
プラスミドpLaC212spx3は次のリーダー配列をエンコ
ードする： シグナル配列は突然変異したマウス唾液シグナルであ
る。pLaC212spx3のEcoR I−Xba IフラグメントのDNA配
列を第13図に示す。
例 ４ それぞれＢ（12）がGln、Ｂ（27）がArgでＡ（21）が
Glyであるインシュリン類似体の前駆体をエンコードす
るDNAは、90bp Stu1−Xba Iフラグメントを次の合成DN
A: に代えることによりプラスミドpKFN126（マルクーセンM
arkussenら、（1987）Protein Engineering:1,215−22
3）から導びかれた。
得られたプラスミドpKFN371から124bp Hid III−Xba
Iフラグメントを単離し、これを用いてpT7212spx3およ
びpT7αMI3の類似Hid III−Xba Iフラグメントを代える
（第14図参照）。これにより上記インシュリン類似物を
エンコードするDNA配列を、Ｂ（27）がArgでＡ（21）が
Glyであるインシュリン類似物をコードする配列へ直し
た。pMT743のSph I−BamH Iフラグメントを、これらの
構築物から生ずるプラスミドpT7212spx3−0174およびpT
7α−0174の2.2kb Sph I−BamH Iフラグメントに代える
とそれぞれpLaC212spx3−0174およびpKFN216が構築され
た（第15図参照）。これらのプラスミドにおいて、それ
ぞれ212spx3およびサッカロミセス セレヴィシアエMF
αリーダーがインシュリン類似物の分泌を仲介する。
例 ５ 上記のように調製されたプラスミドは、グリコース増
殖を選択することによりTPI遺伝子に欠失を有するサッ
カロミセス セレヴィシアエ株へ形質転換された。
形質点かした酵母株をYPD培地（シェアマン，エフ.Sh
erman,F.ら、Methods in Yeast Genetics,コールドスプ
リング ハーバーラボラトリィ1981）で増殖した。各々
６株に対しそれぞれ5mlの培養物をOD600がほぼ15（ほぼ
48時間）に達するまで30℃にて振とうした。遠心分離後
上澄をHPLC分析のために除き、この方法により分泌され
たインシュリン前駆体の濃度をレオ スネルLe Snelら
（1987）Chro−motographia 24,329−332により記載さ
れた方法で測定した。
様々なインシュリン前駆体の発現レベルを次の第１表
および第２表にまとめた。
第１表および第２表において本発明によるリーダー配
列の使用によりインシュリン前駆体の発現レベルは、同
じ酵母株ではあるがしかしMFαシグナル／リーダー配列
の使用によるものにおいて発現され分泌された同じイン
シュリン前駆体の発現レベルのパーセントで示される。
第１表 酵母形質転換体におけるインシュリン前駆体Ｂ（１−2
9）−Ala−Ala−Lys−Ａ（１−21）の発現レベル プラスミド 発現レベル＊ pMT743 100％ pLaC193 160％ pLaC194 200％ pLaC195 90％ pLaC200 170％ pLaC212spx3 120％ ＊発現レベルは、任意に100％としたpMT743の発現レ
ベルのパーセントとして示される。
第２表 Ｂ（27）がArgでＡ（21）がGlyであるインシュリン前駆
体の発現レベル プラスミド 発現レベル＊＊ pKFN216 100％ pLaC212spx3−0174 150％ ＊＊発現レベルは、任意に100％と設定したpKFN216の
発現レベルのパーセントとして示される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865）

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次式（Ｉ） （式中、 X1はAlaまたはGlnであり； X2はIle、アミノ酸残基10個までのペプチド鎖、または
    ペプチド結合であり； X3はアミノ酸残基５個までのペプチド鎖またはペプチド
    結合であり；そして X4およびX5はLysまたはArgである。） を有する酵母における分泌のためのリーダーペプチド。
  2. 【請求項２】X2はIleであり、そしてX1,X3,X4およびX5
    は請求項１で定義したものである請求項１に記載のリー
    ダーペプチド。
  3. 【請求項３】X2がペプチド鎖Gly−Phe−Leu−Asp−Leu
    −Ala−Gly−Asp−Asp−Ileであり、そしてX1,X3,X4お
    よびX5は請求項１で定義したものである請求項１に記載
    のリーダーペプチド。
  4. 【請求項４】次のペプチド配列： を有する請求項１に記載のリーダーペプチド。
  5. 【請求項５】次のペプチド配列： を有する請求項１に記載のリーダーペプチド。
  6. 【請求項６】次のペプチド配列： を有する請求項１に記載のリーダーペプチド。
  7. 【請求項７】次のペプチド配列： を有する請求項１に記載のリーダーペプチド。
  8. 【請求項８】請求項１〜７のいずれか１項に記載のリー
    ダーペプチドをコードするDNA配列。
  9. 【請求項９】次のヌクレオチド配列： を有する請求項８に記載のDNA配列。
  10. 【請求項１０】次のヌクレオチド配列： を有する請求項８に記載のリーダーペプチドをコードす
    るDNA配列。
  11. 【請求項１１】次のヌクレオチド配列： を有する請求項８に記載のリーダーペプチドをコードす
    るDNA配列。
  12. 【請求項１２】次のヌクレオチド配列： を有する請求項８に記載のDNA配列。
  13. 【請求項１３】上流に所望生成物をコードするDNA配列
    が位置しそしてプロモーターとシグナル配列が作用可能
    に接続した請求項１〜７のいずれか１項に記載のリーダ
    ーペプチドをコードするDNA配列を含む複製可能な酵母
    ベクター。
  14. 【請求項１４】請求項13に記載のベクターで形質転換さ
    れた酵母株。
  15. 【請求項１５】請求項13に記載のベクターで形質転換さ
    れた酵母株を適当な培養基で培養しそして所望生産物を
    培養基から単離することを特徴とする酵母におけるタン
    パク質の産生方法。
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Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK463887D0 (da) * 1987-09-07 1987-09-07 Novo Industri As Gaerleader
US5759802A (en) * 1988-10-26 1998-06-02 Tonen Corporation Production of human serum alubumin A
DK105489D0 (da) * 1989-03-03 1989-03-03 Novo Nordisk As Polypeptid
IT1229996B (it) * 1989-04-20 1991-09-20 Cesare Sirtori Espressione di apolipoproteina ai e apolipoproteina ai-milano in lievito e composizioni farmaceutiche che contengono dette apolipoproteine.
CA2025180A1 (en) * 1989-10-12 1991-04-13 William G. Weisburg Nucleic acid probes and methods for detecting pathogenic candida yeasts
ATE158816T1 (de) 1990-11-26 1997-10-15 Genetics Inst Expression von pace in wirtszellen und verfahren zu dessen verwendung
DK300090D0 (da) * 1990-12-19 1990-12-19 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til fremstilling af leadersekvenser
DK6893D0 (da) * 1993-01-21 1993-01-21 Novo Nordisk As Peptid
US5538863A (en) * 1993-07-01 1996-07-23 Immunex Corporation Expression system comprising mutant yeast strain and expression vector encoding synthetic signal peptide
DE4417353A1 (de) * 1994-05-18 1996-01-25 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Aprotinin und rekombinanten Aprotinin Varianten mit der natürlichen N-terminlaen Sequenz
CN102080070B (zh) 1995-03-17 2016-01-20 诺沃奇梅兹有限公司 新的内切葡聚糖酶
EP1231218B1 (en) 1996-03-01 2008-05-14 Novo Nordisk A/S An appetite-suppressing peptide, its compositions and use
DE19629982A1 (de) 1996-07-25 1998-01-29 Bayer Ag Aprotinin-Varianten mit verbesserten Eigenschaften
AU9363798A (en) 1997-11-06 1999-05-31 Chiron S.P.A. Neisserial antigens
CA2317815A1 (en) 1998-01-14 1999-07-22 Chiron S.P.A. Neisseria meningitidis antigens
GB9808932D0 (en) 1998-04-27 1998-06-24 Chiron Spa Polyepitope carrier protein
ES2304065T3 (es) 1998-05-01 2008-09-01 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Antigenos y composiciones de neisseria meningitidis.
US6190883B1 (en) 1998-09-09 2001-02-20 Novo Nordisk A/S Method for the production of heterologous polypeptides in transformed yeast cells
NZ581940A (en) 1999-04-30 2011-07-29 Novartis Vaccines & Diagnostic Conserved neisserial antigens
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
EP1200566A2 (en) 1999-07-09 2002-05-02 Novozymes A/S Glucoamylase variant
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
RU2281956C2 (ru) 1999-10-29 2006-08-20 Чирон С.Р.Л. Антигенные пептиды neisseria
CN1415019A (zh) 1999-12-29 2003-04-30 诺沃挪第克公司 用于生产在酵母中具有改进发酵产量的胰岛素前体和胰岛素前体类似物的方法
DK2289545T3 (en) 2000-01-17 2016-09-05 Glaxosmithkline Biologicals Sa Supplemented OMV vaccine against meningococcus
EP2189473A3 (en) 2000-10-27 2010-08-11 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Nucleic and proteins from streptococcus groups A & B
AU2002249096B2 (en) 2001-03-22 2007-06-28 Novo Nordisk Health Care Ag Coagulation factor VII derivatives
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
US20030082671A1 (en) * 2001-07-24 2003-05-01 Thomas Hoeg-Jensen Method for making acylated polypeptides
US7595172B2 (en) * 2001-07-24 2009-09-29 Novo Nordisk A/S Method for making acylated polypeptides
CA2461003A1 (en) 2001-09-27 2003-04-03 Novo Nordisk Health Care Ag Human coagulation factor vii polypeptides
JP4413617B2 (ja) 2001-12-12 2010-02-10 カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに対する免疫化
CA2498017C (en) 2002-09-13 2016-06-14 Cornell Research Foundation, Inc. Using mutations to improve aspergillus phytases
DK2279746T3 (da) 2002-11-15 2013-11-25 Novartis Vaccines & Diagnostic Overfladeproteiner i neisseria meningitidis
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
ATE547519T1 (de) 2003-09-09 2012-03-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Gerinnungsfaktor-vii-polypeptide
KR20060126449A (ko) * 2003-09-23 2006-12-07 파브릴, 인크. 자가 유도된 항원을 특이적-결합 세포감소제와 병용하여 ｂ세포 병증을 개선시키는 방법
EP1687428A1 (en) 2003-11-14 2006-08-09 Novo Nordisk A/S Processes for making acylated insulin
WO2005054291A1 (en) 2003-12-03 2005-06-16 Novo Nordisk A/S Single-chain insulin
US8034326B2 (en) 2005-04-18 2011-10-11 Novo Nordisk A/S IL-21 variants
ES2368500T3 (es) 2005-08-16 2011-11-17 Novo Nordisk A/S Método para producir polipéptidos de insulina maduros.
EP2316930A1 (en) 2005-09-14 2011-05-04 Novo Nordisk Health Care AG Human coagulation factor VII polypeptides
ATE482977T1 (de) 2006-02-27 2010-10-15 Novo Nordisk As Insulinderivate
CN101541830A (zh) 2006-09-22 2009-09-23 诺沃-诺迪斯克有限公司 蛋白酶抗性的胰岛素类似物
JP5503968B2 (ja) 2006-09-27 2014-05-28 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 成熟インスリンポリペプチドの作製方法
US7795411B2 (en) * 2006-10-05 2010-09-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Vectors for expressing in vivo biotinylated recombinant proteins
WO2009010428A1 (en) 2007-07-16 2009-01-22 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, pegylated insulin analogues
EP2910571B1 (en) 2008-03-18 2016-10-05 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, acylated insulin analogues
WO2010103038A1 (en) 2009-03-11 2010-09-16 Novo Nordisk A/S Interleukin-21 variants having antagonistic binding to the il-21 receptor
WO2010103546A2 (en) * 2009-03-12 2010-09-16 Bigtec Private Limited A polynucleotide and polypeptide sequence and methods thereof
KR102184713B1 (ko) 2009-07-17 2020-12-01 오메로스 코포레이션 보체 활성화의 억제제로서의 masp 이소형
ES2583259T3 (es) 2009-12-01 2016-09-20 Novo Nordisk A/S Nuevas liasas alfa-amidantes de peptidil alfa-hidroxiglicina
JP6148013B2 (ja) 2010-03-05 2017-06-14 リグショスピタレト 補体活性化のキメラ抑制分子
DK2812024T3 (en) 2012-02-09 2018-07-23 Var2 Pharmaceuticals Aps TARGET ORIENTATION OF CHONDROITIN-SULPHATE GLYCANES
US20150307865A1 (en) 2012-10-15 2015-10-29 Novo Nordisk Health Care Ag Coagulation factor vii polypeptides
JP6735561B2 (ja) 2012-12-03 2020-08-05 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． Ｏ−グリコシル化カルボキシ末端部分（ｃｔｐ）ペプチド系のインスリンおよびインスリン類似体
JP2016521701A (ja) 2013-06-07 2016-07-25 ノヴォ ノルディスク アー／エス 成熟インスリンポリペプチドを作製するための方法
EP3268384B1 (en) 2015-03-10 2021-11-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Process for preparing recombinant insulin using microfiltration
CN112789504A (zh) 2018-07-13 2021-05-11 瓦克特诊断有限责任公司 使用重组疟疾蛋白var2csa分离胎儿来源的循环细胞

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4546082A (en) * 1982-06-17 1985-10-08 Regents Of The Univ. Of California E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins
US5015575A (en) * 1983-04-07 1991-05-14 Chiron Corporation Hybrid DNA synthesis of insulin
DK58285D0 (da) * 1984-05-30 1985-02-08 Novo Industri As Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf
JPS6236183A (ja) * 1985-06-20 1987-02-17 ザ・サルク・インステイチユ−ト・バイオテクノロジ−／インダストリアル・アソシエイツ・インコ−ポレ−テツド サツカロミセス・セレビシエからのポリペプチドの発現および分泌
DK463887D0 (da) * 1987-09-07 1987-09-07 Novo Industri As Gaerleader

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NUCLEIC ACIDS RES *
PROC NATL ACAD SCI USA *

Also Published As

Publication number Publication date
US5162498A (en) 1992-11-10
WO1989002463A1 (en) 1989-03-23
DK463887D0 (da) 1987-09-07
EP0378567A1 (en) 1990-07-25
EP0378567B1 (en) 1993-12-15
JPH03500171A (ja) 1991-01-17
US5316923A (en) 1994-05-31
DE3886408T2 (de) 1994-05-11
DE3886408D1 (en) 1994-01-27

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