JPH0215092A - 求核性三級有機ホスフインによる特異的ペプチド結合切断 - Google Patents
求核性三級有機ホスフインによる特異的ペプチド結合切断Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規な求核性三級有機ホスフィン及び求核性
三級有機ホスフィンによるペプチド結合の特異的切断(
specific cleanage)に関する。本発
明は、特に、タンパク質の切断及びタンパク質のアミノ
酸配列の決定に使用するための化学品剤を提供するのに
有用である。
三級有機ホスフィンによるペプチド結合の特異的切断(
specific cleanage)に関する。本発
明は、特に、タンパク質の切断及びタンパク質のアミノ
酸配列の決定に使用するための化学品剤を提供するのに
有用である。
タンパク質中のアミノ酸配列の決定には、ポリペプチド
鎖を切断してフラグメントとする再現性のある方法が必
要である。アミノ酸配列の分析の計画には、少なくとも
2つの異なる特定の方法によりタンパク質を切断してフ
ラグメントとし、部分的に重複する(overlapp
ing)ペグチドフラグメントの配列を得ることができ
ることを必要とする。
鎖を切断してフラグメントとする再現性のある方法が必
要である。アミノ酸配列の分析の計画には、少なくとも
2つの異なる特定の方法によりタンパク質を切断してフ
ラグメントとし、部分的に重複する(overlapp
ing)ペグチドフラグメントの配列を得ることができ
ることを必要とする。
ポリペプチド鎖を切断するための種々の方法、例えば、
下記する酵素的及び化学的方法が知られている。トリプ
シン、キモトリプシン、サーモリシン及びペプシンなど
のタンパク質分解酵素がアミノ酸配列に基づいた特異的
部位でタンパク質を切断することができることは、当業
者には周知されている。これらの酵素の内、トリプシン
は、リシン又はアルギニン残基のC−末端側でポリペプ
チドを切断する最も特異的なプロテアーゼである。
下記する酵素的及び化学的方法が知られている。トリプ
シン、キモトリプシン、サーモリシン及びペプシンなど
のタンパク質分解酵素がアミノ酸配列に基づいた特異的
部位でタンパク質を切断することができることは、当業
者には周知されている。これらの酵素の内、トリプシン
は、リシン又はアルギニン残基のC−末端側でポリペプ
チドを切断する最も特異的なプロテアーゼである。
キモトリプシン及びペプシンは、フェニルアラニン、ト
リプトファン又はチロンン残基のC−末端側でポリペプ
チドを切断するが、サーモリシンは、ロイシン、インロ
イシン又はバリン残基のN−末端側で切断する。[レー
ニンガー、ニー・エル、バイオケミストリー、第二編、
1975、ワース・パブリツシャーズ(Lehning
er、A、L、、 BiochemistrV 2nd
edition、 1975. Worth Pub
lishers)]。
リプトファン又はチロンン残基のC−末端側でポリペプ
チドを切断するが、サーモリシンは、ロイシン、インロ
イシン又はバリン残基のN−末端側で切断する。[レー
ニンガー、ニー・エル、バイオケミストリー、第二編、
1975、ワース・パブリツシャーズ(Lehning
er、A、L、、 BiochemistrV 2nd
edition、 1975. Worth Pub
lishers)]。
ポリペプチド鎖を切断するだめの化学的方法のうち、最
も良く知られている方法は、メチオニン残基のC−末端
側で切断する臭化シアンの使用を含む。[グロス、イー
1.臭化シアン反応、メソッズ・イン・エンザイモロジ
ー、11.238.(1967XGross、 E、
、 丁he cyanogen bromrde
raaction、 Methods in En
zymology、 11.238. (1967)]
。
も良く知られている方法は、メチオニン残基のC−末端
側で切断する臭化シアンの使用を含む。[グロス、イー
1.臭化シアン反応、メソッズ・イン・エンザイモロジ
ー、11.238.(1967XGross、 E、
、 丁he cyanogen bromrde
raaction、 Methods in En
zymology、 11.238. (1967)]
。
他の化学的切断反応には、N−ブロモスクシンイミドに
よるトリプトファニル残基での切断が包含される[シェ
フター ワイ8. バチョルニク、ニー・及ヒバースタ
イン、ワイ、N−ブロモスクシンイミドによる酸化塩素
化によるトリプトファニルペプチド結合の選択的化学的
切断、バイオケミ ス ト リ −、 j 1
5 0 7 1%1 9 7 6(Schecter。
よるトリプトファニル残基での切断が包含される[シェ
フター ワイ8. バチョルニク、ニー・及ヒバースタ
イン、ワイ、N−ブロモスクシンイミドによる酸化塩素
化によるトリプトファニルペプチド結合の選択的化学的
切断、バイオケミ ス ト リ −、 j 1
5 0 7 1%1 9 7 6(Schecter。
Y、、 Patchornik、 A、 and Bu
rsLein、 Y、 5elective Chmi
cal cleavage of tryptopha
nyl peptidebonds by oxida
tive chlorination with N−
brom。
rsLein、 Y、 5elective Chmi
cal cleavage of tryptopha
nyl peptidebonds by oxida
tive chlorination with N−
brom。
succinimide、 Biochen+1str
y、 Il+ 5071+ 1976)]。
y、 Il+ 5071+ 1976)]。
この反応はタンパク質においては比較的効率が良くない
傾向があり、タンパク質におけるトリプト7アニルペプ
チド結合のto−50%しか切断しない。主としてトリ
プトファニル残基で反応する追加の化学的切断剤が記載
されている。これらには、2−(2−ニトロフェニル−
スルホニル)−3−メチル−3−ブロモインドレニンE
フォンタナ、ユ゛−、、BNPS−スカトールによるト
リプトファンの修飾、メソッズ・イン・エンザイモロジ
=25129、l 972 (Fontana、 A、
、 Meth、Enzym恒凹位、胆、 29.197
2) ] 、]2,4.6−ドリブロモー4−メチルシ
クロへキサジオン[バースタイン、ワイ・及びバチョル
ニク、ニー、ペプチド及びタンパク質におけるトリプト
ファニルペプチド結合の選択的化学的切断、バイオケミ
ストリー11 4641、 197’2(Burste
in Y and Patchornik、 A、
5elective Chmical cleav
age oftryptophanyl peptid
e bonds in peptide and pr
oteins、 Biochemistry、 11,
4641.1972)] 、o −ヨード安息香酸[マ
ホネイ、ダブリュ・シー及びハーモドソン、エム・ニー
、0−ヨード安息香aによるトリプトファニルペプチド
結合の高い収率1 979 (Mahoney、 W
、C,and Hermodoson、 M、A、。
傾向があり、タンパク質におけるトリプト7アニルペプ
チド結合のto−50%しか切断しない。主としてトリ
プトファニル残基で反応する追加の化学的切断剤が記載
されている。これらには、2−(2−ニトロフェニル−
スルホニル)−3−メチル−3−ブロモインドレニンE
フォンタナ、ユ゛−、、BNPS−スカトールによるト
リプトファンの修飾、メソッズ・イン・エンザイモロジ
=25129、l 972 (Fontana、 A、
、 Meth、Enzym恒凹位、胆、 29.197
2) ] 、]2,4.6−ドリブロモー4−メチルシ
クロへキサジオン[バースタイン、ワイ・及びバチョル
ニク、ニー、ペプチド及びタンパク質におけるトリプト
ファニルペプチド結合の選択的化学的切断、バイオケミ
ストリー11 4641、 197’2(Burste
in Y and Patchornik、 A、
5elective Chmical cleav
age oftryptophanyl peptid
e bonds in peptide and pr
oteins、 Biochemistry、 11,
4641.1972)] 、o −ヨード安息香酸[マ
ホネイ、ダブリュ・シー及びハーモドソン、エム・ニー
、0−ヨード安息香aによるトリプトファニルペプチド
結合の高い収率1 979 (Mahoney、 W
、C,and Hermodoson、 M、A、。
High yield of cleavage of
tryptophanyl pepLide bo
nds by o−1odobenzoic ac
id、BiochemisLry、 18.3810.
1979)]及び]N−クロロスクシンイミドシェフタ
ー、ワイ、、バチョルニク、ニー・及ヒバースタイン、
ワイ、N−クロロスクシンイミドによる酸化塩素化によ
るトリプトファニルペプチド結合の選択的化学的切断、
バイオケミストリー 15 5071、l 976 (
SchecLer。
tryptophanyl pepLide bo
nds by o−1odobenzoic ac
id、BiochemisLry、 18.3810.
1979)]及び]N−クロロスクシンイミドシェフタ
ー、ワイ、、バチョルニク、ニー・及ヒバースタイン、
ワイ、N−クロロスクシンイミドによる酸化塩素化によ
るトリプトファニルペプチド結合の選択的化学的切断、
バイオケミストリー 15 5071、l 976 (
SchecLer。
Y、、 Patchornik、 A、 and Bu
rstein、 Y、 5elective Chem
ical cleavage of LrypLoph
anyl peptidebonds by oxid
ative chlorination with N
−chl。
rstein、 Y、 5elective Chem
ical cleavage of LrypLoph
anyl peptidebonds by oxid
ative chlorination with N
−chl。
rosuccinimide、 Biochemist
ry、 15.5071.1976)]が包含される。
ry、 15.5071.1976)]が包含される。
N−ブロモスクシンイミドの反応と同様に、これらの試
薬のすべてが比較的効率の良くない切断をもたらしそし
て更にいくらかの他のアミノ酸残基の化学的修飾を生じ
させる。更に、ヒドロキシルアミンがアスパラギニル−
グリシルペプチド結合でポリペプチドを切断することは
知られているしホルンスタイン、ビー・及びパリアン、
ジー0. ヒドロキシルアミンによるAsn−Gly結
合の切断、メソッズ・イン・エンザイモロジ−47,1
32、l 977 (BornsLein、 P。
薬のすべてが比較的効率の良くない切断をもたらしそし
て更にいくらかの他のアミノ酸残基の化学的修飾を生じ
させる。更に、ヒドロキシルアミンがアスパラギニル−
グリシルペプチド結合でポリペプチドを切断することは
知られているしホルンスタイン、ビー・及びパリアン、
ジー0. ヒドロキシルアミンによるAsn−Gly結
合の切断、メソッズ・イン・エンザイモロジ−47,1
32、l 977 (BornsLein、 P。
and Ba1ian、 G、、 Cleavage
of Asn−Gly bondswith hydr
oxylamine、 Meth、 Enzymolo
gy+ 47.132、1977)]。これらの切断法
のすべては、そのままの(intact)ジスルフィド
結合を持ったタンパク質に対するよりも、還元及びアル
キル化されたタンパク質に対してのみ最適に作用する。
of Asn−Gly bondswith hydr
oxylamine、 Meth、 Enzymolo
gy+ 47.132、1977)]。これらの切断法
のすべては、そのままの(intact)ジスルフィド
結合を持ったタンパク質に対するよりも、還元及びアル
キル化されたタンパク質に対してのみ最適に作用する。
システィン又はセリンでのポリペプチドの切断は、該ア
ミノ酸残基のデヒドロアラニンへの転化及び、このデヒ
ドロアラニン含有ポリペプチドの酸中でのその後の加水
分解により行うことができることも知られている[ウィ
トコツプ、ビー・及びラマチャンドラン、エル・ブー・
タンパク質の非酵素的選択的修飾及び切断の進歩、メ
タポリズム、13.1016.1064 (WiLko
p、 B、 and Ramachandran、 L
、 K、 ; Progress in nonenz
ymatic 5elective modifica
tion and cleavage ofprote
ins、 Metabolism、 13.1016.
1064):パチョルニク、ニー、及ヒソコロースルキ
ー、エム、lシスチン及びセリン残基のデヒドロアラニ
ン残基への転化によるシスチン及びセリン残基でのペプ
チド鎖の非酵素的切断、ジャーナル・オブ・アメリカン
・ケミカル・ソサイエティ−86,1206、l 95
4 (Patchornik、 A、 and 5ok
olooslk’/、 M、、 NonenzymaL
ic cleavages of peptide a
hains at cystine and 5eri
ne residues through thair
conversion 1nto dehydro
alanine residues、 J、 Amer
、 Chem、 Soc、、 86.1206.196
4);ソコロースキー、エム・サブ−、ティ及びバチョ
ルニク、ニー1. シスチン及びセリン残基のデヒドロ
アラニン(DHAL)への転化によるシスチン及びセリ
ン残基でのペプチド鎖の非酵素的切断、(Sokolo
osky、 M、 5adeh、 T、 and Pa
tchornik、 A、。
ミノ酸残基のデヒドロアラニンへの転化及び、このデヒ
ドロアラニン含有ポリペプチドの酸中でのその後の加水
分解により行うことができることも知られている[ウィ
トコツプ、ビー・及びラマチャンドラン、エル・ブー・
タンパク質の非酵素的選択的修飾及び切断の進歩、メ
タポリズム、13.1016.1064 (WiLko
p、 B、 and Ramachandran、 L
、 K、 ; Progress in nonenz
ymatic 5elective modifica
tion and cleavage ofprote
ins、 Metabolism、 13.1016.
1064):パチョルニク、ニー、及ヒソコロースルキ
ー、エム、lシスチン及びセリン残基のデヒドロアラニ
ン残基への転化によるシスチン及びセリン残基でのペプ
チド鎖の非酵素的切断、ジャーナル・オブ・アメリカン
・ケミカル・ソサイエティ−86,1206、l 95
4 (Patchornik、 A、 and 5ok
olooslk’/、 M、、 NonenzymaL
ic cleavages of peptide a
hains at cystine and 5eri
ne residues through thair
conversion 1nto dehydro
alanine residues、 J、 Amer
、 Chem、 Soc、、 86.1206.196
4);ソコロースキー、エム・サブ−、ティ及びバチョ
ルニク、ニー1. シスチン及びセリン残基のデヒドロ
アラニン(DHAL)への転化によるシスチン及びセリ
ン残基でのペプチド鎖の非酵素的切断、(Sokolo
osky、 M、 5adeh、 T、 and Pa
tchornik、 A、。
NonenzymaLic cleavages of
peptide chains atcystir、
e and 5erine residues thr
ough theirconversion 1nto
dehydroalanine (DHAL)、 M
。
peptide chains atcystir、
e and 5erine residues thr
ough theirconversion 1nto
dehydroalanine (DHAL)、 M
。
システイニルペプチドの特異的化合物切断(■。
The 5pecific chemical
cleavage of cysteiny+pe
pt 1des)、 ジャーナル・オプ・アメリカン
・ケミカル・ソサイエティ−86,1212,1964
(J、 Amer、 Chem、 Soc、、 86,
1212.1964)] 。
cleavage of cysteiny+pe
pt 1des)、 ジャーナル・オプ・アメリカン
・ケミカル・ソサイエティ−86,1212,1964
(J、 Amer、 Chem、 Soc、、 86,
1212.1964)] 。
本本発明前に知られていたもので、シスチン残基でポリ
ペプチドを特異的に切断する唯一の化学的試薬はシアン
化物である。[カルチンブーラス、エヌ・及びウッド、
ジエー・エル・ シアン化物132、I 964 (C
artsimpoolas、 N、 and Wood
。
ペプチドを特異的に切断する唯一の化学的試薬はシアン
化物である。[カルチンブーラス、エヌ・及びウッド、
ジエー・エル・ シアン化物132、I 964 (C
artsimpoolas、 N、 and Wood
。
J、L、The reaction of cyan
ide with bovineserum albu
min、 J、 Biol、 Chem、、 239.
4132+ 1964);カルチンブーラス、エヌ・及
びウッド、ジェー・エル・ シアン化物によるシスチン
ペプチドの特異的切断、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー、241,1790.1964(C
artimpoolas、 N、 and Wood、
J−L、 Specificcleavage o
f cystine peptide by
cyanide。
ide with bovineserum albu
min、 J、 Biol、 Chem、、 239.
4132+ 1964);カルチンブーラス、エヌ・及
びウッド、ジェー・エル・ シアン化物によるシスチン
ペプチドの特異的切断、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー、241,1790.1964(C
artimpoolas、 N、 and Wood、
J−L、 Specificcleavage o
f cystine peptide by
cyanide。
J、 Biol、 Chem、、 24↓、 1790
.1966)] 、シアン化物はシスチンと反応してス
ルフヒドリル基及びチオシアノ基を生じる。チオシアノ
含有誘導体は、8又はそれ以下のpHで環化し、次いで
加水分解を受けてペプチド結合を切断される。システィ
ン又はシスチン残基での切断は、ポリペプチドを2ニト
ロ−5−チオシアノ−安息香酸と反応させることによっ
て達成することができる[ヤコブソン、ジー・アール1
. シャツファー、エム・エイチ、、 スタフク、ジー
・アール5.バナマン、チー・シー1. システィン及
びシスチン残基のアミノペプチド結合における高収率で
の特異的化obson、G、R,,5chaffer、
M、H,,5tank、G、R,。
.1966)] 、シアン化物はシスチンと反応してス
ルフヒドリル基及びチオシアノ基を生じる。チオシアノ
含有誘導体は、8又はそれ以下のpHで環化し、次いで
加水分解を受けてペプチド結合を切断される。システィ
ン又はシスチン残基での切断は、ポリペプチドを2ニト
ロ−5−チオシアノ−安息香酸と反応させることによっ
て達成することができる[ヤコブソン、ジー・アール1
. シャツファー、エム・エイチ、、 スタフク、ジー
・アール5.バナマン、チー・シー1. システィン及
びシスチン残基のアミノペプチド結合における高収率で
の特異的化obson、G、R,,5chaffer、
M、H,,5tank、G、R,。
Vanaman、T、C,,5pecific ch
emical cleavagein high
yield at the amino pep
tide bonds ofcysteine a
nd cystine residues、J、B
iol ChelIl、。
emical cleavagein high
yield at the amino pep
tide bonds ofcysteine a
nd cystine residues、J、B
iol ChelIl、。
248、6583.1973)]。ポポリペブチのN末
端はこの方法によりブロックされそして、修飾されたア
ミノ酸残基をアラニンに転化するのにニッケル及びナト
リウムボロハイドライドによる追加の処理を必要とする
。シアン化物及びシアノ誘導体によるフェニルアラニル
−セリル及びフェニルアラニルトレオニルベプチド結合
の切断も又報告されている[ウィトコツプ、ビー・及び
ラマチャンドラン、エル・チー・タンパク質の非酵素的
選択的修飾及び切断の進歩、メタポリズム、13,10
16、i 064 (Witkop、 B、 and
Ramachancran。
端はこの方法によりブロックされそして、修飾されたア
ミノ酸残基をアラニンに転化するのにニッケル及びナト
リウムボロハイドライドによる追加の処理を必要とする
。シアン化物及びシアノ誘導体によるフェニルアラニル
−セリル及びフェニルアラニルトレオニルベプチド結合
の切断も又報告されている[ウィトコツプ、ビー・及び
ラマチャンドラン、エル・チー・タンパク質の非酵素的
選択的修飾及び切断の進歩、メタポリズム、13,10
16、i 064 (Witkop、 B、 and
Ramachancran。
L、 K、 : Progress in nonen
zymatic 5elective modific
ation and cleavage of
proteins、Metab。
zymatic 5elective modific
ation and cleavage of
proteins、Metab。
115m、 13.1016.1064)] 。しかし
ながら、この切断反応における特異性の欠如及びシアン
化物による他のアミノ酸残基の付随する修飾のため、こ
の反応はタンパク質化学における切断方法としては希に
しか使用されない。 成る種の三級有機ホスフィンは、
ケラチン繊維の形状を変える能力及び成る条件下で毛髪
の抜毛(dep i la t 1on)を引き起こす
能力を有することが記載された。トラッカー(Druc
ker)等への米国特許第3,489.811号は、ヘ
アーウェービング組成物における如き化粧品用途に好適
な成る種の三級有機ホスフィンを開示している。更に、
その特許は、実質的に臭いのない三級ホスフィンを製造
する方法を開示すると共に請求している。ケラチン繊維
を変形させるため又は抜毛を引き起こすのに特定の有機
ホスフィンを使用することはグレイソン(Grayso
n)等への米国特許第3.628.910号に開示され
ている。
ながら、この切断反応における特異性の欠如及びシアン
化物による他のアミノ酸残基の付随する修飾のため、こ
の反応はタンパク質化学における切断方法としては希に
しか使用されない。 成る種の三級有機ホスフィンは、
ケラチン繊維の形状を変える能力及び成る条件下で毛髪
の抜毛(dep i la t 1on)を引き起こす
能力を有することが記載された。トラッカー(Druc
ker)等への米国特許第3,489.811号は、ヘ
アーウェービング組成物における如き化粧品用途に好適
な成る種の三級有機ホスフィンを開示している。更に、
その特許は、実質的に臭いのない三級ホスフィンを製造
する方法を開示すると共に請求している。ケラチン繊維
を変形させるため又は抜毛を引き起こすのに特定の有機
ホスフィンを使用することはグレイソン(Grayso
n)等への米国特許第3.628.910号に開示され
ている。
グレイソン特許は、特定の有機ホスフィンによるケラチ
ン繊維に対する変形及び抜毛効果は、ケラチン繊維のポ
リペプチド間に存在するシスチンジスルフィド結合連結
部の破壊及び再構成の結果であることを教示している。
ン繊維に対する変形及び抜毛効果は、ケラチン繊維のポ
リペプチド間に存在するシスチンジスルフィド結合連結
部の破壊及び再構成の結果であることを教示している。
更に、成る種の非対称三級有機ホスフィンが抜毛を行う
ことができることが、米国特許第3.754.035号
に開示されている。ここでも、このような有機ホスフィ
ンの効果は91毛髪ケラチンのジスルフィド結合を切断
することであることを教示している。有機ホスフィンが
還元剤として作用することによりジスルフィド結合を還
元することができることがモデル化合物を使用して示さ
れた。更に、タンパク質の研究において、還元剤として
トリブチルホスフィンの使用が報告された[ルエッグ、
ニー・チー及びルジンゴ、ジェー・ トリブチルホスフ
ィンによるシスチンジスルフィドの還元切断、メソッズ
・イン・エンザイモロジー、上7.ill−126(R
uegg、U、T、and Rudingo、J、Re
ductiva Cleavage of Cys
tine Disulfides with T
ributylphosphine、Methods
in Enzymology、47,111−126
)] 。
ことができることが、米国特許第3.754.035号
に開示されている。ここでも、このような有機ホスフィ
ンの効果は91毛髪ケラチンのジスルフィド結合を切断
することであることを教示している。有機ホスフィンが
還元剤として作用することによりジスルフィド結合を還
元することができることがモデル化合物を使用して示さ
れた。更に、タンパク質の研究において、還元剤として
トリブチルホスフィンの使用が報告された[ルエッグ、
ニー・チー及びルジンゴ、ジェー・ トリブチルホスフ
ィンによるシスチンジスルフィドの還元切断、メソッズ
・イン・エンザイモロジー、上7.ill−126(R
uegg、U、T、and Rudingo、J、Re
ductiva Cleavage of Cys
tine Disulfides with T
ributylphosphine、Methods
in Enzymology、47,111−126
)] 。
しかしながら、我々の知る限りでは、本発明以前には、
求核性三級有機ホスフィンが特異的ペプチド結合切断を
行うであろうということは知られていなかった。
求核性三級有機ホスフィンが特異的ペプチド結合切断を
行うであろうということは知られていなかった。
故に、本発明の主要な目的は、ペプチド結合切断を行う
ことができる求核性三級有機ホスフィンを提供すること
である。本発明の他の特定の目的は、特異的にペプチド
結合切断を行うことができる求核性三級有機ホスフィン
を提供することである。なお更に、本発明の目的は、こ
のような求核性三級有機ホスフィンによってこのような
ペプチド結合切断を行うのに使用される方法を提供する
ことである。本発明の追加の目的及び利点は、部は、下
記の説明に記載されそして、一部は下記の説明から自明
であるか又は後に説明しそして後記する及び特許請求の
範囲に記載されているような本発明の実施により理解す
ることができる。
ことができる求核性三級有機ホスフィンを提供すること
である。本発明の他の特定の目的は、特異的にペプチド
結合切断を行うことができる求核性三級有機ホスフィン
を提供することである。なお更に、本発明の目的は、こ
のような求核性三級有機ホスフィンによってこのような
ペプチド結合切断を行うのに使用される方法を提供する
ことである。本発明の追加の目的及び利点は、部は、下
記の説明に記載されそして、一部は下記の説明から自明
であるか又は後に説明しそして後記する及び特許請求の
範囲に記載されているような本発明の実施により理解す
ることができる。
本発明の新規な求核性三級有機ホスフィンは、式;
%式%
Y及び2は、 NR+−R++又は−ORt *であり
、R1゜及びRoは、Nと一緒になって、イミダゾリル
、ピリドニル、ピリジル又はモルホリニル環を形成し、 R12は−CH2CH20Hであり、 2口 RI3はH又は−OHであり、 R14は、 (CHx)、CHzOHであり、n、 m
及びLは独立に0−3であり、R、−R、は、独立に、
H又はアルキル(c+ C4)であり、 但し、ZとYは、いずれの化合物についても同一ではな
いものとする、 により表すことができる。
、R1゜及びRoは、Nと一緒になって、イミダゾリル
、ピリドニル、ピリジル又はモルホリニル環を形成し、 R12は−CH2CH20Hであり、 2口 RI3はH又は−OHであり、 R14は、 (CHx)、CHzOHであり、n、 m
及びLは独立に0−3であり、R、−R、は、独立に、
H又はアルキル(c+ C4)であり、 但し、ZとYは、いずれの化合物についても同一ではな
いものとする、 により表すことができる。
前記新規な求核性三級有機ホスフィンの他に、本発明は
、特異的ペプチド結合切断剤としての求核性三級有機ホ
スフィンの新規な使用にも関する。
、特異的ペプチド結合切断剤としての求核性三級有機ホ
スフィンの新規な使用にも関する。
後記するようにシスティンにおいて特異的にペプチド結
合を切断するのに本発明で使用される求核性三級有機ホ
スフィンは、式、 Q“ Q−P−Q’ であり; Q′はQ又はQ″であり、 Y及びZは、 OH,N R+oR11又はOR+ z
であり、 R1゜及びR11は、独立に、H又はアルキル(C+−
〇、)であるか、又は、 R3゜及びR11は、Nと一緒になって、モルホリニル
、ピペリジニル、イミダゾリル又はピロリジニルを形成
し、又は、 R11は、RI。がHである場合には、アセチル、カル
バミル又はグアニルであり、 RIB R12は−CHI−CHであり;RIBはH又は−OH
であり; Rlfiは−(CHZ)、−CH、OHであり;n、
m及びLは、独立に、0−3である、により表すことが
できる。
合を切断するのに本発明で使用される求核性三級有機ホ
スフィンは、式、 Q“ Q−P−Q’ であり; Q′はQ又はQ″であり、 Y及びZは、 OH,N R+oR11又はOR+ z
であり、 R1゜及びR11は、独立に、H又はアルキル(C+−
〇、)であるか、又は、 R3゜及びR11は、Nと一緒になって、モルホリニル
、ピペリジニル、イミダゾリル又はピロリジニルを形成
し、又は、 R11は、RI。がHである場合には、アセチル、カル
バミル又はグアニルであり、 RIB R12は−CHI−CHであり;RIBはH又は−OH
であり; Rlfiは−(CHZ)、−CH、OHであり;n、
m及びLは、独立に、0−3である、により表すことが
できる。
求核性三級有機ホスフィンの製造
本発明の求核性三級有機ホスフィンは、当業者に周知さ
れた方法により製造される。例えば、ジャーナル・オブ
・オルガニック・ケミストリー(J。
れた方法により製造される。例えば、ジャーナル・オブ
・オルガニック・ケミストリー(J。
」]ユ勺旦畦、ム止、5138(1961)、スティレ
ス(Stiles)等への米国特許第2.803.59
7号及びグレーソン・ニー(Grayson、 A)等
への米国特許第3,754.036号を参照されたい。
ス(Stiles)等への米国特許第2.803.59
7号及びグレーソン・ニー(Grayson、 A)等
への米国特許第3,754.036号を参照されたい。
下記の実施例は本発明をより詳細に説明するのに役立つ
であろう。しかしこの実施例は本発明の範囲を限定する
ものと解するべきではない。一般的方法は、2.2’
−アゾビス(2−メチルブチロニトリル)(以後ABN
と呼ぶ)のような遊離基開始剤の存在下に、ホスフィン
(PH3)を末端エチレン性不飽和アミン又はアルコー
ルと加圧された容器中で反応させることである。蒸留に
より反応混合物から所望の生成物(−級又は二級ホスフ
ィン)を分離した後、それを適尚な溶媒に溶解しそして
、再び遊離基開始剤の存在下に、末端エチレン性不飽和
アルコール又はアミンと不活性雰囲気で反応させる。末
端エチレン性不飽和アミンの典型は、3−アリル−1−
p−モルホリン、3−アリル−1−イミダゾール、3−
アリル−1−ピロリドン及び3−N、N−ジエチルアミ
ンプロパンである。末端エチレン性アルコールの典型は
、3−ヒドロキシプロペン、アリル−2−ヒドロキシエ
チルエーテル及び6.7−シヒドロキシー4−オキサヘ
プト−1−エン(3−アリルオキシ−1゜2−プロパン
−ジオール)である。
であろう。しかしこの実施例は本発明の範囲を限定する
ものと解するべきではない。一般的方法は、2.2’
−アゾビス(2−メチルブチロニトリル)(以後ABN
と呼ぶ)のような遊離基開始剤の存在下に、ホスフィン
(PH3)を末端エチレン性不飽和アミン又はアルコー
ルと加圧された容器中で反応させることである。蒸留に
より反応混合物から所望の生成物(−級又は二級ホスフ
ィン)を分離した後、それを適尚な溶媒に溶解しそして
、再び遊離基開始剤の存在下に、末端エチレン性不飽和
アルコール又はアミンと不活性雰囲気で反応させる。末
端エチレン性不飽和アミンの典型は、3−アリル−1−
p−モルホリン、3−アリル−1−イミダゾール、3−
アリル−1−ピロリドン及び3−N、N−ジエチルアミ
ンプロパンである。末端エチレン性アルコールの典型は
、3−ヒドロキシプロペン、アリル−2−ヒドロキシエ
チルエーテル及び6.7−シヒドロキシー4−オキサヘ
プト−1−エン(3−アリルオキシ−1゜2−プロパン
−ジオール)である。
式、
Q“
響
Q−P−Q’
において、QがQ“と同じであるかどうかは、上記反応
で使用した反応比に依存する。上記方法に従って製造さ
れた化合物の製品純度は微量分析及び”P NMRス
ペクトル法により決定することができる。
で使用した反応比に依存する。上記方法に従って製造さ
れた化合物の製品純度は微量分析及び”P NMRス
ペクトル法により決定することができる。
実施例1
A、3−N、N−ジエチルアミノプロピルホスフィン
500rrlの2−プロパツールを含有する1ガロンの
オートクレーブをPH,で600psiに加圧しそして
85°Cに加熱した。N、N−ジエチルアリルアミン5
00g(4,4モル)、2−プロパツール500g及び
2.2′−アゾ−ビス(2−メチルブチロニトリル)l
Og(0、05モル)の混合物を系に供給して150
0gの全仕込み量とした。
オートクレーブをPH,で600psiに加圧しそして
85°Cに加熱した。N、N−ジエチルアリルアミン5
00g(4,4モル)、2−プロパツール500g及び
2.2′−アゾ−ビス(2−メチルブチロニトリル)l
Og(0、05モル)の混合物を系に供給して150
0gの全仕込み量とした。
反応系を600psiで2時間保持し、次いで85°C
で1時間加熱した。オートクレーブを排気しそして一級
ホスフィン(229g、1.54モル)を溶媒及び二級
及び三級ホスフィン生成物から蒸留により分離した。
で1時間加熱した。オートクレーブを排気しそして一級
ホスフィン(229g、1.54モル)を溶媒及び二級
及び三級ホスフィン生成物から蒸留により分離した。
上記Aからの3−N、N−ジエチルアミノプロピルホス
フィン18.5gを不活性雰囲気を含む反応フラスコ中
で2−プロパツール150mQに溶解した。この溶液に
1/2gの2,2′−アゾビス(2−メチルブチロニト
リル)を加え、次いで油浴で55−60°Cに加熱した
。2−プロパツール3OmQ中のアリルイミダゾール2
8.1gの溶液を、反応混合物に、反応混合物の温度を
55−60℃に保ちながら、45分間にわたり滴下によ
り加えた。次いで、反応混合物を75°Cに6時間加熱
した。次いで、溶媒、出発物質及び中間体を高真空下に
除去した。生成物(27g)、3−ジエチルアミノプロ
ピル ビス(3−イミダゾリルプロピル)ホスフィンが
、200℃及び0.lmmHgで蒸留ポット中に残留し
た。所望により、この生成物の更なる精製は、バルブツ
ーバルブ装置(bulb−to−bulb appar
atus)(例えば、原管)を使用して200°C及び
Q、lmmHgでの蒸留により達成することができる。
フィン18.5gを不活性雰囲気を含む反応フラスコ中
で2−プロパツール150mQに溶解した。この溶液に
1/2gの2,2′−アゾビス(2−メチルブチロニト
リル)を加え、次いで油浴で55−60°Cに加熱した
。2−プロパツール3OmQ中のアリルイミダゾール2
8.1gの溶液を、反応混合物に、反応混合物の温度を
55−60℃に保ちながら、45分間にわたり滴下によ
り加えた。次いで、反応混合物を75°Cに6時間加熱
した。次いで、溶媒、出発物質及び中間体を高真空下に
除去した。生成物(27g)、3−ジエチルアミノプロ
ピル ビス(3−イミダゾリルプロピル)ホスフィンが
、200℃及び0.lmmHgで蒸留ポット中に残留し
た。所望により、この生成物の更なる精製は、バルブツ
ーバルブ装置(bulb−to−bulb appar
atus)(例えば、原管)を使用して200°C及び
Q、lmmHgでの蒸留により達成することができる。
3−N、N−ジエチルアミノプロピルホスフィン(実施
例1の上記Aに記載の如くして製造した)14.2gを
、不活性雰囲気を含む反応フラスコ中で2−プロパツー
ル150m(2に溶解した。この溶液に1/2gの2.
2′−アゾビス(2−メチルブチロニトリル)を加え、
次いで溶液を70°Cに加熱した。2−プロパツール5
0mQ中にアリルヒドロキシエチルエーテル22.4g
を含有する溶液を、反応混合物に、反応混合物の温度を
70−80°Cに保ちながら、45分間にわたり滴下に
より加えた。次いで、反応混合物の温度を、更に6時間
70−80°Cに保ち、その際、3.5時間にABNo
、5gを添加した。3−ジエチルアミノプロピル ビス
(2−ヒドロキシエチルオキシ−3−プロピル)ホスフ
ィン21gの生成物を、溶媒、出発物質及び中間体から
分離しそして実施例1に記載の如くして精製した。
例1の上記Aに記載の如くして製造した)14.2gを
、不活性雰囲気を含む反応フラスコ中で2−プロパツー
ル150m(2に溶解した。この溶液に1/2gの2.
2′−アゾビス(2−メチルブチロニトリル)を加え、
次いで溶液を70°Cに加熱した。2−プロパツール5
0mQ中にアリルヒドロキシエチルエーテル22.4g
を含有する溶液を、反応混合物に、反応混合物の温度を
70−80°Cに保ちながら、45分間にわたり滴下に
より加えた。次いで、反応混合物の温度を、更に6時間
70−80°Cに保ち、その際、3.5時間にABNo
、5gを添加した。3−ジエチルアミノプロピル ビス
(2−ヒドロキシエチルオキシ−3−プロピル)ホスフ
ィン21gの生成物を、溶媒、出発物質及び中間体から
分離しそして実施例1に記載の如くして精製した。
実施例3.4及び5
表1に記載の三級ホスフィンを、それぞれのアミノアル
キル又はシクロアミノアルキルホスフィン中間体及びア
ルテノールから、実施例1に記載の方法を使用して製造
した。
キル又はシクロアミノアルキルホスフィン中間体及びア
ルテノールから、実施例1に記載の方法を使用して製造
した。
実施例6
A、3−ヒドロキシプロピルホスフィン本質的に実施例
IAにな記載の如くして、2゜2′−アゾビス(2−メ
チルイソブチロニトリル)の存在下にPH,及びアリル
アルコールから3−ヒドロキシプロピルホスフィンを製
造した。
IAにな記載の如くして、2゜2′−アゾビス(2−メ
チルイソブチロニトリル)の存在下にPH,及びアリル
アルコールから3−ヒドロキシプロピルホスフィンを製
造した。
混合物)
上記Aの反応生成物12.0gを不活性雰囲気下の反応
フラスコ中で2−プロパツール150mαに溶解した。
フラスコ中で2−プロパツール150mαに溶解した。
次いで、ABNo、5gを加えそして混合物を50−5
5℃に加熱した。2−プロパツール3OmQ中に3−ア
リルイミダゾール28゜1gを含有する混合物を30分
間にわたり反応混合物に滴下により加えた。次いで反応
混合物を合計6時間80℃で加熱し、その際3時間で0
.2gのABNを添加した。この反応により、3−イミ
ダゾリルプロピルビス(3−ヒドロキシプロピル)ホス
フィン(5)20%と3−ヒドロキシプロピルビス(3
−イミダゾリルプロピル)ホスフィン(6)80%の分
離できない混合物が生成され、次いで、このものを出発
物質、中間体及び溶媒から本質的に実施例1に記載の如
くして分離した。
5℃に加熱した。2−プロパツール3OmQ中に3−ア
リルイミダゾール28゜1gを含有する混合物を30分
間にわたり反応混合物に滴下により加えた。次いで反応
混合物を合計6時間80℃で加熱し、その際3時間で0
.2gのABNを添加した。この反応により、3−イミ
ダゾリルプロピルビス(3−ヒドロキシプロピル)ホス
フィン(5)20%と3−ヒドロキシプロピルビス(3
−イミダゾリルプロピル)ホスフィン(6)80%の分
離できない混合物が生成され、次いで、このものを出発
物質、中間体及び溶媒から本質的に実施例1に記載の如
くして分離した。
実施例1−6の反応生成物は、元素分析及び”PNMR
により確かめられた。その結果は表2に示されている。
により確かめられた。その結果は表2に示されている。
求核性三級有機ホスフィンによるペプチド結合の切断
三級有機ホスフィンによるタンパク質中のペプチド結合
の切断を、約0.1 5 m g / m Qの範囲の
濃度及び約3.0−11.0の範囲のpHでのタンパク
質の処理により検討した。
の切断を、約0.1 5 m g / m Qの範囲の
濃度及び約3.0−11.0の範囲のpHでのタンパク
質の処理により検討した。
タンパク質の消化の結果は、当業者には周知されている
方法に従って、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動(S D S −P AGE)により
決定された。
方法に従って、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動(S D S −P AGE)により
決定された。
このような方法は、例えば、ウェーバ−・ブー及びオス
ポーン・エム、ザ・プロテインズ、編者、エイチ・ニュ
ーラス及びアール・エル・ヒル、アカデミツク・プレス
、ニューヨーク19 75.1巻、第三板、179−2
23頁(Weber、 K、 andOsborne、
M、、 The Proteins、 H−Neur
aLh andR,L、 Hill、 editor
s、 Academic Press、 New Yo
rk 1975. Vol、 I 3rd、、 p
p 179−223)により記載されている。タンパク
質バンドは、クーマシーブルーR(Coomassie
Blue−R)又はゲル:l−ト銀染色(Gel−C
ode 5ilver 5tain)のいずれカラ使用
シて染色することにより同定された。このような切断の
特定の例を下記の実施例に示す。これらの実施例は本発
明をより詳細に説明するためのものであって、本発明の
範囲を限定するものとみなすべきではない。
ポーン・エム、ザ・プロテインズ、編者、エイチ・ニュ
ーラス及びアール・エル・ヒル、アカデミツク・プレス
、ニューヨーク19 75.1巻、第三板、179−2
23頁(Weber、 K、 andOsborne、
M、、 The Proteins、 H−Neur
aLh andR,L、 Hill、 editor
s、 Academic Press、 New Yo
rk 1975. Vol、 I 3rd、、 p
p 179−223)により記載されている。タンパク
質バンドは、クーマシーブルーR(Coomassie
Blue−R)又はゲル:l−ト銀染色(Gel−C
ode 5ilver 5tain)のいずれカラ使用
シて染色することにより同定された。このような切断の
特定の例を下記の実施例に示す。これらの実施例は本発
明をより詳細に説明するためのものであって、本発明の
範囲を限定するものとみなすべきではない。
実施例7
切断
チオグリコレートと比較して、N、N−ジエチルアミノ
プロビル−ビス(3−ヒドロキシプロピル)ホスフィン
による毛髪ケラチンの切断を検討した。細かく切り刻ん
だ人間の毛髪を0,2MのN、N −’;エチルアミノ
プロピルービス(3−ヒドロキシプロピル)ホスフィン
又は0.2Mのチオグリコール酸ナトリウムを含有する
8Mの尿素1Omf2中でpH1o、5.37°Cで4
時間消化した。
プロビル−ビス(3−ヒドロキシプロピル)ホスフィン
による毛髪ケラチンの切断を検討した。細かく切り刻ん
だ人間の毛髪を0,2MのN、N −’;エチルアミノ
プロピルービス(3−ヒドロキシプロピル)ホスフィン
又は0.2Mのチオグリコール酸ナトリウムを含有する
8Mの尿素1Omf2中でpH1o、5.37°Cで4
時間消化した。
消化に続いて、毛髪タンパク質はシェフター等、ジャー
ナル・オブ・インベスティゲイティブ・デルマトロジ−
52巻、57 (1969X5hecter。
ナル・オブ・インベスティゲイティブ・デルマトロジ−
52巻、57 (1969X5hecter。
et at、、 J、 Invest、 Derm
、52 、57 (1969)により記載されている方
法に従ってヨード酢酸との反応によりアセチル化された
。消化生成物の試料を、次いで上述の方法に従う5DS
−PAGEにより分析した。第1図は、N、N−ジエチ
ルアミノプロピル−ビス(3−ヒドロキシプロピル)ホ
スフィン及びチオグリコール酸ナトリウムによる毛髪の
消化を比較するこのようなゲルの表示である。第1図に
見られるとおり、N、N−ジエチルアミノプロピル−ビ
ス(3−ヒドロキシプロピル)ホスフィンによる毛髪の
消化は、ジスルフィド結合の還元のみ(即ち、チオグリ
コレートによる消化)により生成したフラグメントより
低分子量の7ラグメントを生成する。
、52 、57 (1969)により記載されている方
法に従ってヨード酢酸との反応によりアセチル化された
。消化生成物の試料を、次いで上述の方法に従う5DS
−PAGEにより分析した。第1図は、N、N−ジエチ
ルアミノプロピル−ビス(3−ヒドロキシプロピル)ホ
スフィン及びチオグリコール酸ナトリウムによる毛髪の
消化を比較するこのようなゲルの表示である。第1図に
見られるとおり、N、N−ジエチルアミノプロピル−ビ
ス(3−ヒドロキシプロピル)ホスフィンによる毛髪の
消化は、ジスルフィド結合の還元のみ(即ち、チオグリ
コレートによる消化)により生成したフラグメントより
低分子量の7ラグメントを生成する。
実施例8
ドロキシプロピル)ホスフィンによるウシ血清アN 、
N−ジエチルアミノプロピル−ビス(3−1ドロキシ
プロピル)ホスフィンのBSAを切断する能力を検討し
、そしてBSAに対するジスルフィド結合還元剤チオグ
リコレート(TG)及び2−メルカプトエタノール(E
tSH)の効果と比較した。pH8,0の0.1Mトリ
ス緩衝液中のlOm g / m QのBSAの溶液を
等容量の0.2MのN、N−ジエチルアミノプロピル−
ビス(3−ヒドロキシプロピル)ホスフィン、チオグリ
コール酸ナトリウム又は2−メルカプトエタノールと一
緒にし、15分間煮沸し、次いで還元剤を加えないでS
DS試料緩衝液と1=1で混合しI;。
N−ジエチルアミノプロピル−ビス(3−1ドロキシ
プロピル)ホスフィンのBSAを切断する能力を検討し
、そしてBSAに対するジスルフィド結合還元剤チオグ
リコレート(TG)及び2−メルカプトエタノール(E
tSH)の効果と比較した。pH8,0の0.1Mトリ
ス緩衝液中のlOm g / m QのBSAの溶液を
等容量の0.2MのN、N−ジエチルアミノプロピル−
ビス(3−ヒドロキシプロピル)ホスフィン、チオグリ
コール酸ナトリウム又は2−メルカプトエタノールと一
緒にし、15分間煮沸し、次いで還元剤を加えないでS
DS試料緩衝液と1=1で混合しI;。
第2図は、チオグリコレートで処理されたBSAとN、
N−ジエチルアミノプロピル−ビス(3−ヒドロキシプ
ロピル)ホスフィンで処理されたBSAを示す5DS−
PAGEゲルの表示である。
N−ジエチルアミノプロピル−ビス(3−ヒドロキシプ
ロピル)ホスフィンで処理されたBSAを示す5DS−
PAGEゲルの表示である。
EtSH又はTGによるBSAの処理は、66にモノマ
ーの生成をもたらす。N、N−ジエチルアミノフロピル
ービス(3−ヒドロキシプロピル)ホスフィンによるB
SAの処理は、66にモノマーのより小さいペプチドフ
ラグメントへの切断を生じ、これは共有結合の切断を示
している。EtSH又はTGによる66にモノマーにお
ける共有結合の切断は見られない。
ーの生成をもたらす。N、N−ジエチルアミノフロピル
ービス(3−ヒドロキシプロピル)ホスフィンによるB
SAの処理は、66にモノマーのより小さいペプチドフ
ラグメントへの切断を生じ、これは共有結合の切断を示
している。EtSH又はTGによる66にモノマーにお
ける共有結合の切断は見られない。
実施例9
切断
N、N−ジエチルアミノプロピル−ビス(3−ヒドロキ
シプロピル)ホスフィンによるその後の切断に対するB
SA中のジスルフィド結合の前以ての還元の効果を検討
した。BSAのl Omg/ mQ試料を等容量の0.
2Mの2−メルカプトエタノール又はチオグリコレート
と混合し、そして沸騰水中で15分間加熱した。反応混
合物を、N、N−ジエチルアミノプロピル−ビス(3−
ヒドロキシプロピル)ボスフィンにおいて0.2Mなら
しめ、そして反応混合物を実施例8の如くして処理した
。
シプロピル)ホスフィンによるその後の切断に対するB
SA中のジスルフィド結合の前以ての還元の効果を検討
した。BSAのl Omg/ mQ試料を等容量の0.
2Mの2−メルカプトエタノール又はチオグリコレート
と混合し、そして沸騰水中で15分間加熱した。反応混
合物を、N、N−ジエチルアミノプロピル−ビス(3−
ヒドロキシプロピル)ボスフィンにおいて0.2Mなら
しめ、そして反応混合物を実施例8の如くして処理した
。
この検討の結果を第2図に示す。第2図は5DS−PA
GEゲルにおける表示である。第2図に示される如<、
BSAがチオグリコレートで予備処理されている場合に
は、N、N−ジエチルアミノプロピル−ビス(3−ヒド
ロキシプロピル)ホスフィンによるペプチド結合切断は
見られない。これらの結果は、本発明の化合物によるタ
ンパク質の切断を行うためには、そのままの(inta
ct)ジスルフィド結合が必要であることを示している
。
GEゲルにおける表示である。第2図に示される如<、
BSAがチオグリコレートで予備処理されている場合に
は、N、N−ジエチルアミノプロピル−ビス(3−ヒド
ロキシプロピル)ホスフィンによるペプチド結合切断は
見られない。これらの結果は、本発明の化合物によるタ
ンパク質の切断を行うためには、そのままの(inta
ct)ジスルフィド結合が必要であることを示している
。
実施例10
処」L
N、N−ジエチルアミノプロピル−ビス(3−ヒドロキ
シプロピル)ホスフィンがマツコラクジラのミオグロビ
ンを切断する能力を検討した。マツコラクジラのミオグ
ロビンはシスティン残基を含まない。特に、このタンパ
ク質は、実施例8に記載の如く0.2Mメルカプ)・エ
タノール又はホスフィンで濃度10mg/mQで処理さ
れた。
シプロピル)ホスフィンがマツコラクジラのミオグロビ
ンを切断する能力を検討した。マツコラクジラのミオグ
ロビンはシスティン残基を含まない。特に、このタンパ
ク質は、実施例8に記載の如く0.2Mメルカプ)・エ
タノール又はホスフィンで濃度10mg/mQで処理さ
れた。
5DS−PAGEは、マツコラクジラのミオグσビンが
N、N−ジエチルアミノプロピル−ビス(3−ヒドロキ
シプロピル)ホスフィンにより切断されないことを示し
た。
N、N−ジエチルアミノプロピル−ビス(3−ヒドロキ
シプロピル)ホスフィンにより切断されないことを示し
た。
実施例11
他のシスチン含有タンパク質の切断
実施fII8に記載の方法と同じ方法を使用して、ずべ
てシスチン残基を含有する下記のタンパク質;アルコー
ルデヒドロゲナーゼ、ホスホリラーゼB1ピルベートキ
ナーゼ、クレアチニンキナーゼ及びホスホグルコ−ムタ
ーゼ(phosphogluco−mutase) ;
をN、N−ジエチルアミノプロピル−ビス(3−ヒドロ
キシプロピル)ホスフィン溶液により処理し、生成物を
5DS−PAGEにより分析した。
てシスチン残基を含有する下記のタンパク質;アルコー
ルデヒドロゲナーゼ、ホスホリラーゼB1ピルベートキ
ナーゼ、クレアチニンキナーゼ及びホスホグルコ−ムタ
ーゼ(phosphogluco−mutase) ;
をN、N−ジエチルアミノプロピル−ビス(3−ヒドロ
キシプロピル)ホスフィン溶液により処理し、生成物を
5DS−PAGEにより分析した。
上記のタンパク質のすべては、SDSゲルでの低分子量
ペプチドフラグメントの存在により証明されるようにペ
プチド結合切断を示した。
ペプチドフラグメントの存在により証明されるようにペ
プチド結合切断を示した。
実施例12
N、N−ジエチルアミノプロピル−ビス(3−ヒベグチ
ド結合切断の主部位がシスチン残基にあることを確認す
るために、モデルタンパク質として生成したアスパラギ
ナーゼを使用した。アスパラギナーゼのそのままのペプ
チド鎖は、34,000の分子量を有する。システィン
残基は、321アミノ酸中の残基76及び105にある
。第3図は、アスパラギナーゼとN、N−ジエチルアミ
ノプロピルービス(3−ヒドロキシプロピル)ホスフィ
ンとの反応の後のアスパラギナーゼの構造及びSDSゲ
ルを表示している。ペプチドフラグメントの寸法は、標
準曲線プロットから決定された。
ド結合切断の主部位がシスチン残基にあることを確認す
るために、モデルタンパク質として生成したアスパラギ
ナーゼを使用した。アスパラギナーゼのそのままのペプ
チド鎖は、34,000の分子量を有する。システィン
残基は、321アミノ酸中の残基76及び105にある
。第3図は、アスパラギナーゼとN、N−ジエチルアミ
ノプロピルービス(3−ヒドロキシプロピル)ホスフィ
ンとの反応の後のアスパラギナーゼの構造及びSDSゲ
ルを表示している。ペプチドフラグメントの寸法は、標
準曲線プロットから決定された。
反応後に見られるペプチドフラグメントは、26゜50
0.23,500.19,000及び8.000ダルト
ンの分子量に相当する。更に、低分子量のバンド(はぼ
3000ダルトン)が見られる。反応は、完了するには
至らず、相当な元のポリペプチド(34k)が切断され
ないで残っている。
0.23,500.19,000及び8.000ダルト
ンの分子量に相当する。更に、低分子量のバンド(はぼ
3000ダルトン)が見られる。反応は、完了するには
至らず、相当な元のポリペプチド(34k)が切断され
ないで残っている。
もしもホスフィンがすべての可能なシスティン部位を同
時に切断するならば、−次配列から予想され乙フラグメ
ントは、2971,8055.11.02fi及び23
.054ダルトンである。これは実情ではない。その理
由は、ゲルパターンに存在する26,500フラグメン
トが見られるからである。故に、更にポリペプチドの部
分的切断が起こっている。
時に切断するならば、−次配列から予想され乙フラグメ
ントは、2971,8055.11.02fi及び23
.054ダルトンである。これは実情ではない。その理
由は、ゲルパターンに存在する26,500フラグメン
トが見られるからである。故に、更にポリペプチドの部
分的切断が起こっている。
1つのシスティン残基に的中するアスパラギナーゼの部
分的切断は、アミノ末端から定めて下記の可能な7ラグ
メント;8055.26,025.11.026及び2
3,054をもたらす。これは依然として11.025
7ラグメントの欠如及び19.000分子量のバンドの
存在の説明とはならない。故に、可能な説明としては下
記の如く進めることができる:ll、025がもしも8
055フラグメントと架橋するならば、19,000フ
ラグメントを生じるであろう。i応が完了するまで行な
うと仮定すれば、両システィン残基の同時的的中がらの
8055は残るが、11,025は、過剰の80557
ラグメントにより結合される0)ound up)ので
残らないであろう。これは、ゲルデータと合致している
。その理由は、80557ラグメントはゲル中に見られ
るからである。
分的切断は、アミノ末端から定めて下記の可能な7ラグ
メント;8055.26,025.11.026及び2
3,054をもたらす。これは依然として11.025
7ラグメントの欠如及び19.000分子量のバンドの
存在の説明とはならない。故に、可能な説明としては下
記の如く進めることができる:ll、025がもしも8
055フラグメントと架橋するならば、19,000フ
ラグメントを生じるであろう。i応が完了するまで行な
うと仮定すれば、両システィン残基の同時的的中がらの
8055は残るが、11,025は、過剰の80557
ラグメントにより結合される0)ound up)ので
残らないであろう。これは、ゲルデータと合致している
。その理由は、80557ラグメントはゲル中に見られ
るからである。
23.0547ラグメントは、他のフラグメントのほぼ
2倍の濃度で存在していることは、バンドの強度から明
らかである。これは、多分、上記の仮定が成り立つとす
れば、1つへの的中と同時的な的中の2つが等しい割合
で起こるからであろう。
2倍の濃度で存在していることは、バンドの強度から明
らかである。これは、多分、上記の仮定が成り立つとす
れば、1つへの的中と同時的な的中の2つが等しい割合
で起こるからであろう。
uLLL!
他の三級有機ホスフィンのペプチド結合切断能力
求核性側鎖を持っている三級有機ホスフィンと求核性側
鎖を持たない三級有機ホスフィンのペプチドを切断する
能力を評価した。前記した消化の基本的方法を使用して
、求核性側鎖を有する三級有機ホスフィンは、システィ
ン残基を含むタンパク質を切断するが、これに対して、
求核性側鎖を持たない三級有機ホスフィンは還元剤とし
て作用するが、このようなタンパク質を切断しないこと
が見出だされた。例えば、トリス−カルボキシ−エチル
、トリス−n−ブチル、トリス−イソブチル、又はトリ
ーンアノエチル側鎖を持った三級有機ホスフィンは、ペ
プチド結合を切断する徴候を示さない。BSA及びトリ
ス(イソブチル)ホスフィンを使用したこのような実験
の結果は、第2図に示されている。もとの66にのタン
パク質のみが反応後に見られる。
鎖を持たない三級有機ホスフィンのペプチドを切断する
能力を評価した。前記した消化の基本的方法を使用して
、求核性側鎖を有する三級有機ホスフィンは、システィ
ン残基を含むタンパク質を切断するが、これに対して、
求核性側鎖を持たない三級有機ホスフィンは還元剤とし
て作用するが、このようなタンパク質を切断しないこと
が見出だされた。例えば、トリス−カルボキシ−エチル
、トリス−n−ブチル、トリス−イソブチル、又はトリ
ーンアノエチル側鎖を持った三級有機ホスフィンは、ペ
プチド結合を切断する徴候を示さない。BSA及びトリ
ス(イソブチル)ホスフィンを使用したこのような実験
の結果は、第2図に示されている。もとの66にのタン
パク質のみが反応後に見られる。
本発明の求核性三級有機ホスフィンは、システィン残基
を含むタンパク質を、システィン残基部位で選択的に切
断する。ウシ血清アルブミンのような、多数のシスティ
ン−システィン配列を含むタンパク質は、すべて本発明
の化合物により容易に切断される。より少数のシスティ
ン残基を持った他のタンパク質では、反応が完了するま
で押し進めるには、消化反応に熱を加える必要がある。
を含むタンパク質を、システィン残基部位で選択的に切
断する。ウシ血清アルブミンのような、多数のシスティ
ン−システィン配列を含むタンパク質は、すべて本発明
の化合物により容易に切断される。より少数のシスティ
ン残基を持った他のタンパク質では、反応が完了するま
で押し進めるには、消化反応に熱を加える必要がある。
本発明の化合物の切断反応は、広いpH範囲(4−12
)にわたって起こり、そして本発明が関係する当業者に
より最適の結果が得られるように調節することができる
。反応は、種々の適当な水性緩衝液中で行うことができ
る。
)にわたって起こり、そして本発明が関係する当業者に
より最適の結果が得られるように調節することができる
。反応は、種々の適当な水性緩衝液中で行うことができ
る。
システィン残基部位に対する本発明の切断の選択性によ
り、これらの化合物はタンパク質配列のマツピング及び
タンパク質構造分析用の試薬として非常に有用である。
り、これらの化合物はタンパク質配列のマツピング及び
タンパク質構造分析用の試薬として非常に有用である。
このようなマツピング及び分析は、上述の消化方法を使
用して行うことができる。
用して行うことができる。
ケラチンは、高い百分率のシスティン残基を含有してい
るので、本発明の化合物によるケラチンの処理はケラチ
ンを可溶化するであろう。限定ではなく例として、羽毛
、カルス組織(callus tissue)、毛髪及
び爪は、これらの求核性三級有機ホスフィンにより可溶
化することができる。このような可溶化は、動物の皮革
(hides)のなめしの前の脱毛剤として、又肉に食
い込んだ(ingrovn)足指の爪(toena i
!s)除去用の剤として有用でありうる。
るので、本発明の化合物によるケラチンの処理はケラチ
ンを可溶化するであろう。限定ではなく例として、羽毛
、カルス組織(callus tissue)、毛髪及
び爪は、これらの求核性三級有機ホスフィンにより可溶
化することができる。このような可溶化は、動物の皮革
(hides)のなめしの前の脱毛剤として、又肉に食
い込んだ(ingrovn)足指の爪(toena i
!s)除去用の剤として有用でありうる。
本発明の化合物は、抗バクテリア活性、抗ウィルス活性
及び抗菌活性も有することができる。その理由は、これ
らの化合物はシスチン含有タンパク質を切断するからで
ある。
及び抗菌活性も有することができる。その理由は、これ
らの化合物はシスチン含有タンパク質を切断するからで
ある。
特定のタンパク質のエンジニアリングを含む生物工学の
最近の進歩によって、本発明の化合物は、タンパク質の
選択的切断によるタンパク質の修飾において追加の選択
的道具として有用であろう。
最近の進歩によって、本発明の化合物は、タンパク質の
選択的切断によるタンパク質の修飾において追加の選択
的道具として有用であろう。
本発明の化合物についての前記した使用は、例として述
べられたものであり、本発明の範囲を限定するものでは
ない。これらの化合物の他の用途は、本明細書に含まれ
た開示の助けにより当業者には明らかであり、従って、
このような使用は本発明の範囲内にあるであろう。
べられたものであり、本発明の範囲を限定するものでは
ない。これらの化合物の他の用途は、本明細書に含まれ
た開示の助けにより当業者には明らかであり、従って、
このような使用は本発明の範囲内にあるであろう。
本発明の主なる特徴及び態様は以下のとおりである。
1、そのままの、鋼量ジスルフィド結合又は鎖内ジスル
フィド結合を含むポリペプチド鎖及びタンパク質中のシ
スティン残基においてペプチド結合を切断する方法であ
って、求核性側鎖を持った有機ホスフィンで処理するこ
とより成り、前記ホスフィンは、一般式、 Q“ Q−P−Q’ 式中、Q、Q’及びQ“は、ヒドロキシルアルキル、ポ
リ(ヒドロキシアルキル)、アミノアルキル又はシクロ
アミノアルキルであり、ここに、前記アルキルはC,−
C,であり、前記アミンは一級、二級又は三級であり、
前記シクロアミンは窒素を含む5員又は6員の複素環で
ある、 の三級有機ホスフィンから成る群より選ばれるものであ
ることを特徴とする方法。
フィド結合を含むポリペプチド鎖及びタンパク質中のシ
スティン残基においてペプチド結合を切断する方法であ
って、求核性側鎖を持った有機ホスフィンで処理するこ
とより成り、前記ホスフィンは、一般式、 Q“ Q−P−Q’ 式中、Q、Q’及びQ“は、ヒドロキシルアルキル、ポ
リ(ヒドロキシアルキル)、アミノアルキル又はシクロ
アミノアルキルであり、ここに、前記アルキルはC,−
C,であり、前記アミンは一級、二級又は三級であり、
前記シクロアミンは窒素を含む5員又は6員の複素環で
ある、 の三級有機ホスフィンから成る群より選ばれるものであ
ることを特徴とする方法。
2、前記三級ホスフィンが、式、
Q#
Q−P−Q’
であり、
Q′はQ又はQ“であり、
R8
Y及びZは、−NR,。R1,又は−OR1!であり、
RIG及びR11は、Nと一緒になって、イミダグリル
、ピリドニル、ピリジル又はモルホリニル環を形成し、 R12はcHt CHCHR14であり、R3,はH
又は−OHであり、 R1,は、 (CH2)−CHzOHであり、0%m及
びtは独立に0−3であり、 R、−Rsは、独立に、H又はアルキル(C1−Ct)
であり、 但し、ZとYは、いずれの化合物についても同一ではな
いものとする、 の化合物から選ばれる上記lに記載の方法。
、ピリドニル、ピリジル又はモルホリニル環を形成し、 R12はcHt CHCHR14であり、R3,はH
又は−OHであり、 R1,は、 (CH2)−CHzOHであり、0%m及
びtは独立に0−3であり、 R、−Rsは、独立に、H又はアルキル(C1−Ct)
であり、 但し、ZとYは、いずれの化合物についても同一ではな
いものとする、 の化合物から選ばれる上記lに記載の方法。
3、前記有機ホスフィンが、3−N、N−ジエチルアミ
ノプロピルビス−(3−イミダゾリルプロピル)ホスフ
ィンである、 上記2に記載の方法。
ノプロピルビス−(3−イミダゾリルプロピル)ホスフ
ィンである、 上記2に記載の方法。
4、式、
Q#
Q−P−Q’
式中、
Qは−(CH2)、−CH
−Z
であり、
Q′はQ又はQ#であり、
Q“は−(CH、)、−CH−C−Yであり、薯
Y及びZは、 N R+。R11又は−○R+2であり
、 RIG及びR1,は、Nと一緒になって、イミダゾリル
、ピリドニル、ピリジル又はモルホリニル環を形成し、 R目 R1!はCHz CHCHR++であり、R13はH
又は−OHであり、 R11は、 (CH2)1CH20Hであり、n、
m及びしは独立に0−3であり、R、−R、は、独立に
、H又はアルキル(C3−C4)であり、 但し、ZとYは、いずれの化合物についても同一ではな
いものとする、 の化合物から選ばれる二級ホスフィン。
、 RIG及びR1,は、Nと一緒になって、イミダゾリル
、ピリドニル、ピリジル又はモルホリニル環を形成し、 R目 R1!はCHz CHCHR++であり、R13はH
又は−OHであり、 R11は、 (CH2)1CH20Hであり、n、
m及びしは独立に0−3であり、R、−R、は、独立に
、H又はアルキル(C3−C4)であり、 但し、ZとYは、いずれの化合物についても同一ではな
いものとする、 の化合物から選ばれる二級ホスフィン。
5、化合物、3−N、N−ジエチルアミノプロピルビス
−(3−イミダゾリルプロピル)ホスフィン。
−(3−イミダゾリルプロピル)ホスフィン。
6、化合物、3−N、N−ジエチルアミノプロピルビス
−(2−ヒドロキシ−エチルオキシ−3−プロピル)ホ
スフィン。
−(2−ヒドロキシ−エチルオキシ−3−プロピル)ホ
スフィン。
7、化合物、3−イミダゾリルプロピルビス(3−ヒド
ロキシ−プロピル)ホスフィン。
ロキシ−プロピル)ホスフィン。
8、化合物、3−N、N−ジエチルアミノプロピルビス
(1,2−ジヒドロキシプロピルオキシ−3−プロピル
)ホスフィン。
(1,2−ジヒドロキシプロピルオキシ−3−プロピル
)ホスフィン。
9、化合物、N−ピロリドニルエチルビス(1゜2−ジ
ヒドロキシプロピルオキシ−3−プロピル)ホスフィン
。
ヒドロキシプロピルオキシ−3−プロピル)ホスフィン
。
IO1化合物、3−ヒドロキシプロピルビス(3−イミ
ダゾリルプロピル)ホスフィン。
ダゾリルプロピル)ホスフィン。
第1図は実施例7に記載の5DS−PAGEの結果を示
す図である。 第2図は実施例8.9及び13に記載の5DS−PAG
Eの結果を示す図である。 第3図は実施例13に記載の5DS−PAGEの結果を
示す図である。 特許出願人 アメリカン・サイアナミド・カンパA開の
毛)をイ火用(マの作用噂1美Q矛支容すR構モ示ワ吏
(ている
す図である。 第2図は実施例8.9及び13に記載の5DS−PAG
Eの結果を示す図である。 第3図は実施例13に記載の5DS−PAGEの結果を
示す図である。 特許出願人 アメリカン・サイアナミド・カンパA開の
毛)をイ火用(マの作用噂1美Q矛支容すR構モ示ワ吏
(ている
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、そのままの、鎖間ジスルフィド結合又は鎖内ジスル
フィド結合を含むポリペプチド鎖及びタンパク質中のシ
ステイン残基においてペプチド結合を切断する方法であ
って、求核性側鎖を持った有機ホスフィンで処理するこ
とより成り、 前記ホスフィンは、一般式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Q、Q′及びQ″は、ヒドロキシルアルキル、ポ
リ(ヒドロキシアルキル)、アミノアルキル又はシクロ
アミノアルキルであり、ここに、前記アルキルはC_1
−C_4であり、前記アミンは一級、二級又は三級であ
り、前記シクロアミンは窒素を含む5員又は6員の複素
環である、 の三級有機ホスフィンから成る群より選ばれるものであ
ることを特徴とする方法。 2、式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Qは▲数式、化学式、表等があります▼ であり、 Q′はQ又はQ″であり、 Q″は▲数式、化学式、表等があります▼であり、 Y及びZは、−NR_1_0R_1_1又は−OR_1
_2であり、 R_1_0及びR_1_1は、Nと一緒になって、イミ
ダゾリル、ピリドニル、ピリジル又はモル ホリニル環を形成し、 R_1_2は▲数式、化学式、表等があります▼であり
、 R_1_3はH又は−OHであり、 R_1_4は、−(CH_2)_t−CH_2OHであ
り、n、m及びtは独立に0−3であり、 R_3−R_8は、独立に、H又はアルキル(C_1−
C_4)であり、 但し、ZとYは、いずれの化合物について も同一ではないものとする、 の化合物から選ばれる三級ホスフィン。
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Citations (4)
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FR1522660A (fr) * | 1966-05-02 | 1968-04-26 | American Cyanamid Co | Nouvelles compositions permettant de déformer les fibres kératiniques |
FR1574239A (ja) * | 1967-07-12 | 1969-07-11 | ||
US3754035A (en) * | 1970-01-29 | 1973-08-21 | American Cyanamid Co | Tertiary organophosphines |
DE2601520A1 (de) * | 1975-01-16 | 1976-07-22 | Borg Warner | Verfahren zur herstellung von 2-hydroxyalkylphosphinen |
-
1989
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- 1989-03-06 AT AT89103906T patent/ATE111918T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-03-06 ES ES89103906T patent/ES2064374T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-30 CA CA000595161A patent/CA1330800C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-04-01 JP JP1083848A patent/JPH0215092A/ja active Pending
Patent Citations (4)
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